TWI400081B - 肽類及與受體結合之化合物 - Google Patents

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Description

肽類及與受體結合之化合物 相關申請案之相互參照
本申請案為2004年8月13日提出申請之美國申請案序號10/918,561之部分延續案，及請求美國申請案序號10/918,561與60/498,740之優先權，其全部內容均併入本文以資參考。
發明領域
本發明提供結合及活化血小板生成素受體(c－mpl或TPO－R)或者具有TPO促效劑作用之肽化合物。本發明可應用於生化及醫藥化學領域，並特別提供用於治療人類疾病之TPO促效劑。
 發明背景
巨核細胞係骨髓衍生之細胞，其負責製造循環血小板。於多數物種中，巨核細胞雖然構成<0.25%之骨髓細胞，惟其具有>10倍典型骨髓細胞之容積。參閱Kuter,et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11104－11108(1994)。巨核細胞歷經所謂核內有絲分裂程序，從而複製其核，惟無法進行細胞分裂，因此產生多倍體細胞。相應於血小板計數減少，核內有絲分裂速率增加，形成較高多倍體巨核細胞，巨核細胞數量可能增加多達3倍。參閱Harker,J.Clin.Invest.,47：458－465(1968)。對照之下，相應於血小板計數增加，核內有絲分裂速率降低，形成較低多倍體巨核細胞，巨核細胞數量可能減少50%。
由多數循環血小板調控核內有絲分裂速率及骨髓巨核細胞數之確切生理反饋機制尚為未知。頃認為涉及傳介此反饋迴路之循環血小板生成因子係血小板生成素(TPO)。詳言之，TPO已被證實係涉及血小板減少情況中之主要體液調控子。參閱，例如，Metcalf,Nature,369：519－520(1994)。於數項研究中，TPO被證實增加血小板計數、增加血小板大小、及增加受血動物血小板中之同位素併入。具體而言，TPO被認為以數種方式影響巨核細胞形成：(1)其造成巨核細胞大小及數量之增加；(2)其造成DNA含量，於巨核細胞中，呈多倍體形式增加；(3)其增加巨核細胞之核內有絲分裂；(4)其造成增加之巨核細胞熟成；及(5)其造成骨髓中呈小乙醯膽鹼酯酶陽性細胞形式之前驅體細胞百分比之增加。
血小板(凝血細胞)為血液凝固所需，當其數量很低時，病患將瀕臨由於猝變性地出血而死亡之嚴重危險。TPO因此在多種血液失調症(例如，起因於血小板不足之疾病)之診斷及治療上具有潛在之有效應用。進行中之使用TPO之臨床試驗已指出，TPO可安全地投與病患。此外，新近之研究已為TPO療法在血小板減少症(特別是起因於治療癌症或淋巴瘤之化學療法、放射療法、或骨髓移植之血小板減少症)之治療上提供有效規劃之基礎。參閱，例如，McDonald,Am.J.Ped.Hematology/Oncology,14：8－21(1992)。
由基因編碼之TPO已被轉殖及確認。參閱Kuter,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91：11104－11108(1994)；Barley,et al.,Cell 77：1117－1124(1994)；Kaushansky et al.,Nature 369：568－571(1994)；Wendling,et al.,Nature,369：571－574(1994)；及Sauvage et al.,Nature 369：533－538(1994)。血小板生成素為具有至少兩種形式之醣蛋白，其表觀分子質量為25 kDa與31 kDa，具有常見之N端胺基酸序列。參閱，Bartley,et al.,Cell,77：1117－1124(1994)。血小板生成素似乎具有被潛在Arg－Arg切割位點隔開的兩個區域。於人類及小鼠中，其胺基末端區域具高度保守性，與紅血球生成素及干擾素－a與干擾素－b具有一些同質性；羧基末端區域則顯示寬廣之物種差異性。
人類TPO－R(亦為所謂c－mpl)之DNA序列與編碼肽序列已被敘述。參閱Vigon,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：5640－5644(1992)。TPO－R為造血素生長因子受體族之成員，該族之特徵為胞外功能部位常見之結構設計，包括N端部分之四個保守C殘基及接近跨膜區域之WSXWS主結構(SEQ ID NO：1)。參閱Bazan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：6934－6938(1990)。此受體於造血作用上具重要功能之證據包括觀察到其表現限定於小鼠之脾臟、骨髓、或胎肝(參閱Souyri,et al.,Cell 63：1137－1147(1990))及人類之巨核細胞、血小板、與CD34＋細胞(參閱Methia,et al.,Blood 82：1395－1401(1993))。再者，使CD34＋細胞暴露於與mpl RNA反義之合成寡核苷酸明顯地抑制巨核細胞群落之外觀而不影響類紅血球或髓樣群落形成。有些研究者假設此受體與G－CSF和紅血球生成素的受體情形類似，具有同質二聚體之功能。
TPO－R選殖基因之可利用性有助於此重要受體的促效劑之搜尋。重組受體蛋白之可利用性容許於各種隨機及半隨機肽多樣性發生系統(diversity generation systems)中進行受體－配位體相互作用之研究。彼等系統揭示於美國專利案6,251,864、6,083,913、6,121,238、5,932,546、5,869,451、5,506,362、與6,465,430及Cwirla et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：6378－6382(1990)；前述各專利申請案及文獻均併入本文以資參考。
罹患血小板減少症的病患，其血小板量緩慢回復為一嚴重問題，而增添尋找能促進血小板再生之血液生長因子促效劑之急迫性。本發明提供此等促效劑。
 發明概述
本發明係有關經界定之低分子量肽化合物，其對TPO－R具有強力結合性質，可活化TPO－R；相較於已知TPO促效劑，潛在地容許減少之副作用。因此，該肽化合物可供治療用途以治療由TPO傳介之症狀(例如，起因於化學治療、放射治療、或骨髓輸液之血小板減少症)以及供診斷用途以研究造血作用機制，及供試管內擴增巨核細胞及其關鍵原祖細胞用。
適用於治療及/或診斷用途之肽化合物具有以例如美國專利案5,869,451實例3中敘述之結合親和試驗所測定之約2 mM或2 mM以下之IC5 0 (其中較低之IC5 0 與對TPO－R較強之結合親和性相關聯)。美國專利案5,869,451中之該試驗如下述：於競爭結合試驗中進行肽化合物結合親和性之測定；微量滴定盤之諸槽以1毫克抗生物素鏈菌素塗覆，以PBS/1% BSA封阻，隨後添加50奈克生物素化之抗－受體固定化抗體(Ab179)；接著以水溶性TPO－R獲取物之1：10稀釋液處理諸槽；使各種濃度之肽化合物與固定量之截短型TPO[由稠合於結合麥芽糖蛋白C端之殘基1－156組成(MBP－TPO1 5 6 )]混合；添加該等肽MBP－TPO1 5 6 混合物至塗覆TPO－R之諸槽，於4℃培育2小時，然後以PBS洗滌；平衡時所結合MBP－TPO之量藉添加被指引對抗MBP之兔抗－血清，隨後添加結合鹼性磷酸酶之山羊抗－兔IgG予以測定；接著使用標準方法測定各槽中之鹼性磷酸酶量；此試驗針對一系列濃度之肽化合物進行，將其結果作圖，y軸代表所結合MBP－TPO量及x軸代表肽化合物濃度；如此即可決定減少50%結合於固定化TPO－R之MBP－TPO量時之肽化合物濃度(IC5 0 )。肽之解離常數(Kd)應與使用彼等試驗條件測定之IC5 0 類似。供醫藥用途時，肽化合物較佳為具有不超過約100 μM，更佳為，不超過500 nM之IC5 0 。於較佳具體實例中，肽化合物之分子量為約250至約8,000道爾頓。本發明之肽化合物若予以低聚化、二聚化、及/或如本文所述以親水性聚合物衍生化，則該等肽化合物之分子量實質上將更大，而可為約500至約120,000道爾頓不等，更佳為約8,000至約80,000道爾頓不等。
供診斷用途時，本發明肽化合物較佳為以可檢測之標記物予以標記，因此，不具此等標記物之肽化合物即作為製備標記肽化合物時之中間體用。
符合分子量及對TPO－R的結合親和性之界定準則之肽化合物含有9個或9個以上胺基酸，其中該等胺基酸為天然存在或合成(非天然存在)之胺基酸。
因此，較佳肽化合物包含具下述條件之化合物：(1)分子量小於約5000道爾頓，及(2)以IC5 0 表示之對TPO－R之結合親和性不超過約100 μM，其中該肽化合物之零個至所有－－C(O)NH－－鍵結被選自下述組群之鍵結置換：－－CH2 OC(O)NR－－鍵結、膦酸根鍵結、－－CH2 S(O)2 NR－－鍵結、－－CH2 NR－－鍵結、－－C(O)NR6 －－鍵結、與－－NHC(O)NH－－鍵結，其中R為氫或低級烷基及R6 為低級烷基；進一步地，其中該肽化合物之N端係選自下述組群：－－NRR1 基團；－－NRC(O)R基團；－－NRC(O)OR基團；－－NRS(O)2 R基團；－－NHC(O)NHR基團；琥珀醯亞胺基團；苄基氧羰基－NH－－基團；苄基氧羰基－NH－－基團，其於苯基環上具有1至3個選自下述組群之取代基：低級烷基、低級烷氧基、氯基、與溴基；其中R與R1 獨立地選自下述組群：氫與低級烷基；又進一步地，其中該肽化合物之C端具式－－C(O)R2 ，其中R2 係選自下述組群：羥基、低級烷氧基、與－NR3 R4 ；其中R3 與R4 係獨立地選自下述組群：氫與低級烷基，及其中－NR3 R4 基團之氮原子可視需要為該肽N端之胺基基團俾便形成環狀肽；及其生理上可接受之鹽。
於相關具體實例中，本發明係有關一種經標記之肽化合物，其含有已共價連接有能檢測的標記物之如上文敘述之肽化合物。
於一具體實例中，該核心肽化合物包含下述胺基酸序列：(SEQ ID NO：2)X9 X8 G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7
其中X9 為A、C、E、G、I、L、M、P、R、Q、S、T、或V；X8 為A、C、D、E、K、L、Q、R、S、T、或V；及X6 為－(2－萘基)丙胺酸(本文中稱為“2－Nal”)殘基。更佳為，X9 為A或I；X8 為D、E、或K。再者X1 為C、L、M、P、Q、V；X2 為F、K、L、N、Q、R、S、T或V；X3 為C、F、I、L、M、R、S、V或W；X4 為基因編碼的20個L－胺基酸之任一者；X5 為A、D、E、G、K、M、Q、R、S、T、V或Y；及X7 為C、G、I、K、L、M、N、R或V。
特佳之肽化合物包含胺基酸序列I E G P T L R Q(2－Nal)L A A R(Sar)(SEQ ID NO：7)，其中(2－Nal)為－(2－萘基)丙胺酸及(Sar)為肌胺酸。
於另一具體實例中，本發明肽化合物較佳為經二聚化或低聚化以增加彼等化合物之親和性及/或活性。較佳之二聚化肽化合物包含，惟不限於，具下式之化合物： 式中X1 0 為肌胺酸或β－丙胺酸殘基(SEQ ID NO：7)。上述結構式亦可以下式表示：(H－IEGPTLRQ(2－Nal)LAARX1 0 )2 K－NH2 。
當X1 0 為肌胺酸時，該化合物具下述結構式： 其中(2－Nal)為－(2－萘基)丙胺酸及(Sar)為肌胺酸(SEQ ID NO：7)。此肽化合物亦可以下式表示：(H－IEGPTLRQ(2－Nal)LAAR(Sar))2 K－NH2 ，於本文中稱之為「1號TPO化合物」。
於又進一步具體實例中，供本發明用之較佳肽化合物包括共價連接於一或多個各種親水性聚合物之肽化合物。適當之親水性聚合物包含，惟不限於，如美國專利案5,869,451中敘述之聚烷基醚類(其實例為聚乙二醇與聚丙二醇)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧鏈烯類、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素與纖維素衍生物、葡聚醣與葡聚醣衍生物等，該專利案全部內容併入本文以資參考。
本文所述之肽化合物係用於預防及治療由TPO傳介之疾病，特別是用於治療血液學上之疾病，包括惟不限於，起因於化學治療、放射治療、或骨髓輸液之血小板減少症。因此，本發明亦提供一種治療方法，其中係使具有對TPO促效劑治療敏感的疾病之病患接受或對其投與治療有效劑量或量之本發明肽化合物。
本發明亦提供一種醫藥組作物，其包含一或多種本文所述之肽化合物及生理上可接受之載劑。彼等醫藥組成物可呈多種形式包括口服劑量型、以及吸入式粉劑與溶液及可注射與灌注之溶液。
詳細具體實例說明 I. 界定及一般參數
下文之界定係用於說明與界定本發明之各術語之意義與範圍。
「促效劑」係指具生物活性之配位體，此配位體和與其互補之具生物活性之受體結合並活化後者，俾使於該受體中引起生物反應或者提高該受體原先存在之活性。
「肽化合物」係指會水解成為胺基酸及/或胺基酸衍生物及/或胺基酸替代物之分子。
「醫藥上可接受之鹽」係指利用此項技藝中悉知之方法製備之製藥工業上常用之無毒鹼金屬、鹼土金屬、與銨鹽，包括鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋇、銨、與魚精蛋白鋅等鹽。此術語亦包括無毒之酸加成鹽，其通常係利用使本發明化合物與適當有機或無機酸反應而製備。代表性鹽類包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、對甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘磺酸鹽等。
「醫藥上可接受之酸加成鹽」係指保留游離鹼的生物有效性與性質且於生物學或其他方面均符合需求之與無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，及有機酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等形成之鹽。有關作為前驅藥物之醫藥上可接受之酸加成鹽之敘述參閱Bundgaard,H.,文獻同前。
「醫藥上可接受之酯」係指於酯鍵水解後，仍保留該羧酸或醇的生物有效性與性質且於生物學或其他方面均符合需求之酯類。有關作為前驅藥物之醫藥上可接受之酯之敘述參見Bundgaard,H.,ed.,Design of Prodrugs,Elsevier Science Publishers,Amsterdam(1985)。彼等酯類典型地係由對應羧酸及醇形成。一般而言，酯之形成可經由習知合成技術達成(參閱，例如，March,Advanced Organic Chemistry,4th Ed.,John Wiley & Sons,New York(1992),393－396與其中引用之文獻，及Mark,et al.,Encyclopedia of Chemical Technology,John Wiley & Sons,New York(1980))。酯之醇成分通常包含(i)C2 －C1 2 脂族醇，其可含或不含一或多個雙鍵及可含或不含分支碳鏈或(ii)C7 －C1 2 芳族或雜芳族醇。本發明亦考量使用為如本文敘述之酯，同時為其醫藥上可接受之酸加成鹽之彼等組成物。
「醫藥上可接受之醯胺」係指於醯胺鍵水解後，仍保留該羧酸或胺的生物有效性與性質且於生物學或其他方面均符合需求之醯胺類。有關作為前驅藥物之醫藥上可接受之醯胺之敘述參閱Bundgaard,H.,ed.,Design of Prodrugs,Elsevier Science Publishers,Amsterdam(1985)。彼等醯胺類典型地係由對應羧酸及胺形成。一般而言，醯胺之形成可經由習知合成技術達成(參閱，例如，March,Advanced Organic Chemistry,4th Ed.,John Wiley & Sons,New York(1992),p.393，及Mark,et al.,Encyclopedia of Chemical Technology,John Wiley & Sons,New York(1980))。本發明亦考量使用為如本文敘述之醯胺，同時為其醫藥上可接受之酸加成鹽之彼等組成物。
「醫藥或治療上可接受之載劑」係指不干預活性成分生物活性之有效性且對宿主或病患不具毒性之載劑介質。
「立體異構物」係指彼此具有相同分子量、化學組成與成分，惟原子聚集方式不同之化學化合物。亦即，特定相同的化學基團具有不同之空間指向，因此，於極純時，具有旋轉偏光平面的能力。然而，有些純立體異構物可能具有很微小而無法以目前儀器檢測之旋光度。本發明化合物可具有一或多個不對稱碳原子，因而包含多種立體異構物。所有立體異構物均涵蓋於本發明範圍之內。
應用於本發明組成物之「治療或醫藥有效量」係指足以誘發所需生物效果之組成物之量。該效果可為減緩疾病的徵象、症狀、或原因，或任何其他期望之生物系統之改變。本發明中，該效果典型地包括降低對感染或組織傷害之免疫及/或炎性等反應。
肽類中之胺基酸殘基係依下文縮寫：苯基丙胺酸為Phe或F；白胺酸為Leu或L；異白胺酸為Ile或I；甲硫胺酸為Met或M；纈胺酸為Val或V；絲胺酸為Ser或S；脯胺酸為Pro或P；息寧胺酸為Thr或T；丙胺酸為Ala或A；酪胺酸為Tyr或Y；組胺酸為His或H；麩胺醯胺為Gln或Q；天冬醯胺為Asn或N；離胺酸為Lys或K；天冬胺酸為Asp或D；麩胺酸為Glu或E；半胱胺酸為Cys或C；色胺酸為Trp或W；精胺酸為Arg或R；及甘胺酸為Gly或G。此外，t－Buo為第三丁基氧基，Bzl為苄基，CHA為環己胺，Ac為乙醯基，Me為甲基，Pen為青黴胺，Aib為胺基異丁酸，Nva為正纈胺酸，Abu為胺基丁酸。Thi為噻吩基丙胺酸，OBn為O－苄基，及hyp羥基脯胺酸。
肽類似物於醫藥工業中通常作為具有與模板肽相似性質之非肽藥物之用。此類型之非肽化合物被稱為「肽模擬物」(“peptidemimetics”或“peptidemimetics”或“peptidomimetics”)(Luthman,et al.,A Textbook of Drug Design and Development,14：386－406,2nd Ed.,Harwood Academic Publishers(1996)；Joachim Grante,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33：1699－1720(1994)；Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15：29(1986)；Veber and Freidinger TINS,p.392(1985)；及Evans,et al.,J.Med.Chem.30：1229(1987)，彼等均併入本文以資參考)。與治療有用之肽類結構上類似之肽模擬物可用以產生相等或增加之治療或預防效果。一般而言，肽模擬物結構上與範例多肽(亦即，具有生物或藥理活性之多肽，例如天然存在之結合受體之多肽)類似，惟其一或多個肽鍵結視需要被替代鍵結(例如－－CH2 NH－－、－－CH2 S－－等)置換，此置換方法為此項技藝中已知及進一步敘述於下述文獻：Spatola,A F.in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins,B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983)；Spatola,A.F.Vega Data(March 1983),Vol.1,Issue 3,Peptide Backbone Modifications(一般綜述)；Morley,Trends Pharm.Sci.pp.463－468(1980)(一般綜述)；Hudson,et al.,Int.J.Pept.Prot.Res.,14：177－185(1979)；Spatola,et al.,Life Sci.,38：1243－1249(1986)；Hann,J.Chem.Soc.Perkin Trans.I,307－314(1982)；Almquist,et al.,J.Med.Chem.,23：1392－1398,(1980)；Jennings－White,et al.,Tetrahedron Lett.23：2533(1982)；Szelke,et al.,歐洲申請案EP 45665(1982)；Holladay,et al.,Tetrahedron Lett.,24：4401－4404(1983)；及Hruby,Life Sci.,31：189－199(1982)；彼等均併入本文以資參考。特佳之非肽鍵結為－－CH2 NH－－。此等肽模擬物與多肽具體實例相較下，具有顯著優點，包括例如：製造更為經濟、化學穩定性較大、藥理性質增加(半衰期、吸收性、效力、功效等)、特異性改變(例如，廣譜之生物活性)、抗原性減少等。肽模擬物之標記通常涉及直接或經由間隔子(例如，醯胺基團)共價連接一或多個標記物至肽上利用定量結構活性數據及/或分子模擬法預測出之(諸)無干擾位置。此等無干擾位置通常為不與大分子(例如，免疫球蛋白超族分子)形成直接接觸之位置，該等大分子為肽模擬物擬與其結合以產生治療效果者。肽模擬物之衍生化(例如，標記)不應實質上干預該肽模擬物之所需生物或藥理活性。通常，結合受體的肽之肽模擬物以高度親和性與受體結合且具有可檢測之生物活性(亦即，對一或多個由受體傳介之表現型變化具有促效或拮抗性)。
以相同種類之D－胺基酸進行一致序列的一或多個胺基酸之系統取代(例如，以D－離胺酸取代L－離胺酸)可用以產生更穩定之肽類。此外，利用此項技藝中已知之方法(Rizo,et al.,Ann.Rev.Biochem.,61：387(1992))可產生含有一致序列或實質上相同的一致序列變化之強迫肽類(constrained peptides)；例如，利用添加能形成環化該肽的分子內二硫橋鍵之內部半胱胺酸殘基。
「可檢測之標記物」係指當共價連接於本發明之肽化合物時，得以於已投與該肽化合物之病患中檢測活體內肽化合物之物質。適當的可檢測標記物為此項技藝所悉知，包括例如放射性同位素、螢光標記(例如，螢光黃)等。所用之特定可檢測標記物並不具關鍵性，係就欲使用的標記物之量以及於所用標記物量下之標記物毒性予以選擇。標記物就該等因素之選擇乃熟習此項技藝人士悉知之範圍。
可檢測標記物與肽化合物之共價連接係利用此項技藝中悉知之習用方法達成。例如，於使用1 2 5 I放射性同位素作為可檢測標記物時，1 2 5 I與肽化合物之共價連接可利用將酪胺酸胺基酸併入該肽化合物中，然後碘化該肽化合物而達成(參閱，例如，Weaner,et al.,Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds,pp.137－140(1994))。酪胺酸之併入肽化合物之N或C端可利用悉知化學方法達成。同樣地，3 2 P可呈磷酸根基團，利用習知化學方法，經由例如肽化合物上之羥基，併入肽化合物中。
II. 綜述
本發明提供結合及活化TPO－R，或者具有TPO促效劑作用之肽化合物。彼等化合物肽包含「領導」肽化合物(“lead”peptide compounds)及所構築以與該領導化合物具有相同或類似之分子構造或形狀惟對水解及/或蛋白水解作用之敏感性及/或其他生物性質(例如與受體之親合性增加)與該領導化合物不同之「衍生」肽化合物。本發明亦提供含有有效量肽化合物－更特別為用於治療血液疾病(特別是與化學療法、放射療法、或骨髓輸液相關之血小板減少症)的肽化合物－之組成物。
頃發現，核心肽化合物可包含胺基酸序列(SEQ ID NO：2)：X9 X8 GX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 ，其中X6 可為β－(2－萘基)丙胺酸，及其中X9 為A、C、E、G、I、L、M、P、R、Q、S、T、或V；X8 為A、C、D、E、K、L、Q、R、S、T、或V。更佳為，X9 係A或I；及X8 係D、E、或K。再者X1 為C、L、M、P、Q、V；X2 為F、K、L、N、Q、R、S、T或V；X3 為C、F、I、L、M、R、S、V或W；X4 為基因編碼的20個L－胺基酸之任一者；X5 為A、D、E、G、K、M、Q、R、S、T、V或Y；及X7 為C、G、I、K、L、M、N、R或V。
然而，如下文之進一步敘述，頃發現X6 以β－(2－萘基)丙胺酸置換時，彼等化合物與含β－(1－萘基)丙胺酸之化合物相較下，提供不同之性質。因此，特佳之肽化合物包含胺基酸序列(SEQ ID NO：7)：I E G P T L R Q(2－Nal)L A A R(Sar)。
於另一具體實例中，本發明之肽化合物較佳為經二聚化或低聚化以增加該等化合物之親和性及/或活性。較佳二聚化肽化合物之實例包含，惟不限於，具下式之化合物： 式中X1 0 為肌胺酸或β－丙胺酸殘基(SEQ ID NO：7)。必須注意的是，一X1 0 殘基可為肌胺酸，另一殘基可為β－丙胺酸。上式結構亦可以下述結構式表示：(H－IEGPTLRQ(2－Nal)LAARAX1 0 )2 K－NH2 。
較佳之肽化合物如下述： 式中(2－Nal)為－(2－萘基)丙胺酸及(Sar)為肌胺酸(SEQ ID NO：7)。此肽化合物於本文中稱為「1號TPO化合物」。
IC5 0 大於約100 mM之肽化合物缺乏容許於本發明診斷或治療態樣中使用之足夠結合性。較佳為，供診斷用途時，肽化合物具有約2 mM或小於2 mM之IC5 0 ；供醫藥用途時，肽化合物具有約100μM或小於100μM之IC5 0 。
圖1使用標準相對發光單元試驗技術比較三個不同批次1號TPO化合物與一批次先前技藝肽化合物之活性。此試驗使用經建造以穩定表現人類TPO受體及由fos啟動子驅動的蟲螢光素酶報導子構築體之鼠類細胞。1號TPO化合物與先前技藝肽化合物間之差異在於該先前技藝肽化合物具有－(1－萘基)丙胺酸(1－Nal)而1號TPO化合物上為(2－Nal)。於圖1中，1號TPO化合物稱為2－Nal，先前技藝肽化合物稱為1－Nal(先前技藝)。如圖1所示，各化合物活性相似。
圖2比較幾個不同的PEG化1號TPO化合物(本發明化合物之聚乙二醇化反應詳述於下文)之活性。兩個PEG化先前技藝肽化合物均顯示實質上與未PEG化先前技藝肽化合物相同程度之高活性。其餘線段說明不同批次PEG化1號TPO化合物之活性。如圖2所示，於此模式中，後者相較於PEG化先前技藝肽化合物，活性較小。於圖2中，PEG化1號TPO化合物稱為PEG－2－Nal，PEG化先前技藝肽化合物稱為PEG－1－Nal(先前技藝)。
圖3說明PEG化先前技藝肽化合物與PEG化1號TPO化合物之相對效力。經由大鼠模式，圖3證實投與PEG化先前技藝肽化合物與PEG化1號TPO化合物後，血小板計數之活體內變化。如圖3所示，最高劑量PEG化1號TPO化合物具有與最低劑量先前技藝肽化合物相同之活性。效力較小的化合物對標的細胞可能提供較小的激烈刺激，可能減少由過度刺激標的細胞引起副作用(例如，於接續之化療週期後，血小板減少症惡化)之風險。於圖3中，PEG化1號TPO化合物稱為PEG－2－Nal，PEG化先前技藝肽化合物稱為PEG－1－Nal(先前技藝)。
圖4與圖5顯示於正常小鼠中，PEG化先前技藝肽化合物與PEG化1號TPO化合物之激戰(head－to－head)劑量反應研究結果。於圖4與圖5中，PEG化1號TPO化合物稱為PEG－2－Nal，PEG化先前技藝肽化合物稱為PEG－1－Nal(先前技藝)。於治療6天後，圖4顯示血小板含量增加，圖5顯示平均血小板容積增加。劑量範圍為10至3000徵克/公斤。此二肽化合物均以依賴劑量之方式增加循環中的血小板數，於低至30微克/公斤之劑量下，均觀察到相較於對照組仍增加。於最大反應時，彼等肽化合物使血小板計數升高至對照值4倍以上的程度。彼等肽化合物之劑量－反應曲線非常相似，表示於此模式中，二測試化合物於彼等測試端點上基本上沒有差異。
IV. 肽化合物之製備 A. 固相合成法
本發明肽化合物可利用此項技藝中已知之傳統方法，例如，使用標準固相技術，予以製備。該等標準方法包括全部固相合成法、部分固相合成法、片段縮合法、傳統溶液合成法、甚至利用重組DNA技術。參閱，例如，Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85：2149(1963)，其內容併入本文以資參考。於固相上，典型地係使用α－胺基經保護之樹脂，從肽之C端開始合成。可製備適當之起始物質，例如，將所需α－胺基酸連接於氯甲基化之樹脂、羥甲基樹脂、或二苯甲基胺樹脂。有一此等氯甲基化樹脂由Bio Rad Laboratories,Richmond,CA出售，商品名為BIO－BEADS SX－1；羥甲基樹脂之製備見述於Bodonszky,et al.,Chem.Ind.(London),38：1597(1966)。二苯甲基胺樹脂見述於Pietta and Marshall,Chem.Commn.,650(1970)，可自Beckman Instruments,Inc.,Palo Alto,Calif.購得，係呈鹽酸鹽型。
因此，本發明肽化合物之製備可利用根據Gisin,Helv.Chim.Acta.,56：1467(1973)敘述之方法，藉助於例如，碳酸氫銫觸媒，使α－胺基經保護之胺基酸與氯甲基化樹脂偶聯。經初始偶聯後，於室溫，選擇含有於有機溶劑中之三氟乙酸(TFA)或鹽酸(HCl)溶液之試劑，去除α－胺基保護基。
該等α－胺基保護基團為已知於肽類之逐步合成技藝中所用者，包括醯基型保護基(例如，甲醯基、三氟乙醯基、乙醯基)、芳族胺基甲酸酯型保護基(例如，苄氧羰基(Cbz)與經取代之Cbz)、脂族胺基甲酸酯型保護基(例如，第三丁氧羰基(Boc)、異丙基氧羰基、環己基氧羰基)及烷基型保護基(例如，苄基、三苯基甲基)。Boc與Fmoc為較佳之保護基。側鏈保護基於偶聯反應期間保持完整，於胺基末端保護基脫保護或偶聯期間亦不分離。此側鏈保護基須於完成最終肽合成及於不更改標的肽之反應條件下可予以去除。
用於Tyr之側鏈保護基包括四氫吡喃基、第三丁基、三苯甲基、苄基、Cbz、Z－－Br－－Cbz、及2,5－二氯苄基；用於Asp之側鏈保護基包括苄基、2,6－二氯苄基、甲基、乙基、及環己基；用於Thr與Ser之側鏈保護基包括乙醯基、苯甲醯基、三苯甲基、四氫吡喃基、苄基、2,6－二氯苄基、及Cbz；用於Thr與Ser之側鏈保護基為苄基；用於Arg之側鏈保護基包括硝基、對甲苯磺醯基(Tos)、Cbz、金剛烷基氧羰基、均三甲基苯磺醯基(Mts)，或Boc；用於Lys之側鏈保護基包括Cbz、2－氯苄基氧羰基(2－Cl－－Cbz)、2－溴苄基氧羰基(2－BrCbz)、Tos、或Boc。
去除α－胺基保護基後，所留下之經保護之胺基依所需順序予以偶聯。通常係使用過量之各經保護基之胺基酸及於溶液(例如二氯甲烷(CH2 Cl2 )、二甲亞碸(DMF)混合物)中之適當羧基活化劑例如二環己基羰化二亞胺(DCC)。
完成所需胺基酸序列後，所需肽藉由以試劑例如三氟乙酸或氟化氫(HF)處理而與樹脂支撐體脫偶聯，其不僅將肽自樹脂切割下來，亦切割所有殘留之側鏈保護基。於使用氯甲基化樹脂時，進行氟化氫處理造成游離肽酸之形成；於使用二苯甲基胺樹脂時，進行氟化氫處理直接產生游離肽醯胺。或者，於使用氯甲基化樹脂時，可利用以氨處理肽樹脂使側鏈經保護之肽脫偶聯，得到所需之側鏈經保護之醯胺；或以烷基胺處理，得到側鏈經保護之烷基醯胺或二烷基醯胺。然後以習知方式，利用以氟化氫處理去除側鏈保護，得到游離之醯胺、烷基醯胺、或二烷基醯胺。
彼等固相肽合成程序於此項技藝中已悉知，進一步詳述於John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young,Solid Phasc Peptide Syntheses(2n d Ed.,Pierce Chemical Company,1984)。
B. 合成之胺基酸
彼等程序亦可用於合成本發明任何化合物之一、二、或更多位置被天然存在、基因編碼的20個胺基酸以外之胺基酸取代之肽。
基因編碼的20個胺基酸(或D胺基酸)之天然存在之側鏈可用其他側鏈，舉例而言，以例如烷基、低級烷基、4、5、6、至7員環烷基、醯胺、醯胺低級烷基、醯胺二(低級烷基)、低級烷氧基、羥基、羧基與其低級酯衍生物、及以4、5、6、至7員雜環之基團，予以置換。特別是，可使用其中脯胺酸殘基之環大小由5員變成4、6、或7員之脯胺酸類似物。環狀基可為飽和或不飽和，若不飽和，可為芳族或非芳族。雜環基團較佳為含一或多個氮、氧、及/或硫雜原子。此等基團之實例包括呋呫基、呋喃基、咪唑啶基、咪唑基、咪唑啉基、異噻唑基、異唑基、嗎啉基(例如嗎啉－4－基)、唑基、六氫吡基(例如1－六氫吡基)、六氫吡啶基(例如，1－六氫吡啶基)、吡喃基、吡基、吡唑啶基、吡唑啉基、吡唑基、嗒基、吡啶基、嘧啶基、吡咯啶基(例如，1－吡咯啶基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代嗎啉基(例如硫代嗎啉－4－基)、及三唑基。彼等雜環基可經取代或未經取代，於經取代時，取代基可為烷基、烷氧基、鹵素、氧、或經取代或未經取代之苯基。
利用磷酸化反應亦可容易地修飾本發明肽類(參閱，例如，W.Bannwarth,et al.,Biorganic and Medicinal Chemistry Letters,6(17)：2142－2146(1996))，其他用於製造本發明化合物的肽衍生物之方法見述於Hruby,et al.,Biochem.J.,268(2)249－262(1990)。因此，本發肽化合物亦可作為製備具有相同生物活性的肽模擬物之基本成分。
C. 末端修飾作用
熟習此項技藝人士認知，有多種技術可用於構築與對應肽化合物具有相同或相似之所需生物活性，惟於溶解性、穩定性、及對水解與蛋白水解作用之敏感性上比該肽更具有有利活性之肽化合物。參閱，例如，Morgan,et al.,Ann.Rep.Med.Chem.,24：243－252(1989)。下文敘述製備於N端胺基、C端羧基經修飾之肽化合物，及/或將該肽中之一或多個醯胺鍵結改變為非醯胺鍵結之方法。需瞭解的是，於一肽化合物結構中，可使二或多個該等修飾作用結合(例如，於肽化合物的兩個胺基酸之間進行C端羧基之修飾及併入－CH2 －胺基甲酸根鍵結)。
1.N 端修飾作用
肽化合物典型地係合成為游離酸型，惟如上文所述，可容易地製備為醯胺或酯型。亦可修飾本發明肽化合物之胺基及/或羧基末端，以產生其他本發明化合物。胺基末端修飾作用包括甲基化作用、乙醯基化作用、添加苄基氧羰基、或以含有由RCOO－－(其中R係選自萘基、吖啶基、類固醇基、及類似基團)界定的羧酸根官能度之任何封阻基團封阻胺基末端。羧基末端修飾作用包括以甲醯胺基團置換游離酸或於羧基末端形成環狀內醯胺以引入結構限制性。
胺基末端修飾作用如上述，包括烷基化、乙醯基化、添加碳苯甲醯基、形成琥珀醯亞胺基等(參閱，例如，Murray,et al.,Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery,5th ed.,Vol.1,Manfred E.Wolf,ed.,John Wiley and Sons,Inc.(1995))。詳言之，N端胺基可如下文所述予以反應：(a)利用與醯基鹵化物或對稱酸酐反應形成具式RC(O)NH－－之醯胺基團，其中R如上文之界定；典型地，此反應可利用使大約等莫耳或過量(例如，約5當量)醯基鹵化物與肽於惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中接觸而進行，稀釋劑中較佳為含有過量(例如，約10當量)三級胺例如二異丙基乙胺，以清除反應期間產生之酸；此外，反應條件為習知(例如，室溫30分鐘)；末端胺基之烷基化反應提供低級烷基N－取代作用，隨後如上述與醯基鹵化物反應而提供具式RC(O)NR－－之N－烷基醯胺基團；(b)利用與琥珀酸酐反應形成琥珀醯亞胺基團，如前述，可使用大約等莫耳量或過量琥珀酸酐(例如，約5當量)，利用此項技藝中悉知之方法，包括於適當惰性溶劑(例如二氯甲烷)中，使用過量(例如，10當量)三級胺例如二異丙基乙胺，將胺基轉化為琥珀醯亞胺；參閱，例如，Wollenberg,et al.,美國專利案4,612,132，其全部內容併入本文以資參考；應瞭解的是，該琥珀酸根基團可被例如烷基或－－SR取代基取代，其係以習知方法製備，以提供肽N端之經取代之琥珀醯亞胺；此等烷基取代基係利用使低級烯烴與順丁烯二酸酐以Wollenberg,et al.(文獻同前)敘述之方法反應而製備；－－SR取代基係利用使RSH(其中R如上文之界定)與順丁烯二酸酐反應而製備；(c)利用使大約等當量或過量CBZ－－Cl(亦即，苄基氧羰基氯)或經取代之CBZ－－Cl於適當惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中反應，以形成苄基氧羰基－NH－－或經取代之苄基氧羰基－NH－－基團，其中稀釋劑較佳為含有三級胺，以清除反應期間產生之酸；(d)利用使等當量或過量(例如，5當量)R－－S(O)2 Cl(式中R如上文之界定)於適當惰性稀釋劑(二氯甲烷)中反應，將末端胺轉化為磺醯胺，以形成磺醯胺基團；較佳為，惰性稀釋劑含有過量(例如，10當量)三級胺例如二異丙基乙胺，以清除反應期間產生之酸；此外，反應條件為習知(例如，室溫，30分鐘)；(e)利用使等當量或過量(例如，5當量)R－－OC(O)Cl或R－－OC(O)OC6 H4 －p－NO2 (式中R如上文之界定)於適當惰性稀釋劑(二氯甲烷)中反應，將末端胺轉化為胺基甲酸根，以形成胺基甲酸根基團；較佳為，惰性稀釋劑含有過量(例如，10當量)三級胺例如二異丙基乙胺，以清除反應期間產生之酸；此外，反應條件為習知(例如，室溫30分鐘)；及(f)利用使等當量或過量(例如，5當量)R－N＝C＝O(式中R如上文之界定)於適當惰性稀釋劑(二氯甲烷)中反應，將末端胺轉化為脲基(亦即，RNHC(O)NH－－)，以形成脲基基團；較佳為，惰性稀釋劑含有過量(例如，約10當量)三級胺例如二異丙基乙胺；此外，反應條件為習知(例如，室溫約30分鐘)。
2. C 端修飾作用
於製備其C端羧基被酯(亦即，－－C(O)OR，其中R如上文之界定)置換之肽化合物時，係使用製備肽酸時所用之樹脂，側鏈經保護之肽係以鹼與適當醇(例如，甲醇)切割；然後以習知方式，利用以氟化氫處理去除側鏈保護基，獲得所需酯。
於製備其C端羧基被醯胺－－C(O)NR3 R4 置換之肽化合物時，係使用二苯甲基胺樹脂作為合成肽時之固體支撐體。完成合成後，經氟化氫處理使肽自支撐體釋出，直接產生游離之肽醯胺(亦即，C端為－－C(O)NH2 )。或者，使用肽合成期間之氯甲基化樹脂，結合與氨之反應，自支撐體切割側鏈經保護之肽，得到游離之肽醯胺；與烷基胺或二烷基胺反應，得到側鏈經保護之烷基醯胺或二烷基醯胺(亦即，C端為－－C(O)NRR1 (其中R與R1 如上文之界定)。然後以習知方式去除側鏈保護，利用以氟化氫處理得到游離之醯胺、烷基醯胺、或二烷基醯胺。
亦可將本發明肽化合物環化，或於肽化合物末端併入脫胺基或脫羧基殘基，使末端胺基或羧基不存在，以降低對蛋白酶的敏感性或限制該肽化合物之構像。本發明肽化合物之C端官能基包括醯胺、醯胺低級烷基、醯胺二(低級烷基)、低級烷氧基、羥基、羧基、與其低級酯衍生物、及其醫藥上可接受之鹽。
除了前述N端及C端修飾作用之外，本發明肽化合物，包括肽模擬物，可有利地以一或多種親水性聚合物修飾或與其共價偶聯。頃發現，當肽化合物以親水性聚合物衍生化時，其溶解性及循環半衰期增加，及其免疫原性被遮蔽。前述反應之完成並未(若有，也極少)減損其結合活性。根據本發明適用之非蛋白質聚合物包含，惟不限於，聚烷基醚類例如聚乙二醇與聚丙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧鏈烯類、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素與纖維素衍生物、葡聚糖與葡聚糖衍生物等。通常，此等親水性聚合物平均分子量在約500至約100,000道爾頓之範圍內，更佳為約2,000至約40,000道爾頓，又更佳為約5,000至約20,000道爾頓。於較佳具體實例中，此等親水性聚合物具有約5,000道爾頓、10,000道爾頓與20,000道爾頓之平均分子量。
本發明肽化合物可使用下述文獻中敘述之任何方法以該等聚合物衍生化或與其偶聯：Zallipsky,S.,Bioconjugate Chem.,6：150－165(1995)；Monfardini,C.et al.,Bioconjugate Chem.,6：62－69(1995)；美國專利案4,640,835；美國專利案4,496,689；美國專利案4,301,144；美國專利案4,670,417；美國專利案4,791,192；美國專利案4,179,337或WO 95/34326；其全部內容均併入本文以資參考。
於將呈現之較佳具體實例中，本發明肽化合物係使用聚乙二醇(PEG)予以衍生化。PEG為帶有兩個末端羥基之含環氧乙烷重覆單元之線型、水溶性聚合物。PEGs依其分子量分類，分子量典型地介於約500道爾頓至約40,000道爾頓之間。於將呈現之較佳具體實例中，所用PEGs之分子量介於5,000道爾頓至約20,000道爾頓之間。與本發明肽化合物偶聯之PEGs可為分支鏈或非分支鏈者(參閱，例如，Monfardini,C.,et al.,Bioconjugate Chem.,6：62－69(1995))。PE Gs可自Shearwater Polymers,Inc.(Huntsville,Ala.)(現為Nektar Therapeutics(San Carlo,CA)之一部分)、Sigma Chemical Co.及其他公司購得。此等PEGs包含，惟不限於，單甲氧聚乙二醇(MePEG－OH)、單甲氧聚乙二醇－琥珀酸酯(MePEG－S)、單甲氧聚乙二醇－琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG－S－NHS)、單甲氧聚乙二醇－胺(MePEG－NH2 )、單甲氧聚乙二醇－三氟乙磺酸酯(MePEG－TRES)、及單甲氧聚乙二醇－咪唑基－羰基(MePEG－IM)。
簡言之，於一具體實例中，所用親水性聚合物，例如，PEG，較佳為其一終端以非反應性基團例如甲氧基或乙氧基封端。然後，於另一終端利用與適當活化劑例如氰尿酸鹵化物(例如，氰尿酸氯、氰尿酸溴或氰尿酸氟)、二咪唑、酸酐試劑(例如，二鹵基琥珀酸酐如二溴琥珀酸酐)、醯基疊氮化物、對重氮鎓苄基醚、3－(對重氮鎓苯氧基)－2－羥丙基醚等反應，活化該聚合物。接著使該經活化之聚合物與本發明肽化合物反應，產生以聚合物衍生化之肽化合物。或者，可將本發明肽化合物中之官能基活化，以與聚合物反應，或使用已知偶聯方法使該二基團於協合偶聯反應中接合。一般將容易地察知，本發明肽化合物可利用熟習此項技藝人士已知及使用之無數其他反應途徑，以PEG予以衍生化。
當肽化合物以親水性聚合物衍生化時，其溶解性及循環半衰期增加，其免疫原性降低。前述衍生化之完成並未(若有，也極少)減損其生物活性。於較佳具體實例中，衍生化肽類的活性為未修飾肽類之0.1至0.01倍。於更佳具體實例中，衍生化肽類的活性為未修飾肽類之0.1至1倍。於又更佳具體實例中，衍生化肽類之活性較未修飾肽類大。
D. 主鏈修飾作用
製造本發明化合物的肽衍生物之其他方法見述於Hruby,et al.,Biochem J.,268(2)：249－262(1990)，其內容併入本文以資參考。因此，本發明肽化合物亦作為具有相似生物活性的非肽化合物之結構模式用。熟習此項技藝人士認知，有多種技術可用於構築與領導肽化合物具有相同或相似所需生物活性，惟於溶解性、穩定性、及對水解與蛋白水解作用之敏感性比該領導肽更具有有利活性之化合物。參閱Morgan,et al.,Ann.Rep.Med.Chem.,24：243－252(1989)，其內容併入本文以資參考。彼等技術包括以由膦酸根、脒酸根、胺基甲酸根、磺醯胺、二級胺、及N－甲基胺基酸構成之主鏈置換該肽主鏈。
適當試劑包括，例如，胺基酸之羧基被適於形成上述鍵結之一者之基團置換之胺基酸類似物。
同樣地，以膦酸根鍵結置換肽中之醯胺鍵結之反應可用美國專利案5,359,115與5,420,328中敘述之方法完成，該等文獻全部揭示內容均併入本文以資參考。
E. 形成二硫鍵
本發明化合物中若出現半胱胺酸，則可呈於併入之半胱胺酸之硫醇基間具有分子內二硫鍵之環狀型存在。或者，可於半胱胺酸之硫醇基間產生分子內二硫鍵而獲得二聚體(或更高之低聚體)化合物。一或多個半胱胺酸殘基亦可以高半胱胺酸替換。
V. 用途
本發明肽化合物於活體外可作為瞭解TPO生物角色之獨特工具之用，包括評估被認為影響TPO產生及受體結合過程或受該等程序影響之許多因子。本發明肽化合物亦用於開發結合及活化TPO－R之其他化合物，由於本發明肽化合物提供結構與活性間之重要資訊，應有助於此項開發。
本發明肽化合物亦可於新TPO受體促效劑之篩選試驗中作為競爭性結合劑用。於該等試驗實例中，本發明肽化合物可不需修飾或以多種方式修飾而使用；舉例而言，藉由標記，例如共價或非共價地與基團接合而直接或間接提供可檢測之訊號。於任何彼等試驗中，其中之物質可直接或間接予以標記。可能用於直接標記者包括標記基團例如：放射性標記例如125 I、酵素(美國專利案3,645,090)例如過氧化酶與鹼性磷酸酶、及能偵測螢光強度變化、波長轉移、或偏極螢光之螢光標記(美國專利案3,940,475)。可能用於間接標記者包括將一成分生物素化，然後使其與連接於上述標記基團之一者之抗生物素蛋白結合。於肽化合物欲連接於固體支撐體之情形下，該肽化合物亦可包含間隔子或連接子。
再者，基於其結合TPO受體之能力，本發明肽化合物亦可作為供檢測活細胞、固定細胞上、生物體液、組織均質液、純化、天然生物物質等中之TPO受體之試劑用。舉例而言，藉由標記該等肽化合物，可鑑定其表面具有TPO－R之細胞。此外，基於其結合TPO受體之能力，本發明肽化合物可於原位染色、FACS(螢光活化細胞分類)、西方墨點法、ELISA等中使用。此外，基於其結合TPO受體之能力，本發明肽化合物可用於純化受體、或純化於細胞表面(或於滲透細胞內側)表現TPO受體之細胞。
本發明肽化合物亦可作為商業試劑，用於各種醫學研究及診斷用途。彼等用途包含，惟不限於：(1)於各種功能試驗中作為定量候選TPO促效劑的活性校正標準之用；(2)用於維持依賴TPO的細胞株之增殖與生長；(3)經由共結晶作用，用於進行TPO受體之結構分析；(4)用於研究TPO訊息轉導/受體活化之機制；及(5)其他研究與診斷應用，其中TPO受體較佳為經活化或該等活化係方便地以已知量TPO促效劑校正等。
本發明肽化合物可用於活體外擴增巨核細胞及其關鍵原祖細胞，二者均可與其他細胞激素結合或就其本身單獨使用。參閱，例如，DiGiusto,et al.,PCT公告案No.95/05843，其內容併入本文以資參考。化學療法與放射療法由於殺死迅速分裂、更成熟的巨核細胞族群而引致血小板減少。然而，彼等治療處理亦減少不成熟、有絲分裂活性較小的巨核細胞前體細胞的數量及存活性。因此，利用TPO或本發明化合物改善血小板減少症可藉於化學治療或放射治療後，以利用試管內培養增殖巨核細胞及不成熟前體細胞之病患本身細胞族群注入病患體內來促成。
本發明肽化合物亦可投與溫血動物，包括人類，以於活體內活化TPO－R。因此，本發明涵蓋用於治療TPO相關病症之方法，該方法包括投與本發明肽化合物，其量足以模擬TPO於活體內對TPO－R之效應。例如，可投與本發明肽化合物以治療多種血液疾病包含惟不限於血小板疾病及血小板減少症，特別是與骨髓輸液、放射療法及化學療法相關者。
於本發明一些具體實例中，較佳為對正在進行化學治療或放射治療的病患先投與TPO拮抗劑，隨後投與本發明之TPO促效劑。
本發明肽化合物之活性可以McDonald,Am.J.of Pediatric Hematology/Oncology,14：8－21(1992)中敘述的許多模式之一者進行試管內或活體內評估，該文獻併入本文以資參考。
根據一具體實例，本發明之組成物係用於治療與骨髓輸液、放射治療、或化學治療相關之血小板減少症。該等肽化合物典型地係於化學治療、放射治療、或骨髓移植之前或於其後進行預防性投與。
因此，本發明亦提供一種醫藥組成物，其包含至少一種本發明肽化合物作為活性成分以及包含醫藥載劑或稀釋劑。本發明肽化合物可經口、肺、非經腸(經肌內、腹膜內、靜脈內(IV)或皮下注射)、吸入法(經由微細粉劑調配物)、經皮、鼻、陰道、直腸、或舌下等投與途徑投與，及可調配為適用於各投與途徑之劑量型。參閱，例如，Bernstein,et al.,PCT專利公告案WO 93/25221；Pitt,et al.,PCT專利公告案WO 94/17784；及Pitt,et al.,歐洲專利申請案613,683；各文獻均併入本文以資參考。
供口服投與固體劑量型包括膠囊、錠劑、丸劑、粉劑及粒劑。於此等固體劑量型中，係將活性肽化合物與至少一種惰性之醫藥上可接受載劑例如蔗糖、乳糖、或澱粉摻合。依一般慣例，此等劑量型亦可含有惰性稀釋劑以外之其他物質，例如，潤滑劑如硬脂酸鎂。於膠囊、錠劑、與丸劑之情形下，劑量型亦可含有緩衡劑。錠劑與丸劑附加地可以腸衣被覆劑製備。
供口服投與用之液體劑量型包含帶有含此項技藝中常用的惰性稀釋劑(例如水)之酏劑之醫藥上可接受之乳液、溶液、懸浮液、糖漿。除了該等惰性稀釋劑外，組成物亦可包含佐劑，例如濕潤劑、乳化劑與懸浮劑，及增甜劑、調味劑與芳香劑。
根據本發明之供非經腸投與用之製劑包含無菌水性或非水性溶液、懸浮液、或乳液。非水性溶劑或載體之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油與玉米油、明膠、及注射用有機酯類例如油酸乙酯。此等劑量型亦可含佐劑例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑、及分散劑。彼等可利用，例如，通過細菌固定濾器過濾、於組成物中併入滅菌劑、輻照組成物、或加熱組成物進行滅菌；亦可於接近使用之前，以無菌水或一些其他無菌注射用介質予以製造。
供直腸或陰道投與用之組成物較佳為栓劑，其除了活性物質外，可含有賦形劑例如可可脂或栓劑蠟。供經鼻或舌下投與用之組成物亦可以此項技藝中悉知之標準賦形劑製備。
可投與含本發明肽化合物之組成物以供預防及/或治療處理。於治療應用中，係將組成物投與已罹患如上述疾病之病患，其量足以治療或至少部分制止該疾病及其併發症之症狀。將足以完成此目的之量界定為「治療有效劑量」。供此用途之有效量將取決於疾病的嚴重性及病患的重量與一般狀況。
本發明組成物亦可利用，例如，Tice與Bibi(於Treatise on Controlled Drug Delivery,ed.A.Kydonieus,Marcel Dekker,New York(1992),pp.315－339中)之方法，予以微膠囊化。
於預防應用中，係將含本發明肽化合物之組成物投與對特定疾病敏感或者瀕臨患病之病患，將該等投與量界定為「預防有效量」。於此用途中，確切量再度取決於病患的健康狀況與體重。
供有效治療所需肽化合物之量取決於許多不同因素，包括投與方式、標的位置、病患生理狀況、及所投與之其他藥劑。因此，治療劑量須經滴定測量，以獲得最佳安全性及效力。典型地，試管內所用劑量可提供彼等試劑用於原位投與的量之有用指標。治療特定疾病之動物試驗有效劑量將提供人類劑量之進一步預測指示。各種考慮因素見述於，例如，Gilman,et al.(eds),Goodman and Gilman’s：The Pharmacological Basis of Therapeutics,8th ed.,Pergamon Press(1990)；及Remington’s Pharmaceutical Sciences,7th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1985)；各文獻均併入本文以資參考。
當本發明肽化合物以每天約0.001毫克至約10毫克/公斤體重範圍內之劑量投與時，可有效地治療TPO傳介之病症。所用具體劑量由治療之特定病症、投與途徑以及參與的臨床醫師取決於例如症狀嚴重性、病患年齡及一般狀況等因素之判斷予以調控。
 實例1 固相肽化合物合成
本發明之肽化合物可使用Merrifield固相合成技術(參閱Steward and Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd.edition,Pierce Chemical,Rockford,Ill.(1984)及Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85：2149(1963))或Applied Biosystems Inc.Model 431A或433A肽合成儀予以合成。使用the Applied Biosystems Inc.Synth Assist.TM.1.0.0或Synth AssistT M 2.0.2標準實驗流程進行肽化合物之組合。各偶聯反應可使用HBTU(六氟磷酸2－(1H－苯並三唑－1－基)－1,1,3,3－四甲基銶)及HOBt(1－羥基苯並三唑)進行2x30分鐘。
所用樹脂可為HMP樹脂(對羥甲基苯氧甲基)聚苯乙烯樹脂或PAL(Milligen/Biosearch)，其為以5－(4’－Fmoc－胺甲基－3,5’－二甲氧苯氧基)戊酸為連接子之交聯聚苯乙烯樹脂。使用PAL樹脂，於肽自樹脂切割時，產生羧基末端之醯胺官能性。切割後，HMP樹脂於終產物C端產生羧酸基團。大部分試劑、樹脂、及經保護之胺基酸(游離或於樹脂上)係購自Millipore或Applied Biosystems Inc.。
於偶聯過程中，可使用Fmoc基團進行胺基保護。胺基酸上一級胺的保護係使用Fmoc達成，至於側鏈保護基，絲胺酸、酪胺酸、麩胺酸、與蘇胺酸為第三丁基；麩胺醯胺為三苯甲基；精胺酸為Pmc(2,2,5,7,8－五甲基色滿－6－磺醯基)；色胺酸為N－第三氧羰基；組胺酸為N－三苯甲基及半胱胺酸為S－三苯甲基。
利用以K試劑(或將其稍加修飾)處理，可將肽化合物自樹脂去除，同時達成側鏈官能之脫保護。或者，於具有醯胺化羧基末端的彼等肽類之合成中，以90%三氟乙酸、5%乙二硫醇、與5%水之混合物切割充分組合之肽，溫度開始時為4℃，逐漸增加至室溫。脫保護之肽化合物以乙醚使其沉澱。純化可利用製備性、逆相、高效能液相層析法，於C1 8 鍵結矽膠管柱上，使用乙腈/水於0.1%三氟乙酸中之梯度進行。於可實施時，該均質肽化合物可利用快速原子撞擊質譜分析法或電噴灑式質譜分析法及胺基酸分析法予以鑑定。
於較佳具體實例中，本發明肽化合物係使用熟習此項技藝人士已知且使用之標準合成程序予以二聚化。於彼等合成途徑之後，熟習此項技藝人士可根據本發明，容易地製備二聚體肽化合物。此外，熟習此項技藝人士將容易地顯見，該等二聚次單元可使用已知方法及連接劑容易地予以連接。
實例2 肽化合物之聚乙二醇化
本發明肽化合物之聚乙二醇化可利用一般悉知技術進行。舉例而言，以10毫克/毫升之濃度，使本發明肽化合物溶於100 mM N－二(羥乙基)甘胺酸(pH 8.0)中，並將其添加至1.25倍莫耳過量之粉末狀PEG2(自Shearwater Polymers,Inc.(Huntsville,Ala.)購得)中，於室溫攪拌至反應完全，一般約需1－2小時。使用40－65%乙腈梯度，於YMC ODS AQ管柱上，利用逆相HPLC偵測反應。反應完全時，添加此溶液至第二份1.25倍莫耳過量之粉末狀PEG2中，重複此程序4次，每莫耳多肽共計使用5莫耳PEG2。然後以PBS將溶液稀釋2倍以減少黏性，並裝填至事先以PBS平衡及溶洗之Superdex 200管柱(Pharmacia)上。得自該分級排除管柱之溶離份利用逆相HPLC進行分析。收集含有二－PEG－多肽(其比任何單－PEG－多肽先溶洗出)之溶離份，貯存於5℃或凍乾。
實例3 1號TPO PEG化化合物血小板生成活性之臨床前動物研究
1號TPO化合物並未與內源TPO分享任何序列同質性，因而減輕與內源TPO形成交叉反應抗體之風險。將1號TPO化合物PEG化以減少空隙(clearance)及進一步減少抗原性。此實例敘述PEG化1號 TPO化合物於動物中血小板生成活性之臨床前研究。
使用正常Wistar公大鼠(來源)供研究用。其他動物，例如狗、小鼠、猴子等，亦可用於此臨床前研究。所有涉及動物之程序均於由美國實驗動物認證協會(American Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)充分認可之動物設施中，根據實驗動物飼養管理及使用規範(The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(NIH)進行。
正常Wistar公大鼠(10週齡，給藥體重在230至367克範圍內)以30、100或300微克/公斤1號TPO化合物之單一靜脈內劑量進行處理(40隻大鼠/組)。於給藥前、給藥96、144、192、240、288與312小時後，藉由穿刺未麻醉大鼠之頸靜脈收集大約0.5毫升血液(每個時間點5隻大鼠，以EDTA作為抗凝血劑)，使用自動血液分析系統評估血小板計數。收集各試樣之前，令動物禁食隔夜，惟自由取水。
PEG化1號TPO化合物之單一靜脈內劑量(30、100或300微克/公斤)，由第4天之最早給藥後評估顯示，導使正常Wistar公大鼠周邊血小板計數增加(圖6)。於其後兩週，每隔2天進行血小板計數評估，並與給藥前計數比較。300微克/公斤劑量誘導血小板計數增加最多，第14天回到基線。
實例4 PEG化1號TPO化合物血小板生成活性之第I階段臨床研究
進行第I階段研究以探查PEG化1號TPO化合物之忍受性、藥效學與藥物動力學。此實例敘述PEG化1號TPO化合物經單一靜脈內注射投與健康男性志工後之第I階段研究。PEG化1號TPO化合物與根據本發明之其他化合物於多次靜脈內注射及/或其他方式投與需要治療之病患後之第I階段研究係使用熟習此項技藝人士已知之實驗流程進行。
以6：2比率使40位志工隨機接受單一i.v.推注之PEG化1號TPO化合物或寬慰劑。八位實驗對象以6：2比率隨機接受PEG化1號TPO化合物或寬慰劑之單一注射，劑量範圍為0.375、0.75、1.5、2.25或3微克/公斤。由血小板計數高度測量PEG化1號TPO化合物之藥效學反應。使用認可之酵素連結免疫吸附試驗測定血小板稀少之血漿中之PEG化1號TPO化合物量。使用標準免疫試驗，於指示之時間點測量內源TPO、EPO、IL－6與IL－11等量。使用生物感應器免疫試驗(BiaCore technology)測量對抗PEG化1號TPO化合物之肽部分之抗體形成。於投與PEG化1號TPO化合物4小時及12天後，利用偵測膠原蛋白誘導之血小板聚集，測量對血小板功能之影響。
PK分析暗示與劑量相關之PEG化1號TPO化合物之動力學，惟於0.75微克/公斤或0.75微克/公斤以下之劑量時，PEG化1號TPO化合物之血漿濃度通常在6.25奈克/毫升之定量極限之下(圖7)。0.375微克/公斤劑量組之四位實驗對象及3.0微克/公斤PEG化1號TPO化合物劑量組之一位實驗對象無可計量之血漿含量。平均Cmax值從0.75微克/公斤PEG化1號TPO化合物之10.9奈克/毫升至3.0微克/公斤PEG化1號TPO化合物之61.7奈克/毫升不等(表1)。於1號TPO化合物之0.375微克/公斤i.v.下，無可測量之PK數據。PEG化1號TPO化合物之平均最終半衰期為大約18至36小時不等。Tmax中間值在0.09至2小時之範圍內。Cmax隨著劑量增加而增加，大約與劑量成正比，惟常態化AUC0 － 2 4 值隨著劑量而明顯增加，暗示高過成正比之劑量增加值。
投與PEG化1號TPO化合物之血小板反應與rhTPO及AMG531之公告結果類似。血小板計數依賴劑量地增加，於第10－12天達到高峰量，3－4週內回到基線(圖8)。平均最高血小板計數從0.375微克/公斤i.v.之315x109/升至3微克/公斤i.v.之685 x 109/升不等；自基線之平均最大血小板計數增加從0.375微克/公斤之1.4倍至3.0微克/公斤之3.2倍不等(表2)。於接受0.75微克/公斤劑量PEG化1號TPO化合物的6位實驗對象中之4位觀察到至少50%之血小板增加；而於1.5微克/公斤劑量的6位實驗對象中之約3位觀察到至少2倍之血小板計數增加。選定0.75微克/公斤i.v.劑量作為第II階段臨床研究之起始劑量。
除了血小板計數變化之外，其他成熟之循環血液細胞均未受影響(數據未示出)。此外，投與PEG化1號TPO化合物，於出現新製造的血小板時，在投與時間，亦或投與12天後，均不影響血小板功能。
評估投與PEG化1號TPO化合物對已知具有血小板生成活性的生長因子之影響。內源TPO量依賴劑量地增加，於給藥3天後達到高峰量(圖9)。血液中之IL－6、IL－11與EPO等量未觀察到明顯的變化。
全血中，以膠原蛋白誘導之血小板聚集評估之血小板功能，於各處理間並無不同。無任何實驗對象遭受嚴重之不利後果或劑量引起之毒性。最常觀察到之不利後果包括輕微頭痛及疲勞，於積極治療及寬慰劑給藥後均發生。未檢測到對抗PEG化1號TPO化合物之抗體。彼等結果表示，PEG化1號TPO化合物於所測試之劑量範圍內耐受性良好。
上文中雖僅詳細敘述本發明之較佳具體實例，惟一般將察知，在不偏離本發明精神與意指範圍下，可能進行本發明之各種修飾與變化。
圖1顯示及比較1號TPO化合物與先前技藝肽化合物(全文中稱之為「先前技藝肽化合物」)之活性。1號TPO化合物與先前技藝肽化合物間之差異在於先前技藝肽化合物具有β－(1－萘基)丙胺酸(1－Nal)而1號TPO化合物上為(2－Nal)。
圖2顯示及比較PEG化1號TPO化合物與PEG化先前技藝肽化合物之活性。
圖3顯示及比較大鼠血小板計數之活體內變化，說明PEG化1號TPO化合物對PEG化先前技藝肽化合物之相對效力。
圖4與圖5係於使用PEG化先前技藝肽化合物及使用PEG化1號TPO化合物下，分別以依賴劑量之方式顯示及比較循環中的血小板之計數及容積。
圖6顯示PEG化1號TPO化合物之單一靜脈內劑量(30、100或300微克/公斤)於正常Wistar公大鼠中產生周邊血小板計數之增加。
圖7顯示PEG化1號TPO化合物於健康男性志工中之PK，濃度－時間量變曲線：滿格正方形－PEG化1號TPO化合物，0.75微克/公斤i.v.；空心方塊－PEG化1號TPO化合物，1.5微克/公斤i.v.；滿格正三角形－PEG化1號TPO化合物，2.25微克/公斤i.v.；空心倒三角形－PEG化1號TPO化合物，3微克/公斤i.v.。
圖8顯示健康男性志工投與PEG化1號TPO化合物後，血小板計數依賴劑量地增加。
圖9顯示健康男性志工投與PEG化1號TPO化合物後，內源TPO量依賴劑量地增加。
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Claims (26)

  1. 一種用於治療罹患血小板減少之病患之醫藥組成物，其係包含治療有效劑量或量之包含下述序列之肽化合物：(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10 )-K(NH2 )-(X10 RAAL(2-Nal)Q RLTPGEI)-H，(SEQ ID NO：7)，其中X10 為肌胺酸，且(2-Nal)為β-(2-萘基)丙胺酸，且其中該肽化合物係以約0.1與約0.75微克/公斤間之劑量範圍投與。
  2. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該肽化合物係以約0.375、或0.75微克/公斤之劑量投與。
  3. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中投與該肽化合物，約0.75微克/公斤肽化合物產生約10奈克/毫升之平均Cmax 值。
  4. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中投與該肽化合物產生約18小時至約36小時之該肽化合物之平均最終半衰期。
  5. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中投與該肽化合物產生約0.09小時至約2小時之tmax 中間值。
  6. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中投與該肽化合物，於約0.75微克/公斤劑量下，產生約50%之血小板計數增加。
  7. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中投與該肽化合物產生內源TPO量之增加。
  8. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該肽化合物係共價連接於親水性聚合物。
  9. 如申請專利範圍第8項之醫藥組成物，其中該親水性聚合物具有約500至約40,000道爾頓間之平均分子量。
  10. 如申請專利範圍第9項之醫藥組成物，其中該親水性聚合物具有約5,000至約20,000道爾頓間之平均分子量。
  11. 如申請專利範圍第8項之醫藥組成物，其中該親水性聚合物係選自包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸與聚乙醇酸之組群。
  12. 如申請專利範圍第11項之醫藥組成物，其中該親水性聚合物為聚乙二醇。
  13. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該肽化合物之各二聚次單元係共價連接於親水性聚合物。
  14. 如申請專利範圍第13項之醫藥組成物，其中該親水性聚合物為聚乙二醇。
  15. 如申請專利範圍第14項之醫藥組成物，其中該聚乙二醇係選自下述組群：單甲氧聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧聚乙二醇-琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧聚乙二醇-胺(MePEG-NH2 )、單甲氧聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)、與單甲氧聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
  16. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該肽化合物具下式： 其中(2-Nal)為β-(2-萘基)丙胺酸及(Sar)為肌胺酸。
  17. 如申請專利範圍第16項之醫藥組成物，其中該肽化合物係共價連接於親水性聚合物。
  18. 如申請專利範圍第17項之醫藥組成物，其中該親水性聚合物係選自包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸與聚乙醇酸之組群。
  19. 如申請專利範圍第18項之醫藥組成物，其中該親水性聚合物為聚乙二醇。
  20. 如申請專利範圍第19項之醫藥組成物，其中該聚乙二醇具有約5,000至約20,000道爾頓間之平均分子量。
  21. 如申請專利範圍第19項之醫藥組成物，其中該聚乙二醇係選自下述組群：單甲氧聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧聚乙二醇-琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧聚乙二醇-胺(MePEG-NH2 )、單甲氧聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)、與單甲氧聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
  22. 如申請專利範圍第17項之醫藥組成物，其中該肽化合物之各二聚次單元係共價連接於親水性聚合物。
  23. 如申請專利範圍第22項之醫藥組成物，其中該親水性聚合物係選自包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸與聚乙醇酸之組群。
  24. 如申請專利範圍第23項之醫藥組成物，其中該親水性聚合物為聚乙二醇。
  25. 如申請專利範圍第24項之醫藥組成物，其中該聚乙二醇具有約5,000至約20,000道爾頓間之平均分子量。
  26. 如申請專利範圍第24項之醫藥組成物，其中該聚乙二醇係選自下述組群：單甲氧聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧聚乙二醇-琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧聚乙二醇-胺(MePEG-NH2 )、單甲氧聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)、與單甲氧聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
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