KR102285771B1

KR102285771B1 - Arl6ip5 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암제-내성 난소암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102285771B1
Application number: KR1020200034297A
Authority: KR
Inventors: 윤현옥; 엠디엔타즈바하; 김현수; 김지예
Original assignee: 경상국립대학교산학협력단; 사회복지법인 삼성생명공익재단; 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-08-05

Abstract

본 발명은 ARL6IP5 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 난소암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 ARL6IP5 단백질은 시스플라틴에 대한 내성을 가지는 난소암세포의 세포사멸 증가 및 세포증식 억제 효과가 우수할 뿐만 아니라, 시스플라틴 또는 올라파립과 함께 사용하였을 때 항암 효과가 현저하게 증진되므로, 시스플라틴에 대한 내성이 있는 난소암의 예방, 개선 또는 치료용 의약품 또는 건강기능식품 개발에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ARL6IP5 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암제-내성 난소암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{ARL6IP5 composite agent for preventing, improving or treating anticancer agent-resistant ovarian cancer}

본 발명은 ARL6IP5(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 5) 단백질을 유효성분으로 함유하는, 항암제-내성 난소암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

난소암(ovarian cancer)은 부인암 중에서도 가장 사망률이 높아서 발병한 환자의 50% 이상이 사망하게 된다. 임상적으로 가장 흔한 종류의 난소암으로 상피성 난소암(epithelial ovarian cancer)을 들 수 있는데, 전체 난소암의 90%를 차지한다. 상피성 난소암은 80% 이상이 폐경기 여성에서 발생하며 가장 높은 발생빈도를 보이는 연령은 62세이다. 상피성 난소암과는 달리 20세 이하의 젊은 여성에서 주로 발생하는 악성 생식세포암(germ cell tumor)도 있다. 이 난소암은 30대에서도 간혹 발견되나 나이가 증가할수록 그 빈도가 감소하게 되며 드물게는 10세 이하에서도 발견된다. 침윤성 상피성 난소암(다른 부위 및 다른 장기로 전이된 난소암)의 5년 생존율은 15%에서 35%에 그친다.

난소암은 대부분의 경우 다른 장기로 전이된 상태에서도 증상이 나타나지 않기 때문에 상당히 진행된 상태, 즉 높은 임상병기(임상3기)에서야 발견이 된다. 따라서 난소암은 최대한 종양을 제거하는 종양감축술(Debulking surgery)을 반드시 필요로 하며 동시에 항암화학요법 또는 방사선치료를 병합한 복합적 치료 방법이 항시 요구된다.

난소암은 수술 후 항암화학치료제에 비교적 민감하게 반응하나 항암제 내성을 획득하는 경우가 많은 질환으로 재발률과 사망률이 매우 높은 까닭에 이런 문제를 해결할 수 있는 새로운 치료제의 개발이 절실한 상황이다. 수술요법은 적절한 제거, 즉 제거 후 복강 내에 남아 있는 악성 종양의 크기가 지름 1㎝ 미만으로 줄어졌느냐에 따라 그 성패가 좌우된다. 잔존 종양의 용적에 따라 수술 받은 환자의 예후와도 직결되기 때문이다. 수술 후 잔류 종양의 크기가 작으면 작을수록 수술 후 항암화학치료제 투여에 예후가 훨씬 좋아진다. 난소암 치료에서 방사선 요법은 여러 가지 검토가 이루어져야 한다. 일부 몇몇의 난소암을 제외하고는 방사선 단독요법은 부적절한 경우가 많으며 특히 생식 능력의 보존이라는 측면에서는 세부적인 검토가 필요하다. 항암화학치료요법에 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin)이 사용되고 있으며 탁솔(taxol), 토포테칸(topotecan)과 같은 약제가 부각되고 있다.

그러나, 난소암은 부인암 중 가장 치명적인 암으로 3기 이상의 진행성 난소암의 경우 초기 치료에서 60-70% 정도의 관해율을 보이지만, 결국 대부분의 환자가 재발성 또는 항암제 내성암으로 진행되어 사망에 이르게 된다.

항암제 내성 발생은 항암화학치료에 기반을 둔 암치료에 있어서 큰 장애가 된다. 대부분의 암세포들은 유전자 변이 억제와 관련된 기능이 이미 상실된 상태에 있으므로, 하나의 암 덩어리 안에 있는 세포들 각각도 다양한 유전자 발현패턴을 가지게 된다. 항암제를 이용한 화학적 치료시 유전적 다양성으로 인하여 항암제 내성을 가진 세포가 선별적으로 살아남게 되며, 살아남은 항암제 내성 세포가 증식을 거듭하여 결국 대부분의 암 덩어리의 세포가 항암제 내성을 가지게 된다. 유전적 다양성 또는 돌연변이로 인한 항암제 내성 외에도, 환자의 부작용이 너무 심하여 충분한 양의 항암제를 투여하지 못한 경우, 경구 투여시 약물 흡수가 비정상적으로 저하된 경우, 또는 생리학적으로 혈관과 암조직 사이에 세포로 이루어진 장벽이 있어 제대로 약물이 침투하지 못한 경우 등에도 항암제 내성 현상을 보일 수 있다.

한편, 한국등록특허 제1900568호에는 '항암제 저항성 난소암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1706462호에는 'NAG-1 억제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 억제용 약학조성물'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 'ARL6IP5 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 난소암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 ARL6IP5 단백질을 시스플라틴에 내성을 가지는 난소암세포에 처리하였을 때, 기존 항암제인 시스플라틴(cisplatin) 및 올라파립(olaparib)에 비해 세포사멸 효과 및 세포증식 억제 효과가 우수할 뿐만 아니라, ARL6IP5 단백질과 시스플라틴 또는 ARL6IP5 단백질과 올라파립을 병용 처리함으로써 시스플라틴에 내성이 있는 난소암에 대한 항암 효과가 현저하게 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 ARL6IP5(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 5) 단백질 또는 상기 ARL6IP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 난소암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ARL6IP5 단백질 또는 상기 ARL6IP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 개체에게 투여하여 항암제 내성 난소암세포의 항암제에 대한 민감도를 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ARL6IP5 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 항암제 내성 난소암을 앓는 환자로부터 채취한 시료에 후보물질을 처리하는 단계;

(2) 상기 단계 (1)의 후보물질이 처리된 시료의 ARL6IP5의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(3) 상기 단계 (2)에서 측정한 발현 수준을 상기 후보물질을 처리하지 않은 시료의 ARL6IP5의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 항암제 내성 난소암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 ARL6IP5 단백질은 시스플라틴에 대한 내성을 가지는 난소암세포의 세포사멸 증가 및 세포증식 억제 효과가 우수할 뿐만 아니라, 시스플라틴 또는 올라파립과 함께 사용하였을 때 항암 효과가 현저하게 증진되므로, 시스플라틴에 대한 내성이 있는 난소암의 예방, 개선 또는 치료용 의약품 또는 건강기능식품 개발에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 시스플라틴(cisplatin)에 내성이 있는 난소암세포(SKOV-CisR)에 ARL6IP5 재조합 단백질을 단독 처리하거나, 시스플라틴(cisplatin) 또는 올라파립(olaparib)과 병용 처리하였을 때, (a) 세포사멸율(apoptotic rate) 및 (b) 세포증식(proliferation rate)을 확인하고 (c) Hoechst 33324 염료를 이용하여 사멸세포와 생존세포를 확인한 결과이다. control: 무처리 대조군.
도 2는 시스플라틴에 내성이 있는 난소암세포(SKOV-CisR) 내 ARL6IP5 단백질의 발현 조절에 따른 세포증식을 확인한 결과이다. control: 무처리 대조군; Scramble: non-targeting siRNA 처리 대조군; ARL6IP5++: ARL6IP5 단백질 과발현군; siRNA_ARL61P5: ARL6IP5 단백질 넉다운(knockdown)군.
도 3은 시스플라틴에 내성이 있는 난소암세포(SKOV-CisR)에서 ARL6IP5 단백질의 발현을 조절한 후, 50μM 또는 100μM의 시스플라틴을 처리하고 확인한 결과이다. (a) 및 (c)는 Hoechst 33324 염료를 이용하여 세포를 염색한 사진이고, (b) 및 (d)는 ARL6IP5 단백질의 발현을 조절한 군에서 시스플라틴 처리에 따른 세포사멸율을 확인한 것이다. control: 무처리 대조군; Scramble: non-targeting siRNA 처리 대조군; ARL6IP5++: ARL6IP5 단백질 과발현군; siRNA_ARL61P5: ARL6IP5 단백질 넉다운(knockdown)군. *: ARL6IP5 단백질 과발현군과 무처리 대조군, non-targeting siRNA 처리 대조군 및 ARL6IP5 단백질 넉다운군 간에 통계적으로 유의한 차이가 있으며, P값이 0.001 미만인 것을 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ARL6IP5(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 5) 단백질 또는 상기 ARL6IP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 난소암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

ARL6IP5(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 5)은 PRA1(Prenylated rab acceptor) 패밀리 단백질로서 인간에서 ARL6IP5 유전자에 의해 코딩되는 단백질로서, 시스플라틴에 대한 내성을 가지는 난소암에 ARL6IP5 재조합 단백질을 처리하거나, ARL6IP5 단백질의 발현을 증가시킬 경우 항암 효과가 우수한 것을 확인하였다.

본 명세서에서 "항암제 내성"이란, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때 치료 초기부터 효과가 없거나 초기에는 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 감소 또는 상실되는 것을 의미한다.

본 발명의 항암제 내성 난소암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 항암제는 플래티넘(platinum) 계열 항암제일 수 있으며, 상기 플래티넘(platinum) 계열 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 시스플라틴일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 약한 조성물은 시스플라틴(cisplatin) 또는 올라파립(olaparib)과 동시에, 별도로 또는 순차적으로 병용 처리되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 ARL6IP5 단백질을 시스플라틴(cisplatin) 또는 올라파립(olaparib)과 병용 처리하였을 때, ARL6IP5 단백질을 단독 처리한 경우에 비해 항암제 내성 난소암세포의 세포사멸 증가 및 세포증식 억제 효과가 증진되는 효과가 있다.

본 발명의 상기 ARL6IP5 단백질을 포함하는 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 조합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 ARL6IP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 재조합 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터 또는 박테리오파아지 벡터일 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드 벡터인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 재조합 바이러스는 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항암제는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "민감도 증진"은 항암제 등의 암 치료 물질에 대한 암세포의 민감도를 증진시키는 것을 의미한다. 민감도가 증진되는 경우 치료 물질을 상대적으로 낮은 용량으로 사용하거나, 짧은 시간으로 처리하여도 암세포의 증식 억제 및 사멸 효과가 나타나므로, 우수한 암 치료 효과를 기대할 수 있게 된다.

상기 개체는 예를 들면, 인간을 제외한 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 ARL6IP5 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암보조제를 제공한다. 상기 항암 보조제는 항암제 내성 난소암을 개선할 수 있다.

상기 항암 보조제는 ARL6IP5 단백질에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다. 상기 항암 보조제는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 비경구 투여 시 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사, 자궁 내 경막주사, 뇌혈관 내 주사 또는 흉부 내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 항암 보조제는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 상기 항암 보조제의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 항암 보조제는 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 항암제 내성 난소암 치료제의 스크리닝 방법에서, 상기 시료는 간조직, 림프액, 타액, 혈청, 혈장 및 혈액 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.

상기 단계 (2)에서 측정한 발현 수준이 상기 후보물질을 처리하지 않은 시료의 ARL6IP5의 mRNA 또는 단백질 발현 수준보다 높은 경우, 상기 후보물질을 항암제 내성 난소암의 치료용 물질로 판단할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. IC ₅₀ 측정 및 세포증식 분석

시스플라틴(cis-Dichlorodiammine platinum(II), # P4394, Sigma Aldrich, St. Louis, USA), 올라파립(AZD2281, # A10111-10mM-D, Adooq Bioscience, Irvine, CA, USA) 또는 인간 ARL6IP5 재조합 단백질(ARL6IP5 RP, # ARLIP5-9863H, UT, Creative Bioscience)의 IC₅₀값(시스플라틴에 내성을 가지는 난소암세포의 증식을 50% 억제하는 시료의 농도)을 결정하기 위해, 일반 난소암세포(SKOV-3)을 대상으로 EZ-cytox 세포생존 분석 키트(# DLS-1906, DoGenBioCo., Ltd.)를 사용하여 세포증식률을 측정하였다. 세포(1×10⁴ 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 배양한 세포에 각각 다른 농도의 시스플라틴(0~100μM), 올라파립(0~100μM), ARL6IP5 재조합 단백질(0~80㎍/㎖)을 각각 처리하고 추가로 72시간 동안 배양하였다. 그 후, EZ-cytox 세포생존 분석 키트를 사용하여 세포 증식률을 측정하였다. IC₅₀ 값은 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 사용하여 분석하였다. 시스플라틴에 내성을 가지는 난소암세포(SKOV-3/CisR)는 일반 난소암세포에 10μM의 시스플라틴을 처리하여 살아남은 세포를 수집하는 과정을 10회 반복하고 이후에 순차적으로 20μM, 40μM, 80μM 및 100μM의 시스플라틴을 각각 상기 과정과 동일하게 진행하여 최종적으로 획득하였으며, 상기 동일한 방법으로 EZ-cytox 세포생존 분석 키트를 사용하여 세포 증식률을 측정하였다.

2. 세포사멸 분석

ARL6IP5 재조합 단백질 처리에 따른 세포사멸을 측정하기 위해 Hoechst 33342 염색을 수행하였다. 구체적으로, 세포(2×10⁵ 세포/웰)를 6-웰 플레이트에 이식하여 배양기에 밤새 배양하였다. 배양된 세포에 시스플라틴(IC₅₀=20μM), 올라파립(IC₅₀=25μM) 및 ARL6IP5 재조합 단백질(IC₅₀=2.5㎍/㎖)을 각각 또는 병용 처리하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 6-웰 플레이트에 배양된 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 15분 동안 5㎍/㎖의 Hoechst 33342를 처리하였다. 마지막으로, 세포를 PBS로 2회 세척하고 역형광 현미경(Axioskop 2 plus microscope, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하여, 세포사멸 핵은 중첩되지 않은 5개 영역에서 산출되었으며, 산출된 총 핵 수의 백분율로 표현되었다.

3. ARL6IP5 과발현

인간 ARL6IP5(NC_000003.12) 유전자가 코딩된 pcDNA3.1 플라스미드를 GenScript사(oHu24499; Piscataway, USA)로부터 구입하였다. 세포(0.5×10⁵ 세포/웰)를 성장 배지에서 24-웰 플레이트 상에 분주하고 형질전환시 웰에 80% 컨플루언시(confluency) 상태로 세포를 증식시킨 후, Lipofectamine 2000(# 11668019, Invitrogent-Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)으로 제조사의 지침에 따라 형질전환시켰다. 구체적으로, 1㎍의 pcDNA3.1/ARL6IP5 플라스미드를 함유하는 50㎕의 무혈청 배지를 제조하고 3㎕의 Lipofectamine 2000을 50㎕의 무혈청 배지에 별도로 희석시킨 후, 두 용액을 혼합한 다음, 5분 동안 배양하여 융합물을 형성시켰다. 이어서, 50㎕의 융합물을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 손으로 부드럽게 흔들어 처리 용액이 웰에 잘 분산되도록 하였다. 이어서, 세포를 48시간 동안 배양하고, 처리 용액을 정상 배양 배지로 교체하여 12시간 배양하였다. 이후 세포를 걷어 들여, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 세포에서 ARL6IP5 발현을 확인하였다. 비교대조군으로는 무처리 대조군(control); non-targeting siRNA 대조군(Scramble); 및 ARL6IP5 단백질 넉다운(knockdown)군(siRNA_ARL61P5)을 사용하였다.

4. 세포 내 ARL6IP5 단백질 발현에 따른 세포증식

세포 내 ARL6IP5 단백질 발현에 따른 세포 증식은 EZ-cytox 세포생존 분석 키트(# DLS-1906, DoGenBioCo., Ltd.)를 이용하여 분석하였다. 형질주입된 SKOV-3/CisR 세포를 완전 배지에서 배양시킨 후, 세포(1×10⁴ 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 접종하고 적절한 기간 동안 배양하였다. 각 그룹(control, Scramble, ARL6IP5++ 및 siRNA_ARL61P5)을 3개의 웰에서 3회 반복하였다. 24, 48 및 72 시간 동안 배양한 후, EZ-cytox 분석 키트를 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 이어서, 490nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더(Synergy H1, BioTek, Winooski, VT, USA)로 흡광도를 측정하였다.

5. 세포 내 ARL6IP5 단백질 발현에 따른 세포사멸

세포 내 ARL6IP5 단백질 발현에 따른 세포사멸은 Hoechst 33342 염색을 수행하여 확인하였다. 형질주입된 SKOV-3/CisR 세포를 (1×10⁴ 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 접종하고 적절한 기간 동안 배양하였다. 각 그룹(control, Scramble, ARL6IP5++ 및 siRNA_ARL61P5)을 3개의 웰에서 3회 반복하였다. 6-웰 플레이트에 배양된 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 15분 동안 5㎍/㎖의 Hoechst 33342를 처리하였다. 마지막으로, 세포를 PBS로 2회 세척하고 역형광 현미경(Axioskop 2 plus microscope, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하여, 세포사멸 핵은 중첩되지 않은 5개 영역에서 산출되었으며, 산출된 총 핵 수의 백분율로 표현되었다.

실시예 1. ARL6IP5 재조합 단백질 처리에 따른 항암제 내성 난소암세포의 세포사멸 증가 및 세포증식 억제 효과

일반 난소암세포에 대한 시스플라틴(cisplatin, 20μM), 올라파립(olaparib, 25μM) 및 인간 ARL6IP5 재조합 단백질(2.5㎍/㎖)의 IC₅₀값을 이용하여 시스플라틴에 내성을 가지는 난소암세포(SKOV-3/CisR)의 세포사멸 증가 및 세포증식 억제 효과를 확인하였다. 그 결과, ARL6IP5 재조합 단백질의 항암제 내성 난소암세포에 대한 세포사멸 증가 및 세포증식 억제 효과를 확인한 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 시스플라틴에 내성이 있는 난소암세포(SKOV-3/CisR)를 대상으로 ARL6IP5 재조합 단백질(2.5㎍/㎖)을 단독 처리하였을 때, 기존 항암제인 시스플라틴(cisplatin, 20μM) 및 올라파립(olaparib, 25μM)을 단독 처리한 경우에 비해 세포사멸율이 2.9~4.1배 증가되고(도 1a), 세포증식 억제효과가 2.6~7.4배 증가하였으며(도 1b), ARL6IP5 단백질(2.5㎍/㎖)을 시스플라틴(20μM) 및 올라파립(25μM) 중 1개 이상의 항암제와 함께 처리하였을 때 세포사멸 증가 및 세포증식 억제 효과가 상당히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 사멸된 세포의 경우, 형태가 매끈하지 않고 찢어진 형태로 생존 세포와 구분되는데, Hoechst 33324 염색법을 이용하여 시스플라틴 내성 난소암세포(SKOV-3/CisR)에 ARL6IP5 재조합 단백질을 단독 또는 기존 항암제와 병용 처리하였을 때, 무처리 대조군(Control)에 비해 세포 밀도가 감소되고 존재하는 세포들조차 대부분 사멸된 것을 확인할 수 있었다(도 1c).

실시예 2. 항암제 내성 난소암세포 내 ARL6IP5 단백질의 발현 증가에 따른 항암제 내성 난소암세포의 세포사멸 증가 및 세포증식 억제 효과

ARL6IP5 단백질의 세포 내 발현 증가에 따른 항암제 내성 난소암세포의 세포사멸 증가 및 세포증식 억제 효과를 확인한 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 시스플라틴에 내성이 있는 난소암세포(SKOV-3/CisR)에서 ARL6IP5 단백질의 발현을 저해시킨 실험군(siRNA_ARL6IP5)의 경우에 아무것도 처리하지 않은 대조군(Control)에 비해 시스플라틴 내성 난소암세포의 증식이 증가된 반면, ARL6IP5 단백질 과발현군(ARL6IP5++)의 경우에는 시스플라틴 내성 난소암세포의 증식이 상당히 감소되는 것을 확인하였다.

또한, 시스플라틴 내성 난소암세포의 세포사멸 효과 측면에서 보면, ARL6IP5 단백질의 발현을 증가시켰을 경우(ARL6IP5++), ARL6IP5 단백질의 발현을 저해시킨 경우(siRNA_ARL6IP5)에 비해 시스플라틴(50μM 및 100μM)을 처리 후 세포 밀도가 감소되어 있고 존재하는 세포들조차 대부분은 사멸된 것을 확인할 수 있었으며(도 3a 및 3c), 세포사멸율도 상당히 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 3b 및 3d). 이를 통해 ARL6IP5 단백질의 발현을 증가시킴으로써 항암제에 대한 민감도가 증진된다는 것을 알 수 있었다.

Claims

ARL6IP5(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 5) 단백질을 유효성분으로 함유하는 플래티넘(platinum) 계열 항암제 내성 난소암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 플래티넘(platinum) 계열 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 플래티넘 계열 항암제 내성 난소암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 플래티넘 계열 항암제 내성 난소암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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