BRPI0613146A2 - inibição de lesões osteolìticas por inibidores de src quinase - Google Patents

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BRPI0613146A2 BRPI0613146-8A BRPI0613146A BRPI0613146A2 BR PI0613146 A2 BRPI0613146 A2 BR PI0613146A2 BR PI0613146 A BRPI0613146 A BR PI0613146A BR PI0613146 A2 BRPI0613146 A2 BR PI0613146A2
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bone
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Bryant G Darnay
Janet E Price
Ann Poblenz
Moshe Talpaz
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Univ Texas
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Abstract

INIBIçãO DE LESõES OSTEOLìTICAS POR INIBIDORES DE SRC QUINASE. A presente invenção incluí métodos e composições para tratar doenças de reabsorção óssea ou reabsorção óssea relacionada a uma condição patológica incluindo, geralmente, mas sem limitação, osteoporose, artrite, artrite reumatólde, metástase de câncer para o osso, câncer ósseo, hipercalcemia, lesões osteolíticas com implantes ortopédicos, doença de Paget, e perda óssea associada ao hiperparatiroidismo. Cânceres representativos incluem, mas sem limitação, câncer da mama, câncer da próstata, câncer do cólon, câncer do endométrio, mieloma múltiplo, carcinoma de células renais, doença de Heck, cânceres do pescoço e da cabeça, e carcinoma cervical. Condições artríticas incluem, mas sem limitação, artrite induzida por adjuvante, colágeno, bactéria e antígeno, particularmente artrite reumatóide.

Description

"inibição de lesões osteolíticas por inibidores desrc quinase"
Este pedido reivindica a prioridade do Pedido dePatente Provisório US 60/691.933 depositado em 17 de junhode 2005, que é aqui incorporado a titulo de referência, emsua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
I. CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se, genericamente, aocampo da biologia, celular, fisiologia celular, medicina eoncologia. Mais particularmente, refere-se a métodos pararegular osteoclastogênese em um paciente que necessite des-tes, e, particularmente, osteoclastogênese relacionada àdestruição de osso induzida por câncer.
II. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
Câncer da mama é a malignidade feminina mais comumnos E.U.A e a segunda causa principal de morte por câncer emmulheres. Mulheres com câncer da mama estão em risco de me-tástases ósseas. 5 a 10% dos pacientes com câncer da mamaapresentarão inicialmente doença metastática no osso. Paci-entes com doença óssea osteolitica de câncer da mama metas-tátici. Pacientes com doença óssea osteolitica do câncer damama metastático estão em risco aumentado de fraturas pato-lógicas, dor óssea, compressão da medula e hipercalcemia. Opadrão corrente de cuidado para tratar metástases ósseas éterapia com bifosfonato, que retarda eventos esqueléticos,mas não as previne. Além disso, nem todos os pacientes res-pondem a este tratamento. Embora seja desejado um tratamentomais eficaz, é requerida uma adicional dissecção moleculardessa doença. 0 ativador de receptor de ΝΚ-κΒ (RANK) e seuligante (RANKL, também conhecido como TRANCE/ODF/OPGL) sãomediadores essenciais da osteoclastogênese e têm sido impli-cados em várias doenças, que incluem artrite reumatóide, os-teoporose, tumor de células gigantes, doença de Paget, cân-cer da mama e da próstata metastáticos, mieloma múltiplo, eosteólise. Osteoprotegerina (OPG, também conhecida como O-CIF/TR1) é um receptor agudo que inibe RANKL de se ligar aoseu receptor de superfície celular RANK.
Modelos de camundongo de nocaute de RANKL, RANK, eOPG têm demonstrado um papel essencial destas moléculas naosteoclastogênese (i.e., remodelagem do osso). A importânciadessas moléculas é enfatizada pela indução de osteoporosegrave por ruptura alvejada da OPG e pela indução de osteopo-rose por ruptura alvejada de RANKL ou por superexpressão deOPG. Assim, a formação de osteoclastos pode ser atribuída àrazão relativa de RANKL para OPG no microambiente da medulaóssea, e alterações neste balanço podem ser a causa princi-pai da perda óssea em muitos distúrbios ósseos metabólicos.Similar a RANKL-/-camundongos, a ruptura alvejada de RANKleva também a um fenótipo osteopetrótico. Tanto a RANK-/-como a RANKL-/-camundongos exibiram ausência de osteoclas-tos, indicando a exigência essencial destas moléculas para aosteoclastogênese. Além disso, RANK e RANKL são requeridaspara organogênese de linfonodos e desenvolvimento precoce decélulas B e T. Adicionalmente, camundongos carentes deTRAF6, c-Src, c-Fos, ou as subunidades de ΝΚ-κΒ p50/p52 mos-tram também um fenótipo osteopetrótico; embora esses camun-dongos mutantes tenham osteoclastos, estas células têm apa-rentemente defeitos na reabsorção óssea. Assim, RANKL eRANK, bem como suas moléculas sinalizadoras citoplásmicassão fatores influenciadores que regulam a homeostasia ósseanormal.
A relação existente entre a importância deRANK/RANKL/OPG na remodelação óssea e que a maior parte dadestruição óssea induzida por câncer é devida à atividadeosteoclástica aumentada sugere um papel principal deRANK/RANKL/OPG em doenças ósseas e câncer. Além do envolvi-mento de RANK/RANKL/OPG na osteoporose, relatórios recentessugerem um papel potencial destas moléculas em outras doen-ças, que incluem artrite reumatóide, tumor de células gigan-tes do osso, doença de Paget, e osteólise expansivel famili-ar (devido à mutação no exon 1 da RANK) . Cânceres da mama eda próstata, metastáticos, têm a capacidade de invadir ecrescer como metástases no osso causando lesões osteolíti-cas. Em modelos de camundongos de tumor metastático, nosquais o tumor causa osteoclastogênese e destruição óssea au-mentada, a administração sistêmica de OPG reduz a destruiçãoóssea mediada por tumor e dor associada ao câncer ósseo. As-sim, alvejar o maquinário de transdução de sinal de RANK po-deria ser usado potencialmente como uma estratégia terapêu-tica para inibir a destruição óssea aumentada associada aocâncer e aos distúrbios metabólicos ósseos. São nencessáriaestratégias adicionais para evitar destruição óssea não de-sejada associada aos cânceres metastáticos, ou condições as-sociadas ou relacionadas à perda óssea.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com a presente invenção são proporciona-dos compostos das Fórmulas estruturais I, II, III, ou IV:
Fórmula I
<formula>formula see original document page 5</formula>
em que η é um número inteiro de 1 a 3; X é N, CH,com a condição que quando X é Ν, η é 2 ou 3; Ré uma alquilade 1 a 3 átomos de carbono; R(I) é 2,4-diCl, 5-OMe; 2,4-diCl; 3,4,5-tri-OMe; 2-C1, 5-OMe; 2-Me; 5-OMe; 2,4-diMe;2,4-diMe-5-OMe, 2,4-diCl, 5-OEt; R(2) é uma alquila de 1 a 2átomos de carbono, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.Fórmula II
<formula>formula see original document page 6</formula>
em que η é 2 ou 3; Ré uma alquila de 1 a 3 átomosde carbono; R(2) é uma alquila de 1 a 2 átomos de carbono, esais farmaceuticamente aceitáveis deste.
Fórmula III
<formula>formula see original document page 6</formula>
em que η é 2 ou 3; R(I) é 2,4-diCl, 5-0Me; 2,4-diCl; 3,4,5-tri-0Me; 2-C1, 5-0Me; 2-Me; 5-0Me; 2,4-diMe;
2,4-diMe-5-OMe, 2,4-diCl, 5-0Et; R(2) é uma alquila de 1 a 2átomos de carbono, ou sais farmaceuticamente aceitáveis deste.Fórmula IV
<formula>formula see original document page 7</formula>
em que η é 2 ou 3; Ré uma alquila de 1 a 3 átomosde carbono; R(I) é 2,4-diCl, 5-OMe; 2,4-diCl; 3,4,5-tri-OMe;2-C1, 5-OMe; 2-Me; 5-OMe; 2,4-diMe; 2,4-diMe-5-OMe, 2,4-diCl, 5-OEt.
Os compostos desta invenção podem ser usados paratratar, prevenir, ou inibir reabsorção óssea, reabsorção ós-sea patológica, atividade de osteoclastos, osteoclastogêne-se, lesões osteoliticas, ou outras condições patológicas comperda ou destruição óssea associada. Em certas modalidades,os compostos são usados como parte de uma composição farma-cêutica.
Compostos específicos da invenção incluem: compos-to 1 - 4-((2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino)-6-metóxi-7-(3-(4-metil-l-piperazinil)propóxi)-3-quinolinacarbonitrila;composto 2 - 4-((2,4-Dicliloro-5-metoxifenil)amino)-7-(3-(4-etil-l-piperazinil)propóxi)-6-metóxi-3-quinolinacarbonitrila; composto 3 - 4-[(2,4- Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(4-metil-l-piperazinil etó-xi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 4 - 4-[ (2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-7-[2-(4-etil-l-piperazinil)etóxi]-6-metóxi-3-quinolinacarbonitrila; composto 5 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 6 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(1-metilpiperidin-4-il)etóxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto7 _ 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3-(1-metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; com-posto 8 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil) amino]-7-[(1-etilpiperidin-4-il)metóxi]-6-metoxiquinolina-3-carbonitrila;composto 9 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-metilpiperazin-l-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila;composto 10 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-i1)metóxi]quinolina-3-carbonitrila ;composto 11 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-etilpiperazin-l-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila;composto 12 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(1-metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 13 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(4-metil-l-piperazinil)etoxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 14 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(1-metilpiperidin-4-il)etóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto15 - 4-[(2, 4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3-(4-propil-l-piperazinil)propóxi]-3-quinolinacarbonitrila; com-posto 16 - 4-[ (2,4-diclorofenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]-3-quinolinacarbonitrila; compos-to 17 - 6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]-4-[(3,4,5-trimetoxifenil)amino]quinolina-3-carbonitrila; com-posto 18 - 4-[(2-cloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; compos-to 19 - 6-metóxi-4-[(5-metóxi-2-metilfenil)amino]-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; compos-to 20 - 4-[(2,4-dimetilfenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; compos-to 21 - 6-metóxi-4-[(5-metóxi-2,4-dimetilfenil)amino]-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; compos-to 22 - 4-[(2,4-dicloro-5-etoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; e saisfarmaceuticamente aceitáveis destes. Em certas modalidadesum composto preferido é o composto 1 - 4-( (2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino)-6-metóxi-7-(3-(4-metil-l-piperazinil)propóxi)-3-quinolinacarbonitrila.
É contemplado que qualquer método ou composição,descrito aqui, pode ser implementado com respeito a qualqueroutro método ou composição descrito aqui.
O uso da palavra "um" ou "uma" quando usado aquiem conjunção com o termo "compreendendo" nas reivindicaçõese/ou no relatório descritivo pode significar "um", mas étambém consistente com o significado de "um ou mais", "pelomenos um" e "um ou mais que um".
0 uso do termo "ou" nas reivindicações é usado pa-ra significar "e/ou", a menos que explicitamente indicadopara referir-se a alternativas somente ou à alternativa se-jam mutuamente exclusivos, embora a exposição fundamente umadefinição referente somente a alternativas e "e/ou".
Outros objetivos, características e vantagens dapresente invenção tornar-se-ão aparentes a partir da seguin-te descrição detalhada. Contudo, deve ser entendido que adescrição detalhada e os exemplos específicos, embora indi-quem modalidades específicas da invenção, são fornecidos atítulo de ilustração, pois várias alterações e modificaçõesdentro do espírito e escopo da invenção tornar-se-ão aparen-tes para aqueles versados na técnica a partir da descriçãodetalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Os seguintes desenhos fazem parte do presente re-latório descritivo e estão incluídos para adicionalmente de-monstrar certos aspectos da presente invenção. A invençãopode ser mais bem entendida por referência a um ou mais des-ses desenhos em combinação com a descrição detalhada das mo-dalidades específicas apresentadas aqui.
Figuras 1A-1C. SKI606 é um potente inibidor de os-teoclastogênese. (FIG. IA) A estrutura da 4-fenilamino-3-quinolinacarbonitrila SKI606. (Fig. 1B) Células BMM foramplaqueadas em placas de 48 poços (2 χ IO4 células/poço) eestimuladas com M-CSF (10 ng/mL) ou M-CSF e RANKL (100ng/mL), em quadrupletos com concentrações indicadas deSKI606. M-CSF foi reabastecido no dia 3. As células foramfixadas e coloridas para TRAP no dia cinco, usando um kit decoloração de TRAP de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). (Fig.1C) Os dados mostrados representam três experimentos. Sãomostradas fotografias de campos representativos dos diferen-tes tratamentos usando uma lente objetiva IOx.
Figuras 2A-2B. As células BMM respondem à SKI606em modo dependente de tempo. (Fig. 2A) Células BMM foramplaqueadas em placas de 48 poços (2 χ IO4 células/poço) epré-tratadas com M-CSF (10 ng/mL) ou M-CSF e RANKL (300ng/mL) em quadrupletos pelos tempos indicados, então trata-dos com SKI606 300nM. M-CSF foi reabastecido no dia 3. Ascélulas foram fixadas e coloridas para TRAP no dia cinco,usando um kit de coloração de TRAP da Sigma-Aldrich (St.Louis, MO). (Fig. 2B) Os dados mostrados representam trêsexperimentos. As fotografias são de campos representativosdos diferentes tratamentos usando uma lente objetiva IOx.
Figuras 3A-3B. As células MDA-MB-435 estimulam aosteoclastogênese nas células RAW264.7. (Fig. 3A) As célulasRAW264.7 (500 células/poço; 8 poços por tratamento) foramplaqueadas em placas de 96 poços células com MDA-MD-435 nasdensidades indicadas e incubadas por 5 dias. (Fig. 3Ba) Omeio condicionado foi preparado conforme descrito acima. Cé-lulas RAW264.7 (750 células/poço; 8 poços por tratamento)incubadas com meio condicionado de MDA-MB-435, nas concen-trações indicadas por 5 dias. As culturas foram fixadas ecoloridas para TRAP no dia cinco, usando um kit de coloraçãode TRAP da Sigma-Aldrich (St. Louis,.MO). Os dados mostradosrepresentam cinco experimentos. As fotografias são de camposrepresentativos a partir dos diferentes tratamentos usandouma lente objetiva IOx.
Figuras 4A-4B. SKI606 inibe osteoclastogênese es-timulada por MDA-MB-435 em RAW264.7. (Fig. 4A) CélulasRAW264.7 (500 células/poço; 8 poços por tratamento) foramplaqueadas em placas com 96 poços com células MDA-MD-435(800 células/poço) em densidades indicadas e incubadas por 5dias em presença de doses crescentes de SKI606. (Fig. 4B)Células RAW264.7 (750 células/poço; 8 poços por tratamento)foram plaqueadas em placas de 96 poços em meios condiciona-dos a 10% de MDA-MB-4 35, por 5 dias. As culturas foram fixa-das e coloridas para TRAP no dia cinco, usando um kit de co-loração de TRAP da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Os dadosmostrados representam cinco experimentos.
Figuras 5A-5C. SKI606 diminui significantemente ocrescimento de tumor e lesões osteoliticas. Os camundongosforam divididos em 3 grupos de tratamento. 0 tratamento foiiniciado 3 dias depois de injeção tibial de 5 χ IO5 de célu-las MDA-MB-435, ou por qualquer gavagem oral de veiculo (Me-tocel 0,5%/Tween 0,4% em PBS), 150 mg/kg de SKI606 em veicu-lo, ou injeções subcutâneas de 10 mg/kg de Zomeda (ácido zo-lendrônico) em 0,1 mL de PBS, 5 dias por semana, durante 9semanas. (Fig. 5A) 0 peso do tumor foi determinado como aseguir: peso da perna injetada - peso da perna traseira nãoinjetada do mesmo animal. (Fig. 5B) Áreas de Iise foram es-timadas a partir de imagens digitais de raios X; foi usado oprograma NIH Scion para medir as áreas tibiais e liticas,para calcular a razão de pixels nas zonas liticas/pixels naárea da tibia. (Fig. 5C) A tibia injetada tumoral foi fixadae descalcificada em EDTA, e seções foram coloridas para ve-rificação da presença de osteoclastos multinucleados (>3 nú-cleos) usando um kit de coloração de TRAP da Sigma-Aldrich(St. Louis, MO).
Figuras 6A-6C. SKI606 reduz significantemente ocrescimento do tumor e lesões osteolíticas. Imagens de raiosX foram tiradas aos 35 dias após a injeção, e também em in-tervalos de 14 dias. Depois de 9 semanas, imagens de raios Xfinais foram tiradas do grupo de controle, tratados com ga-vagem oral de veiculo (Metocel 0,5%/Tween 0,4% em PBS) (Fig.6A), camundongos tratados com 150 mg/kg (Fig. 6B) ou Zomeda(Fig. 6C).
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRATIVASTecido ósseo vivo está continuamente sendo reabas-tecido pelo processo de reabsorção e deposição de mineraisde cálcio. Esse processo, descrito como ciclo de absorção-reabsorção, é facilitado por dois tipos de células, os oste-oblastos e os osteoclastos. O osteoclasto é uma célula mul-tinucleada e é a única célula no corpo conhecida como tendoa capacidade para degradar (ou reabsorver osso). Em certascondições patológicas, o ciclo de absorção-reabsorção ficadefeituoso resultando na degradação do osso. A degradação doosso resulta tipicamente em um risco aumentado de fraturasósseas, compressão da medula espinal e hipercalcemia.
As modalidades da presente invenção incluem méto-dos e composições para tratar lesões osteolíticas e reabsor-ção óssea relacionadas a uma condição patológica, que in-clui, geralmente, mas sem limitação, osteoporose, artrite,artrite reumatóide, metástases de câncer para o osso, câncerósseo, hipercalcemia, lesões osteolíticas com implantes or-topédicos, doença de Paget, e perda óssea associada ao hi-perparatireoidismo. Cânceres representativos incluem, massem limitação, mieloma múltiplo, carcinoma de célula renal,cânceres da cabeça e do pescoço, e carcinoma cervical. Con-dições artríticas incluem, mas sem limitação, artrite indu-zida por adjuvante, colágeno, bactéria e antigeno, particu-larmente artrite reumatóide. Lesões osteoliticas incluem,mas sem limitação, adamantinoma, cisto ósseo aneurismal (le-são), angiossarcoma - alto grau, angiossarcoma - baixo grau,lesões ósseas da doença de Gaucher, tumor marrom do hiperpa-ratireoidismo, condroblastoma, fibroma condromixóide, con-drossarcoma, cordoma, condrossarcoma de células claras, os-teossarcoma intramedular convencional, doença de articulaçãodegenerativa, fibroma desmoplásico, estenose medular diafi-sária com histiocitoma fibroso maligno, encondroma, granulo-ma eosinofilico, hemangioendotelioma epitelióide, sarcoma deEwing do osso, osteossarcoma extraósseo, fibrossarcoma, dis-plasia fibrosa, periostite reativa de coloração vermelho-brilhante, tumor de células gigantes, tumor de glomo, sarco-ma granulocitico em osso, sindrome de Hardcastle, hemangio-na, hemangiopercitoma, osteossarcaoma de superfície de altograu, linfoma de Hodgkin ósseo, osteossarcoma intracortical,osteossarcoma bem diferenciado intraósseo, condroma justa-cortical, leucemia, histiocitoma fibroso maligno, melorreos-tose, câncer da mama metastático, câncer do rim metastático,câncer do pulmão metastático, câncer da próstata metastáti-co, osteossarcoma multifocal, mieloma múltiplo, miosite os-sificante; neurofibroma do osso; linfoma de não-Hodgkin; fi-broma não ossificante (defeito cortical fibroso); lesão deNora; osteoblastoma; osteocondroma; osteocondromatose (hmo-ce) ; displasia osteofibrosa; osteoma osteóide; osteoma; os-teomielite; osteopatia estriada; osteopecilose; osteossarco-ma, doença de Paget, osteossarcoma parosteal; condroma peri-osteal; osteossarcoma periosteal; sinovite vilonodular pig-mentada; sarcoma de pós-Paget; schwanoma de osso; osteossar-coma de pequenas células; cisto ósseo solitário; tumor fi-broso solitário; mieloma solitário (plasmacitoma); cistosubcondral; condromatose sinovial; osteossarcoma telangectá-tico; lesões "Tug" - defeito fibroso metafisário; ou cistoósseo unicameral.
I. INIBIDORES DE QUINASE RELACIONADOS A SRC
De acordo com a presente invencao sao proporciona-dos compostos da seguinte formula estrutural (i):
<formula>formula see original document page 15</formula>
em que: η é um número inteiro de 1 a 3; X é N, CH,com a condição que quando X é Ν, η é 2 ou 3; Ré uma al-quila de 1 a 3 átomos de carbono; R(I) é 2,4-diCl, 5-OMe;2,4-diCl; 3,4,5-tri-OMe; 2-C1, 5-OMe; 2-Me; 5-OMe; 2,4-diMe;2,4-diMe-5-OMe, 2,4-diCl, 5-OEt; R(2) é uma alquila de 1 a 2átomos de carbono, e/ou sais farmaceuticamente aceitáveisdeste.
Compostos específicos da invenção incluem: compos-to 1 - 4-((2, 4-Dicloro-5-metoxifenil)amino)-6-metóxi-7-(3-(4-metil-l-piperazinil)propóxi)-3-quinolinacarbonitrila;composto 2 - 4-((2,4-Dicliloro-5-raetoxifenil)amino)-7-(3-(4-etil-l-piperazinil)propóxi)-6-metóxi-3-quinolinacarbonitrila; composto 3 - 4 — [ (2,4— Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(4-metil-l-piperazinil etó-xi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 4 - 4-[(2,4-Dicloro-5-'metoxifenil)amino]-7-[2-(4-etil-l-piperazinil)etóxi]-6-metóxi-3-quinolinacarbonitrila; composto 5 - 4—[(2,4—Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il) metoxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto 6 - 4—[ (2,4 —Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(1-metilpiperidin-4-il)etóxi]-3-quinolinacarbonitrila; composto7 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3-(1-metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; com-posto 8 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil) amino]-7-[(1-etilpiperidin-4-il)metóxi]-6-metoxiquinolina-3-carbonitrila;composto 9 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-metilpiperazin-l-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila;composto 10 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[(l-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila;composto 11 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-etilpiperazin-l-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila;composto 12 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(l-metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto 13 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(4-metil-l-piperazinil) etoxi] quinolina-3-carbonitrila; composto 14 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(1-metilpiperidin-4-il)etóxi]quinolina-3-carbonitrila; composto15 - 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3-(4-propil-l-piperazinil)propóxi]-3-quinolinacarbonitrila; com-posto 16 - 4-[(2,4-diclorofenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]-3-quinolinacarbonitrila; compos-to 17 - 6-metóxi-7-[(l-metilpiperidin-4-il)metóxi]-4-[(3,4,5-trimetoxifenil)amino]quinolina-3-carbonitrila; com-posto 18 - 4-[(2-cloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; compos-to 19 - 6-metóxi-4-[(5-metóxi-2-metilfenil)amino]-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; compos-to 20 - 4-[(2,4-dimetilfenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; compos-to 21 - 6-metóxi-4-[(5-metóxi-2,4-dimetilfenil)amino]-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; compos-to 22 - 4-[(2,4-dicloro-5-etoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; e saisfarmaceuticamente aceitáveis destes.
Os compostos desta invenção podem ser usados paratratar, atenuar, prevenir, ou inibir osteoclastogênese ouperda óssea. Em uma modalidade preferida, os compostos sãousados como parte de uma composição farmacêutica. Em uma mo-dalidade preferida, o composto 1 - 4-((2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino)-6-metóxi-7-(3-(4-metil-l-piperazinil)propóxi)-3-quinolinacarbonitrila é usado parainibir osteoclastogênese ou perda óssea.
Sais farmaceuticamente aceitáveis são aqueles de-rivados de tais ácidos orgânicos e inorgânicos como: acéti-co, láctico, carboxílico, cítrico, cinâmico, tartárico, suc-cinico, fumárico, maléico, malônico, mandélico, málico, oxá-lico, propiônico, clorídrico, bromidrico, fosfórico, nitri-co, sulfúrico, glicólico, pirúvico, metanossulfônico, eta-nossulfônico, toluenossúlfônico, salicilico, benzóico, e á-cidos similarmente conhecidos e aceitáveis.
0 termo "alquila" refere-se ao radical de gruposalifáticos saturados, incluindo grupos alquila de cadeia li-near, grupos alquila de cadeia ramificada, grupos cicloal-quila (alicíclicos), grupos cicloalquila substituídos comalquila, e grupos alquila substituídos com cicloalquila. Emuma modalidade preferida, uma alquila de cadeia linear ouramificada tem 3 ou menos átomos de carbono em sua cadeiaprincipal.
Os compostos podem ser fornecidos por injeção o-ral; intralesional; intraperitoneal; intramuscular ou intra-venosa; infusão; distribuição mediada por lipossoma; distri-buição tópica; nasal; anal; vaginal; sublingual; uretral;transdérmica; intratecal; ocular ou ótica. De modo a obterconsistência no fornecimento do composto desta invenção, épreferido que um composto da invenção esteja na forma de umadose unitária. Formas de doses unitárias adequadas incluemcomprimidos, cápsulas, e pós em sachet ou ampolas. Tais for-mas de doses unitárias podem conter de 0,1, 0,5, 1, 10, 100,200 a 300 ng ou mg de um composto da invenção, incluindo to-dos os valores e faixas no intervalo deles, e em certos as-pectos de 2 a 100 ng ou mg. Em uma outra modalidade, as for-mas de dosagens unitárias contêm de 50 a 150 mg de um com-posto da presente invenção. Os compostos da presente inven-ção podem ser administrados oralmente ou por outras vias deadministração bem conhecidas. Tais compostos podem ser admi-nistrados de 1, 2, 3, 4, 5 a 6 vezes ao dia, mais usualmentede 1, 2, 3, a 4 vezes ao dia, semana ou mês, durantes sema-nas, meses ou anos. A quantidade eficaz será determinada poraquele versado na técnica; ela será também dependente daforma do composto. Aquele versado na técnica poderia reali-zar rotineiramente testes de atividade empírica para deter-minar a bioatividade do composto em bioensaios e assim de-terminar qual dosagem a ser administrada, bem como extrapo-lar e analisar dados de experimentos clínicos.
Os compostos da invenção podem ser formulados comexcipientes convencionais, tais como carga, agente desinte-grador, ligante, lubrificante, agente flavorizante, aditivode corante, ou veículo. 0 veículo pode ser, por exemplo, di-luente, aerosol, veículo tópico, uma solução aquosa, uma so-lução não aquosa ou um veículo sólido. 0 veículo pode ser umpolímero. Um veículo nesta invenção engloba qualquer um dosveículos padrão farmaceuticamente aceitos, tais como soluçãosalina tamponada com fosfato, solução salina tamponada comacetato, água, emulsões tais como uma emulsão de óleo em á-gua ou uma emulsão de triglicerídeos, vários tipos de agen-tes molhantes, comprimidos, comprimidos revestidos e/ou cáp-sulas.
Quando suprido oral ou topicamente, tais compostosseriam fornecidos a um paciente por distribuição em diferen-tes veículos. Tipicamente, tais veículos contêm excipientestais como amido, leite, açúcar, certos tipos de argila, ge-latina, ácido esteárico, talco, gorduras ou óleos vegetais,gomas, ou glicóis. 0 veiculo especifico necessitaria ser se-lecionado com base no método de distribuição desejado, porexemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) poderiaser usada para distribuição intravenosa e sistêmica e gordu-ras vegetais, cremes, pomadas, ungüentos ou géis podem serusados para distribuição tópica.
Os compostos da presente invenção podem ser dis-tribuídos juntamente com diluentes, conservantes, solubili-zantes, emulsificantes, adjuvantes e/ou veículos adequadosúteis no tratamento ou prevenção de uma lesão osteolíticae/ou perda óssea. Tais composições são líquidos ou formula-ções liofilizadas ou de outro modo secas e incluem diluentesde conteúdo variado de tampão (por exemplo, Tris-HCl, aceta-to, fosfato), pH e resistência iônica, aditivos tais comoalbuminas ou gelatina para prevenir absorção nas superfí-cies, detergentes (por exemplo, TWEEN 20, TWEEN 80, PLURONICF68, sais de ácido bilioso), agentes solubilizantes (por e-xemplo, glicerol, polietileno glicerol), antioxidantes (porexemplo, ácido ascórbico, metabissulfato de sódio), conser-vantes (por exemplo, timerosal, álcool benzílico, parabe-nos), substâncias de avultamento ou modificadores de tonici-dade (por exemplo, lactose, manitol), ligação covalente depolímeros tal como polietileno glicol, complexação com íonsde metal, ou incorporação do composto em ou sobre as prepa-rações particuladas de hidrogéis, lipossomas, microemulsões,micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, fantasmasde eritrócito, ou esferoblastos. Tais composições influenci-arão o estado físico, solubilidade, estabilidade, taxa deliberação in vivo, e taxa de depuração in vivo do compostoou composição. A escolha das composições dependerá das pro-priedades físicas e químicas do composto capaz de tratar,atenuar ou prevenir uma condição particular ou estado doentio.
O composto da presente invenção pode ser distribu-ído via uma cápsula que permite uma liberação constante docomposto por um período de tempo. Composições de liberaçãocontrolada ou constante incluem a formulação em depósitoslipofílicos (por exemplo, ácidos graxos, ceras, óleos).
A presente invenção proporciona ainda um compostoda invenção para uso como uma substância terapêutica ativapara tratar, regular, atenuar, prevenir, ou inibir osteo-clastogênese ou perda óssea.
A presente invenção proporciona ainda um métodopara tratar perda óssea em humanos, que compreende adminis-trar ao indivíduo, diagnosticado com ou em risco de desen-volver uma lesão osteolítica, uma quantidade eficaz de umcomposto ou uma composição farmacêutica da invenção. A dosefornecida ao paciente variará dependendo do que está sendoadministrado, da finalidade da administração, do modo de ad-ministração, e similar. Uma "quantidade terapeuticamente e-ficaz" é uma quantidade suficiente para curar, reduzir ouatenuar sintomas de perda óssea.
Os compostos da invenção podem ser distribuídossozinhos ou em combinações com outros compostos usados paratratar qualquer estado doentio ou patologias relacionadas.
Os compostos da invenção foram preparados de: (a)materiais de partida comercialmente disponíveis, (b) materi-ais de partida conhecidos que podem ser preparados conformedescrição na literatura, ou (c) novos intermediários descri-tos nos esquema e nos procedimentos experimentais aqui refe-renciados. Os compostos incluídos nesta invenção podem serpreparados de acordo com as rotas de síntese descritas naPatente US 6.002.008 e Patente US 6.780.996; e no Pedido dePatente US 20050101780A1, em que cada um destes é aqui in-corporado a título de referência, em sua totalidade.
As reações são realizadas em um solvente apropria-do para os reagentes e materiais empregados e adequados paraas reações que estão sendo efetuadas. Aqueles versados natécnica de síntese orgânica entendem que as várias funciona-lidades presentes na molécula devem ser consistentes com astransformações químicas propostas. Quando não especificadas,a ordem das etapas sintéticas, escolha de grupos protetorese condições de desproteção tornar-se-âo prontamente aparen-tes para aqueles versados na técnica. Além disso, em algunscasos, os substituintes nos materiais de partida podem serincompatíveis com certas condições de reação. Restriçõespertinentes aos dados substituintes serão aparentes para umversado na técnica. As reações são efetuadas sob atmosferainerte, se apropriado.
A preparação dos compostos de Fórmula I foi rela-tada na literatura (Boschelli et al., 2001a; Boschelli etal., 2001b; Boschelli et al.2003; Boschelli et al., 2004, eYe et al., 2001, cada uma destas citações é aqui incorporadaa titulo de referência).
II. CICLO DE ABSORÇÃO-REABSORÇÃO ÓSSEA
O tecido ósseo vivo está sendo continuamente rea-bastecido pelo processo de reabsorção e deposição de mine-rais de cálcio. Esse processo, descrito como o ciclo de ab-sorção-reabsorção, é facilitado por dois tipos de células,os osteoblastos e os osteoclastos. 0 osteoclasto é uma célu-la multinucleada e é a única célula no corpo conhecida porter a capacidade de degradar (ou reabsorver) osso. Essa ati-vidade de reabsorção é obtida pelo osteoclasto que forma es-cavações (lacunas de reabsorção) no tecido ósseo. De fato, aatividade dos osteoclastos na cultura de células é medidapor sua capacidade de formar essas escavações em fatias detecido mineralizado tal como osso ou dentina de baleia ca-chalote. 0 osteoclasto é derivado de um precursor hematopoi-ético que ele compartilha com os elementos formados do san-gue (Takahashi et al., 1987). 0 precursor para o osteoclastoé uma célula mononuclear (célula com um núcleo simples), queé encontrado na medula óssea e o qual forma o osteoclastomaduro e multinucleado único depois de passar por replicaçãoe diferenciação por meio de fusão celular. 0 osteoclasto ma-duro se distingue de outras células multinucleadas pela pre-sença da enzima fosfatase ácida resistente ao tartarato(TRAP), que é freqüentemente usada como um marcador de célula de osteoclasto.
Dentre as condições patológicas associadas ao de-senvolvimento ou função anormal de osteoclastos estão ascondições em que a reabsorção óssea aumentada resulta no de-senvolvimento de estrutura óssea frágil e/ou quebradiça, talcomo osteoporose, ou absorção óssea aumentada resulta no de-senvolvimento de massa óssea em excesso, tal como osteope-trose. Acredita-se que o desenvolvimento de populações deosteoclastos ou osteoblastos em excesso ou deficientes re-sulta de carência ou excesso correspondente de citocinas es-pecificas.
Muitas citocinas conhecidas estimulam ou inibem ascélulas sangüíneas: várias citocinas reguladoras de cresci-mento, tais como M-CSF, fator de crescimento transformantealfa (TGF-α), interleucina-1 (IL-I) e fator de necrose tumo-ral (TNF) têm mostrado que estimulam a proliferação de célu-las mononucleares da medula. Embora as citocinas, tais comointerleucina-1, fator de necrose tumoral e interleucina-6(IL-6), possam influenciar a formação e diferenciação de os-teoclastos (Mundy, 1990), esses fatores não são fatores re-guladores de crescimento de osteoclastos específicos.
Modelos de camundongo de nocaute RANKL, RANK, e(OPG) têm demonstrado um papel essencial destas moléculas emosteoclastogênese (i.e., remodelagem do osso). A importânciabiológica dessas moléculas é enfatizada pela indução de os-teoporose grave por ruptura alvejada da OPG e pela induçãode osteoporose por ruptura alvejada de RANKL ou por superex-pressão de OPG (Bucay et al., 1998; Kong et al., 1999; Mizu-no et al., 1998). Assim, a formação de osteoclastos pode seratribuída à razão relativa de RANKL para OPG no microambien-te da medula óssea, e alterações neste balanço pode ser acausa principal da perda óssea em muitos distúrbios ósseosmetabólicos. Similar a RANKL-/-camundongos, a ruptura alve-jada de RANK leva também a um fenótipo osteopetrótico (Dou-gall et al., 1999; Li et al., 2000). Tanto RANK-/- comoRANKL-/-camundongos exibiram ausência de osteoclastos, indi-cando a exigência essencial destas moléculas para a osteo-clastogênese. Além disso, RANK e RANKL são requeridas paraorganogênese de linfonodos e desenvolvimento precoce de cé-lulas BeT (Dougall et al., 1999; Kong et al., 1999). Adi-cionalmente, camundongos carentes de TRAF6 (Lomaga et al.,1999), c-Src (Soriano et al., 1991), c-Fos (Johnson et al.,1992), ou as subunidades de ΝΚ-κΒ p50/p52 (Franzoso et al.,1997; Iotsova et al., 1997) mostram também um fenótipo oste-opetrótico; embora esses camundongos mutantes tenham osteo-clastos, estas células têm aparentemente defeitos na reab-sorção óssea.
Manutenção de integridade óssea requer um equilí-brio dinâmico entre a formação óssea e reabsorção óssea. 0tamanho da reunião da rede de osteoclastos ativos é determi-nado pelos efeitos da rede de diferenciação e fusão dos pre-cursores de osteoclastos e pela atividade e taxa de apoptosedos osteoclastos ativos. Embora vários citocinas (TNF, IL-1,IL-6, IL-Ilf TGFa) e moléculas (11a, 25-diidroxivitamina D3e glicocorticóides) expressas por células de linhagem de os-teoblastos tenham mostrado que desempenham um papel na dife-renciação dos osteoclastos, parece que os fatores essenciaissão RANKL (produzido por osteoblastos) e RANK (expresso nososteoclastos e progenitores dos osteoclastores) , bem como osmecanismos de sinalização intracelulares e vias resultantes.Há também uma exigência por M-CSF, mas sua função ainda per-manece de difícil compreensão, mas é provavelmente somenterequerida para a iniciação de diferenciação dos progenitoresdos osteoclastos precoces e sobrevivência.
0 esqueleto humano é continuamente remodelado,normalmente renovando em cerca de 2 anos e possibilita o usode minério do esqueleto na homeostasia de cálcio. A resis-tência e conformação do esqueleto são conservadas por subs-tituição segmentai: uma seção óssea é degradada pelos osteo-clastos, formados de precursores de monócito-macrófago (S-cheven et al., 1986; e Fujikawa et al., 1996), enquanto queos osteoblastos, derivados de células estromais, sintetizamosso novo (Rickard, et al., 1996). Essas células não rela-cionadas se diferenciam de um modo acoplado, produzindo umanova seção óssea em poucas semanas.
Os osteoclastos, que são células gigantes multinu-cleadas, provêem de células-tronco hematopoiéticas e são ascélulas primárias responsáveis pela reabsorção fisiológica epatológica. Os osteoclastos são especializados para a remo-ção de ambos as fases inorgânicas e orgânicas do osso (Blairet al., 1986). Alterações nos níveis de citocinas e fatoresde crescimento em microambiente causam reabsorção óssea a-normal pelos osteoclastos (para uma revisão vide Mundy, etal., 1997). Por conseguinte, a expressão forçada de IL-4(Lewis, et al., 1993), e G-CSF (Takahashi, et al., 1996) os-teopenia induzida em camundongos, enquanto camundongos su-perexpressam receptor de TNF-α solúvel (Ammann, et al.,1997) ou esgotados do gene de IL-6 (Poli, et al., 1994) sãoprotegidos contra a perda óssea causada por deficiência deestrogênio.
A dissolução da fase mineral de hidroxiapatita édependente da acidificação da lacuna de reabsorção subosteo-clástica, via a ação de anidrase carbônica II e uma bomba deprótons (Vaes, 1968; Baron et al., 1985; Blair et al., 1992).
Reabsorção óssea excessiva por osteoclastos con-tribui para a patologia de muitas doenças humanas incluindoartrite, osteoporose, periodontite, e hipercalcemia de ma-lignidade. Durante a reabsorção, os osteoclastos removemtanto os componentes minerais e orgânicos do osso (Blair etal., 1986). As doenças ósseas principais correntes de preo-cupação pública são osteoporose, hipercalcemia de malignida-de, osteopenia devido às metástases ósseas, doença periodon-tal, hiperparatireoidismo, erosões periarticulares em artri-te reumatóide, doença de Paget, osteopenia induzida por imo-bilização, e tratamento com glicocorticóide. Todas essascondições são caracterizadas por perda óssea, resultante deum desequilíbrio entre a reabsorção óssea (esgotamento) eformação óssea, que continua por toda a vida na faixa decerca de 14% por ano, na média. Contudo, a taxa de renovaçãoóssea difere de sítio para sítio, por exemplo, é maior queno osso trabecular das vértebras e o osso alveolar nos maxi-lares que nos córtices dos ossos longos. 0 potencial paraperda óssea está diretamente relacionado para a renovação epodem perfazer mais que 5% por ano nas vértebras imediata-mente seguinte à menopausa, uma condição que leva ao riscoaumentado de fratura. A renovação pode ser efetuada por umacréscimo ou decréscimo na atividade dos osteoblastos ou umacréscimo ou decréscimo da atividade dos osteoclastos. Ascomposições e métodos para modular os osteoclastos e/ou ososteoblastos em um paciente seriam útil no tratamento de umavariedade de doenças ou condições associadas à perda óssea.
Todas as condições listadas acima se beneficiariamdo tratamento com agentes que inibem ou regulam a osteoclas-togênese ou reabsorção óssea. Um mecanismo para a inibiçãoda reabsorção óssea é a inibição da fusão de células precur-soras dos osteoclastos.
III. MÉTODOS PARA TRATAR CONDIÇÕES OSTEOLÍTICAS
A presente invenção envolve o tratamento dos paci-entes com uma enfermidade ou condição de reabsorção ósseapatológica. 0 termo "beneficio terapêutico" refere-se aqualquer coisa que promove ou intensifica o bem estar do pa-ciente com respeito ao tratamento médico de condição do pa-ciente, que inclui o tratamento de condições osteoliticase/ou regulação da reabsorção óssea, atividade dos osteoclas-tos, e/ou osteoclastogênese.
A. Formulações Farmacêuticas e Distribuição
Certas modalidades da presente invenção contemplamos métodos envolvendo a distribuição de um ou mais compostosda invenção. Exemplos de doenças e condições que podem serprevenidas, atenuadas, ou tratadas com um ou mais compostosda invenção incluem perda óssea associada à metástase decâncer para o osso, que inclui, mas sem limitação, metásta-ses de câncer do pulmão, da cabeça e do pescoço, da prósta-ta, ósseo, testicular, cervical, gastrintestinal, do cólon,da bexiga e outras, bem como outras doenças ou condição re-lacionadas ou associadas às lesões osteoliticas.
Uma "quantidade eficaz" da composição farmacêuticaé geralmente definida como aquela quantidade suficiente paradetectável e repetidamente obter o resultado desejado esta-belecido, por exemplo, para atenuar, reduzir, minimizar oulimitar a extensão da condição ou doença osteolitica, ouseus sintomas. Em certos aspectos, definições mais rigorosaspodem ser aplicadas, incluindo prevenção, eliminação, erra-dicação ou cura da doença.
Em certas modalidades especificas, é desejado ini-bir osteoclastogênese ou, de outro modo, reverter, impedirou reduzir a reabsorção óssea usando os métodos e composi-ções da presente invenção. As vias de administração varia-rão, naturalmente, com o local e a natureza da lesão e podemincluir, por exemplo, administração e formulação intradérmi-cas, subcutâneas, regionais, parenterais, intravenosas, in-tramusculares, intranasais, sistêmicas, e orais.
Administração continua pode ser também aplicada,quando apropriado. Distribuição via seringa ou cateterismo écontemplada. Tal perfusão continua pode ocorrer por um perí-odo de cerca de 1-2 horas, a cerca de 2-6 horas, a cerca de6-12 horas, a cerca de 12-24 horas, a cerca de 1-2 dias, acerca de 1-2 semanas ou mais tempo, seguinte ao início dotratamento. Em geral, a dose da composição terapêutica viaperfusão contínua será equivalente àquela dada por uma inje-ção simples ou por injeções múltiplas, ajustada por um perí-odo de tempo durante o qual a perfusão ocorre.
Os tratamentos podem incluir várias "doses unitá-rias". A dose unitária é definida como contendo uma quanti-dade predeterminada da composição terapêutica. A quantidadea ser administrada, e a via particular e formulação estãodentro do conhecimento daqueles versados nas técnicas clínicas.
Uma dose unitária não precisa ser administrada como umainjeção simples, mas pode compreender infusão contínua porum período de tempo estabelecido. A dose unitária da presen-te invenção pode ser convenientemente descrita em termos demg por volume de formulação ou peso (por exemplo, miligramasou mg) da composição terapêutica.
Em algumas modalidades, o método para distribuiçãode uma composição compreendendo uma ou mais composições dainvenção é via administração sistêmica. Contudo, as composi-ções farmacêuticas descritas aqui podem ser alternativamenteadministradas via parenteral, subcutânea, intratraqueal, in-travenosa, intradérmica, intramuscular, ou mesmo intraperi-toneal. A injeção pode ser por seringa ou qualquer outro mé-todo usado para injeção de uma solução.
Soluções dos compostos ativos como base livre ousais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas emágua, adequadamente misturados com um tensoativo, tal comohidroxipropilcelulose. As dispersões podem também ser prepa-radas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturasdestes e em óleos. Sob condições ordinárias da armazenagem euso, essas preparações contêm um conservante para impedir ocrescimento de microrganismos. As formas farmacêuticas ade-quadas para o uso injetável incluem soluções aquosas ou dis-persões estéreis e pós estéreis para a preparação extemporâ-nea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis (PatenteUS 5.466.468, aqui incorporada especificamente a titulo dereferência, em sua totalidade) . Em todos os casos, a formadeve ser estéril e deve ser fluida até onde haja uma fácilseringabilidade. Ela deve ser estável sob as condições defabricação e armazenagem e deve ser conservada contra a açãode contaminação de microrganismos, tais como bactérias efungos.
O veiculo pode ser um solvente ou um meio de dis-persão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por e-xemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol li-quido e similares), misturas adequadas destes, e/ou óleosvegetais. Fluididade própria pode ser mantida, por exemplo,pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manu-tenção do tamanho requerido da partícula no caso de disper-são e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação dos mi-crorganismos pode ser efetuada por vários agentes antibacte-rianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol,fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos ca-sos, a absorção das composições injetáveis pode ser obtidapelo uso na composição de agentes retardadores de absorção,por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Para administração parenteral em uma solução aquo-sa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada,se necessário, e o diluente líquido tornado inicialmente i-sotônico com suficiente solução salina ou glicose. Essas so-luções aquosas particulares são especialmente adequadas paraadministração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-tumoral e intraperitoneal. A esse respeito, meios aquososestéreis que podem ser empregados serão conhecidos daquelesversados na técnica à luz da presente exposição. Por exem-plo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 mL da solução deNaCl isotônica e ou adicionada a 1.000 mL de fluido de hipo-dermóclise ou injetado no sitio de infusão proposto, (vide,por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a Edi-ção, pp. 1035-1038 e 1570-1580. Alguma variação da dosagemocorrerá necessariamente dependendo da condição do pacienteque está sendo tratado.
A pessoa responsável pela adminis-tração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada parao paciente individual. Além disso, para administração a hu-manos, as preparações devem satisfazer os padrões gerais deesterilidade, pirogenicidade, segurança e pureza, conformerequeridos pelos padrões do FDA Office of Biologics.
Soluções injetáveis estéreis são preparadas porincorporação dos compostos ativos na quantidade requerida nosolvente apropriado com vários dos ingredientes enumeradosacima, conforme requeridos, seguido por esterilização fil-trada. Em geral, as dispersões são preparadas por incorpora-ção dos vários ingredientes esterilizados em um veículo es-téril que contém o meio de dispersão básica e os outros in-gredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso depós estéreis para a preparação de soluções injetáveis esté-reis, alguns dos métodos de preparação são técnicas de seca-gem sob vácuo e Iiofilização, que produzem um pó do ingredi-ente ativo, mais qualquer ingrediente adicional desejado deuma solução previamente filtrada deste.
As composições descritas aqui podem ser formuladasem uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente acei-táveis incluem sais de adição de ácido (formados com os gru-pos amino livre da proteína) e que são formados com ácidosinorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídricos oufosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como, acético, oxálico,tartárico, mandélico e similares. Os sais formados com osgrupos carboxila livre podem ser também derivados de basesinorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio,potássio, amônio, cálcio, ou férricos, e tais bases orgâni-cas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaínae similares. Mediante formulação, as soluções serão adminis-tradas de um modo compatível com a formulação de dosagem eem tal quantidade que seja terapeuticamente eficaz. As for-mulações são facilmente administradas em uma variedade deformas de dosagem tais como soluções injetáveis, cápsulas deliberação de fármaco e similares.
Como usado aqui, "veículo" inclui qualquer um etodos os solventes, meios de dispersão, veículos, revesti-mentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos,agentes isotônicos e de retardamento de absorção, tampões,soluções de veículos, suspensões, colóides e similares. Ouso de tais meios e agentes para substâncias ativas farma-cêuticas é bem conhecido da técnica. Exceto até onde qual-quer meio convencional ou agente é incompatível com o ingre-diente ativo, seu uso nas composições terapêuticas é contem-plado. Ingredientes ativos suplementares podem ser tambémincorporados nas composições.
A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se aentidades moleculares e composições que não produzem reaçãoalérgica ou irritante similar quando administradas a um hu-mano. A preparação de uma composição aquosa, que contém umaproteína como um ingrediente ativo, é bem entendida na téc-nica. Tipicamente, tais composições são preparadas como so-luções ou suspensões injetáveis; formas sólidas para a solu-ção, ou suspensão, no líquido para injeção podem ser tambémpreparadas.
B. Tratamentos em Combinação
Em certas modalidades, as composições e métodos dapresente invenção envolvem um composto que inibe ou regula areabsorção óssea, a atividade dos osteoclastos, e/ou osteo-clastogênese, que, por sua vez, pode ser usado em combinaçãocom outros agentes ou composições para intensificar o efeitode outros tratamentos, tais como tratamentos antineoplási-cos, para melhorar a qualidade de vida de um paciente queestá sendo tratado. Essas composições seriam providas em umaquantidade eficaz combinada para obtenção do efeito deseja-do, por exemplo, exterminar ou inibir o crescimento de célu-la cancerosa e a inibição de osteoclastogênese, a atividadedos osteoclastos, ou a reabsorção óssea. Esse processo podeenvolver contatar as células com uma composição da invençãoe um segundo agente(s) terapêutico(s) ou fator(es) múlti-plo (s) ao mesmo tempo. Isso pode ser obtido por contato dacélula com uma composição simples ou formulação que incluidois ou mais agentes, ou por contato da célula com duas oumais composições ou formulações distintas, em que pelo menosuma composição inclui uma composição da invenção e uma oumais de outras composições incluem pelo menos um segundo a-gente terapêutico.
Em uma modalidade da presente invenção, é contem-plado que a terapia anti-osteoclastos é usada em conjuntocom a intervenção de imunoterapia, além de agentes pró-apoptóticos, antiangiogênicos ou reguladores do ciclo celu-lar. Alternativamente, a terapia pode preceder ou seguir ooutro tratamento com agente por intervalos que variam de mi-nutos a semanas. Em modalidades onde um ou mais do segundoagente terapêutico e uma terapia anti-osteoclastos são apli-cados separadamente a uma célula, tecido, órgão ou paciente,deve ser em geral assegurado que um periodo de tempo signi-ficante não expire entre o tempo de cada distribuição, demodo que o segundo agente e a composição inventiva seriamcapazes de exercer um efeito vantajosamente combinado no pa-ciente. Em tais casos, é contemplado que se possa contataras células com ambas as modalidades dentro de cerca de 12-24horas uma da outra e, mais preferivelmente, dentro de cercade 6-12 horas uma da outra. Contudo, em algumas situações,pode ser desejável estender significantemente o periodo detempo para tratamento, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7)a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7) decorram entre asrespectivas administrações.
Várias combinações podem ser empregadas, por exem-pio, uma composição da presente invenção é "A" e uma segundaterapia, tal como quimioterapia, é "B":
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B
B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A
B/B/A/A
B/A/B/A/ B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A
A/A/B/A
A administração das composições anti-osteoclastoda presente invenção a um paciente seguirá os protocolos ge-rais para administração de tais composições, levando em con-ta a toxidez, se alguma. Espera-se que os ciclos de trata-mento sejam repetidos se necessário. É também contempladoque várias terapias padrão, bem como intervenção cirúrgica,podem ser aplicadas em combinação com a terapia descrita.
Em modalidades especificas, é contemplado que umaterapia anticâncer, tal como quimioterapia, radioterapia, ouimunoterapia, é empregada em combinação com as terapias an-ti-osteoclasto descritas aqui.
1. Quimioterapia
Terapias de câncer incluem também uma variedade deterapias de combinação com ambos os tratamentos com base emquímica e radiação. Quimioterapias de combinação incluem,por exemplo, cisplatina (CDDP), carboplatina, procarbazina,meclorretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida,melfalano, clorambucila, bussulfano, nitrosouréia, dactino-micina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomi-cina, mitomicina, etoposídeo (VP16), tamoxifeno, raloxifeno,agentes ligantes de receptor de estrogênio, taxol, gencitam-bina, navelbina, inibidores de farnesil-proteina transfera-se, transplatina, 5-fluoruracila, vincristina, vimblastina emetotrexato, ou qualquer análogo ou derivado variante dosacima.
2. Radioterapia
Outros fatores que danificam o DNA e têm sido usa-dos extensivamente incluem aqueles que são comumente conhe-cidos como raios γ, raios X, e/ou a distribuição dirigida deradioisótopos para células tumorais. Outras formas de fato-res danificadores de DNA são também contempladas tais comomicroondas, irradiação de feixe de prótons (Patente US5.760.395 e Patente US 4.870.287) e irradiação de UV. É maisprovável que todos esses fatores efetuem uma ampla extensãode dano no DNA, nos precursores de DNA, na replicação e re-paro de DNA, e na montagem e manutenção dos cromossomos. Asfaixas de dosagens de raios X variam em faixas de doses diá-rias de 50 a 200 roentgens por prolongados períodos de tempo(3 a 4 semanas), a doses simples de 2.000 a 6.000 roentgens.As faixas de dosagens para radioisótopos variam extensamen-te, e dependem da meia vida do isótopo, da resistência e otipo de radiação emitida, e da absorção pelas células neo-plásicas.
Os termos "contatado" e "exposto", quando aplica-dos a uma célula, são usados aqui para descrever o processopelo qual uma composição terapêutica e um agente quimiotera-pêutico ou radioterapêutico são distribuídos a uma célulaalvo, tecido ou paciente, ou são colocados em justaposiçãodireta.
3. Imunoterapia
No contexto do tratamento de câncer, substânciasimunoterapêuticas geralmente se baseiam no uso de células emoléculas imuno-efetoras (por exemplo, anticorpos monoclo-nais) para alvejar e destruir células cancerosas. Trastuzu-mabe (Herceptin™) é um exemplo de tal. O imuno-efetor podeser, por exemplo, um anticorpo especifico para algum marca-dor na superfície de uma célula tumoral. O anticorpo sozinhopode servir como um efetor de terapia ou ele pode recrutaroutras células para realmente efetuar a destruição das célu-las. O anticorpo pode ser também conjugado a um fármaco outoxina (substância quimioterapêutica, radionuclídeo, cadeiaA da ricina, toxina da cólera, toxina da pertussis, etc.) eservir meramente como um agente de alvejamento. Alternativa-mente, o efetor pode ser um linfócito transportando uma mo-lécula de superfície que interage, tanto direta como indire-tamente, com um alvo de célula tumoral. Várias células efe-toras incluem células T citotóxicas e células NK. A combina-ção de modalidades terapêuticas, i.e. atividade citotóxicadireta e inibição ou redução de ErbB2 proporcionaria um be-nefício benéfico no tratamento de cânceres que superexpressam ErbB2.
Existem várias abordagens diferentes para imunote-rapia de câncer. Elas podem ser amplamente categorizadas co-mo a seguir: injeção de anticorpos sozinhos; injeção de an-ticorpos acoplados a toxinas ou a agentes quimioterapêuti-cos; injeção de anticorpos acoplados a isótopos radioativos;injeção de anticorpos antiidiotipicos; e, finalmente, purgade células tumorais na medula óssea.
Na imunoterapia ativa, um peptideo antigênico, po-lipeptideo ou proteína, ou uma composição de células tumo-rais autólogas ou alogênicas ou "vacina" é administrada, ge-ralmente com um adjuvante bacteriano distinto (Ravindranathe Morton, 1991; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990;Mitchell et al., 1993). Na imunoterapia de melanoma, aquelespacientes que elicitam alta resposta a IgM freqüentementesobrevivem melhor que aqueles que não elicitam ou elicitampoucos anticorpos de IgM (Morton et al., 1992).
Anticorpos de IgM são freqüentemente transitórios e a exceção à regraparece ser os anticorpos anti-gangliosídeos ou anti-carboidratos.
Na imunoterapia adotiva, os linfócitos circulantesdo paciente, ou linfócitos infiltrados no tumor, são isola-dos in vitro, ativados por linfocinas tal como IL-2 outransduzidos com genes para necrose tumoral, e re-administrados (Rosenberg et al., 1988; 1989). Para alcançarisso, deve-se administrar a um animal, ou a um paciente hu-mano, uma quantidade imunologicamente eficaz de linfócitosativados em combinação com uma composição de peptídeos anti-gênicos conforme descrita aqui. Os linfócitos ativados se-rão, mais preferivelmente, as próprias células do pacienteque foram anteriormente isoladas de uma amostra de sangue oude tumor e ativadas (ou "expandidas") in vitro. Essa formade imunoterapia tem produzido vários casos de regressão demelanoma e carcinoma renal, mas a percentagem de respondedo-res foram poucas em comparação com aqueles que não responde-ram.
4. Cirurgia
Aproximadamente 60% das pessoas com câncer passa-rão por algum tipo de cirurgia, que inclui cirurgia preven-tiva, diagnostica ou de estadiamento, curativa e paliativa.
Cirurgia curativa inclui ressecção na qual todo ou parte dotecido canceroso é fisicamente removido, excisado, e/ou des-truído. A ressecção de tumor refere-se à remoção física depelo menos parte de um tumor. Além da ressecção do tumor,tratamento por cirurgia inclui cirurgia a laser, criocirur-gia, eletrocirurgia, e cirurgia microscopicamente controlada(cirurgia de Mohs). É ainda contemplado que a presente in-venção pode ser usada em conjunto com a remoção de cânceressuperficiais, pré-cânceres, ou quantidades incidentais detecido normal.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são incluídos para demons-trar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreci-ado por aqueles versados na técnica que as técnicas descri-tas nos exemplos que são dados a seguir representam técnicasdescobertas pelo inventor para funcionarem bem na prática dainvenção, e assim podem ser consideradas como constituindomodos preferidos para sua prática. Contudo, aqueles versadosna técnica devem, à luz da presente exposição, apreciar quevárias alterações podem ser feitas nas modalidades específi-cas que são descritas e ainda obter um resultado parecido ousimilar sem se desviar do espírito e escopo da invenção.EXEMPLO 1
MÉTODOS
Animais e linhagens de células. Camundongos fê-meas, nude, atímicos, NCr, foram obtidos da Animal Producti-on Area of the National Câncer Institute, Frederick CâncerResearch Facility (Frederick, MD) . Seis camundongos pretos(C57BL/6J) foram obtidos da Charles Rivers (Wilmington, MA).
Os camundongos foram mantidos em uma cabine com fluxo de arlaminar sob condições especificas isentas de patógenos e u-sados quando na idade de 8 semanas. Todas as instalações fo-ram aprovadas pela American Association for Accreditation ofLaboratory Animal Care (AAALAC) de acordo com os regulamen-tos e padrõe correntes do United States Department of Agri-culture, o Department of Health and Human Services, e o NIH.
Os camundongos foram alimentados com a ração para roedores,Purina, e água da bica a vontade. A linhagem de células decâncer da mama, células MDA-MB-435 foram mantidas em D-MEM(Invitrògen, Carlsbad, CA) suplementado com FBS a 10% e pi-ruvato de sódio ImM (Invitrògen, Carlsbad, CA) . A linhagemde células de macrófagos do camundongo RAW2 64.7 foi mantidaem DMEM/F12 (Invitrògen, Carlsbad, CA) suplementado com FBSa 10% (Invitrògen, Carlsbad, CA) . Todos os meios continhamFungizone em uma diluição 1:100 (concentração final: penici-Iina G, estreptomicina em 100 unidades/mL e anfotericina, B250 ng/mL).
Cultura de Células Primárias da Medula Óssea. Cé-lulas primárias da medula óssea (BMM) das tíbias e fêmuresforam assepticamente dissecados de 6 camundongos pretos(C57BU6J) com 8 a 12 semanas de idade. A medula óssea foirinsada com D-MEM incompleto e centrifugada a 1.200 rpm por3 minutos e re-suspensa em 5 mL de D-MEM incompleto. As cé-lulas BMM foram incubadas em 20 mL de tampão de Iise de cé-lulas vermelhas do sangue (8,3 g/L de NH4Cl, 1 g/L de bicar-bonato de sódio, 0,4 g/L de EDTA), à temperatura ambiente,por 1 a 2 minutos. Vinte e cinco mililitros de D-MEM suple-mentado com FBS a 10% e 100 unidades/mL de penicilina (D-MEMcompleto) foram adicionados e as células BMM foram centrifu-gadas por 3 minutos a 1.200 rpm. As células BMM foram entãoplaqueadas em 1,5 - 2 χ IO7 células /placa de 10 cm com 10mL de D-MEM completo e cultivadas por 24 horas.
Células nãoaderentes foram coletadas e centrifugadas por 5 minutos, a1,200 rpm e plaqueadas em uma concentração de 2,5 χ IO4 cé-lulas/poço em uma placa de 96 poços para ensaios de citoto-xicidade, 2 χ IO4 células/poço em placas de 48 poços, ou 5 χIO3 células/poço em placas de 96 poços para ensaios de dife-renciação de osteoclastos. As células foram cultivadas por 3dias em presença de 10 ng/mL de M-CSF antes de serem lavadase usadas em estudos subseqüentes. Para diferenciação nos os-teoclastos, 30-100 ng/mL de RANKL são adicionados. Os meiosforam suplementados depois de 2 dias com M-CSF e RANKL frescos.
Ensaio de Citotoxidade. A citotoxidade de SKI606contra células BMM foi realizada em placas de cultura de te-cido, com fundo chato e 96 poços. As células BMM (2,5 χ IO4)foram plaqueadas e tratadas como descrito acima. As célulasforam incubadas por 72 horas e as células aderentes remanes-centes foram coloridas com violeta cristal (0,5% em metanola 20% e solubilizadas com tampão de Sorenson (citrato de só-dio 0,1M, pH 4,2, em metanol a 50%). Absorbância foi medidaem 630 nm usando uma leitora de microplacas universal EL800da Bio-Tek Instruments Inc (Winooski, VT).
Diferenciação de Osteoclasto In Vitro. Células BMM(2 χ IO4) foram cultivadas em placas de 48 poços, conformedescrição acima e então tratadas com 100 ng/mL de RANKL e 10ng/mL de M-CSF. As culturas de células foram submetidas àtroca de meio no dia 3. No dia 5, as células foram fixadas eavaliadas quanto à diferenciação de osteoclastos por conta-gem do número total de células multinucleadas (>3 núcleos),positivas a TRAP, por poço, 96 horas pós tratamento usando okit de fosfatase ácida dos leucócitos da Sigma-Aldrich (St.Louis, MO).
Ensaio de Reabsorção Óssea. Células BMM (5 χ IO3)foram cultivadas em placas de 96 células conforme descriçãoacima. Em resumo, as células foram semeadas sobre placas Os-teoAssay™ da Cambrex (Rockland, ME) e tratadas inicialmentecom 100 ng/mL de RANKL e 10 ng/mL de M-CSF com ou semSKI606. As culturas de células foram suplementadas com 10ng/mL de M-CSF fresco no dia 3. No dia 5, uma alíquota de 20μL do sobrenadante foi usada para avaliar a reabsorção ósseada placa OsteoAssay™. A reabsorção óssea foi avaliada pormedição de liberação de colágeno I da placa OsteoAssay™ u-sando CrossLaps para kit de cultura ELISA da Nordic Biosci-ence Diagnostics (Portsmouth, VA). A absorbância foi medidaem 450 nm usando a leitura em 650 nm, como referência usandouma leitora de microplacas universal EL800 da Bio-Tex Ins-truments Inc (Winoosli, VT).
Dependência do Tempo. Células BMM (2x IO4) foramcultivadas em placas de 48 poços conforme descrição acima etratadas com RANKL (100 ng/mL) em ausência ou presença deSKI606 300nM, adicionadas ou estimuladas com RANKL e colori-das para TRAP 96 horas depois do tratamento, ou adicionadas12, 24 ou 48 horas depois de estimulação com RANKL e colori-das para TRAP nas 96 horas. As células foram então fixadas,coloridas para TRAP e os números de osteoclastos foram con-tados em cada condição, conforme descrição acima.
Co-cultura de RAW 264.7 com células MDA MB435 eMeios Condicionados. Para ensaios de co-cultura, RAW264.7(500 células/poço) foram plaqueadas em placas de 96 poços edeixadas aderirem por 12 horas. As MDA-MB-435 foram entãointroduzidas na cultura de RAW264.7 em densidade crescente eincubadas por 12 horas. As co-culturas foram então incubadascom ou sem SKI606, nas concentrações indicadas, por 5 dias.
As células foram então fixadas, coloridas para TRAP e os nú-meros de osteoclastos foram contados em cada condição con-forme descrição acima.
Para os meios condicionados, as células MDA-MB-35foram plaqueadas em placas de 10 cm (1 χ IO6 células/placa)e incubadas por 36 horas. Os meios foram então removidos,centrifugados por 5 minutos a 2.500 rpm e os sobrenadantesforam isolados e colocados a 4°C, até uso. As célulasRAW264.7 (750 células/poço) foram plaqueadas em placas de 96poços e deixadas aderirem por 12 horas. Os meios condiciona-dos para as células MDA-MB-435 foram adicionados e incubadoscom SKI606, nas concentrações indicadas, por 5 dias. As cé-lulas foram então fixadas, coloridas para TRAP e os númerosde osteoclastos foram contados em cada condição, conformedescrição acima.
Injeções Intraóssea e Processamento de Amostras deTecidos Ósseos. Células MDA-MB-435 foram colhidas com solu-ção de tripsina a 0,025% - EDTA a 0,01%, foram lavadas emPBS e re-suspensas em PBS, em preparação para implantaçãonos camundongos. Os animais foram anestesiados com injeçõesintramusculares de cetamina (100 mg/kg) mais acepromazina(2,5 mg/kg).
Os camundongos fêmeas nude NCr, atimicos, foraminjetados com 5 χ IO5 células de câncer da mama MDA-MB-435em 0,01 mL de PBS, na tibia proximal de cada camundongo, u-sando uma agulha Hamilton de calibre 28. Três dias após ainjeção, os camundongos foram divididos em 3 grupos e o tra-tamento foi iniciado, com gavagem oral' diária do veiculo(Methocel a 0,5%/Tween a 0,4% em PBS), 150 mg/kg de SKI606em veiculo, ou injeções subcutâneas de 10 μg/kg de Zomeda(ácido zolendrônico) em 0,1 mL de PBS. 0 tratamento foi dadodiariamente, 5 dias por semana, por 9 semanas. Imagens deraios X foram tomadas 35 dias após a injeção, e também emintervalos de 15 dias. Depois de 9 semanas, as imagens deraios X finais foram tomadas, o peso do tumor foi calculadoda diferença em peso da perna com tumor e da perna sem tumordo mesmo animal. A tibia injetada com tumor foi fixada edescalcifiçada em EDTA, e secções foram coloridas para veri-ficação da presença de osteoclastos multinucleados (>3 nú-cleos) usando kit de Fosfatase Ácida dos Leucócitos da Sig-ma-Aldrich (St. Louis, MO).
Incidência de tumor na tibia foideterminada por exame de secções histológicas. O peso do tu-mor foi determinado como a seguir: peso da perna injetada -peso da perna traseira não injetada do mesmo animal. Áreasde Iise foram estimadas a partir de imagens de raio X; oprograma NIH Scion foi usado para medir a área das tíbias eáreas líticas, para calcular a razão de pixels em zonas Ii-ticas/pixels na área da tíbia.
RESULTADOS
Para identificar potenciais inibidores de quinase,os compostos 1, 2, 3, 4, e 5 foram testados quando à sua ca-pacidade de inibir diferenciação de osteoclastos induzidospor RANKL das células RAW264.7. SKI606 foi escolhida porqueum composto relacionado havia mostrado ser um inibidor dualde Src e Abl quinases (Boschelli et al., 2001b). SK606 foiidentificada e caracterizada, e verificou-se que este com-posto inibe Src em um ensaio de enzima com CI50 de l,2mM einibe a fosforilação da proteína tirosina dependente de Srcem concentrações comparáveis.
0 composto não é citotóxico para células BMM e me-nos que 10% das células morreram em SKI606 600nM, indicandoque o efeito inibitório sobre osteoclastogênese não é devidoà atividade citotóxica da SKI606 nas células precursoras. Aestrutura dessa 4-fenilamino-3-quinolinacarbonitrila é co-nhecida (Figura IA) e tem um efeito inibidor sobre a dife-renciação de osteoclastos mediada por RANKL em BMM em um mo-do dependente de dose (Figura 1B) . As células BMM parecemser menos sensíveis à SKI606, se a adição é feita depois deiniciada a osteoclastogênese (Figuras 2A e 2B) . Além disso,a capacidade de SKI606 de inibir reabsorção óssea foi estu-dada por estimulação das células com RANKL em placas Osteo-Assay™ da Cambrex (Rockland, ME) com ou sem SKI606. As cul-turas de BMM tratadas com M-CSF e RANKL em presença deSKI606 300nM exibiram um decréscimo de 3,7 vezes na libera-ção de colágeno I, um indicador da reabsorção óssea, em com-paração com tratamento com M-CSF e RANKL.
Foi examinada a capacidade da linhagem de célulasde câncer da mama, MDA-MB-435, de induzir osteoclastogêneseem células RAW264.7. Verificou-se que esta era dependente dadensidade com um número ótimo de 800 células de MDA-MB-435por poço (Figura 3A). 0 número ótimo de células RAW264.7 foiestabelecido, para este estudo, em 500 células/poço para co-cultura com células MDA-MB-435 (dados não mostrados). Meioscondicionados de células MDA-MB-435 foram também capazes desuportarem osteoclastogênese em culturas de células RAW264.7com uma mistura ótima de meios condicionados a 10% de célu-Ias MDA-MB-435 em DMEM/Fl2 (Figura 3B) . Isso indica que acapacidade das células MBA-MB-435 de induzirem a osteoclas-togênese em células RAW264.7 se deve a um fator liberado enão ao contato de célula com célula. MDA-MB-435 pode tambémliberar um fator inibidor tal como OPG conforme o número deosteoclastos formados diminuiu com concentrações mais altasdos meios condicionados.
Estudos adicionais incluíram a investigação da ca-pacidade de SKI606 de inibir a formação de osteoclastos in-duzida por câncer da mama. SKI606 inibiu significantemente aosteoclastogênese em células RAW264.7 em uma concentração deSKI606 de 400nM (Figura 4A). SKI606 foi também capaz de ini-bir a osteoclastogênese induzida por meios condicionados decélulas MDA-MB-435 em um modo dependente de dose (Figura 4B).
SKI606 foi avaliada em um modelo in vivo, usandocamundongos fêmeas, nude, NCr, atimicos (8 semanas de idade)injetados com 5 χ IO5 células MDA-MB-435 em 0,01 mL de PBSna tibia proximal de cada camundongo usando uma agulha Ha-milton de calibre 28. Os camundongos foram divididos em trêsgrupos de tratamento e a incidência de tumor na tibia foideterminada por exame de secções de histologia e peso do tu-mor. Os pesos de tumores das tíbias dos camundongos tratadosou com SKI606 ou Zomeda foram significantemente menores queos tumores do grupo de controle (Figura 5A e Tabela I) . Á-reas de Iise eram significantemente menores em camundongostratados com SKI606 ou Zomeda, (Figura 5B e Tabela 1). Alémdisso, células positivas a TRAP significantemente menoresforam contadas nas seções de tumores dos camundongos trata-dos com SKI606 (Figura 5C). Compósitos das imagens digitaissão mostrados nas Figuras 6A-6C.
Tabela 1. Avaliação da SKI606 sobre Modelo de Ca-mundongo de Tumor Ósseo com MDA-MB-435<table>table see original document page 49</column></row><table>
REFERÊNCIAS
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Claims (15)

1. Método para inibir a reabsorção óssea,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende proporcionar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um composto da fórmula <formula>formula see original document page 52</formula> Fórmula Iem que:η é um número inteiro de 1 a 3;X é N, CH, com a condição que quando X é Ν, η é 2ou 3 ;Ré uma alquila de 1 a 3 átomos de carbono;R(I) é 2,4-diCl, 5-OMe; 2,4-diCl; 3,4,5-tri-OMe;-2-C1, 5-GMe; 2-Me; 5-OMe; 2,4-diMe; 2,4-diMe-5-OMe, 2,4-diCl, 5-OEt;R (2) é uma alquila de 1 a 2 átomos de carbono, ousais farmaceuticamente aceitáveis deste.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é de fórmula: <formula>formula see original document page 52</formula> Fórmula I<formula>formula see original document page 53</formula> em que:η é um número inteiro de 2 a 3;X é N, CH, com a condição que quando X é Ν, η é 2ou 3;R é uma alquila de 1 a 3 átomos de carbono;R(I) é 2,4-diCl, 5-0Me; 2,4-diCl; 3,4, 5-tri-0Me;-2-C1, 5-OMe; 2-Me, 5-OMe; 2,4-diMe; 2,4-diMe-5-OMe, 2,4-diCl, 5-OEt;R (2) é uma alquila de 1 a 2 átomos de carbono, ousais farmaceuticamente aceitáveis deste.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é de fórmula: <formula>formula see original document page 53</formula> Fórmula IX é Ν, CH;η é 3;R (2) e R são metila; ou sais farmaceuticamente aceitáveis deste.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1CARACTERIZADO pelo fato de que R(2) é metila.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1CARACTERIZADO pelo fato de que X é N.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1CARACTERIZADO pelo fato de que X é CH.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é 4-[ (2,4-Dicloro 5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3-(4-metil-l-piperazinil)propóxi]-3-quinolinacarbonitrila ou um sal farmaceuticamente aceitável desta.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é 4-[(2,4-Dicloro 5-metoxifenil)amino]-7-[3-(4-etil-l-piperazini1)propóxi]-6-metóxi-3-quinolinacarbonitrila; 4-[(2,4-Dicloro-5metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(4-metil-l-piperazinil)etóxi]-3-quinolinacarbonitrila; 4- [ (2,4-Dicloro 5-metoxifenil)amino]-7-[2-(4-etil-l-piperazinil)etóxi]-6-metóxi-3-quinolinacarbonitrila; 4-[ (2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(l-metilpiperidin-4-il)metóxi]-3-quinolinacarbonitrila; 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[2-(l-metilpiperidin-4-il)etóxi]-3-quinolinacarbonitrila; 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3-(l-metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-7-[(l-etilpiperidin-4-il)metóxi]-6-metoxiquinolina-3-carbonitrila; 4- [ (2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-metilpiperazin-l-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; 4-[ (2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[(l-metilpiperidin-4-il)mètóxi]quinolina-3-carbonitrila; 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(4-etilpiperazin-l-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; 4-[(2,4-Dicloro-5- metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[3-(l-metilpiperidin-4-il)propóxi]quinolina-3-carbonitrila; 4 - [ (2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(4-metil-l-piperazinil)etóxi]quinolina-3-carbonitrila; 4-[(2,4-Dicloro--5-metoxifenil)amino]-6-etóxi-7-[2-(l-metilpiperidin-4-il)etóxi]quinoline-3-carbonitrila; 4-[(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3-(4-propil-l-piperazinil)propóxi]-3-quinolinacarbonitrila; 4- [ (2,4-diclorofenil)amino]-6-metóxi-7-[(l-metilpiperidin-4-il)metóxi]-3-quinolinacarbonitrila; 6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]-4-[(3,4,5-trimetoxifenil)amino]quinolina-3-carbonitrila; 4- [ (2-cloro--5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(l-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; 6-metóxi-4-[(5-metóxi-2-metilfenil)amino]-7-[(l-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; 4-[(2,4-dimetilfenil)amino]-6-metóxi-7-[(1-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; 6-metóxi-4-[(5-metóxi--2,4-dimetilfenil)amino]-7-[(l-metilpiperidin-4-il)metóxi]quinolina-3-carbonitrila; 4-[ (2,4-dicloro-5-etoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[(l-metilpiperidin-4-il) metóxi]quinolina-3-carbonitrila; ou um sal farmaceutica-mente aceitável destas.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é um inibidor deSrc quinase.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a perda óssea é associada àosteoporose; tumor ósseo de células gigantes; mieloma múlti-plo; osteólise expansiva familiar; osteopenia; doença perio-dontal; hiperparatiroidismo; erosões periarticulares em ar-trite reumatóide; doença de Paget; osteopenia induzida porimobilização; hipercalcemia de malignidade; metástase óssea;adamantinoma; cisto (lesão) óssea aneurismal; angiossarcoma(grau alto); angiossarcoma (grau baixo); lesões ósseas dedoença de Gaucher; tumor de Brown de hiperparatiroidismo;condroblastoma; fibroma condromixóide; condrossarcoma; cor-doma; condrossarcoma de células claras; osteossarcoma intra-medular convencional; doença de articulação degenerativa;fibroma desmopl.ásico; estenose medular diafisário com histi-ocitoma fibroso maligno; encondroma; granuloma eosinofílico;hemangioendotelioma epitelióide; sarcoma de Ewing do osso;osteossarcoma extraósseo; fibrossarcoma; displasia fibrosa;periostite reativa de coloração vermelho-brilhante; tumor deglomo; sarcoma granulocitico em osso; sindrome de Hardcas-tle; hemangioma; hemangiopericitoma; osteossarcoma de super-fície de alto grau; linfoma de Hodgkin de osso; osteossarco-ma intracortical; osteossarcoma bem diferenciado intraósseo;condroma justacortical; leucemia; histiocitoma fibroso ma-ligno; melorreostose; câncer da mama metastático; câncer dorim metastático; câncer do pulmão metastático; câncer dapróstata metastático; osteossarcoma multifocal; miosite os-sificante; neurofibroma do osso; linfoma de não-Hodgkin; fi-broma não ossificante; (defeito cortical fibroso); lesão deNora; osteoblastoma; osteocondroma; osteocondromatose; dis-plasia osteofibrosa; osteoma osteóide; osteoma; osteomieli-te; osteopatia estriada; osteopecilose; osteossarcoma paros-teal; condroma periosteal; ostessarcoma periosteal; sinovitevilonodular pigmentada; sarcoma de pós-Paget; schwanoma deosso; osteossarcoma de pequenas células; cisto ósseo solitá-rio; tumor fibroso solitário; mieloma solitário (plasmacito-ma) ; cisto subcondral; condromatose sinovial; osteossarcomatelangectático; lesões "Tug" - defeito fibroso metafisário;ou cisto ósseo unicameral.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que a metástase óssea é metástasede câncer do pulmão, da cabeça e do pescoço, da mama, pan-creático, da próstata, renal, do osso, testicular, cervical,gastrointestinal, do cólon, da bexiga.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que a metástase óssea é uma me-tástase de câncer da mama ou da próstata.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende fornecer umaterapia anti-neoplásica.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia anti-neoplásicaquimioterapia, imunoterapia ou cirurgia.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é administrado oralmente.
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