BRPI0613146B1 - Uso terapêutico de inibidores de src quinase. - Google Patents

Abstract

inibição de lesões osteolíticas por inibidores de src quinase. a presente invenção incluí métodos e composições para tratar doenças de reabsorção óssea ou reabsorção óssea relacionada a uma condição patológica incluindo, geralmente, mas sem limitação, osteoporose, artrite, artrite reumatôlde, metástase de câncer para o osso, câncer ósseo, hipercalcemia, lesões osteolíticas com implantes ortopédicos, doença de paget, e perda óssea associada ao hiperparatiroidismo. cânceres representativos incluem, mas sem limitação, câncer da mama, câncer da próstata, câncer do cólon, câncer do endométrio, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais, doença de heck, cânceres do pescoço e da cabeça, e carcinoma cervical. condições artríticas incluem, mas sem limitação, artrite induzida por adjuvante, colágeno, bactéria e antígeno, particularmente artrite reumatóide.

Description

[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório US 60/691.933 depositado em 17 de junho de 2005, que é aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO I. CAMPO DA INVENÇÃO

[002]A presente invenção refere-se, genericamente, ao campo da biologia celular, fisiologia celular, medicina e oncologia. Mais particularmente, refere-se a métodos para regular osteoclastogênese em um paciente que necessite destes, e, particularmente, osteoclastogênese relacionada à destruição de osso induzida por câncer.

II. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[003] Câncer da mama é a malignidade feminina mais comum nos E.U.A e a segunda causa principal de morte por câncer em mulheres. Mulheres com câncer da mama estão em risco de metástases ósseas. 5 a 10% dos pacientes com câncer da mama apresentarão inicialmente doença metastática no osso. Pacientes com doença óssea osteolítica de câncer da mama metastátici. Pacientes com doença óssea osteolítica do câncer da mama metastático estão em risco aumentado de fraturas patológicas, dor óssea, compressão da medula e hipercalcemia. O padrão corrente de cuidado para tratar metástases ósseas é terapia com bifosfonato, que retarda eventos esqueléticos, mas não as previne. Além disso, nem todos os pacientes respondem a este tratamento. Embora seja desejado um tratamento mais eficaz, é requerida uma adicional dissecção molecular dessa doença. O ativador de receptor de NK-KB (RANK) e seu ligante (RANKL, também conhecido como TRANCE/ODF/OPGL) são mediadores essenciais da osteoclastogênese e têm sido implicados em várias doenças, que incluem artrite reumatóide, osteoporose, tumor de células gigantes, doença de Paget, câncer da mama e da próstata metastáticos, mieloma múltiplo, e osteólise. Osteoprotegerina (OPG, também conhecida como OCIF/TR1) é um receptor agudo que inibe RANKL de se ligar ao seu receptor de superfície celular RANK.

[004] Modelos de camundongo de nocaute de RANKL, RANK, e OPG têm demonstrado um papel essencial destas moléculas na osteoclastogênese (i.e., re- modelagem do osso). A importância dessas moléculas é enfatizada pela indução de osteoporose grave por ruptura alvejada da OPG e pela indução de osteoporose por ruptura alvejada de RANKL ou por superexpressão de OPG. Assim, a formação de osteoclastos pode ser atribuída à razão relativa de RANKL para OPG no microambi- ente da medula óssea, e alterações neste balanço podem ser a causa principal da perda óssea em muitos distúrbios ósseos metabólicos. Similar a RANKL-/- camundongos, a ruptura alvejada de RANK leva também a um fenótipo osteopetróti- co. Tanto a RANK-/- como a RANKL-/-camundongos exibiram ausência de osteo-clastos, indicando a exigência essencial destas moléculas para a osteoclastogênese. Além disso, RANK e RANKL são requeridas para organogênese de linfonodos e desenvolvimento precoce de células B e T. Adicionalmente, camundongos carentes de TRAF6, c-Src, c-Fos, ou as subunidades de NK-KB p50/p52 mostram também um fenótipo osteopetrótico; embora esses camundongos mutantes tenham osteoclastos, estas células têm aparentemente defeitos na reabsorção óssea. Assim, RANKL e RANK, bem como suas moléculas sinalizadoras citoplásmicas são fatores influenci- adores que regulam a homeostasia óssea normal.

[005] A relação existente entre a importância de RANK/RANKL/OPG na remodelação óssea e que a maior parte da destruição óssea induzida por câncer é devida à atividade osteoclástica aumentada sugere um papel principal de RANK/RANKL/OPG em doenças ósseas e câncer. Além do envolvimento de RANK/RANKL/OPG na osteoporose, relatórios recentes sugerem um papel potencial destas moléculas em outras doenças, que incluem artrite reumatóide, tumor de células gigantes do osso, doença de Paget, e osteólise expansível familiar (devido à mutação no exon 1 da RANK). Cânceres da mama e da próstata, metastáticos, têm a capacidade de invadir e crescer como metástases no osso causando lesões osteolí- ticas. Em modelos de camundongos de tumor metastático, nos quais o tumor causa osteoclastogênese e destruição óssea aumentada, a administração sistêmica de OPG reduz a destruição óssea mediada por tumor e dor associada ao câncer ósseo. Assim, alvejar o maquinário de transdução de sinal de RANK poderia ser usado potencialmente como uma estratégia terapêutica para inibir a destruição óssea aumentada associada ao câncer e aos distúrbios metabólicos ósseos. São nencessária estratégias adicionais para evitar destruição óssea não desejada associada aos cânceres metastáticos, ou condições associadas ou relacionadas à perda óssea.

SUMÁRIO DA INVENCÀO

[006] De acordo com a presente invenção são proporcionados compostos das Fórmulas estruturais I, II, III, ou IV: Fórmula I

em que n é um número inteiro de 1 a 3; X é N, CH, com a condição que quando X é N, n é 2 ou 3; R é uma alquila de 1 a 3 átomos de carbono; R(1) é 2,4- diCI, 5-OMe; 2,4-diCI; 3,4,5-tri-OMe; 2-CI, 5-OMe; 2-Me; 5-OMe; 2,4-diMe; 2,4-diMe- 5-OMe, 2,4-diCI, 5-OEt; R(2) é uma alquila de 1 a 2 átomos de carbono, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. Fórmula II

em que n é 2 ou 3; R é uma alquila de 1 a 3 átomos de carbono; R(2) é uma alquila de 1 a 2 átomos de carbono, e sais farmaceuticamente aceitáveis deste. Fórmula III

em que n é 2 ou 3; R(1) é 2,4-diCI, 5-OMe; 2,4-diCI; 3,4,5-tri-OMe; 2-CI, 5- OMe; 2-Me; 5-OMe; 2,4-diMe; 2,4-diMe-5-OMe, 2,4-diCI, 5-OEt; R(2) é uma alquila de 1 a 2 átomos de carbono, ou sais farmaceuticamente aceitáveis deste. Fórmula IV

em que n é 2 ou 3; R é uma alquila de 1 a 3 átomos de carbono; R(1) é 2,4- diCI, 5-OMe; 2,4-diCI; 3,4,5-tri-OMe; 2-CI, 5-OMe; 2-Me; 5-OMe; 2,4-diMe; 2,4-diMe- 5-OMe, 2,4-diCI, 5-OEt.

[007] Os compostos desta invenção podem ser usados para tratar, prevenir, ou inibir reabsorção óssea, reabsorção óssea patológica, atividade de osteoclastos, osteoclastogênese, lesões osteolíticas, ou outras condições patológicas com perda ou destruição óssea associada. Em certas modalidades, os compostos são usados como parte de uma composição farmacêutica.

[008] Compostos específicos da invenção incluem: composto 1 - 4-((2,4- Dicloro-5-metoxifenil)amino)-6-metóxi-7-(3-(4-metil-l-piperazinil)propóxi)-3- quinolinacarbonitrila; composto 2 - 4-((2,4-Dicliloro-5-metoxifenil)amino)-7-(3-(4-etil- 1-piperazinil)propóxi)-6-metóxi-3-quinolinacarbonitrila; composto 3 - 4-[(2,4- Dicloro- 5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(4-metil-1-piperazinil etóxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 4 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-7-[2-(4-etil-1-piperazinil)etóxi]-6- metóxi-3-quinolinacarbonitrila; composto 5 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6- metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metoxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 6 - 4-[(2,4- Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(1-metilpiperidin-4-il)etóxi]-3- quinolinacarbonitrila; composto 7 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3- (1 -metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 8 - 4-[(2,4-Dicloro-5- metoxifenil) amino]-7-[(1-etilpiperidin-4-il)metóxi]-6-metoxiquinolina-3-carbonitrila; composto 9 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-metilpiperazin-1- il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 10 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]- 6-etóxi-7-[(1 -metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 11 - 4-[(2,4- Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-etilpiperazin-1-il)propóxi]quinolina-3- carbonitrila; composto 12 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(1- metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 13 - 4-[(2,4-Dicloro-5- metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(4-metil-1-piperazinil)etoxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 14 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(1-metilpiperidin-4- il)etóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 15 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6- metóxi-7-[3-(4-propil-1-piperazinil)propóxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 16-4- [(2,4-diclorofenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]-3- quinolinacarbonitrila; composto 17 - 6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]-4- [(3,4,5-trimetoxifenil)amino]quinolina-3-carbonitrila; composto 18 - 4-[(2-cloro-5- metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 19 - 6-metóxi-4-[(5-metóxi-2-metilfenil)amino]-7-[(1-metilpiperidin-4- il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 20 - 4-[(2,4-dimetilfenil)amino]-6-metóxi- 7-[(1 -metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 21 - 6-metóxi-4-[(5- metóxi-2,4-dimetilfenil)amino]-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 22 - 4-[(2,4-dicloro-5-etoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4- il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; e sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Em certas modalidades um composto preferido é o composto 1 - 4-((2,4-Dicloro-5- metoxifenil)amino)-6-metóxi-7-(3-(4-metil-1-piperazinil)propóxi)-3- quinolinacarbonitrila.

[009] É contemplado que qualquer método ou composição, descrito aqui, pode ser implementado com respeito a qualquer outro método ou composição descrito aqui.

[0010] O uso da palavra “um” ou “uma” quando usado aqui em conjunção com o termo “compreendendo” nas reivindicações e/ou no relatório descritivo pode significar “um”, mas é também consistente com o significado de “um ou mais”, “pelo menos um” e “um ou mais que um”.

[0011] O uso do termo “ou” nas reivindicações é usado para sig nificar “e/ou”, a menos que explicitamente indicado para referir-se a alternativas somente ou à alternativa sejam mutuamente exclusivos, embora a exposição fundamente uma definição referente somente a alternativas e “e/ou”.

[0012] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. Contudo, deve ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades específicas da invenção, são fornecidos a título de ilustração, pois várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção tor- nar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] Os seguintes desenhos fazem parte do presente relatório descritivo e estão incluídos para adicionalmente demonstrar certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem entendida por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas aqui.

[0014] Figuras 1A-1C. SKI606 é um potente inibidor de osteo- clastogênese. (FIG. 1 A) A estrutura da 4-fenilamino-3-quinolinacarbonitrila SKI606. (Fig. 1B) Células BMM foram plaqueadas em placas de 48 poços (2 x 104 célu- las/poço) e estimuladas com M-CSF (10 ng/mL) ou M-CSF e RANKL (100 ng/mL), em quadrupletos com concentrações indicadas de SKI606. M-CSF foi reabastecido no dia 3. As células foram fixadas e coloridas para TRAP no dia cinco, usando um kit de coloração de TRAP de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). (Fig. 1C) Os dados mostrados representam três experimentos. São mostradas fotografias de campos repre- sentativos dos diferentes tratamentos usando uma lente objetiva 10x.

[0015] Figuras 2A-2B. As células BMM respondem à SKI606 em modo dependente de tempo. (Fig. 2A) Células BMM foram plaqueadas em placas de 48 poços (2 x 104 células/poço) e pré-tratadas com M-CSF (10 ng/mL) ou M-CSF e RANKL (300 ng/mL) em quadrupletos pelos tempos indicados, então tratados com SKI606 300nM. M-CSF foi reabastecido no dia 3. As células foram fixadas e coloridas para TRAP no dia cinco, usando um kit de coloração de TRAP da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). (Fig. 2B) Os dados mostrados representam três experimentos. As fotografias são de campos representativos dos diferentes tratamentos usando uma lente objetiva 10x.

[0016] Figuras 3A-3B. As células MDA-MB-435 estimulam a os- teoclastogênese nas células RAW264.7. (Fig. 3A) As células RAW264.7 (500 células/poço; 8 poços por tratamento) foram plaqueadas em placas de 96 poços células com MDA-MD-435 nas densidades indicadas e incubadas por 5 dias. (Fig. 3Ba) O meio condicionado foi preparado conforme descrito acima. Células RAW264.7 (750 células/poço; 8 poços por tratamento) incubadas com meio condicionado de MDA- MB-435, nas concentrações indicadas por 5 dias. As culturas foram fixadas e coloridas para TRAP no dia cinco, usando um kit de coloração de TRAP da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Os dados mostrados representam cinco experimentos. As fotografias são de campos representativos a partir dos diferentes tratamentos usando uma lente objetiva 10x.

[0017] Figuras 4A-4B. SKI606 inibe osteoclastogênese estimula da por MDA-MB-435 em RAW264.7. (Fig. 4A) Células RAW264.7 (500 células/poço; 8 poços por tratamento) foram plaqueadas em placas com 96 poços com células MDA-MD-435 (800 células/poço) em densidades indicadas e incubadas por 5 dias em presença de doses crescentes de SKI606. (Fig. 4B) Células RAW264.7 (750 células/poço; 8 poços por tratamento) foram plaqueadas em placas de 96 poços em meios condicionados a 10% de MDA-MB-435, por 5 dias. As culturas foram fixadas e coloridas para TRAP no dia cinco, usando um kit de coloração de TRAP da Sigma- Aldrich (St. Louis, MO). Os dados mostrados representam cinco experimentos.

[0018] Figuras 5A-5C. SKI606 diminui significantemente o cres cimento de tumor e lesões osteolíticas. Os camundongos foram divididos em 3 grupos de tratamento. O tratamento foi iniciado 3 dias depois de injeção tibial de 5 x 105 de células MDA-MB-435, ou por qualquer gavagem oral de veículo (Metocel 0,5%/Tween 0,4% em PBS), 150 mg/kg de SKI606 em veículo, ou injeções subcutâneas de 10 mg/kg de Zomeda (ácido zolendrônico) em 0,1 mL de PBS, 5 dias por semana, durante 9 semanas. (Fig. 5A) O peso do tumor foi determinado como a seguir: peso da perna injetada - peso da perna traseira não injetada do mesmo animal. (Fig. 5B) Áreas de lise foram estimadas a partir de imagens digitais de raios X; foi usado o programa NIH Scion para medir as áreas tibiais e líticas, para calcular a razão de pixels nas zonas Iíticas/pixels na área da tíbia. (Fig. 5C) A tíbia injetada tumoral foi fixada e descalcificada em EDTA, e seções foram coloridas para verificação da presença de osteoclastos multinucleados (>3 núcleos) usando um kit de coloração de TRAP da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

[0019] Figuras 6A-6C. SKI606 reduz significantemente o cresci mento do tumor e lesões osteolíticas. Imagens de raios X foram tiradas aos 35 dias após a injeção, e também em intervalos de 14 dias. Depois de 9 semanas, imagens de raios X finais foram tiradas do grupo de controle, tratados com gavagem oral de veículo (Metocel 0,5%/Tween 0,4% em PBS) (Fig. 6A), camundongos tratados com 150 mg/kg (Fig. 6B) ou Zomeda (Fig. 6C).

DESCRICÀO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0020] Tecido ósseo vivo está continuamente sendo reabasteci do pelo processo de reabsorção e deposição de minerais de cálcio. Esse processo, descrito como ciclo de absorção-reabsorção, é facilitado por dois tipos de células, os osteoblastos e os osteoclastos. O osteoclasto é uma célula multinucleada e é a única célula no corpo conhecida como tendo a capacidade para degradar (ou reabsorver osso). Em certas condições patológicas, o ciclo de absorção-reabsorção fica defeituoso resultando na degradação do osso. A degradação do osso resulta tipicamente em um risco aumentado de fraturas ósseas, compressão da medula espinal e hipercalcemia.

[0021] As modalidades da presente invenção incluem métodos e composições para tratar lesões osteolíticas e reabsorção óssea relacionadas a uma condição patológica, que inclui, geralmente, mas sem limitação, osteoporose, artrite, artrite reumatóide, metástases de câncer para o osso, câncer ósseo, hipercalcemia, lesões osteolíticas com implantes ortopédicos, doença de Paget, e perda óssea associada ao hiperparatireoidismo. Cânceres representativos incluem, mas sem limitação, mieloma múltiplo, carcinoma de célula renal, cânceres da cabeça e do pescoço, e carcinoma cervical. Condições artríticas incluem, mas sem limitação, artrite induzida por adjuvante, colágeno, bactéria e antígeno, particularmente artrite reumatóide. Lesões osteolíticas incluem, mas sem limitação, adamantinoma, cisto ósseo aneu- rismal (lesão), angiossarcoma - alto grau, angiossarcoma - baixo grau, lesões ósseas da doença de Gaucher, tumor marrom do hiperparatireoidismo, condroblasto- ma, fibroma condromixóide, condrossarcoma, cordoma, condrossarcoma de células claras, osteossarcoma intramedular convencional, doença de articulação degenerativa, fibroma desmoplásico, estenose medular diafisária com histiocitoma fibroso maligno, encondroma, granuloma eosinofílico, hemangioendotelioma epitelióide, sarcoma de Ewing do osso, osteossarcoma extraósseo, fibrossarcoma, displasia fibrosa, periostite reativa de coloração vermelho-brilhante, tumor de células gigantes, tumor de glomo, sarcoma granulocítico em osso, síndrome de Hardcastle, hemangi- ona, hemangiopercitoma, osteossarcaoma de superfície de alto grau, linfoma de Hodgkin ósseo, osteossarcoma intracortical, osteossarcoma bem diferenciado intraós- seo, condroma justacortical, leucemia, histiocitoma fibroso maligno, melorreostose, câncer da mama metastático, câncer do rim metastático, câncer do pulmão metastá- tico, câncer da próstata metastático, osteossarcoma multifocal, mieloma múltiplo, miosite ossificante; neurofibroma do osso; linfoma de não-Hodgkin; fibroma não ossi- ficante (defeito cortical fibroso); lesão de Nora; osteoblastoma; osteocondroma; os- teocondromatose (hmoce); displasia osteofibrosa; osteoma osteóide; osteoma; oste- omielite; osteopatia estriada; osteopecilose; osteossarcoma, doença de Paget, osteossarcoma parosteal; condroma periosteal; osteossarcoma periosteal; sinovite vi- lonodular pigmentada; sarcoma de pós-Paget; schwanoma de osso; osteossarcoma de pequenas células; cisto ósseo solitário; tumor fibroso solitário; mieloma solitário (plasmacitoma); cisto subcondral; condromatose sinovial; osteossarcoma telangectá- tico; lesões “Tug” - defeito fibroso metafisário; ou cisto ósseo unicameral.

I. INIBIDORES DE QUINASE RELACIONADOS A SRC

[0022] De acordo com a presente invenção são proporcionados compostos da seguinte fórmula estrutural (I):

em que: n é um número inteiro de 1 a 3; X é N, CH, com a condição que quando X é N, n é 2 ou 3; Ré uma alquila de 1 a 3 átomos de carbono; R(1) é 2,4- diCI, 5-OMe; 2,4-diCI; 3,4,5-tri-OMe; 2-CI, 5-OMe; 2-Me; 5-OMe; 2,4-diMe; 2,4-diMe- 5-OMe, 2,4-diCI, 5-OEt; R(2) é uma alquila de 1 a 2 átomos de carbono, e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis deste.

[0023] Compostos específicos da invenção incluem: composto 1 - 4-((2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino)-6-metóxi-7-(3-(4-metil-l-piperazinil)propóxi)-3- quinolinacarbonitrila; composto 2 - 4-((2,4-Dicliloro-5-metoxifenil)amino)-7-(3-(4-etil- 1-piperazinil)propóxi)-6-metóxi-3-quinolinacarbonitrila; composto 3 - 4-[(2,4- Dicloro- 5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(4-metil-1-piperazinil etóxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 4 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-7-[2-(4-etil-1-piperazinil)etóxi]-6- metóxi-3-quinolinacarbonitrila; composto 5 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6- metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metoxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 6 - 4-[(2,4- Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(1-metilpiperidin-4-il)etóxi]-3- quinolinacarbonitrila; composto 7 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3- (1-metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 8 - 4-[(2,4-Dicloro-5- metoxifenil) amino]-7-[(1-etilpiperidin-4-il)metóxi]-6-metoxiquinolina-3-carbonitrila; composto 9 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-metilpiperazin-1- il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 10 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]- 6-etóxi-7-[(1 -metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 11 - 4-[(2,4- Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-etilpiperazin-1-il)propóxi]quinolina-3- carbonitrila; composto 12 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(1- metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 13 - 4-[(2,4-Dicloro-5- metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(4-metil-1-piperazinil)etoxi]quinolina-3-carbonitrila;composto 14 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(1-metilpiperidin-4- il)etóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 15 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6- metóxi-7-[3-(4-propil-1-piperazinil)propóxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 16-4- [(2,4-diclorofenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]-3- quinolinacarbonitrila; composto 17 - 6-metóxi-7-[(1 -metilpiperidin-4-il)metóxi]-4- [(3,4,5-trimetoxifenil)amino]quinolina-3-carbonitrila; composto 18 - 4-[(2-cloro-5- metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 19 - 6-metóxi-4-[(5-metóxi-2-metilfenil)amino]-7-[(1-metilpiperidin-4- il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 20 - 4-[(2,4-dimetilfenil)amino]-6-metóxi- 7-[(1 -metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 21 - 6-metóxi-4-[(5- metóxi-2,4-dimetilfenil)amino]-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 22 - 4-[(2,4-dicloro-5-etoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4- il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; e sais farmaceuticamente aceitáveis destes.

[0024] Os compostos desta invenção podem ser usados para tratar, atenuar, prevenir, ou inibir osteoclastogênese ou perda óssea. Em uma modalidade preferida, os compostos são usados como parte de uma composição farmacêutica. Em uma modalidade preferida, o composto 1 - 4-((2,4-Dicloro-5- metoxifenil)amino)-6-metóxi-7-(3-(4-metil-1-piperazinil)propóxi)-3- quinolinacarbonitrila é usado para inibir osteoclastogênese ou perda óssea.

[0025] Sais farmaceuticamente aceitáveis são aqueles derivados de tais ácidos orgânicos e inorgânicos como: acético, láctico, carboxílico, cítrico, ci- nâmico, tartárico, succínico, fumárico, maléico, malônico, mandélico, málico, oxálico, propiônico, clorídrico, bromídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, glicólico, pirúvico, me- tanossulfônico, etanossulfônico, toluenossúlfônico, salicílico, benzóico, e ácidos similarmente conhecidos e aceitáveis.

[0026] O termo “alquila” refere-se ao radical de grupos alifáticos saturados, incluindo grupos alquila de cadeia linear, grupos alquila de cadeia ramificada, grupos cicloalquila (alicíclicos), grupos cicloalquila substituídos com alquila, e grupos alquila substituídos com cicloalquila. Em uma modalidade preferida, uma alquila de cadeia linear ou ramificada tem 3 ou menos átomos de carbono em sua cadeia principal.

[0027] Os compostos podem ser fornecidos por injeção oral; in- tralesional; intraperitoneal; intramuscular ou intravenosa; infusão; distribuição mediada por lipossoma; distribuição tópica; nasal; anal; vaginal; sublingual; uretral; trans- dérmica; intratecal; ocular ou ótica. De modo a obter consistência no fornecimento do composto desta invenção, é preferido que um composto da invenção esteja na forma de uma dose unitária. Formas de doses unitárias adequadas incluem comprimidos, cápsulas, e pós em sachet ou ampolas. Tais formas de doses unitárias podem conter de 0,1, 0,5, 1, 10, 100, 200 a 300 ng ou mg de um composto da invenção, incluindo todos os valores e faixas no intervalo deles, e em certos aspectos de 2 a 100 ng ou mg. Em uma outra modalidade, as formas de dosagens unitárias contêm de 50 a 150 mg de um composto da presente invenção. Os compostos da presente invenção podem ser administrados oralmente ou por outras vias de administração bem conhecidas. Tais compostos podem ser administrados de 1,2, 3, 4, 5 a 6 vezes ao dia, mais usualmente de 1,2, 3, a 4 vezes ao dia, semana ou mês, duran- tes semanas, meses ou anos. A quantidade eficaz será determinada por aquele versado na técnica; ela será também dependente da forma do composto. Aquele versado na técnica poderia realizar rotineiramente testes de atividade empírica para determinar a bioatividade do composto em bioensaios e assim determinar qual dosagem a ser administrada, bem como extrapolar e analisar dados de experimentos clínicos.

[0028] Os compostos da invenção podem ser formulados com excipientes convencionais, tais como carga, agente desintegrador, ligante, lubrificante, agente flavorizante, aditivo de corante, ou veículo. O veículo pode ser, por exemplo, diluente, aerosol, veículo tópico, uma solução aquosa, uma solução não aquosa ou um veículo sólido. O veículo pode ser um polímero. Um veículo nesta invenção engloba qualquer um dos veículos padrão farmaceuticamente aceitos, tais como solução salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com acetato, água, emulsões tais como uma emulsão de óleo em água ou uma emulsão de triglicerí- deos, vários tipos de agentes molhantes, comprimidos, comprimidos revestidos e/ou cápsulas.

[0029] Quando suprido oral ou topicamente, tais compostos seri- am fornecidos a um paciente por distribuição em diferentes veículos. Tipicamente, tais veículos contêm excipientes tais como amido, leite, açúcar, certos tipos de argila, gelatina, ácido esteárico, talco, gorduras ou óleos vegetais, gomas, ou glicóis. O veículo específico necessitaria ser selecionado com base no método de distribuição desejado, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) poderia ser usada para distribuição intravenosa e sistêmica e gorduras vegetais, cremes, pomadas, ungüentos ou géis podem ser usados para distribuição tópica.

[0030] Os compostos da presente invenção podem ser distribuí dos juntamente com diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsificantes, adjuvantes e/ou veículos adequados úteis no tratamento ou prevenção de uma lesão osteolí- tica e/ou perda óssea. Tais composições são líquidos ou formulações liofilizadas ou de outro modo secas e incluem diluentes de conteúdo variado de tampão (por exemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), pH e resistência iônica, aditivos tais como albuminas ou gelatina para prevenir absorção nas superfícies, detergentes (por exemplo, TWEEN 20, TWEEN 80, PLURONIC F68, sais de ácido bilioso), agentes solubilizantes (por exemplo, glicerol, polietileno glicerol), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfato de sódio), conservantes (por exemplo, timerosal, álcool benzílico, parabenos), substâncias de avultamento ou modificadores de tonicidade (por exemplo, lactose, manitol), ligação covalente de polímeros tal como polietileno glicol, complexação com íons de metal, ou incorporação do composto em ou sobre as preparações particuladas de hidrogéis, lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, fantasmas de eritrócito, ou esferoblastos. Tais composições influenciarão o estado físico, solubilidade, estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa de depuração in vivo do composto ou composição. A escolha das composições dependerá das propriedades físicas e químicas do composto capaz de tratar, atenuar ou prevenir uma condição particular ou estado doentio.

[0031] O composto da presente invenção pode ser distribuído via uma cápsula que permite uma liberação constante do composto por um período de tempo. Composições de liberação controlada ou constante incluem a formulação em depósitos lipofílicos (por exemplo, ácidos graxos, ceras, óleos).

[0032] A presente invenção proporciona ainda um composto da invenção para uso como uma substância terapêutica ativa para tratar, regular, atenuar, prevenir, ou inibir osteoclastogênese ou perda óssea.

[0033] A presente invenção proporciona ainda um método para tratar perda óssea em humanos, que compreende administrar ao indivíduo, diagnosticado com ou em risco de desenvolver uma lesão osteolítica, uma quantidade eficaz de um composto ou uma composição farmacêutica da invenção. A dose fornecida ao paciente variará dependendo do que está sendo administrado, da finalidade da administração, do modo de administração, e similar. Uma “quantidade terapeuticamen- te eficaz” é uma quantidade suficiente para curar, reduzir ou atenuar sintomas de perda óssea.

[0034] Os compostos da invenção podem ser distribuídos sozi nhos ou em combinações com outros compostos usados para tratar qualquer estado doentio ou patologias relacionadas.

[0035] Os compostos da invenção foram preparados de: (a) ma teriais de partida comercialmente disponíveis, (b) materiais de partida conhecidos que podem ser preparados conforme descrição na literatura, ou (c) novos intermediários descritos nos esquema e nos procedimentos experimentais aqui referenciados. Os compostos incluídos nesta invenção podem ser preparados de acordo com as rotas de síntese descritas na Patente US 6.002.008 e Patente US 6.780.996; e no Pedido de Patente US 20050101780A1, em que cada um destes é aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade.

[0036] As reações são realizadas em um solvente apropriado pa ra os reagentes e materiais empregados e adequados para as reações que estão sendo efetuadas. Aqueles versados na técnica de síntese orgânica entendem que as várias funcionalidades presentes na molécula devem ser consistentes com as transformações químicas propostas. Quando não especificadas, a ordem das etapas sintéticas, escolha de grupos protetores e condições de desproteção tornar-se-ão prontamente aparentes para aqueles versados na técnica. Além disso, em alguns casos, os substituintes nos materiais de partida podem ser incompatíveis com certas condições de reação. Restrições pertinentes aos dados substituintes serão aparentes para um versado na técnica. As reações são efetuadas sob atmosfera inerte, se apropriado.

[0037] A preparação dos compostos de Fórmula I foi relatada na literatura (Boschelli et al., 2001a; Boschelli et al., 2001b; Boschelli et al.2003; Boschelli et al., 2004, e Ye et al., 2001, cada uma destas citações é aqui incorporada a título de referência).

II. CICLO DE ABSORÇÃO-REABSORÇÃO ÓSSEA

[0038] O tecido ósseo vivo está sendo continuamente reabaste cido pelo processo de reabsorção e deposição de minerais de cálcio. Esse processo, descrito como o ciclo de absorção-reabsorção, é facilitado por dois tipos de células, os osteoblastos e os osteoclastos. O osteoclasto é uma célula multinucleada e é a única célula no corpo conhecida por ter a capacidade de degradar (ou reabsorver) osso. Essa atividade de reabsorção é obtida pelo osteoclasto que forma escavações (lacunas de reabsorção) no tecido ósseo. De fato, a atividade dos osteoclastos na cultura de células é medida por sua capacidade de formar essas escavações em fatias de tecido mineralizado tal como osso ou dentina de baleia cachalote. O osteoclasto é derivado de um precursor hematopoiético que ele compartilha com os elementos formados do sangue (Takahashi et al., 1987). O precursor para o osteoclasto é uma célula mononuclear (célula com um núcleo simples), que é encontrado na medula óssea e o qual forma o osteoclasto maduro e multinucleado único depois de passar por replicação e diferenciação por meio de fusão celular. O osteoclasto maduro se distingue de outras células multinucleadas pela presença da enzima fosfa- tase ácida resistente ao tartarato (TRAP), que é freqüentemente usada como um marcador de célula de osteoclasto.

[0039] Dentre as condições patológicas associadas ao desenvol vimento ou função anormal de osteoclastos estão as condições em que a reabsorção óssea aumentada resulta no desenvolvimento de estrutura óssea frágil e/ou quebradiça, tal como osteoporose, ou absorção óssea aumentada resulta no desenvolvimento de massa óssea em excesso, tal como osteopetrose. Acredita-se que o desenvolvimento de populações de osteoclastos ou osteoblastos em excesso ou deficientes resulta de carência ou excesso correspondente de citocinas específicas.

[0040] Muitas citocinas conhecidas estimulam ou inibem as célu las sangüíneas: várias citocinas reguladoras de crescimento, tais como M-CSF, fator de crescimento transformante alfa (TGF-a), interleucina-1 (IL-1) e fator de necrose tumoral (TNF) têm mostrado que estimulam a proliferação de células mononucleares da medula. Embora as citocinas, tais como interleucina-1, fator de necrose tumoral e interleucina-6 (IL-6), possam influenciar a formação e diferenciação de osteoclastos (Mundy, 1990), esses fatores não são fatores reguladores de crescimento de osteoclastos específicos.

[0041] Modelos de camundongo de nocaute RANKL, RANK, e (OPG) têm demonstrado um papel essencial destas moléculas em osteoclastogênese (i.e., remodelagem do osso). A importância biológica dessas moléculas é enfatizada pela indução de osteoporose grave por ruptura alvejada da OPG e pela indução de osteoporose por ruptura alvejada de RANKL ou por superexpressão de OPG (Bucay et al., 1998; Kong et al., 1999; Mizuno et al., 1998). Assim, a formação de osteoclastos pode ser atribuída à razão relativa de RANKL para OPG no microambi- ente da medula óssea, e alterações neste balanço pode ser a causa principal da perda óssea em muitos distúrbios ósseos metabólicos. Similar a RANKL-/- camundongos, a ruptura alvejada de RANK leva também a um fenótipo osteopetróti- co (Dougall et al., 1999; Li et al., 2000). Tanto RANK-/- como RANKL-/- camundongos exibiram ausência de osteoclastos, indicando a exigência essencial destas moléculas para a osteoclastogênese. Além disso, RANK e RANKL são requeridas para organogênese de linfonodos e desenvolvimento precoce de células B e T (Dougall et al., 1999; Kong et al., 1999). Adicionalmente, camundongos carentes de TRAF6 (Lomaga et al., 1999), c-Src (Soriano et al., 1991), c-Fos (Johnson et al., 1992), ou as subunidades de NK-KB p50/p52 (Franzoso et al., 1997; lotsova et al., 1997) mostram também um fenótipo osteopetrótico; embora esses camundongos mutantes tenham osteoclastos, estas células têm aparentemente defeitos na reabsorção óssea.

[0042] Manutenção de integridade óssea requer um equilíbrio di nâmico entre a formação óssea e reabsorção óssea. O tamanho da reunião da rede de osteoclastos ativos é determinado pelos efeitos da rede de diferenciação e fusão dos precursores de osteoclastos e pela atividade e taxa de apoptose dos osteoclastos ativos. Embora vários citocinas (TNF, IL-1, IL-6, IL-11, TGFoc) e moléculas (11a, 25-diidroxivitamina D3 e glicocorticóides) expressas por células de linhagem de os- teoblastos tenham mostrado que desempenham um papel na diferenciação dos osteoclastos, parece que os fatores essenciais são RANKL (produzido por osteoblas- tos) e RANK (expresso nos osteoclastos e progenitores dos osteoclastores), bem como os mecanismos de sinalização intracelulares e vias resultantes. Há também uma exigência por M-CSF, mas sua função ainda permanece de difícil compreensão, mas é provavelmente somente requerida para a iniciação de diferenciação dos progenitores dos osteoclastos precoces e sobrevivência.

[0043] O esqueleto humano é continuamente remodelado, nor malmente renovando em cerca de 2 anos e possibilita o uso de minério do esqueleto na homeostasia de cálcio. A resistência e conformação do esqueleto são conservadas por substituição segmentai: uma seção óssea é degradada pelos osteoclastos, formados de precursores de monócito-macrófago (Scheven et al., 1986; e Fujikawa et al., 1996), enquanto que os osteoblastos, derivados de células estromais, sintetizam osso novo (Rickard, et al., 1996). Essas células não relacionadas se diferenciam de um modo acoplado, produzindo uma nova seção óssea em poucas semanas.

[0044] Os osteoclastos, que são células gigantes multinucleadas, provêem de células-tronco hematopoiéticas e são as células primárias responsáveis pela reabsorção fisiológica e patológica. Os osteoclastos são especializados para a remoção de ambos as fases inorgânicas e orgânicas do osso (Blair et al., 1986). Alterações nos níveis de citocinas e fatores de crescimento em microambiente causam reabsorção óssea anormal pelos osteoclastos (para uma revisão vide Mundy, et al., 1997). Por conseguinte, a expressão forçada de IL-4 (Lewis, et al., 1993), e G-CSF (Takahashi, et al., 1996) osteopenia induzida em camundongos, enquanto camundongos superexpressam receptor de TNF-oc solúvel (Ammann, et al., 1997) ou esgotados do gene de IL-6 (Poli, et al., 1994) são protegidos contra a perda óssea causada por deficiência de estrogênio.

[0045] A dissolução da fase mineral de hidroxiapatita é depen dente da acidificação da lacuna de reabsorção subosteoclástica, via a ação de ani- drase carbônica II e uma bomba de prótons (Vaes, 1968; Baron et al., 1985; Blair et al., 1992).

[0046] Reabsorção óssea excessiva por osteoclastos contribui para a patologia de muitas doenças humanas incluindo artrite, osteoporose, perio- dontite, e hipercalcemia de malignidade. Durante a reabsorção, os osteoclastos removem tanto os componentes minerais e orgânicos do osso (Blair et al., 1986). As doenças ósseas principais correntes de preocupação pública são osteoporose, hipercalcemia de malignidade, osteopenia devido às metástases ósseas, doença peri- odontal, hiperparatireoidismo, erosões periarticulares em artrite reumatóide, doença de Paget, osteopenia induzida por imobilização, e tratamento com glicocorticóide. Todas essas condições são caracterizadas por perda óssea, resultante de um desequilíbrio entre a reabsorção óssea (esgotamento) e formação óssea, que continua por toda a vida na faixa de cerca de 14% por ano, na média. Contudo, a taxa de re-novação óssea difere de sítio para sítio, por exemplo, é maior que no osso trabecular das vértebras e o osso alveolar nos maxilares que nos cortices dos ossos longos. O potencial para perda óssea está diretamente relacionado para a renovação e podem perfazer mais que 5% por ano nas vértebras imediatamente seguinte à menopausa, uma condição que leva ao risco aumentado de fratura. A renovação pode ser efetuada por um acréscimo ou decréscimo na atividade dos osteoblastos ou um acréscimo ou decréscimo da atividade dos osteoclastos. As composições e métodos para modular os osteoclastos e/ou os osteoblastos em um paciente seriam útil no tratamento de uma variedade de doenças ou condições associadas à perda óssea.

[0047] Todas as condições listadas acima se beneficiariam do tratamento com agentes que inibem ou regulam a osteoclastogênese ou reabsorção óssea. Um mecanismo para a inibição da reabsorção óssea é a inibição da fusão de células precursoras dos osteoclastos.

III MÉTODOS PARA TRATAR CONDIÇÕES OSTEOLÍTICAS

[0048] A presente invenção envolve o tratamento dos pacientes com uma enfermidade ou condição de reabsorção óssea patológica. O termo “benefício terapêutico” refere-se a qualquer coisa que promove ou intensifica o bem estar do paciente com respeito ao tratamento médico de condição do paciente, que inclui o tratamento de condições osteolíticas e/ou regulação da reabsorção óssea, atividade dos osteoclastos, e/ou osteoclastogênese.

A. Formulações Farmacêuticas e Distribuição

[0049] Certas modalidades da presente invenção contemplam os métodos envolvendo a distribuição de um ou mais compostos da invenção. Exemplos de doenças e condições que podem ser prevenidas, atenuadas, ou tratadas com um ou mais compostos da invenção incluem perda óssea associada à metásta- se de câncer para o osso, que inclui, mas sem limitação, metástases de câncer do pulmão, da cabeça e do pescoço, da próstata, ósseo, testicular, cervical, gastrintestinal, do cólon, da bexiga e outras, bem como outras doenças ou condição relacionadas ou associadas às lesões osteolíticas.

[0050] Uma “quantidade eficaz” da composição farmacêutica é geralmente definida como aquela quantidade suficiente para detectável e repetidamente obter o resultado desejado estabelecido, por exemplo, para atenuar, reduzir, minimizar ou limitar a extensão da condição ou doença osteolítica, ou seus sintomas. Em certos aspectos, definições mais rigorosas podem ser aplicadas, incluindo prevenção, eliminação, erradicação ou cura da doença.

[0051] Em certas modalidades específicas, é desejado inibir os teoclastogênese ou, de outro modo, reverter, impedir ou reduzir a reabsorção óssea usando os métodos e composições da presente invenção. As vias de administração variarão, naturalmente, com o local e a natureza da lesão e podem incluir, por exemplo, administração e formulação intradérmicas, subcutâneas, regionais, paren- terais, intravenosas, intramusculares, intranasais, sistêmicas, e orais.

[0052] Administração contínua pode ser também aplicada, quan do apropriado. Distribuição via seringa ou cateterismo é contemplada. Tal perfusão contínua pode ocorrer por um período de cerca de 1-2 horas, a cerca de 2-6 horas, a cerca de 6-12 horas, a cerca de 12-24 horas, a cerca de 1-2 dias, a cerca de 1-2 semanas ou mais tempo, seguinte ao início do tratamento. Em geral, a dose da composição terapêutica via perfusão contínua será equivalente àquela dada por uma injeção simples ou por injeções múltiplas, ajustada por um período de tempo durante o qual a perfusão ocorre.

[0053] Os tratamentos podem incluir várias “doses unitárias”. A dose unitária é definida como contendo uma quantidade predeterminada da composição terapêutica. A quantidade a ser administrada, e a via particular e formulação estão dentro do conhecimento daqueles versados nas técnicas clínicas. Uma dose unitária não precisa ser administrada como uma injeção simples, mas pode compreender infusão contínua por um período de tempo estabelecido. A dose unitária da presente invenção pode ser convenientemente descrita em termos de mg por volume de formulação ou peso (por exemplo, miligramas ou mg) da composição terapêutica.

[0054] Em algumas modalidades, o método para distribuição de uma composição compreendendo uma ou mais composições da invenção é via administração sistêmica. Contudo, as composições farmacêuticas descritas aqui podem ser alternativamente administradas via parenteral, subcutânea, intratraqueal, intravenosa, intradérmica, intramuscular, ou mesmo intraperitoneal. A injeção pode ser por seringa ou qualquer outro método usado para injeção de uma solução.

[0055] Soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água, adequadamente misturados com um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. As dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas destes e em óleos. Sob condições ordinárias da armazenagem e uso, essas preparações contêm um conservante para impedir o crescimento de microrganismos. As formas farmacêuticas adequadas para o uso injetável incluem soluções aquosas ou dispersões estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis (Patente US 5.466.468, aqui incorporada especificamente a título de referência, em sua totalidade). Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida até onde haja uma fácil seringabilidade. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem e deve ser conservada contra a ação de contaminação de microrganismos, tais como bactérias e fungos.

[0056] O veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido e similares), misturas adequadas destes, e/ou óleos vegetais. Fluididade própria pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho requerido da partícula no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação dos microrganismos pode ser efetuada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, para- benos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, a absorção das composições injetáveis pode ser obtida pelo uso na composição de agentes retardadores de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0057] Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, se necessário, e o diluente líquido tornado inicialmente isotônico com suficiente solução salina ou glicose. Essas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intratumoral e intraperitoneal. A esse respeito, meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos daqueles versados na técnica à luz da presente exposição. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml_ da solução de NaCI isotônica e ou adicionada a 1.000 ml_ de fluido de hipodermóclise ou injetado no sítio de infusão proposto, (vide, por exemplo, “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 15â Edição, pp. 1035- 1038 e 1570-1580. Alguma variação da dosagem ocorrerá necessariamente depen-dendo da condição do paciente que está sendo tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o paciente individual. Além disso, para administração a humanos, as preparações devem satisfazer os padrões gerais de esterilidade, pirogenicidade, segurança e pureza, conforme requeridos pelos padrões do FDA Office of Biologies.

[0058] Soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorpo ração dos compostos ativos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos ingredientes enumerados acima, conforme requeridos, seguido por esterilização filtrada. Em geral, as dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básica e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, alguns dos métodos de preparação são técnicas de secagem sob vácuo e liofilização, que produzem um pó do ingrediente ativo, mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente filtrada deste.

[0059] As composições descritas aqui podem ser formuladas em uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livre da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como, acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Os sais formados com os grupos carboxila livre podem ser também derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio, ou férricos, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaí- na e similares. Mediante formulação, as soluções serão administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de fármaco e similares.

[0060] Como usado aqui, “veículo” inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibac- terianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção, tampões, soluções de veículos, suspensões, colóides e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecido da técnica. Exceto até onde qualquer meio convencional ou agente é incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares podem ser também incorporados nas composições.

[0061] A frase “farmaceuticamente aceitável” refere-se a entida des moleculares e composições que não produzem reação alérgica ou irritante similar quando administradas a um humano. A preparação de uma composição aquosa, que contém uma proteína como um ingrediente ativo, é bem entendida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como soluções ou suspensões injetáveis; formas sólidas para a solução, ou suspensão, no líquido para injeção podem ser também preparadas.

B. Tratamentos em Combinação

[0062] Em certas modalidades, as composições e métodos da presente invenção envolvem um composto que inibe ou regula a reabsorção óssea, a atividade dos osteoclastos, e/ou osteoclastogênese, que, por sua vez, pode ser usado em combinação com outros agentes ou composições para intensificar o efeito de outros tratamentos, tais como tratamentos antineoplásicos, para melhorar a qualidade de vida de um paciente que está sendo tratado. Essas composições seriam providas em uma quantidade eficaz combinada para obtenção do efeito desejado, por exemplo, exterminar ou inibir o crescimento de célula cancerosa e a inibição de osteoclastogênese, a atividade dos osteoclastos, ou a reabsorção óssea. Esse processo pode envolver contatar as células com uma composição da invenção e um segundo agente(s) terapêutico(s) ou fator(es) múltiplo(s) ao mesmo tempo. Isso pode ser obtido por contato da célula com uma composição simples ou formulação que inclui dois ou mais agentes, ou por contato da célula com duas ou mais composições ou formulações distintas, em que pelo menos uma composição inclui uma composi- ção da invenção e uma ou mais de outras composições incluem pelo menos um segundo agente terapêutico.

[0063] Em uma modalidade da presente invenção, é contempla do que a terapia anti-osteoclastos é usada em conjunto com a intervenção de imuno- terapia, além de agentes pró-apoptóticos, antiangiogênicos ou reguladores do ciclo celular. Alternativamente, a terapia pode preceder ou seguir o outro tratamento com agente por intervalos que variam de minutos a semanas. Em modalidades onde um ou mais do segundo agente terapêutico e uma terapia anti-osteoclastos são aplicados separadamente a uma célula, tecido, órgão ou paciente, deve ser em geral assegurado que um período de tempo significante não expire entre o tempo de cada distribuição, de modo que o segundo agente e a composição inventiva seriam capazes de exercer um efeito vantajosamente combinado no paciente. Em tais casos, é contemplado que se possa contatar as células com ambas as modalidades dentro de cerca de 12-24 horas uma da outra e, mais preferivelmente, dentro de cerca de 6- 12 horas uma da outra. Contudo, em algumas situações, pode ser desejável estender significantemente o período de tempo para tratamento, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7) decorram entre as respectivas administrações.

[0064] Várias combinações podem ser empregadas, por exem plo, uma composição da presente invenção é “A” e uma segunda terapia, tal como quimioterapia, é “B”:

[0065] A administração das composições anti-osteoclasto da presente invenção a um paciente seguirá os protocolos gerais para administração de tais composições, levando em conta a toxidez, se alguma. Espera-se que os ciclos de tratamento sejam repetidos se necessário. É também contemplado que várias terapias padrão, bem como intervenção cirúrgica, podem ser aplicadas em combinação com a terapia descrita.

[0066] Em modalidades especificas, é contemplado que uma terapia anticâncer, tal como quimioterapia, radioterapia, ou imunoterapia, é empregada em combinação com as terapias anti-osteoclasto descritas aqui.

1. Quimioterapia

[0067] Terapias de câncer incluem também uma variedade de terapias de combinação com ambos os tratamentos com base em quimica e radiação. Quimioterapias de combinação incluem, por exemplo, cisplatina (CDDP), carboplatina, procarbazina, meclorretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalano, clorambucila, bussulfano, nitrosouréia, dactino- micina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomi- cina, mitomicina, etoposideo (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes ligantes de receptor de estrogênio, taxol, gencitam- bina, navelbina, inibidores de farnesil-proteina transferase, transplatina, 5-fluoruracila, vincristina, vimblastina e metotrexato, ou qualquer análogo ou derivado variante dos acima.

2. Radioterapia

[0068] Outros fatores que danificam o DNA e têm sido usados extensivamente incluem aqueles que são comumente conhecidos como raios y, raios X, e/ou a distribuição dirigida de radioisótopos para células tumorais. Outras formas de fatores danificadores de DNA são também contempladas tais como microondas, irradiação de feixe de prótons (Patente US 5.760.395 e Patente US 4.870.287) e irradiação de UV. É mais provável que todos esses fatores efetuem uma ampla extensão de dano no DNA, nos precursores de DNA, na replicação e reparo de DNA, e na montagem e manutenção dos cromossomos. As faixas de dosagens de raios X variam em faixas de doses diárias de 50 a 200 roentgens por prolongados periodos de tempo (3 a 4 semanas), a doses simples de 2.000 a 6.000 roentgens. As faixas de dosagens para radioisótopos variam extensamente, e dependem da meia vida do isótopo, da resistência e o tipo de radiação emitida, e da absorção pelas células neo- plásicas.

[0069] Os termos "contatado"e "exposto", quando aplicados a uma célula, são usados aqui para descrever o processo pelo qual uma composição terapêutica e um agente quimiotera- pêutico ou radioterapêutico são distribuídos a uma célula alvo, tecido ou paciente, ou são colocados em justaposição direta.

3. Imunoterapia

[0070] No contexto do tratamento de câncer, substâncias imunoterapêuticas geralmente se baseiam no uso de células e moléculas imuno-efetoras (por exemplo, anticorpos monoclo- nais) para alvejar e destruir células cancerosas. Trastuzu- mabe (Herceptin™) é um exemplo de tal. O imuno-efetor pode ser, por exemplo, um anticorpo especifico para algum marcador na superfície de uma célula tumoral. 0 anticorpo sozinho pode servir como um efetor de terapia ou ele pode recrutar outras células para realmente efetuar a destruição das células. O anticorpo pode ser também conjugado a um fármaco ou toxina (substância quimioterapêutica, radionuclídeo, cadeia A da ricina, toxina da cólera, toxina da pertussis, etc.) e servir meramente como um agente de alvejamento. Alternativamente, o efetor pode ser um linfócito transportando uma molécula de superfície que interage, tanto direta como indiretamente, com um alvo de célula tumoral. Várias células efe- toras incluem células T citotóxicas e células NK. A combinação de modalidades terapêuticas, i.e. atividade citotóxica direta e inibição ou redução de ErbB2 proporcionaria um benefício benéfico no tratamento de cânceres que superexpres- sam ErbB2.

[0071] Existem várias abordagens diferentes para imunote-rapia de câncer. Elas podem ser amplamente categorizadas como a seguir: injeção de anticorpos sozinhos; injeção de an-ticorpos acoplados a toxinas ou a agentes quimioterapêuti- cos; injeção de anticorpos acoplados a isótopos radioativos; injeção de anticorpos antiidiotipicos; e, finalmente, purga de células tumorais na medula óssea.

[0072] Na imunoterapia ativa, um peptideo antigênico, po- lipeptideo ou proteina, ou uma composição de células tumo- 5 rais autólogas ou alogênicas ou "vacina" é administrada, geralmente com um adjuvante bacteriano distinto (Ravindranath e Morton, 1991; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993). Na imunoterapia de melanoma, aqueles pacientes que elicitam alta resposta a IgM freqüentemente 10 sobrevivem melhor que aqueles que não elicitam ou elicitam poucos anticorpos de IgM (Morton et al., 1992). Anticorpos de IgM são frequentemente transitórios e a exceção à regra parece ser os anticorpos anti-gangliosideos ou anti- carboidratos.

[0073] Na imunoterapia adotiva, os linfócitos circulantes do paciente, ou linfócitos infiltrados no tumor, são isolados in vitro, ativados por linfocinas tal como IL-2 ou transduzidos com genes para necrose tumoral, e re administrados (Rosenberg et al. , 1988; 1989). Para alcançar 20 isso, deve-se administrar a um animal, ou a um paciente hu-mano, uma quantidade imunologicamente eficaz de linfócitos ativados em combinação com uma composição de peptídeos anti- gênicos conforme descrita aqui. Os linfócitos ativados serão, mais preferivelmente, as próprias células do paciente 25 que foram anteriormente isoladas de uma amostra de sangue ou de tumor e ativadas (ou "expandidas") in vitro. Essa forma de imunoterapia tem produzido vários casos de regressão de melanoma e carcinoma renal, mas a percentagem de respondedo- res foram poucas em comparação com aqueles que não responderam.

4. Cirurgia

[0074] Aproximadamente 60% das pessoas com câncer passarão por algum tipo de cirurgia, que inclui cirurgia preventiva, diagnóstica ou de estadiamento, curativa e paliativa. Cirurgia curativa inclui ressecção na qual todo ou parte do tecido canceroso é fisicamente removido, excisado, e/ou des-truído. A ressecção de tumor refere-se à remoção fisica de pelo menos parte de um tumor. Além da ressecção do tumor, tratamento por cirurgia inclui cirurgia a laser, criocirur- gia, eletrocirurgia, e cirurgia microscopicamente controlada (cirurgia de Mohs). É ainda contemplado que a presente in-venção pode ser usada em conjunto com a remoção de cânceres superficiais, pré-cânceres, ou quantidades incidentais de tecido normal.

EXEMPLOS

[0075] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que são dados a seguir representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionarem bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. Contudo, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente exposição, apreciar que várias alterações podem ser feitas nas modalidades especifi-cas que são descritas e ainda obter um resultado parecido ou similar sem se desviar do espirito e escopo da invenção.

EXEMPLO 1 MÉTODOS

[0076] Animais e linhagens de células. Camundongos fêmeas, nude, atimicos, NCr, foram obtidos da Animal Production Area of the National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility (Frederick, MD) . Seis camundongos pretos (C57BL/6J) foram obtidos da Charles Rivers (Wilmington, MA). Os camundongos foram mantidos em uma cabine com fluxo de ar laminar sob condições especificas isentas de patógenos e u- sados quando na idade de 8 semanas. Todas as instalações fo-ram aprovadas pela American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) de acordo com os regulamentos e padrõe correntes do United States Department of Agri-culture, o Department of Health and Human Services, e o NIH. Os camundongos foram alimentados com a ração para roedores, Purina, e água da bica a vontade. A linhagem de células de câncer da mama, células MDA-MB-435 foram mantidas em D-MEM (Invitrbgen, Carlsbad, CA) suplementado com FBS a 10% e pi- ruvato de sódio lmM (Invitrogen, Carlsbad, CA) . A linhagem de células de macrófagos do camundongo RAW264.7 foi mantida em DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com FBS a 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Todos os meios continham Fungizone em uma diluição 1:100 (concentração final: penici-lina G, estreptomicina em 100 unidades/mL e anfotericina, B 250 ng/mL).

[0077] Cultura de Células Primárias da Medula Óssea. Cé-lulas primárias da medula óssea (BMM) das tibias e fêmures foram assepticamente dissecados de 6 camundongos pretos (C57BU6J) com 8 a 12 semanas de idade. A medula óssea foi rinsada com D-MEM incompleto e centrifugada a 1.200 rpm por 3 minutos e re-suspensa em 5 mL de D-MEM incompleto. As células BMM foram incubadas em 20 mL de tampão de lise de células vermelhas do sangue (8,3 g/L de NH4C1, 1 g/L de bicarbonato de sódio, 0,4 g/L de EDTA), à temperatura ambiente, por 1 a 2 minutos. Vinte e cinco mililitros de D-MEM suplementado com FBS a 10% e 100 unidades/mL de penicilina (D-MEM completo) foram adicionados e as células BMM foram centrifugadas por 3 minutos a 1.200 rpm. As células BMM foram então plaqueadas em 1,5 - 2 x 107 células /placa de 10 cm com 10 mL de D-MEM completo e cultivadas por 24 horas. Células não aderentes foram coletadas e centrifugadas por 5 minutos, a 1,200 rpm e plaqueadas em uma concentração de 2,5 x 104 cé- lulas/poço em uma placa de 96 poços para ensaios de citoto- xicidade, 2 x 104 células/poço em placas de 48 poços, ou 5 x 103 células/poço em placas de 96 poços para ensaios de dife-renciação de osteoclastos. As células foram cultivadas por 3 dias em presença de 10 ng/mL de M-CSF antes de serem lavadas e usadas em estudos subsequentes. Para diferenciação nos os-teoclastos, 30-100 ng/mL de RANKL são adicionados. Os meios foram suplementados depois de 2 dias com M-CSF e RANKL fres-cos .

[0078] Ensaio de Citotoxidade. A citotoxidade de SKI606 contra células BMM foi realizada em placas de cultura de te-cido, com fundo chato e 96 poços. As células BMM (2,5 x 104) foram plaqueadas e tratadas como descrito acima. As células foram incubadas por 72 horas e as células aderentes remanes-centes foram coloridas com violeta cristal (0,5% em metanol a 20% e solubilizadas com tampão de Sorenson (citrato de sódio O,1M, pH 4,2, em metanol a 50%). Absorbância foi medida em 630 nm usando uma leitora de microplacas universal EL800 da Bio-Tek Instruments Inc (Winooski, VT).

[0079] Diferenciação de Osteoclasto In Vitro. Células BMM (2 x 104) foram cultivadas em placas de 48 poços, conforme descrição acima e então tratadas com 100 ng/mL de RANKL e 10 ng/mL de M-CSF. As culturas de células foram submetidas à troca de meio no dia 3. No dia 5, as células foram fixadas e avaliadas quanto à diferenciação de osteoclastos por contagem do número total de células multinucleadas (>3 núcleos), positivas a TRAP, por poço, 96 horas pós tratamento usando o kit de fosfatase ácida dos leucócitos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

[0080] Ensaio de Reabsorção Óssea. Células BMM (5 x 103) foram cultivadas em placas de 96 células conforme descrição acima. Em resumo, as células foram semeadas sobre placas Os- teoAssay™ da Cambrex (Rockland, ME) e tratadas inicialmente com 100 ng/mL de RANKL e 10 ng/mL de M-CSF com ou sem SKI606. As culturas de células foram suplementadas com 10 ng/mL de M-CSF fresco no dia 3. No dia 5, uma aliquota de 20 pL do sobrenadante foi usada para avaliar a reabsorção óssea da placa OsteoAssay™. A reabsorção óssea foi avaliada por medição de liberação de colágeno I da placa OsteoAssay™ u- sando CrossLaps para kit de cultura ELISA da Nordic Biosci-ence Diagnostics (Portsmouth, VA) . A absorbância foi medida em 450 nm usando a leitura em 650 nm, como referência usando uma leitora de microplacas universal EL800 da Bio-Tex Ins-truments Inc (Winoosli, VT).

[0081] Dependência do Tempo. Células BMM (2x 104) foram cultivadas em placas de 48 poços conforme descrição acima e tratadas com RANKL (100 ng/mL) em ausência ou presença de SKI606 300nM, adicionadas ou estimuladas com RANKL e colori-das para TRAP 96 horas depois do tratamento, ou adicionadas 12, 24 ou 48 horas depois de estimulação com RANKL e colori-das para TRAP nas 96 horas. As células foram então fixadas, coloridas para TRAP e os números de osteoclastos foram con-tados em cada condição, conforme descrição acima.

[0082] Co-cultura de RAW 264.7 com células MDA MB435 e Meios Condicionados. Para ensaios de co-cultura, RAW264.7 (500 células/poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços e deixadas aderirem por 12 horas. As MDA-MB-435 foram então introduzidas na cultura de RAW264.7 em densidade crescente e incubadas por 12 horas. As co-culturas foram então incubadas com ou sem SKI606, nas concentrações indicadas, por 5 dias. As células foram então fixadas, coloridas para TRAP e os nú-meros de osteoclastos foram contados em cada condição con-forme descrição acima.

[0083] Para os meios condicionados, as células MDA-MB-35 foram plaqueadas em placas de 10 cm (1 x 106 células/placa) e incubadas por 36 horas. Os meios foram então removidos, centrifugados por 5 minutos a 2.500 rpm e os sobrenadantes foram isolados e colocados a 4°C, até uso. As células RAW264.7 (750 células/poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços e deixadas aderirem por 12 horas. Os meios condiciona- dos para as células MDA-MB-435 foram adicionados e incubados com SKI606, nas concentrações indicadas, por 5 dias. As cé-lulas foram então fixadas, coloridas para TRAP e os números de osteoclastos foram contados em cada condição, conforme descrição acima.

[0084] Injeções Intraóssea e Processamento de Amostras de Tecidos Ósseos. Células MDA-MB-435 foram colhidas com solução de tripsina a 0,025% - EDTA a 0,01%, foram lavadas em PBS e re-suspensas em PBS, em preparação para implantação nos camundongos. Os animais foram anestesiados com injeções intramusculares de cetamina (100 mg/kg) mais acepromazina (2,5 mg/kg). Os camundongos fêmeas nude NCr, atimicos, foram injetados com 5 x 105 células de câncer da mama MDA-MB-435 em 0, 01 mL de PBS, na tibia proximal de cada camundongo, u- sando uma agulha Hamilton de calibre 28. Três dias após a injeção, os camundongos foram divididos em 3 grupos e o tra-tamento foi iniciado, com gavagem oral' diária do veículo (Methocel a 0,5%/Tween a 0,4% em PBS), 150 mg/kg de SKI606 em veículo, ou injeções subcutâneas de 10 pg/kg de Zomeda (ácido zolendrônico) em 0,1 mL de PBS. 0 tratamento foi dado diariamente, 5 dias por semana, por 9 semanas. Imagens de raios X foram tomadas 35 dias após a injeção, e também em intervalos de 15 dias. Depois de 9 semanas, as imagens de raios X finais foram tomadas, o peso do tumor foi calculado da diferença em peso da perna com tumor e da perna sem tumor do mesmo animal. A tíbia injetada com tumor foi fixada e descalcifiçada em EDTA, e secções foram coloridas para veri-ficação da presença de osteoclastos multinucleados (>3 nú-cleos) usando kit de Fosfatase Ácida dos Leucócitos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Incidência de tumor na tibia foi determinada por exame de secções histológicas. O peso do tu-mor foi determinado como a seguir: peso da perna injetada - peso da perna traseira não injetada do mesmo animal. Áreas de lise foram estimadas a partir de imagens de raio X; o programa NIH Scion foi usado para medir a área das tibias e áreas liticas, para calcular a razão de pixels em zonas 11- ticas/pixels na área da tibia.

RESULTADOS

[0085] Para identificar potenciais inibidores de quinase, os compostos 1, 2, 3, 4, e 5 foram testados quando à sua ca-pacidade de inibir diferenciação de osteoclastos induzidos por RANKL das células RAW264.7. SKI606 foi escolhida porque um composto relacionado havia mostrado ser um inibidor dual de Src e Abl quinases (Boschelli et al., 2001b). SK606 foi identificada e caracterizada, e verificou-se que este com-posto inibe Src em um ensaio de enzima com CI5o de l,2mM e inibe a fosforilação da proteína tirosina dependente de Src em concentrações comparáveis.

[0086] O composto não é citotóxico para células BMM e me-nos que 10% das células morreram em SKI606 600nM, indicando que o efeito inibitório sobre osteoclastogênese não é devido à atividade citotóxica da SKI606 nas células precursoras. A estrutura dessa 4-fenilamino-3-quinolinacarbonitrila é co-nhecida (Figura IA) e tem um efeito inibidor sobre a dife-renciação de osteoclastos mediada por RANKL em BMM em um modo dependente de dose (Figura 1B) . As células BMM parecem ser menos sensíveis à SKI606, se a adição é feita depois de iniciada a osteoclastogênese (Figuras 2A e 2B) . Além disso, a capacidade de SKI606 de inibir reabsorção óssea foi estu-dada por estimulação das células com RANKL em placas Osteo-Assay™ da Cambrex (Rockland, ME) com ou sem SKI606. As cul-turas de BMM tratadas com M-CSF e RANKL em presença de SKI606 300nM exibiram um decréscimo de 3,7 vezes na liberação de colágeno I, um indicador da reabsorção óssea, em comparação com tratamento com M-CSF e RANKL.

[0087] Foi examinada a capacidade da linhagem de células de câncer da mama, MDA-MB-435, de induzir osteoclastogênese em células RAW264.7. Verificou-se que esta era dependente da densidade com um número ótimo de 800 células de MDA-MB-435 por poço (Figura 3A) . 0 número ótimo de células RAW2 64.7 foi estabelecido, para este estudo, em 500 células/poço para co- cultura com células MDA-MB-435 (dados não mostrados) . Meios condicionados de células MDA-MB-435 foram também capazes de suportarem osteoclastogênese em culturas de células RAW264.7 com uma mistura ótima de meios condicionados a 10% de células MDA-MB-435 em DMEM/F12 (Figura 3B) . Isso indica que a capacidade das células MBA-MB-435 de induzirem a osteoclastogênese em células RAW264.7 se deve a um fator liberado e não ao contato de célula com célula. MDA-MB-435 pode também liberar um fator inibidor tal como OPG conforme o número de osteoclastos formados diminuiu com concentrações mais altas dos meios condicionados.

[0088] Estudos adicionais incluíram a investigação da capacida de de SKI606 de inibir a formação de osteoclastos induzida por câncer da mama. SKI606 inibiu significantemente a osteoclastogênese em células RAW264.7 em uma concentração de SKI606 de 400nM (Figura 4A). SKI606 foi também capaz de inibir a osteoclastogênese induzida por meios condicionados de células MDA-MB-435 em um modo dependente de dose (Figura 4B).

[0089] SKI606 foi avaliada em um modelo in vivo, usando ca mundongos fêmeas, nude, NCr, atímicos (8 semanas de idade) injetados com 5 x 105 células MDA-MB-435 em 0,01 ml_ de PBS na tíbia proximal de cada camundongo usando uma agulha Hamilton de calibre 28. Os camundongos foram divididos em três grupos de tratamento e a incidência de tumor na tíbia foi determinada por exame de secções de histologia e peso do tumor. Os pesos de tumores das tíbias dos camundongos tratados ou com SKI606 ou Zomeda foram significantemente menores que os tumores do grupo de controle (Figura 5A e Tabela I). Áreas de lise eram significantemente menores em camundongos tratados com SKI606 ou Zomeda, (Figura 5B e Tabela 1). Além disso, células positivas a TRAP significantemente menores foram contadas nas seções de tumores dos camundongos tratados com SKI606 (Fi-gura 5C). Compósitos das imagens digitais são mostrados nas Figuras 6A-6C. Tabela 1. Avaliação da SKI606 sobre Modelo de Camundongo de Tumor Ósseo com MDA-MB-435

REFERÊNCIAS

[0090] As seguintes referências, até a extensão que elas propor cionam procedimentos exemplares e outros detalhes suplementares aos estabelecidos aqui, são especificamente aqui incorporadas a título de referência. Patente US 4.870.287 Patente US 5.466.468 Patente US 5.760.395 Patente US 6.780.996 Patente US 6.002.008 Pedido de Patente US 2005010170A1 Ammann et al, J. Clin. Invest., 99(7):1699-1703, 1997. Baron et al., J. Cell Biol, 101 (6):2210-2222, 1985. Blair et al, J. Cell Biol, 102(4):1164-1172, 1986. Blair et al, J. Cell Biochem., 48(4):401 -410, 1992. Blair et al., J. Cell Biol, 102(4):1164-1172, 1986. Boschelli et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 13:3797, 2003. Boschelli et al., J Med. Chem., 44:822, 2001b. Boschelli et al., J. Med. Chem., 47:1599, 2004. Bucay et al., Genes Dev., 12(9):1260-1268, 1998. Dougall et al., Genes Dev., 13(18):2412-2424, 1999. Franzoso et al., Genes Dev., 11 (24):3482-3496, 1997. Fujikawa et al., Ann. Rheum. Dis., 55(11 ):816-822, 1996. lotsova et al., Nat. Med., 3(11 ):1285-1289, 1997. Johnson et al., Cell. 71 (4):577-86, 1992. Kong et al., Nature, 397(6717):315-323, 1999. Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(24):11618-11622, 1993. Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(4):1566-1571,2000. Lomaga et al., Genes Dev., 13(8): 1015-1024, 1999. Mitchell et al., Ann. NY Acad. Sci., 690:153-166, 1993. Mitchell et al., J. Clin. Oncol, 8(5):856-869, 1990. Mizuno et al., Gene, 215(2):339-343, 1998. Morton et al., Arch. Surg., 127:392-399, 1992. Mundy et al, Cancer, 80(Supl. 8): 1546-1556, 1997. Mundy, Ann. NY Acad. Sci, 593:91-97, 1990. Poli et al., EMBO J., 13(5):1189-1196, 1994. Ravindranath e Morton, Intern. Rev. Immunol, 7: 303-329, 1991. Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15a Edição, pp. 1035-1038 e 1570- 1580, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980. Rickard et al., J Bone Miner Res., 11 (3):312-324, 1996. Rosenberg et al., Ann. Surg. 210(4):474-548, 1989. Boschelli et al., J. Med. Chem., 44:3965, 2001a. Rosenberg et al., N. Engl. J. Med., 319:1676, 1988. Scheven et al., Nature, 321 (6065):79-78, 1986. Soriano et al., Cell, 64(4): 693-702, 1991. Takahashi et al., Lab Invest. 74(4):827-34, 1996. Takahashi et al., J. Bone Miner Res., 2(4):311-317, 1987. Vaes, J. Cell Biol., 39(3):676-697, 1968. Ye et al., 221th National Meeting of the American Chemical Society, San Diego, Califórnia, Abril de 2001.

Claims (6)

1. Uso de um composto, em que o composto é 4-[(2,4-dicloro-5- metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3-(4-metil-1-piperazinil)propóxi]-3-quinolinacarbonitrila ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um produto farmacêutico para tratamento ou prevenção de lesões osteolíticas, osteoporose, tumor ósseo de células gigantes, mieloma múltiplo, osteó- lise expansiva familiar, osteopenia, doença periodontal, hiperparatiroidismo, erosões periarticulares em artrite reumatóide, doença de Paget, osteopenia induzida por imobilização, hipercalcemia de malignidade, metástase óssea, adamantinoma, cisto (lesão) óssea aneurismal, angiossarcoma (grau alto), angiossarcoma (grau baixo), lesões ósseas de doença de Gaucher, tumor de Brown de hiperparatiroidismo, con- droblastoma, fibroma condromixóide, condrossarcoma, cordoma, condrossarcoma de células claras, osteossarcoma intramedular convencional, doença de articulação degenerativa, fibroma desmoplásico, estenose medular diafisário com histiocitoma fibroso maligno, encondroma, granuloma eosinofílico, hemangioendotelioma epite- lióide, sarcoma de Ewing do osso, osteossarcoma extraósseo, fibrossarcoma, displasia fibrosa, periostite reativa florida, tumor de glomo, sarcoma granulocítico em osso, síndrome de Hardcastle, hemangioma, hemangiopericitoma, osteossarcoma de superfície de alto grau, linfoma de Hodgkin de osso, osteossarcoma intracortical, osteossarcoma bem diferenciado intraósseo, condroma justacortical, leucemia, histiocitoma fibroso maligno, melorreostose, câncer de mama metastático, câncer do rim metastático, câncer de pulmão metastático, câncer da próstata metastático, osteossarcoma multifocal, miosite ossificante, neurofibroma do osso, linfoma não-Hodgkin, fibroma não ossificante (defeito cortical fibroso), lesão de Nora, osteoblastoma, os- teocondroma, osteocondromatose, displasia osteofibrosa, osteoma osteóide, osteoma, osteomielite, osteopatia estriada, osteopecilose, osteossarcoma parosteal, condroma periosteal, ostessarcoma periosteal, sinovite vilonodular pigmentada, sar- coma de pós-Paget, schwanoma de osso, osteossarcoma de pequenas células, cisto ósseo solitário, tumor fibroso solitário, mieloma solitário (plasmacitoma), cisto sub- condral, condromatose sinovial, osteossarcoma telangectático, lesões “Tug” - defeito fibroso metafisário, ou cisto ósseo unicameral.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é da seguinte fórmula:

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é um inibidor de Src quinase.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a metástase óssea é metástase de câncer do pulmão, da cabeça e do pescoço, da mama, pancreático, da próstata, renal, do osso, testicular, cervical, gastrointestinal, do cólon, ou da bexiga.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto farmacêutico está associado com quimioterapia, radioterapia, imuno- terapia, ou cirurgia.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto farmacêutico é formulado para administração oral.

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