BRPI0614647A2 - peptìdeos e compostos que se ligam a um receptor - Google Patents

Abstract

PEPTìDEOS E COMPOSTOS QUE SE LIGAM A UM RECEPTOR. A presente invenção refere-se a compostos peptídeos que se ligam a e ativam o receptor de trombopoletina (c-mpl ou TPO-R) ou de outro modo agem como um agonista de TPO são descritos

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEOSE COMPOSTOS QUE SE LIGAM A UM RECEPTOR".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

O presente pedido, que é uma continuação em parte do pedidoU.S. N9 de Série 10/918.561 depositado em 13 de agosto de 2004, reivindicaprioridade dos pedidos de patente U.S. Ne de Série 10/918.561 e60/498.740, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a títu-lo de referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a compostos peptídeos que seligam a e ativam o receptor de trombopoietina (c-mpl ou TPO-R) ou de outromodo agem como um agonista de TPO. A invenção tem aplicação nos cam-pos de bioquímica e química medicinal e particularmente provê agonistas deTPO para uso no tratamento de doença humana.

Antecedentes da Invenção

Megacariócitos são células derivadas da medula óssea, que sãoresponsáveis pela produção de plaquetas sangüíneas circulantes. Emboracompreendendo <0,25% das células da medula óssea na maioria das espé-cies, elas têm >10 vezes o volume de células da medula óssea típicas. VideKutere outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:11104-11108 (1994). Megaca-riócitos sofrem um processo conhecido como endomitose com o que elesreplicam seus núcleos, mas falham em sofrer divisão celular e então dãoorigem a células poliplóides. Em resposta a uma contagem de plaqueta bai-xa, a taxa endomitótica aumenta, megacariócitos mais plóides são formados,e o número de megacariócitos pode aumentar até 3 vezes. Vide Harker, J.Clin. Invest., 47:458-465 (1968). Em contraste, em resposta a uma contagemde plaqueta elevada, a taxa endomitótica diminui, megacariócitos menosplóides são formados, e o número de megacariócitos pode diminuir em 50%.

O mecanismo de feedback fisiológico exato através do qual amassa de plaquetas circulantes regula a taxa endomitótica e número de me-gacariócitos na medula óssea não é conhecido. O fator trombopoiético circu-lante envolvido na mediação desta alça de feedback é agora imaginado sertrombopoietina (TPO). Mais especificamente, TPO foi mostrada ser o regu-lador humoral principal em situações envolvendo trombocitopenia. Vide, porexemplo, Metcalf, Nature, 369:519-520 (1994). TPO foi mostrada em váriosestudos aumentar as contagens de plaqueta, aumentar o tamanho de pla-queta e aumentar a incorporação de isótopo em plaquetas de animais recipi-entes. Especificamente, TPO é imaginada afetar megacariocitopoiese devárias maneiras: (1) ela produz aumentos em tamanho e número de mega-cariócito; (2) ela produz um aumento no teor de DNA, na forma de poliplóide,em megacariócitos; (3) ela aumenta a endomitose de megacariócito; (4) elaproduz maturação aumentada de megacariócitos; e (5) ela produz um au-mento na porcentagem de células precursoras, na forma de células acetilco-linesterase-positivas pequenas, na medula óssea.

Plaquetas (trombócitos) são necessárias para coagulação san-güínea. Quando seus números são muito baixos um paciente está sob sériorisco de morte de hemorragia catastrófica. TPO tem então tem aplicação útilpotencial em ambos diagnóstico e tratamento de vários distúrbios hematoló-gicos, por exemplo, doenças principalmente devido a defeitos de plaqueta.

Testes clínicos em andamento com TPO indicaram que TPO pode ser admi-nistrada seguramente a pacientes. Ainda, estudos recentes proveram umabase para a projeção de eficácia de terapia de TPO no tratamento de trom-bocitopenia, e particularmente trombocitopenia resultante de quimioterapia,terapia com radiação ou transplante de medula óssea como tratamento paracâncer ou linfoma. Vide, por exemplo, McDonald, Am. J. Ped. Hemato-logy/Oncology, 14:8-21 (1992).

O gene codificando TPO foi clonado e caracterizado. Vide Kutere outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:11104-11108 (1994); Barley e ou-tros, Cell 77:1117-1124 (1994); Kaushansky e outros, Nature 369:568-571(1994); Wendling e outros, Nature, 369:571-574 (1994); e Sauvage e outros,Nature 369:533-538 (1994). A trombopoietina é uma glicoproteína com pelomenos duas formas, com massas moleculares aparentes de 25 kDa e 31kDa, com uma seqüência de aminoácido N-terminal comum. Vide Bartley eoutros, Cell, 77:1117-1124 (1994). A trombopoietina parece ter duas regiõesdistintas separadas por um sítio de clivagem Arg-Arg potencial. A região a-mino-terminal é altamente conservada em homem e camundongo, e temalguma homologia com eritropoietina e interferon-α e interferon-β. A regiãocarbóxi-terminal mostra divergência em espécies ampla.

As seqüências de DNA e seqüências de peptídeo codificado pa-

ra TOP-R humana (também conhecida como c-mpl) foram descritas. VideVigon e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:5640-5644 (1992). TPO-R éum membro da família de receptor de fator de crescimento hematopoietina,uma família caracterizada por um design estrutural comum do domínio ex- tracelular, incluindo quatro resíduos C conservados na porção N-terminal eum motivo WSXWS (SEQ ID N0:1) próximo à região de transmembrana.Vide Bazan1 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6934-6938 (1990). Evidência queeste receptor desempenha um papel funcional em hematopoiese inclui ob-servações que sua expressão é restrita a baço, medula óssea ou fígado fetalem camundongos (vide Souyri e outros, Cell 63:1137-1147· (1990)) e a me·gacariócitos, plaquetas e células CD34+ em seres humanos (vide Methia eoutros, Blood 82:1395-1401 (1993)). Ainda, exposição de células CD34+ aoligonucleotídeos sintéticos anti-sentido para RNA de mpl inibe significante-mente o aparecimento de colônias de megacariócito sem afetar a formaçãode colônia de eritróide ou mielóide. Alguns profissionais postulam que o re-ceptor funcione como um homodímero, similar à situação com os receptorespara G-CSF e eritropoietina.

A disponibilidade de genes clonados para TPO-R facilita a pes-quisa por agonistas deste receptor importante. A disponibilidade da proteínareceptora recombinante permite o estudo de interação receptor-ligante emuma variedade de sistemas de geração de diversidade de peptídeo aleató-rios e semi-aleatórios. Esses sistemas são descritos nas Patentes U.S. Nos.6.251.864, 6.083.913, 6.121.238. 5.932.546. 5.869.451, 5.506.362 e6.465.430 e em Cwirla e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378-6382(1990); cada um dos pedidos e publicações de patente acima é aqui incorpo-rado a título de referência.

A recuperação lenta de níveis de plaqueta em pacientes sofren-do de trombocitopenia é um problema sério, e acrescentou urgência para apesquisa de um agonista de fator de crescimento sangüíneo capaz de acele-rar regeneração de plaqueta. A presente invenção provê tal agonista.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a compostos peptídeos de pesomolecular baixo definidos que têm propriedades de ligação fortes com aTPO-R, podem ativar a TPO-R e potencialmente permitem efeitos colateraisreduzidos comparado com agonistas de TPO conhecidos. Deste modo, oscompostos peptídeos podem ser úteis para propósitos terapêuticos no tra-tamento de condições mediadas por TPO (por exemplo, trombocitopeniaresultante de quimioterapia, terapia com radiação ou transfusões de medulaóssea) bem como para propósitos de diagnóstico no estudo do mecanismode hematopoiese e para a expansão in vitro de megacariócitos e célulasprogenitoras comprometidas.

Compostos peptídeos adequados para propósitos terapêuticose/ou de diagnóstico têm um IC5o de cerca de 2 mM ou menos, conforme de-terminado através, por exemplo, do ensaio de afinidade de ligação mostradono Exemplo 3 da Patente U.S. Ns 5.869.451, onde um IC5o menor se relacio-na com uma afinidade de ligação mais forte a TPO-R. O ensaio na PatenteU.S. Ns 5.869.451 é como segue: afinidades de ligação de compostos peptí-deos são medidas em um ensaio de ligação por competição. As cavidadesde uma placa de microtitulação são revestidas com 1 mg de estreptavidina,bloqueadas com PBS/BSA a 1 %, seguido por 50 ng de anticorpo de imobili-zação anti-receptor biotinilado (Ab179). As cavidades são então tratadascom uma diluição 1:10 de coleta de TPO-R solúvel. Várias concentrações decomposto peptídeo são misturadas com uma quantidade constante de umaforma truncada de TPO consistindo em resíduos 1-156 fundidos ao terminalC de proteína de ligação de maltose (MBP-TP0156)· As misturas MBP-TPO156 de peptídeo são adicionadas às cavidades revestidas de TPO-R,incubadas por 2 horas a 4°C e então lavadas com PBS. A quantidade deMBP-TPO que é ligada em equilíbrio é medida adicionando um anti-soro decoelho direcionado contra MBP, seguido por IgG anticoelho de cabra conju-gado à fosfatase alcalina. A quantidade de fosfatase alcalina em cada cavi-dade é então determinada usando métodos padrão. O ensaio é conduzidoem uma faixa de concentrações de composto peptídeo e os resultados sãodesenhados em gráfico de modo que o eixo y representa a quantidade deMBP-TPO ligada e o eixo χ representa a concentração de composto peptí-deo. Uma pessoa pode então determinar a concentração na qual o compos-to peptídeo vai reduzir em 50% (IC50) a quantidade de MBP-TPO ligada aTPO-R imobilizada. A constante de dissociação (Kd) para o peptídeo deveser similar a IC50 usando essas condições de ensaio. Para propósitos farma-cêuticos, compostos peptídeos têm de preferência um IC5o de não mais doque cerca de 100 μΜ, com mais preferência, não mais do que 500 nM. Emuma modalidade preferida, o peso molecular do composto peptídeo é de apartir de cerca de 250 a cerca de 8.000 dáltons. Se o composto peptídeo dainvenção for oligomerizado, dimerizado e/ou derivatizado com um polímerohidrofílico conforme aqui descrito, os pesos moleculares de tais compostospeptídeo serão substancialmente maiores e podem variar em qualquer pontode a partir de cerca de 500 a cerca de 120.000 dáltons, com mais preferên-cia de a partir de cerca de 8.000 a cerca de 80.000 dáltons.

Quando usados para propósitos de diagnóstico, os compostospeptídeos da presente invenção são de preferência marcados com um mar-cador detectável e, então, os compostos peptídeo sem tal marcador servemcomo intermediários na preparação de compostos peptídeos marcados.

Um composto peptídeo satisfazendo os critérios definidos parapeso molecular e afinidade de ligação para a TPO-R compreendem 9 oumais aminoácidos onde os aminoácidos são aminoácidos de ocorrência na-tural ou sintéticos (de ocorrência não-natural).

Deste modo, compostos peptídeos preferidos compreendem umcomposto tendo:

(1) um peso molecular de menos do que cerca de 500 dáltons, e

(2) uma afinidade de ligação para TPO-R conforme expresso por um IC5o denão mais do que cerca de 100 μΜ.

onde de a partir de zero a todas as ligações --C(O)NH-- do com-posto peptídeo foram substituídas por uma ligação selecionada do grupoconsistindo em uma ligação -CH2OC(O)NR--; uma ligação fosfonato; umaligação -CH2S(O)2NR-; uma ligação -CH2NR-; e uma ligação -C(O)NR6--;e uma ligação -NHC(0)NH-onde R é hidrogênio ou alquila inferior e R6 éalquila inferior,

ainda onde o terminal N do dito composto peptídeo é seleciona-do do grupo consistindo em um grupo -NRR1; um grupo -NRC(O)R; umgrupo -NRC(O)OR; um grupo -NRS(O)2R; um grupo -NHC(O)NHR; umgrupo succinimida; um grupo benziloxicarbonil-NH-; e um grupo benziloxi-carbonil-NH- tendo de a partir de 1 a 3 substituintes no anel fenila selecio-nados do grupo consistindo em alquila inferior, alcóxi inferior, cloro e bromo,onde R-e R1 são independentemente selecionados do-grupo consistindo emhidrogênio e alquila inferior,

e ainda onde o terminal C do dito composto peptídeo tem a fór-mula -C(O)R2 onde R2 é selecionado do grupo consistindo em hidróxi, alcóxiinferior e -NR3R4 onde R3 e R4 são independentemente selecionados dogrupo consistindo em hidrogênio e alquila inferior e onde o átomo de nitro-gênio do grupo -NR3R4 pode ser opcionalmente o grupo amina do terminalN do peptídeo de modo a formar um peptídeo cíclico,e seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Em uma modalidade relacionada, a invenção refere-se a umcomposto peptídeo marcado compreendendo um composto peptídeo comoacima descrito tendo covalentemente ligado a ele um marcador capaz dedetecção.

Em uma modalidade, o composto peptídeo núcleo compreendeuma seqüência de aminoácidos: (SEQ ID N0:2).Xg Xe G Xi X2 X3 X4 X5 X6 X7

onde X9 é A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T ou V; e X8 é A, C, D,Ε, K, L, Q, R, S, T ou V; e X6 é um resíduo B-(2-naftil)alanina (referida aquicomo "2-Nal"). Com mais preferência, X9 é A ou I; e X8 é D, E ou K. Ainda,X1 é C, L, Μ, P, Q, V; X2 é F, K, L, N, Q, R, S, T ou V; X3 é C, F, I, L, M, R, S,V ou W; X4 é qualquer um dos 20 L-aminoácidos geneticamente codificados;X5 é A, D, E, G, K, M1 Q1 R, S, Τ, V ou Y; e X7 é C, G, I, K, L, M, N, R ou V.

Um composto peptídeo particularmente preferido inclui a se-qüência de aminoácido I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) (SEQ IDNO:7), onde (2-Nal) é B-(2-naftil)alanina e (Sar) é sacosina.

Em outra modalidade, os compostos peptídeos da presente in-venção são de preferência dimerizados ou oligomerizados para aumentar aafinidade e/ou atividade dos compostos. Um exemplo de um composto pep-tídeo dimerizado preferido inclui, mas não está limitado a, o que segue:

<formula>formula see original document page 8</formula>

onde X-io é um resíduo de sarcosina ou β-alanina (SEQ ID NO:7). A estruturacima pode ser também representada pela estrutura que segue:(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2.

Quando X10 é uma sarcosina, o composto tem a estrutura quesegue:

<formula>formula see original document page 8</formula>

onde (2-Nal) é β-(2-naftil)alanina e (Sar) é sarcosina (SEQ ID NO:7). Estecomposto peptídeo, que pode ser também representado pela estrutura quesegue (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar))2K-NH2 é referido aqui como "Com-posto TPO Ns 1".

Em ainda uma modalidade adicional, os compostos peptídeospreferidos para uso na presente invenção incluem compostos peptídeos quesão covalentemente ligados a um ou mais de uma variedade de polímeroshidrofílicos. Polímeros hidrofílicos adequados incluem, mas não estão limita-dos a, polialquiléteres conforme exemplificado por polietileno glicol e polipro-pileno glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialcenos, polivinilálco-ol, polivinilpirrolidona, celulose e derivados de celulose, dextrano e derivadosde dextrano, etc., conforme descrito na Patente U.S. Nq 5.869.451, cujo con-teúdo em sua totalidade é aqui incorporado a título de referência.

Os compostos peptídeos descritos aqui são úteis para a preven-

ção e tratamento de doenças mediadas por TPO e, particularmente, paratratamento de distúrbios hematológicos, incluindo, mas não limitado a, trom-bocitopenia resultante de quimioterapia, terapia com radiação ou transfusõesde medula óssea. Deste modo, a presente invenção também provê um mé- todo para tratamento onde um paciente tendo um distúrbio que é suscetívela tratamento com um agonista de TPO recebe, ou é administrado com, umadose ou quantidade-terapeuticamente eficaz de um composto peptídeo dapresente invenção.

A invenção também provê composições farmacêuticas compre- endendo um ou mais dos compostos peptídeos descritos aqui e um veículofisiologicamente aceitável. Essas composições farmacêuticas podem estarem uma variedade de formas incluindo formas de dosagem oral, bem comopós inaláveis e soluções e soluções injetáveis e de infusão.Breve Descrição das Figuras A figura 1 mostra e compara a atividade de Composto TPO Nq 1

com um composto peptídeo da técnica anterior (referido aqui como "compos-to peptídeo da técnica anterior"). A diferença entre o Composto TPO N9I e ocomposto peptídeo da técnica anterior é que o composto peptídeo da técnicaanterior tem uma β-Ο-ηβ^Ν^Ιβη^ (1-Nal) onde (2-Nal) está no CompostoTPO N9 1.

A figura 2 mostra e compara a atividade de Composto TPO Nq 1PEGuiIado com o composto peptídeo da técnica anterior PEGuilado.

A figura 3 mostra e compara a mudança in vivo em contagens deplaqueta em rato demonstrando a potência relativa de Composto TPO N9 1PEGuilado com composto peptídeo da técnica anterior PEGuilado.

As figuras 4 e 5 mostram e comparam o número e volume deplaquetas circulantes de uma maneira dependente da dose, respectivamentequando do uso de composto peptídeo da técnica anterior PEGuiIado e o usode Composto TPO N9 1 PEGuilado.

A figura 6 mostra que doses intravenosas únicas de CompostoTPO N5 1 PEGuilado (30, 100 ou 300 pg/kg) resultam em uma contagem deplaqueta periférica aumentada em ratos Wistar machos normais.

A figura 7 mostra a PK, perfis de concentração - tempo deComposto TPO N2 1 PEGuilado em voluntários do sexo masculino saudá-veis: quadrado cheio - Composto TPO Nq 1 PEGuilado, 0,75 pg/kg i.v.; dia-mante aberto - Composto TPO N5 1 PEGuilado, 1,5 pg/kg i.v.; triângulo paracima cheio - Composto TPO Ne 1 PEGuilado, 2,25 pg/kg i.v.; triângulo abertopara baixo - Composto TPO Ns 1 PEGuilado, 3 pg/kg i.v.

A figura 8 mostra que as contagens de plaqueta aumentaramdependentemente da dose em voluntários do sexo masculino saudáveis pós-administração de Composto TPO Ne 1 PEGuilado.

A figura 9 mostra que níveis de TPO endógenos aumentaramdependentemente da dose em voluntários do sexo masculino saudáveis pós-administração de Composto TPO Ne 1 PEGuilado.

Descrição de Modalidades Específicas

I. Definições e Parâmetros Gerais

As definições que seguem são mostradas para ilustrar e definir osignificado e escopo dos vários termos usados para descrever a presenteinvenção.

"Agonista" refere-se a um Iigante biologicamente ativo que seliga a seu receptor biologicamente ativo complementar e ativa o último oupara causar uma resposta biológica no receptor ou para aumentar a ativida-de biológica preexistente do receptor.

"Composto peptídeo" refere-se a uma molécula que hidrolisa emaminoácidos e/ou derivados de aminoácidos e/ou substitutos de aminoácido.

"Sais farmaceuticamente aceitáveis" referem-se aos sais de me-tal alcalino, metal alcalino-terroso e de amônio não-tóxicos geralmente usa-dos na indústria farmacêutica incluindo os sais de sódio, potássio, lítio, cál-cio, magnésio, bário, amônio e protamina, que são preparados através demétodos bem-conhecidos na técnica. O termo também inclui sais de adiçãoácidos não-tóxicos, que são geralmente preparados através de reação doscompostos da invenção com um ácido orgânico ou inorgânico adequado.Sais representativos incluem os sais de cloridrato, bromidrato, sulfato, bissul-fato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fos-fato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, napsilato e simi-lar.

"Sal de adição ácido farmaceuticamente aceitável" refere-se à-queles sais que retêm a eficácia e propriedades biológicas das bases livres eque não são biologicamente ou de outro modo indesejados, formados comácidos inorgânicos tal como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúri-co, ácido nítrico, ácido fosfórico e similar, e ácidos orgânicos tal como ácidoacético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácidomálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácidotartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, áci-do metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácidosalicílico e similar. Para uma descrição de sais de adição ácidos farmaceuti-camente aceitáveis como pró-fármacos vide Bundgaard, H., supra.

"Éster farmaceuticamente aceitável" refere-se àqueles ésteresque retêm, quando da hidrólise da ligação éster, a eficácia e propriedadesbiológicas do ácido carboxílico ou álcool e não são biologicamente ou deoutro modo indesejáveis. Para uma descrição de ésteres farmaceuticamenteaceitáveis como pró-fármacos, vide Bundgaard, H., Ed., Design of Prodrugs,Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Esses ésteres são tipica-mente formados a partir do ácido carboxílico correspondente e um álcool.Em geral, formação de éster pode ser realizada através de técnicas sintéti-cas convencionais (vide, por exemplo, March, Advanced Organic Chemistry,4ê Ed., John Wiley & Sons, Nova York (1992), 393-396 e referências citadasnele, e Mark e outros, Encyclopedia of Chemical Technology, John Wlley &Sons, Nova York (198)). O componente álcool do éster vai geralmente com-preender (i) um álcool C2-C12 alifático que pode ou não conter uma ou maisligações duplas e pode ou não conter carbonos ramificados ou (ii) álcooisC7-C12 aromáticos ou heteroaromáticos. A presente invenção também com-preende o uso dessas composições que são ambos ésteres conforme aquidescrito e ao mesmo tempo são os sais de adição ácidos farmaceuticamenteaceitáveis deles.

"Amida farmaceuticamente aceitável" refere-se àquelas amidasque retêm, quando da hidrólise da ligação amida, a eficácia e propriedadesbiológicas do ácido carboxílico ou amina e não são biologicamente ou deoutro modo indesejáveis. Para uma descrição de amidas farmaceuticamenteaceitáveis como pró-fármacos, vide Bundgaard, H., Ed., Design of Prodrugs,Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Essas amidas são tipica-mente formadas a partir do ácido carboxílico correspondente e uma amina.Em geral, formação de amida pode ser realizada através de técnicas sintéti-cas convencionais (March, Advanced Organic Chemistry, 4- Ed., John Wiley& Sons, Nova York (1992), 393 e Mark e outros, Encyclopedia of ChemicalTechnology, John Wlley & Sons, Nova York (198)). A presente invençãotambém compreende o uso dessas composições que são ambos amidasconforme aqui descrito e ao mesmo tempo são os sais de adição ácidosfarmaceuticamente aceitáveis delas.

"Veículo farmaceuticamente ou terapeuticamente aceitável" refe-re-se a um meio veículo que não interfere com a eficácia da atividade bioló-gica dos ingredientes ativos e que não é tóxico para o hospedeiro ou pacien-te.

"Estereoisômero" refere-se a um composto químico tendo osmesmos peso molecular, composição química e constituição que o outro,mas com átomos agrupados diferentemente. Isto é, certas porções químicasidênticas estão em orientações diferentes em espaço e, então, quando pu-ras, têm a habilidade em girar o plano de luz polarizada. No entanto, algunsestereoisômeros puros podem ter uma rotação óptica que é tão pequenaque é indetectável com instrumentação presente. Os compostos da presenteinvenção podem ter um ou mais átomos de carbono assimétricos e entãoincluem vários estereoisômeros. Todos os estereoisômeros estão incluídosno escopo da invenção."Quantidade terapeuticamente ou farmaceuticamente eficaz"conforme aplicado às composições da presente invenção refere-se à quanti-dade de composição suficiente para induzir um resultado biológico desejado.Este resultado pode ser alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doen-ça, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Na pre-sente invenção, o resultado vai tipicamente envolver uma diminuição dasrespostas imunológicas e/ou inflamatórias à infecção ou dano a tecido.

Resíduos de aminoácido em peptídeos são abreviados comosegue: Fenilalanina é Phe ou F; Leucina é Leu ou L; Isoleucina é Ile ou I;Metionina é Met ou M; Valina é Val ou V; Serina é Ser ou S; Prolina é Pro ouP; Treonina é Thr ou T; Alanina é Ala ou A; Tirosina é Tyr ou Y; Histidina éHis ou H; Glutamina é Gln ou Q; Asparagina é Asn ou N; Lisina é Lys ou K;Ácido Aspártico é Asp ou D; Ácido Glutâmico é Glu ou E; Cisteína é Cys ouC; Triptofano é Trp ou W; Arginina é Arg ou R; e Glicina é Gly ou G. Adicio-nalmente, t-Buo é t-butilóxi, Bzl é benzila, CHA é cicloexilamina, Ac é acetila,Me é metila, Pen é penicilamina, Aib é ácido aminobutírico, Nva é norvalina,Abu é ácido aminobutírico, Thi é tienilalanina, OBn é O-benzila e hyp é hi-droxiprolina.

Análogos de peptídeo são geralmente usados na indústria far-macêutica como fármacos não-peptídeo com propriedades análogas àquelasdo peptídeo molde. Esses tipos de compostos não-peptídeos são chamados"peptideomiméticos" ou "peptídeo miméticos" ou "peptidomiméticos" (Luth-man e outros, A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2-Ed., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew. Chem.Int. Ed. Engl., 33:1699-1720 (1994); Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15:29(1986); Veber e Freidinger TINS, p. 392 (1985); e Evans e outros, J. Med.Chem. 30:1229 (1987), que são aqui incorporados a título de referência).Peptídeos miméticos que são estruturalmente similares a peptídeos terapeu-ticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ouprofilático equivalente ou aumentado. Em geral, peptidomiméticos são estru-turalmente similares a um polipeptídio paradigma (isto é, um polipeptídio quetem uma atividade biológica ou farmacológica), tal como polipeptídio de liga-ção a receptor de ocorrência natural, mas têm uma ou mais ligações peptí-deo opcionalmente substituídas por uma ligação alternativa tal como --CH2NH--, -CH2S-, etc., através de métodos conhecidos na técnica e descri-tos mais nas referências que seguem: Spatola, A. F. em Chemistry and Bio-chemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein1 eds., MareeiDekker, Nova York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (Março 1983),Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (revisão geral); Morley,Trends Pharm. Sei. pp. 463-468 (1980), (revisão geral); Hudson e outros, Int.J. Pept. Prot. Res., 14:177-185 (1979); Spatola e outros, Life Sci., 38:1243-1249 (1986); Hann1 J. Chem. Soe. Perkin Trans. I, 307-314 (1982); Almquiste outros, J. Med. Chem., 23:1392-1398, (1980); Jennings-White e outros,Tetrahedron Lett. 23:2533 (1982); Szelke e outros, European Appln. EP45665 (1982); Holladay e outros, Tetrahedron Lett., 24:4401-4404 (1983);and Hruby, Life Sci., 31:189-199 (1982); cada um dos quais é aqui incorpo-rado a título de referência. Uma ligação não-peptídeo particularmente prefe-rida é -CH2NH-. Tais peptídeos miméticos podem ter vantagens significan-tes sobre as modalidades de polipeptídeo, incluindo, por exemplo: produçãomais econômica, maior estabilidade química, propriedades farmacológicasaumentadas (meia-vida, absorção, potência, eficácia, etc.), especificidadealterada (por exemplo, um espectro amplo de atividades biológicas), antige-nicidade reduzida e outros. Marcação de peptidomiméticos geralmente en-volve ligação covalente de um ou mais marcadores, diretamente ou atravésde um espaçador (por exemplo, um grupo amida), a posição(ões) de não-interferência nos peptidomiméticos que são previstas através de dados deestrutura-atividade quantitativos e/ou modelagem molecular. Tais posiçõesde não-interferência geralmente são posições que não formam contatos dire-tos com a(s) macromolécula(s) (por exemplo, moléculas da superfamília deimunoglobulina) às quais peptidomiméticos se ligam para produzir o efeitoterapêutico. Derivação (por exemplo, marcação) de peptidomiméticos nãodeve interferir substancialmente com a atividade biológica ou farmacológicadesejada do peptidomimético. Em geral, peptidomiméticos de peptídeos deligação a receptor se ligam ao receptor com alta afinidade e possuem ativi-dade biológica detectável (isto é, são agonísticos ou antagonísticos parauma ou mais mudanças fenotípicas mediadas por receptor).

Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de umaseqüência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo,D-Iisina ou lugar de L-lisina) pode ser usada para gerar mais peptídeos está-veis. Ainda, peptídeos não-naturais compreendendo uma seqüência de con-senso ou uma variação de seqüência de consenso substancialmente idênti-ca podem ser gerados através de métodos conhecidos na técnica (Rizo eoutros, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992), incorporado aqui a título de refe-rência); por exemplo, através da adição de resíduos cisteína internos capa-zes de formar pontes dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.— nMarcador detectável - refere-se a materiais que, quando cova-

Ientemente ligados aos compostos peptídeo da presente invenção, permitemdetecção dos compostos peptídeos in vivo no paciente ao qual o composto peptídeo foi administrado. Marcadores detectáveis adequados são bem-conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, radioisótopos, marca-dores fluorescentes (por exemplo, fluoresceína) e similar. O marcador detec-tável particular empregado não é crítico e é selecionado com relação à quan-tidade de marcador a ser empregada bem como a toxidez do marcador na quantidade de marcador empregada. Seleção do marcador com relação atais fatores está dentro da habilidade da técnica.

Ligação covalente do marcador detectável ao composto peptí-deo é realizada através de métodos convencionais bem-conhecidos na téc-nica. Por exemplo, quando o radioisótopo 125I é empregado como o marca- dor detectável, ligação covalente de 125I ao composto peptídeo pode serconseguida através da incorporação do aminoácido tirosina ao compostopeptídeo e então iodinação do composto peptídeo (vide, por exemplo, Wea-ner e outros, Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds,PP. 137-140 (1994)). Incorporação de tirosina ao terminal N ou C do com- posto peptídeo pode ser conseguida através de química bem-conhecida. Damesma maneira, 32P pode ser incorporado ao composto peptídeo comouma porção fosfato através de, por exemplo, um grupo hidróxi no compostopeptídeo usando química convencional.

II. Visão Geral

A presente invenção provê compostos peptídeos que se ligam ae ativam o a TPO-R ou de outro modo se comportam como um agonista deTPO. Esses compostos peptídeos incluem compostos peptídeo "líderes" ecompostos peptídeos "derivados" construídos de modo a terem a mesmaestrutura ou formato molecular ou um similar que os compostos peptídeoslíderes, mas que diferem dos compostos peptídeo líderes ou com relação àsusceptibilidade à hidrólise ou proteólise e/ou com relação a outras proprie-dades biológicas, tal como afinidade maior para o receptor. A presente in-venção também provê composições compreendendo uma quantidade eficazde um composto peptídeo, e, mais particularmente, um composto peptídeoque é útil para tratamento de distúrbios hematológicos, e, particularmente,trombocitopenia associada com quimioterapia, terapia com radiação outransfusões de medula óssea.

Foi constatado que o composto peptídeo núcleo pode compre-ender uma seqüência de aminoácidos: (SEQ ID N0:2): X9 X8 G Xi X2 X3 X4X5 Xe X7, onde X6 pode ser p-(2-naftil)alanina e onde X9 é A, C, E, G, I, L, M,P, R, Q, S, T ou V; e X8 é A, C, D, Ε, K, L, Q, R, S, T ou V. Com mais prefe-rência, X9 é A ou I; e X8 é D, E ou K. Ainda Xi é C, L, Μ, P, Q, V; X2 é F, K,L, N, Q, R, S, T ou V; X3 é C, F, I, L, M, R, S, V ou W; X4 é qualquer um dos20 L-aminoácidos geneticamente codificados; X5 é A, D, E, G, Κ, M, Q, R, S,Τ, V ou Y; e X7 é C, G, I, K, L, Μ, N, R ou V.

No entanto, conforme descrito mais aqui, foi constatado quesubstituindo Xe por p-(2-naftil)alanina, o composto provê propriedades dife-rentes ao composto contendo p-(1-naftil)alanina. Deste modo, um compostopeptídeo particularmente preferido inclui a seqüência de aminoácido (SEQID N0:7): I E G P T L R Q (2-Nal) LAAR (Sar).

Em outra modalidade, os compostos peptídeos da presente in-venção são de preferência dimerizados ou oligomerizados para aumentar aafinidade e/ou atividade dos compostos. Um exemplo de um composto pep-tídeo dimerizado preferido inclui, mas não está limitado a, o que segue:<formula>formula see original document page 17</formula>

onde X-io é um resíduo sarcosina ou β-alanina (SEQ ID NO:7). Deve ser no-tado que um resíduo X10 pode ser sarcosina e o outro resíduo pode ser β-alanina. A estrutura acima pode ser representada pelo que segue: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2.

Um composto peptídeo preferido é como segue:

<formula>formula see original document page 17</formula>

onde (2-Nal) é p-(naftil)alanina e (Sar) é sarcosina (SEQ ID NO:7). Estecomposto peptídeo é referido aqui como "Composto TPO N9 1".

Compostos peptídeos tendo um IC50 maior do que cerca de 100mM não têm ligação suficiente para permitir o uso nem no aspecto de diag-nóstico nem terapêutico da presente invenção. De preferência, para propósi-tos de diagnóstico, os compostos peptídeo têm um IC50 de cerca de 2 mMou menos e, para propósitos farmacêuticos, os compostos peptídeo têm umIC50 de cerca de 100 μΜ ou menos.

A figura 1 compara a atividade de três bateladas diferentes deComposto TPO Ns 1 com uma batelada de composto peptídeo da técnicaanterior usando técnicas de ensaio de unidades Iuminescentes relativas pa-drão. O ensaio emprega células de murino engenheiradas para expressarestavelmente o receptor de TPO humano e um construto repórter de Iucife-rase direcionado pelo promotor fos. A diferença entre Composto TPO N- 1 eo composto peptídeo da técnica anterior é que o composto peptídeo da téc-nica anterior tem uma p-(1-naftil)alanina (1-Nal) onde a (2-Nal) está no com-posto TPO N5 1. O Composto TPO Ne 1 é referido como 2-Nal e o compostopeptídeo da técnica anterior é referido como 1 -NaI (Técnica Anterior) na figu-ra 1. Conforme mostrado a partir da figura 1, a atividade é similar para cadacomposto.

A figura 2 compara a atividade de várias bateladas diferentes deComposto TPO N9 1 PEGuiIado (a peguilação dos compostos da presenteinvenção é descrita em mais detalhes abaixo). Ambas bateladas do compos-to peptídeo da técnica anterior PEGuiIado mostram atividade com essenci-almente o mesmo nível de atividade que o composto peptídeo da técnicaanterior não-PEGuilado. As linhas restantes ilustram a atividade de batela-das diferentes de Composto TPO N2 1 PEGuilado. Conforme mostrado nafigura 2, neste modelo, o último tem menos atividade com relação aos com-postos peptídeo da técnica anterior PEGuilados, Composto TPO N9 1 PE-Guilado é referido como PEG-2-Nal e composto peptídeo da técnica anteriorPEGuilado é referido como PEG-1-Nal (Técnica Anterior) na figura 2.

A figura 3 demonstra a potência relativa de composto peptídeoda técnica anterior PEGuilado e Composto TPO N-1 PEGuilado. Através deum modelo de rato, a figura 3 mostra a mudança in vivo em contagens deplaqueta após administração de composto peptídeo da técnica anterior PE-Guilado e Composto TPO Ng 1 PEGuilado. Conforme mostrado pela figura 3,a dose mais alta do COMPOSTO TPO N9 1 PEGuilado tem a mesma ativi-dade que a menor dose do composto peptídeo da técnica anterior PEGuila-do. Um composto menos potente pode prover um estímulo menos drástico àcélula alvo, que poderia reduzir o risco de efeitos colaterais causados porestimulação em excesso da célula alvo, tal como trombocitopenia exacerba-da seguindo ciclo subseqüente de quimioterapia. O Composto TPO N9 1PEGuilado é referido como PEG-2-Nal e o composto peptídeo da técnicaanterior PEGuilado é referido como PEG-1-Nal (Técnica Anterior) na figura3.

As figuras 4 e 5 mostram os resultados de um estudo de doseresposta de igual para igual de um composto peptídeo da técnica anteriorPEGuilado e Composto TPO N9 1 PEGuilado em camundongos normais. OComposto TPO N9 1 PEGuilado é referido como PEG-2-Nal e o compostopeptídeo da técnica anterior PEGuiIado é referido como PEG-1-Nal (TécnicaAnterior) nas figuras 4 e 5. A figura 4 mostra aumentos em níveis de plaque-ta e a figura 5 mostra Volume de Plaqueta Médio seis (6) dias seguindo tra-tamento. A faixa de dose foi de a partir de 10 a 3000 ug/kg. Ambos compos-tos peptídeos aumentaram o número de plaquetas circulantes de uma ma-neira dependente da dose com aumentos com relação ao grupo controleobservados em doses tão baixas quanto 30 ug/kg para ambos compostos.Na resposta máxima, esses compostos peptídeos elevaram as contagens deplaqueta para níveis que eram até 4 vezes maiores do que os valores decontrole. As curvas de dose-resposta para esses compostos peptídeos erammuito similares indicando que neste modelo não havia essencialmente ne-nhuma diferença entre os dois artigos de teste com base nesses pontos fi-nais.

IV. Preparação de Compostos Peptídeos

A. Síntese de Fase Sólida

Os compostos peptídeos da invenção podem ser preparadosatravés de métodos clássicos conhecidos na técnica, por exemplo, usandotécnicas de fase sólida padrão. Os métodos padrão incluem síntese de fasesólida exclusiva, métodos de síntese de fase sólida parciais, condensaçãode fragmento, síntese de solução clássica e até mesmo através de tecnolo-gia de DNA recombinante. Vide, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,85:2149 (1963), incorporado aqui a título de referência. Em fase sólida, asíntese é tipicamente iniciada a partir da extremidade C-terminal do peptídeousando uma resina alfa-amino protegida. Um material de partida adequadopode ser preparado, por exemplo, ligando o alfa-aminoácido requerido auma resina clorometilada, uma resina de hidroximetila ou uma resina debenzidrilamina. Tal resina clorometilada é vendida sob a marca registradaBIO-BEADS SX-1 pela Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, e a preparaçãoda resina de hidroximetila é descrita por Bodonszky e outros, Chem. Ind.(Londres), 38:1597 (1966). A resina de benzidrilamina (BHA) foi descrita porPietta e Marshall, Chem. Commn., 650 (1970) e está comercialmente dispo-nível da Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, Calif., na forma de cloridrato.Deste modo, os compostos peptídeos da invenção podem serpreparados através de acoplamento de um aminoácido alfa-amino protegidoà resina clorometilada com o auxílio de, por exemplo, catalisador de bicar-bonato de césio, de acordo com o método descrito por Gisin1HeIv., Chim.Acta, 56:1467 (1973). Após o acoplamento inicial, o grupo de proteção alfa-amino é removido através de uma escolha de reagentes incluindo soluçõesde ácido trifluoracético (TFA) ou ácido clorídrico (HCI) em solventes orgâni-cos em temperatura ambiente.

Os grupos de proteção alfa-amino são aqueles conhecicos serúteis na técnica de síntese em etapas de peptídeos. Incluídos estão os gru-pos de proteção do tipo acila (por exemplo, formila, trifluoracetila, acetila),grupos deproteção do tipo uretana aromáticos (por exemplo, benziloxicar-bonila (Cbz) e Cbz substituída), grupos de proteção uretana alifáticos (porexemplo, butoxicarbonila (Boc), isopropiloxicarbonila, cicloexiloxicarbonila) egrupos de proteção do tipo alquila (por exemplo, benzila, trifenilmetila). Boc eFmoc são grupos de proteção preferidos. O grupo de proteção de cadeialateral permanece intacto durante acoplamento e não é separado durante adesproteção do grupo de proteção amino-terminal ou durante acoplamento.O grupo de proteção de cadeia lateral deve ser removível quando do términoda síntese do peptídeo final e sob condições de reação que não vão alterar opeptídeo alvo.

Os grupos de proteção de cadeia lateral para Tyr incluem tetrai-dropiranila, terc-butila, tritila, benzila, Cbz, Z--Br-Cbz e 2,5-diclorobenzila. Osgrupos de proteção de cadeia lateral para Asp incluem benzila, 2,6-diclorobenzila, metila, etila e cicloexila. Os grupos de proteção de cadeia late-ral para Thr e Ser incluem acetila, benzila, tritila, tetraidropiranila, benzila, 2,6-diclorobenzila e Cbz. O grupo de proteção de cadeia lateral para Thr e Ser ébenzila. Os grupos de proteção de cadeia lateral para Arg incluem nitro, Tosila(Tos), Cbz, adamantiloxicarbonil mesitoilsulfonila (Mts) ou Boc. Os grupos deproteção de cadeia lateral para Lys incluem Cbz, 2-clorobenziloxicarbonila (2-Cl-Cbz), 2-bromobenziloxicarbonila (2-BrCbz), Tos ou Boc.

Após remoção do grupo de proteção alfa-amino, os aminoácidosprotegidos restantes são acoplados em etapas na ordem desejada. Um ex-cesso de cada aminoácido protegido é geralmente usado com um ativadorde grupo carboxila apropriado tal como dicicloexilcarbodiimida (DCC) emsolução, por exemplo, em misturas de cloreto de metileno (CH2CI2), dimetilformamida (DMF).

Após a seqüência de aminoácido desejada ter sido completada,o peptídeo desejado é desacoplado do apoio de resina através de tratamen-to com um reagente tal como ácido trifluoracético ou fluoreto de hidrogênio(HF), que não apenas cliva o peptídeo da resina, mas também cliva todos osgrupos de proteção de cadeia lateral restantes. Quando a resina clorometila-da é usada, tratamento com fluoreto de hidrogênio resulta na formação dosácidosde peptídeos livres. Quando a resina benzidrilamina é usada, trata-mento com fluoreto de hidrogênio resulta diretamente na amida de peptídeolivre. Alternativamente, quando a resina clorometilada é empregada, o peptí-deo protegido de cadeia lateral pode ser desacoplado através de tratamentoda resina peptídeo com amônia para dar a amida protegida de cadeia dese-jada ou com uma alquilamina para dar uma alquilamida ou dialquilamida pro-tegida de cadeia lateral. Proteção de cadeia lateral é então removida da ma-neira comum através de tratamento com fluoreto de hidrogênio para dar asamidas, alquilamidas ou dialquilamidas livres.

Os procedimentos de síntese de peptídeo de fase sólida sãobem-conhecidos na técnica e descritos mais por John Morrow Stewart e Ja-nis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Syntheses (2ê Ed., Pierce ChemicalCompany, 1984). ,

B. Aminoácidos Sintéticos

Esses procedimentos podem ser também usados para sintetizarpeptídeos onde aminoácidos outros que não os 20 aminoácidos genetica-mente codificados, de ocorrência natural, são substituídos em uma, duas oumais posições de qualquer um dos compostos da invenção. Uma pessoa pode substituir as cadeias laterais de ocorrência

natural dos 20 aminoácidos geneticamente codificados (ou D aminoácidos)com outras cadeias laterais, por exemplo, com grupos tal como alquila, alqui-la inferior, alquila de 4, 5, 6 ou 7 membros cíclica, amida, alquil amida inferi-or, di(alquil inferior) amida, alcóxi inferior, hidróxi, carbóxi e o seu derivadoéster inferior e com heterocíclico de 4, 5, 6 a 7 membros. Em particular, aná-logos de prolina onde o tamanho de anel dos resíduos prolina é mudado de5 membros para 4, 6 ou 7 membros podem ser empregados. Grupos cíclicospodem ser saturados ou insaturados, e se insaturados, podem ser aromáti-cos ou não-aromáticos. Grupos heterocíclicos contêm de preferência um oumais heteroátomos de nitrogênio, oxigênio e/ou enxofre. Exemplos de taisgrupos incluem a furazanila, furila, imidazolidinila, imidazolila, imidazolinila,isotiazolila, isoxazolila, morfolinila (por exemplo, morfolino), oxazolila, pipe-razinila (por exemplo, 1-piperazinila), piperidila (por exemplo, 1-piperidila,piperidina), piranila, pirazinila, pirazolidinila, pirazolinila, pirazolila, piridazini-la, piridila, pirimidinila, pirrolidinila (por exemplo, 1-pirrolidinila), pirrolinila,pirrolila, tiadiazolila, tiazolila, tienila, tiomorfolinila (por exemplo, tiomorfolino)e triazolila. Esses grupos heterocíclicos podem ser substituídos ou não-substituídos. Onde um grupo for substituído, o substituinte pode ser alquila,alcóxi, halogênio, oxigênio ou fenila substituída ou não-substituída.

Uma pessoa pode também modificar os peptídeos da presenteinvenção através de fosforilação (vide, por exemplo, W. Bannwarth e outros,Biorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6(17):2141-2146 (1996)) e outrosmétodos para fabricação de derivados de peptídeo dos compostos da pre-sente invenção são descritos em Hruby e outros, Biochem. J., 268(2):249-262 (1990). Deste modo, os compostos peptídeos da invenção também ser-vem como uma base para preparar peptídeo miméticos com atividade bioló-gica similar.

C. Modificações Terminais

Aqueles versados na técnica reconhecem que uma variedade detécnicas está disponível para construção de compostos peptídeos com amesma atividade biológica desejada ou similar que o composto peptídeo cor-respondente, mas com atividade mais favorável do que o composto peptídeocom relação à solubilidade, estabilidade e susceptibilidade à hidrólise e prote-ólise. Vide, por exemplo, Morgan e outros, Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252(1989). A seguir são descritos métodos para preparação de compostos peptí-deos modificados no grupo amino N-terminal, no grupo carboxila C-terminale/ou mudança de uma ou mais das ligações amido no peptídeo para uma li-gação não-amido. Sendo compreendido que duas ou mais tais modificaçõespodem ser acopladas em uma estrutura de composto peptídeo (por exemplo,modificação no grupo carboxila C-terminal e inclusão de uma ligação - Chfe-carbamato entre dois aminoácidos no composto peptídeo).1. Modificações N-terminais

Os compostos peptídeos são tipicamente sintetizados como oácido livre mas, conforme acima mencionado, poderiam ser prontamentepreparados como a amida ou éster. Uma pessoa pode também modificar oterminal amino e/ou carbóxi dos-compostos peptídeos da invenção para pro-duzir outros compostos da invenção. Modificações amino terminais incluemmetilação, acetilação, adição de um grupo benziloxicarbonila ou bloqueio doterminal amino com qualquer grupo de bloqueio contendo uma funcionalida-de carboxilato definida por RCOO--, onde R é selecionado do grupo consis-tindo em naftila, acridinila, esteroidila e grupos similares. Modificações car-bóxi terminais incluem substituição do ácido livre com um grupo carboxami-da ou formação de uma Iactama cíclica no terminal carbóxi para introduzirrestrições estruturais.

Modificações amino terminais são conforme acima mencionadoe incluem alquilação, acetilação, adição de um grupo carbobenzoíla, forma-ção de um grupo succinimida, etc.. (Vide, por exemplo, Murray e outros,Burger1S Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5a ed., Vol. 1, Manfred E.Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc. (1995)). Especificamente, o grupo ami-no N-terminal pode ser então reagido como segue:

(a) para formar um grupo amida da fórmula RC(0)NH--onde R éconforme acima definido através da reação com um haleto ácido ou anidridosimétrico. Tipicamente, a reação pode ser conduzida através de contato dequantidades mais ou menos equimolares ou em excesso (por exemplo, cer-ca de 5 equivalentes) de um haleto ácido ao peptídeo em um diluente inerte(por exemplo, diclorometano), de preferência contendo um excesso (por e-xemplo, cerca de 10 equivalentes) de amina terciária, tal como diisopropileti-lamina, para seqüestrar o ácido gerado durante a reação. Condições de rea-ção são de outro modo convencionais (por exemplo, temperatura ambientepor 30 minutos). Alquilação do amino terminal para prover uma substituiçãoN-alquila inferior seguido por reação com um haleto ácido conforme descritoacima vai prover grupo N-alquil amida da fórmula RC(O)NR--;

(b) para formar um grupo succinimida através de reação comanidrido succínico. Como antes, uma quantidade aproximadamente equimo-Iar ou um excesso de anidrido succínico (por exemplo, cerca de 5 equivalen-tes) pode ser empregado e o grupo amino é convertido na succinimida atra-vés de métodos bem-conhecidos a técnica incluindo o uso de um excesso(por exemplo, dez equivalentes) de uma amina terciária tal como diisopropi-Ietilamina em um solvente inerte adequado (por exemplo, diclorometano).

Vide, por exemplo, Wollenberg e outros, Patente U.S. N9 4.612.132 que éaqui incorporada a título de referência em sua totalidade. É compreendidoque o grupo succínico pode ser substituído com, por exemplo, substituintesalquila ou -SR que são preparados de uma maneira convencional para pro-ver succinimida substituída no terminal N do peptídeo. Tais substituintes al-quila são preparados através de reação de uma olefina inferior com anidridomaléico da maneira descrita por Wollenberg e outros, supra, e substituintes-SR são preparados através de reação de RSH com anidrido maléico ondeR é conforme acima definido;

(c) para formar um grupo benziloxicarbonil-NH-ou benziloxicar-bonil-NH-substituído através de reação com aproximadamente uma quanti-dade equivalente ou um excesso de CBZ-CI (isto é, cloreto de benziloxicar-bonila) ou um CBZ--CI substituído em um diluente inerte adequado (por e-xemplo, diclorometano) de preferência contendo uma amina terciária paraseqüestrar o ácido gerado durante a reação;

(d) para formar um grupo sulfonamida através de reação comuma quantidade equivalente ou um excesso (por exemplo, 5 equivalentes)de R--(O)2CI em um diluente inerte adequado (diclorometano) para convertera amina terminal em uma sulfonamida onde R é conforme acima definido.De preferência, o diluente inerte contém amina terciária em excesso (porexemplo, dez equivalentes) tal como diisopropiletilamina, para seqüestrar oácido gerado durante a reação. Condições de reação são de outro modoconvencionais (por exemplo, temperatura ambiente por 30 minutos);

(e) para formar um grupo carbamato através de reação com umaquantidade equivalente ou um excesso (por exemplo, 5 equivalentes) de R--OC(O)CI ou R--OC(O)OC6H4 P-NO2 em um diluente inerte adequado (porexemplo, diclorometano) para converter a amina terminal em um carbamatoonde R é conforme definido acima. De preferência, o diluente inerte contémum excesso (por exemplo, cerca de 10 equivalentes) de uma amina terciária,tal como diisopropiletilamina, para seqüestrar qualquer ácido gerado durantea reação. Condições de reação são de outro modo convencionais (por e-xemplo,-temperatura ambiente por 30 minutos); e

(f) para formar um grupo uréia através de reação com uma quan-tidade equivalente ou um excesso (por exemplo, 5 equivalentes) de R—N=C=O em um diluente inerte adequado (por exemplo, diclorometano) paraconverter a amina terminal em um grupo uréia (isto é, RNHC(O)NH--) ondeR é conforme acima definido. De preferência, o diluente inerte contém umexcesso (por exemplo, cerca de 10 equivalentes) de uma amina terciária, talcomo diisopropiletilamina. Condições de reação são de outro modo conven-cionais (por exemplo, temperatura ambiente por cerca de 30 minutos).

2. Modificações C-terminais

Na preparação de compostos peptídeos onde o grupo carboxilaC-terminal é substituído por um éster (isto é, -C(O)OR onde R é conformeacima definido), as resinas usadas para preparar os ácidos peptídeos sãoempregadas, e o peptídeo protegido de cadeia lateral é clivado com base e oálcool apropriado, por exemplo, metanol. Grupos de proteção de cadeia late-ral são então removidos da maneira comum através de tratamento com fluo-reto de hidrogênio para se obter o éster desejado.

Na preparação dos compostos peptídeo onde o grupo carboxilaC-terminal é substituído pela amida --C(O)NR3R4, uma resina benzidrilaminaé usada como o apoio sólido para síntese de peptídeo. Quando do términoda síntese, tratamento com fluoreto de hidrogênio para liberar o peptídeo doapoio resulta diretamente na amida de peptídeo livre (isto é, o terminal C é --C(O)NH2). Alternativamente, uso da resina clorometilada durante a síntesede peptídeo acoplado com reação com amônia para clivar o peptídeo prote-gido na cadeia lateral do apoio dá a amida de peptídeo livre e reação comuma alquilamina ou uma dialquilamina dá uma alquilamida ou dialquilamidaprotegida de cadeia lateral (isto é, o terminal C é -C(O)NRR1 onde R e R1são conforme acima definido). Proteção de cadeia lateral é então removidada maneira comum através de tratamento com fluoreto de hidrogênio paradar as amidas, alquilamidas ou dialquilamidas livres.

Uma pessoa pode também ciclizar os compostos peptídeos dainvenção, ou incorporar um resíduo desâmino ou descarbóxi aos terminaisdo composto peptídeo, de modo que não haja nenhum grupo amino ou car-boxila terminal, para diminuir a susceptibilidade a proteases ou para restrin-gir a conformação do composto peptídeo. Grupos funcionais C-terminais doscompostos peptídeos da presente invenção incluem amida, alquil amida infe-rior, di(alquil inferior) amida, alcóxi inferior, hidróxi e carbóxi, e os seus deri-vados de éster inferior, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Em adição às modificações N-terminal e C-terminal acima, oscompostos peptídeos da invenção, incluindo peptidomiméticos, podem servantajosamente modificados com ou covalentemente acoplados a um oumais de uma variedade de polímeros hidrofílicos. Foi constatado que quandoos compostos peptídeos são derivatizados com um polímero hidrofílico, suasolubilidade e meia-vidas de circulação são aumentadas e sua imunogenici-dade é mascarada. O acima pode ser realizado com pouca, se alguma, di-minuição em sua atividade de ligação. Polímeros não-proteináceos adequa-dos para uso de acordo com a presente invenção incluem, mas não estãolimitados a, polialquiléteres conforme exemplificado por polietileno glicol epolipropileno glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialcenos, álcoolde polivinila, polivinilpirrolidona, celulose e derivados de celulose, dextrano ederivados de dextrano, etc.. Geralmente, tais polímeros hidrofílicos têm umpeso molecular médio variando de a partir de cerca de 500 a cerca de100.000 dáltons, com mais preferência de a partir de cerca de 2.000 a cercae 40.000 dáltons e, com mais preferência ainda, de a partir de cerca de5.000 a cerca de 20.000 dáltons. Em modalidades preferidas, tais polímeroshidrofílicos têm um peso molecular médio de cerca de 5.000 dáltons, 10.000dáltons e 20.000 dáltons.

Os compostos peptídeos da invenção podem ser derivatizadoscom ou acoplado a tais polímeros usando qualquer um dos métodos mostra-dos em Zallipsky, S., Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995); Monfardini, C.e outros, Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995); patente U.S. N9 4.640.835;patente U.S. N9 4.496.689; patenteU.S. N2 4.301.144; patenteU.S. N94.670.417; patente U.S. N9 4.791.192; patente U.S. N9 4.179.337 ou WO95/34326, todos aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

Em uma modalidade aqui preferida, os compostos peptídeos dapresente invenção são derivatizados com polietileno glicol (PEG). PEG é umpolímero de unidades de repetição de oxido de etileno solúvel em água comdois grupos hidroxila terminais. PEGs são classificados por seus pesos mo-leculares que variam tipicamente de a partir de cerca de 500 dáltons a cercade 40.000 dáltons. Em uma modalidade preferida, os PEGs empregados têmpesos moleculares variando de a partir de 5.000 dáltons a cerca de 20.000dáltons. PEG acoplado aos compostos peptídeos da presente invenção po-dem ser ou ramificados ou não-ramificados. (Vide, por exemplo, Monfardini,C. e outros, Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995)). PEGs estão comercial-mente disponíveis da Shearwater Polymers, Inc. (Hunstville, Ala) (agora par-te da Nektar Therapeutics (San Cario, CA), Sigma Chemical Co. e outrascompanhias. Tais PEGs incluem, mas não estão limitados a, monometoxipo-lietileno glicol (MePEG-OH), monometoxipolietileno glicol-succinamato (Me-PEG-S), monometoxipolietileno glicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipolietileno glicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolie-tileno glicol-tresilato (MePEG-TRES) e monometoxipolietileno glicol-imidazolil-carbonila (MePEG-IM).

Resumidamente, em uma modalidade, o polímero hidrofílico queé empregado, por exemplo, PEG, é de preferência capeado em uma extre-midade por um grupo não-reativo tal como um grupo metóxi ou etóxi. Emseguida, o polímero é ativado na outra extremidade através de reação comum agente de ativação adequado, tal como haletos cianúricos (por exemplo,cloreto, brometo ou fluoreto cianúrico), diimadozle, um reagente anidrido (porexemplo, anidrido dialossuccínico, tal como anidrido dibromossuccínico), acilazida, p-diazoniobenzil éter, 3-(p-diazoniofenóxi)-2-hidroxipropiléter) e simi-lar. O polímero ativado é então reagido com um composto peptídeo da pre-sente invenção para produzir um composto peptídeo derivatizado com umpolímero. Alternativamente, um grupo funcional nos compostos peptídeos dainvenção pode ser ativado para reação com o polímero, ou os dois grupospodem ser unidos em uma reação de acoplamento ajustada usando méto-dos de acoplamento conhecidos. Será prontamente compreendido que oscompostos peptídeos da invenção podem ser derivatizados com PEG usan-do uma miríade de outros esquemas de reação conhecidos e usados poraqueles versados na técnica.

Quando os compostos peptídeos são derivatizados com um po-límero hidrofílico, sua solubilidade e meias-vidas de circulação são aumen-tadas e sua imunogenicidade é diminuída. O acima pode ser realizado compouca, se alguma, perda em atividade biológica. Em modalidades preferidas,os peptídeos derivatizados têm uma atividade que é 0,1 a 0,01 vez aquelados peptídeos não-modificados. Em modalidades mais preferidas, os peptí-deos derivatizados têm uma atividade que é 0,1 a 1 vez aquela dos peptí-deos não-modificados. Em modalidades ainda mais preferidas, os peptídeosderivatizados têm uma atividade que é maior do que os peptídeos não-modificados.

D. Modificações da Estrutura Principal

Outros métodos para fabricação de derivados de peptídeo doscompostos da presente invenção são descritos em Hruby e outros, Biochem.J., 268(2):249-262 (1990), incorporado aqui a título de referência. Deste mo-do, os compostos peptídeos da invenção também servem como modelosestruturais para compostos não-peptídeos com atividade biológica similar.Aqueles versados na técnica reconhecem que uma variedades de técnicasestá disponível para construção de compostos com a mesma atividade bio-lógica desejada ou similar que o composto peptídeo líder, mas com atividademais favorável do que o líder com relação à solubilidade, estabilidade e sus-ceptibilidade à hidrólise e proteólise. Vide, Morgan e outros, Ann. Rep. Med.Chem., 24:243-252 (1989), incorporado aqui a título de referência. Essastécnicas incluem substituição da estrutura principal do peptídeo com umaestrutura composta de fosfonatos, amidatos, carbamatos, sulfonamidas, a-minas secundárias e N-metilaminoácidos.

Reagentes adequados incluem, por exemplo, análogos de ami-noácido onde o grupo carboxila do aminoácido foi substituído com uma por-ção adequada para formação de uma das ligações acima.

Similarmente, substituição de uma ligação amino no peptídeocom uma ligação fosfonato pode ser conseguida da maneira mostrada nasPatentes U.S. Nos. 5.359.115 e 5.420.328, cujas descrições são aqui incor-poradas a título de referência em sua totalidade.E. Formação de Ligação Dissulfeto

Os compostos da presente invenção podem existir em uma for-ma ciclizada com uma ligação dissulfeto intramolecular entre os grupos tiolde cisteínas incorporadas, se presentes. Alternativamente, uma ligação dis-sulfeto intermolecular entre os grupos tiol das cisteínas pode ser produzidapara dar um composto dimérico (ou oligomérico superior). Um ou mais dosresíduos cisteína podem ser também substituídos com uma homocisteína.V. Utilidade

Os compostos peptídeos da invenção são úteis in vitro comoferramentas únicas para compreensão do papel biológico da TPO, incluindoa avaliação de muitos fatores imaginados influenciar, e ser influenciados,pela produção de TPO e o processo de ligação de receptor. Os presentescompostos peptídeos são também úteis no desenvolvimento de outros com-postos que se ligam a e ativam TPO-R, porque os presentes compostos pep-tídeos provêem uma informação importante sobre a relação entre estrutura eatividade que deve facilitar tal desenvolvimento.

Os compostos peptídeos são também úteis como Iigantes compe-titivos em ensaios para avaliar novos agonistas do receptor de TPO. Em taismodalidades de ensaio, os compostos peptídeos da invenção podem ser usa-dos sem modificação ou podem ser modificados de uma variedade de modos;por exemplo, através de marcação, tal como covalentemente ou não-covalentemente unindo uma porção que diretamente ou indiretamente provêum sinal detectável. Em qualquer um desses ensaios, os materiais para elespodem ser marcados ou diretamente ou indiretamente. Possibilidades paramarcação direta incluem grupos de marcação tal como: radiomarcadores talcomo 1251, enzimas (Patente U.S. Ne 3.645.090) tal como peroxidase e fosfa-tase alcalina e marcadores fluorescentes (Patente U.S. N9 3.940.475) capazesde monitoramento da mudança em intensidade de fluorescência, mudança decomprimento de onda ou polarização da fluorescência. Possibilidades paramarcação indireta incluem biotinilação de um constituinte seguido por ligaçãoà avidina acoplada a um dos grupos marcadores acima. Os compostos peptí-deos podem também incluir espaçadores ou Iigantes em casos onde os com-postos peptídeos devem ser ligados a um apoio sólido.

Além disso, com base em sua habilidade em se ligar a receptorde TPO, os compostos peptídeos da presente invenção podem ser usadoscomo reagentes para detecção de receptores de TPO em células vivas, célu-las fixadas, em fluidos biológicos, em homogenatos de tecido, materiais bio-lógicos naturais, purificados, etc.. Por exemplo, através da marcação de taiscompostos peptídeos, uma pessoa pode identificar células tendo TPO-R emsuas superfícies. Em adição, com base em sua habilidade em se ligar a re-ceptor de TPO, os compostos peptídeos da presente invenção podem serusados em tingimento in situ, FACS (seleção de célula ativada por fluores-cência), Western blotting, ELISA, etc.. Ainda, com base em sua habilidadeem se ligar ao receptor de TPO, os compostos peptídeos da presente inven-ção podem ser usados em purificação de receptor, ou em células de purifi-cação expressando receptores de TPO na superfície celular (ou dentro decélulas permeabilizadas).

Os compostos peptídeos da presente invenção podem ser tam-bém utilizados como reagentes comerciais para vários usos de pesquisa ediagnóstico médicos. Tais usos incluem, mas não estão limitados a: (1) usocomo um padrão de calibragem para quantificação das atividades de agonis-tas de TPO candidatos em uma variedade de ensaios funcionais; (2) usopara manter a proliferação e crescimento de linhagens de célula dependen-tes de TPO; (3) uso em análise estrutural do receptor de TPO através de co-cristalização; (4) uso para investigar o mecanismo de transdução de si-nal/ativação de receptor de TPO; e (5) outras aplicações de pesquisa e di-agnóstico onde o receptor de TPO é de preferência ativado ou tal ativação éconvenientemente calibrada contra uma quantidade conhecida de um ago-nista de TPO1 e similar.

Os compostos peptídeos da presente invenção podem ser usa-dos para a expansão in vitro de megacariócitos e seus progenitores com-prometidos, ambos em conjunto com citocinas adicionais ou sozinhos. Vide,por exemplo, DiGiusto e outros, Publicação PCT N5 95/05843, que é aquiincorporada a título de referência. Quimioterapia e terapias de radiação cau-sam trombocitopenia matando a população mais madura de megacariócitos,rapidamente se dividindo. No entanto, esses tratamentos terapêuticos po-dem também reduzir o número e viabilidade de células precursoras de me·gacariócito menos mitoticamente ativas, imaturas. Deste modo, melhora datrombocitopenia pela TPO ou os compostos da presente invenção pode serprecipitada através de infusão dos pacientes pós-quimioterapia ou terapia deradiação com uma população das próprias células dele ou dela enriquecidascom megacariócitos e precursores imaturos através de cultura in vitro.Os compostos peptídeos da invenção podem ser também administrados aanimais de sangue quente, incluindo humanos, para ativar a TPO-R in vivo.Deste modo, a presente invenção compreende métodos para tratamentoterapêutico de distúrbios relacionados com TPO que compreende adminis-trar um composto peptídeo da invenção em quantidades suficientes paraimitar o efeito de TPO ou TPO-R in vivo. Por exemplo, os compostos peptí-deos da invenção podem ser administrados para tratar uma variedade dedistúrbios hematológicos, incluindo, mas não limitado a, distúrbios de pla-queta e trombocitopenia, particularmente quando associados com transfu-sões de medula óssea, terapia com radiação e quimioterapia.

Em algumas modalidades da invenção, antagonistas de TPOsão de preferência primeiro administrados a pacientes sofrendo quimiotera-pia ou terapia de radiação, seguido por administração dos agonistas de TPOda invenção.

A atividade dos compostos peptídeos da presente invenção po-de ser avaliada ou in vitro ou in vivo em um dos numerosos modelos descri-tos em McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14:8021 (1992),que é aqui incorporado a título de referência.

De acordo com uma modalidade, as composições da presenteinvenção são úteis para tratamento de trombocitopenia associada com trans-fusões de medula óssea, terapia com radiação ou quimioterapia. Os com-postos peptídeos tipicamente serão administrados profilaticamente antes daquimioterapia, terapia de radiação ou transplante de medula óssea ou apóstal exposição.

Deste modo, a presente invenção também provê composiçõesfarmacêuticas compreendendo, como um ingrediente ativo, pelo menos umdos compostos peptídeos da invenção em associação com um veículo oudiluente farmacêutico. Os compostos peptídeos da presente invenção po-dem ser administrados através de vias de administração oral, pulmonar, pa-rental (injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou subcutâ-nea), inalação (através de uma formulação em pó fino), transdermal, nasal,vaginal, retal ou sublingual e podem ser formulados em formas de dosagemapropriadas para cada via de administração. Vide, por exemplo, Bernstein eoutros, Publicação de Patente PCT Ng WO 93/25221; Pitt e outros, Publica-ção de Patente PCT N9 WO 94/17784; e Pitt e outros, Pedido de PatenteEuropeu 613.683, cada um deles é aqui incorporado a título de referência.

Formas de dosagem sólidas para administração oral incluemcápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagemsólidas, o composto peptídeo ativo é misturado com pelo menos um veículofarmaceuticamente aceitável inerte tal como sacarose, Iactose ou amido.Tais formas de dosagem podem também compreender, como é prática nor-mal, substâncias adicionais outras que não diluentes inertes, por exemplo,agentes lubrificantes, tal como estearato de magnésio. No caso de cápsulas,comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podem também compreenderagentes de tamponamento. Comprimidos e pílulas podem adicionalmenteser preparados com revestimentos entéricos.

Formas de dosagem líquidas para administração oral incluememulsões, soluções, suspensões, xaropes farmaceuticamente aceitáveis,com os elixires contendo diluentes inertes geralmente usados na técnica, talcomo água. Além de tais diluentes inertes, as composições podem tambémincluir adjuvantes, tal como agentes umectantes, agentes emulsificantes ede suspensão e agentes adoçantes, saborizantes e de perfume.

Preparações de acordo-com a invenção para administração pa-renteral incluem soluções, suspensões ou emulsões aquosas ou não-aquosasestéreis. Exemplos de solventes ou veículos não-aquosos são propileno glicol,polietileno glicol, óleos vegetais, tal como óleo de oliva e óleo de milho, gelati-na, e ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila. Tais formas de do-sagem podem também conter adjuvantes tal como agentes de preservação,umectantes, emulsificantes e dispersantes. Elas podem ser esterilizadas atra-vés de, por exemplo, filtragem através de um filtro de retenção de bactérias,através da incorporação de agentes de esterilização às composições, atravésde irradiação das composições ou através de aquecimento das composições.Elas podem ser também fabricadas usando água estéril, ou algum outro meioinjetável estéril, imediatamente antes do uso.

Composições para administração retal ou vaginal são de prefe-rência supositórios que podem conter, em adição à substancia ativa, excipi-entes tal como manteiga de cacau ou uma cera de supositório. Composiçõespara administração sublingual são também preparadas com excipientes pa-drão bem-conhecidos na técnica.

As composições contendo os compostos peptídeos podem seradministradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em aplicaçõesterapêuticas, as composições são administradas a um paciente já sofrendode uma doença, conforme acima descrito, em uma quantidade suficientepara curar ou pelo menos parcialmente parar os sintomas da doença e suascomplicações. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como"dose terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para este uso vão de-pender da severidade da doença e do peso e estado geral do paciente.

As composições da invenção podem ser também microencapsu-Iadas através do, por exemplo, método de Tice e Bibi (em Treatise on Con-trolled Drug Delivery, ed. A. Kydonieus, Mareei Dekker, Nova York (1992),pp. 315-339).

Em aplicações profiláticas, as composições contendo os com-postos peptídeos da invenção são administradas a um paciente suscetível aou de outro modo sob risco de uma doença particular. Tal quantidade é defi-nida ser uma "dose profilaticamente eficaz". Neste uso, as quantidades pre-cisas novamente dependem do estado de saúde e do peso do paciente.

As quantidades do composto peptídeo necessárias para terapiaeficaz vão depender de muitos fatores diferentes, incluindo dispositivos deadministração, o sítio alvo, estado fisiológico do paciente e outros medica-mentos administrados. Deste modo, dosagens de tratamento devem ser titu-ladas para otimizar segurança e eficácia. Tipicamente, dosagens usadas invitro podem prover guia útil nas quantidades úteis para administração in situdesses reagentes. Teste animal de doses eficazes para tratamento de dis-túrbios particulares vai prover indicação previsiva adicional de dosagem hu-mana. Várias considerações são descritas, por exemplo, em Gilman e outros(eds), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics,8a ed., Pergamon Press (1990); e Remington1S Pharmaceutical Sciences, 7-Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985); cada um dos quais é aqui in-corporado a título de referência.

Os compostos peptídeos da presente invenção são eficazes notratamento de condições mediadas por TPO quando administrados em umafaixa de dosagem de a partir de cerca de 0,001 mg a cerca de 10 mg/kg depeso do corpo por dia. A dose específica empregada é regulada pela condi-ção particular sendo tratada, a via de administração bem como pelo julga-mento do médico atendente dependendo de fatores tal como a severidadeda condição, a idade e condição geral do paciente e similar.

Exemplo 1

Síntese de Composto Peptídeo de Fase Sólida

Os compostos peptídeos da invenção podem ser sintetizados,por exemplo, usando as técnicas de síntese de fase sólida Merrifield (videSteward e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2- edição, Pierce Chemi-cal, Rockford, III. (1984) e Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963)) ousintetizador de pepídeo Applied Biosystems Inc. Modelo 431A ou 433A. Oscompostos peptídeos podem ser montados usando protocolos padrão daApplied Biosystems Inc. Synth Assist® 1.0.0 ou Synth Assist® 2.0.2. Cadaacoplamento pode ser realizado por 2x30 min com HBTU (2-(1H-benzatriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio hexafluorfosfato) e HOBt (1-hidroxibenzotriazol).

A resina usada pode ser resina HMP (p-hidroximetil fenoxime-til)poliestireno ou PAL (Milligen/Biosearch), que é uma resina de poliestirenoligada com cruzamento com ácido 5-(4'-Fmoc-aminometil·3,5,-dimetoxifenóxi)valérico como um ligante. Uso de resina PAL resulta em umafuncionalidade amida carboxil terminal quando da clivagem do peptídeo apartir da resina. Quando da clivagem, a resina HMP produz uma porção deácido carboxílico no terminal C do produto final. A maioria dos reagentes,resinas e aminoácidos protegidos (livres ou na resina) pode ser comprada daMillipore ou Applied Biosystems Inc.

O grupo Fmoc pode ser usado para proteção amino durante oprocedimento de acoplamento. Proteção de amina primária em aminoácidospode ser conseguida com Fmoc e grupos de proteção de cadeia lateral talcomo t-butila para serina, tirosina, ácido glutâmico e treonina; tritila para glu-tamina; Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonila) para arginina; N-t-butoxicarbonila para triptofano; N-tritila para histidina e S-tritila para cisteínapodem ser empregados.

Remoção dos compostos peptídeos da resina e desproteçãosimultânea das funções de cadeia lateral podem ser conseguidas através detratamento com reagente K ou ligeiras modificações dele. Alternativamente,na síntese desses peptídeos, com um terminal carboxila amidado, o peptí-deo integralmente montado pode ser clivado com uma mistura de 90% deácido trifluoracético, 5% de etanodiol e 5% de água, inicialmente a 4°C, egradualmente aumentando para temperatura ambiente. Os compostos pep-tídeos desprotegidos podem ser precipitados com dietil éter. Purificação po-de ser através de cromatografia líquida de alta performance, de fase-reversa, preparativa, em uma coluna de sílica gel ligada Cie com um gradi-ente de acetonitrila/água em 0,1% de ácido trifluoracético. Os compostospeptídeos homogêneos podem ser caracterizados por espectrometria demassa de Bombardeamento de Átomo Rápido ou espectrometria de massade eletropulverização e análise de aminoácido quando aplicável.

Em uma modalidade preferida, os compostos peptídeos da pre-sente invenção são dimerizados usando procedimentos sintéticos padrãoconhecidos e usados por aqueles versados na técnica. Seguindo esses es-quemas sintéticos, aqueles versados na técnica podem prontamente prepa-rar compostos peptídeos dímeros de acordo com a presente invenção. Ain-da, será prontamente aparente àqueles de habilidade na técnica que as su-bunidades diméricas podem ser prontamente ligadas usando metodologias eIigantes conhecidos. Exemplo 2

Peauilacão dos Compostos Peptídeos

Peguilação de um composto peptídeo da presente invenção po-de ser realizada através de técnicas bem-conhecidas. Por exemplo, umcomposto peptídeo da invenção pode ser dissolvido em 100 mM de bicinapH 8,0 em uma concentração de 10 mg/ml, adicionado a um excesso molarde 1,25 vez de PEG2 em pó (comercialmente disponível da ShearwaterPolymers, Inc. (Huntsville, Ala, agora Nektar Therapeutics (San Cario, CA)) eagitado em temperatura ambiente até que a reação esteja completa, tipica-mente 1-2 horas. A reação é monitorada através de HPLC de fase reversausando um gradiente de acetonitrila de 40-65% com uma coluna YMC ODSAQ. Quando a reação está completa, a solução é adicionada a um segundoexcesso molar de PEG2 em pó e o processo é repetido 4 vezes usando umtotal de 5 moles de PEG2 para cada mol do peptídeo. A solução é diluída 2vezes com PBS para reduzir a viscosidade e carregada em uma coluna su-perdex 200 (Pharmacia), previamente equilibrada e eluída com PBS. Fra-ções da coluna de exclusão de tamanho podem ser analisadas através deHPLC de fase reversa. Frações contendo di-PEG-polipeptídeo que elui antesde qualquer composto peptídeo mono-PEG podem ser agrupadas e arma-zenadas a 5°C ou liofilizadas.

Exemplo 3

Estudos Animais Pré-clínicos da Atividade Trombopoiética de CompostoTPO № 1 PEGuiIado

O Composto TPO N- 1 não compartilha nenhuma homologia deseqüência com TPO endógena, mitigando o risco da formação de anticorposreagindo com cruzamento com TPO endógena. O Composto TPO Ns 1 foiPEGuiIado para reduzir liberação e para reduzir mais antigenicidade. Esteexemplo descreve estudos pré-clínicos sobre a atividade trombopoiética doComposto TPO N2 1 PEGuiIado em um animal.

Ratos Wistar machos normais (fonte) foram usados para os es-tudos. Outros animais, tal como cachorros, camundongos, macacos, etc.,podem ser também usados para estudos pré-clínicos. Todos os procedimen-tos envolvendo animais foram conduzidos em uma instalação animal intei-ramente autorizada pela American Association for Assessment and Accredi-tation of Laboratory Animal Care (AAALAC) e de acordo com o The Guide forthe Care and Use of Laboratory Animais (NIH).

Ratos Wistar machos normais (10 semanas de idade, 230 a 367gramas de faixa de peso do corpo em dosagem) foram tratados com dosesintravenosas simples de Composto TPO № 1 a 30, 100 ou 300 ug/kg (40ratos/grupo). Na pré-dose, 96, 144, 192, 240, 288 e 312 horas pós-dose,aproximadamente 0,5 mL de sangue foi coletado através de punção da veiajugular de ratos não-anestesiados (5 ratos por ponto de tempo, EDTA comoanticoagulante) e contagens de plaqueta foram avaliadas usando um siste-ma de análise de hematologia automatizado. Os animais foram deixados emjejum da noite para o dia, com água disponível, antes de cada coleta de a-mostra.

Doses intravenosas simples de Composto TPO N9 1 PEGuiIado(30, 100 ou 300 pg/kg) resultaram em uma contagem de plaqueta periféricaaumentada em ratos Wistar machos normais através da avaliação pós-dosemais cedo no Dia 4 (figura 6). Contagens de plaqueta foram avaliadas a cada2 dias durante o acompanhamento de 2 semanas e comparadas com a con-tagem de pré-dose. A dose de 300 pg/kg induziu o maior aumento em conta-gem de plaqueta, que retornou para a linha de base por volta do Dia 14.

Exemplo 4

Estudos Clínicos de Fase I da Atividade Trombopoiética de Composto TPONg 1 PEGuiIado

Estudos de Fase I foram conduzidos para investigar a tolerabili-dade, farmacodinâmica e farmacocinética do Composto TPO N9 1 PEGuiIa-do. Este exemplo descreve estudos de Fase I do Composto TPO N9 1 PE-Guilado após uma injeção intravenosa simples em voluntários masculinossaudáveis. Estudos de Fase I em Composto TPO N9 1 PEGuiIado e outroscompostos de acordo com a invenção após injeção intravenosa múltipla ououtros dispositivos de administração e/ou a um paciente com necessidadede um tratamento podem ser realizados usando protocolos conhecidos deuma pessoa de habilidade na técnica.

Quarenta voluntários foram aleatorizados para receberem Com-posto TPO N9 1 PEGuiIado ou placebo como uma injeção de bolo i.v. sim-ples em uma razão de 6:2. Oito indivíduos foram aleatorizados em razão 6:2para receberem uma injeção simples de Composto TPO N9 1 PEGuiIado ouplacebo, com uma faixa de dose de 0,375, 0,75, 1,5, 2,25 ou 3 pg/kg. A res-posta farmacodinâmica de Composto TPO N9 1 PEGuiIado foi medida comoelevação em contagens de plaqueta. Os níveis de Composto TPO N91 PE-Guilado foram determinados em plasma pobre em plaqueta usando o ensaioimunoabsorvente ligado à enzima validado. Níveis de TPO, EPO, IL-6 e IL-11 endógenos foram medidos nos pontos de tempo indicados usando imu-noensaios padrão. Um imunoensaio biosensor (BiaCore technology) foi usa-do para medição de formação de anticorpo contra a porção de peptídeo deComposto TPO N5 1 PEGuilado. O efeito sobre a função de plaqueta foi me-dido monitorando agregação de plaqueta induzida por colágeno em 4 horase 12 dias após administração do Composto TPO N9 1 PEGuilado.

Análise PK indicou cinética relacionada com a dose de CompostoTPO N9 1 PEGuilado, embora em doses de 0,75 pg/kg ou menores, concen-trações de Composto TPO N9 1 PEGuilado no plasma estivessem geralmenteabaixo do limite de quantificação de 6,25 ng/mL (figura 7). Quatro indivíduosno grupo de dose de 0,375 pg/kg e um indivíduo no grupo de 3,0 pg/kg deComposto TPO N9 1 PEGuilado não tinham quaisquer níveis no plasma quan-tificáveis. Valores Cmax médios variaram de a partir de 10,9 ng/mL em 0,75pg/kg de Composto TPO N9 1 PEGuilado a 6,17 ng/mL a 3,0 pg/kg de Com-posto TPO N9 1 PEGuilado (Tabela 1). Quaisquer dados PK puderam ser me-didos a 0,375 pg/kg i.v. de Composto TPO N9 1. A meia-vida terminal médiade Composto TPO N9 1 PEGuilado variou de a partir de aproximadamente 18a 36 horas. O tmax médio variou de a partir de 0,09 a 2 horas. O aumento nàCmax com dose maior foi aproximadamente dose proporcional, mas houve ne-nhum aumento aparente no valor AUCO-24 normalizado com dose maior, su-gerindo um aumento maior do que dose proporcional.

Tabela 1. Sumário de análise PK

<table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>

Resposta de plaqueta à administração de Composto TPO N9 1PEGuiIado foi similar aos resultados publicados para rhTPO e AMG531.Contagens de plaqueta aumentaram dependentemente da dose atingindoníveis de pico nos Dias 10-12, e as contagens retornaram para linha de basedentro de 3-4 semanas (figura 8). As contagens de plaqueta de pico médiasvariaram de a partir de 315 χ 109/L a 0,375 pg/kg i.v. a 685 χ 109/L a 3 pg/kgi.v., e contagens de plaqueta máximas médias aumentadas da linha de basevariaram de a partir de 1,4 vez a 0,375 pg/kg a 3,2 vezes a 3,0 pg/kg (Tabela2). Pelo menos 50% do aumento em plaquetas foram observados em 4 de 6indivíduos recebendo Composto TPO N9 1 PEGuiIado em uma dose de 0,75ug/kg, enquanto pelo menos aumento de 2 vezes em contagem de plaquetafoi observado em cerca de 3 de 6 indivíduos em uma dose de 1,5 ug/kg, etc..A dose de 0,75 ug/kg i.v. tinha sido escolhida como a dose inicial para estu-do clínico de Fase II.

Com exceção de mudanças em contagens de plaqueta, outrascélulas sangüíneas circulantes maduras não foram afetadas (dados nãomostrados). Em adição, administração de Composto TPO N2 1 PEGuiIadonão afetou função de plaqueta, nem no momento de administração, nem em12 dias pós-dose, no momento do aparecimento de plaquetas recém-produzidas.

Tabela 2. Sumário de análises de contagem de plaqueta

<table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>

O efeito da administração do Composto TPO N9 1 PEGuiIadosobre fatores de crescimento que são conhecidos possuir atividade trombo-poiética foi avaliado. Níveis de TPO endógenos dependentemente da doseaumentaram, atingido níveis de pico em 3 dias pós-dose (figura 9). Quais-quer mudanças significantes foram observadas em níveis sangüíneos deníveis de IL-6, IL-11 e EPO.

Função de plaqueta, avaliada como agregação de plaqueta in-duzida por colágeno em sangue integral, não foi diferente entre os tratamen-tos. Nenhum dos indivíduos sofreu um evento adverso sério ou toxidezes delimitação de dose. Os eventos adversos mais freqüentemente observadosincluem cefaléias e fadiga leves e aconteceram ambos após tratamento ativoe placebo. Quaisquer anticorpos contra Composto TPO Ng 1 PEGuiIado fo-ram detectados. Esses resultados indicam que Composto TPO N- 1 PEGui-Iado foi bem tolerado na faixa de dose testada.

Embora apenas modalidades preferidas da invenção sejam es-pecificamente descritas acima, será compreendido que modificações e vari-ações da invenção são possíveis sem se afastar do espírito e escopo pre-tendido da invenção.Seqüência de Listagem

<110> MACDONALD, BRIAN R.

WEIS1 3EFFERY KENNETHYURKW1 EDWARD JOHN

<120> PEPTÍDEOS E COMPOSTOS QUE SE LIGAM A UM RECEPTOR

<130> TDP-5001-USANP

<140> 10/918,561<141> 2004-08-13

<150> 60/498,740<151> 2003-08-28

<160> 7

<170> PatentIn ver. 3.3

<210> 1<211> 5<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<223> Descrição da seqüência Artificial: Motivo de peptídeo sintéti<220>

<221> MOD.RES<222> (3)

<223> Aminoácido variável<400> 1

Trp Ser Xaa Trp Ser1 5

<210> 2<211> 10<212> PRT

<213> seqüência Artificial

<223> Descrição da seqüência Artificial: Peptideo sintético<220>

<221> MOD..RES<222> (1)

<223> Ala. Cys. Glu. Gly, lie, Leu1 Met1 Pro. Arg, Gln1Ser, Tnr1 ou Val. preferivelmente Ala ou lie

<220>

<221> MOD_RES<222> (2)

<223> Ala, Cys1 Asp, G]u, Lys, Leu, Gln1 Arg, Ser, Thr1ou vai, preferivelmente Asp, Glu1 ou Lys

<220>

<221> M0D_RES<222> (4)

<223> Cys, teu, Met1 Pro1 Gln1 ou Val<220>

<221> MOD_RES<222> C5)

<22Β> Phe, Lys, Leu, Asn. Glnl Arg, Ser, Thr1 ou vai<220>

<221> MOD_RES<222> (6)

<223> Cys, Phe1 lie, Leu, Met, Arg, ser, vai, ou Trp<220>

<221> M0D_RE5<222> (7)

<223> Aminoácido Variável<220>

<221> MOD_RES<222> (8)

<223> Ala, Asp, Glu, Gly1 Lys1 Met, Gln, Arg, ser, Thr,vai, ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES<222> f91

<223> b-(2-naftil)alanina<220>

<221> M0D_RE5<222> (10)

<223> Cys. Gly, He, Lys, Leu, Met, Asn, Arg, ou vai<400> 2

xaa Xaa Gly xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10

<210> 3<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES<222> (95

<223> b-(2-naftiDalanina<400> 3

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln xaa Leu Ala Ala Arg Ala15 10

<210> 4<211> 15<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético

<220>

<221> M0D_RES<222> (9)

<223> b-C2-naftil)alanina<220>

<221> MOD_RE5<222> (15)

<223> sarcosina ou beta-alanina<400> 4

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Xaa Leu Ala Ala Arg Ala xaa1 5 10 15

<210> 5<211> 13<212> PRT

<213> seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da seqüencia Artificial: Peptideo sintético

<220>

<22I> MOD_RES<222> (9)

<223> b-(2-naftiDalanina<400> 5

Xle Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Xaa Leu Ala Ala Arq1 5 10

<210> 6<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da seqüência Artificial: Peptideo sintético

<220>

<221> MOD_RES<222> (9)

<223> b-(l-naftil)alanina<400> 6

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Xaa Leu Ala Ala Arq1 5 10

<210> 7<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüencia Artificial: Peptideo sintético

<220>

<221> MOD_RES<222> C9)

<223> b-(2-naftil)alanina<220>

<221> MOD_RES<222> (14)

<223> sarcosina ou beta-alanina

<400> 7

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln xaa Leu Ala Ala Arg Xaa1 5 10

Claims (30)

1. Método para tratamento de um paciente sofrendo de um dis-túrbio que é suscetível a tratamento com um agonista de trombopoietinacompreendendo administrar ao paciente uma dose ou quantidade terapeuti-camente eficaz de um composto peptídeo compreendendo a seqüência quesegue: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXio)-K(NH2)-(XioRAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, (SEQ ID NO: 7), onde X10 é sarcosina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o dito compos-to peptídeo é administrado em uma faixa de dose entre cerca de 0,1 e cercade 5 mg/kg.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o dito compos-to peptídeo é administrado em uma faixa de dose de cerca de 0,375, 0,75,-2,25 ou 3 mg/kg, respectivamente.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a administra-is ção do dito composto peptídeo resulta em um valor Cmax médio de cerca de-10 ng/mL em cerca de 0,75 pg/kg de composto peptídeo.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a administra-ção do dito composto peptídeo resulta em um valor Cmax médio de cerca de-60 ng/mL em cerca de 3,0 pg/kg de composto peptídeo.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a administra-ção do dito composto peptídeo resulta em uma meia-vida terminal média dodito composto peptídeo de a partir de cerca de 18 horas a cerca de 36 horas.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, onde administraçãodo dito composto peptídeo resulta em um tmax médio de a partir de cerca de-0,09 hora a cerca de 2 horas.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a administra-ção do dito composto peptídeo resulta em um aumento de cerca de 50% emcontagem de plaqueta em uma dose de cerca de 0,75 ug/kg.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a administra-ção do dito composto peptídeo resulta em um aumento de cerca de 2 vezesem contagem de plaqueta em uma dose maior do que cerca de 0,75 ug/kg.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a administra-ção do dito composto peptídeo resulta em um aumento nos níveis de TPOendógenos.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o dito com-posto peptídeo é covalentemente ligado a um polímero hidrofílico.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, onde o dito polí-mero hidrofílico tem um peso molecular médio entre cerca de 500 a cerca de 40.000 dáltons.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, onde o dito polí-mero hidrofílico tem um peso molecular médio entre cerca de 5.000 a cercade 20.000 dáltons.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, onde o dito polí-mero hidrofílico é selecionado do grupo consistindo em polietileno glicol, po-Iipropileno glicol, ácido poliláctico e ácido poliglicólico.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, onde o dito polí-mero hidrofílico é polietileno glicol.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o dito com-posto peptídeo é dimerizado.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, onde cada umadas subunidades diméricas do dito composto peptídeo é covalentementeligada a um polímero hidrofílico.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, onde o dito polí-mero hidrofílico é polietileno glicol.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, onde o polietilenoglicol é selecionado do grupo consistindo em monometoxipolietileno glicol(MePEG-OH), monometoxipolietileno glicol-succinato (MePEG-S), monome-toxipolietileno glicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipo-lietileno glicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietileno glicol-tresilato(MePEG-TRES) e monometoxipolietileno glicol-imidazolil-carbonila (MePEG-IM).

20. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o dito com-posto peptídeo tem a fórmula que segue:3I E G P T L R Q (2-Nal) LAAR -(Sar)K(NH2)I E G P T L R Q (2-Nal) LAAR -(Sar)onde (2-Nal) é p-(2-naftil)alanina e (Sar) é sarcosina.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, onde o dito com-posto peptídeo é covalentemente ligado a um polímero hidrofílico.

22. Composto peptídeo como definido na reivindicação 21, onde o dito polímero hidrofílico é selecionado do grupo consistindo em polietilenoglicol, polipropileno glicol, ácido poliláctico e ácido poliglicólico.

23. Composto peptídeo de acordo com a reivindicação 22, ondeo dito polímero hidrofílico é polietileno glicol.

24. Composto peptídeo de acordo com a reivindicação 23, onde o dito polietileno glicol tem um peso molecular médio entre cerca de 5.000 acerca de 20.000 dáltons.

25. Composto peptídeo de acordo com a reivindicação 23, ondeo polietileno glicol é selecionado do grupo consistindo em monometoxipolieti-Ieno glicol (MePEG-OH), monometoxipolietileno glicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietileno glicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), mono-metoxipolietileno glicol-amida (MePEG-NH2), monometoxipolietileno glicol-tresilato (MePEG-TRES) e monometoxipolietileno glicol-imidazolil-carbonila(MePEG-IM).

26. Composto peptídeo como definido na reivindicação 21, ondecada uma das subunidades diméricas do dito composto peptídeo é covalen-temente ligada a um polímero hidrofílico.

27. Composto peptídeo de acordo com a reivindicação 26, ondeo dito polímero hidrofílico é selecionado do grupo consistindo em polietilenoglicol, polipropileno glicol, ácido poliláctico e ácido poliglicólico.

28. Composto peptídeo de acordo com a reivindicação 27, ondeo dito polímero hidrofílico é polietileno glicol.

29. Composto peptídeo de acordo com a reivindicação 28, ondeo dito polietileno glicol tem um peso molecular médio entre cerca de 5.000 acerca de 20.000 dáltons.

30. Composto peptídeo de acordo com a reivindicação 28, ondeo polietileno glicol é selecionado do grupo consistindo em monometoxipolieti-leno glicol (MePEG-OH), monometoxipolietileno glicol-succinato (MePEG-S)1monometoxipolietileno glicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS)1 mono-metoxipolietileno glicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietileno glicol-tresilato (MePEG-TRES) e monometoxipolietileno glicol-imidazolil-carbonila(MePEG-IM).