CN101287749A - 与tpo受体结合的肽的用途 - Google Patents

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Abstract

公开了与血小板生成素受体(c－mpl或TPO－R)结合并激活血小板生成素受体，或以其他方式充当TPO激动剂的肽化合物。

Description

与TPO受体结合的肽的用途
与相关申请的交叉参考
本申请是于2004年8月13日提交的美国申请系列号10/918,561的部分继续申请，要求美国申请系列号10/918,561和60/498,740的优先权，所述美国申请系列号的整体内容引入本文作为参考。
发明领域
本发明提供了与血小板生成素受体(c-mpl或TPO-R)结合并激活血小板生成素受体，或以其他方式充当TPO激动剂的肽化合物。本发明在生物化学和医药化学领域中具有应用，且具体地提供TPO激动剂用于在人疾病治疗中使用。
发明背景
巨核细胞是负责生产循环血小板的骨髓衍生细胞。尽管在大多数物种中构成＜0.25％的骨髓细胞，但它们具有＞10倍的一般骨髓细胞体积。参见Kuter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11104-11108(1994)。巨核细胞经历被称为核内有丝分裂的过程，由此它们复制它们的细胞核但不能经历细胞分裂，且因此产生多倍体细胞。响应减少的血小板计数，核内有丝分裂率增加，形成较高倍性的巨核细胞，并且巨核细胞数目可以增加最高达3倍。参见Harker，J.Clin.Invest.，47：458-465(1968)。相反，响应升高的血小板计数，核内有丝分裂率减少，形成较低倍性的巨核细胞，并且巨核细胞数目可以减少50％。
循环血小板团(mass)通过其调节核内有丝分裂率以及骨髓巨核细胞数目的确切生理学反馈机制未知。涉及介导这种反馈环的循环血小板生成因子目前被认为是血小板生成素(TPO)。更具体地，在涉及血小板减少症的情况下，TPO已显示是主要体液调节剂。参见，例如，Metcalf，Nature，369：519-520(1994)。在几项研究中已显示TPO增加血小板计数、增加血小板大小、且增加同位素掺入受体动物的血小板内。具体地，TPO被认为以几种方式影响巨核细胞生成：(1)它引起巨核细胞大小和数目中的增加；(2)它引起DNA含量、多倍性形成、巨核细胞中的增加；(3)它增加巨核细胞核内有丝分裂；(4)它引起巨核细胞的成熟增加；和(5)它引起前体细胞百分比、小乙酰胆碱酯酶阳性细胞形成、骨髓中的增加。
血小板(凝血细胞)是血液凝固所需的。当它们的数目非常低时，患者处于因灾难性出血而死亡的严重危险中。TPO因此在各种血液学病症的诊断和治疗中具有潜在有用的应用，所述血液学病症例如主要由于血小板缺陷的疾病。正在进行的使用TPO的临床试验已指出TPO可以安全地施用于患者。此外，近期研究已提供了关于TPO疗法在血小板减少症，且特别是起因于化学疗法、放射疗法、或作为用于癌症或淋巴瘤治疗的骨髓移植的血小板减少症治疗中的功效预测基础。参见，例如McDonald，Am.J.Ped.Hematology/Oncology，14：8-21(1992)。
编码TPO的基因已被克隆和表征。参见Kuter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：11104-11108(1994)；Barley等人，Cell 77：1117-1124(1994)；Kaushansky等人，Nature 369：568-571(1994)；Wendling等人，Nature，369：571-574(1994)；和Sauvage等人，Nature 369：533-538(1994)。血小板生成素是具有至少2种形式的糖蛋白，表观分子量为25kDa和31kDa，具有共同的N末端氨基酸序列。参见，Bartley等人，Cell，77：1117-1124(1994)。血小板生成素似乎具有由潜在的Arg-Arg切割位点分开的2个不同区域。氨基末端区域在人和小鼠中是高度保守的，且与促红细胞生成素以及干扰素-a和干扰素-b具有一些同源性。羧基末端区域显示广泛的物种趋异。
关于人TPO(也称为c-mpl)的DNA序列和编码的肽序列已得到描述。参见Vigon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5640-5644(1992)。TPO-R是血细胞生成素生长因子受体家族成员，这是特征为细胞外结构域的共同结构设计的家族，包括N末端部分中的4个保守C残基和接近于跨膜区的WSXWS基序(SEQ ID NO：1)。参见Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6934-6938(1990)。这种受体在血细胞生成中起功能作用的证据包括下述观察：其表达限制于小鼠中的脾、骨髓、或胎儿肝(参见Souyri等人，Cell 63：1137-1147(1990))，以及人中的巨核细胞、血小板和CD34+细胞(参见Methia等人，Blood 82：1395-1401(1993))。此外，使CD34+细胞暴露于对mpl RNA反义的合成寡核苷酸，显著抑制巨核细胞集落的出现，而不影响红细胞类或髓样集落形成。某些工作者假定该受体作为同二聚体发挥作用，类似于关于G-CSF和促红细胞生成素受体的情况。
关于TPO-R的克隆的基因的可用性促进关于这种重要受体的激动剂的研究。重组受体蛋白的可用性允许在多种随机和半随机肽多样性产生系统中研究受体-配体相互作用。这些系统公开于下述参考文献中：美国专利号6,251,864、6,083,913、6,121,238、5,932,546、5,869,451、5,506,362和6,465,430，以及Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378-6382(1990)；前述专利申请和出版物各自引入本文作为参考。
在患有血细胞减少症的患者中血小板水平缓慢恢复是严重问题，且已给关于血液生长因子激动剂的研究增加了紧急性，所述激动剂能够加速血小板再生。本发明提供了此类激动剂。
发明概述
本发明涉及限定的低分子量肽化合物，所述肽化合物具有针对TPO-R的强结合特性、可以激活TPO-R且与已知TPO激动剂相比较，可能允许减少副作用。因此，肽化合物可以在由TPO介导的状况(例如，起因于化学疗法、放射疗法、或骨髓输血的血小板减少症)治疗中用于治疗目的，以及在血细胞生成机制研究和巨核细胞(megakaroycytes)和定型祖细胞的体外扩张中用于诊断目的。
如通过例如美国专利号5,869,451实施例3中所述的结合亲和力测定所测定的，适合于治疗和/或诊断目的肽化合物具有约2mM或更小的IC50，其中较低的IC50与对于TPO-R较强的结合亲和力相关。美国专利号5,869,451中的测定如下：肽化合物的结合亲和力在竞争结合测定中进行测量。微量滴定板孔用1mg链霉抗生物素蛋白包被，用PBS/1％BSA封闭，随后为50ng生物素化的(biotnylated)抗受体固定抗体(Ab179)。孔随后用1∶10稀释的可溶性TPO-R收获物进行处理。各种浓度的肽化合物与恒定量的与麦芽糖结合蛋白C末端融合的截短形式的TPO混合，所述截短形式的TPO由残基1-156组成(MBP-TPO156)。将肽MBP-TPO156混合物加入TPO-R包被的孔中，于4℃温育2小时，且随后用PBS进行洗涤。平衡时结合的MBP-TPO量通过添加针对MBP的兔抗血清，随后为碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG来测量。每个孔中的碱性磷酸酶量随后使用标准方法进行测定。测定在一系列肽化合物浓度上进行，且这样对结果作图，从而使得y轴表示结合的MBP-TPO量，且x轴表示肽化合物浓度。随后可以测定肽化合物将使与固定化的TPO-R结合的MBP-TPO量减少50％的浓度(IC50)。关于肽的解离常数(Kd)应当类似于使用这些测定条件测量的IC50。为了药学目的，肽化合物优选具有仅仅约100μM的IC50，更优选地，仅仅500nM。在一个优选实施方案中，肽化合物的分子量为约250-约8,000道尔顿。如果本发明的肽化合物是寡聚的、二聚的和/或与如本文所述的用亲水聚合物衍生的，那么此类肽化合物的分子量将基本上更大，且可以为约500-约120,000道尔顿，更优选约8,000-约80,000道尔顿。
当用于诊断目的时，本发明的肽化合物优选用可检测的标记进行标记，且因此不含此类标记的肽化合物在标记的肽化合物的制备中充当中间物。
符合关于分子量和对于TPO-R结合亲和力的限定标准的肽化合物包含9个或更多氨基酸，其中所述氨基酸是天然存在的或合成(非天然存在的)氨基酸。
因此，优选的肽化合物包含具有下述的化合物：
(1)小于约5000道尔顿的分子量，和
(2)如由仅仅约100μM的IC50表示的，对于TPO-R的结合亲和力，
其中肽化合物的0至所有--C(O)NH--键已用选自下述的键替换：--CH2OC(O)NR--键；膦酸酯键；--CH2S(O)2NR--键；--CH2NR--键；和--C(O)NR6--键；以及--NHC(O)NH--键，其中R是氢或低级烷基且R6是低级烷基，
进一步地其中所述肽化合物的N末端选自-NRR1基团；--NRC(O)R基团；--NRC(O)OR基团；--NRS(O)2R基团；--NHC(O)NHR基团；琥珀酰亚胺基团；苄氧羰基-NH--基团；和在苯基环上具有1-3个取代基的苄氧羰基-NH--基团，所述取代基选自低级烷基、低级烷氧基、氯、和溴，其中R和R1独立地选自氢和低级烷基，
且再进一步地其中所述肽化合物的C末端具有式--C(O)R2，其中R2选自羟基、低级烷氧基和-NR3R4，其中R3和R4独立地选自氢和低级烷基，且其中-NR3R4基团的氮原子可以任选是肽N末端的胺基，以便形成环肽，
及其生理学可接受的盐。
在相关实施方案中，本发明涉及包含如上所述的肽化合物的标记的肽化合物，所述肽化合物具有与其共价附着的能检测的标记。
在一个实施方案中，核心肽化合物包含氨基酸序列：(SEQ ID NO：2)
X9 X8 G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7
其中X9是A、C、E、G、I、L、M、P、R、Q、S、T、或V；且X8是A、C、D、E、K、L、Q、R、S、T、或V；且X6是β-(2-萘基)丙氨酸(在本文中称为“2-Nal”)残基。更优选地，X9是A或I；且X8是D、E、或K。进一步地X1是C、L、M、P、Q、V；X2是F、K、L、N、Q、R、S、T或V；X3是C、F、I、L、M、R、S、V或W；X4是20种遗传编码的L-氨基酸中的任何一种；X5是A、D、E、G、K、M、Q、R、S、T、V或Y；且X7是C、G、I、K、L、M、N、R或V。
特别优选的肽化合物包括氨基酸序列I E G P T L R Q(2-Nal)L A AR(Sar)(SEQ ID NO：7)，其中(2-Nal)是β-(2-萘基)丙氨酸且(Sar)是肌氨酸。
在另一个实施方案中，本发明的肽化合物优选是二聚或寡聚的，以增加化合物的亲和力和/或活性。优选二聚的肽化合物的例子包括但不限于，下述；
其中X10是肌氨酸或β-丙氨酸残基(SEQ ID NO：7)。上文结构也可以由下述结构表示：(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2。
当X10是肌氨酸时，化合物具有下述结构；
Figure A20068003761000092
其中(2-Nal)是β-(2-萘基)丙氨酸且(Sar)是肌氨酸(SEQ ID NO：7)。这种肽化合物也可以由下述结构(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar))2K-NH2表示，在本文中称为“第1号TPO化合物”。
在再进一步的实施方案中，用于在本发明中使用的优选肽化合物包括与多种亲水聚合物中的一种或多种共价附着的肽化合物。合适的亲水聚合物包括但不限于，如美国专利号5,869,451中所述的，如由聚乙二醇和聚丙二醇例示的聚烷基醚、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧烯(polyoxyalkenes)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素和纤维素衍生物、葡聚糖和葡聚糖衍生物等，所述专利的整体内容在此引入作为参考。
本文描述的肽化合物可用于预防和治疗由TPO介导的疾病，且特别是用于治疗血液学病症，包括但不限于，起因于化学疗法、放射疗法、或骨髓输血的血小板减少症。因此，本发明还提供了用于治疗的方法，其中患有对TPO激动剂治疗易感病症的患者接受，或被施用治疗有效剂量或量的本发明的肽化合物。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文描述的一种或多种肽化合物和生理学可接受的载体。这些药物组合物可以为多种形式，包括经口剂型、以及可吸入粉末和溶液以及可注射和可输注溶液。
附图简述
图1显示且比较了第1号TPO化合物与现有技术肽化合物(本文自始至终称为“现有技术肽化合物”)的活性。第1号TPO化合物与现有技术肽化合物之间的差异在于：现有技术肽化合物具有β-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)，其中(2-Nal)在第1号TPO化合物上。
图2显示且比较了聚乙二醇化的(PEGylated)第1号TPO化合物与聚乙二醇化的现有技术肽化合物的活性。
图3显示且比较了在大鼠血小板计数中的体内变化，显示了聚乙二醇化的第1号TPO化合物与聚乙二醇化的现有技术肽化合物的相对效力。
图4和5显示且比较了分别使用聚乙二醇化的现有技术肽化合物和使用聚乙二醇化的第1号TPO化合物后，以剂量依赖性方式的循环血小板数目和体积。
图6显示单次静脉内剂量的聚乙二醇化的第1号TPO化合物(30、100或300μg/kg)，导致正常雄性Wistar大鼠的外周血小板计数增加。
图7显示在健康男性志愿者中聚乙二醇化的第1号TPO化合物的PK，浓度-时间曲线图：实心正方形-聚乙二醇化的第1号TPO化合物，0.75μg/kg静脉内(i.v.)；空心菱形-聚乙二醇化的第1号TPO化合物，1.5μg/kg静脉内；实心正三角形-聚乙二醇化的第1号TPO化合物，2.25μg/kg静脉内；空心倒三角形-聚乙二醇化的第1号TPO化合物，3μg/kg静脉内。
图8显示在聚乙二醇化的第1号TPO化合物施用后，在健康男性志愿者中血小板计数剂量依赖性地增加。
图9显示在聚乙二醇化的第1号TPO化合物施用后，在健康男性志愿者中内源TPO水平剂量依赖性地增加。
具体实施方案描述
I.定义和一般参数
提出下列定义以举例说明和限定本文用于描述本发明的各种术语的含义和范围。
“激动剂”指生物学活性配体，所述配体与其互补生物学活性受体结合且激活后者，以引起受体中的生物学应答或增强受体预先存在的生物活性。
“肽化合物”指水解成氨基酸和/或氨基酸衍生物和/或氨基酸取代物的分子。
“药学可接受的盐”指药物工业中常用的无毒碱金属、碱土金属、和铵盐，包括通过本领域众所周知的方法制备的钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵、和鱼精蛋白锌盐。该术语还包括无毒酸加成盐，这一般通过使本发明的化合物与合适的有机或无机酸反应来制备。代表性盐包括氢氯化物、氢溴化物、硫酸盐、硫酸氢盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、月硅酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘磺酸盐等。
“药学可接受的酸加成盐”指保留游离碱的生物学有效性和特性，并且非生物学或其他方面不希望的那些盐，由无机酸和有机酸形成，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、薄荷烷磺酸(menthanesulfonic acid)、甲磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。关于作为前体药物的药学可接受的酸加成盐的描述，参见，Bundgaard，H.，同上。
“药学可接受的酯”指在酯键水解后，保留羧酸或醇的生物学有效性和特性，且并非生物学或其他方面不希望的那些酯。关于作为前体药物的药学可接受的酯的描述，参见Bundgaard，H.，编辑，Design of Prodrugs，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)。这些酯一般由相应的羧酸和醇形成。一般地，酯形成可以经由常规合成技术来完成。(参见，例如，March，Advanced Organic Chemistry，第4版，John Wiley & Sons，New York(1992)，393-396和其中引用的参考文献，以及Mark等人，Encyclopedia of Chemical Technology，John Wiley & Sons，New York(1980)。)酯的醇组分一般将包含(i)可以包含或不含一个或多个双键且可以包含或不含分支碳的C2-C12脂族醇，或(ii)C7-C12芳族或杂芳族醇。本发明还预期了既是本文描述的酯同时也是其药学可接受的酸加成盐的那些组合物的用途。
“药学可接受的酰胺”指在酰胺键水解后，保留羧酸或胺的生物学有效性和特性，且并非生物学或其他方面不希望的那些酰胺。关于作为前体药物的药学可接受的酰胺的描述，参见Bundgaard，H.，编辑，Designof Prodrugs，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)。这些酰胺一般由相应的羧酸和胺形成。一般地，酰胺形成可以经由常规合成技术来完成。(参见，例如，March，Advanced Organic Chemistry，第4版，John Wiley & Sons，New York(1992)，第393页和Mark等人，Encyclopedia of Chemical Technology，John Wiley & Sons，New York(1980)。)本发明还预期了既是本文描述的酰胺同时也是其药学可接受的酸加成盐的那些组合物的用途。
“药学或治疗可接受的载体”指不干扰活性成分的生物活性效力并且对宿主或患者无毒的载体介质。
“立体异构体”指具有与另一种相同的分子量、化学组成和构造，但原子不同地聚合的化合物。即，某些相同化学部分在空间上处于不同方向，且因此当为纯的时，具有使偏振光平面旋转的能力。然而，一些纯立体异构体可能具有如此轻微的旋光性，以致于使得用目前的仪器操作不可检测。本发明的化合物可能具有一个或多个不对称碳原子，且因此包括各种立体异构体。所有立体异构体都包括在本发明的范围内。
“治疗或药学有效量”当应用于本发明的组合物时，指足以诱导所需生物学结果的组合物量。那种结果可以是疾病病征、症状、或原因缓和，或生物学系统的任何其他所需的改变。在本发明中，该结果一般将涉及针对感染或组织损害的免疫和/或炎症应答减少。
肽中的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸是Phe或F；亮氨酸是Leu或L；异亮氨酸是Ile或I；甲硫氨酸是Met或M；缬氨酸是Val或V；丝氨酸是Ser或S；脯氨酸是Pro或P；苏氨酸是Thr或T；丙氨酸是Ala或A；酪氨酸是Tyr或Y；组氨酸是His或H；谷氨酰胺是Gln或Q；天冬酰胺是Asn或N；赖氨酸是Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；谷氨酸是Glu或E；半胱氨酸是Cys或C；色氨酸是Trp或W；精氨酸是Arg或R；且甘氨酸是Gly或G。此外，t-Buo是叔丁氧基(bulyloxy)，Bzl是苯甲基，CHA是环己胺，Ac是乙酰基，Me是甲基，Pen是青霉胺，Aib是氨基异丁酸，Nva是正缬氨酸，Abu是氨基丁酸，Thi是噻吩丙氨酸，OBn是O-苯甲基，且hyp是羟脯氨酸。
肽类似物在药物工业中常用作为非肽药物，具有类似于模板肽那些的性质。这些类型的非肽化合物被称为“拟肽(peptidemimetics)”或“肽模拟物”或“模拟肽(peptidomimetics)”(Luthman等人，A Textbook ofDrug Design and Development，14：386-406，第2版，Harwood AcademicPublishers(1996)；Joachim Grante，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，33：1699-1720(1994)；Fauchere，J.，Adv.Drug Res.，15：29(1986)；Veber和Freidinger TINS，第392页(1985)；和Evans等人，J.Med.Chem.30：1229(1987)，所述参考文献引入本文作为参考)。在结构上类似于治疗有用肽的肽模拟物可以用于产生等价或增强的治疗或预防作用。一般地，模拟肽在结构上类似于范例多肽(即，具有生物学或药理学活性的多肽)，例如非天然存在的受体结合多肽，但具有通过本领域已知且在下述参考文献中进一步描述的方法任选用可替代的键替换的一个或多个肽键，所述可替代的键例如--CH2NH--、--CH2S --等，所述文献为：Spatola，A.F.in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，B.Weinstein，编辑，Marcel Dekker，New York，第267页(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(March 1983)，第1卷，Issue 3，Peptide Backbone Modifications(一般综述)；Morley，TrendsPharm.Sci.第463-468页(1980)，(一般综述)；Hudson等人，Int.J.Pept.Prot.Res.，14：177-185(1979)；Spatola等人，Life Sci.，38：1243-1249(1986)；Hann，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，307-314(1982)；Almquist等人，J.Med.Chem.，23：1392-1398，(1980)；Jennings-White等人，Tetrahedron Lett.23：2533(1982)；Szelke等人，European Appln.EP 45665(1982)；Holladay等人，Tetrahedron Lett.，24：4401-4404(1983)；和Hruby，Life Sci.，31：189-199(1982)；所述参考文献各自引入本文作为参考。特别优选的非肽键是-CH2NH--。此类肽模拟物可能具有超过多肽实施方案的显著优点，包括例如：更经济的生产、更大的化学稳定性、增强的药理学性质(半衰期、吸收、效力、功效等)，改变的特异性(例如，广谱生物学活性)，减少的抗原性等。模拟肽的标记通常涉及一种或多种标记直接或通过间隔基(例如，酰胺基)，与模拟肽上的一个或多个非干扰位置共价附着，所述非干扰位置通过定量结构活性数据和/或分子建模来预测。此类非干扰位置一般是不与一种或多种大分子(例如免疫球蛋白超家族分子)形成直接接触的位置，模拟肽与所述大分子结合以产生疗效。模拟肽衍生化(例如，标记)应基本上不干扰模拟肽的所需生物学或药理学活性。一般地，受体结合肽的模拟肽以高亲和力与受体结合，且具有可检测的生物学活性(即，对一种或多种受体介导的表型变化激动或拮抗)。
用相同类型的D-氨基酸系统置换共有序列的一个或多个氨基酸(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可以用于产生更稳定的肽。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列变异的约束肽(constrained peptide)可以通过本领域已知的方法来产生(Rizo等人，Ann.Rev.Biochem.，61：387(1992)，引入本文作为参考)；例如，通过添加能够形成分子内二硫键的内部半胱氨酸残基，所述分子内二硫键使肽环化。
“可检测的标记”指当与本发明的肽化合物共价附着时，允许在肽化合物已对其施用的患者体内检测肽化合物的材料。合适的可检测的标记是本领域众所周知的，且包括例如放射性同位素、荧光标记(例如，荧光素)等。使用的具体可检测的标记不是关键的，且相对于使用的标记量以及在使用的标记量时标记的毒性进行选择。相对于此类因素的标记选择完全在本领域技术内。
可检测的标记与肽化合物的共价附着通过本领域众所周知的常规方法来完成。例如，当125I放射性同位素用作可检测的标记时，125I与肽化合物的共价附着可以通过下述方法来完成：将氨基酸酪氨酸掺入肽化合物内，且随后使肽化合物碘化(参见，例如，Weaner等人，Synthesisand Applications of Isotopically Labelled Compounds，第137-140页(1994))。酪氨酸掺入肽化合物的N或C末端可以通过众所周知的化学作用来完成。同样地，32P可以使用常规化学作用通过例如肽化合物上的羟基，作为磷酸盐部分掺入肽化合物上。
II.概述
本发明提供了与TPO-R结合并激活TPO-R，或以其他方式起TPO激动剂作用的肽化合物。这些肽化合物包括“引导(lead)”肽化合物和“衍生”肽化合物，所述衍生肽化合物如此构建，以便具有与引导肽化合物相同或相似的分子结构或形状，但就对水解或蛋白酶解易感性而言，和/或就其他生物学性质例如对受体的亲和力增加而言，不同于引导肽化合物。本发明还提供了组合物，所述组合物包含有效量的肽化合物，且更具体而言用于治疗血液学病症且特别是与化学疗法、放射疗法、或骨髓输血相关的血小板减少症的肽化合物。
发现核心肽化合物可以包含氨基酸序列：(SEQ ID NO：2)：X9 X8G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7，其中X6可以是β-(2-萘基)丙氨酸，且其中X9是A、C、E、G、I、L、M、P、R、Q、S、T、或V；且X8是A、C、D、E、K、L、Q、R、S、T、或V。更优选地，X9是A或I；且X8是D、E、或K。进一步地X1是C、L、M、P、Q、V；X2是F、K、L、N、Q、R、S、T或V；X3是C、F、I、L、M、R、S、V或W；X4是20种遗传编码的L-氨基酸中的任何一种；X5是A、D、E、G、K、M、Q、R、S、T、V或Y；且X7是C、G、I、K、L、M、N、R或V。
然而，如本文进一步描述的，已发现通过用β-(2-萘基)丙氨酸替换X6，该化合物提供了超过包含β-(1-萘基)丙氨酸的化合物的不同性质。因此，特别优选的肽化合物包括氨基酸序列(SEQ ID NO：7)：I EG P T L R Q(2-Nal)L A A R(Sar)。
在另一个实施方案中，本发明的肽化合物优选是二聚或寡聚的，以增加化合物的亲和力和/或活性。优选二聚的肽化合物的例子包括但不限于，下述；
Figure A20068003761000151
其中X10是肌氨酸或β-丙氨酸残基(SEQ ID NO：7)。应当指出一个X10残基可以是肌氨酸，且另一个残基可以是β-丙氨酸。上文结构也可以由下述表示：(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2。
优选的肽化合物如下：
其中(2-Nal)是β-(2-萘基)丙氨酸且(Sar)是肌氨酸(SEQ ID NO：7)。这种肽化合物在本文中称为“第1号TPO化合物”。
具有超过约100mM的IC50的肽化合物缺乏足够的结合，以允许在本发明的诊断或治疗方面使用。优选地，对于诊断目的，肽化合物具有约2mM或更小的IC50，且对于药学目的，肽化合物具有约100μM或更小的IC50。
图1使用标准相对发光单位测定技术，比较了3个不同批次的第1号TPO化合物与1批现有技术肽化合物的活性。该测定使用被工程改造以稳定表达由fos启动子驱动的人TPO受体和萤光素酶报道分子构建体的鼠细胞。第1号TPO化合物与现有技术肽化合物之间的差异在于：现有技术肽化合物具有β-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)，其中(2-Nal)在第1号TPO化合物上。在图1中第1号TPO化合物被称为2-Nal，且现有技术肽化合物被称为1-Nal(现有技术)。如由图1中所示，活性对于每种化合物是类似的。
图2比较了几个不同批次的聚乙二醇化的第1号TPO化合物(本发明的化合物的聚乙二醇化在下文更详细地描述)的活性。2批聚乙二醇化的现有技术肽化合物都显示了与未聚乙二醇化的现有技术肽化合物的活性水平基本上相同的高活性。剩余的线举例说明了不同批聚乙二醇化的第1号TPO化合物的活性。如由图2所示，在这个模型中，相对于聚乙二醇化的现有技术肽化合物，后者具有较少的活性，在图2中聚乙二醇化的第1号TPO化合物被称为PEG-2-Nal，且聚乙二醇化的现有技术肽化合物被称为PEG-1-Nal(现有技术)。
图3显示了聚乙二醇化的现有技术肽化合物与聚乙二醇化的第1号TPO化合物的相对效力。通过大鼠模型，图3显示在聚乙二醇化的现有技术肽化合物和聚乙二醇化的第1号TPO化合物施用后，血小板计数中的体内变化。如图3所示，最高剂量的聚乙二醇化的第1号TPO化合物具有与最低剂量的聚乙二醇化的现有技术肽化合物相同的活性。较不有效的化合物可以提供对靶细胞较不激烈的刺激，这可以减少由靶细胞过度刺激(overstimulation)引起的副作用危险，例如在后续化学疗法循环后加剧的血小板减少症。在图3中聚乙二醇化的第1号TPO化合物被称为PEG-2-Nal，且聚乙二醇化的现有技术肽化合物被称为PEG-1-Nal(现有技术)。
图4和5显示了在正常小鼠中，聚乙二醇化的现有技术肽化合物和聚乙二醇化的第1号TPO化合物不相上下的剂量应答研究。在图4和5中聚乙二醇化的第1号TPO化合物被称为PEG-2-Nal，且聚乙二醇化的现有技术肽化合物被称为PEG-1-Nal(现有技术)。图4显示了血小板水平中的增加，且图5显示了治疗后六(6)天的平均血小板体积。剂量范围为10-3000ug/kg。2种肽化合物以剂量依赖性方式增加循环血小板的数目，其中对于2种化合物在低至30ug/kg的剂量时，观察到相对于对照组的增加。在最大应答时，这些肽化合物使血小板计数升高至为对照值的最高4倍的水平。关于这些肽化合物的剂量应答曲线是非常相似的，从而指出在这种模型中基于这些终点在2种测试物品之间基本上不存在差异。
IV.肽化合物的制备
A.固相合成
本发明的肽化合物可以通过本领域已知的传统方法进行制备，例如通过使用标准固相技术。标准方法包括全部固相合成、部分固相合成法、片段缩合、传统溶液合成、和甚至通过重组DNA技术。参见，例如，引入本文作为参考的Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149(1963)。在固相上，合成一般使用α-氨基保护的树脂从肽的C末端开始。合适的原材料可以例如，通过使所需α-氨基酸与氯甲基化树脂、羟甲基树脂、或二苯甲基胺树脂附着来制备。一种此类氯甲基化树脂在商品名BIO-BEADS SX-1下由Bio Rad Laboratories，Richmond，CA销售，并且羟甲基树脂的制备由Bodonszky等人，Chem.Ind.(London)，38：1597(1966)描述。二苯甲基胺(BHA)树脂已由Pietta和Marshall，Chem.Commn.，650(1970)描述，且从Beckman Instruments，Inc.，Palo Alto，Calif.以氢氯化物形式商购可得。
因此，本发明的肽化合物可以根据由Gisin，Helv.Chim.Acta.，56：1467(1973)描述的方法，借助于例如碳酸氢铯催化剂，通过使α-氨基保护的氨基酸与氯甲基化树脂偶联来制备。最初偶联后，α-氨基保护基团通过在室温下选择试剂去除，所述试剂包括溶于有机溶剂的三氟乙酸(TFA)或盐酸(HCl)溶液。
α-氨基保护基团是肽分步合成领域中已知有用的那些。包括的是酰基类型的保护基团(例如，甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)，芳族氨基甲酸乙酯类型保护基团(例如，苄氧羰基(benzyloxycarboyl)(Cbz)和取代的Cbz)，脂族氨基甲酸乙酯保护基团(例如，叔丁氧羰基(Boc)、异丙氧羰基(isopropyloxycarbonyl)、环己氧羰基(cyclohexyloxycarbonyl))和烷基类型保护基团(例如，苯甲基、三苯甲基)。Boc和Fmoc是优选的保护基团。侧链保护基团在偶联期间保持完整，且在氨基末端保护基团脱保护期间或偶联期间不分裂。侧链保护基团必须是在最终肽合成完成后且在将不改变靶肽的反应条件下可去除的。
用于Tyr的侧链保护基团包括四氢吡喃基、叔丁基、三苯甲基、苯甲基、Cbz、Z--Br--Cbz、和2，5-二氯苯甲基。用于Asp的侧链保护基团包括苯甲基、2，6-二氯苯甲基、甲基、乙基、和环己基。用于Thr和Ser的侧链保护基团包括乙酰基、苯甲酰基、三苯甲基、四氢吡喃基、苯甲基、2，6-二氯苯甲基、和Cbz。用于Thr和Ser的侧链保护基团是苯甲基。用于Arg的侧链保护基团包括硝基、甲苯磺酰基(Tos)、Cbz、金刚烷氧羰基
Figure A20068003761000181
酰磺酰基(adamantyloxycarbonyl mesitoylsulfonyl)(Mts)、或Boc。用于Lys的侧链保护基团包括Cbz、2-氯苄氧羰基(2-Cl--Cbz)、2-溴苄氧羰基(2-BrCbz)、Tos、或Boc。
去除α-氨基保护基团后，剩余保护的氨基酸以所需顺序逐步偶联。过量的每种保护的氨基酸一般与合适的羰基活化剂例如二环己基碳二亚胺(DCC)一起在溶液中使用，例如在二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基甲酰胺(DMF)混合物中。
所需氨基酸序列已完成后，所需肽通过用试剂例如三氟乙酸或氟化氢(HF)处理与树脂支持体去偶联，所述试剂不仅切开肽与树脂，还切割所有剩余侧链保护基团。当使用氯甲基化树脂时，氟化氢处理导致形成游离肽酸。当使用二苯甲基胺树脂时，氟化氢处理直接导致游离肽酰胺。可替代地，当使用氯甲基化树脂时，侧链保护的肽可以通过用氨处理肽树脂去偶联以产生所需侧链保护的酰胺，或用烷基胺处理以产生侧链保护的烷基酰胺或二烷基酰胺。侧链保护随后以通常方式通过用氟化氢处理来去除，以产生游离酰胺、烷基酰胺、或二烷基酰胺。
这些固相肽合成程序是本领域众所周知的，且由John MorrowStewart和Janis Dillaha Young，Solid Phase Peptide Syntheses(第2版，Pierce Chemical Company，1984)进一步描述。
B.合成氨基酸
这些程序也可以用于合成其中除20种天然存在的、遗传编码的氨基酸外的氨基酸在任何本发明的化合物的1、2或更多位置上被取代的肽。
人们可将20种遗传编码的氨基酸(或D氨基酸)的天然存在的侧链替换为其他侧链，例如基团，例如烷基，低级烷基，环4-、5-、6-至7-员烷基，酰胺，酰胺低级烷基，酰胺二(低级烷基)，低级烷氧基，羟基，羧基及其低级酯衍生物，以及4-、5-、6-至7-员杂环。具体地，可以使用其中脯氨酸残基的环大小从5员变成4、6、或7员的脯氨酸类似物。环状基团可以是饱和或不饱和的，并且如果是不饱和的，则可以是芳族或非芳族的。杂环基团优选包含一个或多个氮、氧、和/或硫杂原子。此类基团的例子包括呋吖基(furazanyl)、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基(例如吗啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如1-哌嗪基)、哌啶基(例如1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如硫代吗啉代)、和三唑基。这些杂环基团可以是取代或未取代的。当基团是取代的时，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧、或取代或未取代的苯基。
通过磷酸化(参见，例如，W.Bannwarth等人，Biorganic andMedicinal Chemistry Letters，6(17)：2141-2146(1996))可以容易地修饰本发明的肽，并且用于制备本发明化合物的肽衍生物的其他方法在Hruby等人，Biochem.J.，268(2)：249-262(1990)中描述。因此，本发明的肽化合物也可用作基础以制备具有类似生物学活性的肽模拟物。
C.末端修饰
本领域技术人员认识到多种技术可用于构建具有与相应的肽化合物相同或相似所需生物学活性，但就溶解性、稳定性、以及对水解和蛋白酶解的易感性而言，具有比肽化合物更有利的活性的肽化合物。参见，例如，Morgan等人，Ann.Rep.Med.Chem.，24：243-252(1989)。下文描述了用于制备在N末端氨基、C末端羧基上修饰的肽化合物，和/或使肽中的一个或多个酰氨键变成非酰氨键的方法。应当理解2个或更多此类修饰可以在1种肽化合物结构中偶联(例如，在C末端羧基上的修饰以及包括在肽化合物中的2个氨基酸之间的-CH2-氨基甲酸酯键)。
1.N末端修饰
肽化合物一般合成为游离酸，但如上所述，可以容易地制备为酰胺或酯。还可以修饰本发明的肽化合物的氨基和/或羧基末端，以产生本发明的其他化合物。氨基末端修饰包括甲基化、乙酰化、添加苄氧羰基、或用包含由RCOO--限定的羧化物功能性的任何封闭基团来封闭氨基末端，其中R选自萘基、吖啶基、类固醇基(steroidyl)和类似基团。羧基末端修饰包括用氨甲酰基团替换游离酸，或在羧基末端上形成环状内酰胺以引入结构约束。
氨基末端修饰如上所述，且包括烷基化、乙酰化、添加羧苯甲酰(carbobenzoyl)、形成琥珀酰亚胺基等。(参见，例如，Murray等人，Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery，第5版，第1卷，Manfred E.Wolf，编辑，John Wiley and Sons，Inc.(1995)。)具体而言，N末端氨基随后可以如下反应：
(a)通过与酸性卤化物或对称酐反应以形成式RC(O)NH--的酰胺基，其中R如上定义。一般地，该反应可以通过使约等摩尔或过量(例如，约5当量)酸性卤化物与肽在惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中接触来进行，所述惰性稀释剂优选包含过量(例如，约10当量)叔胺，例如二异丙基乙胺，以清除反应期间产生的酸。反应条件在其他方面是常规的(例如，室温30分钟)。使末端氨基烷基化以提供低级烷基N-取代随后如上所述与酸性卤化物反应，将提供式RC(O)NR--的N-烷基酰胺基；
(b)通过与琥珀酐反应以形成琥珀酰亚胺基。如先前一样，可以使用约等摩尔量或过量琥珀酐(例如，约5当量)，且通过本领域众所周知的方法使氨基转变成琥珀酰亚胺，所述方法包括使用在合适的惰性溶剂(例如，二氯甲烷)中的过量(例如，10当量)叔胺，例如二异丙基乙胺。参见，例如，整体引入本文作为参考的Wollenberg等人，美国专利号4,612,132。应当理解琥珀酸基团可以用例如烷基或--SR取代基来取代，所述--SR取代基以常规方式进行制备，以提供在肽的N末端上的取代的琥珀酰亚胺。此类烷基取代基通过使低级烯烃与马来酐以Wollenberg等人同上描述的方式反应来制备，且--SR取代基通过使RSH与马来酐反应来制备，其中R如上定义；
(c)通过与约等量或过量CBZ--Cl(即，苄氧羰基氯)或取代的CBZ--Cl在合适的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应，以形成苄氧羰基-NH--或取代的苄氧羰基-NH--基团，所述惰性稀释剂优选包含叔胺，以清除反应期间产生的酸；
(d)通过与等量或过量(例如，5当量)R--S(O)2 Cl在合适的惰性稀释剂(二氯甲烷)中反应，使末端胺转变成氨磺酰，以形成氨磺酰基团，其中R如上定义。优选地，惰性稀释剂包含过量叔胺(例如，10当量)，例如二异丙基乙胺，以清除反应期间产生的酸。反应条件在其他方面是常规的(例如，室温30分钟)；
(e)通过与等量或过量(例如，5当量)R--OC(O)Cl或R--OC(O)OC6H4-p-NO2在合适的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应，使末端胺转变成氨基甲酸酯，以形成氨基甲酸酯基团，其中R如上定义。优选地，惰性稀释剂包含过量(例如，约10当量)叔胺，例如二异丙基乙胺，以清除反应期间产生的任何酸。反应条件在其他方面是常规的(例如，室温30分钟)；和
(f)通过与等量或过量(例如，5当量)R-N＝C＝O在合适的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应，使末端胺转变成尿素(即，RNHC(O)NH--)基团，以形成尿素基团，其中R如上定义。优选地，惰性稀释剂包含过量(例如，约10当量)叔胺，例如二异丙基乙胺。反应条件在其他方面是常规的(例如，室温约30分钟)。
2.C末端修饰
在其中C末端羧基替换为酯(即--C(O)OR，其中R如上定义)的肽化合物制备中，使用用于制备肽酸的树脂，且侧链保护的肽用碱和合适的醇例如甲醇进行切割。侧链保护基团随后以通常方式通过用氟化氢处理来去除，以获得所需酯。
在其中C末端羧基替换为酰胺--C(O)NR3 R4的肽化合物制备中，使用二苯甲基胺树脂作为用于肽合成的固体支持体。合成完成后，氟化氢处理从支持体释放肽直接导致游离肽酰胺(即，C末端是--C(O)NH2)。可替代地，使用在肽合成期间偶联有与氨的反应的氯甲基化树脂以从支持体切割侧链保护的肽产生游离肽酰胺，且与烷基胺或二烷基胺的反应产生侧链保护的烷基酰胺或二烷基酰胺(即，C末端是--C(O)NRR1，其中R和R1如上定义)。侧链保护随后以通常方式通过用氟化氢处理来去除，以产生游离酰胺、烷基酰胺、或二烷基酰胺。
还可以使本发明的肽化合物环化，或在肽化合物末端上掺入脱氨或脱羧(descarboxy)残基，从而使得不存在末端氨基或羧基，以减少对蛋白酶的易感性或限制肽化合物的构象。本发明的肽化合物的C末端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、和羧基，及其低级酯衍生物，以及其药学可接受的盐。
除了前述N末端和C末端修饰外，本发明的肽化合物包括模拟肽，可以有利地用多种亲水聚合物中的一种或多种进行修饰，或与多种亲水聚合物中的一种或多种共价偶联。已发现当肽化合物用亲水聚合物衍生化时，它们的溶解性和循环半衰期增加并且它们的免疫原性被掩盖。前述可以在其结合活性中的少许减少(若有的话)的同时完成。适合于依照本发明使用的非蛋白质聚合物包括但不限于，如由聚乙二醇和聚丙二醇例示的聚烷基醚、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素和纤维素衍生物、葡聚糖和葡聚糖衍生物等。一般地，此类亲水聚合物具有约500-约100,000道尔顿的平均分子量，更优选约2,000-约40,000道尔顿，且甚至更加优选约5,000-约20,000道尔顿。在优选实施方案中，此类亲水聚合物具有约5,000道尔顿、10,000道尔顿和20,000道尔顿的平均分子量。
本发明的肽化合物可以使用下述参考文献中所述的任何方法用此类聚合物衍生化或与其偶联：Zallipsky，S.，Bioconjugate Chem.，6：150-165(1995)；Monfardini，C等人，Bioconjugate Chem.，6：62-69(1995)；美国专利号4,640,835；美国专利号4,496,689；美国专利号4,301,144；美国专利号4,670,417；美国专利号4,791,192；美国专利号4,1 79,337或WO 95/34326，所有这些参考文献整体引入本文作为参考。
在目前优选的实施方案中，本发明的肽化合物用聚乙二醇(PEG)衍生化。PEG是环氧乙烷重复单位的线形、水溶性聚合物，具有2个末端羟基。PEGs通过其分子量进行分类，所述分子量一般为约500道尔顿-约40,000道尔顿。在目前优选的实施方案中，使用的PEGs具有5,000道尔顿-约20,000道尔顿的分子量。与本发明的肽化合物偶联的PEGs可以是分支或未分支的。(参见，例如，Monfardini，C.等人，Bioconjugate Chem.，6：62-69(1995))。PEGs从Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Ala.)(现在是Nektar Therapeutics(San Carlo，CA)，Sigma Chemical Co.的部分及其他公司商购可得。此类PEGs包括但不限于，单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(tresylate)(MePEG-TRES)、和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
简言之，在一个实施方案中，使用的亲水聚合物例如PEG优选在一个末端上由非活性基团例如甲氧基或乙氧基进行加帽。其后，聚合物在另一个末端上通过与合适的活化剂反应来活化，所述活化剂例如氰尿酰卤(例如，氰尿酰氯、溴或氟)、diimadozle、酐试剂(例如，二卤琥珀酐、例如二溴琥珀酐)、酰叠氮、对重氮苯甲基醚(p-diazoiumbenzylether)、3-(对重氮苯氧基)-2-羟丙基醚)等。活化的聚合物随后与本发明的肽化合物反应以产生用聚合物衍生的肽化合物。可替代地，本发明的肽化合物中的官能团可以进行活化以与聚合物反应，或2个基团可以使用已知的偶联方法在协同的偶联反应中进行连接。将容易理解本发明的肽化合物可以使用本领域技术人员已知且使用的众多其他反应方案用PEG衍生化。
当肽化合物用亲水聚合物衍生化时，它们的溶解性和循环半衰期增加并且它们的免疫原性减少。前述可以在结合活性中的少许损失(若有的话)的同时完成。在优选实施方案中，衍生的肽具有未修饰肽那种的0.1-0.01倍的活性。在更优选的实施方案中，衍生的肽具有未修饰肽那种的0.1-1倍的活性。在更加优选的实施方案中，衍生的肽具有大于未修饰肽的活性。
D.主链修饰
用于制备本发明化合物的肽衍生物的其他方法在Hruby等人，Biochem J.，268(2)：249-262(1990)中描述，所述参考文献引入本文作为参考。因此，本发明的肽化合物也充当关于具有类似生物学活性的非肽化合物的结构模型。本领域技术人员认识到多种技术可用于构建具有与引导肽化合物相同或相似所需生物学活性，但就溶解性、稳定性、以及对水解和蛋白酶解的易感性而言，具有比引导更有利的活性的化合物。参见，引入本文作为参考的Morgan等人，Ann.Rep.Med.Chem.，24：243-252(1989)。这些技术包括用由下述物质组成的主链替换肽主链：膦酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、氨磺酰、仲胺、和N-甲基氨基酸。
合适的试剂包括例如，其中氨基酸的羧基已用适合于形成上述键之一的部分替换的氨基酸类似物。
类似地，用膦酸酯键替换肽中的酰胺键可以以美国专利号5,359,115和5,420,328中所述方式来完成，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考。
E.二硫键形成
本发明的化合物可以以环化形式存在，在掺入的半胱氨酸(若存在的话)的巯基之间具有分子内二硫键。可替代地，可以产生半胱氨酸巯基之间的分子间二硫键，以产生二聚(或更高的寡聚)化合物。一个或多个半胱氨酸残基也可以用高半胱氨酸置换。
V.效用
本发明的肽化合物在体外可用作用于理解TPO生物学作用的独特工具，包括被认为影响TPO生产和受体结合过程，或受TPO生产和受体结合过程影响的许多因素的评估。本发明的肽化合物也可用于开发与TPO-R结合且激活TPO-R的其他化合物，因为本发明的肽化合物提供了应促进此类开发的关于结构和活性之间关系的重要信息。
肽化合物也可在筛选新TPO受体激动剂的测定中用作竞争结合剂。在此类测定实施方案中，本发明的肽化合物可以不含修饰而使用，或可以以多种方式进行修饰；例如通过标记，例如共价或非共价连接直接或间接提供可检测信号的部分。在这些测定的任何一种中，材料另外可以直接或间接进行标记。关于直接标记的可能性包括标记基团例如：放射性标记例如125 I，酶(美国专利号3,645,090)例如过氧化物酶和碱性磷酸酶，以及能够监控荧光强度、波长移动或荧光偏振中的变化的荧光标记(美国专利号3,940,475)。关于间接标记的可能性包括使一个组成成分生物素化，随后结合与上述标记基团之一偶联的抗生物素蛋白。在其中肽化合物将与固体支持体附着的情况下，肽化合物还可以包括间隔基或接头。
此外，基于其与TPO受体结合的能力，本发明的肽化合物可以用作试剂用于检测活细胞、固定细胞上、生物学流体、组织匀浆、纯化的天然生物材料等中的TPO受体。例如，通过标记此类肽化合物，人们可以鉴定在其表面上具有TPO-R的细胞。此外，基于其结合TPO受体的能力，本发明的肽化合物可以用于原位染色、FACS(荧光激活细胞分选)、蛋白质印迹、ELISA等。此外，基于其与TPO受体结合的能力，本发明的肽化合物可以用于受体纯化、或在细胞表面上(或透化的细胞内)表达TPO受体的细胞纯化。
本发明的肽化合物也可以用作商业试剂用于各种医学研究和诊断用途。此类用途包括但不限于：(1)作为校准标准用于在多种功能测定中定量候选TPO激动剂的活性的用途；(2)维持TPO依赖性细胞系增殖和生长的用途；(3)通过共结晶在TPO受体结构分析中的用途；(4)研究TPO信号转导/受体活化机制的用途；和(5)其中TPO受体优选活化，或此类活化针对已知量TPO激动剂方便地校准的其他研究和诊断应用，等。
本发明的肽化合物可以与另外的细胞因子结合或独立地用于体外扩张巨核细胞及其定型祖先。参见，例如，引入本文作为参考的DiGiusto等人，PCT公开号95/05843。化学疗法和放射疗法通过杀死快速分裂、更成熟的巨核细胞群体引起血小板减少症。然而，这些治疗处理也可以减少未成熟的、较低有丝分裂活性的巨核细胞前体细胞的数目和生存力。因此，通过TPO或本发明的肽化合物改善血小板减少症可以通过在化学疗法或放射疗法后给患者输注患者自身细胞群体得到加速，所述患者自身细胞通过体外培养富含巨核细胞和未成熟的前体。
本发明的肽化合物也可以施用于温血动物包括人，以活化体内的TPO-R。因此，本发明包含了用于TPO相关病症的治疗处理方法，所述方法包括施用本发明的肽化合物，其量足以模拟TPO在体内对TPO-R的作用。例如，可以施用本发明的肽化合物以治疗多种血液学病症，包括但不限于，血小板病症和血小板减少症，特别是当与骨髓输血、放射疗法、和化学疗法相关时。
在本发明的一些实施方案中，优选首先给经历化学疗法或放射疗法的患者施用TPO拮抗剂，随后施用本发明的TPO激动剂。
本发明的肽化合物的活性可以在体外或体内，在McDonald，Am.J.ofPediatric Hematology/Oncology，14：8-21(1992)描述的众多模型之一中进行评估，所述参考文献引入本文作为参考。
根据一个实施方案，本发明的组合物用于治疗与骨髓输血、放射疗法、或化学疗法相关的血小板减少症。肽化合物一般将在化学疗法、放射疗法、或骨髓移植前或在此类暴露后预防地施用。
因此，本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含与药学载体或稀释剂结合的，作为活性成分的至少一种本发明的肽化合物。本发明的肽化合物可以经口、肺、肠胃外(parental)(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(经由细粉制剂)、经皮、鼻、阴道、直肠、或舌下施用途径进行施用，且可以配制为适合于每种施用途径的剂型。参见，例如，Bernstein等人，PCT专利公开号WO 93/25221；Pitt等人，PCT专利公开号WO 94/17784；和Pitt等人，欧洲专利申请613,683，所述专利各自引入本文作为参考。
用于经口施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末、和颗粒。在此种固体剂型中，活性肽化合物与至少一种惰性药学可接受的载体例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。如在通常实践中一样，此种剂型还可以包含除惰性稀释剂外的其他物质，例如润滑剂例如硬脂酸镁。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。片剂和丸剂可以另外用肠溶衣制备。
用于经口施用的液体剂型包括药学可接受的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆、与包含本领域中常用的惰性稀释剂例如水的酏剂。除了此类惰性稀释剂之外，组合物还可以包括佐剂，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、以及甜味剂、调味剂和芳香剂。
根据本发明用于肠胃外(parental)施用的制剂包括无菌含水或非含水溶液、悬浮液或乳剂。非含水溶剂或载体的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和玉米油、明胶、和可注射的有机酯例如油酸乙酯。此类剂型还可以包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂、和分散剂。它们可以通过下述方法进行灭菌：例如经由细菌保留滤器过滤、将灭菌剂掺入组合物内、照射组合物、或加热组合物。它们还可以紧在使用前使用无菌水，或一些无菌可注射介质进行制备。
用于直肠或阴道施用的组合物优选是栓剂，所述栓剂除了活性物质外还可以包含赋形剂，例如可可脂或栓剂蜡。用于鼻或舌下施用的组合物也可以用本领域众所周知的标准赋形剂进行制备。
可以施用包含肽化合物的组合物用于预防和/或治疗处理。在治疗应用中，组合物如上所述给已患有疾病的患者施用，其量足以治愈或至少部分阻止疾病及其并发症的症状。足以达到这点的量被定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量将取决于疾病的严重性以及患者的重量和一般状态。
本发明的组合物也可以通过例如Tice和Bibi(在Treatise onControlled Drug Delivery中，编辑A.Kydonieus，Marcel Dekker，New York(1992)，第315-339页)的方法微囊化。
在预防应用中，包含本发明的肽化合物的组合物施用于对特定疾病易感，或在其他方面处于特定疾病危险中的患者。此种量被定义为“预防有效剂量”。在这种用途中，精确量再次取决于患者的健康状态和重量。
对于有效治疗所需的肽化合物量将取决于许多不同因素，包括施用方式、靶位点、患者的生理学状态、以及施用的其他药物(medicant)。因此，治疗剂量应当被滴定(titrate)以使安全性和功效最优化。一般地，体外使用的剂量可以在这些试剂原位施用中有用的量方面提供有用的指导。关于治疗具体病症的有效剂量的动物试验将提供人剂量的进一步推测性指标。各种考虑在下述参考文献中描述，例如Gilman等人，(编辑)，Goodman和Gilman′s：The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第8版，Pergamon Press(1990)；以及Remington′sPharmaceutical Sciences，第7版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1985)；所述参考文献各自在此引入作为参考。
当以约0.001mg-约10mg/kg体重/天的剂量范围施用时，本发明的肽化合物在TPO介导的状况治疗中有效。采用的具体剂量由待治疗的具体状况、施用途径以及由主治临床医生取决于下述因素的判断来调节：例如病状严重性、患者的年龄和一般状况等。
实施例1
固相肽化合物合成
本发明的肽化合物可以例如，使用Merrifield固相合成技术(参见Steward和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical，Rockford，Ill.(1984)以及Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149(1963))或Applied Biosystems Inc.Model 431A或433A肽合成仪进行合成。肽化合物可以使用Applied Biosystems Inc.Synth AssistTM 1.0.0或SynthAssistTM 2.0.2的标准规程进行装配。每种偶联可以进行2x30分钟，使用HBTU(2-(1H-苯并三唑(benzatriazol)-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯)和HOBt(1-羟基苯并三唑)。
使用的树脂可以是HMP树脂(对羟甲基苯氧甲基)聚苯乙烯树脂或PAL(Milligen/Biosearch)，所述PAL是用5-(4′-Fmoc-氨基甲基-3，5′-二甲氧基苯氧基)戊酸作为接头的交联聚苯乙烯树脂。PAL树脂的使用在肽与树脂切开后导致羧基末端酰胺功能性。切割后，HMP树脂产生在终产物C末端上的羧酸部分。大多数试剂、树脂、和保护的氨基酸(游离或在树脂上)可以购自Millipore或Applied Biosystems Inc.。
在偶联程序期间Fmoc基团可以用于氨基保护。氨基酸上的伯胺保护可以用Fmoc来完成，并且可以使用侧链保护基团，例如用于丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、和苏氨酸的叔丁基；用于谷氨酰胺的三苯甲基；用于精氨酸的Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰)；用于色氨酸的N-叔丁氧羟基；用于组氨酸的N-三苯甲基和用于半胱氨酸的S-三苯甲基。
从树脂中取出肽化合物和同时使侧链功能脱保护可以通过用试剂K处理或其轻微修饰来完成。可替代地，在具有酰胺化羧基末端的那些肽的合成中，完全装配的肽可以用90％三氟乙酸、5％乙二硫醇(ethanedithiol)、和5％水的混合物进行切割，起初于4℃，并逐渐增至室温。脱保护的肽化合物可以用二乙醚进行沉淀。纯化可以是通过制备型、反相、高效液相层析在C18键合硅胶柱上，使用溶于0.1％三氟乙酸的乙腈/水梯度。均质肽化合物可以通过可应用时的快原子轰击质谱法，或电雾化质谱法和氨基酸分析来表征。
在优选实施方案中，本发明的肽化合物使用本领域技术人员已知且使用的标准合成程序进行二聚化。根据这些合成方案，本领域技术人员可以容易地制备依照本发明的二聚物肽化合物。此外，对于本领域技术人员显而易见的是，二聚亚单位可以使用已知方法和接头容易地进行连接。
实施例2
肽化合物的聚乙二醇化
本发明的肽化合物的聚乙二醇化可以通过众所周知的技术来进行。例如，本发明的肽化合物可以以10mg/ml的浓度溶解于100mM N-二(羟乙基)甘氨酸pH 8.0中，加入1.25倍摩尔过量的粉末状PEG2(从Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Ala.，现在的Nektar Therapeutics(San Carlo，CA)商购可得)中，且于室温搅动直至反应完全，一般为1-2小时。反应通过反相HPLC来监控，使用40-65％乙腈梯度使用YMC ODS AQ柱。当反应完成时，将溶液加入第二份1.25摩尔过量的粉末状PEG2中，且使过程重复4次，对于每摩尔多肽使用总共5摩尔PEG2。溶液用PBS稀释2倍以减少粘度，且装载到先前进行平衡的superdex 200柱(Pharmacia)上，并且用PBS进行洗脱。来自大小排阻柱的级分可以通过反相HPLC进行分析。在任何单-PEG肽化合物之前洗脱、包含二-PEG-多肽的级分可以进行合并，且贮存于5℃或冻干。
实施例3
关于TPO聚乙二醇化的第1号化合物的血小板生成活性的临床前 动物研究
第1号TPO化合物与内源TPO没有共享任何序列同源性，从而减轻了形成与内源TPO交叉反应的抗体的危险。第1号TPO化合物进行聚乙二醇化，以减少清除率且进一步减少抗原性。这个实施例描述了关于聚乙二醇化的第1号TPO化合物在动物中的血小板生成活性的临床前研究。
正常雄性Wistar大鼠(来源)用于该研究。其他动物例如狗、小鼠、猴等也可以用于临床前研究。所有涉及动物的程序都在由美国实验室动物管理评估和授权管理协会(American Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care)(AAALAC)完全授权的动物实验室中，且依照The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH)来进行。
正常雄性Wistar大鼠(在给药时年龄10周，体重范围230-367克)用单次静脉内剂量的第1号TPO化合物以30、100或300ug/kg进行处理(40只大鼠/组)。在给药前，给药后96、144、192、240、288和312小时时，通过穿刺未麻醉的大鼠(5只大鼠/时间点，EDTA作为抗凝剂)颈静脉收集约0.5mL血液，且使用自动化血液学分析系统评估血小板计数。在每次样品收集前动物禁食过夜，可获得水。
通过在第4天时的最早给药后评估，单次静脉内剂量的聚乙二醇化第1号TPO化合物(30、100或300μg/kg)导致正常雄性Wistar大鼠中的外周血小板计数增加(图6)。在2周随访期间，血小板计数每2天进行评估且与给药前计数进行比较。300μg/kg剂量诱导血小板计数最大的增加，这在第14天时回到基线。
实施例4
关于聚乙二醇化的第1号TPO化合物的血小板生成活性的I期临床 研究
进行I期研究以研究聚乙二醇化的第1号TPO化合物的耐受性、药物动力学和药物代谢动力学。这个实施例描述了在健康男性志愿者中单次静脉内注射后对聚乙二醇化的第1号TPO化合物的I期研究。在多次静脉内注射或其他施用方式和/或给需要治疗的患者后，关于聚乙二醇化的第1号TPO化合物以及根据本发明的其他化合物的I期研究，可以使用本领域技术人员已知的规程来进行。
40名志愿者以6∶2的比率随机接受作为静脉内快速灌注(single i.v.bolus)的聚乙二醇化的第1号TPO化合物或安慰剂。8名受试者以6∶2的比率随机接受单次注射的聚乙二醇化的第1号TPO化合物或安慰剂，其剂量范围为0.375、0.75、1.5、2.25或3μg/kg。聚乙二醇化的第1号TPO化合物的药物动力学应答测量为血小板计数中的升高。聚乙二醇化的第1号TPO化合物水平在缺乏血小板的血浆中使用验证的酶联免疫吸附测定进行测定。内源TPO、EPO、IL-6和IL-11水平在指定时间点使用标准免疫测定进行测量。生物传感器免疫测定(BiaCoretechnology)用于测量针对聚乙二醇化的第1号TPO化合物的肽部分的抗体形成。在聚乙二醇化的第1号TPO化合物施用后4小时和12天时，对血小板功能的作用通过监控胶原诱导的血小板聚集进行测量。
PK分析指出聚乙二醇化的第1号TPO化合物的剂量相关动力学，尽管在0.75μg/kg或更低剂量时，聚乙二醇化的第1号TPO化合物的血浆浓度一般低于6.25ng/mL的定量极限(图7)。0.375μg/kg剂量组中的4名受试者和3.0μg/kg聚乙二醇化的第1号TPO化合物剂量组中的1名受试者没有可以定量的血浆水平。平均Cmax值为0.75μg/kg聚乙二醇化的第1号TPO化合物时的10.9ng/mL至3.0μg/kg聚乙二醇化的第1号TPO化合物时的61.7ng/mL(表1)。在0.375μg/kg静脉内的第1号TPO化合物时不可测量到PK数据。聚乙二醇化的第1号TPO化合物的平均最终半衰期为约18-36小时。中值tmax为0.09-2小时。Cmax伴随渐增剂量的增加是近似与剂量成比例的，但在用渐增剂量的标准化AUC0-24值中存在明显增加，从而暗示高于与剂量成比例的增加。
表1.PK分析概括
Figure A20068003761000311
针对聚乙二醇化的第1号TPO化合物施用的血小板应答类似于关于rhTPO和AMG531的公开结果。血小板计数剂量依赖性增加，在第10-12天时达到峰水平，并且计数在3-4周内回到基线(图8)。平均峰血小板计数为0.375μg/kg静脉内时315x109/L至3μg/kg静脉内时685x109/L，且从基线增加的平均最大血小板计数为0.375μg/kg时的1.4倍至3.0μg/kg时的3.2倍(表2)。在接受0.75ug/kg剂量的聚乙二醇化的第1号TPO化合物的6名受试者中的4名中，观察到血小板至少50％的增加，而在接受1.5ug/kg剂量的6名受试者中的3名中观察到血小板计数至少2倍的增加，等。0.75ug/kg静脉内剂量已选择为用于II期临床研究的起始剂量。
除血小板计数中的变化外，其他成熟的循环血细胞不受影响(数据未显示)。此外，在施用时、给药后12天时、新产生的血小板出现时，聚乙二醇化的第1号TPO化合物的施用都不影响血小板功能。
表2.血小板计数分析概括
  聚乙二醇化的第1号TPO化合物   0(μg/kg)   0.375(μg/kg)   0.75(μg/kg)   1.5(μg/kg)   2.25(μg/kg)   3.0(μg/kg)
  N   10   6   6   6   6   6
  n(＞1.5x)   0   3   3   4   4   5
  n(＞2x)   0   0   1   3   4   5
  n(＞3x)   0   0   0   0   0   4
  n(＞4x)   0   0   0   0   0   1
  Plt0(109/L)1)   192/203(163-233)   223/205(159-304)   212/212(155-264)   228/230(200-258)   215/203(193-261)   208/200(150-284)
  Pltmax(109/L)1)   230/225(189-271)   315/309(214-482)   347/335(232-495)   430/458(238-597)   454/500(254-576)   685/750(188-979)
  Pltmax/Plt0 1)   1.14/1.13(1.04-1.38)   1.42/1.42(1.08-1.81)   1.63/1.63(1.15-2.12)   1.91/2.13(1.01-2.59)   2.15/2.33(1.28-2.98)   3.21/3.50(1.25-4.52)
评估了聚乙二醇化的第1号TPO化合物施用对已知具有血小板生成活性的生长因子的作用。内源TPO水平剂量依赖性地增加，在给药后3天时达到峰水平(图9)。在IL-6、IL-11和EPO水平的血液水平中没有观察到显著变化。
作为全血中胶原诱导的血小板聚集评估的血小板功能在处理之间没有不同。没有一名受试者经历严重的不利事件或剂量限制毒性。最常观察到的不利事件包括轻微头痛和疲劳，且在积极治疗和安慰剂后都出现。没有检测到针对聚乙二醇化的第1号TPO化合物的抗体。这些结果指出聚乙二醇化的第1号TPO化合物在测试的剂量范围时是良好耐受的。
尽管上文只具体描述了本发明的优选实施方案，但将理解在不背离本发明的精神和预期范围的情况下，本发明的修饰和变化是可能的。

Claims (30)

1.一种用于治疗患有对血小板生成素激动剂疗法易感的病症的患者的方法，其包括给所述患者施用治疗有效剂量或量的肽化合物，所述肽化合物包括下述序列：(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)-K(NH2)-(X10RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H，(SEQ ID NO：7)，其中X10是肌氨酸。
2.权利要求1的方法，其中所述肽化合物以约0.1-约5mg/kg的剂量范围施用。
3.权利要求1的方法，其中所述肽化合物分别以约0.375、0.75、1.5、2.25或3mg/kg的剂量范围施用。
4.权利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用在约0.75μg/kg肽化合物时导致约10ng/mL的平均Cmax值。
5.权利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用在约3.0μg/kg肽化合物时导致约60ng/mL的平均Cmax值。
6.权利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用导致约18小时-约36小时的所述肽化合物平均最终半衰期。
7.权利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用导致约0.09小时-约2小时的中值tmax。
8.权利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用在约0.75ug/kg剂量时导致血小板计数约50％的增加。
9.权利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用在大于约0.75ug/kg剂量时导致血小板计数约2倍的增加。
10.权利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用导致内源TPO水平增加。
11.权利要求1的方法，其中所述肽化合物与亲水聚合物共价附着。
12.权利要求11的方法，其中所述亲水聚合物具有约500-约40,000道尔顿的平均分子量。
13.权利要求12的方法，其中所述亲水聚合物具有约5,000-约20,000道尔顿的平均分子量。
14.权利要求11的方法，其中所述亲水聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸和聚乙醇酸。
15.权利要求14的方法，其中所述亲水聚合物是聚乙二醇。
16.权利要求1的方法，其中所述肽化合物是二聚的。
17.权利要求16的方法，其中所述肽化合物的每个所述二聚亚单位与亲水聚合物共价附着。
18.权利要求17的方法，其中所述亲水聚合物是聚乙二醇。
19.权利要求18的方法，其中所述聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
20.权利要求1的方法，其中所述肽化合物具有下式：
Figure A20068003761000031
其中(2-Nal)是β-(2-萘基)丙氨酸且(Sar)是肌氨酸。
21.权利要求20的方法，其中所述肽化合物与亲水聚合物共价附着。
22.权利要求21的肽化合物，其中所述亲水聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸和聚乙醇酸。
23.权利要求22的肽化合物，其中所述亲水聚合物是聚乙二醇。
24.权利要求23的肽化合物，其中所述聚乙二醇具有约5,000-约20,000道尔顿的平均分子量。
25.权利要求23的肽化合物，其中所述聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
26.权利要求21的肽化合物，其中所述肽化合物的每个所述二聚亚单位与亲水聚合物共价附着。
27.权利要求26的肽化合物，其中所述亲水聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸和聚乙醇酸。
28.权利要求27的肽化合物，其中所述亲水聚合物是聚乙二醇。
29.权利要求28的肽化合物，其中所述聚乙二醇具有约5,000-约20,000道尔顿的平均分子量。
30.权利要求28的肽化合物，其中所述聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
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