CN112263578A - Tipranavir在制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症治疗药物中的用途 - Google Patents

Tipranavir在制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症治疗药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Tipranavir在制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症治疗药物中的用途，涉及医药技术领域。本发明还公开了一种癌症的治疗药物，所述药物能够杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞；所述药物以Tipranavir为主要的活性成分，并含有药学上可接受的载体。本发明首次提供了Tipranavir可以用于制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的抗癌药物，其抗胃癌效果明显优于现有胃癌一线治疗药物(5‑FU和cisplatin联用)，且无明显毒副作用，毒副作用明显小于胃癌一线治疗药物(5‑FU和cisplatin联用)，将为靶向肿瘤干细胞的肿瘤治疗及其治愈肿瘤提供了新的药物和方案，对提高肿瘤治疗效果，改善患者生存质量具有重要意义。

Description

Tipranavir在制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症治疗药 物中的用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及Tipranavir在制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症治疗药物中的用途。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。例如，胃癌(GastricCancer,GC)是最常见的消化系统恶性肿瘤，发病率在全球范围内位列所有恶性肿瘤的第五位，死亡率位居恶性肿瘤死因第三位。我国是胃癌高发区，发病率、死亡率居高不下，均居恶性肿瘤第2位。胃癌治疗原则是以手术治疗为主的综合治疗。在我国，胃癌早诊率仍然相对低下，患者诊断时多为晚期肿瘤，失去手术治愈的机会，大多数患者由于肿瘤复发转移而死亡。
肿瘤中的肿瘤细胞可分为两类：一类为普通的肿瘤细胞，一类为肿瘤干细胞。普通肿瘤细胞具有快速分裂，对抗癌药敏感，无自我更新能力等特点。而肿瘤干细胞(Cancerstem cells,CSCs)是肿瘤中少数具有干细胞特性即自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞亚群，被认为是肿瘤中的“种子”细胞，是肿瘤发生、转移和复发，及放化疗耐受的根源，也是肿瘤治疗失败和死亡的最主要原因。其具有以下特点：通常情况下处于静息状态，对抗癌药不敏感，具有自我更新能力，即具有无限增殖的能力。在肿瘤化疗中，大量的肿瘤细胞被杀死(对化疗药敏感)，然而肿瘤干细胞会生存下来(对化疗药不敏感)。目前，很多治疗手段都能使肿瘤在短时间内得到控制和缩小，但大多数患者会出现复发和转移，从而导致治疗失败。因此，肿瘤的复发是由于肿瘤化疗药对肿瘤干细胞无效，换言之，目前的肿瘤化疗药主要是针对肿瘤细胞，而不是肿瘤干细胞。事实上，大多数肿瘤化疗药只对肿瘤细胞有效，而对肿瘤干细胞无效。因此，要达到治愈癌症的目的，不仅要消灭普通的肿瘤细胞，更重要的是通过特异性治疗杀死引起肿瘤增殖的肿瘤干细胞。但目前针对肿瘤干细胞的特异性治疗靶点缺乏，缺乏针对肿瘤干细胞的药物，尤其是同时杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的药物。因此，寻找并建立能有效杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的治疗药物对于控制进而治愈肿瘤，改善癌症患者预后有重要意义。
Tipranavir(替拉那韦，PNU-140690)为临床抗HIV药物，也是第一个批准上市的非肽类蛋白酶抑制剂，其作用机制主要为通过抑制蛋白酶而发挥作用。研究表明，Tipranavir可以抑制对市售药物产生耐药性的HIV病毒，适用于对多种蛋白酶抑制剂耐药的有病毒复制迹象的HIV感染者。但目前，Tipranavir在制备治疗肿瘤干细胞及其肿瘤细胞药物中的应用未见文献报道，未用于抗肿瘤中。
发明内容
本发明的主要目的在于提供Tipranavir(替拉那韦，PNU-140690)在用于制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症治疗药物的新用途。
因此，本发明进行了以下研究：
1、Tipranavir处理人胃癌干细胞并检测不同浓度Tipranavir及不同时间处理人胃癌干细胞，使用CCK-8试剂盒检测细胞生存情况。结果显示：Tipranavir能有效杀伤人胃癌干细胞，且呈现时间和浓度依赖性。
2、Tipranavir与目前胃癌一线化疗药物fluorouracil(氟尿嘧啶，5-FU)和cisplatin(顺铂)联用分别处理人胃癌干细胞，使用CCK-8试剂盒检测细胞生存情况，比较Tipranavir和目前胃癌一线化疗药物fluorouracil(氟尿嘧啶，5-FU)和cisplatin(顺铂)联用对胃癌干细胞的作用。结果显示：胃癌干细胞对5-FU和顺铂联用抵抗，5-FU和顺铂不能有效杀伤胃癌干细胞，而Tipranavir能有效杀伤胃癌干细胞，效果显著优于5-FU和顺铂联用。
3、Tipranavir和目前胃癌一线化疗药物fluorouracil(氟尿嘧啶，5-FU)和cisplatin(顺铂)联用分别处理四种胃癌细胞系(AGS，HGC-27，MGC-803，BGC-823)，及其正常胃上皮细胞(GES-1)，使用CCK-8试剂盒检测细胞生存情况，比较Tipranavir和目前胃癌一线化疗药物fluorouracil(氟尿嘧啶，5-FU)和cisplatin(顺铂)联用对胃癌细胞的杀伤作用及其对正常细胞的毒副作用。结果显示：Tipranavir杀伤胃癌细胞的作用也显著优于5-FU和顺铂联用，且对正常胃上皮细胞无毒副作用，而5-FU和顺铂联用存在对正常胃上皮细胞的毒副作用。
4、Tipranavir处理不同癌细胞系，包括肺癌细胞(PC9)，前列腺癌细胞(PC3)，紫杉醇耐药的前列腺癌细胞(PC3/Tax)，食管癌细胞(KYSE180和KYSE520)，结直肠癌细胞(HCT116)，乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，肝癌细胞(Huh7)，使用CCK-8试剂盒检测细胞生存情况。结果表明：Tipranavir能有效杀伤各种肿瘤细胞，包括肺癌、前列腺癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌，表明Tipranavir对其他各种肿瘤具有抗癌作用，可用做制备广谱肿瘤治疗药物；同时，Tipranavir对紫杉醇耐药的前列腺癌细胞(PC3/Tax)的杀伤作用显著强于普通前列腺癌细胞(PC3)，表明Tipranavir对紫杉醇耐药的前列腺癌病人具有显著作用，可用做制备紫杉醇耐药的前列腺癌治疗药物。
5、裸鼠成瘤实验检测动物水平上Tipranavir抗胃癌干细胞作用，并比较其与一线胃癌化疗药物5-FU和cisplatin(顺铂)联用治疗胃癌干细胞移植瘤作用。人胃癌干细胞注射于裸鼠皮下，待其成瘤后Tipranavir或5-FU和cisplatin(顺铂)联用腹腔注射，通过检测移植瘤体积，瘤重及瘤体大小分析其对人胃癌干细胞始动的胃癌发生和生长的作用。结果显示：Tipranavir处理能明显抑制移植瘤的生长，其作用显著优于5-FU和cisplatin(顺铂)联用，且对肺、肝脏、脾脏、肾、心脏组织无明显毒副作用。而5-FU和cisplatin(顺铂)联用具有肾毒性，存在对肾脏的毒副作用。
6、凋亡检测实验分析Tipranavir杀伤胃癌干细胞的作用机制，结果表明：Tipranavir通过诱导胃癌干细胞凋亡(apoptosis)实现杀伤胃癌干细胞。
7、RNA-seq分析比较Tipranavir处理和不处理的胃癌干细胞基因表达变化，寻找Tipranavir处理胃癌干细胞的差异基因，并通过qPCR，Western blotting验证相关差异基因的表达，结果表明：Tipranavir处理胃癌干细胞显著上调IL24表达，IL24可能为Tipranavir作用靶点。IL24已被证实为肿瘤细胞特异性抑癌基因，其高表达能显著抑制肿瘤生长，且其在正常细胞高表达对正常细胞无影响。
8、分子机制上，Tipranavir杀伤胃癌干细胞的分子机制具体为：Tipranavir通过上调IL24，进而上调Bax和Bak蛋白，激活细胞线粒体凋亡通路(mitochondrial apoptoticpathway)，诱导胃癌干细胞凋亡(apoptosis)，从而杀伤胃癌干细胞。
根据上述研究结果，本发明确认了Tipranavir具有杀伤胃癌干细胞和胃癌细胞，及其它肿瘤干细胞和肿瘤细胞的新作用，可以用于制备抗胃癌及其它抗肿瘤治疗药物。
本发明提供了Tipranavir在制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症治疗药物中的用途。
进一步地，本发明提供了Tipranavir在制备抑制肿瘤干细胞和肿瘤细胞增殖药物中的用途。
进一步地，本发明还提供了Tipranavir在制备降低肿瘤干细胞和肿瘤细胞体内成瘤能力药物中的用途，其包括减少肿瘤干细胞形成的肿瘤体积、减轻瘤重、以及减缓肿瘤干细胞形成肿瘤的生长速度，同时，其对肺、肝脏、脾脏、肾、心脏组织无明显毒副作用。
优选地，Tipranavir通过诱导胃癌干细胞凋亡从而杀伤胃癌干细胞来治疗癌症。
优选地，Tipranavir通过线粒体凋亡途径诱导胃癌干细胞凋亡，进而杀伤胃癌干细胞，即，Tipranavir通过上调IL24，促进线粒体中Cytochrome c的释放并促进Cleavedcaspas9、Cleaved caspas7、Cleaved caspas3、Cleaved PARP的表达，同时，上调Bax和Bak蛋白。
优选地，Tipranavir浓度依赖性地杀伤人胃癌干细胞，且对正常胃上皮细胞无毒副作用。
优选地，Tipranavir用于制备紫杉醇耐药的前列腺癌治疗药物。
更进一步地，本发明还提供一种癌症的治疗药物，所述药物能够杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞；所述药物以Tipranavir为主要的活性成分，并含有药学上可接受的载体。
本发明所述的载体为药学上可以接受的载体，其指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质。它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
优选的，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
优选的，所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明提到的肿瘤干细胞癌症包括胃癌以及其他癌症。
进一步地，由于胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，具有高复发率和低治愈率，且死亡率很高。因此，对其生存调控机制及分子靶向治疗进行的研究可作为其他肿瘤的实验依据和理论参考。同时，不同实体瘤的肿瘤干细胞具有共同的特点：均具有自我更新、增殖和自我分化的能力，都能导致体内成瘤性等，不同实体瘤干细胞具有相同或相似的分子调控通路。因此，根据本发明的记载和本领域的公知常识，可以推测Tipranavir同样对除胃癌干细胞以外的其他肿瘤干细胞和肿瘤细胞具有抗癌作用，用于制备抗肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症治疗药物。
所述肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症包括胃癌、肺癌、前列腺癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌。
优选地，所述肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症为胃癌。
本发明的有益效果在于：本发明首次提供了Tipranavir可以用于制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的抗癌药物，其抗胃癌效果明显优于现有胃癌一线治疗药物(5-FU和cisplatin联用)，且无明显毒副作用，毒副作用明显小于胃癌一线治疗药物(5-FU和cisplatin联用)，将为靶向肿瘤干细胞的肿瘤治疗及其治愈肿瘤提供了新的药物和方案，对提高肿瘤治疗效果，改善患者生存质量具有重要意义。
附图说明
图1为CCK8检测用Tipranavir处理胃癌干细胞(GCSC1和GCSC2)的细胞增殖和活性情况；
图2为CCK8检测分别用Tipranavir、fluorouracil(氟尿嘧啶，5-FU)和cisplatin(顺铂)处理胃癌干细胞(GCSC1和GCSC2)的细胞增殖和活性情况，Control为对照组；
图3为CCK8检测分别用Tipranavir、fluorouracil(氟尿嘧啶，5-FU)和cisplatin(顺铂)处理胃癌细胞株(AGS，HGC-27，MGC-803，BGC-823)和正常胃上皮细胞的细胞增殖和活性情况；
图4为CCK8检测用Tipranavir处理肺癌细胞(PC9)、前列腺癌细胞(PC3)、紫杉醇耐药的前列腺癌细胞(PC3/Tax)、食管癌细胞(KYSE180和KYSE520)、结直肠癌细胞(HCT116)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)及肝癌细胞(Huh7)的细胞增殖和活性情况，Control为对照组；
图5Tipranavir抑制裸鼠中胃癌干细胞移植瘤生长：图5a小鼠体内成瘤实验；图5b为Tipranavir组、5-FU和顺铂联用组(5-FU+Cis)和对照组(Control)处理的胃癌干细胞形成的移植瘤形状变化；图5c为Tipranavir组、5-FU和顺铂联用组(5-FU+Cis)和对照组(Control)处理的胃癌干细胞形成的移植瘤重量变化；图5d为Tipranavir组、5-FU和顺铂联用组(5-FU+Cis)和对照组(Control)处理的胃癌干细胞形成的移植瘤生长曲线；图5e为染色检测各给药组中肺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏器组织的病理学特征；图5f为给药后的小鼠体重变化；图5g为各给药组中肺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏器组织的脏器指数；图5h为Tipranavir组、5-FU和顺铂联用组(5-FU+Cis)和对照组(Control)处理的胃癌干细胞形成的移植瘤瘤体的WB分析；
图6Tipranavir通过诱导胃癌干细胞凋亡实现杀伤胃癌干细胞：图6a为Tipranavir处理胃癌干细胞(GCSC1和GCSC2)的胃癌干细胞(GCSC1和GCSC2)凋亡形态，Control为对照组；图6b、图6c为Annexin V-FITC/PI标记流式分析胃癌干细胞(GCSC1和GCSC2)的细胞凋亡率；图6d、图6e为TUNEL检测分析胃癌干细胞(GCSC1和GCSC2)的细胞凋亡；图6f为蛋白质免疫印迹法检测Cytochrome c的分布和凋亡标志物(Bax、Bak、Cleavedcaspas9、Cleaved caspas7、Cleaved caspas3、Cleaved PARP)的表达；
图7Tipranavir通过上调IL24，进而上调Bax和Bak蛋白，激活细胞线粒体凋亡通路，诱导胃癌干细胞凋亡，从而杀伤胃癌干细胞：图7a、图7b用RNA-seq分析比较Tipranavir处理和不处理的胃癌干细胞基因表达变化，寻找Tipranavir处理胃癌干细胞的差异基因，发现Tipranavir胃癌干细胞显著上调IL24表达；图7c、图7d为分别用qPCR、Westernblotting验证了Tipranavir处理的胃癌干细胞显著上调IL24表达；图7e，图7f胃癌干细胞中IL24表达随Tipranavir浓度的升高而增加，呈现浓度依赖性表达；
图8胃癌干细胞中siRNA干扰敲低IL24后，再用Tipranavir处理胃癌干细胞，证实Tipranavir通过IL24-Bax/Bak线粒体凋亡通路诱导胃癌干细胞凋亡，从而杀伤胃癌干细胞：图8a胃癌干细胞中siRNA干扰敲低IL24后，显著缓解Tipranavir对胃癌干细胞的杀伤作用；图8B用Western blotting检测Tipranavir处理胃癌干细胞中siRNA干扰敲低IL24后的胃癌干细胞(siIL24-1、siIL24-2)的相关蛋白表达情况，未敲IL24的胃癌干细胞(siNC)为对照组；图8c胃癌干细胞中过表达IL24对胃癌干细胞的影响，GCSC-IL24为IL24过表达组；GCSC-vec为IL24正常表达的对照组；图8d胃癌干细胞中过表达IL24，对胃癌干细胞中线粒体凋亡通路蛋白及其凋亡标志物表达的影响，GCSC-IL24为IL24过表达组；GCSC-vec为IL24正常表达的对照组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
可以理解地，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明所用的主要材料如下：
Atazanavir,Darunavir,Fosamprenavir,Tipranavir,5-FU and cisplatin购自Med Chemexpress公司；Poloxamer 188(F68)购自Shenyang Jiqi PharmaceuticalCompany公司；RNA抽提试剂盒(RNeasy Mini Kit)购自QIAGEN公司；逆转录试剂盒、Tag DNA聚合酶购自Life Technology公司；逆转录酶M-MLV、PCR试剂盒购自TIANGEN公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo Fischer Scientific公司；WB化学发光显色底物(ImmobilonWestern Chemiluminescent HRP substrate)购自Millipore公司；WB化学发光显色底物(Super Signal West Chemiluminescent substrate)购自Thermo Fischer Scientific公司；CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所；FITC-annexin V/PI凋亡检测试剂盒(FITC AnnexinV Apoptosis Detection kit)购自BD Biosciences公司；TUNEL凋亡检测试剂盒(InsituCell Death Detection Kit)购自Roche Molecular Biochemicals公司；线粒体抽提试剂盒(Mitochondria Isolation Kit)购自Thermo Fischer Scientific公司；细胞转染试剂盒(Lipofectamine 3000)购自Thermo Fischer Scientific公司；一抗anti-Bcl-2,anti-Bcl-xL,anti-Bax,anti-Bak,anti-Cleaved caspase-9,anti-Cleaved caspase-7,anti-Cleaved caspase-3,anti-Cleaved PARP,anti-GAPDH,anti-VDAC购自Cell SignalingTechnology公司；anti-IL-24购自Proteintech公司；anti-Cytochrome C购自BDBiosciences公司；二抗Anti-mouse、二抗Anti-rabbit购自Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo Fischer Scientific公司；限制性内切酶EcoRI、MluI购自NEB公司；HSP90抑制剂17-AAG、SNX2112购自Selleck Chemicals公司；DMSO、嘌呤霉素(puromycin)、强力霉素(Doxycycline，Dox)、一抗Anti-β-actin购自Sigma公司；一抗Anti-Clusterin-α、二抗Anti-goat购自Santa Cruz Biotechnologies公司；一抗Anti-HSP90购自Abcam公司；一抗Anti-Sox2、anti-Cleaved PARP、anti-pSer807/Ser811-Rb、anti-AKT、anti-CDK4、anti-HER2、anti-c-Raf、anti-EGFR、anti-IGF-1R、二抗Anti-mouse、二抗Anti-rabbit购自Cell Signaling Technology公司。
本发明涉及到的统计分析方法是采用SPSS12.0统计学软件，实验结果以均值±标准差(x±s)表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，p＜0.05认为具有统计学差异，并用“*”表示。图1-8中，*表示有统计学差异(p＜0.05)；**表示有显著差异(p＜0.01)；***表示有明显显著差异(p＜0.001)；****表示有极为显著差异(p＜0.0001)。
本发明实施例所用肿瘤干细胞和肿瘤细胞均购自中科院生化细胞所细胞库，细胞培养方法为本领域常规方法。
本发明实施例中涉及的Western blot检测方法，如无特殊说明，其具体操作如下：
RIPA细胞裂解液提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白样品经10％SDS-PAGE电泳后转膜印迹，封闭，一抗4℃过夜孵育，洗膜加二抗，室温孵育1h，洗膜后用ECL(Super Signal West chemiluminescent substrates，Thermo Fisher Scientific)显色。
本发明实施例中涉及的TUNEL检测GCSC细胞凋亡方法，如无特殊说明，其具体操作如下：
采用罗氏公司(Roche Molecular Biochemicals)生产的原位末端标记试剂盒(Insitu Cell Death Detection Kit，Cat.No.11684817910)，参照试剂盒说明书进行：⑴4％多聚甲醛固定1h，PBS缓冲液漂洗；⑵3％H2O2阻断液室温10min，PBS漂洗；⑶0.1％TritonX-100渗透液冰上作用2min，PBS漂洗；⑷加50μl TUNEL反应混合液，湿盒中37℃作用1h，PBS漂洗；⑸含DAPI抗猝灭剂封片，显微镜观察记录，所有细胞核呈蓝色，凋亡细胞呈绿色荧光，在光镜下任选一定数目的视野进行凋亡细胞计数，统计凋亡细胞(FITC绿色荧光细胞)占所有细胞(DAPI染色的蓝色细胞)的百分率。
实施例1：Tipranavir低浓度时就能有效杀伤人胃癌干细胞，且呈现时间和浓度依赖性。
取两株不同胃癌病人来源的胃癌干细胞(记为GCSC1和GCSC2)，细胞浓度均为(1×105cells/mL，100μl)，接种于96孔板，每组3个复孔，分别用不同浓度Tipranavir(0uM,0.5uM,1.0uM,2.5uM,5.0uM,10uM,20uM,40uM,100uM)处理GCSC1和GCSC2细胞24hr,48hr,72hr，DMSO作为对照。分别加入CCK-8测定波长450nm的吸光值(A450)，绘制各组细胞生长曲线。检测Tipranavir对胃癌干细胞(GCSC1和GCSC2)的杀伤作用，并计算其IC50，结果见图1(图1，cell viability细胞活性；concentration浓度)。
结果表明Tipranavir低浓度时能有效杀伤人胃癌干细胞(GCSC1和GCSC2)，且呈现时间和浓度依赖性，IC50分别为4.7uM和6.4uM。
实施例2：Tipranavir杀伤胃癌干细胞的作用显著优于现有一线用药5-FU和顺铂联用。
取两株不同胃癌病人来源的胃癌干细胞(记为GCSC1和GCSC2)(1×105cells/mL，100μl)接种于96孔板，每组3个复孔，分别用Tipranavir(10uM)和5-FU+cisplatin(5-FU:2.5μM；cisplatin:4μM)处理GCSC1和GCSC2细胞72hr，DMSO作为对照。分别加入CCK-8测定波长450nm的吸光值(A450)，绘制各组细胞生长曲线。比较Tipranavir和5-FU+cisplatin对胃癌干细胞(GCSC1和GCSC2)的杀伤作用。结果见图2(图2，cell viability细胞活性)。
结果表明Tipranavir杀伤胃癌干细胞的作用显著优于现有胃癌一线用药5-FU和顺铂联用。
实施例3：Tipranavir能有效杀伤胃癌细胞，其作用也显著优于5-FU和顺铂联用，且对正常胃上皮细胞无毒副作用，而5-FU和顺铂联用存在对正常胃上皮细胞的毒副作用。
取四种胃癌细胞株(AGS，HGC-27，MGC-803，BGC-823)和正常胃上皮细胞系(GES-1)(1×105cells/mL，100μl)接种于96孔板，每组3个复孔，分别用Tipranavir(10uM)和5-FU+cisplatin(5-FU:2.5μM；cisplatin:4μM)处理各株细胞72hr，DMSO作为对照。分别加入CCK-8测定波长450nm的吸光值(A450)，绘制各组细胞生长曲线。比较Tipranavir和5-FU+cisplatin对胃癌细胞(AGS,HGC-27,MGC-803,BGC-823)和正常胃上皮细胞(GES-1)的杀伤作用及毒副作用。结果见图3(图3，cell viability细胞活性，+表示有，-表示无)。
结果表明Tipranavir能有效杀伤各种胃癌细胞，其作用也显著优于5-FU和顺铂联用，且对正常胃上皮细胞无毒副作用，而5-FU和顺铂联用存在对正常胃上皮细胞的毒副作用。
以上结果表明，Tipranavir能有效杀伤胃癌干细胞和胃癌细胞，显著优于5-FU和顺铂联用，且对正常胃上皮细胞无毒副作用。
实施例4：Tipranavir对其他不同癌细胞，包括肺癌细胞(PC9)，前列腺癌细胞(PC3)，紫杉醇耐药的前列腺癌细胞(PC3/Tax)，食管癌细胞(KYSE180和KYSE520)，结直肠癌细胞(HCT116)，乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，肝癌细胞(Huh7)各种肿瘤细胞具有抗癌作用，可用做制备广谱肿瘤治疗药物；同时，Tipranavir对紫杉醇耐药的前列腺癌细胞(PC3/Tax)的杀伤作用显著强于普通前列腺癌细胞(PC3)，可用做制备紫杉醇耐药的前列腺癌治疗药物。
取肺癌细胞(PC9)，前列腺癌细胞(PC3)，紫杉醇耐药的前列腺癌细胞(PC3/Tax)，食管癌细胞(KYSE180和KYSE520)，结直肠癌细胞(HCT116)，乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，肝癌细胞(Huh7)(1×105cells/mL，100μl)接种于96孔板，每组3个复孔，分别用Tipranavir(10uM)和5-FU+cisplatin(5-FU:2.5μM；cisplatin:4μM)处理各株细胞72hr，DMSO作为对照。分别加入CCK-8测定波长450nm的吸光值(A450)，绘制各组细胞生长曲线。比较Tipranavir和5-FU+cisplatin对各种肿瘤细胞的杀伤作用。结果见图4(图4，cellviability细胞活性)。
结果表明Tipranavir能有效杀伤胃癌、肺癌、前列腺癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌等各种肿瘤细胞，其作用也显著优于5-FU和顺铂联用，且Tipranavir对紫杉醇耐药的前列腺癌细胞(PC3/Tax)的杀伤作用显著强于普通前列腺癌细胞(PC3)，其对紫杉醇耐药的前列腺癌病人具有显著作用。
本实施例表明Tipranavir对胃癌、肺癌、前列腺癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌等各种肿瘤细胞具有抗癌作用，可用作广谱肿瘤治疗药物，同时，Tipranavir对紫杉醇耐药的前列腺癌细胞(PC3/Tax)的杀伤作用显著强于普通前列腺癌细胞(PC3)，可用做制备紫杉醇耐药的前列腺癌治疗药物。
实施例5：Tipranavir能显著抑制裸鼠中胃癌干细胞移植瘤生长，其作用显著优于5-FU和顺铂联用，且无明显毒副作用。而5-FU和cisplatin(顺铂)联用具有肾毒性，存在对肾脏的毒副作用。
雌性Balb/C裸鼠(5周龄，体重16.0±2.0g)，培养于无菌环境。小鼠分为3组，Tipranavir处理组(Tipranavir)、5-FU和顺铂联用组(5-FU+Cis)和对照组(Control)，每组4只，侧肋皮下注射含4x104GCSC细胞悬液，建立皮下移植瘤模型。10天待其成瘤后开始相关处理，其中Tipranavir处理组(Tipranavir)腹腔注射Tipranavir(F68 solution：1mg/mlin normal saline，25mg/kg/mouse)；5-FU和顺铂联用处理组(5-FU+Cis)腹腔注射5-FU+Cis(5FU:20mg/kg/mouse in F68 solution；cisplatin:2mg/kg/mouse in F68solution)；对照组(Control)腹腔注射F68 solution(1mg/ml in normal saline)，每2天注射一次。密切观察皮下肿瘤生长情况，每2天用游标卡尺测量肿瘤大小，按公式：V＝1/2长径×短径2，计算肿瘤体积，并绘制皮下移植瘤生长曲线。25天处死老鼠取瘤体拍照并称重，取心、肝、脾、肺、肾内脏称重，并固定做免疫组化分析。结果见图5。
图5中结果表明体内成瘤实验发现，较对照组(Control)及5-FU和顺铂联用处理组(5-FU+Cis)相比，Tipranavir处理(Tipranavir)的胃癌干细胞形成的移植瘤明显缩小(图5b)，瘤重显著减轻(图5c)，肿瘤生长曲线也表明Tipranavir处理(Tipranavir)的胃癌干细胞形成的移植瘤生长明显抑制(图5d)。而比较5-FU和顺铂联用处理组(5-FU+Cis)和对照组(Control)发现，两者不论在移植瘤大小、瘤重及生长无明显差异，表明5-FU和顺铂联用对胃癌干细胞无杀伤或抑制作用。进一步，毒副作用分析表明，Tipranavir对心、肝、脾、肺、肾重要脏器无明显毒副作用(图5e)，亦对小鼠体重无影响，不影响小鼠生长(图5f)，脏器指数也证实Tipranavir对心、肝、脾、肺、肾重要脏器无明显毒副作用(图5g)；而5-FU和顺铂联用处理显著影响小鼠，影响小鼠生长(图5f)，脏器指数也证实5-FU和顺铂联用对肾有明显毒副作用，具有肾毒性(图5g)。进一步，对瘤体进行WB分析表明，Tipranavir上调IL24，Bak表达，上调Cleaved caspase3,Cleaved PARP，激活线粒体凋亡通路，诱导凋亡，从而达到抑制肿瘤生长(图5h)。
实施例6：Tipranavir通过诱导胃癌干细胞凋亡(apoptosis)实现杀伤胃癌干细胞。
Tipranavir处理胃癌干细胞导致细胞质浓缩，体积变小，细胞核断裂分散，呈现凋亡小体形态，胃癌干细胞凋亡(图6a)；Annexin V-FITC/PI标记流式分析细胞凋亡表明，凋亡细胞显著增加，Tipranavir显著诱导胃癌干细胞凋亡(图6b,6c)；TUNEL检测也证实Tipranavir极为显著诱导胃癌干细胞凋亡(图6d、6e)；Western blot也发现Tipranavir处理胃癌干细胞中线粒体凋亡通路蛋白及其凋亡标志物(Bax、Bak、Cleaved caspas9、Cleaved caspas7、Cleaved caspas3、Cleaved PARP)明显增加，线路体凋亡通路激活标志Cytochrome c从线粒体流进细胞质，线粒体中Cytochrome c减少(图6f)。因此，Tipranavir通过线粒体凋亡通路诱导胃癌干细胞凋亡(apoptosis)实现杀伤胃癌干细胞。
实施例7：分子机制上：Tipranavir通过上调IL24，进而上调Bax和Bak蛋白，激活细胞线粒体凋亡通路(mitochondrial apoptotic pathway),诱导胃癌干细胞凋亡(apoptosis),从而杀伤胃癌干细胞。
RNA-seq分析比较Tipranavir处理和不处理的胃癌干细胞基因表达变化，寻找Tipranavir处理胃癌干细胞的差异基因，发现Tipranavir胃癌干细胞显著上调IL24表达(图7a,7b)，并通过qPCR(图7c)，Western blotting得到验证(图7d)。且胃癌干细胞中IL24表达随Tipranavir浓度的升高而增加，呈现浓度依赖性表达(图7e,7f)。IL24已被证实为肿瘤细胞特异性抑癌基因，其高表达能显著抑制肿瘤生长，且其在正常细胞高表达对正常细胞无影响。
进一步在胃癌干细胞中用siRNA干扰敲低IL24，通过Tipranavir细胞活性实验显示，敲低IL24之后，显著缓解Tipranavir对胃癌干细胞的杀伤作用(8a)；WB检测显示，敲低IL24之后，显著降低Tipranavir引起的线粒体凋亡通路蛋白及其凋亡标志物(Bax、Bak、Cleaved caspas9、Cleaved caspas7、Cleaved caspas3、Cleaved PARP)的上调，抑制线粒体中Cytochrome c流向细胞质，显著抑制线粒体凋亡通路的活化(8b)。而在胃癌干细胞中过表达IL24，不加入Tipranavir，同样可显著抑制胃癌干细胞的生长，诱导胃癌干细胞凋亡(8c，GCSC-IL24为IL24过表达组；GCSC-vec为IL24正常表达的对照组)；同样地，胃癌干细胞中线粒体凋亡通路蛋白及其凋亡标志物(Bax、Bak、Cleaved caspas9、Cleaved caspas7、Cleaved caspas3、Cleaved PARP)明显增加，促进线粒体中Cytochrome c流向细胞质，激活线粒体凋亡通路，结果见图8d(GCSC-IL24为IL24过表达组；GCSC-vec为IL24正常表达的对照组)，其与Tipranavir处理胃癌干细胞结果相似(8b)。因此，Tipranavir通过IL24-Bax/Bak线粒体凋亡通路诱导胃癌干细胞凋亡(apoptosis)，从而杀伤胃癌干细胞。
综上所述，本发明首次提供了Tipranavir可以用于制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的抗癌新作用，其抗胃癌效果明显优于现有胃癌一线治疗药物(5-FU和cisplatin联用)，且无明显毒副作用，毒副作用明显小于胃癌一线治疗药物(5-FU和cisplatin联用)，可用于制备抗肿瘤治疗药物，解决了目前胃癌一线治疗药物无法根除胃癌及复发耐药的短板，为治愈胃癌及提高胃癌患者的生存率提供新的方向。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.Tipranavir在制备杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症治疗药物中的用途。
2.Tipranavir在制备抑制肿瘤干细胞和肿瘤细胞增殖药物中的用途。
3.Tipranavir在制备降低肿瘤干细胞和肿瘤细胞体内成瘤能力药物中的用途。
4.如权利要求1～3任一项所述用途，其特征在于，所述肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症包括胃癌、肺癌、前列腺癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌。
5.如权利要求4所述用途，其特征在于，所述肿瘤干细胞和肿瘤细胞的癌症为胃癌。
6.如权利要求5所述用途，其特征在于，Tipranavir通过诱导胃癌干细胞凋亡从而杀伤胃癌干细胞来治疗癌症。
7.如权利要求6所述用途，其特征在于，Tipranavir通过线粒体凋亡途径诱导胃癌干细胞和胃癌细胞凋亡，进而杀伤胃癌干细胞和胃癌细胞，即，Tipranavir通过上调IL24，促进线粒体中Cytochrome c的释放并促进Cleaved caspas9、Cleaved caspas7、Cleavedcaspas3、Cleaved PARP的表达，同时，上调Bax和Bak蛋白。
8.如权利要求1所述用途，其特征在于，Tipranavir呈时间和浓度依赖性地杀伤人胃癌干细胞和胃癌细胞，且对正常胃上皮细胞无毒副作用。
9.如权利要求1～3任一项所述用途，其特征在于，Tipranavir用于制备紫杉醇耐药的前列腺癌治疗药物。
10.一种癌症的治疗药物，其特征在于，所述药物能够杀伤肿瘤干细胞和肿瘤细胞；所述药物以Tipranavir为主要的活性成分，并含有药学上可接受的载体。
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