KR101385488B1 - Src 키나제 억제제에 의한 골용해성 병변의 억제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골다공증, 관절염, 류마티즘성 관절염, 뼈로의 암전이, 골암, 고칼슘혈증, 정형외과적 이식이 있는 골용해성 병변, 페제트병 및 부갑상선 기능 항진증과 연관된 골 손실을 통상적으로 포함(이에 제한되지는 않음)하는 골 재흡수 질병 또는 병리학적 병태와 관련된 골 재흡수를 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 대표적인 암은 유방암, 전립선암, 대장암, 자궁 내막암, 다발성 골수종, 신장세포암종, 두경부암 및 자궁 경부암종을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 관절염 병태는 아쥬반트, 콜라겐, 세균 및 항원 유도된 관절염, 특히 류마티즘성 관절염을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

골 재흡수 질병, SRC 키나제, 골용해성 병변

Description

SRC 키나제 억제제에 의한 골용해성 병변의 억제{Inhibition of osteolytic lesions by SRC kinase inhibitors}

본 발명은 본원의 참조로서 인용된, 2005년 6월 17일에 출원한 미국 특허 출원 일련 번호 제60/691,933호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 통상적으로 세포 생물학, 세포 생리학, 의학 및 종양학의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 파골세포형성 조절을 필요로 하는 피험자의 파골세포형성, 특히 암 유도된 골 파괴와 관련된 파골세포형성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

유방암은 미국에서 가장 흔한 여성의 악성 종양이고 여성이 암으로 인해 사망하는 2위인 원인이다. 유방암에 걸린 여성은 골전이의 위험이 있다. 유방암 환자의 5 내지 10%는 초기에 골 전이성 질병을 나타낼 수 있다. 전이성 유방암으로부터 유래한 골용해성 골 질환이 있는 환자는 병리학적 골절, 골 통증, 척수 압박 및 고칼슘혈증에 대한 위험이 높다. 골 전이를 치료하는 현재의 표준 관리는 비스포스페이트 치료이고, 이는 골격성 병리현상을 지연시키지만 완전히 예방하지는 못한다. 또한, 이러한 치료가 모든 환자에게 효과가 있는 것은 아니다. 더 효과적인 치료가 요구되므로, 이러한 질병에 대한 추가적인 생물학적 및 분자적 분석이 필요하다. NF-κB의 수용체 활성 인자(RANK) 및 이의 리간드(RANKL, TRANCE/ODF/OPGL로서 또한 공지됨)는 파골세포형성의 중요한 매개체이고, 류마티즘성 관절염, 골다공증, 거대세포골종, 페제트병(Paget disease), 전이성 유방암 및 전립선암, 다발성 골수종 및 가족성 팽창성 골용해를 포함하는 다양한 질환에 관여한다. 오스테오프로테게린(OPG, OCIF/TRl로서 또한 공지됨)은 RANKL이 세포 표면의 이의 수용체 RANK와 결합하는 것을 억제하는 가용성의 디코이(decoy) 수용체이다.

RANKL, RANK 및 OPG의 녹아웃(knockout) 마우스 모델은 파골세포형성에서 이들 분자의 중요한 역할(즉, 골 리모델링)을 증명했다. 이들 분자의 생물학적 중요성은 OPG의 표적화된 파괴에 의한 중증도의 골다공증의 유도 및 RANKL의 표적화된 파괴에 의한 골다골증 유도 또는 OPG의 과발현에 의해 강조된다. 그러므로, 파골세포형성의 원인은 골수의 미세환경에서 OPG에 대한 RANKL의 상대적인 비율에 기인하고, 이러한 균형의 변화가 많은 대사성 골 장애에서 골 손실의 주요 원인이 될 수 있다. RANKL -/- 마우스와 유사하게, RANK의 표적화된 파괴는 또한 골화성 표현형을 유도한다. RANK -/- 및 RANKL -/- 마우스는 모두 파골세포가 없는 것으로 나타났고, 이는 이들 분자가 파골세포형성의 필수 요건임을 나타낸다. 또한, RANK 및 RANKL은 림프절 기관 형성 및 초기 B 및 T 세포 발달에 필요하다. 추가적으로, TRAF6, c-Src, c-Fos 또는 NF-κB 서브유닛 p50/52가 결여된 마우스도 또한 골화성 표현형을 나타낸다; 이들 돌연변이 마우스는 파골세포를 가지지만, 이들 세포는 명백하게 골 재흡수를 하지 못한다. 그러므로, RANKL 및 RANK 뿐만 아니라 이들의 세포질 신호 전달 분자는 정상적인 골 항상성을 조절하는 관리 인자이다.

골 리모델링에서 RANK/RANKL/OPG의 중요성과 증가하는 파골세포 활성에 의한 대부분의 암 유도된 골 파괴 사이의 관계는 골 질환 및 암에서 RANK/RANKL/OPG의 중요한 역할을 제시한다. RANK/RANKL/OPG이 골다공증에 관계하는 것 외에, 최근 보고는 류마티즘성 관절염, 거대 세포 골종, 페제트병 및 가족성 팽창성 골용해(RANK의 엑손 1의 돌연변이에 의함)를 포함하는 다른 질병에서의 이들 분자의 잠재적 역할을 제시한다. 전이성 유방암 및 전립선암은 전이를 통해 골내에 침투하고 성장하여 골용해 병변을 야기하는 능력을 가진다. 종양이 파골세포형성 및 골 파괴를 증가시키는 원인이 되는 전이성 종양 마우스 모델에서, OPG의 전신 투여는 종양 유도된 골 파괴 및 골암과 연관된 통증을 감소시킨다. 그러므로, RANK 신호 전달 기구를 표적화하는 것은 암 및 전이성 골 장애와 관련된 원하지 않는 골 파괴를 억제하는 치료 전략으로서 이용될 가능성이 있다. 전이성 암과 연관된 원하지 않는 골 파괴, 또는 골 손실과 관련되거나 골 손실과 연관된 병태를 예방하는 추가적인 전략이 필요하다.

발명의 요약

본 발명에 따라 화학식 I, II, III 또는 IV의 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:

상기 화학식 I에서,

n은 1 내지 3의 정수이고;
X는 N 또는 CH 이고, 단, X가 N이면, n은 2 또는 3이고;
R은 탄소수 1 내지 3의 알킬이고; R¹은 2,4-디Cl, 5-OMe; 2,4-디Cl; 3,4,5-트리-OMe; 2-Cl, 5-OMe; 2-Me, 5-OMe; 2,4-디-Me; 2,4-디Me-5-OMe; 또는 2,4-디Cl, 5-OEt이고;
R²는 탄소수 1 내지 2의 알킬이다.

상기 화학식 II에서,

n은 2 또는 3이고;
R은 탄소수 1 내지 3의 알킬이고;
R²는 탄소수 1 내지 2의 알킬이다.

상기 화학식 III에서,

n은 2 또는 3이고;
R¹은 2,4-디Cl, 5-OMe; 2,4-디Cl; 3,4,5-트리-OMe; 2-Cl, 5-OMe; 2-Me, 5-OMe; 2,4-디-Me; 2,4-디Me-5-OMe; 또는 2,4-디Cl, 5-OEt이고;
R²는 탄소수 1 내지 2의 알킬이다.

상기 화학식 IV에서,

n은 2 또는 3이고;
R은 탄소수 1 내지 3의 알킬이고;
R¹은 2,4-디Cl, 5-OMe; 2,4-디Cl; 3,4,5-트리-OMe; 2-Cl, 5-OMe; 2-Me, 5-OMe; 2,4-디-Me; 2,4-디Me-5-OMe; 또는 2,4-디Cl, 5-OEt이다.

본 발명의 화합물은 골 재흡수, 병리학적 골 재흡수, 파골세포 활성, 파골세포형성, 골용해성 병변 또는 골 손실 또는 파괴와 관련된 다른 병리학적 병태를 치료, 예방 또는 억제하기 위해 이용될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 화합물은 약제학적 조성물의 일부로서 이용될 수 있다.

본 발명의 특정 화합물은 다음을 포함한다: 화합물 1- 4-((2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노)-6-메톡시-7-(3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시)-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 2- 4-((2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노)-7-(3-(4-에틸-1-피페라지닐)프로폭시)-6-메톡시-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 3- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[2-(4-메틸-1-피페라지닐)에톡시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 4- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-7-[2-(4-에틸-1-피페라지닐)에톡시]-6-메톡시-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 5- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 6- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[2-(1-메틸피페리딘-4-일)에톡시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 7- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[3-(1-메틸피페리딘-4-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 8- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-7-[(1-에틸피페리딘-4-일)메톡시]-6-메톡시퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 9- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[3-(4-메틸피페라진-1-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 10- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 11- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[3-(4-에틸피페라진-1-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 12- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[3-(1-메틸피페리딘-4-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 13- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[2-(4-메틸-1-피페라지닐)에톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 14- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[2-(1-메틸피페리딘-4-일)에톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 15- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[3-(4-프로필-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 16- 4-[(2,4-디클로로페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 17- 6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]-4-[(3,4,5-트리메톡시페닐)아미노]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 18- 4-[(2-클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 19- 6-메톡시-4-[(5-메톡시-2-메틸페닐)아미노]-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 20- 4-[(2,4-디메틸페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 21- 6-메톡시-4-[(5-메톡시-2,4-디메틸페닐)아미노]-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 22- 4-[(2,4-디클로로-5-에톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염. 특정 양태에서 바람직한 화합물은 화합물 1- 4-((2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노)-6-메톡시-7-(3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시)-3-퀴놀린카보니트릴이다.

본원에서 기술한 임의의 방법 또는 조성물은 본원에서 기술한 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해 실행될 수 있는 것으로 고려된다.

청구항 및/또는 명세서에서 용어 " 포함함"과 함께 이용되는 단어 단수 또는 복수의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 또는 그 이상", "하나 이상" 및 "하나 또는 하나 이상"과 일치한다.

청구항에서 용어 "또는"의 사용은, 명백하게 대안만을 나타내거나 상호 배타적인 대안을 나타내지 않는다면, "및/또는"의 의미로 사용되지만, 당해 기재는 단지 대안 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지지한다.

본 발명의 다른 목적, 특성 및 장점은 다음의 상세한 설명에서 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 특성 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명에서 당업자에게 명백해 질 수 있으므로, 본 발명의 특정 양태를 나타내는 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 예시에 의해서만 제공된다.

다음의 도면은 본 발명의 명세서의 일부이고 본 발명의 특정 양태를 추가로 증명하기 위해 포함된다. 본 발명은 하나 이상의 이들 도면과 본원에서 나타낸 특정 양태의 자세한 설명의 조합을 참조로 더 잘 이해될 수 있다.

도 1A 내지 1C. SKI606은 파골세포형성의 강력한 억제제이다. 도 1A는 4-페닐아미노-3-퀴놀린카보니트릴 SKI606의 구조를 도시한 것이다. 도 1B는 BMM 세포를 48웰 플레이트(2x10⁴ 세포/웰)에 도말한 것이고, 표시한 SKI606의 농도를 갖는 4개 군에서 M-CSF(10ng/mL) 또는 M-CSF 및 RANKL(100ng/mL)로 자극한 것을 도시한 것이다. M-CSF를 3일째에 보충했다. 세포를 5일째에 고정하고, 제조원(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)으로부터의 TRAP 염색 키트를 이용하여 TRAP에 대해 염색했다. 도 1C는 3가지 실험의 대표적인 데이터를 도시한 것이다. 다양한 처리로부터의 대표적인 부위의 사진을 10x 대물렌즈를 이용하여 나타냈다.

도 2A 내지 2B. BMM 세포는 시간 의존적 방식으로 SKI606에 반응한다. 도 2A는 BMM 세포를 48웰 플레이트(2x10⁴ 세포/웰)에 도말하고 표시한 시간 동안 4개 군에서 M-CSF(10ng/mL) 또는 M-CSF 및 RANKL(300ng/mL)로 전처리한 후, 300nM SKI606으로 처리한 것을 도시한 것이다. M-CSF를 3일째에 보충했다. 세포를 5일째에 고정하고 제조원(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)의 TRAP 염색 키트를 이용하여 TRAP에 대해 염색했다. 도 2B는 3가지 실험의 대표적인 데이터를 도시한 것이다. 사진은 10x 대물렌즈를 이용한 다양한 처리로부터의 대표적인 부위이다.

도 3A 내지 3B. MDA-MB-435 세포는 RAW264.7 세포에서 파골세포형성을 자극시켰다. 도 3A는 RAW264.7 세포(500 세포/웰; 처리 당 8웰)를 표시한 밀도로 MDA-MD-435 세포와 함께 도말하고 5일 동안 항온처리한 것을 도시한 것이다. 도 3B는 상기한 것과 같이 제조한 조건 배지를 도시한 것이다. RAW264.7 세포(750 세포/웰; 처리 당 8웰)를 표시한 농도의 MDA-MB-435 세포로부터의 조건 배지와 함께 5일 동안 항온처리한 것이다. 배양물을 5일째에 고정하고 제조원(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)의 TRAP 염색 키트를 이용하여 TRAP에 대해 염색했다. 데이터는 5개의 실험의 대표적인 것을 도시한 것이다. 사진은 10x 대물 렌즈를 이용한 상이한 처리로부터의 대표적인 부위이다.

도 4A 내지 4B. SKI606은 RAW264.7에서 MDA-MB-435로 자극된 파골세포형성을 억제한다. 도 4A는 RAW264.7 세포(500 세포/웰; 처리 당 8웰)를 표시한 밀도의 MDA-MB-435(800 세포/웰) 세포와 함께 96웰 플레이트에 도말하고 SKI606의 용량을 증가시키면서 5일 동안 항온처리한 것을 도시한 것이다. 도 4B는 RAW264.7 세포(500 세포/웰; 처리 당 8웰)를 MDA-MB-435로부터의 10% 조건 배지에서 96웰 플레이트에 5일 동안 도말한 것을 나타낸 것이다. 배양물을 5일째에 고정하고 제조(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)의 TRAP 염색 키트를 이용하여 TRAP에 대해 염색했다. 나타낸 데이터는 5개의 실험의 대표이다.

도 5A 내지 5C. SKI606은 종양 성장 및 골용해성 병변을 현저히 감소시켰다. 마우스를 3개의 처리 그룹으로 나누었다. 5x10⁵ MDA-MB-435 세포를 경골 주사한지 3일 후에, 비히클(PBS 중의 0.5% 메토셀(Methocel)/0.4% 트윈)의 경구적 위관 영양법, 비히클 중의 150mg/kg SKI606, 또는 0.1mL PBS 중의 10mg/kg의 조메다(Zomeda)(졸렌드론산)의 피하 주사로 1주일에 5일씩 9주 동안 처리를 시작했다. 도 5A는 다음과 같이 측정된 종양의 중량을 도시한 것이다: 주사된 다리의 중량 - 동일 동물의 주사하지 않은 뒷다리의 무게. 도 5B는 용해 지역을 디지털 X선 이미지로 측정하였다; NIH-Scion 프로그램을 이용하여 경골 지역 및 용해 지역을 측정하고, 용해 지역의 화소/경골 지역의 화소의 비율을 계산한 것을 도시한 것이다. 도 5C는 종양 주사된 경골을 고정하고 EDTA로 탈칼슘화하고, 절편을 제조원(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)의 TRAP 염색 키트를 이용하여 다핵 파골세포(3개 초과의 핵)의 존재에 대해 염색했다.

도 6A 내지 도6C. SKI606은 종양 성장 및 골용해성 병변을 현저히 감소시켰다. X선 이미지를 주사 후 35일째에 취하고, 또한 14일 간격으로 취했다. 9주 후, 최종 X선 이미지를 대조군 그룹, 비히클(PBS 중의 0.5% 메토셀(Methocel)/0.4% 트윈)의 경구적 위관 영양법으로 처리한 그룹(도 6A), 150mg/kg으로 처리한 마우스 그룹(도 6B) 또는 조메다로 처리한 마우스 그룹(도 6C)에서 취했다.

살아있는 골조직은 칼슘 미네랄의 재흡수 및 침강의 과정에 의해 계속 보충된다. 이러한 과정, 즉 흡수-재흡수 주기는 2가지 세포 유형, 골아세포 및 파골세포에 의해 촉진된다. 파골세포는 다핵세포이고 체내에서 뼈를 분해시키는(또는 재흡수하는) 능력을 가진 것으로 알려진 유일한 세포이다. 특정 병리학적 병태에서, 흡수-재흡수 주기가 손상되면 뼈의 분해라는 치명적인 결과를 낳는다. 뼈의 분해는 통상 병리학적 골절, 골 통증, 척수 압박 및 고칼슘혈증에 대한 위험을 증가시킨다.

본 발명의 양태는 통상적으로 골다공증, 관절염, 류마티즘성 관절염, 암의 골전이, 골암, 고칼슘혈증, 정형외과의 이식에 의한 골용해성 병변, 페제트병 및 부갑상선 기능 항진증과 관련된 골 손실을 포함(이에 제한되지는 않음)하는 골용해성 병변, 골 재흡수 질병 또는 병리학적 병태와 관련된 골 재흡수를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 대표적인 암은 유방암, 전립선암, 대장암, 자궁내막암, 다발성 골수종, 신장세포암, 두경부암 및 자궁 경부암을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 관절염 병태는 아쥬반트, 콜라겐, 세균 및 항원 유도된 관절염, 특히 류마티즘성 관절염을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 골용해성 병변은 에나멜상피종, 동맥류성 골 낭종(병변), 혈관 육종 - 고악성도, 혈관 육종 - 저악성도, 고셰병(Gaucher disease)의 골병변, 부갑상선 기능 항진증의 브라운 종양, 연골 모세포종, 연골 점액양 섬유종, 연골 육종, 연골종, 투명 세포 연골 육종, 통상의 골수내 골육종, 퇴행성 관절병, 결합 조직 형성 섬유종, 악성 섬유성 조직 낭종이 있는 골간 골수 협착, 내연골종, 호산구성 육아종, 상피양 혈관내피종, 유잉(Ewing) 골육종, 골외 골육종, 섬유육종, 섬유성 이형성증, 개화성 반응 골막염, 거대세포 종양, 사구 종양, 과립세포 골육종, 하드캐슬 증후군(hardcastle syndrome), 혈관종, 혈관 주위 세포종, 고악성도 표면 골육종, 호지킨 골림프종, 피질내 골육종, 골내 잘 분화된 골육종, 측피질 연골종, 백혈병, 악성 섬유성 조직 낭종, 유성상 과골증, 전이성 유방암, 전이성 신장암, 전이성 폐암, 전이성 전립선암, 다발초점성 골육종, 다발성 골수종, 골화 근육염, 신경섬유골종, 비호지킨 림프종, 비골화 섬유종(섬유성 피질 손상), 노라(Nora) 병변, 골아세포종, 골연골종증, 골연골증(hmoce), 골섬유성 이형성증, 유골 골종, 골종, 골수염, 서조성 골증, 골반문증, 골육종, 페제트병, 방골종 골육종, 골막성 연골종, 골막 골육종, 색소 융모 결절성 활액막염, 페제트병 후 육종, 신경초 골종, 소세포 골육종, 고립성 골낭, 고립성 섬유종, 고립성 골수종(형질 세포종), 연골하 낭종, 활액막 연골종, 모세혈관 확장성 골육종, "터그(Tug)" 병변 - 골간단부 섬유성 결손 또는 고립성 골낭종을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

I. SRC 관련 키나제 억제제

본 발명에 따라 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:

화학식 I

상기 화학식 I에서,

n은 1 내지 3의 정수이고;
X는 N 또는 CH이고, X가 N이면, n은 2 또는 3이고;
R은 탄소수 1 내지 3의 알킬이고;
R¹은 2,4-디Cl, 5-OMe; 2,4-디Cl; 3,4,5-트리-OMe; 2-Cl, 5-OMe; 2-Me, 5-OMe; 2,4-디-Me; 2,4-디Me-5-OMe; 또는 2,4-디Cl, 5-OEt이고;
R²는 탄소수 1 내지 2의 알킬이다.

본 발명의 특정 화합물은 다음을 포함한다: 화합물 1- 4-((2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노)-6-메톡시-7-(3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시)-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 2- 4-((2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노)-7-(3-(4-에틸-1-피페라지닐)프로폭시)-6-메톡시-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 3- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[2-(4-메틸-1-피페라지닐)에톡시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 4- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-7-[2-(4-에틸-1-피페라지닐)에톡시]-6-메톡시-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 5- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 6- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[2-(1-메틸피페리딘-4-일)에톡시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 7- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[3-(1-메틸피페리딘-4-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 8- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-7-[(1-에틸피페리딘-4-일)메톡시]-6-메톡시퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 9- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[3-(4-메틸피페라진-1-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 10- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 11- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[3-(4-에틸피페라진-1-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 12- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[3-(1-메틸피페리딘-4-일)프로폭시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 13- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[2-(4-메틸-1-피페라지닐)에톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 14- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-에톡시-7-[2-(1-메틸피페리딘-4-일)에톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 15- 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[3-(4-프로필-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 16- 4-[(2,4-디클로로페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]-3-퀴놀린카보니트릴; 화합물 17- 6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]-4-[(3,4,5-트리메톡시페닐)아미노]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 18- 4-[(2-클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 19- 6-메톡시-4-[(5-메톡시-2-메틸페닐)아미노]-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 20- 4-[(2,4-디메틸페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 21- 6-메톡시-4-[(5-메톡시-2,4-디메틸페닐)아미노]-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 화합물 22- 4-[(2,4-디클로로-5-에톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[(1-메틸피페리딘-4-일)메톡시]퀴놀린-3-카보니트릴; 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염.

본 발명의 화합물은 파골세포형성 또는 골 손실을 치료, 완화, 예방 또는 억제하기 위해 이용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 화합물은 약제학적 조성물의 일부로서 이용된다. 바람직한 양태에서, 화합물 1- 4-((2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노)-6-메톡시-7-(3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시)-3-퀴놀린카보니트릴이 파골세포형성 또는 골 손실을 억제하는데 이용된다.

약제학적으로 허용되는 염은 아세트산, 락트산, 카복실산, 시트르산, 신남산, 타르타르산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 만델산, 말산, 옥살산, 프로피온산, 염화수소산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산, 글리콜산, 피루브산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 톨루엔설폰산, 살리실산, 벤조산 및 유사하게 공지된 허용되는 산과 같은 유기 및 무기산으로부터 유래한 것들이다.

용어 "알킬"은, 직쇄 알킬 그룹, 측쇄 알킬 그룹, 사이클로알킬(지환족) 그룹, 알킬 치환된 사이클로알킬 그룹 및 사이클로알킬 치환된 알킬 그룹을 포함하는 포화 지방족 그룹의 라디칼을 의미한다. 바람직한 양태에서, 직쇄 또는 측쇄 알킬은 골격에 3개 이하의 탄소 원자를 갖는다.

화합물은 경구; 병변내; 복강내; 근육내 또는 혈관내 주사; 주입; 리포좀 매개된 전달; 국소적; 비강; 항문; 질; 설하; 요도; 경피; 자궁 경막내; 안구 또는 귀 전달에 의해 제공될 수 있다. 본 발명의 화합물을 제공하면서 일관성을 수득하기 위해, 본 발명의 화합물이 단위 용량 형태인 것이 바람직하다. 적합한 단위 용량 형태는 정제, 캡슐, 및 향낭 또는 바이알 중의 분말을 포함한다. 이러한 단위 용량 형태는 0.1, 0.5, 1, 10, 100, 200 내지 300ng 또는 mg의 본 발명의 화합물을 함유하고, 이 사이에 있는 모든 수치 및 범위를 포함하고, 특정 양태에서, 2 내지 100ng 또는 mg이다. 다른 양태에서, 단위 용량 형태는 50 내지 150mg의 본 발명의 화합물을 함유한다. 본 발명의 화합물은 경구적으로 또는 다른 잘 공지된 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 이러한 화합물은 1일 1, 2, 3, 4, 5 내지 6회, 더 일반적으로는 1일, 1주 또는 1달, 수주, 수개월, 또는 수년 동안 1, 2, 3 내지 4회 투여될 수 있다. 유효량은 당업자에 의해 측정될 수 있다: 이는 또한 화합물의 형태에 의존한다. 당업자는 실험적인 활성 시험을 통상적으로 수행하여 생검에서 화합물의 생물활성을 측정할 수 있으므로 투여될 용량뿐만 아니라 임상 시험 데이터를 추정 및 분석할 수 있다.

본 발명의 화합물은 통상의 부형제, 예를 들어, 충전제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 향미제, 색소 첨가제 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 담체는, 예를 들어, 희석제, 분무제, 국소 담체, 수용액, 비수용액 또는 고체 담체일 수 있다. 담체는 중합체가 될 수 있다. 본 발명의 담체는 약제학적으로 허용되는 모든 표준 담체, 예를 들어, 포스페이트 완충 염수 용액, 아세테이트 완충 염수 용액, 물; 유/수 에멀젼 또는 트리글리세라이드 에멀젼과 같은 에멀젼; 다양한 형태의 습윤제, 정제, 피복정제 및/또는 캡슐을 포함한다.

이러한 화합물이 경구적으로 또는 국부적으로 제공되면 다양한 담체의 운반에 의해 피험자에게 제공된다. 통상적으로, 이러한 담체는 부형제, 예를 들어, 전분, 우유, 당, 특정 유형의 점토, 젤라틴, 스테아르산, 활석, 식물성 지방 또는 기름, 검 또는 글리콜을 함유한다. 특정 담체는 원하는 전달 방법에 근거하여 선택될 필요가 있고, 예를 들어, 포스페이트 완충 염수(PBS)는 정맥내 또는 전신 전달을 위해 이용될 수 있고, 식물성 지방, 크림, 살베(salve), 연고 또는 겔은 국소 전달에 이용될 수 있다.

본 발명의 화합물은, 골용해성 병변 및/또는 골 손실의 치료 또는 예방에 유용한, 적합한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 아쥬반트 및/또는 담체와 함께 전달될 수 있다. 이러한 조성물은 액체 또는 동결 건조된 또는 다른 형태의 건조 제형이고 다양한 완충 성분(예를 들어, 트리스-HCl, 아세테이트 및 포스페이트)의 희석제, pH 및 이온 농도 조절제; 알부민 또는 표면으로의 흡수를 막는 젤라틴과 같은 첨가제, 계면 활성제(예를 들어, 트윈 20, 트윈 80, 플루로닉 F86 및 담즙산염), 가용화제(예를 들어, 글리세롤 및 폴리에틸렌글리세롤), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산 및 나트륨 메타비설페이트), 방부제(예를 들어, 티메로살, 벤질 알콜 및 파라벤), 팽창 물질 또는 삼투 조절제(예를 들어, 락토스 및 만니톨); 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체의 공유 접착; 금속 이온과의 착물화; 또는 하이드로겔 또는 리포좀, 마이크로-에멀젼, 미셀, 단층 또는 다층 소포, 파열 적혈구 또는 스페로블라스트의 미립 제제 내로 또는 제제 상으로의 화합물의 도입을 포함한다. 이들 조성물은 화합물 또는 조성물의 물리적 병태, 가용성, 안정성, 생체내 방출 및 생체내 제거 속도에 영향을 줄 수 있다. 조성물의 선택은 특정 병태 또는 질병 상태를 치료, 완화 또는 예방할 수 있는 화합물의 물리적 및 화학적 성질에 따른다.

본 발명의 화합물은 시간의 경과에 따라 화합물의 방출을 유지하도록 하는 캡슐을 통해 국소적으로 전달될 수 있다. 조절된 또는 서방출 화합물은 친유성 저장소(예를 들어, 지방산, 왁스 및 기름) 중의 제형을 포함한다.

본 발명은 파골세포형성 또는 골 손실을 치료, 조절, 완화, 예방 또는 억제하기 위한 활성 치료 물질로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 추가로 제공한다.

본 발명은 사람의 골 손실을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 당해 방법은 골용해 병변으로 진단되거나 위험이 있는 개인에게 유효량의 본 발명의 화합물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 환자에게 제공되는 용량은 투여되는 성분, 투여 목적, 투여 방식 등에 따라 다양하다. "치료학적 유효량"은 골 손실의 증상을 치유하고, 감소시키거나, 완화하는데 충분한 양이다.

본 발명의 화합물은 단독으로, 또는 모든 관련된 질병 상태 또는 병리를 치료하는데 이용된 다른 화합물과 병용하여 전달될 수 있다.

본 발명의 화합물은 상업적으로 이용가능한 출발 물질(a), 문헌에서 기술한 것과 같이 제조될 수 있는 공지된 출발 물질(b) 또는 본원에 참조된 반응식 또는 실험적 방법에 기재된 신규한 중간체(c)로부터 제조되었다. 본 발명의 화합물은 본원의 참조로서 인용된 미국 특허 제6,002,008호 및 제6,780,996호 및 미국 공개특허공보 제20050101780A1호에서 개시된 합성 경로에 따라 제조될 수 있다.

반응은 이용된 시약 및 물질에 적절하고 영향을 받는 반응에 적합한 용매 중에서 수행된다. 유기 합성 분야의 당업자는 분자 상에 존재하는 다양한 작용기가 제안된 화학적 변형과 반드시 일치해야 함을 이해한다. 구체화되지 않은 경우에, 합성 단계의 순서, 보호 그룹의 선택 및 탈보호 조건을 당업자는 쉽게 인식할 수 있다. 또한, 몇몇 예에서, 출발 물질 상의 치환체는 특정 반응 조건과 모순될 수 있다. 특정 치환체에 대해 적절한 제한은 당업자에게 자명할 수 있다. 반응은, 경우에 따라, 불활성 대기하에서 수행된다.

화학식 I의 화합물의 제조는 문헌[참조: Boschelli et al., 2001a; Boschelli et al., 2001b; Boschelli et al., 2003; Boschelli et al., 2004, and Ye et al., 2001; 본원에 참조로서 인용됨]에서 보고되었다.

II. 골 흡수-재흡수 주기

살아있는 골 조직은 칼슘 미네랄의 재흡수 및 침전의 과정에 의해 연속적으로 보충된다. 이러한 과정, 즉 흡수-재흡수 주기는 2가지 세포 유형, 골아세포 및 파골세포에 의해 촉진된다. 파골세포는 다핵세포이고 체내에서 뼈를 분해시키는(또는 재흡수하는) 능력을 가진 것으로 알려진 유일한 세포이다. 이러한 재흡수 활성은 골조직의 파골세포형성 구멍(pit)(재흡수 공간)에 의해 이루어진다. 실제로, 세포 배양물에서 파골세포 활성은, 뼈 또는 향유 고래 상아질과 같은 미네랄화된 조직의 슬라이스 상에서 이들 피트를 형성할 수 있는 능력에 의해 측정된다. 파골세포는 혈액의 형성 요소를 공유하는 조혈모세포 전구체로부터 유래한다[참조: Takahashi et al., 1987]. 파골세포의 전구체는 단핵 세포(단일 핵을 가진 세포)이고, 골수에서 발견되고 세포 융합에 의한 복제 및 분화 진행 후 성숙하고 독특한 다핵성 파골세포를 형성한다. 성숙한 파골세포는, 파골세포 지표로서 자주 이용되는 효소 타르트레이트 내성 산성 포스파타제의 존재에 의해 다른 다핵성 세포와 구분된다.

비정상적인 파골세포 발달 또는 기능과 연관된 병리학적 병태 중에서 골 재흡수의 증가에 의한 연약하고/하거나 부서지기 쉬운 골 구조의 발생 병태, 예를 들어, 골다공증, 또는 골 흡수의 증가에 의한 과량의 골 질량의 발생 병태, 예를 들어, 골화석증이 있다. 과잉 또는 결핍된 파골세포 또는 골아세포 집단의 발달 원인은 상응하는 특정 사이토카인의 결핍 또는 과잉이다.

공지된 많은 사이토카인은 혈액 세포를 자극하거나 억제한다: M-CSF, 변형 성장 인자 알파(TGF-α), 인터루킨-1(IL-1) 및 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 몇가지 성장 조절 사이토카인은 골수의 단핵 세포 증식을 자극하는 것으로 나타났다. 인터루킨-1, 종양 괴사 인자 및 인터루킨-6(IL-6)과 같은 사이토카인은 파골세포 및 분화에 영향을 줄 수 있지만(Mundy, 1990), 이들 인자는 특정 파골세포 성장 조절 인자는 아니다.

RANKL, RANK 및 오스테오프로테게린 디코이 수용체(OPG)의 녹아웃 마우스 모델은 파골세포형성에서 이들 분자의 중요한 역할(즉, 골 리모델링)을 증명했다. 이들 분자의 생물학적 중요성은 OPG의 표적화된 파괴에 의해 중증도의 골다공증의 유도, 및 RANKL의 표적화된 파괴에 의하거나 OPG의 과발현에 의한 골다공증의 유도에 의해 강조되었다[참조: Bucay et al., 1998; Kong et al., 1999; Mizuno et al., 1998]. 그러므로, 파골세포형성은 골수의 미세환경에서 OPG에 대한 RANKL의 상대적인 비율에 기여할 수 있고, 이러한 균형의 변화가 많은 대사성 골 장애에서 골 손실의 주요 원인이 될 수 있다. RANKL -/- 마우스와 유사하게, RANK의 표적화된 파괴도 또한 골화성 표현형을 유도한다[참조: Dougall et al., 1999; Li et al., 2000]. RANK -/- 및 RANKL -/- 마우스는 모두 파골세포가 없는 것으로 나타났고, 이는 이들 분자가 파골세포형성을 위한 필수 요건임을 나타낸다. 또한, RANK 및 RANKL은 림프절 기관형성 및 초기 B 및 T 세포 발달에 필요하다[참조: Dougall et al., 1999; Kong et al., 1999]. 또한, TRAF6[참조: Lomaga et al., 1999], c-Src[참조: Soriano et al., 1991], c-Fos[참조: Johnson et al., 1992] 또는 NF-κB 서브유닛 p50/p52[참조: Franzoso et al., 1997; Iotsova et al., 1997]이 결여된 마우스는 또한 골화성 표현형을 나타낸다; 이들 돌연변이 마우스는 파골세포를 가지지만, 이들 세포는 명백하게 골 재흡수에 결함이 있다.

골 완결성의 유지는 골 형성과 골 재흡수 사이의 역동적인 균형을 요구한다. 활성 파골세포의 순 풀(pool) 크기는 파골세포 전구체의 분화 및 융합의 순 효과 및 활성 파골세포의 활성 및 아폽토시스 속도에 의해 결정된다. 골아세포계 세포에 의해 발현되는 다양한 사이토카인(TNF, IL-1, IL-6, IL-11, TGFα) 및 분자(11α, 25-디하이드록시비타민 D3 및 글루코코르티코이드)가 파골세포의 분화에서 역할을 하고 있음을 보였지만, 필수 인자는 RANKL(골아세포에 의한 생산) 및 RANK(파골세포 및 파골세포 전구세포 상에 발현) 뿐만 아니라 생성되는 세포내 신호 전달 기작 및 경로인 것으로 보인다. 또한, 기능이 아직 분명하지 않은 M-CSF가 필요하지만, 초기 파골세포 전구세포의 분화의 개시 및 생존에만 필요할 것이다.

사람의 골격은 계속적으로 리모델링되어, 보통 약 2년 내에 바뀌고 칼슘 항상성에서 골격 미네랄의 이용을 가능하게 한다. 골격의 강도 및 형태는 부분적인 대체에 의해 보존된다; 뼈 부분은 단핵세포-대식세포 전구체로부터 형성된 파골세포에 의해 분해되는 반면[참조: Scheven et al., 1986; 및 Fujikawa et al., 1996], 기질 세포(stromal cell)로부터 유래한 골아세포는 신규한 뼈를 합성한다[참조: Rickard, et al., 1996]. 이들 관련없는 세포는 결합된 방식으로 분화하고, 수주 내에 새로운 뼈 부분을 생성한다.

다핵성 거대세포인 파골세포는 조혈줄기세포로부터 발생하고 생리학적 및 병리학적 골 재흡수를 책임지는 주요 세포이다. 파골세포는 뼈의 무기 및 유기 상의 제거를 위해 분화되어 있다[참조: Blair et al., 1986]. 골 미세환경에서의 사이토카인 및 성장 인자 수준의 변화는 파골세포에 의한 비정상적인 골 재흡수를 일으킨다[참조: Mudndy, et al., 1997 참조]. 따라서, 가용성 TNF-α수용체를 과발현하는 마우스[참조: Ammann, et al., 1997] 또는 IL-6 유전자가 결여된 마우스[참조: Poli, et al., 1994]는 에스트로겐 결여에 의한 골 손실로부터 보호되지만, IL-4[참조: Lewis, et al., 1993] 및 G-CSF[참조: Takahashi, et al., 1996]를 강제 발현시킨 마우스는 골감소증이 유도된다.

하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 미네랄 상의 용해는 탄산탈수효소(carbonic anhydrase) II 및 수소 이온 펌프의 기능을 통해, 하위 파골세포의 재흡수 공간의 산성화에 의존한다[참조: Vaes, 1968; Baron et al., 1985; Blair et al., 1992].

파골세포의 과잉 골 흡수는 관절염, 골다공증, 치근막염 및 악성 고칼슘혈증을 포함하는 사람의 많은 병리를 일으킨다. 재흡수 동안에, 파골세포는 뼈의 미네랄 및 유기 성분 모두를 제거한다[참조: Blair et al., 1986]. 현재 사람들이 관심있는 주요 골 질환은 골다공증, 악성 고칼슘혈증, 골전이에 의한 골감소증, 치주 질환, 부갑상선 기능 항진증, 류마티즘성 관절염의 관절 주위 미란, 페제트병, 고정화 유도된 골감소증 및 글루코코르티코이드 치료이다. 이들 모든 병태는 골 재흡수(붕괴)와 골 형성 사이의 불균형으로 인한 골 손실을 특징으로 하고, 평균적으로 1년에 약 14%의 속도로 일생 동안 계속된다. 그러나, 골 회전율의 속도는 위치에 따라 다르고, 예를 들어, 척수의 해면골 및 턱의 치조골에서의 속도가 장골의 피질보다 빠르다. 골 손실의 가능성은 회전율과 직접적으로 관련되며 골절의 위험이 증가된 상태인 폐경 직후 척수골에서는 1년에 5% 이상이 될 수 있다. 회전율은 골아세포 활성의 증가 또는 감소에 의해서나, 파골세포 활성의 증가 또는 감소에 의해서 영향을 받는다. 피험자의 파골세포 및/또는 골아세포를 조절하기 위한 조성물 및 방법은 골 손실과 연관된 다양한 질병 또는 병태의 치료에 유용할 수 있다.

상기한 모든 병태는 파골세포형성 또는 골 재흡수를 억제하거나 조절하는 제제를 이용한 치료로부터 이점을 얻을 수 있다. 골 재흡수의 억제를 위한 하나의 기작은 파골세포 전구체의 세포 융합의 억제이다.

III. 골용해 병태를 치료하는 방법

본 발명은 병리학적 골 재흡수 만성병 또는 병태인 피험자의 치료에 관한 것이다. 용어 "치료적 이점"은 여성/남성 병태의 의학적 치료에 대한 피험자의 복지를 촉진하거나 증강시키는 모든 것을 지칭하고, 이는 골용해 병태의 치료, 및/또는 골 재흡수, 파골세포 활성 및/또는 파골세포형성의 조절을 포함한다.

A. 약제학적 제형 및 전달

본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함하는 방법을 고려한다. 하나 이상의 본 발명의 화합물로 예방, 완화 또는 치료할 수 있는 질병 또는 병태의 예는 폐, 두경부, 유방, 췌장, 전립선, 신장, 뼈, 고환, 자궁 경부, 위장, 대장, 방광 및 다른 암 전이뿐만 아니라 골용해성 병변과 관련된 또는 연관된 질병 또는 병태를 포함(이에 제한되지 않음)하는 암의 골전이와 연관된 골 손실을 포함한다.

약제학적 조성물의 "유효량"은 통상적으로 상기한 원하는 결과, 예를 들어, 골용해 병태 또는 질병 또는 이의 증상의 범위를 완화, 감소, 최소화 또는 제한하는 결과를 얻기 위해 탐색 및 반복하기에 충분한 양으로서 정의한다. 특정 양태에서, 질병의 예방, 제거, 완치 또는 치료를 포함하는 더 엄격한 정의가 적용될 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 파골세포형성을 억제하거나, 골 재흡수를 역전시키거나 방해하거나 감소시키는 것이 바람직하다. 투여 경로는 당연히 위치 및 병변의 특성에 따라 다양하고, 예를 들어, 피내, 피하, 국소적, 비경구, 정맥내, 근육내, 비강내, 전신 및 경구 투여 및 제형을 포함할 수 있다.

연속 투여가 또한 경우에 따라 적용될 수 있다. 주사기 또는 도관법을 통한 전달이 고려된다. 이러한 연속적인 관류는 치료의 개시 후 약 1 내지 2시간에서 약 2 내지 6시간, 약 6 내지 12시간, 약 12 내지 24시간, 약 1 내지 2일, 약 1 내지 2주 또는 그 이상의 기간까지 이루어질 수 있다. 일반적으로, 연속적인 관류를 통한 치료 조성물의 용량은 특정한 단일 또는 다회 주사의 용량과 동일할 수 있고, 관류가 일어나는 시간 기간 동안 조정될 수 있다.

치료는 다양한 "단위 용량"을 포함할 수 있다. 단위 용량은 소정량의 치료 조성물을 함유하는 것으로 정의된다. 투여될 양 및 특정 경로 및 제형은 임상의 당업자의 기술 범위에 속한다. 단위 용량은 단일 주사로서 투여될 필요는 없지만 결정된 기간 동안의 연속적인 관류를 포함할 수 있다. 본 발명의 단위 용량은 제형의 용적 당 mg 또는 치료 조성물의 중량(예를 들어, mg 또는 밀리그램)으로 용이하게 기재할 수 있다.

몇몇 양태에서, 하나 이상의 본 발명의 조성물을 포함하는 조성물의 전달 방법은 전신 투여를 통해서이다. 그러나, 본원에서 개시한 약제학적 조성물은 대안적으로 경구적으로, 피하로, 기관내, 정맥내, 피내, 근육내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 주사는 주사기 또는 용액의 주사에 이용되는 임의의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.

유리 염기 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 물 중에서 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합하여 제조할 수 있다. 분산은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 중에서 및 기름 중에서 제조할 수 있다. 저장 및 이용의 통상의 조건 하에서, 이들 제제는 방부제를 함유하여 미생물의 생장을 예방한다. 주사용에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(특별히 본원의 참조로서 인용된 미국 특허 제5,466,468호 참조). 이 모든 경우에서, 당해 형태는 멸균되어야 하고 쉽게 주사기 내에 존재할 수 있을 정도의 유체이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하고 세균 또는 곰팡이와 같은 미생물의 오염 활동으로부터 보존되어야 한다.

담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 기름을 함유하는 용매 또는 분산 매질이 될 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 이용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 이용에 의해 유지되어야 한다. 미생물의 활동은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빅산, 티머로살 등과 같은 다양한 항균제 또는 항진균제에 의해 예방할 수 있다. 많은 경우에서, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제의 조성물을 이용함으로써 이루어질 수 있다.

수용액의 경구 투여의 경우, 예를 들어, 필요한 경우 용액은 적합하게 완충되어야 하고 액체 희석액은 처음에 충분한 염수 및 글루코스로 등장성으로 해야 한다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명의 개시에서 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 용량을 1mL의 등장성 NaCl 용액에 용해시킬 수 있고 1000mL의 대량 피하 주사 유체에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pp. 1035-1038 및 1570-1580]. 약간의 용량 변화는 치료받는 피험자의 병태에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여하는 사람은, 임의의 경우에서, 개별 피험자에 대한 적절한 용량을 측정할 수 있다. 또한, 사람 투여의 경우, 제제는 기관[FDA Office of Biologics standards]이 요구하는 멸균, 발열성, 일반적 안전성 및 순도 기준을 만족시켜야 한다.

멸균 주사 용액은 필요로 하는 다양한 상기 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 필요한 양의 활성 화합물을 도입하여 제조된 후, 여과 멸균한다. 통상적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을 염기성 분산 매질을 함유하는 멸균 비히클에 도입하여 제조되고, 상기한 것들과 다른 성분을 필요로 한다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 몇몇 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이전의 이의 멸균 여과 용액으로부터 추가로 요구되는 임의의 성분을 제공하는 진공 건조 및 냉동 건조 기법이다.

본원에서 기재된 조성물은 중성 또는 염의 형태로 제형화 될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가 염(단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성됨)을 포함하고, 이는, 예를 들어, 염화수소산, 인산 등과 같은 무기산이나, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성된다. 또한, 유리 카복실 그룹과 함께 형성된 염은 또한, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 철 수산화물과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화시, 용액은 용량 제형과 상용하는 방식으로 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 제형은 투여 용액, 약제 방출 캡슐 등과 같은 다양한 용량 형태로 쉽게 투여될 수 있다.

본원에서 이용한 바와 같이, "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 당해 매질 및 시약의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 시약이 활성 성분과 상용성이 없는 경우를 제외하고, 치료 조성물 중에서의 이의 용도가 예상된다. 보충적인 활성 성분은 또한 당해 조성물에 도입될 수 있다.

용어 "약제학적으로 허용되는"은 사람에게 투여되었을 때 알레르기 또는 유사한 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수용성 조성물의 제조는 당업계에 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 투여할 수 있는 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조된다; 주사전 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다.

B. 병용 치료

특정 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 골 재흡수, 파골세포 활성 및/또는 파골세포형성을 억제하거나 조절하는 조성물을 포함하고, 치료받는 피험자의 삶의 질을 더 좋게 하기 위해, 항종양 치료와 같은 다른 치료의 효과를 증강시키기 위한 시약 또는 조성물과의 병용하여 이용될 수 있다. 이들 조성물은, 예를 들어, 암세포의 사멸 또는 성장 억제 및 파골세포형성, 파골세포의 활성 또는 골 재흡수의 억제와 같은 바람직한 효과를 획득하기 위해 배합된 유효량으로 제공될 수 있다. 당해 방법은 세포와 본 발명의 화합물, 및 제2의 치료제(들) 또는 다인자(들)가 동시에 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 이는 세포를 단일 조성물 또는 2개 이상의 제제를 포함하는 약제학적 제형과 접촉시킴으로써, 또는 하나 이상의 조성물이 본 발명의 조성물을 포함하고 하나 이상의 다른 조성물이 하나 이상의 제2의 치료제를 포함하는, 2개 이상의 개개의 조성물 또는 제형과 세포를 접촉시킴으로써 획득된다.

본 발명의 일 양태에서, 항파골세포 치료는 세포사멸 촉진성, 항혈관형성, 항암 또는 세포 주기 조절제 외에, 면역 치료 중재와 함께 이용되는 것이 고려된다. 대안적으로, 당해 치료는 수분 내지 수주의 범위 간격으로 다른 치료의 전 또는 후에 수행될 수 있다. 하나 이상의 제2의 치료제 및 항파골세포 치료가 개별적으로 세포, 조직, 기관 또는 피험자에게 적용되는 양태에서, 각각의 전달 시간 사이에 상당한 시간이 초과되지 않음으로써, 이러한 제2의 시약 및 본 발명의 조성물이 피험자에게 유리한 병용의 효과를 발휘할 수 있게됨을 당업자는 통상적으로 확신할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자가 세포를 서로 약 12 내지 24시간 이내, 더 바람직하게는, 서로 약 6 내지 12시간 이내에 2가지 양태로 접촉시킬 수 있음이 고려된다. 몇몇 상황에서, 치료 시간 범위를 현저히, 그러나, 각 투여 사이에 수일(2,3,4,5,6 또는 7일) 내지 수주(1,2,3,4,5,6,7 또는 8주) 간격으로 확장하는 것이 바람직할 수 있다.

다양한 조합이 이용될 수 있고, 예를 들어, 본 발명의 조성물은 "A"이고 화학치료와 같은 제2의 치료는 "B"이다:

환자에게 본 발명의 항파골세포 조성물의 투여는 만약에 있을 수 있는 독성을 고려하여, 이러한 조성물의 투여를 위한 일반 프로토콜을 따를 수 있다. 치료 주기가 필요한 만큼 반복될 수 있음이 예상된다. 또한, 다양한 표준 치료뿐만 아니라 외과적 중재가 본원에서 기술한 치료와 병용하여 적용될 수 있음이 고려된다.

특정 양태에서, 화학치료, 방사선 치료 또는 면역 치료와 같은 항암치료가 본원에서 기술한 항파골세포 치료와 병용하여 이용될 수 있음이 고려된다.

1. 화학치료

암치료는 또한 화학 및 방사선 기반 치료와 함께 다양한 복합 치료를 포함할 수 있다. 복합 화합치료는, 예를 들어, 시스플라틴(CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메틀로에타민, 사이클로포스프아미드, 캠프토테신, 이포스프아미드, 멜파란, 클로르암부실, 부술판, 니트로슈리아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 필코마이신, 미토마이신, 에토포사이드(VP 16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 겜시타비엔, 나벨바인, 파네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플래티넘, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트 또는 상기의 임의의 유사체 또는 유도 변형체를 포함한다.

2. 방사선 치료

DNA 손상을 일으키고 광범위하게 이용되어 온 다른 인자는 γ선, X선으로서 통상 공지된 것 및/또는 방사선 동위 원소를 종양 세포로 직접 전달하는 것을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태는 또한 마이크로파, 양성자 빔 조사선(미국 특허 제5,760,395호 및 미국 특허 제4,870,287호) 및 UV 조사가 고려된다. 이들 모든 인자가 광범위한 DNA, DNA의 전구체, DNA 복제 및 보수 및 염색체의 조합 및 유지에서의 손상에 영향을 준다. X선에 대한 용량 범위는 지속적인 시간 기간(3 내지 4주) 동안 1일 50 내지 200 뢴트겐 내지 단일 용량으로 2000 내지 6000 뢴트겐이다. 방사성 동위원소에 대한 용량 범위는 매우 다양하고, 동위 원소의 반감기, 방출되는 방사능의 세기 및 형태, 및 종양 세포에 의한 수용에 의존한다.

세포에 적용되는 용어 "접촉함" 및 "노출됨"은 본원에서 치료 조성물 및 화학치료제 또는 방사선치료제가 표적 세포, 조직 또는 피험자에게 전달되거나 직접적인 병렬에 놓이는 과정을 기술한 것이다.

3. 면역 치료

암 치료의 문맥에서, 면역 치료는, 통상적으로, 표적에 대한 면역 작동 세포 및 분자(예를 들어, 단일클론 항체)의 이용 및 암 세포의 파괴에 의존한다. 트라스투주맵(Trastuzumab)(허셉틴^TM)이 그러한 예이다. 면역 작동체는, 예를 들어, 종양 세포의 표면상의 몇 개의 마커에 대해 특이적인 항체가 될 수 있다. 당해 항체는 단독으로 치료의 작동체로서 역할을 할 수 있거나 실질적인 효과가 있는 세포 사멸을 위해 다른 세포를 이용할 수 있다. 당해 항체는 또한 약제 또는 독소(화학치료, 방사성 핵종, 리신 A쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)와 결합될 수 있고, 표적화 시약으로서만 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 작동체는 직접 또는 간접적으로 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자를 갖는 림프구가 될 수 있다. 다양한 작동 세포는 세포 독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다. 치료 양태의 병용, 즉 직접적인 세포 독성 활성 및 ErbB2의 억제 또는 감소는 ErbB2 과발현 암의 치료에서 치료적 이점을 제공할 수 있다.

수동적인 암의 면역 치료를 위한 다수의 상이한 접근이 존재한다. 이는 다음과 같이 넓게 분류할 수 있다: 항체 단독 주사; 독소 및 화학치료제와 결합된 항체의 주사; 방사성 동위원소와 결합된 항체의 주사; 항유전자형(idiotype) 항체의 주사; 및 마지막으로, 골수 내의 종양 세포의 소거.

능동 면역 치료에서, 항원성 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 자가 조직 또는 동종 종양 세포 조성물 또는 "백신"이 일반적으로 구분되는 세균성 아쥬반트와 함께 투여된다[참조: Ravindranath and Morton, 1991; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993]. 흑색종 면역 치료에서, 높은 IgM 반응을 유도하는 환자들이 IgM 항체가 없거나 낮은 환자들보다 주로 잘 생존한다[참조: Morton et al., 1992]. IgM 항체는 주로 일시적인 항체이고 항갱글리오사이드 또는 항탄수화물 항체로 나타나는 법칙에서 예외이다.

양자 면역 치료에서, 환자의 순환 림프 세포 또는 종양 침윤 림프 세포는 시험관 내에서 분리되고, IL-2와 같은 림포카인에 의해 활성화되거나 종양 괴사에 대한 유전자로 형질 도입되고 재투여된다[참조: Rosenberg et al., 1998; 1989]. 이를 달성하기 위해, 동물 또는 사람 환자에게 활성화된 면역학적 유효량의 림프구를 상기한 아쥬반트 도입된 항원성 펩티드 조성물과의 배합으로 투여할 수 있다. 활성화된 림프구는, 혈액 또는 종양 샘플로부터 초기에 분리되고 시험관 내에서 활성화된(또는 "증식된") 환자 자신의 세포가 되는 것이 가장 바람직하다. 면역 치료의 이러한 형태는 몇몇 경우의 흑색종 및 신장암의 퇴화를 일으키지만, 반응자의 퍼센트는 반응하지 않는 이들과 비교하여 매우 적다.

4. 외과 수술

암이 있는 사람의 약 60%는 예방적, 진단적 또는 단계결정, 치료적 및 완화적 외과 수술을 포함하는 몇 가지 형태의 외과 수술을 진행할 수 있다. 치료적 외과 수술은 암 조직의 전체 또는 일부가 물리적으로 제거, 절제 및/또는 파괴성 절제술을 포함한다. 종양 절제술은 최소한 종양의 일부를 물리적으로 제거하는 것을 지칭한다. 종양 절제술 외에, 외과 수술에 의한 치료는 레이저 외과 수술, 냉동 외과 수술, 전기 외과 수술 및 현미경으로 조절되는 외과 수술(모스(Mohs') 외과 수술)을 포함한다. 또한, 본 발명은 표피암, 전암(precancer), 또는 부수적인 양의 정상 조직의 제거와 함께 이용될 수 있음이 고려된다.

다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 증명하기 위해 포함된다. 당업자들은 본 발명의 실시에서 더 기능을 잘하기 위해 발명자에 의해 밝혀진 기술을 따르는 실시예에서 공개된 기술을 이해할 수 있으므로, 이의 실시를 위한 바람직한 양태를 구성하는 것을 생각할 수 있다. 그러나, 당업자들은, 본 발명의 공개에서, 많은 변화가, 공개되고 본 발명의 의도 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 유사한 또는 비슷한 결과를 수득하는 특정 양태에서 만들어질 수 있다는 것을 이해해야 한다.

실시예 1

방법

동물 및 세포주. 암컷 무흉선 NCr 누드마우스를 제조원(미국 메릴랜드주 프레데릭 소재의 Animal Production Area of National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility)로부터 수득했다. 흑색 마우스 6마리를(C57BL/6J)를 Charles Rivers(미국 매사추세츠주 윌밍톤 소재)로부터 수득했다. 마우스는 특정 무균 상태하에서 층류의 기류 캐비넷에서 유지되었고 8주령을 이용했다. 모든 시설은 기관[American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)]의 현재 규정 및 기관[the United States Department of Agriculture, the Department of Health and Human Services] 및 NIH의 기준에 의해 승인되었다. 마우스는 퓨리나(Purina) 설치류 먹이를 먹였고 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 유방암 세포주, MDA-MB-435 세포를 10% FBS 및 1mM 나트륨 피루베이트(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen)가 첨가된 D-MEM(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen) 중에서 유지했다. 마우스 대식세포 세포주 RAW264.7은 10% FBS(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen)가 첨가된 DMEM/F12(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 Invitrogen) 중에서 유지시켰다. 모든 배지는 1:100의 희석으로 펀지존(Fungizone)을 함유했다(최종 농도: 100 단위/mL의 페니실린 G, 스트렙토마이신 및 250ng/mL의 암포테리신 B)

1차 골수 세포 배양. 8 내지 12주령의 흑색의 마우스 6마리(C57BU6J)의 종아리 다리 마디 및 넓적 다리 마디로부터의 1차 골수 세포(BMM)를 무균적으로 절개했다. 골수가 불완전 D-MEM과 함께 흘러나왔고 1200rpm에서 3분동안 원심분리하고 5mL의 불완전 D-MEM에서 재현탁했다. BMM 세포를 20mL의 적혈구 세포 용해 완충액(8.3g/L NH₄Cl, 1g/L 중탄산나트륨, 0.4g/L EDTA) 중에서 실온에서 1 내지 2분 동안 항온처리했다. 10% FBS 및 100단위/mL의 페니실린이 첨가된 25mL의 D-MEM(완전 D-MEM)을 첨가하고 BMM 세포를 3분 동안 1200rpm에서 원심분리했다. 그 후, BMM 세포를 10mL의 완전 D-MEM과 함께 1.5 내지 2 x 10⁷ 세포/10cm 디쉬에 도말하고 24시간 동안 배양했다. 비부착 세포를 수집하고 5분동안 1200rpm에서 원심분리하고 세포 독성 검사를 위해 96 웰 디쉬에 2.5 x 10⁴ 세포/웰, 파골세포 분화 검사를 위해 48 웰 플레이트에 2 x 10⁴ 세포/웰 또는 96 웰 플레이트에 5 x 10³ 세포/웰의 농도로 도말했다. 세포를 10ng/mL M-CSF의 존재 하에 3일 동안 배양한 후 세척하고 추가 연구에 이용했다. 파골세포로의 분화를 위해 30 내지 100ng/mL의 RANKL이 첨가된다. 2일 후, 배지에 새로운 M-CSF 및 RANKL을 첨가했다.

세포 독성 검사. BMM 세포에 대한 SKI606의 세포독성을 96 웰 평저 조직 배양 디쉬에서 수행했다. BMM 세포(2.5 x 10⁴)를 도말하고 상기한 바와 같이 처리했다. SKI606을 배양 배지 중에 희석하고 2배 연속 희석으로 웰에 첨가했다. 세포를 72시간 동안 항온처리하고, 잔류한 부착 세포를 크리스털 바이올렛(20% 메탄올 중의 0.5%)으로 염색하고 소렌슨(Sorenson's) 완충액(50% 에탄올 중의 0.1M 나트륨 시트레이트, pH 4.2,)으로 가용화시켰다. 흡수도를 제조원(미국 버몬트주 위누스키 소재의 Bio-Tek Instrument Inc.)로부터의 기구[EL 800 universal microplate reader]를 이용하여 630nm에서 측정했다.

시험관내 파골세포 분화. BMM 세포(2 x 10⁴)를 상기한 바와 같이 48 웰 플레이트에서 배양한 후 100ng/mL의 RANKL 및 10ng/mL의 M-CSF를 처리했다. 세포 배양물을 3일째에 배지 교환했다. 5일 째에, 세포를 고정하고 96시간 처리 후 웰 당 TRAP 양성의 다핵화(3개 초과의 핵) 세포의 총수를 제조원(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)로부터의 백혈구 산성 포스파타제 키트를 이용하여 계수함으로써 파골세포 분화에 대해 평가했다.

골 재흡수 검사. BMM 세포(5 x 10³)를 상기한 바와 같이 96 웰 플레이트에서 배양했다. 간단히, 세포를 제조원(미국 메인주 로클랜드 소재의 Cambrex)로부터 오스테오검정(OsteoAssay^TM) 플레이트 상에 도말하고 초기에 100ng/mL의 RANKL 및 10ng/mL의 M-CSF를 300nM의 SKI606의 존재 또는 부재 하에 처리했다. 3일째에 세포 배양물에 새로운 10ng/mL의 M-CSF로 처리했다. 5일째에, 상청액의 20㎕ 분취량을 오스테오검정 플레이트로부터의 골 재흡수를 평가하는데 이용했다. 골 재흡수는 제조원(미국 버지니아주 포츠머스 소재의 Nordic Bioscience Diagnostics)으로부터의 키트[CrossLaps for Culture ELISA kit]를 이용하여 오스테오검정 플레이트로부터의 콜라겐 I의 방출을 측정함으로써 평가되었다. 흡수도를 제조원(미국 버몬트주 위누스키 소재의 Bio-Tek Instrument Inc)으로부터의 기구[EL800 universal microplate reader]를 이용하여 참조로서 650nm에서의 판독을 이용하여 450nm에서 측정했다.

시간 의존성. BMM 세포(2 x 10⁴)를 48 웰 플레이트에서 상기한 바와 같이 배양하고 RANKL(100ng/mL)로 300nM의 SKI606의 존재 또는 부재 하에 처리하고 96시간 처리 후에 RANKL 자극제를 첨가하고 TRAP 염색하거나, 12, 24 또는 48시간 후 RANKL 자극제를 첨가하고 96시간에서 TRAP를 염색했다. 그 후, 세포를 고정하고, TRAP에 대해 염색하고 각 상태에서 파골세포의 수를 상기한 바와 같이 계수했다.

MDA-MB435 세포 및 조건 배지와 함께 RAW264.7의 공동 배양. 공동 배양 검사를 위해 RAW264.7(500 세포/웰)을 96 웰 플레이트에 도말하고 12시간 동안 부착하도록 했다. 그 후, MDA-MB-435를 농도를 증가시키면서 RAW264.7 배양물에 도입하고 12시간 동안 항온처리했다. 그 후, 공동 배양을 표시한 농도의 SKI606의 존재 또는 부재 하에 5일 동안 항온처리했다. 그 후, 세포를 고정하고, TRAP에 대해 염색하고, 파골세포의 수를 각 상태에서 상기한 바와 같이 계수했다.

조건 배지의 경우, MDA-MB-435 세포를 10cm 플레이트에 도말하고(1 x 10⁶ 세포/플레이트) 36시간 동안 배양했다. 그 후 배지를 제거하고, 5분 동안 2500rpm에서 원심분리하고 상청액을 분리한 후 4℃에서 이용할 때까지 정치했다. RAW 264.7세포(750 세포/웰)을 96 웰 플레이트에 도말하고 12시간 동안 부착하도록 했다. MDA-MB-435 세포로부터의 조건 배지를 첨가하고 표시한 농도의 SKI606의 존재 또는 부재 하에 5일 동안 항온처리했다. 그 후 세포를 고정하고, TRAP에 대해 염색하고 파골세포의 수를 상기한 각 상태에서 계수했다.

골 조직 샘플의 골내 주사 및 공정. MDA-MB-435 세포를 0.025% 트립신- 0.01% EDTA 용액으로 수득하고 PBS로 세척하고 마우스에게 이식하기 위한 제제 중의 PBS 중에 재현탁했다. 동물을 케타민(100mg/kg) 및 아세프로마진(2.5mg/kg)의 근육내 주사에 의해 마취시켰다. 암컷 무흉선 NCr 누드 마우스에 0.01mL의 PBS 중의 5 x 10⁵ MDA-MB-435 유방암 세포를 28 게이지 헤밀턴(Hamiltion) 바늘을 이용하여 각 마우스의 경골 부근에 주사했다. 주사 후 3일째에, 마우스를 3가지 그룹으로 나누고 비히클(PBS 중의 0.5% 메토셀/0.4% 트윈)의 매일 경구 위관 영양법, 비히클 중의 150mg/kg SKI606 또는 0.1mL의 PBS 중의 10㎍/kg의 조메다의 피하 주사의 처리를 시작했다. 처리는 9주 동안 매일, 주당 5일로 주어졌다. X선 이미지를 주사 후 35일 및/또는 14일 간격으로 수득했다. 9주 후, 최종 X선 이미지를 수득하고, 종양 중량을 동일한 동물의 종양 함유 및 종양 미함유 다리의 중량의 차이로부터 계산했다. 종양 주사 경골을 고정하고 EDTA 중에서 탈칼슘화하고, 절편을 제조원(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)로부터의 백혈구 산성 포스파타제 키트를 이용하여 다핵화된 파골세포(3개 초과의 핵)의 존재에 대해 염색했다. 경골에서의 종양의 발생은 조직학 절편의 시험에 의해 측정했다. 종양의 중량을 다음과 같이 측정했다: 주사한 다리의 중량-동일한 동물의 주사하지 않은 뒷다리의 중량. 용해 지역을 디지털 X선 이미지로부터 예측했다; NIH Scion 프로그램을 이용하여 경골 지역 및 용해 지역을 측정하고, 용해 지역의 화소/경골 지역에서의 화소의 비율로 계산했다.

결과

잠재적 키나제 억제제를 동정하기 위해, 화합물 1, 2, 3, 4, 및 5를 RAW264.7 세포의 RANKL 유도에 의한 파골세포 분화를 억제하는 이들의 능력에 대해 시험했다. SKI606은, 관련 화합물이 Src 및 Abl 키나제 이중 억제를 나타내었으므로(Boschelli et al., 2001b) 선택되었다. SKI606은 동정되고 특성 규명되었고 이 화합물이 효소 검사에서 1.2nM의 IC₅₀으로 Src를 억제하고 유사한 농도에서 Src 의존 단백질 티로신 인산화를 억제하는 것으로 밝혀졌다.

당해 화합물은 BMM 세포에 세포 독성이 없으며 600nM의 SKI606에서 10% 이하의 세포가 죽고, 이는 파골세포형성에 대한 억제 효과가 전구체 세포에 대한 SKI606의 세포 독성 활성에 의한 것이 아님을 나타낸다. 당해 4-페닐아미노-3-퀴놀린카보니트릴의 구조가 공지되고(도 1A) BMM 세포에서 농도 의존적 방식으로 RANKL 매개된 파골 세포 분화에 대한 억제 효과를 가진다(도 1B). BMM 세포는 파골세포형성의 개시 후 첨가되면 SKI606에 대해 덜 민감한 것으로 나타난다(도 2A 및 2B). 또한, 골 재흡수를 억제하는 SKI606의 능력은, BMM 세포를 SKI606의 존재 또는 부재하에 제조원(미국 메인주 로클랜드 소재의 Cambrex)으로부터의 오스테오검정 플레이트 상의 RANKL로 자극함으로써 연구되었다. 300nM의 SKI606의 존재 하에 M-CSF 및 RANKL을 처리한 BMM 배양물은, M-CSF 및 RANKL 처리군과 비교하여 골 재흡수의 척도인 콜라겐 I의 방출에서 3.7배 감소함을 나타냈다.

유방암 세포주 MDA-MB-435는 RAW264.7 세포에서 파골세포형성을 유도하는 능력이 시험되었다. 당해 시험은, 최적 수의 800MDA-MB-435 세포/웰에서 농도 의존적임을 밝혔다(도 3A). 당해 연구에서 RAW264.7 세포의 최적 숫자는 MDA-MB-435 세포와의 공동 배양을 위해 500세포/웰로 결정되었다(데이터 나타내지 않음). MDA-MB-435 세포로부터의 조건 배지는 또한 DMEM/F12 중의 MDA-MB-435 세포로부터의 10%의 조건배지의 최적 혼합물 중의 RAW264.7 세포 배양물에서 파골세포형성을 지지할 수 있다(도 3B). 이는 RAW264.7 세포에서 파골세포형성을 유도하는 MDA-MB-435 세포의 능력이 세포-세포 접촉보다 방출 인자에 의한 것임을 나타낸다. MDA-MB-435는 또한 OPG와 같은 억제 인자를 방출할 수 있으므로, 형성된 파골 세포의 수가 더 높은 농도의 조건 배지에서 감소했다.

추가적인 연구는 유방암 유도된 파골세포형성을 억제하는 SKI606의 능력의 조사를 포함한다. SKI606은 RAW264.7 세포에서의 MDA-MB-435 유도된 파골세포형성을 SKI606의 400nM 농도에서 현저히 억제한다(도 4A). SKI606은 또한 MDA-MB-435 세포로부터의 조건 배지에 의한 파골세포형성을 농도 의존 방식으로 억제할 수 있었다(도 4B).

SKI606은, 28 게이지의 해밀턴 바늘을 이용하여 각 마우스의 경골 주위에 0.01mL PBS 중의 5 x 10⁵ MDA-MB-435 세포가 주사된 암컷 무흉선 NCr 누드 마우스(8주령)를 이용하는 생체내 모델에서 평가되었다. 마우스를 3가지 처리 그룹으로 나누고 경골에서의 종양의 발생을 조직학 절편의 시험 및 종양의 중량에 의해 측정했다. SKI606 또는 조메다로 처리한 마우스에서 경골 종양의 중량은 대조군 종양보다 현저히 작았다(도 5A 및 표 1). 용해 지역은 SKI606 또는 조메다로 처리한 마우스에서 현저히 적었다(도 5B 및 표 1). 또한 현저히 적은 TRAP 양성 세포가 SKI606로 처리된 마우스로부터 유래한 종양의 절편에서 계수되었다(도 5C). 디지털 이미지의 합성은 도 6A 내지 6C에서 나타낸다.

참조

다음의 참조문헌은 특히 대표적인 과정 또는 상기한 것들에 대한 다른 자세한 부록을 제공하는 범위에서 본원의 참조에 의해 도입된다.

Claims (15)

1. 치료학적 유효량의 4-[(2,4-디클로로-5-메톡시페닐)아미노]-6-메톡시-7-[3-(4-메틸-1-피페라지닐)프로폭시]-3-퀴놀린카보니트릴 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 골 손실을 예방하거나 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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10. 제1항에 있어서, 상기 골 손실이 골다공증; 거대세포골종; 다발성 골수종; 가족성 팽창성 골용해; 골감소증; 치주 질환; 부갑상선 기능 항진증; 류마티즘성 관절염에서의 관절 주위 미란; 페제트병; 고정화 유도된 골감소증; 악성 고칼슘혈증; 암의 골전이; 에나멜 상피종; 동맥류성 골 낭종(병변); 혈관 육종(고악성도); 혈관 육종(저악성도); 고셰병(Gaucher disease)의 골병변; 부갑상선 기능 항진증의 브라운 종양; 연골 모세포종; 연골 점액양 섬유종; 연골 육종; 연골종; 투명 세포 연골 육종; 통상의 골수내 골육종; 퇴행성 관절병; 결합 조직 형성 섬유종; 악성 섬유성 조직 낭종이 있는 골간 골수 협착; 내연골종; 호산구성 육아종; 상피양 혈관 내피종; 유잉(Ewing) 골육종; 골외 골육종; 섬유육종; 섬유성 이형성증; 개화성 반응 골막염; 거대세포 종양; 과립세포 골육종; 하드캐슬 증후군(Hardcastle syndrome); 혈관종; 혈관 주위 세포종; 고악성도 표면 골육종; 호지킨 골림프종; 피질내 골육종; 골내 잘 분화된 골육종; 측피질 연골종; 백혈병; 악성 섬유성 조직 낭종; 유성상 과골증; 전이성 유방암; 전이성 신장암; 전이성 폐암; 전이성 전립선암; 다발초점성 골육종; 골화 근육염; 신경섬유골종; 비호지킨 림프종; 비골화 섬유종(섬유성 피질 손상); 노라(Nora) 병변; 골아세포종; 골연골종증; 골연골증; 골섬유성 이형성증; 유골 골종; 골종; 골수염; 서조성 골증; 골반문증; 방골성 골육종; 골막성 연골종; 골막성 골육종; 색소 융모 결절성 활액막염; 페제트병 후육종; 신경초 골종; 소세포 골육종; 고립성 골낭; 고립성 섬유종; 고립성 골수종(형질 세포종); 연골하 낭종; 활액막 연골종; 모세혈관 확장성 골육종; "터그(Tug)" 병변 - 골간단부 섬유성 결손; 또는 고립성 골낭종과 관련된 것인 약제학적 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 골전이가 폐암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 자궁 경부암, 위장암, 대장암 또는 방광암 전이인 약제학적 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 골전이가 유방암 또는 전립선암 전이인 약제학적 조성물.
13. 제11항에 있어서, 항종양 치료와 병용하여 투여되는 약제학적 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 항종양 치료가 화학치료, 방사선 치료, 면역 치료 또는 외과 수술인 약제학적 조성물.
15. 제1항에 있어서, 경구로 투여되는 약제학적 조성물.

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