MX2008015259A - Composicion farmaceutica para el tratamiento de infecciones virales y/o enfermedades tumorales por medio de la inhibicion del plegamiento proteico y la degradacion proteica. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que como componentes activos contiene al menos un inhibidor de protesoma y un inhibidor de las enzimas de plegamiento de proteínas. Estos agentes son adecuados para el tratamiento de infecciones agudas y crónicas con virus patógenos para el humano y para los animales.

Description

COMPOSICION FARMACEUTICA PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES VIRALES Y/O ENFERMEDADES TUMORALES POR MEDIO DE LA INHIBICIÓN DEL PLEGAMIENTO PROTEICO Y LA DEGRADACIÓN PROTEICA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que como componentes activos contiene por lo menos un inhibidor de proteosoma y un inhibidor de las enzimas de plegamiento de proteínas. Estos agentes son adecuados para el tratamiento de infecciones agudas y crónicas con virus patógenos para el humano y para los animales. A estos virus pertenecen en especial los promotores de enfermedades infecciosas como SIDA, hepatitis, fiebre hemorrágica, SARS, varicela, sarampión, polio y gripa. La invención tiene como objetivos, que por un lado, los agentes cuyos ingredientes activos contienen inhibidores del plegamiento de proteínas. Estos incluyen inhibidores de enzimas de plegamiento celulares (chaperones enzimáticos ) , como también sustancias que interfieren con el plegamiento de proteínas por medio de chaperones químicos. Por otro lado, esos agentes contienen componentes que interfieren con el sistema ubiquitina-proteosoma, en especial agentes que inhiben el proteosoma 26S. Al combinar esos agentes terapéuticos, ya sea por separado o en forma simultanea, pueden interferir con la eficiencia de la biosintesis de proteínas y la degradación de proteínas plegadas de forma errónea. En la suma de estos efectos, también es posible dañar sistemáticamente la vitalidad de las células tumorales degeneradas y/o células infectadas con virus de manera aguda y/o crónica, y con esto, se puede provocar la muerte celular (apoptosis) programada. Los campos de aplicación son los tratamientos de infecciones virales y/o de enfermedades tumorales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los inhibidores de las enzimas de plegamiento de proteínas son conocidos por el documento WO 2005/063281 A2. Los inhibidores de proteosoma son descritos tanto para el tratamiento de enfermedades tumorales (por ejemplo US 6,083,903) como también para el tratamiento de infecciones virales (WO 02/30455) . Una combinación de inhibidores de enzimas de plegamiento de las proteínas e inhibidores de proteosoma no había sido descrita hasta ahora. Sólo la combinación de inhibidores de proteasa no selectivos para proteosomas con enzimas de plegamiento de proteínas se menciona en el documento WO 2005/063281 A2.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se propone el objetivo de presentar nuevas composiciones farmacéuticas para el tratamiento de infecciones virales y/o de enfermedades tumorales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El objetivo se logró de acuerdo con las características de las reivindicaciones. La combinación según la invención de inhibidores de enzimas de plegamiento de proteínas e inhibidores de proteosoma ha sido considerada en el estado de la técnica. Según la invención se preparó una composición farmacéutica que como componentes activos contiene por lo menos un inhibidor del sistema ubiquitina-proteosoma y un inhibidor de los sistemas de plegamiento de proteínas, o un método para influir sobre el plegamiento de proteínas. El inhibidor de las enzimas de plegamiento de proteínas consiste preferentemente de al menos un inhibidor de los chaperones celulares o al menos una sustancia química que influye directamente sobre el plegamiento de proteínas (anti-chaperón químico) . Como métodos para influir sobre el plegado de las proteínas sirve preferentemente la hipertermia local. Otra modalidad preferida de la invención consiste en que como inhibidores de los chaperones celulares o de anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que: a) inhiben, regulan o influyen de otra forma sobre el plegamiento y la maduración proteolítica de proteínas virales y así inhiben la liberación y o replicación de virus, en especial de promotores de enfermedades infecciosas como SIDA, hepatitis, fiebre hemorrágica, SARS, varicela, sarampión, polio, infecciones por virus de herpes o gripa, o b) interfieren con la reproducción de células dañadas, en especial células tumorales, realizándose esto por medio de la acumulación de proteínas plegadas erróneamente para provocar la muerte celular programada. La composición farmacéutica según la invención está caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o anti-chaperones químicos se utilizan sustancias, que especialmente influyen sobre las actividades enzimáticas de los sistemas de plegado moleculares de las células anfitrionas. Las células eucarióticas superiores absorben esos inhibidores o sustancias y después de la absorción celular, bloquean el plegado de las proteínas con estructura viral y de proteínas de células tumorales. Los inhibidores o sustancias pueden administrarse de diferentes forma in vivo ya sea por vía oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea o en forma encapsulada, con o sin modificaciones que porten especificidad celular, presenten una reducida citotoxicidad debido al uso de un régimen determinado de aplicación y/o dosis, produzcan efectos secundarios reducidos o nulos, presenten un tiempo de vida medio metabólico relativamente elevado y una velocidad de aclaramiento relativamente reducida en el organismo. La composición farmacéutica según la invención está además caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que: a) se aislan en forma natural de microorganismos u otras fuentes naturales o b) se producen por medio de modificaciones químicas a partir de sustancias naturales o c) se producen de forma totalmente sintética o d) se sintetizan in vivo por medio de procedimientos terapéuticos genéticos. Los inhibidores de los chaperones celulares o los anti-chaperones químicos interfieren con los procesos altamente organizados de ensamblado y maduración proteolítica de las proteínas con estructura viral y evitan así la liberación y la producción de virus derivados infecciosos. Además, esas sustancias regulan, interfieren o bloquean el plegado de las proteínas virales y/o de las proteínas específicas a los tumores, de tal forma que interfieren con los procesos posteriores de replicación como ensamblado, formación de brotes, maduración proteolítica y liberación del virus. El procesamiento proteolítico de las proteínas precursoras de las poliproteínas queda interferido. Además se bloquea la actividad de las proteosomas virales. Otra modalidad preferida de la invención consiste en que como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que interfieren con las actividades de las proteasas celulares y/o de las enzimas, como por ejemplo ligasas, cinasas, hidrolasas, enzimas de glicosilación, fosfatasas, ADNasas, ARNasas, helicasas y transferasas , que participan en la maduración viral. Los inhibidores de los chaperones celulares o anti-chaperones químicos según la invención presentan un amplio espectro de acción y pueden, por lo tanto, utilizarse como nuevos virustáticos de amplio espectro para la profilaxis y/o la terapia de diferentes infecciones virales. La composición farmacéutica está caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias las cuales bloquean o inhiben a los chaperones celulares, como las proteínas de choque térmico (heat shock proteins (hsp) ) , en especial las actividades de las proteínas de choque térmico Hsp27, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp72, Hsp73, Hsp90, Hspl04 y Hsc70. Como inhibidores de los chaperones celulares pueden utilizarse sustancias que pertenecen a las siguientes clases de sustancias y sus derivados: Geldanamicina (inhibe Hsp90), Radicicol (inhibidor de tirosina-cinasa; inhibe Hsp90), Desoxiespergualina (inhibe Hsc70 y Hsp90), 4-PBA (butirato de 4-fenilo; sub-regulación de la expresión de proteína y de mARN de Hsc70) , Herbimicina A (inhibidor de tirosina-cinasa con inducción de Hsp72/73), Epolactaeno (inhibidor de Hsp60), Scythe y Reaper (inhiben Hsp70) , Artemisinina (inhibidor de Hsp90), CCT0180159 (como inhibidor de pirazol de Hsp90) y SNX-2112 (inhibidor de Hsp90) , Radanamicina (quimera macrolida de Radicicol y Geldanamicina), Novobiocina (inhibidor de Hsp90), Quercetina (inhibidor de la expresión de Hsp70). Como anti-chaperones químicos pueden utilizarse sustancias las cuales regulan, interfieren o bloquean la conformación de las proteínas y el plegamiento de proteínas virales y/o específicas para los tumores. A estos pertenecen, por ejemplo, sustancias como glicerol, trimetilamina, betaina, trehalosa o agua deuterizada (D20) . Además pueden utilizarse sustancias adecuadas para el tratamiento o terapia de inhibición de infecciones con diferentes patógenos humanos o también virus patógenos animales, o sustancias que son adecuadas para el tratamiento, la terapia y la inhibición de infecciones con promotores de enfermedades infecciosas crónicas como SIDA (VIH-1 y VIH-2), de hepatitis (HCV y HBV) , de los promotores del "síndrome respiratorio agudo severo" (SARS) , el SARS-CoV ( coronavirus ) , de virus de varicela, de promotores de la fiebre hemorrágica viral (VHF) como los virus de Ébola como representantes de la familia de los Filoviridae; de los promotores de gripa como los virus de la influenza A. A estos pertenecen ciclosporina A y/o Tacrolimus . La composición farmacéutica según la invención está además caracterizada porque los inhibidores de UPS comprenden por lo menos una sustancia que: a) en forma de inhibidores de proteosoma, especialmente influye sobre las actividades enzimáticas del complejo de proteosoma 26S completo y de la estructura de proteosoma catalíticamente activo 20S que no está no ensamblado con sub-unidades reguladoras, o b) especialmente inhibe el efecto de las ligasas de ubiquitina o c) especialmente inhibe el efecto de las hidrolasas de ubiquitina o d) especialmente inhibe el efecto de las 52-563 enzimas activantes de ubiquitina o e) especialmente inhibe la mono-ubiquitinilización de proteínas o f) especialmente inhibe la poli-ubiquitinilización de proteínas. Los inhibidores de proteosoma se toman de eucariontes superiores y después de la absorción celular interactúan con las sub-unidades catalíticas del proteosoma y bloquean reversible o irreversiblemente así todas o algunas de las actividades proteolíticas del proteosoma, las actividades hidrolizantes de los péptidos de tripsina, quimiotripsina y/o postglutamilo del complejo de proteosoma 26S o también de 20S. Como inhibidores de proteosoma se utilizan sustancias que a) se aislan en forma natural de microorganismos u otras fuentes naturales; o b) se obtienen por medio de modificaciones químicas de sustancias naturales; o c) se producen de forma completamente sintética; o d) se sintetizan in vivo por medio de procedimientos terapéuticos genéticos o e) se producen por medio de un procedimiento genético in vitro o 52-563 f) se producen en microorganismos. Los inhibidores de proteosoma se tratan de compuestos que pertenecen a las siguientes clases de sustancias : a) inhibidores de proteosoma de origen natural: - derivados de péptido, que contienen estructuras epoxicetona C-terminal; o - derivados de ß-lactona; o - Aclacinomicina A (también llamada Aclarubicina) ; o - Lactacistina y sus variantes modificadas químicamente, como la variante que penetra en la membrana células "ß- lactona de clasto lactacisteína" . b) inhibidores de proteosoma producida sintéticamente: peptidaldehídos modificados como N-carbobenzoxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinal (también G132 zLLL), su derivado de ácido bórico MG232; N-Carbobenzoxi-Leu-Leu-Nva-H (designado como MG115; N-Acetil-L-Leucinil-L-Leucinil-L-Norleucinal (designado como LLnL) , N-Carbobenzoxi-Ile-Glu (OBut ) -Ala-Leu-H (también designado como PSI) ; c) Péptidos, que en el C-terminal portan una estructura a, ß-epoxicetona, además vinilsulfona como carbobenzoxi-L-Leucinil-L-Leucinil-L-Leucin-vinil-sulfona o 4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilactetil-L-Leucinil-L-Leucinil-L-Leucin-vinil-sulfona (NLVS) ; 52-563 d) Radicales glioxal- o ácido bórico como Pirazil-CONH (CHPhe) CONH (CHisobutil) B (OH) 2) asi como derivado de ácido dipeptidil-bórico o e) Ester de pinacol - como éster de benciloxicarbonil (Cbz) -Leu-Leu-boro-Leu-pinacol . Inhibidores de proteosoma especialmente adecuados son las epoxicetonas como epoxomicina (epoxomicina, fórmula molecular: C2sH86 407) y/o eponemicina (eponemicina, fórmula molecular: C20H36 2O5 ) o inhibidores de proteosoma de la serie PS de compuestos, se utilizan: a) PS-519 como ß-Lactona asi como derivado de lactacistina el compuesto IR- [1S, R, 5S] ] -1- ( l-Hidroxi-2-metilpropil) -4-propil-6-oxa-2-azabiciclo [3.2.0] -heptano-3,7-diona - fórmula molecular Ci2Hi9N04- y/o b) PS-314 como derivado de ácido peptidil-bórico el compuesto ácido N-pirazincarbonil-L-fenilalanin-L-leuzin-bórico - fórmula molecular C19H25BN4O4 - y/o c) PS-273 (morfolin-CONH- (CH-Naftil) -CONH- (CHisobutil) -B (OH) 2 ) y sus enantiómero PS-293 y/o d) el compuesto PS-296 ( 8-quinolil-sulfonil- CONH- (CH-naftil) -CONH ( -CH-isobutil ) -B (OH) 2) y/o e) PS-303 (NH2 (CH-naftil) -CONH- (CH-isobutil) -B(OH)2) y/o f) PS-321 como (morfolin-CONH- (CH-Naftil ) -CONH- (CH-fenilalanin) -B (OH) 2) ; - y/o 52-563 g) PS-334 (CH3-NH- (CH-naftil-CONH- (CH-isobutil) -B (OH) 2) y/o h) el compuesto PS-325 ( 2-quinol-CONH- {CH-homo-fenilalanin) -CONH- (CH-isobutil ) -B (OH) 2) y/o i) PS-352 (fenilalanin-CH2-CH2-CONH- (CH-fenilalanin) -CONH- (CH-isobutil ) 1-B (OH) 2) y/o j) PS-383 (Piridil-CONH- (CHpF-fenilalanin) - CONH- (CH-isobutil) -B (OH) 2) . Las composiciones farmacéuticas descritas son adecuadas como medicamentos o para la producción de agentes para el tratamiento de infecciones virales y/o enfermedades tumorales. También es posible una combinación con otros medios, para el tratamiento de infecciones virales y/o enfermedades tumorales. El uso según la invención de esos agentes se realiza en forma de: - Inhalaciones - Formas de depósito - parches - en sistemas microelectrónicos ("pildora inteligente") Es posible el uso en oncología y/o en oncología y virología para el tratamiento de: - Glioblastoma (tumores malignos del cerebro) - Cáncer de mama - Cáncer de cabeza y cuello 52-563 - Cáncer epitelial escamoso - Cáncer ovárico - Cáncer bronquial (de células pequeñas y de células grandes ) - Cáncer de glándula tiroides - Cáncer pulmonar - Cáncer de colon - Cáncer pancreático - Leucemia (AML, ALL, CML, CLL) - Leucemia mielocitica crónica aguda - Leucemia linfática aguda crónica - Linfoma (No Hodgkin) - Cáncer del cuello cervicouterino - Neuroblastoma - Cáncer de piel (melanoma) - Cáncer de próstata - Cáncer de vejiga - Sarcoma (huesos y tejidos blandos) - Cáncer de diafragma - Cáncer gastrointestinal (por ejemplo del estómago, esófago) - Cáncer testicular - Metástasis (por ejemplo en la médula ósea) - Virus de linfoma - Herpes simplex -563 - Citomegalia - Varicela - Varicela Zoster - Sarampión - Fiebre de Lassa - SIDA - Paperas (Meningitis, orquitis) - Enteritis; gripe (de cualquier forma) - Encefalitis - Hepatitis (A, B, C, D, E, G) - Rubéola - Virus de Coxsackie B - Poliomielitis - Encefalomielitis - Pancreatitis - Neumonía - Miocarditis - Enfermedades tropicales (virales) - Todos los virus patógenos humanos de ADN y ARN de hebra doble y simple. Sorprendentemente se ha determinado que por medio de la interferencia de los mecanismos del plegamiento de las proteínas se forman más proteínas plegadas defectuosas. Estos productos defectuosos de la biosíntesis de la proteína normalmente se degradan por medio del sistema 52-563 ubiquitin-proteosoma (UPS) y con esto se eliminan del metabolismo celular. En el caso de la inhibición de UPS, por ejemplo por medio de los inhibidores de proteosoma y/o por medio de inhibidores de ligasas de ubiquitina, estos productos defectuosos de la biosintesis de proteina por lo regular poli-ubiquitiniladas y plegadas de forma defectuosa, se acumulan en las células y con esto producen múltiples problemas en el metabolismo celular, que al sumar todos los efectos conducen preferentemente a las células en cuestión a la muerte celular programada (apoptosis) . Ya que tanto en células infectadas con virus, como también en las células tumorales que se dividen rápidamente existe una velocidad especialmente alta de la biosintesis proteica, en especial estas células reaccionan de manera reforzada al efecto de los inhibidores de UPS y el plegamiento de las proteínas, mientras que las células normales y sanas permanecen si influencias de esos inhibidores. En esto se basa el mecanismo de acción básico del nuevo procedimiento terapéutico propuesto por la invención. En una modalidad especial de la invención, se utiliza el efecto de esos inhibidores para el tratamiento de células de plasmacitoma de pacientes con mieloma múltiple. Estos tumores de las células B se caracterizan por una tasa de síntesis extremadamente elevadas de inmunoglobulinas . Según se sabe, estas células de 52-563 plasmacitoma son especialmente sensibles contra el tratamiento con inhibidores de proteosoma. Por esto, los inhibidores de proteosoma, en especial en forma de péptido de ácido bórico (nombre comercial Velcade) , se usan exitosamente para el tratamiento de mieloma múltiple. En cualquier caso, durante el tratamiento con inhibidores de proteosoma debe considerarse un rango terapéutico muy estrecho, ya que los limites entre la dosis terapéutica y la dosis tóxicamente tolerable son muy estrechos. Por medio del tratamiento con inhibidores del plegamiento de proteínas se sensibilizan esas células de plasmacitoma para la acción sobre los inhibidores de proteosoma. Por medio de la combinación de inhibidores de proteosoma e inhibidores del plegamiento de proteína refuerza el efecto de ambos componentes de una forma sinérgica. Simultáneamente pueden utilizarse ambos medicamento en dosis sub-tóxicas con mayor efectividad, lo que en general eleva las probabilidades de éxito de la terapia. La solución según la invención frente al estado de la técnica ofrece las siguientes ventajas: - Evita generar resistencias - Curación de ciertas enfermedades - Tasa de respuestas más altas - Tratamiento de más formas tumorales (casos ligeros, medios, fuertes) 52-563 Otra modalidad preferida de la invención presenta un efecto anti-viral en la combinación de ambas sustancias activas. Se sabe que los inhibidores de proteosoma interfieren en la replicación del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y otros virus, para lo cual se induce la acumulación de proteínas Gag plegadas defectuosamente, las cuales interfieren con los procesos ordenados de ensamblado y liberación de los virus producidos. Este efecto terapéutico de los inhibidores de proteosoma se eleva esencialmente cuando las células infectadas con virus se tratan simultáneamente con inhibidores del plegamiento de proteínas. Con esto se eleva el número de proteínas estructurales plegadas defectuosamente de los virus, que en un mecanismo transnegativo, esto es de una manera similar al efecto de un prión se refuerza el ensamblado de las proteínas virales y con esto la formación de los virus producidos. Esta modalidad de la invención se aplica para todas las infecciones virales en las cuales se realiza una conformación ordenada de proteínas estructurales virales recién sintetizadas. La invención se describirá con más detalladamente con la ayuda de ejemplos de realización, sin limitarse a esos ejemplos. 52-563 Ejemplos de realización Ejemplo 1: El inhibidor de Hsp90 de 17-AAG a una concentración de hasta 10 nM no muestra citotoxicidad en las células CEM. Las células linfáticas CD4+-T (células CEM) se inocularon en una placa de 96 pocilios con una densidad de lxlO4 células por 100 µ? . Al medio (ver ejemplo 4a) se agregan las cantidades antes indicadas 17-AAG, para alcanzar concentraciones finales de 1 µ?; 100 nM; 10 nM; 1 nM; 0.1 nM y 0.01 nM 17-AAG. Después de la incubación durante 30 horas a 37 °C y en 5% C02 se agregaron a 10 µ? AlamarBlue™ (Invitrogen) y todas las preparaciones se incubaron durante otras 4 horas a 37 °C. La medición de la vitalidad de las células CEM (indicado en MTT CEM) bajo la influencia de 17-AAG pudo también determinarse por el cambio de coloración del medio utilizado la medición de fluorescencia a 530/590 nm. Todas las preparaciones se realizaron por triplicado.

Ejemplo 2: Bajo el efecto de 17-AAG, las células HeLaSS6 transíectadas con pNLenvl exhibieron un procesado Gag reducido en la fracción viral y una mayor expresión HsP 70 en la fracción celular. Para el análisis bioquímico de 17-AAG sobre la cinética del procesamiento Gag y la liberación de virus se 52-563 estudiaron las cinéticas. Los detalles experimentales de cultivo, transíección, intercambio de medio y la cinética temporal se dan en el ejemplo 4a/b. Aquí se utilizaron cultivos de células HeLaSS6, que fueron transfectadas con pNLenvl (Schubert et al, 1995) . Después de la incubación en medio que contiene 17-AAG (100 nM 17-AAG) , o medio libre de inhibidor, se inició la cinética según etapas de crecimiento diferentes y la toma de alícuotas de las preparaciones. Las alícuotas de los cultivos celulares se obtienen en cualquier momento y se separan por medio de centrifugación en fracciones celulares, virales y de residuos de cultivos celulares. Las proteínas VIH se separan por SDS-PAGE, se transfieren a membranas PVDF y finalmente se visualizan por medio de quimioluminiscencia mediante anticuerpos por medio de películas radiográficas.

Ejemplo 3: 17-AAG, como también la combinación con PS341, inhibe la replicación viral de los virus HI X4-tróficos en un modelo HLAC. Las amígdalas humanas se maceran y se transfieren a placas de 96 pocilios. Después de un día de incubación las células se infectan con virus HI X4-tróficos, se mezclan con los correspondientes inhibidores y se lavan con etiquetas. Estas etapas, así como también las siguientes, se describen detalladamente en los Ejemplos 4c-d. En cada 52-563 punto cinético se retiran 150 µ? del medio y se conservan a -80°C para medir el RT. El medio que se vuelve a agregar contiene la concentración de inhibidores necesaria para la preparación particular. Después de 15 días se determina la fracción de virus HI formada funcionalmente por medio de ensayos RT (ver ejemplo 4e) de los residuos conservados.

Ejemplo 4: Material y Métodos Ejemplo 4a: Cultivo celular Células CEM se cultivaron en RPMI 1640 con 10% (V/V) de suero de ternera fetal, 2 mM L-Glutamina, 100 U/ml penicilina y 100 g/ml de estreptomicina. Células Hela (ATCC CCL2 ) se modificaron en medio Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, y 100 q/ml de estreptomicina. Las células de las amígdalas se cultivaron en RPMI 1640 con 15% (V/V) de suero de ternera fetal, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina, 2.5 g/ml de Fungizona, 1 mM de piruvato de sodio, 1% de solución de aminoácidos esenciales MEM y 50 g/ml gentanamicina ("medio de amígdalas").

Ejemplo 4b: Transfección, intercambio de medios y 52-563 cinética Células Hela (ATCC CCL2) se transíectaron por medio de mezcla de pNLAenv-Lipofectamina2000 en OPTI-MEM. Después de 8 horas de incubación a 37 °C y 5% C02 Se realizó un cambio de medio. En una de las dos preparaciones se agregó al medio una concentración final de 100 nM 17-AAG y se incubó durante 16 horas. Después de diferentes etapas de lavado en PBS se tomaron alícuotas en los correspondientes momentos. En los momentos correspondientes se separaron las células por medio de centrifugación (5 min; 5000 rpm) se separaron del residuo y finalmente se lisaron por medio de lisis con CHAPS/DOC (3 min sobre hielo) . Los VLP en el residuo se peletizaron sobre cojines de sacarosa al 20% (90 min; 14000 rpm) , y al igual que los lisados de los pelets celulares se separaron por medio de SDS-PAGE al 10%, se transfieren a una membrana PVDF por medio de manchado en húmedo y se bloqueó en leche en polvo al 10% (en PBS-Tween 0.1%). La detección de las proteínas específicas al VIH o las células se realiza sobre anticuerpos específicos (contra Hsp70; Hsp90; p24; PR55; ß-Actina) . Por medio de la reacción con anticuerpos secundarios y su quimioluminiscencia pudieron detectarse las señales sobre películas radiográficas.

Ejemplo 4c: Transfección y obtención de la cepa 52-563 viral Para la producción de preparados virales se transfectó ADN de plásmido de ADN de VIH-1 utilizando el método de precipitación de fosfato de calcio en células HeLa. Para esto se incubaron cultivos confluentes de células Hela (5xl06 células) con 25 µ? de ADN de plásmido en cristales de potasio, producidos según un método de Graham y van der Eb (1973), y a continuación se someten a un choque de glicerol según Gorman et al. (1982) . Para la obtención de preparados virales concentrados se cosecharon las natas del cultivo celular dos dias después de la transfección . A continuación las células asi como sus componentes se separaron por medio de centrifugación (1,000 xg, 5 minutos, 4°C) y el filtrado (0.45 µp? de tamaño de poro) . Las partículas virales se peletizaron por medio de ultracentrifugación (rotor Beckman SW55, 1.5 horas, 35,000 rpm, 10°C) y a continuación se resuspendieron en 1 mi de medio DMEM. Los preparados virales se esterilizarón por medio de filtración (0.45 µp? tamaño de poro) y se congelaron en porciones (-80°C). Los preparados virales individuales se describieron por medio de determinación de la actividad de transcriptasa inversa, y esto es con la ayuda de una prueba ya descrita ( illey et al, 1988), utilizando una construcción [32P]-TTP en una plantilla oligo (dT) -poli (A) estandarizada. 52-563 Ejemplo 4d: Modelo HLAC (obtención; infección; cinética ) El tejido de las amígdalas se lavó en PBS, los coágulos de sangre se retiraron por medio del escalpelo y se dividió en piezas de 1-2 mm2. Las células individuales se obtuvieron por medio de compresión mecánica a través de una red filtrante. Después de la centrifugación de las células individuales (5 min, 1200 rpm) se contaron las células, se sembraron en placas de 96 pocilios y se incuban durante la noche a 37 °C y 5% C02. La infección de las células se realizó por medio de adición de 10 ng una cepa de VIH X4-trófica con la aplicación simultánea de las concentraciones correspondientes de inhibidor. Al siguiente día se tomaron 50 µ? del residuo ("1 dpi") y se conservaron a -80°C. Las células posteriormente se centrifugaron (5 min; 1200 rpm) y se retiraron otros 50 µ? del residuo. Después de la resuspensión de las células en 100 µ? de medio de amígdalas se repitió esta etapa de lavado dos veces. Después de la adición del medio de amígdalas con concentraciones de inhibidor correspondientes, las células se vuelven a incubar nuevamente a 37 °C y 5% C02. En los días 3, 6, 9 y 12 se tomaron en 150 µ? de medio, se conservaron a -80°C y se agregaron 150 µ? de medio con las correspondientes concentraciones de inhibidor. En el día 15 se tomaron principalmente 150 µ? de nata, se conserva a - 52-563 80°C y las células después se desechan.

Ejemplo 4e: Ensayo RT Las natas de las amígdalas conservadas a -80°C se determinaron por medio de actividad de transcriptasa inversa y ciertamente con la ayuda de una prueba ya descrita (Willey et al, 1988), utilizando una construcción [32P]-TTP en una plantilla oligo (dT) -poli (A) .

Leyendas de las figuras Figura 1 El inhibidor de Hsp90, 17-AAG hasta una concentración de 10 nm muestra una citotoxicidad en células CEM. Células CD4+-T (células CEM) se incubaron con diferentes concentraciones de 17-AAG y la coloración dependiente del tiempo que representaba el número de células vivas, se determinó después de la adición de AlamarBlue™ (Invitrogen) por medio de medición de fluorescencia .

Figura 2 : Células HeLaSS6 transfectadas con VIH-1 subgenómico en el vector de expresión pNLenvl bajo la influencia de 17-AAG mostraron en la fracción viral un menor procesamiento Gag y una mayor expresión Hsp70 en la fracción celular.

Figura 3 : Efecto antiviral de 17-AAG individualmente, asi como en combinación con el inhibidor de proteosoma PS341, contra virus HI X4-trófico en un modelo HLAC, representado con la ayuda de los datos RT de los puntos cinéticos correspondientes a dos amígdalas diferentes (A y B) . La replicación viral del virus HI X4-trófico no pudo modificarse claramente en la amígdala A (A) ni por medio de incubación con 1 nM inhibidor de proteosoma PS341, 1 nM 17-AAG ni por medio de 10 nM 17-AAG. Primero la combinación de ambas sustancias (5 nM PS341 y 1 nM 17-AAG) mostró una clara reducción de la replicación viral. Aquí se demostró, que este efecto aditivo en el caso de la aplicación de ambas sustancias puede elevarse aun más por medio de una concentración mayor del inhibidor de Hsp90, 17-AAG (10 nM) . La amígdala B (B) tampoco mostró una influencia en la replicación del VIH X4-trófico durante la incubación con 1 nM PS341 o 1 nM 17-AAG. Contrariamente a la amígdala A, la amígdala B pudo mostrar una reducción de la replicación viral ya durante la adición de 10 nM 17-AAG. Con la misma combinación entre el inhibidor de proteosoma PS341, con el inhibidor Hsp90 17-AAG no pudo observarse ningún tipo de replicación viral adicional.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES : 1. Composición farmacéutica que contiene como componentes activos un inhibidor del sistema ubiquitina-proteosoma y un inhibidor de enzimas de plegamiento de proteínas . 2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque el inhibidor de las enzimas de plegamiento de proteínas es por lo menos un inhibidor de los chaperones celulares o por lo menos una sustancia química que influye directamente sobre el plegamiento de proteínas (anti-chaperón químico) . 3. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de anti-chaperones químicos se utilizan sustancias las cuales a) inhiben, regulan o influyen de otra forma sobre el plegamiento o la maduración proteolítica de proteínas virales y así inhiben la liberación y o replicación de virus, en especial de promotores de enfermedades infecciosas como SIDA, hepatitis, fiebre hemorrágica, SARS, varicela, sarampión, polio, infecciones por virus de herpes o gripa, o b) interfieren con la reproducción de células dañadas, en especial células tumorales, realizándose esto por medio de la acumulación de proteínas plegadas erróneamente para dirigir la muerte celular programada. 4. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que especialmente influyen sobre las actividades enzimáticas de las enzimas de plegado moleculares de las células anfitrionas . 5. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que son absorbidas por las células eucarióticas superiores y después de la absorción celular, bloquean el plegado de las proteínas con estructura viral y de proteínas de células tumorales . 6. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias, que pueden administrarse de diferentes forma in vivo ya sea por vía oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea o en forma encapsulada con o sin modificaciones que porten especificidad celular, presente una reducida citotoxicidad 52-563 debido al uso de un régimen determinado de aplicación y/o dosis, producen efectos secundarios reducidos o nulos, presentan un tiempo de vida medio metabólico relativamente elevado y una velocidad de aclaramiento relativamente reducida en el organismo. 7. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias las cuales a) se aislan en forma natural de los microorganismos u otras fuentes naturales o b) se producen por medio de modificaciones químicas a partir de sustancias naturales o c) se producen de forma totalmente sintética o d) se sintetizan in vivo por medio de procedimientos terapéuticos genéticos. 8. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que interfieren con los procesos altamente organizados del ensamblado y la maduración proteolítica de las proteínas con estructura viral, y evitan así la liberación y la producción de virus derivados infecciosos. 9. Composición farmacéutica según una de las 52-563 reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que regulan, interfieren o bloquean el plegado de las proteínas virales y/o de las proteínas específicas a los tumores. 10. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que interfieren los procesos posteriores de replicación como ensamblado, formación de brotes, maduración proteolítica y liberación del virus. 11. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que interfieren el procesamiento proteolítico de las proteínas precursoras de las poliproteínas . 12. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que bloquean la actividad de las proteosomas virales. 13. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como 52-563 inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que interfieren con las actividades de las proteasas celulares y/o de las enzimas, como por ejemplo ligasas, cinasas, hidrolasas, enzimas de glicolización, fosfatasas, ADNasas, ARNasas, helicasas y transferasas, que participan en la maduración viral . 1 . Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias, que presentan un amplio espectro de acción y pueden, por lo tanto, utilizarse como nuevos virustáticos de amplio espectro para la profilaxis y/o para la terapia de diferentes infecciones virales. 15. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que bloquean a los chaperones celulares como las proteínas del choque térmico (heat shock proteins (hsp) . 16. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias las cuales 52-563 inhiben las actividades de las proteínas del choque térmico Hsp27, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp72, Hsp73, Hsp90, Hspl04 y Hsc70. 17. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares pueden usarse sustancias que pertenecen a las siguientes clases de sustancias y sus derivados: Geldanamicina (inhibe Hsp90), Radicicol (inhibidor de tirosina-cinasa; inhibe Hsp90) , Desoxiespergualina (inhibe Hsc70 y Hsp90), 4-PBA (butirato de 4-fenilo; sub-regulación de la expresión de proteína y de mARN de Hsc70) , Herbimicina A (inhibidor de tirosincinasa con inducción de Hsp72/73), Epolactaeno (inhibidor de Hsp60) , Scythe y Reaper (inhiben Hsp70), Artemisinina (inhibidor de Hsp90), CCT0180159 (como inhibidor de pirazol de Hsp90) y SNX-2112 (inhibidor de Hsp90) , Radanamicina (quimera macrolida de Radicicol y Geldanamicina), Novobiocina (inhibidor de Hsp90), Quercetina (inhibidor de la expresión de Hsp70) . 18. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como anti-chaperones químicos pueden utilizarse sustancias las cuales regulan, interfieren o bloquean la conformación de las proteínas y el plegamiento de proteínas virales y/o específicas para los tumores. 52-563 19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque como anti-chaperones químicos pueden utilizarse sustancias como glicerol, trimetilamina, betaina, trehalosa o agua deuterizada ( D20) . 20. Composición farmacéutica según la reivindicación 18 ó 19, caracterizada porque como anti-chaperones químicos pueden utilizarse sustancias que son adecuadas para el tratamiento, la terapia y la inhibición de infecciones con diferentes virus patógenos para los humanos o también virus patógenos para los animales. 21. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque como inhibidores de los chaperones celulares o de los anti-chaperones químicos se utilizan sustancias que son adecuadas para el tratamiento, la terapia y la inhibición de infecciones con promotores de enfermedades infecciosas crónicas como SIDA (VIH-1 y VIH-2), hepatitis (HCV y HBV) , promotores del "síndrome respiratorio agudo severo" (SARS), el SARS-CoV ( coronavirus ) , virus de varicela, promotores de la fiebre hemorrágica viral (VHF) como los virus de Ébola como representantes de la familia de los Filoviridae ; los promotores de gripa como los virus de la influenza A. 22. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque se utilizan 52-563 ciclosporina A y/o Tacrolimus. 23. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque el inhibidor de UPS es cuando menos una sustancia que: a) en forma de inhibidores de proteosoma, especialmente influye sobre las actividades enzimáticas del complejo de proteosoma 26S completo y de la estructura de proteosoma catalíticamente activo 20S que no está ensamblado con sub-unidades reguladoras, o b) especialmente inhibe el efecto de las ligasas de ubiquitina o c) especialmente inhibe el efecto de las hidrolasas de ubiquitina o d) especialmente inhibe el efecto de las enzimas activantes de ubiquitina o e) especialmente inhibe la mono-ubiquitinilización de proteínas o f) especialmente inhibe la poli-ubiquitinilización de proteínas. 24. Composición farmacéutica según la reivindicación 23, caracterizada porque se utilizan sustancias que, como los inhibidores de proteosoma, son absorbidas por eucariontes superiores y, después de la absorción celular, interactúan con las sub-unidades catalíticas del proteosoma y bloquean todas o algunas de 52-563 las actividades proteoliticas del proteosoma, las actividades hidrolizantes de los péptidos de tripsina, quimiotripsina y/o postglutamilo, dentro del complejo de proteosoma 26S o también de 20S, en forma reversible o irreversible. 25. Composición farmacéutica según la reivindicación 23 ó 24, caracterizada porque como inhibidores de proteosoma se utilizan sustancias que a) se aislan en forma natural de microorganismos u otras fuentes naturales; o b) se obtienen por medio de modificaciones químicas de sustancias naturales; o c) se producen de forma completamente sintética; o d) se sintetizan in vivo por medio de procedimientos terapéuticos genéticos o e) se producen por medio de un procedimiento genético in vitro o f) se producen en microorganismos. 26. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizada porque como inhibidores de proteosoma se utilizan sustancias que pertenecen a las siguientes clases de sustancias: a) inhibidores de proteosoma de origen natural: - derivados de péptido, que contienen estructuras 52-563 epoxicetona C-terminal ; o - derivados de ß-lactona; o - Aclacinomicina A (también llamada Aclarubicina) ; o - Lactacistina y sus variantes modificadas químicamente, como la variante que penetra en la membrana celular "ß- lactona de clasto lactacisteína" . b) inhibidores de proteosoma producidos sintéticamente: peptidaldehídos modificados como N-carbobenzoxi-L-leucinil-L-leucinil-L-leucinal (también MG132 zLLL) , su derivado de ácido bórico G232; N-Carbobenzoxi-Leu-Leu-Nva-H (designado como MG115; N-Acetil-L-Leucinil-L-Leucinil-L-Norleucinal (designado como LLnL) , N-Carbobenzoxi-Ile-Glu (OBut ) -Ala-Leu-H (también designado como PSI) ; c) Péptidos, que en el C-terminal portan una estructura a, ß-epoxicetona, y también vinilsulfonas como carbobenzoxi-L-Leucinil-L-Leucinil-L-Leucin-vinil-sulfona o 4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilactetil-L-Leucinil-L-Leucinil-L-Leucin-vinil-sulfona (NLVS) ; d) Radicales glioxal o de ácido bórico como Pirazil-CONH (CHPhe) CONH (CHisobutil) B (OH) 2) , así como derivado de ácido dipeptidil-bórico o e) Ester de pinacol, como éster de benciloxicarbonil (Cbz) -Leu-Leu-boro-Leu-pinacol . 27. Composición farmacéutica según una de las 52-563 reivindicaciones 23 a 25, caracterizada porque como inhibidores de proteosoma especialmente adecuados se utilizan las epoxicetonas como epoxomicina (epoxomicina, fórmula molecular: C28H86N407) y/o eponemicina (eponemicina, fórmula molecular: C20H36 2O5 ) . 28. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizada porque como inhibidores de proteosoma especialmente adecuados se utilizan inhibidores de proteosoma de la serie PS de compuestos: a) PS-519 como ß-Lactona asi como derivado de lactacistina el compuesto IR- [ 1S, 4R, 5S ] ] -1- ( l-Hidroxi-2-metilpropil) -4-propil-6-oxa-2-azabiciclo [3.2.0]- heptano-3,7-diona - fórmula molecular C12H19NO4 - y/o b) PS-314 como derivado de ácido peptidil-bórico el compuesto ácido N-pirazincarbonil-L-fenilalanin-L-leuzin-bórico - fórmula molecular C19H25BN4O4 - y/o c) PS-273 (morfolin-CONH- (CH-Naftil) -CONH- (CH-isobutil ) -B (OH) 2) y sus enantiómeros PS-293 y/o d) el compuesto PS-296 ( 8-quinolil-sulfonil- CONH- (CH-naftil) -CONH ( -CH-isobutil ) -B (OH) 2 ) y/o e) PS-303 (NH2 (CH-naftil) -CONH- (CH-isobutil) -B(OH)2) y/o f) PS-321 como (morfolin-CONH- (CH-Naftil ) -CONH- (CH-fenilalanin) -B (OH) 2) ; - y/o 52 -563 g) PS-334 (CH3-NH- (CH-naftil-CONH- (CH-isobutil) -B (OH) 2) y/o h) el compuesto PS-325 (2-quinol-CONH- {CH-homo-fenilalanin) -CONH- (CH-isobutil ) -B (OH) 2) y/o i) PS-352 (fenilalanin-CH2-CH2-CONH- (CH-fenilalanin) -CONH- (CH-isobutil ) 1-B (OH) 2) y/o j) PS-383 (Piridil-CONH- (CHpF-fenilalanin) - CONH- (CH-isobutil) -B (OH) 2) . 29. Agente para el tratamiento de infecciones viral y/o enfermedades tumorales que contienen a la composición según una de las reivindicaciones 1 a 28. 30. Uso de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 28, para el tratamiento de las infecciones virales y/o enfermedades tumorales. 31. Uso de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 28, para el tratamiento de las infecciones virales y/o enfermedades tumorales. 32. Uso según la reivindicación 30 ó 31 en combinación con otros medios, para el tratamiento de infecciones virales y/o enfermedades tumorales. 33. El uso según una de las reivindicaciones 30 a 32 en forma de: - inhalaciones - formas de depósito - parches 52-563 - en sistemas microelectronicos ("pildora inteligente") 34. Uso según una de las reivindicaciones 30 33 en la oncología y/o en oncología y virología. 35. Uso según la reivindicación 30 ó 31 para tratamiento de: - Glioblastoma (tumores malignos del cerebro) - Cáncer de mama - Cáncer de cabeza y cuello - Cáncer epitelial escamoso - Cáncer ovárico - Cáncer bronquial (de células pequeñas y de célul grandes ) - Cáncer de glándula tiroides - Cáncer pulmonar - Cáncer de colon - Cáncer pancreático - Leucemia (AML, ALL, CML, CLL) - Leucemia mielocítica crónica aguda - Leucemia linfática aguda crónica - Linfoma (No Hodgkin) - Cáncer del cuello cervicouterino - Neuroblastoma - Cáncer de piel (melanoma) - Cáncer de próstata - Cáncer de vejiga 52-563 - Sarcoma (huesos y tejidos blandos) - Cáncer de diafragma - Cáncer gastrointestinal (por ejemplo del estómago, esófago ) - Cáncer testicular - Metástasis (por ejemplo en la médula ósea) - Virus de linfoma - Herpes simplex - Citomegalia - Varicela - Varicela Zoster - Sarampión - Fiebre de Lassa - SIDA - Paperas (Meningitis, orquitis) - Enteritis; gripe (de cualquier forma) - Encefalitis - Hepatitis (A, B, C, D, E, G) - Rubéola - Virus de Coxsackie B - Poliomielitis - Encefalomielit is - Pancreatitis - Neumonía - Miocarditis -563 Enfermedades tropicales (virales) Todos los virus patógenos humanos de ADN y ARN de heb doble y simple.