PT1957517E - Uso de peptídeos que se ligam ao receptor de tpo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

USO DE PEPTÍDEOS QUE SE LIGAM AO RECEPTOR DE TPO DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona compostos peptideos que se ligam e ativam o receptor trombopoietina (c-mpl ou TPO-R) ou, por outro lado, atuam como um agonista de TPO. A presente invenção tem aplicação no campo da quimica medicinal e da bioquímica e em particular proporciona agonistas de TPO para utilização no tratamento de doenças humanas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os megacariócitos são derivados das células da medula óssea, que são responsáveis pela produção de plaquetas sanguíneas em circulação. Embora compreendendo <0,25% das células de medula óssea na maioria das espécies, têm >10 vezes o volume de células de medula típicos. Ver Kuter, et. al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91:11104-11108 (1994).

Megacariócitos sofrem um processo conhecido como endomitose em que replicam os seus núcleos, mas não sofrem divisão celular dando assim origem a células poliploides. Em resposta a uma contagem reduzida de plaquetas, os aumentos da taxa endomitotica formam megacariócitos mais elevados de ploidia, bem como o número de megacariócitos pode aumentar até 3 vezes. Ver Harker J. Clin. Invest., 47:458-465 (1968). Em contraste, em resposta a uma contagem elevado de plaquetas, a taxa de endomitotica diminuiu, formaram-se megacariócitos mais baixos de ploidia, bem como o número de megacariócitos pode diminuir em 50%. 1 0 exato mecanismo de feedback fisiológico pelo qual a massa de plaquetas circulantes regula a taxa endomitotica e o número de megacariócitos de medula óssea não é conhecido. 0 fator de circulação trombopoiética envolvida na mediação deste ciclo de realimentação é agora conhecido como trombopoietina (TPO). Mais especificamente, a TPO demonstrou ser o principal regulador humoral em situações que envolvem trombocitopenia. Ver, por exemplo, Metcalf, Nature, 369:519-520 (1994). TPO tem sido demonstrado em vários estudos para aumentar as contagens de plaquetas, aumenta o tamanho das plaquetas, e aumenta a incorporação de isótopos em plaquetas de animais receptores.

Especificamente, pensa-se que a TPO afeta megacariocitopoiese de diversas maneiras: (1) Produz aumento no tamanho e número de megacariócitos, (2) Produz um aumento no conteúdo de ADN, na forma de poliploidia, em megacariócitos, (3) Aumenta a endomitose megacariócito, (4) Produz um aumento de maturação de megacariócitos, e (5) Produz um aumento na percentagem de células precursoras, na forma de pequenas células positivas para a acetilcolinesterase, na medula óssea.

As plaquetas (trombócitos) são necessárias para a coagulação do sangue. Quando o seu número é muito baixo o paciente está em sério risco de morte por hemorragia catastrófica. TPO tem, portanto, potencial aplicação útil tanto no diagnóstico como no tratamento de várias perturbações hematológicas, como por exemplo, as doenças principalmente devidas a defeitos de plaquetas. Ensaios clinicos em curso com TPO indicaram que a TPO pode ser administrada com segurança a pacientes. Além disso, estudos recentes proporcionaram uma base para a projeção da eficácia da terapia com TPO no tratamento de 2 trombocitopenia, e particularmente trombocitopenia resultante de quimioterapia, terapia de radiação, ou transplante de medula óssea como tratamento para cancro ou linfoma. Ver, por exemplo, McDonald, AM. J. Ped. Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992). 0 gene que codifica a TPO foi clonado e caraterizado. Ver Ruter, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 91:11104-11108 (1994); Cevada, et al, Cell 77:1117-1124 (1994). Kaushansky et al, Nature 369:568-571 (1994). Wendling, et al, Nature. 369:571-574 (1994), e Sauvage et al, Nature 369:533-538 (1994). Trombopoietina é uma glicoproteína com pelo menos duas formas, com massas moleculares aparentes de kDa e 31kDa, com uma sequência comum de aminoácido N-terminal. Ver, Bartley et al., Cell, 77:1117-1124 (1994). Trombopoietina parece ter duas regiões distintas, separadas por um potencial local de clivagem. A região amino-terminal é altamente conservada no homem e no rato, e possui alguma homologia com eritropoietina e interferon-a e interferon-b. A região carboxi-terminal apresenta divergentes espécies de largura.

As sequências de ADN e as sequências de codificação de peptideos para a TPO-R humana (também conhecida como c-mpl) têm sido descritos. Ver Vigon, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 89:5640-5644 (1992). TPO-R é um membro da familia de receptores de hematopoietina do fator de crescimento, uma familia caraterizada por um desenho estrutural comum do dominio extracelular, incluindo quatro residuos conservados C na porção N-terminal e um motivo WSXWS (SEQ ID NO: 1) perto da região transmembranar. Ver Bazan, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 87:6934-6938 (1990). A prova de que este receptor desempenha um papel funcional na hematopoiese inclui observações de que a sua expressão é 3 restrita ao baço, medula óssea ou do figado fetal em ratinhos (ver Souyri et al., Cell 63:1137-1147 (1990)) e para megacariócitos, plaquetas e células CD34+ em humanos (ver Methia et al., Blood 82:1395-1401 (1993)). Além disso, a exposição de células CD34+ para oligonucleótidos antisense sintéticos para ARN mpl inibe significativamente o aparecimento de colónias de megacariócitos, sem afetar a formação de colónias eritroides ou mieloides. Alguns trabalhadores postulam que as funções do receptor como um homodimero são similares à situação com os receptores para G-CSF e eritropoietina. A disponibilidade dos genes clonados para TPO-R facilita a pesquisa de agonistas deste importante receptor. A disponibilidade do receptor de proteína recombinante permite o estudo da interação receptor-ligando numa variedade aleatória e semi-aleatória de sistemas de geração de diversidade peptideos. Esses sistemas estão descritos nas Patentes dos Estados Unidos n°s 6.251.864, 6.083.913, 6.121.238, 5.932.546, 5.869.451, 5.506.362, e 6.465.430 e em Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 87:6378-6382 (1990) . A lenta recuperação dos niveis de plaquetas em pacientes que sofrem de trombocitopenia é um problema sério, e aclamou urgência para a busca de um fator de crescimento de sangue agonista capaz de acelerar a regeneração de plaquetas. A presente invenção proporciona esse tal agonista. Case et al, Stem Cells, 2000, 18 (5):360-5; de Serres et al, Stem Cells, 1999: 17 (6):316-26: de Serres et al, células-tronco, 1999: 17 (4): 203-9; Kaushansky K, Y AnnN Acad, 2001 Jun.: 938:131-8; Singer et al., Blood, 1998, 92 (10), Supl. Ia Parte 568A Ia página, e 40a Reunião Anual da Sociedade Americana de Hematologia, em Miami 4

Beach, Flórida, EUA: 4-08 dezembro de 1998, ISSN: 0006-4971, e US-A-5 869 451, todos divulgam um composto, referido como GW395058, semelhante ao compostos definidos nas reivindicações. WO 2004/026332 descreve os compostos definidos nas reivindicações para uso no tratamento de doenças hematológicas. WO 2005/023834 descreve os compostos definidos nas reivindicações para aumentar a produção de células-tronco hematopoiéticas.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a um peso molecular baixo de peptideos que possua fortes propriedades de ligação para o TPO-R, possa ativar o TPO-R e, potencialmente, permitir que os efeitos secundários sejam reduzidos em comparação com os agonistas de TPO conhecidos. Consequentemente, os compostos de peptideo podem ser úteis para fins terapêuticos no tratamento de condições mediadas por TPO (por exemplo, trombocitopenia resultante de quimioterapia, terapia de radiação, ou transfusão de medula óssea), assim como para fins de diagnóstico no estudo do mecanismo de hematopoiese e para a expansão in vitro de megacariocitos e células progenitoras comprometidas. A invenção fornece uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de peptideo para utilização de acordo com a reivindicação 1. A invenção também proporciona a votação de uma dose terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 30.

Compostos peptideos adequados para fins terapêuticos e/ou de diagnóstico têm uma IC50 de cerca de 2 mM ou menos, como determinado por, por exemplo, o conjunto de ensaio de ligação de afinidade descrito no Exemplo 3 da Patente dos 5 EUA N° 5.869.451, em que um IC50 inferior se correlaciona com uma ligação de maior afinidade para a TPO-R. 0 ensaio na Patente dos EUA N° 5.869.451 é o seguinte: As afinidades de ligação de compostos peptídeos são medidas num ensaio de ligação de competição. As cavidades de uma placa de microtitulação são revestidas com 1 mg de estreptavidina, bloqueada com PBS/BSA a 1%, seguido por 50 ng de anticorpo biotinilado anti-receptor de imobilização (Abl79). As cavidades são então tratadas com uma diluição de 1:10 de colheita TPO-R solúvel. Várias concentrações do composto de peptideo são misturadas com uma quantidade constante de uma forma truncada de TPO consistindo nos resíduos 1-156 fundidos com o terminal C da proteína de ligação de maltose (MBP-TP0156). Os peptídeos MBP-TP0156 misturas são adicionados aos poços revestidos com TPO-R, incubadas durante 2 horas a 4°C e, em seguida, lavadas com PBS. A quantidade de MBP-TPO, que está ligada no estado de equilíbrio é medida pela adição de um anticorpo de coelho antissoros dirigido contra MBP, seguido por fosfatase alcalina conjugada com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho. A quantidade de fosfatase alcalina em cada poço é então determinada utilizando métodos padrão. O ensaio é conduzido ao longo de um intervalo de concentrações de compostos de peptídeos e os resultados são representados graficamente de forma que o eixo dos y representa a quantidade de MBP-TPO ligada e o eixo x representa a concentração de composto peptideo. Pode-se então determinar a concentração à qual o composto peptideo irá reduzir em 50% (CI50) a quantidade de MBP-TPO ligado a TPO-R imobilizado. A constante de dissociação (Kd) para o peptideo deve ser semelhante à IC50 medida utilizando estas condições de ensaio. Para fins farmacêuticos, os compostos peptídeos têm de preferência um valor de IC50 de não mais do que cerca de 100 iM, mais preferencialmente, não mais do 6 que 500nM. Numa forma de realização preferida, o peso molecular do composto de peptídeo é de cerca de 250 a cerca de 8.000 daltons. Se o composto peptídeo da presente invenção for oligomerizado, dimerizado e/ou derivatizado com um polímero hidrófilo tal como aqui descrito, os pesos moleculares de tais compostos peptídeos será substancialmente maior e pode variar entre cerca de 500 a cerca de 120.000 daltons, mais preferencialmente entre cerca 8.000 a cerca de 80.000 daltons.

Quando utilizado para fins de diagnóstico, os compostos de peptídeo para utilização de acordo com a presente invenção são de preferência marcados com uma etiqueta detetável e, por conseguinte, os compostos peptídeos sem tal rótulo servem como intermediários na preparação de compostos de peptídeos marcados.

Um composto peptídeo que satisfaça os critérios definidos para o peso molecular e afinidade de ligação para o TPO-R tem 9 ou mais aminoácidos, em que os aminoácidos são de ocorrência natural ou aminoácidos sintéticos (que não ocorre naturalmente).

Assim, os compostos peptídeos preferidos compreendem um composto que possui: (1) um peso molecular de menos de cerca de 5000 daltons, e (2) uma afinidade de ligação para a TPO-R como expresso por um valor de IC50 de não mais do que cerca de ΙΟΟρΜ, em que desde zero a todas as ligações C-(0)NH- do composto de peptídeo tenha sido substituída por uma ligação selecionada de entre o grupo consistindo de uma ligação CH20C(0)NR-, uma ligação de fosfonato; uma ligação 7 CH2S(0)2NR-, uma ligação -CH2NR-, e uma ligação -C(0)NR6-, e uma ligação -NHC(0)NH- em que R é hidrogénio ou baixo alquilo e R6 é alquilo inferior, além disso o terminal -N do referido composto peptideo é escolhido de entre o grupo consistindo de um grupo -NRR1; um grupo -NRC(0)R, um grupo -NRC(0)OR, um grupo -NRS(0)2R; um grupo -NHC(0)NHR, um grupo succinimida, um grupo benziloxicarbonila-NH-, e um grupo benziloxicarbonila-NH- tendo de 1 a 3 substituintes no anel fenilo selecionado a partir do grupo que consiste em alquilo inferior, alcoxi inferior, cloro, e bromo, onde R e R1 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogénio e alquilo inferior, e ainda mais, em que o C-terminal do peptideo do referido composto tem a fórmula -C(0)R2 onde R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxilo, alcoxi inferior, e NR3R4 em que R3 e R4 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogénio e alquilo inferior e em que o átomo de azoto do grupo -NR3R4 pode opcionalmente ser o grupo amina do terminal N do peptideo, de modo a formar um peptideo cíclico, e seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Aqui descrito está também um composto de peptideo marcado compreendendo um composto peptideo descrito como acima tendo aí ligado covalentemente um marcador de deteção capaz. A invenção refere-se a compostos de peptídeos, incluindo a sequência de aminoácidos IEG P T L R Q(2-Nal)L A A R(Sar) (SEQ ID NO: 7), em que (2-Nal) é B-(2-naftil)alanina e (Sar) é sarcosina, para utilização de acordo com a reivindicação 1. 8

Noutra forma de realização, os compostos peptídeos são de preferência dimerizados ou oligomerizados para aumentar a afinidade e/ou atividade dos compostos. Um exemplo de um composto peptideo preferido dimerizado inclui, mas não está limitado ao seguinte: íEGPTLRQ(2-Nal)I.AAit X}0 \ K(NHí) / í E G PT L RQ (2-Nal) LAAR X}0

Onde Xio é uma sarcosina (SEQ ID N0:7).A estrutura acima também pode ser representada pela seguinte estrutura: (H-IEGPTLRQ (2-Nal LAARXio) 2K-NH2 .

Quando Χ20 é uma sarcosina, o composto tem a seguinte estrutura; í E G P T L R Q (2-Nai) L A A R-(Sar) \ K(NH2) / f EGPTLRQ (2~NaÍ) LAAR-(Sar},

Em que (2-Nal) é B-(2-naftil)alanina e (Sar) é sarcosina (SEQ ED NO: 7). Este composto peptideo, que também pode ser representado pela seguinte estrutura (H-IEGPTLRQ(2-Nal) LAAR (Sar) ) 2K-NH2, é referido aqui como " Composto TPO N° 1".

Ainda numa outra forma de realização, os compostos de peptideos preferidos para uso na presente invenção incluem os compostos peptideos que estão ligados de forma covalente a uma ou mais de uma variedade de polímeros hidrófilos. Polímeros hidrofílicos adequados incluem, mas não estão limitados a, polialquilesteres como exemplificados por polietileno glicol e polipropileno glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, 9 polioxialquenos, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, celulose e derivados de celulose, dextrano e derivados de dextrano, etc, como descrito na Patente dos EUA N° 5.869.451.

Os compostos peptídeos aqui descritos são úteis para a prevenção e tratamento de doenças mediadas por TPO, e particularmente para o tratamento de doenças hematológicas, incluindo mas não se limitando a, trombocitopenia resultante de quimioterapia, terapia de radiação, ou transfusão de medula óssea. É também aqui descrito um método para o tratamento, em que um paciente com uma doença que é suscetível ao tratamento com um agonista de TPO recebe, ou é administrada, uma dose terapeuticamente eficaz ou quantidade de um composto de peptídeo aqui descrito. A especificação também fornece composições farmacêuticas compreendendo um ou mais dos compostos de peptídeos aqui descritos e um veículo fisiologicamente aceitável. Estas composições farmacêuticas podem estar numa variedade de formas, incluindo formas de dosagem oral, assim como pós e soluções inaláveis e soluções injetáveis e infusíveis.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1 Mostra e compara a atividade de Composto TPO N° 1 a um composto peptídeo da técnica anterior (referidos como "composto peptídeo da técnica anterior"). A diferença entre o Composto TPO N° 1 e o composto peptídeo da técnica anterior é a de que o composto peptídeo da técnica anterior tem um B-(1-naftil)alanina(1-Nal) onde (2-Nal) está no Composto TPO N° 1. 10

Fig. 2 Mostra e compara a atividade de Composto PEGuilado TPO N° 1 com o composto peptideo PEGuilado da técnica anterior.

Fig. 3 Mostra e compara a mudança no número de plaquetas in vivo em ratos demonstrando a potência relativa do Composto PEGuilado TPO N° 1 para o composto peptideo PEGuilado da técnica anterior.

As Figs. 4 e 5 mostram e comparam o número e volume de plaquetas circulantes de um modo dependente da dose, respetivamente, após a utilização do composto peptideo PEGuilado da técnica anterior e a utilização do Composto PEGuilado TPO N° 1.

Fig. 6 Mostra que a administração de doses únicas intravenosas de Composto PEGuilado TPO N° 1 (30, 100 ou 300 yg/kg) resulta num aumento da contagem de plaquetas periféricas em ratos Wistar machos.

Fig. 7 Mostra a PK, concentração - Perfis de tempo do Composto PEGuilado TPO. N°1 em voluntários saudáveis do sexo masculino: quadrado preenchido - Composto PEGuilado TPO N° 1, 0,75 f-ig/kg iv; diamante aberto - Composto PEGuilado TPO N° 1, 1,5 (Xg/kg IV; cheio para cima-triângulo - Composto PEGuilado TPO N° 1, 2,25 fig/kg iv, aberto para baixo, triângulo - Composto PEGuilado TPO N° 1, 1,3 mg/kg iv

Fig. 8 Mostra que a contagem de plaquetas aumentou dependendo da dose nos machos saudáveis voluntários após a administração do Composto PEGuilado TPO N° 1.

Fig. 9 Mostra que os niveis endógenos de TPO aumentaram dependendo da dose após a administração de Composto PEGuilado TPO N° 1 em voluntários saudáveis do sexo masculino. 11 DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS I. definições e parâmetros gerais

As seguintes definições são apresentadas para ilustrar e definir o significado e âmbito dos vários termos utilizados para descrever a presente invenção. "Agonista" refere-se a um ligante biologicamente ativo que se liga ao seu receptor complementar biologicamente ativo e ativa este último quer para causar uma resposta biológica no receptor quer para melhorar a atividade biológica preexistente do receptor. "Composto Peptídeo" refere-se a uma molécula que se hidrolisa em aminoácidos e/ou derivados de aminoácidos e/ou substitutos de aminoácidos. "Sais farmaceuticamente aceitáveis" referem-se ao metal alcali não tóxico, metais terrestres alcalinos e sais de amónio geralmente utilizados na indústria farmacêutica incluindo os sais de sódio, potássio, litio, cálcio, magnésio, bário, amónio, sais de zinco e protamina, que são preparados por métodos bem conhecidos na especialidade. 0 termo também inclui sais não tóxicos de adição de ácido, que são geralmente preparados por reação dos compostos da presente invenção com um ácido orgânico ou inorgânico adequado. Os sais representativos incluem os sais cloridrato, bromidrato, sulfato, bissulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, napsilato, e afins. 12 "Sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades das bases livres e que não são biologicamente ou de outro modo indesejáveis, formados com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, fosfórico ácido e semelhantes, e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido salicílico e semelhantes. Para uma descrição de sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis como pro-fármacos, ver Bundgaard, H., supra. "Éster farmaceuticamente aceitável" refere-se aqueles ésteres que mantêm, após a hidrólise da ligação éster, a eficácia biológica e propriedades do ácido carboxílico ou álcool e não são biologicamente ou de outra forma indesejáveis. Para uma descrição de ésteres farmaceuticamente aceitáveis como pro-fármacos, ver Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985).Estes ésteres são tipicamente formados a partir do ácido carboxílico correspondente e um álcool. Geralmente, a formação de ésteres pode ser conseguida por via de técnicas sintéticas convencionais. (Ver, por exemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed., John Wiley & Sons, New York (1992), 393-396 e referências aí citadas, e Mark et al., Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). O componente álcool do éster compreenderá geralmente: (i) um álcool C2-C12 alifático que pode ou não pode conter uma ou mais ligações duplas e pode ou não 13 conter carbonos ramificados ou (ii) uma C7-C12 aromática ou álcoois heteroaromáticos. Este invento contempla também a utilização de tais composições que são tanto os ésteres como aqui descrito como ao mesmo tempo são os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis. "Amida farmaceuticamente aceitável" refere-se às amidas que retêm, após a hidrólise da ligação da amida, a eficácia biológica e propriedades do ácido carboxilico ou amina e não são biologicamente ou de outra forma indesejáveis. Para uma descrição de amidas farmaceuticamente aceitáveis como pro-fármacos, ver Bundgaard, H., ed., Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Estas amidas são tipicamente formadas a partir do ácido carboxilico correspondente e um amino. Geralmente, a formação de amida pode ser conseguida via técnicas sintéticas convencionais. (Ver, por exemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 4th ed., John Wiley & Sons, New York (1992), p. 393 e Mark, et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). Este invento contempla também a utilização de tais composições que são tanto amidas como aqui descrito e ao mesmo tempo são os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis. "Farmaceuticamente ou terapeuticamente aceitável" refere-se a um meio transportador que não interfere com a eficácia da atividade biológica dos ingredientes ativos e que não é tóxico para o hospedeiro ou paciente. "Estereoisómero" refere-se a um composto químico que tem o mesmo peso molecular, composição química, e constituição que um outro, mas com os átomos agrupados de maneira diferente. Isto é, certas porções químicas idênticas estão em orientações diferentes no espaço e, portanto, quando puros, têm a capacidade de girar o plano da luz 14 polarizada. Contudo, alguns estereoisómeros puros podem ter uma rotação ótica que é tão ligeira que é indetetável com a instrumentação presente. Os compostos da presente invenção podem ter um ou mais átomos de carbono assimétricos e, por conseguinte, incluem vários estereoisómeros. Todos os estereoisómeros estão incluídos dentro do âmbito da invenção. "Quantidade terapeuticamente ou farmaceuticamente eficaz" como aplicado para as composições da presente invenção refere-se à quantidade de composição suficiente para induzir um resultado biológico desejado. Esse resultado pode ser a redução dos sinais, sintomas ou causas de uma doença, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Na presente invenção, o resultado envolverá tipicamente uma diminuição da resposta imunológica e/ou inflamatória à infeção ou lesão do tecido.

Residuos de aminoácidos em peptideos são abreviados como se segue: Fenilalanina é Phe ou F; leucina é Leu ou L; Isoleucina é lie ou I; metionina é Met ou M; Valina é Vai ou V.

Serina é Ser ou S; prolina é Pro ou P; Treonina Thr ou T; Alanina é Ala ou A; tirosina é Tyr ou Y; Histidina é His ou H; glutamina é Gin ou Q; Asparagina Asn ou N; lisina é Lys ou K; Ácido Aspártico é Asp ou D; Ácido glutâmico é Glu ou E; cisteina é Cys ou C. 0 triptofano é Trp ou W; arginina é Arg ou R e glicina é Gly ou G. Além disso, o t-Buo é terc- butóxido, Bzl é benzilo, CHA é ciclohexilamina, Ac é acetilo, Me é metilo, Pen é penicilamina, Aib é aminoisobutirico, Nva é norvalina, Abu é ácido aminobutírico, Thi é tienilalanina, OBn 0-é benzilo, e hyp é hidroxiprolina. Análogos peptideos são normalmente utilizados na indústria farmacêutica como não-drogas 15 peptídicas com propriedades análogas às do modelo peptídeo. Estes tipos de compostos não peptídeos são designados por "peptidomiméticos" ou "miméticos de peptídeos" ou "peptidomiméticos" (Luthman et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2nd

Ed, Harwood Academic Publishers (1996) ; Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 33:1699-1720 (1994);. Fauchere, J "Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber e Freidinger TINS, p. 392 (1985), e Evans, et al, J. Med. Chem. 30:1229 (1987) . Miméticos de peptídeos que são estruturalmente semelhantes a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico equivalente ou melhorado ou um efeito profilático. Geralmente, peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um paradigma polipeptídeo (isto é, um polipeptídeo que possui uma atividade biológica ou farmacológica), tais como de ocorrência natural de ligação ao receptor de polipeptídeo, mas têm uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituída por uma ligação alternativa, tais como - CH2NH-,-CH2S-, etc, por métodos conhecidos na técnica e descritos nas referências seguintes: Spatola, AF, em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds, Mareei Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, AF, Vega Data (Março 1983), vol. 1, edição, 3, Peptide Backbone Modifications (revisão geral); Morley, Trends Pharm.Sci. pp 463-468 (1980), (revisão geral); Hudson et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 14:177-185 (1979) ,. Spatola, et ai, Life Sei., 38:1243-1249 (1986); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982); Almquist, et al, J. Med. Chem.. Chem, 23:1392-1398, (1980) ,. Jennings-White, et al, Tetrahedron Lett. 23:2533 (1982); Szelke, et al, European Appln.. EP 45665 (1982),. Holladay, et al, Tetrahedron Lett, 24:4401-4404 (1983),. E Hruby, Life Sei., 31:189-199 (1982). Um particularmente 16 preferido de ligação não peptidica é -CH2NH-. Tais peptideos miméticos podem ter vantagens significativas sobre as formas de realização de polipeptideos, incluindo, por exemplo: a produção mais económica, uma maior estabilidade quimica, propriedades farmacológicas melhoradas (semivida, a absorção, a potência, eficácia, etc), especificidade alterada (por exemplo, um largo espectro de atividades biológicas) , antigenicidade reduzida, e outros. A marcação de peptideos normalmente envolve a ligação covalente de uma ou mais etiquetas, diretamente ou através de um espaçador (por exemplo, um grupo amida) , com a posição de não interferência (s) sobre o peptidomimético que estão previstas por estrutura-atividades quantitativas, dados e/ou modelagem molecular. Tais posições não-interferentes geralmente são posições que não formam contactos diretos com as macromolécula (s) (por exemplo, moléculas da superfamilia das imunoglobulinas) a que o peptidomimético se liga para produzir o efeito terapêutico. Derivatização (por exemplo, etiquetagem) de peptidomiméticos não deve interferir substancialmente com a atividade biológica desejada ou farmacológica do peptidomimético. Geralmente, os peptidomiméticos do receptor de ligação de peptideos liga-se ao receptor com elevada afinidade e possui atividade biológica detetável (isto é, são agonistas ou antagonistas para um ou mais receptores mediados por alterações fenotipicas).

Substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina em lugar de L-lisina) pode ser utilizada para gerar os peptideos mais estáveis. Além disso, os peptideos de restrição compreendendo uma sequência de consenso ou de uma variação da sequência de consenso substancialmente idênticos podem ser gerados por 17 métodos conhecidos na especialidade (Rizo, et al., Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992), por meetpurauJd lieiem por referência), por exemplo, pela adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes dissulfureto intramoleculares que ciclizam o peptídeo. "Marcador detetável" refere-se a materiais, que quando covalentemente ligados aos compostos peptídeos da presente invenção, permitem a deteção dos compostos peptídeos in vivo no doente a quem o composto peptídeo tenha sido administrado. Marcadores detetáveis adequados são bem conhecidos na especialidade e incluem, a título de exemplo, radioisótopos, marcadores fluorescentes (por exemplo, fluoresceína), e semelhantes. A etiqueta particularmente detetável empregue não é crítica e é selecionada em relação à quantidade de etiqueta a ser empregue assim como a toxicidade da etiqueta na quantidade de marcador empregue. A seleção do rótulo em relação a tais fatores está bem marcada dentro da especialidade. A ligação covalente do marcador detetável no composto de peptídeo é efetuada por métodos convencionais bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, quando o radioisótopo é usado como o marcador detetável, a ligação covalente do composto peptídeo pode ser conseguida por incorporação do aminoácido tirosina no composto peptídeo e iodação do composto de peptídeo (ver, por exemplo, Weaner, et al., Synthesis e aplicações de compostos isotopicamente rotulados, pp 137-140 (1994)).Incorporação de tirosina do terminal N ou C do composto peptídeo pode ser alcançado através de química bem conhecida. Do mesmo modo, P, pode ser incorporado para o composto peptídeo como um fosfato radical, por exemplo, um grupo hidroxilo no composto peptídeo utilizando química convencional. 18 II. Visão geral A presente especificação fornece compostos peptideos que se ligam entre si e ativam o TPO-R, ou por outro lado, comportam-se como um agonista de TPO. Estes compostos peptideos incluem "piloto" de compostos peptideos e "derivados" de compostos peptideos construídos de modo a ter a mesma ou semelhante estrutura ou forma molecular que os compostos de peptídeo de chumbo, mas que diferem dos compostos peptideos de chumbo quer seja no que respeita à sua suscetibilidade à hidrólise ou proteólise e/ou no que respeita a outras propriedades biológicas, tais como uma afinidade aumentada para o receptor. A presente especificação também proporciona composições que compreendem uma quantidade eficaz de um composto peptídeo, e mais particularmente um composto de peptídeo, que é útil para o tratamento de doenças hematológicas, e particularmente, trombocitopenia associada com quimioterapia, terapia de radiação, ou transfusão de medula óssea. A invenção refere-se a compostos de peptideos, incluindo a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 7): IEGPTLRQ(2-Nal) LAAR(Sar), para uso de acordo com a reivindicação 1.

Noutra forma de realização, os compostos peptideos são de preferência dimerizados ou oligomerizados para aumentar a afinidade e/ou atividade dos compostos. Um exemplo de um composto peptídeo preferido dimerizado inclui, mas não está limitado ao seguinte: ϊ E G P T L R Q (2-Nal) LA AR (Sar)-Xl0 KÍNSh) / ÍEOPTLRQ (2-Nal) LAAR (S&t)~Xi9 19

Onde Χίο é uma sarcosina. A estrutura acima também pode ser representada pela seguinte estrutura: (H-IEGPTLRQ(2-

Nal)LAARXio)2K-NH2.

Um composto peptídeo preferido é o seguinte: IE G P T L R Q (2-Nal) LAAR RSár) \ K(N«3> / IEGPTLRQ (2-Na!) L A A R~(Sar) em que (2-Nal) é B-(2-naftil)alanina e (Sar) é sarcosina (SEQ ID NO: 7).Este composto peptídeo é aqui referido como "Composto TPO N° 1".

Compostos peptídeos que têm uma IC50 superior a cerca de 100 mM de falta de ligação suficiente para permitirem a utilização em qualquer um dos aspetos de diagnóstico ou terapêuticas da presente invenção. De preferência, para fins de diagnóstico, os compostos têm um IC50 de peptídeos de cerca de 2 mM ou menos e, para fins farmacêuticos, os compostos têm um IC50 de peptídeos de cerca de 100 pM ou menos.

Fig. 1 Compara a atividade de três lotes diferentes de Composto TPO N° 1 com um lote do composto peptídeo da técnica anterior, utilizando unidades luminescentes técnicas de ensaio padrão relativo. O ensaio emprega células murinas estavelmente manipuladas para expressar o receptor de TPO humano e um constructo repórter luciferase conduzido pelo promotor fos. A diferença entre o Composto TPO N° 1 e o composto peptídeo da técnica anterior é a de que o composto peptídeo da técnica anterior tem um B-(1-naftil)alanina (1-Nal), onde (2-Nal) está no Composto TPO N° 1. Composto TPO N 0 1 é referido como 2-Nal e o composto 20 peptídeo da técnica anterior é conhecido como 1-Nal (técnica anterior) na fig. 1. Como mostrado na fig. I, a atividade 25 é semelhante para cada composto.

Fig. 2 Compara a atividade de vários lotes diferentes de Composto PEGuilado TPO N° 1 (PEGuilação dos compostos da presente invenção é descrito em mais detalhe abaixo). Ambos os lotes do composto peptideo da técnica PEGuilada anterior mostram elevada atividade essencialmente com o mesmo nivel de atividade que o composto peptídeo não-PEGuilado da técnica anterior. As linhas restantes ilustram a atividade de diferentes lotes de Composto PEGuilado TPO N° l.Como mostrado na fig. 2, neste modelo, o último tem menos atividade em relação aos compostos peptídeos PEGuilados da técnica anterior, o Composto PEGuilado TPO N° 1 é referido como PEG-2-Nal e composto peptídeo PEGuilado da técnica anterior é designado por PEG-l-Nal (técnica anterior) na fig. 2.

Fig. 3 Demonstra a potência relativa do composto peptideo PEGuilado da arte anterior e o Composto PEGuilado TPO N° . 1. Por meio de um rato modelo, a Fig. 3 mostra a mudança in vivo na contagem de plaquetas depois da administração do composto peptideo PEGuilado da arte anterior e o Composto PEGuilado TPO N° 1. Como mostrado na fig. 3, a dose mais elevada do Composto PEGuilado TPO N° 1 tem a mesma atividade que a dose mais baixa do composto de peptídeo ligado a PEG da técnica anterior. Um composto menos potente pode proporcionar um estímulo menos drástico para a célula-alvo, o que pode reduzir o risco de efeitos colaterais causados pela sobre estimulação da célula alvo, tal como trombocitopenia exacerbada após subsequente ciclo de quimioterapia. Composto PEGuilado TPO N° 1 é referido como PEG-2-Nal e composto peptídeo PEGuilado da técnica 21 anterior é designado por PEG-l-Nal (técnica anterior) na fig. 3.

As Figs. 4 e 5 mostram os resultados de um estudo de resposta de dose por cabeça de um composto peptideo ligado a PEG da técnica anterior e o Composto PEGuilado TPO N° 1 em ratos normais. Composto PEGuilado TPO N° 1 é referido como PEG-2-Nal e composto peptideo PEGuilado da técnica anterior é designado por PEG-l-Nal (técnica anterior) nas Figs. 4 e 5.Fig. 4 mostra o aumento dos niveis de plaquetas e a Fig. 5 mostra o volume médio de plaquetas de seis (6) dias após o tratamento. 0 intervalo de dose foi de 10 a 3000ug/kg. Ambos os compostos peptideos aumentaram o número de plaquetas circulantes de um modo dependente da dose com um aumento em relação ao grupo de controlo observado com doses tão baixas como 30ug/kg para ambos os compostos. Na resposta máxima, estes compostos peptideos elevaram a contagem de plaquetas a niveis que eram até 4 vezes maior do que os valores de controlo. As curvas de resposta por dose para estes compostos peptideos foram muito semelhantes, indicando que, neste modelo não havia nenhuma diferença significativa entre os dois artigos de teste baseados nestes parâmetros. IV. Preparação de compostos peptideos A. Síntese em fase sólida

Os compostos peptideos podem ser preparados através de métodos clássicos conhecidos na especialidade, por exemplo, usando técnicas padrão de fase sólida. Os métodos convencionais incluem a síntese em fase sólida exclusiva, métodos parciais de síntese em fase sólida, de condensação de fragmentos, a síntese clássica em solução, e 22 mesmo por tecnologia de ADN recombinante. Ver, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Chem. Soc., 85:2149 (1963). Em fase sólida, a sintese é tipicamente iniciada a partir da extremidade C-terminal do peptideo utilizando uma resina de alfa-amino protegido. Um material de partida adequado pode ser preparado, por exemplo, por ligação do ácido alfa-amino desejado, a uma resina clorometilada, uma resina de hidroximetilo, ou uma resina de benzidrilamina. Uma tal resiina clorometilada é vendida sob o nome comercial de BIO-BEADS SX-1 por Bio Rad Laboratories, Richmond, Califórnia, e a preparação da resina de hidroximetilo está descrita por Bodonszky, et al., Chem. Ind. (London), 38:1597 (1966). A resina de benzidrilamina (BHA) foi descrita por Pietta e Marshall, Chem. Comran., 650 (1970) e encontra-se comercialmente disponível a partir de Beckman Instruments, Inc., Paio Alto, Califórnia, na forma de cloridrato.

Assim, os compostos peptideos podem ser preparados por acoplamento de um alfa-amino ácido protegido por amino com a resina clorometilada com o auxílio de, por exemplo, bicarbonato de césio do catalisador, de acordo com o método descrito por Gisin, Helv. Chim. Acta., 56:1467 (1973).Após o acoplamento inicial, o grupo alfa-amino protetor é removido por uma variedade de reagentes, incluindo o ácido trifluoroacético (TFA) ou ácido clorídrico (HC1) de soluções em solventes orgânicos à temperatura ambiente.

Os grupos alfa-amino protetores são aqueles conhecidos na especialidade como sendo úteis na sintese passo a passo dos peptideos. Estão incluídos os grupos protetores de tipo acilo (por exemplo, formilo, trifluoroacetilo, acetilo), grupos de uretano aromáticos (por exemplo, do tipo de proteção benziloxicarbonil (CBZ) e CBZ substituído), grupos 23 protetores de uretano alifáticos (por exemplo, t-butiloxicarbonilo (Boc), isopropiloxicarbonilo, ciclo-hexiloxicarbonilo) e do tipo de alquilo os grupos protetores (por exemplo, benzilo, trifenil-metilo). Boc e Fmoc são os grupos protetores preferidos. 0 grupo protetor da cadeia lateral permanece intacto durante o acoplamento e não é cindido durante a desproteção do grupo protetor amino-terminal ou durante o acoplamento. 0 grupo protetor da cadeia lateral deve ser removível após conclusão da síntese do peptídeo final, e sob condições de reação que não alterem o peptídeo alvo. A cadeia lateral de grupos protetores para Tyr inclui tetra-hidropiranilo, terc-butilo, tritilo, benzilo, Cbz, Z-Br-Cbz, e 2,5-diclorobenzil. A cadeia lateral de grupos protetores para Asp incluem benzilo, 2,6-diclorobenzilo, metilo, etilo, e ciclo-hexilo. A cadeia lateral de grupos protetores para Thr e Ser incluem acetilo, benzoílo, tritilo, tetra-hidropiranilo, benzilo, 2,6-diclorobenzilo, e Cbz. 0 grupo protetor da cadeia lateral para Thr e Ser é o benzilo. A cadeia lateral de grupos protetores para Arg inclui nitro, tosilo (Tos), Cbz, adamantiloxicarbonilo mesitoylsulfonyl (Mts), ou Boc. A cadeia lateral de grupos protetores para Lys inclui Cbz, 2-clorobenziloxicarbonilo (2-Cl-Cbz), 2-bromobenziloxicarbonilo (2-BrCbz) , Tos, ou Boc.

Após a remoção do grupo alfa-amino protetor, os restantes aminoácidos protegidos são acoplados passo a passo na ordem desejada. Um excesso de cada amino ácido protegido é geralmente utilizado com um grupo carboxilo ativador apropriado tal como diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) em 24 solução, por exemplo, em cloreto de metileno (CH2C12), dimetilo formamida (DMF) misturas.

Após a sequência de aminoácidos desejada ter sido concluída, o peptídeo desejado é desacoplado do suporte de resina por tratamento com um reagente tal como o ácido trifluoroacético ou o ácido fluorídrico (HF) , que não só cliva o peptídeo da resina, como também cliva todos os restantes grupos protetores da cadeia lateral. Quando a resina clorometilada é utilizada, o tratamento com fluoreto de hidrogénio resulta na formação dos ácidos peptídeos livres. Quando a resina de benzidrilamina é usada, o tratamento de fluoreto de hidrogénio resulta diretamente na amida livre do peptídeo. Alternativamente, quando a resina clorometilada é empregada, a cadeia lateral do peptídeo protegido pode ser desacoplada por tratamento da resina do peptídeo com amoníaco para dar a desejada amida de cadeia lateral protegida ou com uma alquilamina para dar uma alquilamida de cadeia lateral protegida ou dialquilamida. A proteção da cadeia lateral é então removida da forma habitual por tratamento com fluoreto de hidrogénio para dar as amidas livres, alquilamidas, ou dialquilamidas.

Estes processos de fase sólida de síntese de peptídeos são bem conhecidos na especialidade e descritos por John Morrow Stewart e Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Synthesis (2nd ed., Pierce Chemical Company, 1984). B. Aminoácidos sintéticos

Estes procedimentos podem também ser utilizados para sintetizar peptídeos em que os aminoácidos que não ocorrem naturalmente, os aminoácidos geneticamente codificados são 25 substituídos com um, dois, ou mais posições de qualquer um dos compostos da invenção.

Pode-se substituir as cadeias laterais que ocorrem naturalmente dos ácidos aminados geneticamente codificados (ou D aminoácidos) com outras cadeias laterais, por exemplo com grupos tais como alquilo, alquilo inferior, cíclico 4-, 5-, 6-, a 7- membros um grupo alquilo, amida, amida alquilo inferior, amida di (alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi, carboxi e os derivados de éster mais baixos dos mesmos, e com 4-, 5-, 6-, a 7- membros hetereociclicos. Em particular, os análogos da prolina em que o tamanho do anel do resíduo de prolina é alterado de 5 membros para 4, 6, ou 7 membros podem ser empregados. Grupos cíclicos podem ser saturados ou insaturados, e se insaturados, podem ser aromáticos ou não aromáticos. Os grupos heterocíclicos contêm de preferência um ou mais de azoto, oxigénio e/ou heteroátomos de enxofre. Exemplos de tais grupos incluem o furazanilo, furilo, imidazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo (por exemplo, morfolino), oxazolilo, piperazinilo (por exemplo 1-piperazinilo), piperidilo (por exemplo, 1-piperidilo, piperidino), piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo (por exemplo 1-pirrolidinilo), pirrolinilo, pirrolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, tiomorfolinilo (por exemplo, tiomorfolino) , e triazolilo. Estes grupos heterocíclicos podem ser substituídos ou não substituídos. Quando um grupo é substituído, o substituinte pode ser alquilo, alcoxi, halogénio, oxigénio, ou fenilo substituído ou não substituído.

Pode-se também modificar facilmente os peptídeos por fosforilação (ver, por exemplo, W. Bannwarth, et al., 26

Chemistry Letters Biorganic and Medicinal, 6 (17):2141-2146 (1996)), e outros métodos para a derivação dos compostos de peptideos da presente invenção são descritos em Hruby et al., Biochem.J., 268 (2):249-262 (1990). Assim, os compostos peptideos da invenção também servem como uma base para preparar miméticos de peptideos com atividade biológica semelhante. C. Modificações terminais

Os peritos na especialidade reconhecem que uma variedade de técnicas estão disponiveis para a construção de compostos peptideos, com a mesma ou semelhante atividade biológica desejada como o composto peptideo correspondente, mas com mais atividade mais favorável do que o composto peptideo com respeito à solubilidade, suscetibilidade a estabilidade, e para hidrólise e proteólise. Ver, por exemplo, Morgan et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252 (1989). O que se segue descreve métodos para a preparação de compostos peptideos modificados no grupo amino N-terminal e, no grupo carboxilo C-terminal, e/ou alterando uma ou mais das ligações de amido no peptideo a uma ligação não amido. Entendendo-se que duas ou mais dessas modificações podem ser acopladas numa estrutura de composto peptideo (por exemplo, a modificação no grupo carboxilo C-terminal e da inclusão de uma ligação -CH2-carbamato entre dois aminoácidos no composto peptideo). 1. Modificações n-terminais

Os compostos peptideos são tipicamente sintetizados como o ácido livre, mas, como notado acima, podem ser facilmente preparados como o amido ou éster. Pode-se também modificar o terminal amino e/ou carboxilo dos compostos peptideos da presente invenção para produzir outros compostos da 27 presente invenção. Modificações terminais de amino incluem metilação, acetilação, a adição de um grupo benziloxicarbonil, ou bloqueamento do terminal amino com qualquer grupo de bloqueamento contendo uma funcionalidade carboxilato definida por RCOO-, em que R é selecionado a partir do grupo consistindo em naftil, acridinilo, esteroidil, e grupos semelhantes. Modificações terminais de carboxilo incluem a substituição do ácido livre com um grupo carboxamida ou a formação de uma lactama ciclica no terminal carboxi para introduzir limitações estruturais.

Modificações terminais de amino são como descrito acima e incluem alquilação, acetilação, a adição de um grupo carbobenzoil, formando um grupo succinimida, etc (Ver, por exemplo, Murray, et al., Medicinal Chemistry Burger e Drug Discovery, 5 a ed., Vol. 1, Manfred Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc. (1995)) . Especificamente, o grupo amino N-terminal pode depois ter reagido como se segue: (A) para formar um grupo amida de fórmula RC (0) NH-, onde R é definido como acima por reação com um anidrido de ácido ou halogeneto simétrico. Tipicamente, a reação pode ser realizada fazendo contactar quantidades aproximadamente equimolares ou em excesso (por exemplo, cerca de 5 equivalentes) de um haleto de ácido para o peptideo num diluente inerte (por exemplo, diclorometano) preferencialmente contendo um excesso (por exemplo, cerca de 10 equivalentes) de uma amina terciária, tal como diisopropiletilamina, para eliminar o ácido gerado durante a reação. As condições de reação são de outro modo convencionais (por exemplo, temperatura ambiente, durante 30 minutos). A alquilação do terminal amino para proporcionar um grupo alquilo inferior N-substituição seguida por reação com um 28 halogeneto de ácido, tal como descrito acima irá proporcionar a fórmula RC(0)NR~ para o grupo N-alquilo; (B) para formar um grupo succinimida por reação com anidrido succinico. Tal como anteriormente, uma quantidade aproximadamente equimolar ou um excesso de anidrido succinico (por exemplo, cerca de 5 equivalentes) podem ser empregues e o grupo amino é convertido para a succinimida por métodos bem conhecidos na especialidade, incluindo a utilização de um excesso (por exemplo, dez equivalentes) de uma amina terciária tal como di-isopropiletilamina num solvente inerte adequado (diclorometano, por exemplo). Ver, por exemplo, Wollenberg, et al., Patente dos EUA. N° 4.612.132, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Entende-se que o grupo succinico pode ser substituído com, por exemplo, alquilo ou substituintes -SR que são preparados de uma forma convencional para proporcionar succinimida substituída no terminal-N do peptídeo. Estes substituintes alquilo são preparados por reação de uma olefina inferior, com anidrido maleico da forma descrita por Wollenberg, et al, supra e substituintes -SR são preparados por reação de RSH com anidrido maleico em que R é como definido acima; (C) para formar um benziloxicarbonil -NH- ou um grupo benziloxicarbonilo -NH- substituído, por reação com cerca de uma quantidade equivalente ou um excesso de CBZ-C1 (isto é, cloreto de benziloxicarbonilo) ou um CBZ-C1 substituído num diluente inerte adequado (por exemplo, diclorometano) preferencialmente contendo uma amina terciária para eliminar o ácido gerado durante a reação; 29 (D) para formar um grupo sulfonamida por reação com uma quantidade equivalente ou um excesso (por exemplo, 5 equivalentes) de R-S(0)2C1 num diluente inerte adequado (diclorometano) para converter a amina terminal numa sulfonamida em que R é como definido acima. De preferência, o diluente inerte contém excesso de amina terciária (por exemplo, dez equivalentes) tal como diisopropiletilamina, para eliminar o ácido gerado durante a reação. As condições de reação são de outro modo convencionais (por exemplo, temperatura ambiente, durante 30 minutos); (E) para formar um grupo carbamato por reação com uma quantidade equivalente ou um excesso (por exemplo, 5 equivalentes) de R-OC(0)CI ou R-OC (O) OC6H4-p-NC>2 num diluente inerte adequado (por exemplo, diclorometano) para converter a amina terminal num carbamato em que R é como definido acima. De preferência, o diluente inerte contém um excesso (por exemplo, cerca de 10 equivalentes) de uma amina terciária, tal como diisopropiletilamina, para eliminar qualquer ácido gerado durante a reação. As condições de reação são de outro modo convencionais (por exemplo, temperatura ambiente, durante 30 minutos); e (F) para formar um grupo ureia por reação com uma quantidade equivalente ou um excesso (por exemplo, 5 equivalentes) de R-N=C=0, num diluente inerte adequado (por exemplo, diclorometano) para converter 15 da amina terminal numa ureia (ou seja, RNHC(O)NH-) onde grupo R é como definido acima. De preferência, o diluente inerte contém um excesso (por exemplo, cerca de 10 equivalentes) de uma amina terciária, tal como diisopropiletilamina. As condições de reação são de outro 30 modo convencionais (por exemplo, temperatura ambiente, durante cerca de 30 minutos). 1. Modificações c-terminais

Na preparação de compostos de peptideos em que o grupo carboxilo C-terminal é substituído por um éster (isto é, -C(0)0R, onde R é como definido acima), as resinas usadas para preparar os ácidos peptideos são empregadas, e a cadeia lateral do peptideo protegido é clivada com base no álcool apropriado, por exemplo, o metanol. Grupos de cadeias laterais de proteção são então removidos de modo convencional por tratamento com fluoreto de hidrogénio para se obter o éster desejado.

Na preparação de compostos de peptideos em que o grupo carboxilo C-terminal é substituído pela amida -C(0)NR3R4, uma resina de benzidrilamina é usada como suporte sólido para a sintese peptidica. Após a conclusão da sintese, o tratamento com fluoreto de hidrogénio para libertar o peptideo do suporte resulta diretamente na amida livre de peptideo (isto é, o C-terminal é C-(0)NH2). Alternativamente, o uso da resina clorometilada durante a sintese de peptideos juntamente com a reação com amoniaco para clivar o peptideo de cadeia lateral protegida do apoio produz a amida peptidica livre e a reação com uma alquilamina ou uma dialquilamina produz uma alquilamida de cadeia lateral protegida ou dialquilamida (isto é, o C-terminal é -CfOJNRR1 onde R e R1 são como definidos acima). A proteção da cadeia lateral é então removida da forma habitual por tratamento com fluoreto de hidrogénio para dar as amidas livres, alquilamidas, ou dialquilamidas.

Pode-se também ciclizar os compostos peptideos ou incorporar um residuo desamino ou descarboxi no terminal do 31 composto peptídeo, de modo que não exista nenhum grupo terminal amino ou carboxilo, para diminuir a suscetibilidade a proteases ou para restringir a conformação do composto peptídeo. C-terminais de grupos funcionais dos compostos peptídeos da presente invenção, incluem amida, amida alquilo inferior, amida di (alquilo inferior), alcoxi inferior, hidroxi, e carboxilo, e os derivados de éster mais baixos dos mesmos, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Além do que precede as modificações N-terminais e C-terminais, os compostos de peptídeos, incluindo peptidomiméticos, podem, vantajosamente, ser modificados com ou covalentemente ligados a uma ou mais de uma variedade de polímeros hidrófilos. Verificou-se que quando os compostos peptídeos são derivatizados com um polimero hidrofílico, a sua solubilidade e semivida de circulação são aumentadas e a sua imunogenicidade é mascarada. 0 precedente pode ser concretizado com pouca, se alguma, diminuição na sua atividade de ligação. Polímeros não proteicos adequados para utilização de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, polialquileteros como exemplificados por polietileno glicol e polipropileno glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialquenes, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, celulose e derivados da celulose, dextrano e derivados de dextrano, etc Geralmente, estes polímeros hidrófilos têm um peso molecular médio variando de cerca de 500 a cerca de 100.000 toneladas dal, mais preferivelmente de cerca de 2.000 a cerca de 40.000 daltons, e ainda mais preferencialmente, desde cerca de cerca de 20.000 daltons. Em formas de realização preferidas, estes polímeros hidrófilos têm um peso 32 molecular médio de cerca de 5.000 daltons, de 10.000 daltons e 20000 daltons.

Os compostos peptídeos da invenção podem ser derivatizados, com ou acoplados a tais polímeros, utilizando qualquer um dos métodos estabelecidos no Zallipsky, S., Bioconjuqate Chem, 6: ISO-165 (1995); Monfardini, C, et al, Bioconjugate. Chem, 6:62-69 (1995), Patente dos EUA. N° 4.640.835; Patente dos EUA. N° 4.496.689; Patente dos EUA. N° 4.301.144; Patente dos EUA. N° 4.670.417; Patente dos EUA. N° 4.791.192; Patente dos EUA. N° 4.179.337 ou WO 95/34326.

Numa forma de realização presentemente preferida, os compostos peptídeos da presente invenção são derivatizados com polietileno glicol (PEG).PEG é um linear, polímero solúvel em água de unidades de óxido de etileno de repetição com dois grupos hidroxilo terminais. PEGs são classificados pelos seus pesos moleculares que variam tipicamente de cerca de 500 daltons a cerca de 40.000 daltons. Numa forma de realização presentemente preferida, os PEGs empregados têm pesos moleculares que variam de 5.000 daltons a cerca de 20.000 daltons. PEGs acoplados aos compostos peptídeos da presente invenção podem ser ou não ramificados. (Ver, por exemplo, Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995)). PEGs são comercialmente disponíveis a partir de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.) (agora parte da Nektar Therapeutics (San Cario, CA), Sigma Chemical Co. e outras empresas. PEGs incluem, mas não estão limitados a, monometoxipolietilenoglicol (MePEG-OH), monometoxipolietileno glicol succinato-(MePEG-S), monometoxipolietileno glicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipolietileno glicol amina (MePEG-NH2) , 33 tresilato monometoxipolietileno glicol (MePEG-TRES) , e monometoxipolietileno glicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-EM) .

Em resumo, numa concretização, o polímero hidrofílico que é empregue, por exemplo, PEG, é de preferência limitado a uma extremidade por um grupo reativo tal como um grupo metoxi ou etoxi. Em seguida, o polímero é ativado na outra extremidade, por reação com um agente de ativação adequado, tal como halogenetos de cianurilo (por exemplo, cloreto cianúrico, brometo ou fluoreto), diimadozle, um reagente (por exemplo, anidrido, um anidrido dihalosuccinic, tais como anidrido dibromosuccinic), azida de acilo, p-diazoiumbenzyl éter, ácido 3 - (p-diazoniumphenoxy) - 2-hydroxypropylether) e outros semelhantes. 0 polímero ativado é então reagido com um composto de peptídeo da presente invenção para produzir um composto peptídeo derivatizado com um polímero. Alternativamente, um grupo funcional em compostos peptídeos da invenção podem ser ativados por reação com o polímero, ou os dois grupos podem ser ligados numa reação de acoplamento concertada, utilizando métodos de acoplamento conhecidos. Será prontamente apreciado que os compostos peptídeos da invenção podem ser derivatizados com PEG, utilizando uma variedade de esquemas de reação, conhecidos e utilizados pelos especialistas.

Quando os compostos peptídeos são derivatizados com um polímero hidrofílico, a sua solubilidade e semivida de circulação são aumentadas e a sua imunogenicidade é reduzida. 0 precedente pode ser realizado com poucas perdas, se algumas, na atividade biológica. Em formas de realização preferidas, os peptídeos derivados possuem uma atividade que é de 0,1 a 0,01 vezes a dos peptídeos não 34 modificados. Em concretizações mais preferidas, os peptideos derivados possuem uma atividade que é de 0,1 a 1 vez que os peptideos não modificados. Em formas de realização ainda mais preferidas, os peptideos derivados possuem uma atividade que é maior do que os peptideos não modificados. D. Modificações de medula óssea

Outros métodos para fazer derivados peptideos dos compostos aqui descritos são descritos em Hruby et al., Biochem J., 268 (2):249-262 (1990).Assim, os compostos peptideos também servem como modelos estruturais para compostos não peptideos com uma atividade biológica similar. Os especialistas reconhecem que uma variedade de técnicas estão disponíveis para a construção de compostos com a mesma ou semelhante atividade biológica desejada do composto de peptídeo de chumbo, mas com mais atividade favorável do que o chumbo com respeito à solubilidade, estabilidade e suscetibilidade à hidrólise e proteólise. Ver, por exemplo, Morgan et al., Ann. Rep. Med. Chem., 24:243-252 (1989). Estas técnicas incluem a substituição do esqueleto peptídeo com uma espinha dorsal composta por fosfonatos, amidates, carbamatos, sulfonamidas, aminas secundárias, e N-metilamino ácidos. Reagentes adequados incluem, por exemplo, análogos de aminoácidos, em que o grupo carboxilo do aminoácido foi substituído por um radical apropriado para formar uma das ligações acima.

Da mesma forma, a substituição de uma ligação amido no peptídeo com uma ligação de fosfonato pode ser conseguida do modo apresentado na Patente dos EUA N° s 5.359.115 e 5.420.328. 35 E. Formação de ligação dissulfureto

Os compostos aqui descritos podem existir numa forma ciclizada com uma ligação dissulfureto intramolecular entre o grupo tiol de cisternas incorporadas, se estiverem presentes. Como alternativa, uma ligação de dissulfureto intermolecular entre os grupos tiol dos resíduos cisteína podem ser produzidos para se obter um composto dimérico (ou superior oligomérico) composto. Um ou mais dos resíduos de cisteína pode também ser substituído com uma homocisteína. V. Utilidade

Os compostos peptídeos são úteis in vitro como ferramentas únicas para a compreensão do papel biológico de TPO, incluindo a avaliação dos muitos fatores que se pensa influenciar, e ser influenciados pela produção de TPO e o processo de ligação do receptor. Os compostos peptídeos da presente invenção são também úteis para o desenvolvimento de outros compostos que se ligam e ativam o TPO-R, porque os presentes compostos peptídeos fornecem informações importantes sobre a relação entre estrutura e atividade que deve facilitar esse desenvolvimento.

Os compostos peptídeos são também úteis como ligantes competitivos em ensaios para triagem de novos agonistas do receptor de TPO. Em formas de realização do ensaio, os compostos peptídeos da invenção podem ser utilizados sem qualquer modificação ou podem ser modificados numa variedade de formas, por exemplo, por meio de rotulagem, tal como covalentemente ou não covalentemente unindo uma unidade que diretamente ou indiretamente proporciona um sinal detetável. Em qualquer destes ensaios, os materiais podem de igual forma ser rotulados, direta ou 36 indiretamente. Possibilidades para a marcação direta incluem grupos de rótulos, tais como: marcadores radioativos, tais como 1251, enzimas (Patente dos EUA N° 3.645.090.) Tais como peroxidase e fosfatase alcalina, e marcadores fluorescentes (Patente dos EUA N° 3.940.475.) Capazes de monitorizar a alteração na intensidade de fluorescência, comprimento de onda de deslocamento, ou polarização de fluorescência. Possibilidades de marcação indireta incluem biotinilação de um constituinte seguido por ligação a avidina acoplada a um dos grupos de etiquetas acima. Os compostos peptideos podem também incluir espaçadores ou ligantes em casos em que os compostos peptideos são para ser ligados a um suporte sólido.

Além disso, com base na sua capacidade para se ligarem ao receptor de TPO, os compostos peptideos da presente invenção podem ser utilizados como reagentes para detetar receptores de TPO em células vivas, células fixadas, em fluidos biológicos, em homogenatos de tecidos, em purificadas naturais, materiais biológicos, etc, por exemplo, por marcação de tais compostos peptideos, pode-se identificar células que possuem a TPO-R nas suas superfícies. Além disso, com base na sua capacidade para se ligarem ao receptor de TPO, os compostos peptideos do presente invento podem ser utilizados em coloração em situ, FACS (triagem ativada por fluorescência de células), transferência de Western, ELISA, etc Além disso, com base na sua capacidade de se ligar ao receptor de TPO, os compostos peptideos do presente invento podem ser utilizados na purificação do receptor, ou em purificação de células que expressam os receptores de TPO na superfície das células (ou células dentro permeabilizadas).

Os compostos peptideos podem também ser utilizados como reagentes comerciais para a investigação médica e várias 37 utilizações de diagnóstico. Tais utilizações incluem, mas não estão limitados a: (1) usar como um padrão de calibração para a quantificação das atividades de agonistas candidatos de TPO numa variedade de ensaios funcionais, (2) utilizar para manter a proliferação e crescimento de linhas celulares dependentes de TPO; (3) uso na análise estrutural do receptor de TPO, através de co cristalização, (4) utilizar para investigar o mecanismo de transdução de sinal de ativação de TPO-receptor, e (5) outras investigações e aplicações de diagnóstico, em que o TPO-receptor é preferencialmente ativado ou essa ativação é convenientemente calibrada contra a quantidade conhecida de um agonista de TPO, e semelhantes.

Os compostos peptideos podem ser utilizados para a expansão in vitro de megacariócitos e seus progenitores dedicados, ambos em conjunto com citocinas adicionais ou por conta própria. Ver, por exemplo, DiGiusto et al., PCT Publication N°95/05843. Terapias de quimioterapia e radiação causam trombocitopenia por matarem a divisão rápida, população mais madura de megacariócitos. No entanto, estes tratamentos terapêuticos podem também reduzir o número e viabilidade das imaturas, menos mitoticamente ativas células precursoras de megacariócitos. Assim, uma melhoria da trombocitopenia por TPO ou os compostos da presente invenção pode ser acelerada através da infusão de pacientes pós-quimioterapia ou terapia de radiação com uma população de suas próprias células enriquecidas em megacariócitos e precursores imaturos por cultura in vitro.

Os compostos peptideos podem também ser administrados a animais de sangue quente, incluindo humanos, para ativar o TPO-R in vivo. Assim, são aqui descritos métodos para o tratamento terapêutico de desordens relacionadas com a TPO 38 que compreendem a administração de um composto peptideo da presente invenção em quantidades suficientes para mimetizar o efeito de TPO em TPO-R in vivo. Por exemplo, os compostos peptideos podem ser administrados para tratar uma variedade de doenças hematológicas, incluindo, mas não se limitando a distúrbios plaquetários e trombocitopenia, particularmente quando associado a transfusão de medula óssea, terapia de radiação e quimioterapia.

Em algumas formas de realização são, de preferência os antagonistas de TPO primeiro administrados a doentes submetidos a quimioterapia ou terapia de radiação, seguido por administração de agonistas de TPO da presente invenção. A atividade dos compostos peptideos pode ser avaliada in vitro ou in vivo, num dos numerosos modelos descritos em McDonald, Am. J. of. Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992) .

De acordo com uma forma de realização, a composição para utilização de acordo com a presente invenção é útil para o tratamento de trombocitopenia associado a transfusão de medula óssea, terapia de radiação ou quimioterapia. Os compostos peptideos normais serão administrados profilaticamente antes da quimioterapia, terapia de radiação, ou transplante de medula óssea ou após tal exposição.

Deste modo, composições farmacêuticas compreendem, como ingrediente ativo, pelo menos um dos compostos peptideos da invenção em associação com um veiculo ou diluente farmacêutico. Os compostos peptideos podem ser administrados por via oral, pulmonar, parental (intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou 39 subcutânea), por inalação (por meio de uma formulação em pó fino), transdermal, nasal, vaginal, retal, ou via sublingual de administração e pode ser formulados em formas de dosagem apropriadas para cada via de administração. Ver, por exemplo, Bernstein, et al, Publicação PCT N° WO 93/25221; Pitt et al, Publicação de Patente PCT N° WO 94/17784, E Pitt, et al, Pedido de Patente Europeia 613683.

As formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pilulas, pós, e grânulos. Em tais formas de dosagem sólidas, o composto ativo peptídeo é misturado com pelo menos um veiculo inerte farmaceuticamente aceitável, tal como sacarose, lactose, ou amido. Tais formas de dosagem podem também compreender, como é prática normal, substâncias adicionais diferentes de diluentes inertes e agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio. No caso de cápsulas, comprimidos, e pilulas, as formas de dosagem podem também compreender agentes tamponantes. Comprimidos e pilulas podem adicionalmente ser preparados com revestimentos entéricos.

As formas de dosagem liquidas para administração oral incluem emulsões farmaceuticamente aceitáveis, soluções, suspensões, xaropes, com os elixires contendo diluentes inertes vulgarmente utilizados na especialidade, tais como água. Para além desses diluentes inertes, as composições também podem incluir adjuvantes, tais como agentes molhantes, agentes emulsionantes e de suspensão, e agentes edulcorantes, aromatizantes, e agentes perfumantes.

As preparações para administração parental incluem soluções estéreis aquosas ou não aquosas, suspensões ou emulsões. Exemplos de solventes não-aquosos ou veiculos são o propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como azeite e óleo de milho, gelatina, e ésteres orgânicos 40 injetáveis tais como oleato de etilo. Tais formas de dosagem podem também conter adjuvantes tais como agentes conservantes, molhantes, emulsionantes e agentes dispersantes. Eles podem ser esterilizados por, por exemplo, filtração através de um filtro retentor de bactérias, por incorporação de agentes esterilizantes nas composições, irradiando as composições, ou aquecendo as composições. Eles podem também ser fabricados utilizando água estéril, ou algum outro meio injetável estéril, imediatamente antes da utilização.

As composições para administração retal ou vaginal são preferencialmente supositórios que podem conter, para além da substância ativa, excipientes tais como a manteiga de cacau ou uma cera de supositório. As composições para administração nasal ou sublingual também são preparadas com excipientes convencionais bem conhecidos na especialidade.

As composições contendo os compostos peptídeos podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um doente que já sofre de uma doença, como descrito acima, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente os sintomas da doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade da doença e do estado geral e peso do paciente.

As composições também podem ser microencapsuladas, por exemplo, o método de Tice e Bibi (em Treatise on Controlled Drug Delivery, ed.A. Kydonieus, Mareei Dekker, New York (1992), pp 315-339). 41

Em aplicações profiláticas, as composições contendo os compostos peptideos da invenção são administradas a um paciente suscetível a, ou de outro modo em risco de uma doença particular. Uma tal quantidade é definida como sendo uma "dose profilaticamente eficaz". Nesta utilização, as quantidades precisas novamente dependem do estado do paciente, da saúde e do peso.

As quantidades do composto de peptideas necessárias para uma terapia eficaz irão depender de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente, e outros medicamentos administrados. Assim, as dosagens de tratamento devem ser tituladas para otimizar a segurança e eficácia. Tipicamente, as dosagens utilizadas in vitro podem fornecer orientações úteis nas quantidades úteis para a administração local destes reagentes. Os testes em animais com doses eficazes para tratamento de desordens particulares irão fornecer indicação preditiva adicional de dosagem humana. Várias considerações são descritas, por exemplo, em Gilman, et al. (Eds), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed, Pergamon Press (1990) e Remington' s Pharmaceutical Sciences, 7 Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985).

Os compostos peptideos são eficazes no tratamento de condições mediadas por TPO quando administrados num intervalo de dosagem compreendido entre cerca de 0,001 mg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia. A dose especifica utilizada é regulada pelo estado particular a ser tratado, da via de administração, bem como pelo julgamento do médico assistente dependendo de fatores tais como a gravidade da condição, da idade e do estado geral do paciente, e similares. 42 EXEMPLO 1

Fase sólida sintese do composto peptídeo

Os compostos peptídeos podem ser sintetizados, por exemplo, utilizando as técnicas de Merrifield de sintese em fase sólida (ver Steward e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Edição, Pierce Chemical, Rockford, 111. (1984) e

Merrifield, J. Am. Chem. Chem . Soc., 85:2149 (1963)) ou um Applied Biosystems Inc. Modelo 431A ou 433A sintetizador de peptideos. Os compostos de peptideos podem ser montados utilizando protocolos padrão da Synth Applied Biosystems Inc. Assist™ 1.0.0 ou Synth Assist™ 2.0.2. Cada acoplamento pode ser realizado por 2x30min. com HBTU(2-(1H-benzatriazol-l-il)-1, 1,3,3- tetrametilurónio) e HOBt (1- hidroxibenzotriazole).

Pode ser utilizada resina HMP (p-hidroximetil fenoximetil) poliestireno ou resina PAL (Milligen/Biosearch) , que é uma resina de poliestireno de ligação cruzada com 5-(4'-Fmoc-aminometil-3,5'-dimethyoxyphenoxy)ácido valérico como um ligante. Utilização de resina PAL resulta numa funcionalidade amida do terminal carboxilo sobre a clivagem do peptideo a partir da resina. Após a clivagem, a resina HMP produz uma parte de ácido carboxilico no terminal C do produto final. A maioria dos reagentes, resinas, e os aminoácidos protegidos (livres ou na resina) podem ser adquiridos a partir de Millipore ou Applied Biosystems Inc. O grupo Fmoc pode ser utilizado para a proteção de amino, durante o procedimento de acoplamento.

Proteção de amina primária de aminoácidos pode ser conseguida com Fmoc e grupos de proteção de cadeia lateral, 43 tais como t-butilo para serina, tirosina, ácido glutâmico, e treonina; tritilo para glutamina; Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil) para a arginina; N-t-butiloxicarbonil para triptofano, N-tritilo para histidina e S-tritilo para a cisterna pode ser utilizada. A remoção dos compostos peptídeos da resina e desproteção simultânea das funções da cadeia lateral pode ser conseguida por tratamento com reagente K ou ligeiras modificações do mesmo. Alternativamente, na sintese de tais peptideos, com um terminal carboxilo amidado, o peptideo totalmente montado pode ser clivado com uma mistura de 90% de ácido trifluoroacético, 5% de etanoditiol, e 5% de água, inicialmente a 4o C, e, gradualmente aumentando a temperatura ambiente. Os compostos peptideos desprotegidos podem ser precipitados com éter dietilico. A purificação pode ser feita por preparativa, de fase reversa, cromatografia liquida de alta eficiência sobre uma coluna de gel de silica ligada Cis com um gradiente de acetonitrilo/água a 0,1% de ácido trifluoroacético. Os compostos peptideos homogéneos podem ser caracterizados por espectrometria de massa rápida Atom Bombardment ou espectrometria de massa de eletropulverização e análise de aminoácidos, quando aplicável.

Numa forma de realização preferida, os compostos peptideos são dimerizados usando procedimentos padrão de sintese conhecidos e utilizados pelos especialistas. Seguindo estes esquemas de sintese, os especialistas podem facilmente preparar os compostos de dimeros de peptideos de acordo com a presente invenção. Além disso, será facilmente evidente para os especialistas que as subunidades diméricas podem ser facilmente ligadas com metodologias conhecidas e linkers. 44 EXEMPLO 2

Peguilação dos compostos peptideos A PEGuilação de um composto peptideo pode ser realizada por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, um composto de peptideo da presente invenção pode ser dissolvido em 100 mM de bicina pH 8,0 a uma concentração de 10 mg/ml, adicionado a um excesso de 1,25 molar de PEG2 em pó (comercialmente disponível a partir de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama, agora Nektar Therapeutics (San Carlos, CA)) e agitou-se à temperatura ambiente até a reação estar completa, tipicamente 1-2 horas. A reação é monitorizada por HPLC de fase reversa utilizando um gradiente de acetonitrilo de 40-65%, com uma coluna YMC ODS AQ. Quando a reação está completa, a solução é adicionada a um segundo 1,25 excesso molar de PEG2 em pó e o processo é repetido quatro vezes utilizando um total de 5 moles de PEG2 por cada mole de polipeptídeo. A solução é diluída duas vezes com PBS para reduzir a viscosidade e carregada numa coluna Superdex 200 (Pharmacia), previamente equilibrada e eluída com PBS. As frações da coluna de exclusão de tamanho podem ser analisados por HPLC de fase reversa. As frações que contêm di-PEG-polipeptídeo que elui antes de qualquer composto peptideo mono-PEG podem ser reunidas e armazenadas a 5o C ou liofilizado. 45 EXEMPLO 3

Estudos pré-clinicos em animais de atividade trombopoiético de composto pequilado tpo n° 1

Composto TPO N° 1 não partilha homologia de sequência com qualquer TPO endógena, reduzindo o risco de formação de anticorpos de reação cruzada com a TPO endógena. Composto TPO N° 1 foi tratado com PEG para reduzir a folga e para continuar a reduzir a antigenicidade. Este Exemplo descreve estudos pré-clinicos sobre a atividade trombopoiética do composto PEGuilado TPO N° 1 num animal.

Ratos Wistar machos (fonte) foram utilizados para os estudos. Outros animais, tais como cães, ratos, macacos, etc., podem também ser utilizados para os estudos pré-clinicos. Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos numa clinica para animais totalmente credenciada pela Associação Americana para Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) e de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH).

Ratos Wistar machos (10 semanas de idade, 230-367 gramas de peso corporal na gama de dosagem) foram tratados com doses intravenosas únicas de composto TPO N° 1 a 30, 100 ou 300ug/kg (40 ratos/grupo) .Na pré-dose, 96, 144, 192, 240, 288 e 312 horas após a dose, aproximadamente, 0,5 mL de sangue foi colhido por punção da veia jugular em ratos não anestesiados (5 ratos por ponto temporal, EDTA como anticoagulante) e a contagem de plaquetas foi avaliada utilizando um sistema de análise automática de hematologia. Os animais foram mantidos em jejum durante a noite, com água disponível, antes de cada recolha de amostra. 46

Doses únicas intravenosas de Composto PEGuilado TPO N° 1 (30, 100 ou 300 Mg/kg) resultou num aumento da contagem de plaquetas periféricas em ratos Wistar machos e por uma avaliação pós-dose mais cedo no Dia 4 (Fig. 6).As contagens de plaquetas foram avaliadas a cada 2 dias, durante as duas semanas seguintes de acompanhamento e comparadas com a contagem de pré-dose. 0 300 (ig/kg induziu o maior aumento do número de plaquetas, que retornou ao normal no dia 14. EXEMPLO 4

Fase i estudos clínicos sobre a atividade trombopoiética de composto peguilado tpo n° 1

Na Fase I os estudos foram realizados para investigar a tolerabilidade, farmacodinâmica e farmacocinética do Composto PEGuilado TPO N° l.Este exemplo descreve estudos de Fase I sobre Composto PEGuilado TPO N° 1 após uma única injeção intravenosa em voluntários saudáveis do sexo masculino. A Fase I estuda o Composto PEGuilado TPO N° 1 e outros compostos de acordo com a invenção, depois de múltiplas injeções intravenosas ou outros meios de administração e/ou a um paciente com necessidade de um tratamento pode ser realizado por meio de protocolos conhecidos de um especialista.

Quarenta voluntários foram randomizados para receber Composto PEGuilado TPO η ° 1 ou placebo como um único iv. injeção de bólus, numa proporção de 6:2.Oito sujeitos foram randomizados em proporção 6:2 a receber uma injeção única de Composto PEGuilado TPO N° 1 ou placebo, com uma gama de doses de 0,375, 0,75, 1,5, 2,25 ou 3 (Xg/kg.A resposta farmacodinâmica de Composto PEGuilado TPO N° 1 foi medida como a elevação na contagem de plaquetas. Niveis de 47

Composto PEGuilado TPO N° 1 foram determinados num plasma pobre em plaquetas utilizando um ensaio imunoenzimático validado. Niveis de TPO endógena, EPO, IL-6 e IL-11 foram medidos em periodos de tempo indicados, utilizando os imunoensaios convencionais. Um imunoensaio biosensor (BIAcore tecnologia) foi utilizado para medir a formação de anticorpos contra a fração peptidica do Composto PEGuilado TPO N° 1. 0 efeito sobre a função das plaquetas foi medido por monitorização do colagénio agregação plaquetária induzida pelo menos 4 horas e dias após a administração do Comporto PEGuilado TPO N° 1.

Análise de PK relacionados com a dose cinética indicada do composto PEGuilado TPO N° 1, embora nas doses de 0,75 Jig/kg ou inferior, as concentrações plasmáticas de Composto PEGuilado TPO N° 1 foram geralmente abaixo do limite de quantificação de 6,25 ng/mL (Fig. 7).Quatro sujeitos no grupo da dose de 0,375 ig/kg e um sujeito no grupo da dose de 3.0 ig/kg Composto PEGuilado TPO N° 1 não tinham niveis plasmáticos quantificáveis. A média dos valores de Cmax variou de 10,9 ng/mL, 0,75 Composto PEGuilado TPO N° 1 a 61,7 ng/mL em (ig/kg Composto PEGuilado TPO N° 1 (Tabela 1). Nenhuns dados de PK poderiam ser medidos a 375 ig/kg iv. De Composto TPO N° 1. O terminal de meia-vida de Composto PEGuilado TPO N° 1 variou entre aproximadamente 18 e 36 horas. O tmax mediano variou de 0,0 9 a 2 horas. O aumento na Cmax com o aumento da dose foi aproximadamente proporcional à dose, mas houve um aumento aparente no valor normalizado AUC0-24 com o aumento da dose, sugerindo um aumento maior do que proporcional à dose. 48

Tabela 1. Resumo da análise PK

Cmax (Ng/mL) tl/2 (H) AUC» (Ng.h/mL) AUCo-24 (Ng.h/mL) 0,75 (dose yg/kg) N 6 1 0 0 Médio 10, 9 NQ NQ NQ Min-Max BLQ-18,8 18, 6 NQ NQ 1.5 (dose yg/kg) N 6 2 1 4 Médio 20, 9 NQ NQ 311 Min-Max 7,53-28,5 13, 1-22,5 475 268-359 2,25(Dose yg/kg) N 6 2 3 4 Médio 39, 7 NQ 1561 678 min/max 13,1-59,1 29, 8-48,5 1551-1569 655-694 3,0 yg/kg dose, excluindo o sujeito 1027 que não tinha concentrações de quantificação N 6 4 3 5 Médio 61,7 36, 1 2257 965 min/max 53,9-76,0 27,7- 51,3 1773-2764 823-1124 A resposta plaquetária à administração do Composto PEGuilado TPO N° 1 foi semelhante aos resultados publicados para a rhTPO e AMG531. As contagens de plaquetas aumentaram dependentemente da dose atingindo niveis de pico no dia 10-12, e as contagens retornaram aos niveis basais dentro de 3-4 semanas (Fig. 8). A média de pico de plaquetas variou entre 315xl09/L a 0,375 yg/kg i.v. de 685x109/L a 3 yg/kg i.v., e a média máxima de plaquetas aumentou da linha de base variando de 1,4 vezes a 0,375 yg/kg a 3,2 vezes a 3,0 (yg/kg (Tabela 2). Pelo menos 50% de aumento do número de plaquetas foi observado em 4 6 indivíduos que receberam o Composto PEGuilado TPO η ° 1 na dose de 0,75 ug/kg, enquanto que, pelo menos, duas vezes o aumento na contagem de plaquetas foi observada em cerca de 3 a 6 de indivíduos numa dose de 1,5 ug/kg, etc A dose de 49 0,75 ug/kg iv, foi escolhida como a dose de partida para a fase II do estudo clinico.

Para além de alterações na contagem de plaquetas, outras células sanguíneas maduras circulantes não foram afetadas (dados não mostrados). Além disso, a administração de Composto PEGuilado TPO N° 1 não afetou a função das plaquetas, não na altura da administração, nem 12 dias após a administração, na altura do aparecimento de plaquetas recentemente produzidas.

Tabela 2. Resumo da análise de contagem de plaquetas Composto PEGuilado TPO N° 1 0 (yg/kg) 0,375 (yg/kg) 0,75 (yg/kg) 1,5 (yg/kg) 2,25 (yg/kg) 3,0 (yg/kg) N 10 6 6 6 6 6 η (> 1,5 x) 0 3 3 4 4 5 n (> 2x) 0 0 1 3 4 5 n (> 3x) 0 0 0 0 0 4 n (> 4x) 0 0 0 0 0 1 Pito(109/L)1 ) 192/203 (163-233) 223/205 (159-304) 212/212 (155-264) 228/230 (200-258) 215/203 (193-261) 208/200 (150-284) p ltmax (lOg/L)1* 230/225 (189-271) 315/309 (214-482) 347/335 (232-495) 430/458 (238-597) 454/500 (254-576) 685/750 (188-979) PlUax/Plto1 1.14/1.13 (1.04-1.38) 1.42/1.42 (1.08- 1.81) 1.63/1.63 (1.15-2.12) 1.91/2.13 (1.01-2.59) 2.15/2.33 (1.28-2.98) 3.21/3.50 (1.25-4.52) 0 efeito da administração do Composto PEGuilado TPO N° 1 em fatores de crescimento que são conhecidos por possuírem atividade trombopoiética foi avaliado. Os niveis endógenos de TPO dependentemente da dose aumentaram, atingindo niveis máximos aos 3 dias pós-dose (Fig. 9). Não foram observadas alterações significativas dos niveis sanguíneos de IL-6, IL-11 e nos niveis de EPO. 50 A função das plaquetas, tal como avaliado colagénio agregação de plaquetas induzida em sangue total, não foi diferente entre os tratamentos. Nenhum dos individuos experimentaram um evento adverso grave ou toxicidades limitantes da dose. Os eventos adversos mais frequentemente observados incluíram dor de cabeça leve e fadiga e ocorreram ambos após o tratamento ativo e placebo. Não foram encontrados nenhuns anticorpos contra o Composto PEGuilado TPO N° 1. Estes resultados indicam que o composto PEGuilado TPO N° 1 foi bem tolerado na gama de doses testada. 51

Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Dose terapeuticamente eficaz de um composto peptídeo compreendendo a sequência seguinte: (H-IEGPTLRQ(2-Nal) LAARXio)-K (NH2) - (XioRAAL (2-Nal) QRLTPGEI)-H, (SEQ ID NO: 7), em que Xio é sarcosina para uso no tratamento de distúrbios hematológicos em humanos, em que o referido composto peptideo deve ser administrado numa gama de dosagem entre 0,1 e 0,75 yg/kg.
2. 2. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1 em que a desordem é uma desordem hematológica de plaquetas ou trombocitopenia.
3. 3. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1 em que o distúrbio hematológico está associado a transfusões de medula óssea, terapia de radiação e quimioterapia.
4. 4. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto peptideo deve ser administrado numa gama de dosagem de 0,375-0,75 yg/kg.
5. 5. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a administração do referido composto peptídeo resulta num valor Cmax médio de cerca de 10 ng/mL a cerca de 0,75 yg/kg do composto peptideo.
6. 6. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1, onde a administração dos ditos compostos peptídeos resultada num terminal médio de metade da vida do dito composto peptideo, a partir de cerca de 18 horas a cerca de 36 horas.
7. 7. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a administração dos referidos compostos peptideos resulta num tmax mediano de desde cerca de 0,0 9 horas a cerca de 2 horas.
8. 8. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a administração dos referidos compostos peptideos resulta num aumento de cerca de 50% na contagem de plaquetas a uma dose de cerca de 0,75 pg/kg.
9. 9. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a administração dos referidos compostos peptideos resulta num aumento dos niveis endógenos de TPO.
10. 10. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto peptídeo é 35 ligado de forma covalente a um polímero hidrófilo.
11. 11. Composto para uso de acordo com a reivindicação 10, em que o referido polímero hidrofílico tem um peso molecular médio de entre cerca de 500 a cerca de 40.000 daltons.
12. 12. Composto para uso de acordo com a reivindicação 11, em que o referido polímero hidrofílico tem um peso molecular médio compreendido entre cerca de 5.000 a cerca de 20.000 daltons.
13. 13. Composto para uso de acordo com a reivindicação 10, em que o referido polímero hidrófilo é selecionado de entre o grupo constituído por polietileno glicol, polipropileno glicol, ácido poliláctico e ácido poliglicólico.
14. 14. Composto para uso de acordo com a reivindicação 13, em que o referido polímero hidrófilo é polietilenoglicol.
15. 15. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto peptideo é dimerizado.
16. 16. Composto para uso de acordo com a reivindicação 15, em que cada uma das subunidades diméricas do referido composto peptideo está ligada covalentemente a um polimero hidrófilo.
17. 17. Composto para uso de acordo com a reivindicação 16 em que o referido polimero hidrófilo é polietilenoglicol.
18. 18. Composto para uso de acordo com a reivindicação 17, em que o polietileno glicol é escolhido do grupo que consiste de monometoxipolietilenoglicol (MePEG-OH) , monometoxipolietileno glicol succinato-(MePEG-S), monometoxipolietileno glicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS) , monometoxipolietileno glicol-amina (MePEG-NH2), tresilato monometoxipolietileno glicol (MePEG-TRES), e monometoxipolietileno glicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM) .
19. 19. Composto para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto peptideo tem a seguinte fórmula: 1 e G P T L R Q (2-Naí) LAA R-(Sar) K(NH2) / I È G PTL R Q (2-Mal)LAAR-(Sar) em que (2-Nal) é [beta]-(2-naftil)alanina e (Sar) é sarcosina.
20. 20. Composto para uso de acordo com a reivindicação 19, em que o referido composto peptideo é ligado covalentemente a um polimero hidrófilo.
21. 21. Composto para uso de acordo com a reivindicação 20, em que o referido polímero hidrófilo é selecionado de entre o grupo constituído por polietileno glicol, polipropileno glicol, ácido poliláctico e ácido poliglicólico.
22. 22. Composto para uso de acordo com a reivindicação 21, em que o referido polímero hidrófilo é polietilenoglicol.
23. 23. Composto para uso de acordo com a reivindicação 22, em que o dito polietilenoglicol tem um peso molecular médio de entre cerca de 5.000 a cerca de 20.000 daltons.
24. 24. Composto para uso de acordo com a reivindicação 22, em que o polietileno glicol é escolhido do grupo que consiste de monometoxipolietilenoglicol (MePEG-OH) , monometoxipolietileno glicol succinato-(MePEG-S), monometoxipolietileno glicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS) , monometoxipolietileno glicol-amina (MePEG-NH2), tresilato monometoxipolietileno glicol (MePEG-TRES) , e monometoxipolietileno glicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM) .
25. 25. Composto para uso de acordo com a reivindicação 20, em que cada uma das subunidades diméricas do referido composto peptídeo está ligada covalentemente a um polimero hidrófilo.
26. 26. Composto para uso de acordo com a reivindicação, em que o referido polímero hidrófilo é selecionado de entre o grupo constituído por polietileno glicol, polipropileno glicol, ácido poliláctico e ácido poliglicólico.
27. 27. Composto para uso de acordo com a reivindicação 26, em que o referido polímero hidrófilo é polietilenoglicol.
28. 28. Composto para uso de acordo com a reivindicação 27, em que o dito polietilenoglicol tem um peso molecular médio de entre cerca de 5.000 a cerca de 20.000 daltons.
29. 29. Composto para uso de acordo com a reivindicação 27, em que o polietileno glicol é escolhido do grupo que consiste de monometoxipolietilenoglicol (MePEG-OH), monometoxipolietileno glicol succinato-(MePEG-S), monometoxipolietileno glicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipolietileno glicol-amina (MePEG-NH2), tresilato monometoxipolietileno glicol (MePEG-TRES), e monometoxipolietileno glicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM) .
30. 30. Utilização de uma dose terapeuticamente eficaz de um composto peptídeo compreendendo a sequência seguinte: (H-IEGPTLRQ (2-Nal) LAARX10) -K (NH2) - (Xi0RAAL (2-NAL) QRLTPGEI) -H, (SEQ ID NO: 7), em que Xio é sarcosina no fabrico de um medicamento para o tratamento de um paciente humano que sofre de uma desordem em que o referido composto peptídeo hematológico deve ser administrado numa gama de dosagem de entre 0,1 e 0,75 pg/kg.