BR112019022523A2 - Métodos para tratamento de aterosclerose com sequestrantes de gama-cetoaldeído - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um método de tratamento de aterosclerose, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade eficaz de sequestrante de gama-cetoaldeído de um composto sequestrante de gama-cetoaldeído.

Description

“MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE ATEROSCLEROSE COM SEQUESTRANTES DE GAMA-CETOALDEÍDO”

SUPORTE GOVERNAMENTAL

[OO1]Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob HL116263, concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.

CAMPO DA TÉCNICA

[002]A presente invenção refere-se geralmente ao campo de tratamento e prevenção de inflamação e, mais especificamente, ao campo de controle de isocetais e neurocetais.

[003]A presente invenção também se refere ao campo de tratamento e prevenção de aterosclerose ou acúmulo de placa nas artérias, a causa subjacente de ataque cardíaco, acidente vascular cerebral e doença vascular periférica e, mais especificamente, tratamento e prevenção do desenvolvimento de aterosclerose e eventos cardiovasculares, controlando aldeídos reativos, incluindo malondialdeído (MDA), isocetais e neurocetais, e os danos que eles causam às lipoproteínas (LDL e HDL) e à parede da artéria.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004]A peroxidação lipídica produz estresse oxidativo e inflamação e acelera a patogênese da aterosclerose e eventos cardiovasculares. A capacidade do sequestrante de aldeído 2-hidroxibenzilamina (2-HOBA) (salicilamina) de impedir o desenvolvimento de aterosclerose foi examinada em camundongos Ldlr^/_ alimentados com dieta ocidental por 16 semanas. Em comparação com os camundongos tratados com veículo ou análogo não reativo, 4-HOBA, o tratamento com 2-HOBA diminuiu significativamente o desenvolvimento de aterosclerose em camundongos Ldlr^/_ hipercolesterolêmicos em 31% nas aortas proximais e 60% nas aortas en face. O tratamento com 2-HOBA não afetou os níveis plasmáticos de colesterol, mas resultou em teor reduzido de aldeído em HDL, LDL e nas lesões ateroscleróticas. A dieta

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2/54 ocidental aumentou os níveis do aducto plasmático de malondialdeído (MDA) -apoAI em camundongos Ldlr^/_. É importante ressaltar que o tratamento com 2-HOBA reduziu a formação de MDA-apoAI e aumentou a capacidade do HDL de camundongo de reduzir as reservas de colesterol de macrófagos versus veículo ou 4-HOBA. Além disso, o 2-HOBA reduziu a formação in vivo de aductos de MDA-apoB, e o sequestro de MDA com 2-HOBA durante a modificação de LDL reduziu o acúmulo de colesterol de macrófagos in vitro. Além disso, 2-HOBA reduziu a morte de macrófagos e a inflamação em resposta ao estresse oxidativo. É importante ressaltar que o tratamento com 2-HOBA reduziu o número de células TlINEL positivas para lesão aterosclerótica em 72% e aumentou o número de células mortas que foram fagocitadas em comparação com camundongos tratados com veículo ou com 4-HOBA. Isso promoveu a formação estável de placas em camundongos tratados com 2-HOBA, como evidenciado pela redução de 69% (p < 0,01) no núcleo necrótico e pelo aumento do teor de colágeno (2,7 vezes) e espessura da capa fibrosa (2,1 vezes). A presente invenção mostra que o sequestro de aldeído com 2-HOBA tem múltiplos efeitos ateroprotetores nas lipoproteínas e reduz a aterosclerose em modelos murinos. Por conseguinte, uma modalidade da presente invenção é uma nova abordagem terapêutica para a prevenção e o tratamento de doenças cardiovasculares ateroscleróticas.

[005]Assim, um aspecto da presente invenção é um método de tratamento, prevenção ou melhora da aterosclerose, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tratamento um composto da seguinte fórmula:

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[006]em que:

[007]R é N ou C;

[008]R2 é independentemente H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído com um ou mais R2, R3 e R4 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[009]Rs é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2 ou Rs para formar um anel de C38 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[010]R4 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[011 ]Rs é uma ligação, H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C310 cicloalquila, C3-8 anel contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou R4 para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[012]e estereoisômeros e análogos dos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

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[013]As Figuras 1A-1E mostram que uma modalidade da presente invenção, 2HOBA, atenua a aterosclerose nos camundongos Ldlr⁷’ hipercolesterolêmicos (um modelo de hipercolesterolemia familiar). Camundongos fêmeas Ldlr^/_ de 8 semanas foram pré-tratados com 1 g / mL de 2-HOBA ou 1 g / mL de 4-HOBA (análogo não reativo) ou veículo (água) por 2 semanas e, em seguida, o tratamento foi continuado por 16 semanas, durante o qual os camundongos foram alimentados com uma dieta ocidental rica em gordura. (Figura 1A e Figura 1C) As imagens representativas mostram manchas de Red-Oil-O em seções da raiz da aorta proximal (Figura 1 A) e em aortas de pinos abertos (Figura 1C). (Figura 1B e Figura 1D) Quantificação da área média de lesão manchada por Oil-Red-O em seções da raiz da aorta (Figura 1B) e na aorta en face (Figura D). N = 9 ou 10 por grupo, ** p < 0,01, *** p < 0,001. (Figura 1E) Os níveis plasmáticos de colesterol total e triglicerídeos. N = 9 ou 10 por grupo.

[014]As Figuras 2A-2B mostram que o 2-HOBA diminui o teor de MDA das lesões ateroscleróticas da aorta proximal em camundongos Ldlr⁷’. MDA foi detectado por imunofluorescência usando anticorpo primário anti-MDA e anticorpo secundário marcado com fluorescência. Os núcleos foram contramarcados com Hoechst (Azul). (Figura 2A) As imagens representativas mostram coloração com MDA (Vermelho) nas seções da raiz da aorta proximal. (Figura 2B) Quantificação da área média de lesão positiva para MDA em seções de raiz da aorta usando o software ImageJ. Dados presentes como média ± SEM, N = 6 por grupo, *** p < 0,001.

[015]As Figuras 3 A-3D mostram que 2-HOBA promove a formação de placas ateroscleróticas estáveis em camundongos Ldlr⁷’. A coloração tricrômica de Masson foi aplicada para analisar a estabilidade da lesão aterosclerótica em seções da aorta proximal de camundongos Ldlr^/_. (Figura 3 A) As imagens representativas mostram a coloração tricrômica de Masson em seções da raiz da aorta. O teor de colágeno (Figura 3B), a espessura da tampa fibrosa (Figura 3C) e a área necrótica (Figura 3D) foram quantificados usando o software ImageJ. N = 8 por grupo. * p < 0,05, barra de

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5/54 escala = 100 pm. Azul mostra colágeno, Vermelho, citoplasma, Preto, núcleos.

[016]As Figuras 4A-4D mostram que 2-HOBA previne a morte celular e aumenta a eferocitose nas lesões ateroscleróticas dos camundongos Ldlr-/-. (Figura 4A) As imagens representativas mostram células mortas que foram detectadas pela coloração TlINEL (Vermelho) das seções da aorta proximal. Os macrófagos foram detectados pelo anticorpo primário anti-macrófago (Verde), e os núcleos foram contracorados com Hoechst (Azul). (Figura 4B) Uma imagem representativa tirada com uma ampliação maior para indicar a coloração TUNEL associada a macrófagos (setas amarelas) e setas brancas indicam células mortas livres que não estavam associadas a macrófagos. (Figura 4C) Quantificação do número de núcleos TUNELpositivos em seções da aorta proximal. (Figura 4D) A eferocitose foi examinada quantificando as células TUNEL-positivas associadas a macrófagos versus livres nas seções da aorta proximal. Os dados são indicados como média ± SEM (N = 8 por grupo). Barra de escala = 50 pm, ** p 0,01.

[017]As Figuras 5A-5H mostram que o tratamento in vitro com 2-hidroxibenzilamina suprime o estresse oxidativo induzido pela apoptose e inflamação das células. (Figura 5A e Figura 5B) As células endoteliais da aorta de camundongo (Figura 5A) ou macrófagos primários (Figura 5B) foram incubadas por 24h com 250 μΜ de H2O2 isoladamente ou com 4-HOBA ou 2-HOBA. As células apoptóticas foram então detectadas por coloração com Anexina V e citometria de fluxo. (Figura 5C, Figura 5D, Figura 5E, Figura 5F, Figura 5G, Figura 5H) Os níveis de mRNA de IL-β, IL-6 e TNFoc foram analisados por PCR em tempo real nos macrófagos peritoneais incubados por 24 h ou com LDL oxidado (Figura 5C-Figura 5E) ou 250 μΜ de H2O2 (Figura 5FFigura 5H) isoladamente ou com 4-HOBA ou 2-HOBA. (Figura 5A à Figura 5H) Dados presentes como média ± SEM de três experimentos independentes, *** p < 0,001.

[018]As Figuras 6A-6B mostram os efeitos de 2-HOBA na modificação MDA de LDL (Figura 6A) Os aductos de MDA-LDL foram medidos por ELISA em camundongos Ldr

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6/54 ^/_ consumindo uma dieta ocidental por 16 semanas e tratados com 2-HOBA, 4- HOBA, ou veículo. N = 10 por grupo, *** p < 0,001. (Figura 6B) O LDL foi modificado in vitro com MDA na presença de veículo isoladamente ou com 2-HOBA e, em seguida, o LDL foi incubado por 24 h com macrófagos e o colesterol celular foi medido. Os dados são representativos de três experimentos independentes.

[019]As Figuras 7A-7G mostram os efeitos da formação do aducto 2-HOBA e HDLMDA na função HDL. (Figura 7A) Os níveis plasmáticos de aductos MDA-HDL foram medidos por ELISA em camundongos Ldr^/_ tratados como descrito na Figura 6. Dados presentes como média ± SEM (N = 8 por grupo), *** p < 0,001. (Figura 7B) Western blots de apoAI e MDA-apoAI no plasma de camundongo após imunoprecipitação usando anticorpo anti-apoAI primário. Camundongos Ldr^/_ foram tratados como descrito na Figura 6 e apoAI e MDA-apoAI do plasma de camundongos Ldr^/_ que consomem uma dieta de comida são incluídos para comparação. (Figura 7C) Quantificação usando o software ImageJ da densidade média (unidades artificiais) de MDA-apoAI detectada por Western blotting (Figura 7B). (Figura 7D) O HDL foi isolado do plasma de camundongos Ldr⁷’consumindo uma dieta ocidental por 16 semanas e tratado com 2-HOBA ou 4-HOBA ou veículo. Os macrófagos enriquecidos com colesterol foram incubados por 24 horas com HDL (25 pg de proteína / ml) e a % de redução no teor de colesterol celular foi medida. Os níveis de modificação HDL-MDA foram analisados por ELISA. Dados apresentados como média ± SEM, N = 7 por grupo, * p < 0,05, ** p < 0,01. (Figura 7E) O HDL humano foi modificado com doses crescentes de MDA e, em seguida, a capacidade do HDL para reduzir o teor de colesterol dos macrófagos enriquecidos com colesterol foi medida. Os dados são representativos de três experimentos independentes. (Figura 7F) Os níveis plasmáticos de aductos MDA-HDL foram medidos por ELISA em indivíduos de controle ou FH antes e depois de LA. (Figura 7G) A capacidade de HDL de indivíduos de controle ou FH pré e pós LA 9 (n = 6 por grupo) para reduzir o teor de colesterol

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7/54 dos macrófagos apoE’⁷’.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[020]Uma modalidade da presente invenção é um novo método de tratamento de aterosclerose.

[021]Outra modalidade da presente invenção são métodos de tratamento de aterosclerose pela administração de ao menos um composto da presente invenção.

[022]Outra modalidade é um método para inibir a aterosclerose ou o desenvolvimento aterosclerótico em um mamífero (por exemplo, um humano), compreendendo administrar uma quantidade de antiaterosclerose ou desenvolvimento antiaterosclerótico de um composto da presente invenção, como descrito aqui, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ao mamífero.

[023]Outra modalidade da presente invenção é um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para uso como tratamento profilático ou terapêutico de aterosclerose.

[024]Outra modalidade da presente invenção é o uso de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para preparar um medicamento para inibir a aterosclerose ou o desenvolvimento aterosclerótico em um mamífero (por exemplo, um humano).

[025]Outra modalidade da presente invenção é o uso de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para preparar um medicamento para inibir o dano mediado por aldeído reativo de lipoproteínas (incluindo LDL e HDL) que promove o desenvolvimento de aterosclerose em um mamífero (por exemplo, um humano).

[026]Por “inibição do desenvolvimento aterosclerótico” entende-se a supressão do desenvolvimento, progressão e/ou gravidade da aterosclerose, uma doença lentamente progressiva caracterizada pelo acúmulo de colesterol dentro da parede arterial, por exemplo, inibindo, prevenindo ou causando a regressão de uma placa

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8/54 aterosclerótica.

[027]Por conseguinte, a invenção também fornece um método para inibir a aterosclerose ou desenvolvimento aterosclerótico em um mamífero (por exemplo, um humano), compreendendo administrar uma quantidade antiaterosclerose ou de desenvolvimento antiaterosclerótico de um composto ou composição da presente invenção, como descrito aqui, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ao mamífero.

[028]A aterosclerose, a causa subjacente de ataque cardíaco e derrame, é a causa mais comum de morte e incapacidade no mundo industrial. Níveis elevados de apolipoproteína B (LDL e VLDL) contendo lipoproteínas e baixos níveis de HDL aumentam o risco de aterosclerose. Embora a redução de LDL com inibidores de HMG-CoA redutase tenha demonstrado reduzir o risco de ataque cardíaco e derrame em grandes ensaios clínicos, eventos cardiovasculares de risco residual substancial permanecem. A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica com estresse oxidativo, desempenhando um papel crítico. A modificação oxidativa das lipoproteínas contendo apoB melhora a internalização, levando à formação de células espumosas. Além disso, o LDL oxidado induz inflamação, ativação de células imunes, e toxicidade celular. O HDL protege contra a aterosclerose através de múltiplas funções, incluindo a promoção do efluxo de colesterol, impedindo a oxidação de LDL, mantendo a função da barreira endotelial, e minimizando o estresse oxidativo celular e inflamação. A concentração de HDL-C está inversamente associada à doença cardiovascular (CVD), mas estudos recentes sugerem que ensaios da função HDL podem fornecer novos marcadores independentes para o risco de CVD. Existem evidências de que a modificação oxidativa de HDL compromete suas funções, e estudos sugerem que o HDL oxidado é realmente pró-aterogênico.

[029]Durante a peroxidação lipídica, dicarbonilas altamente reativas, incluindo 4oxo-nonenal (4-ONE) malondialdeído (MDA) e isolevuglandinas (IsoLGs) são

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9/54 formadas. Essas dicarbonilas lipídicas reativas se ligam covalentemente ao DNA, proteínas, e fosfolipídios, causando alterações na lipoproteína e nas funções celulares. Em particular, a modificação com dicarbonilas lipídicas reativas promove respostas inflamatórias e toxicidade que podem ser relevantes para a aterosclerose. Os inventores atuais identificaram a 2-hidroxilbenzilamina (2-HOBA) como um sequestrante de aldeído altamente reativo que reage seletivamente com IsoLG e dicarbonilas intimamente relacionadas. De fato, os presentes inventores mostraram que 2-HOBA protege contra hipertensão associada ao estresse oxidativo, citotoxicidade induzida por oxidante, neurodegeneração, e formação de oligômeros amiloides induzidos por estimulação rápida. Embora haja evidências de que os aldeídos reativos desempenham um papel na aterogênese, até o momento, os efeitos do sequestro de aldeídos no desenvolvimento de aterosclerose não foram examinados.

[030]Identificar estratégias eficazes para avaliar a contribuição de dicarbonilas lipídicas reativas para processos de doenças in vivo tem sido um desafio. Embora a formação de dicarbonilas lipídicas reativas possa teoricamente ser suprimida simplesmente pela redução dos níveis de espécies reativas do oxigênio (ROS) usando antioxidantes dietários, o uso de antioxidantes para prevenir eventos cardiovasculares ateroscleróticos tem se mostrado problemático, com a maioria dos ensaios clínicos desfavoráveis não demonstrando benefício. Os antioxidantes dietários, como a vitamina C e a vitamina E, são supressores relativamente ineficazes da lesão oxidativa e da peroxidação lipídica. De fato, estudos cuidadosos de pacientes com hipercolesterolemia descobriram que as doses de vitamina E necessárias para reduzir significativamente a peroxidação lipídica eram substancialmente maiores do que aquelas normalmente usadas na maioria dos ensaios clínicos. Além disso, as altas doses de antioxidantes necessárias para suprimir a peroxidação lipídica foram associadas a efeitos adversos significativos, provavelmente porque os ROS

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10/54 desempenham papéis cruciais na fisiologia normal, incluindo proteção contra infecções bacterianas e em várias vias de sinalização celular. Finalmente, para fins de descoberta, o uso de antioxidantes fornece pouca informação sobre o papel das carbonilas lipídicas reativas, porque a supressão de ROS inibe a formação de um amplo espectro de macromoléculas modificadas oxidativamente, além de espécies de carbonilas lipídicas reativas.

[031]Uma abordagem alternativa à ampla supressão de ROS utilizando antioxidantes é usar sequestrantes de pequenas moléculas que reagem seletivamente com espécies de dicarbonila lipídica sem alterar os níveis de ROS, impedindo assim que as dicarbonilas lipídicas modifiquem as macromoléculas celulares sem interromper a sinalização e a função normais de ROS. A 2-hidroxibenzilamina (2HOBA) (salicilamina) reage rapidamente com as dicarbonilas lipídicas como IsoLG, ONE e MDA, mas não com monocarbonilas lipídicas tal como 4-hidroxinonenal. O isômero de 2-HOBA 4-hidroxibenzilamina (4-HOBA) é ineficaz como sequestrante de dicarbonila. Ambos esses compostos são biodisponíveis por via oral, portanto, podem ser usados para examinar os efeitos do sequestro de dicarbonila lipídica in vivo. 2HOBA protege contra a hipertensão associada ao estresse oxidativo, citotoxicidade induzida por oxidante, neurodegeneração e formação de oligômeros amiloides induzidos por estimulação rápida. Embora existam evidências de que as dicarbonilas lipídicas reativas desempenham um papel na aterogênese, até o momento, os efeitos do sequestro de dicarbonila lipídica no desenvolvimento de aterosclerose não foram examinados.

[032]Os presentes inventores descobriram que o tratamento com compostos da presente invenção, incluindo 2-HOBA, por exemplo, atenua significativamente o desenvolvimento de aterosclerose em camundongos Ldr^/_ hipercolesterolêmicos. Mais importante, o tratamento com compostos da presente invenção inibe a morte das células da lesão e a formação do núcleo necrótico, levando a uma formação mais

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11/54 estável de placas, como evidenciado pelo aumento do teor de colágeno da lesão e da espessura da tampa fibrosa. Consistente com a diminuição da aterosclerose a partir do tratamento com 2-HOBA devido ao sequestro de aldeídos reativos, o teor de MDA da lesão aterosclerótica foi consideravelmente reduzido nos camundongos tratados com 2-HOBA versus camundongos de controle. Os presentes inventores mostram ainda que o tratamento com 2-HOBA resulta em diminuição de MDA-LDL e MDA-HDL no plasma. Além disso, a formação de aductos MDA-apoAI diminuiu e, o que é mais importante, o tratamento com 2-HOBA causou uma função HDL mais eficiente na redução dos estoques de colesterol de macrófagos. Assim, o sequestro de carbonilas reativas com 2-HOBA tem múltiplos efeitos terapêuticos antiaterogênicos que provavelmente contribuem para sua capacidade de reduzir o desenvolvimento de aterosclerose em camundongos Ldlr⁷’ hipercolesterolêmicos.

[033]Exemplos de compostos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, compostos selecionados a partir da fórmula ou análogos dos mesmos, e sais farmacêuticos dos mesmos, e seu uso como agentes antiaterosclerose:

[034]em que:

[035]R é N ou C;

[036]R2 é independentemente H, alquila substituída ou não substituída;

[037]Rs é H, halogênio, alcóxi, hidroxila, nitro;

[038]R4 é H, alquila, carboxila substituída ou não substituída; ou seus análogos.

[039]Antes de os presentes compostos, composições, artigos, sistemas, dispositivos e / ou métodos serem descritos, entende-se que eles não estão limitados

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12/54 a métodos sintéticos específicos, a menos que especificados de outra forma, ou a reagentes específicos, a menos que especificado de outra forma, como tal pode, é claro, variar. Entende-se também que a terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas aspectos particulares e não é destinada a ser limitante. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, métodos e materiais exemplificativos são agora descritos.

[040]Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência para descrever os métodos e/ou materiais relacionados aos quais as publicações são citadas. As publicações discutidas neste documento são fornecidas apenas para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de anteceder essa publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação aqui fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais, que precisam ser confirmadas independentemente.

[041]Conforme usado na especificação e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma” e “o” “a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um grupo funcional”, “uma alquila” ou “um resíduo” inclui misturas de dois ou mais desses grupos funcionais, alquilas, ou resíduos, e similares.

[042]As faixas podem ser expressas aqui como de “cerca de” um valor particular, e / ou a “cerca de” outro valor particular. Quando essa faixa é expressa, um outro aspecto inclui de um valor particular e / ou a outro valor particular. Da mesma forma, quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente “cerca de”, entende-se que o valor particular forma um aspecto adicional. Entende-se ainda que os pontos finais de cada uma das faixas são significativos tanto em relação ao outro ponto final, quanto independentemente do outro ponto final. Entende-se

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13/54 também que existem vários valores aqui descritos e que cada valor também é aqui descrito como “cerca de” esse valor específico, além do próprio valor. Por exemplo, se o valor “10” é descrito, então “cerca de 10” também será descrito. Entende-se também que cada unidade entre duas unidades particulares também é descrita. Por exemplo, se 10 e 15 são descritos, 11, 12, 13 e 14 também são descritos.

[043]Conforme usado aqui, os termos “opcional” ou “opcionalmente” significam que o evento ou circunstância subsequentemente descrita pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui ocorrências em que o dito evento ou circunstância ocorre e ocorrências em que ele não ocorre.

[044]Como aqui utilizado, o termo “indivíduo” refere-se a um alvo de administração. O indivíduo dos métodos aqui descritos pode ser um vertebrado, tal como um mamífero, um peixe, um pássaro, um réptil ou um anfíbio. Assim, o indivíduo dos métodos aqui descritos pode ser um primata humano, não humano, cavalo, porco, coelho, cachorro, ovelha, cabra, vaca, gato, porquinho-da-índia ou roedor. O termo não indica uma idade ou sexo específico. Assim, indivíduos adultos e recém-nascidos, bem como fetos, do sexo masculino ou feminino, devem estar cobertos. Um paciente refere-se a um indivíduo afetado por uma doença ou distúrbio. O termo “paciente” inclui indivíduos humanos e veterinários.

[045]Como aqui utilizado, o termo “tratamento” refere-se ao gerenciamento médico de um paciente com a intenção de curar, melhorar, estabilizar ou prevenir uma doença, condição patológica ou distúrbio. Este termo inclui tratamento ativo, isto é, tratamento direcionado especificamente para a melhora de uma doença, condição patológica ou distúrbio, e também inclui tratamento causai, isto é, tratamento direcionado para a remoção da causa da doença associada, condição patológica ou distúrbio Além disso, esse termo inclui tratamento paliativo, ou seja, tratamento destinado ao alívio dos sintomas, e não à cura da doença, condição patológica ou distúrbio; tratamento preventivo, isto é, tratamento direcionado a minimizar ou inibir

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14/54 parcial ou completamente o desenvolvimento da doença, condição patológica ou distúrbio associado; e tratamento de suporte, isto é, tratamento empregado para suplementar outra terapia específica direcionada à melhora da doença, condição patológica ou distúrbio associado.

[046]Como aqui utilizado, o termo “prevenir” ou “prevenindo” refere-se a impedir, evitar, eliminar, cessar ou suprimir algo de acontecer, especialmente por ação antecipada. Entende-se que quando reduzir, inibir ou prevenir são usados aqui, a menos que especificamente indicado de outra forma, o uso das outras duas palavras também é expressamente descrito. Como pode ser visto aqui, há sobreposição na definição de tratamento e prevenção.

[047]Como aqui utilizado, o termo “diagnosticado” significa ter sido submetido a um exame físico por uma versado na técnica, por exemplo, um médico, e constatado que tem uma condição que pode ser diagnosticada ou tratada pelos compostos, composições ou métodos aqui descritos. Conforme usado aqui, a frase “identificado como estando em necessidade de tratamento para um distúrbio” ou similar, refere-se à seleção de um indivíduo com base na necessidade de tratamento do distúrbio. Por exemplo, um indivíduo pode ser identificado como tendo a necessidade de tratamento de um distúrbio (por exemplo, um distúrbio relacionado à inflamação) com base em um diagnóstico anterior por um versado na técnica e, posteriormente, submetido ao tratamento para o distúrbio. É considerado que a identificação pode, em um aspecto, ser realizada por uma pessoa diferente da pessoa que está fazendo o diagnóstico. Também é considerado, em um aspecto adicional, que a administração pode ser realizada por alguém que subsequentemente realizou a administração.

[048]Como aqui utilizado, os termos “administrar” e “administração” referem-se a qualquer método para fornecer uma preparação farmacêutica a um indivíduo. Tais métodos são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem, dentre outros, administração oral, administração transdérmica, administração por inalação,

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15/54 administração nasal, administração tópica, administração intravaginal, administração oftálmica, administração intra-aural, administração intracerebral, administração retal e administração parentérica, incluindo injetável tal como administração intravenosa, administração intra-arterial, administração intramuscular e administração subcutânea. A administração pode ser contínua ou intermitente. Em vários aspectos, uma preparação pode ser administrada terapeuticamente; isto é, administrada para tratar uma doença ou condição existente. Em vários aspectos adicionais, uma preparação pode ser administrada profilaticamente; isto é, administrada para prevenção de uma doença ou condição.

[049]Como aqui utilizado, o termo “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade que é suficiente para atingir o resultado desejado ou ter um efeito sobre uma condição indesejada. Por exemplo, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade que é suficiente para alcançar o resultado terapêutico desejado ou ter um efeito sobre sintomas indesejados, mas geralmente é insuficiente para causar efeitos colaterais adversos. O nível de dose terapeuticamente eficaz específico para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o distúrbio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; a composição específica empregada; a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a via de administração; a taxa de excreção do composto específico empregado; a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou coincidentes com o composto específico empregado e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas. Por exemplo, está bem dentro da habilidade da técnica iniciar doses de um composto em níveis inferiores aos necessários para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. Se desejado, a dose diária eficaz pode ser dividida em doses múltiplas para fins de administração. Consequentemente, as composições de dose única podem conter essas quantidades ou submúltiplos para formar a dose diária. A

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16/54 dosagem pode ser ajustada pelo médico em caso de contraindicações. A dosagem pode variar e pode ser administrada em uma ou mais administrações de dose diariamente, por um ou vários dias. Pode ser encontrada orientação na literatura para dosagens apropriadas para determinadas classes de produtos farmacêuticos. Em vários aspectos adicionais, uma preparação pode ser administrada em uma “quantidade profilaticamente eficaz”, isto é, uma quantidade eficaz para a prevenção de uma doença ou condição.

[050]Como aqui utilizado, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” referese a soluções aquosas ou não aquosas estéreis, dispersões, suspensões ou emulsões, bem como pós estéreis para reconstituição em soluções ou dispersões injetáveis estéreis imediatamente antes do uso. Exemplos de carreadores, diluentes, solventes ou veículos aquosos e não aquosos adequados incluem água, etanol, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares), carboximetil celulose e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais (tal como óleo de oliva) e ésteres orgânicos injetáveis tal como etil oleato. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos. Estas composições também podem conter adjuvantes, tal como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser garantida pela inclusão de vários agentes antibactehanos e antifúngicos tal como parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotónicos tal como açúcares, cloreto de sódio e similares. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes tais como monoestearato de alumínio e gelatina, que retardam a absorção. As formas de depósito injetáveis são feitas através da formação de matrizes microencapsuladas do fármaco em polímeros biodegradáveis tal como polilactídeo-poliglicolídeo, poli (ortoésteres) e poli (anidridos).

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Dependendo da relação do fármaco para o polímero e da natureza do polímero específico empregado, a taxa de liberação de fármaco pode ser controlada. As formulações injetáveis de depósito também são preparadas aprisionando o fármaco em lipossomos ou microemulsões, que são compatíveis com os tecidos do corpo. As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, porfiltração através de um filtro de retenção de bactérias ou pela incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril imediatamente antes do uso. Os carreadores inertes adequados podem incluir açúcares tal como lactose. Desejavelmente, ao menos 95% em peso das partículas do ingrediente ativo têm um tamanho de partícula eficaz na faixa de 0,01 a 10 micrometres.

[051]Como aqui utilizado, o termo “sequestrante” ou “sequestro” refere-se a uma substância química que pode ser administrada a fim de remover ou inativar impurezas ou produtos de reação indesejados. Por exemplo, os isocetais se aduzem irreversivelmente especificamente aos resíduos de lisina nas proteínas. Os sequestrantes de isocetais da presente invenção reagem com isocetais antes de se aduzirem aos resíduos de lisina. Por conseguinte, os compostos da presente invenção “sequestram” isocetais, impedindo-os assim de se aduzirem às proteínas.

[052]Como aqui utilizado, o termo “substituído” é considerado como incluindo todos os substituintes permitidos de compostos orgânicos. Em um aspecto amplo, os substituintes permitidos incluem substituintes acíclicos e cíclicos, ramificados e não ramificados, carbocíclicos e heterocíclicos, e aromáticos e não aromáticos de compostos orgânicos. Os substituintes ilustrativos incluem, por exemplo, os descritos abaixo. Os substituintes permitidos podem ser um ou mais e iguais ou diferentes para os compostos orgânicos apropriados. Para os fins desta descrição, os heteroátomos, tal como nitrogênio, podem ter substituintes de hidrogênio e/ou quaisquer substituintes permitidos de compostos orgânicos aqui descritos que satisfaçam as

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18/54 valências dos heteroátomos. Esta descrição não é destinada a ser limitada de forma alguma pelos substituintes permitidos de compostos orgânicos. Além disso, os termos “substituição” ou “substituído por” incluem a condição implícita de que essa substituição está de acordo com a valência permitida do átomo substituído e do substituinte, e que a substituição resulta em um composto estável, por exemplo, um composto que não sofre espontaneamente transformações, tais como rearranjo, ciclização, eliminação etc.

[053]O termo “alquila”, conforme usado aqui, é um grupo hidrocarboneto saturado ramificado ou não ramificado de 1 a 24 átomos de carbono, tal como metila, etila, npropila, isopropila, n-butila, isobutila, s-butila, t-butila, n-pentila, isopentila, s-pentila, neopentila, hexila, heptila, octila, nonila, decila, dodecila, tetradecila, hexadecila, eicosila, tetracosila e similares. O grupo alquila pode ser cíclico ou acíclico. O grupo alquila pode ser ramificado ou não ramificado. O grupo alquila também pode ser substituído ou não substituído. Por exemplo, o grupo alquila pode ser substituído por um ou mais grupos, incluindo, mas não limitados a, alquila opcionalmente substituído, cicloalquila, alcóxi, amino, éter, haleto, hidróxi, nitro, silila, sulfo-oxo ou tiol, como descrito aqui. Um grupo “alquila inferior” é um grupo alquila contendo de um a seis (por exemplo, de um a quatro) átomos de carbono.

[054]Em toda a especificação, “alquila” é geralmente usado para se referir a grupos alquil não substituídos e grupos alquila substituídos; no entanto, grupos alquila substituídos também são especificamente citados neste documento, identificando os substituintes específicos no grupo alquila. Por exemplo, o termo “alquila halogenada” refere-se especificamente a um grupo alquila que é substituído por um ou mais haletos, por exemplo, flúor, cloro, bromo ou iodo. O termo “alcóxialquila” refere-se especificamente a um grupo alquila que é substituído por um ou mais grupos alcóxi, como descrito abaixo. O termo “alquilamino” refere-se especificamente a um grupo alquila que é substituído por um ou mais grupos amino, como descrito abaixo, e

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19/54 similares. Quando “alquila” é usado em uma ocorrência e um termo específico tal como “alquilálcool” é usado em outra, não significa que o termo “alquial” também não se refere a termos específicos tal como “alquilálcool” e similares.

[055]Essa prática também é usada para outros grupos aqui descritos. Ou seja, enquanto um termo tal como “cicloalquila” se refere a porções cicloalquila não substituídas e substituídas, as porções substituídas podem, além disso, ser especificamente identificadas aqui; por exemplo, uma cicloalquila substituída particular pode ser chamada, por exemplo, de uma “alquilcicloalquila”. Da mesma forma, um alcóxi substituído pode ser especificamente chamado, por exemplo, de um “alcóxi halogenado”, uma alquenila substituída particular pode ser, por exemplo, um “alquenilálcool” e similares. Novamente, a prática de usar um termo geral, tal como “cicloalquila”, e um termo específico, tal como “alquilcicloalquila”, não significa que o termo geral também não inclua o termo específico.

[056]O termo “cicloalquila”, como usado aqui, é um anel à base de carbono não aromático composto de ao menos três átomos de carbono. Exemplos de grupos cicloalquila incluem, mas não estão limitados a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, norbornila e similares. O termo “heterocicloalquila” é um tipo de grupo cicloalquila como definido acima, e está incluído no significado do termo “cicloalquila”, onde ao menos um dos átomos de carbono do anel é substituído por um heteroátomo tal como, mas não limitado a, nitrogênio, oxigênio, enxofre ou fósforo. O grupo cicloalquila e o grupo heterocicloalquila podem ser substituídos ou não substituídos. O grupo cicloalquila e o grupo heterocicloalquila podem ser substituídos por um ou mais grupos, incluindo, entre outros, alquila opcionalmente substituída, cicloalquila, alcóxi, amino, éter, haleto, hidróxi, nitro, silila, sulfo-oxo ou tiol, como aqui descrito.

[057]O termo “grupo polialquileno”, como aqui utilizado, é um grupo com dois ou mais grupos CH2 ligados um ao outro. O grupo polialquileno pode ser representado por uma fórmula — (CH2)a—, em que “a” é um número inteiro de 2 a 500.

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[058]Os termos “alcóxi” e “alcoxila”, como aqui utilizados, para se referir um grupo alquila ou cicloalquila ligado através de uma ligação éter; isto é, um grupo “alcóxi” pode ser definido como —OA¹ onde A¹ é alquila ou cicloalquila como definido acima. “Alcóxi” também inclui polímeros de grupos alcóxi como já descrito; isto é, um alcóxi pode ser um poliéter tal como —OA¹—OA² ou —OA¹— (OA²)_a—OA³, onde “a” é um número inteiro de 1 a 200 e A¹, A² e A³ são grupos alquila e/ou cicloalquila.

[059]Os termos “amina” ou “amino”, conforme aqui utilizados, são representados por uma fórmula NA¹A²A³, onde A¹, A² e A³ podem ser, independentemente, hidrogênio ou grupo alquila opcionalmente substituída, cicloalquila, alquenila, cicloalquenila, alquinila, cicloalquinila, arila, heteroarila como aqui descrito.

[060]O termo “hidroxila”, como aqui utilizado, é representado por uma fórmula — OH.

[061 ]O termo “nitro”, como aqui utilizado, é representado por uma fórmula —NO2.

[062]O termo “farmaceuticamente aceitável” descreve um material que não é biologicamente ou de outro modo indesejável, isto é, sem causar um nível inaceitável de efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma maneira prejudicial.

[063]Como indicado acima, uma modalidade da presente invenção é um método de tratamento, prevenção ou melhora de aterosclerose por tratamento com sequestrantes de γ-ΚΑ e, de preferência, com os sequestrantes de γ-ΚΑ da presente invenção.

[064]As modalidades da presente invenção incluem compostos da seguinte fórmula, e seu uso como agentes antiateroscleróticos:

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[065]em que:

[066]R é N ou C;

[067]R2 é independentemente H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído com um ou mais R2, R3 e R4, e podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[068]Rs é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2 ou Rs para formar um anel de C38 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[069]R4 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[070]Rs é uma ligação, H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C310 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou R4 para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[071]e estereoisômeros e análogos dos mesmos.

[072]As modalidades da presente invenção também incluem compostos da fórmula

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22/54 a seguir, e seu uso como agentes antiateroscleróticos:

[073]em que:

[074]R2 é independentemente H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído com um ou mais R2, R3 e R4, e podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[075]Rs é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2 ou Rs para formar um anel de C38 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[076]R4 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[077]Rs é uma ligação, H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C310 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou R4 para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[078]e estereoisômeros e análogos dos mesmos.

[079]Em outras modalidades da presente invenção, exemplos de compostos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, compostos selecionados a

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23/54 partir da seguinte fórmula ou análogos dos mesmos, e sais farmacêuticos dos mesmos, e seu uso como agentes aqui descritos:

[080]em que:

[081]RéNouC;

[082]R2 é independentemente H, alquila substituída ou não substituída;

[083]Rs é H, halogênio, alcóxi, hidroxila, nitro;

[084]R4 é H, alquil, carboxila substituída ou não substituída; e estereoisômeros e análogos dos mesmos.

[085]Em outra modalidade da presente invenção, é um composto selecionado a partir da fórmula acima ou de seus análogos, e seus sais farmacêuticos, e seu uso como agentes antiateroscleróticos, desde que R2 não seja -CH2-OH quando R é N, R4 é H e R2 é CH3.

[086]Os compostos ou análogos podem ser escolhidos a partir de:

[087]ou um análogo do mesmo.

[088]Os compostos ou análogos também podem ser escolhidos a partir de:

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[089]ou um análogo dos mesmos.

[090]0s compostos ou análogos também podem ser escolhidos a partir de:

[091 ]ou um análogo dos mesmos.

[092]Os compostos também podem ser escolhidos a partir de:

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[093]ou um análogo dos mesmos.

[094]Os compostos também podem ser escolhidos a partir de:

Salicilamina	Metilsalicilamina

<*

Etilsalicilamina Piridoxamina

	f '
5-Metoxisalicilamina	3-Metoxisalicilamina
W >' Λ
Etilpiridoxamina	Pentilpiridoxamina

[095]ou um análogo dos mesmos.

[096]Outra modalidade da presente invenção é um composto para uso no tratamento, prevenção ou melhora de aterosclerose, onde o composto tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula:

[097]em que:

[098]R é N ou C;

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[099]R2 é independentemente H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído com um ou mais R2, R3 e R4, e podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[0100]Rs é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2 ou Rs para formar um anel de C38 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[0101 ]R4 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído com um ou mais R, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[0102]Rs é uma ligação, H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C310 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou R4 para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[0103]e estereoisômeros e análogos dos mesmos.

[0104]Em um aspecto, a invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo os compostos descritos. Isto é, uma composição farmacêutica pode ser fornecida compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de ao menos um composto descrito ou ao menos um produto de um método descrito e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0105]Em outros aspectos, as composições farmacêuticas descritas compreendem os compostos descritos (incluindo sal(ais) farmaceuticamente aceitável) como um ingrediente ativo, um carreador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, outros ingredientes ou adjuvantes terapêuticos. As presentes composições incluem aquelas

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27/54 adequadas para administração oral, retal, tópica e parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular e intravenosa), embora a via mais adequada em um determinado caso dependa do hospedeiro particular e da natureza e gravidade das condições para as quais o ingrediente ativo está sendo administrado. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia.

[0106]Como aqui utilizado, o termo “sais farmaceuticamente aceitáveis” refere-se a sais preparados a partir de bases ou ácidos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. Quando o composto da presente invenção é ácido, o seu sal correspondente pode ser convenientemente preparado a partir de bases não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases inorgânicas e bases orgânicas. Os sais derivados de tais bases inorgânicas incluem alumínio, amônio, cálcio, cobre (cúprico e cuproso), férrico, ferroso, lítio, magnésio, manganês (mangânico e manganoso), potássio, sódio, zinco e sais similares. Particularmente preferenciais são os sais de amônio, cálcio, magnésio, potássio e sódio. Os sais derivados de bases não tóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, bem como aminas cíclicas e aminas substituídas, tais como aminas substituídas de ocorrência natural e sintetizadas. Outras bases não tóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis a partir das quais os sais podem ser formados incluem resinas de troca iônica tais como, por exemplo, arginina, betaína, cafeína, colina, N,N’ -dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, puhnas, teobromina, trietilamina, thmetilamina, thpropilamina, trometamina e similares.

[0107]Como usado aqui, o termo “ácidos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis” inclui ácidos inorgânicos, ácidos orgânicos e sais preparados a partir deles, por

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28/54 exemplo, ácido acético, benzenossulfônico, benzoico, canforsulfônico, cítrico, etanossulfônico, fumárico, glucônico, glutâmico, bromídrico, clorídrico, isetiônico, lático, maleico, málico, mandélico, metanossulfônico, múcico, nítrico, pamoico, pantotênico, fosfórico, sucínico, sulfúrico, tartárico e ácido p-toluenossulfônico e similares. São preferenciais os ácidos cítrico, bromídrico, clorídrico, maleico, fosfórico, sulfúrico e tartárico.

[0108]Na prática, os compostos da invenção, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, desta invenção podem ser combinados como o ingrediente ativo em mistura íntima com um carreador farmacêutico de acordo com técnicas convencionais de composição farmacêutica. O carreador pode assumir uma grande variedade de formas, dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, oral ou parentérica (incluindo intravenosa). Assim, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser apresentadas como unidades discretas adequadas para administração oral, tal como cápsulas, hóstias ou comprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. Além disso, as composições podem ser apresentadas como um pó, como grânulos, como uma solução, como uma suspensão em um líquido aquoso, como um líquido não aquoso, como uma emulsão de óleo em água ou como uma emulsão de água em óleo. Além das formas de dosagem comuns apresentadas acima, os compostos da invenção e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, também podem ser administrados por meios de liberação controlada e/ou dispositivos de entrega. As composições podem ser preparadas por qualquer um dos métodos de farmácia. Em geral, esses métodos incluem uma etapa de associar o ingrediente ativo ao carreador que constitui um ou mais ingredientes necessários. Em geral, as composições são preparadas por mistura uniforme e íntima do ingrediente ativo com carreadores líquidos ou sólidos finamente divididos ou ambos. O produto pode ser então convenientemente moldado na apresentação desejada.

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[0109]Assim, as composições farmacêuticas desta invenção podem incluir um carreador farmaceuticamente aceitável e um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável dos compostos da invenção. Os compostos da invenção, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, também podem ser incluídos em composições farmacêuticas em combinação com um ou mais outros compostos terapeuticamente ativos. O carreador farmacêutico empregado pode ser, por exemplo, um sólido, líquido ou gás. Exemplos de carreadores sólidos incluem lactose, terra alba, sacarose, talco, gelatina, ágar, pectina, acácia, estearato de magnésio e ácido esteárico. Exemplos de carreadores líquidos são xarope de açúcar, óleo de amendoim, óleo de oliva e água. Exemplos de carreadores gasosos incluem dióxido de carbono e nitrogênio.

[0110]Na preparação das composições para a forma de dosagem oral, qualquer meio farmacêutico conveniente pode ser empregado. Por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes flavorizantes, conservantes, agentes corantes e similares podem ser usados para formar preparações líquidas orais, tais como suspensões, elixires e soluções; enquanto carreadores tal como amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes, agentes desintegrantes e similares podem ser usados para formar preparações sólidas orais, tais como pós, cápsulas e comprimidos. Devido à sua facilidade de administração, comprimidos e cápsulas são as unidades de dosagem oral preferenciais pelas quais são empregues carreadores farmacêuticos sólidos. Opcionalmente, os comprimidos podem ser revestidos por técnicas aquosas ou não aquosas padrão.

[0111]Um comprimido contendo a composição desta invenção pode ser preparado por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios ou adjuvantes. Os comprimidos compactados podem ser preparados comprimindo, em uma máquina adequada, o ingrediente ativo em uma forma de fluxo livre, tal como pó ou grânulos, opcionalmente misturado com um ligante, lubrificante, diluente inerte, agente de superfície ativa ou agente de dispersão. Os comprimidos

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30/54 moldados podem ser feitos moldando-os em uma máquina adequada, uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte.

[0112]As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender um composto da invenção (ou sais farmaceuticamente aceitáveis) como um ingrediente ativo, um carreador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um ou mais agentes terapêuticos ou adjuvantes adicionais. As presentes composições incluem composições adequadas para administração oral, retal, tópica e parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular e intravenosa), embora a via mais adequada em um determinado caso dependa do hospedeiro particular e da natureza e gravidade das condições para as quais o ingrediente ativo está sendo administrado. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia.

[0113]As composições farmacêuticas da presente invenção adequadas para administração parentérica podem ser preparadas como soluções ou suspensões dos compostos ativos em água. Um tensoativo adequado pode ser incluído tal como, por exemplo, hidroxipropil celulose. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas dos mesmos em óleos. Além disso, um conservante pode ser incluído para impedir o crescimento prejudicial de microorganismos.

[0114]As composições farmacêuticas da presente invenção adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis. Além disso, as composições podem estar na forma de pós estéreis para a preparação extemporânea de tais soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma injetável final deve ser estéril e deve ser efetivamente fluida para facilitar fluir na seringa. As composições farmacêuticas devem ser estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento; assim, preferencialmente devem ser preservadas

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31/54 contra a ação contam inante de microorganismos tal como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido), óleos vegetais, e misturas adequadas dos mesmos.

[0115]As composições farmacêuticas da presente invenção podem estar em uma forma adequada para uso tópico, tal como, por exemplo, um aerossol, creme, pomada, loção, pó, enxaguatório bucal, gargarejos, e similares. Além disso, as composições podem estar em uma forma adequada para uso em dispositivos transdérmicos. Estas formulações podem ser preparadas, utilizando um composto da invenção, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, através de métodos de processamento convencionais. Como um exemplo, um creme ou pomada é preparado misturando-se material hidrofílico e água, juntamente com cerca de 5% em peso a cerca de 10% em peso do composto, para produzir um creme ou pomada com a consistência desejada.

[0116]As composições farmacêuticas desta invenção podem estar em uma forma adequada para administração retal, onde o carreador é um sólido. É preferencial que a mistura forme supositórios de dose unitária. Os carreadores adequados incluem manteiga de cacau e outros materiais comumente usados na técnica. Os supositórios podem ser convenientemente formados misturando-se primeiro a composição com o(s) carreador(es) amolecido ou derretido, seguido de resfriamento e modelagem em moldes.

[0117]Além dos ingredientes carreadores mencionados acima, as formulações farmacêuticas descritas acima podem incluir, conforme apropriado, um ou mais ingredientes carreadores adicionais, tal como diluentes, tampões, agentes flavorizantes, ligantes, agentes de superfície ativa, espessantes, lubrificantes, conservantes (incluindo antioxidantes) e similares. Além disso, outros adjuvantes podem ser incluídos para tornar a formulação isotônica com o sangue do destinatário pretendido. As composições contendo um composto da invenção, e/ou seus sais

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32/54 farmaceuticamente aceitáveis, também podem ser preparadas na forma de concentrado em pó ou líquido.

[0118]Os compostos da presente invenção podem ser administrados como o único agente farmacêutico ativo, ou podem ser utilizados em combinação com um ou mais outros agentes úteis para o tratamento ou prevenção de várias complicações, tais como, por exemplo, doenças relacionadas à aterosclerose. Quando administrados como uma combinação, os agentes terapêuticos podem ser formulados como composições separadas que são administradas ao mesmo tempo ou em momentos diferentes, ou os agentes terapêuticos podem ser administrados como uma composição única.

[0119]Como aqui indicado, os compostos da presente invenção podem ser feitos na forma sólida (incluindo grânulos, pós ou supositórios) ou na forma líquida (por exemplo, soluções, suspensões ou emulsões). Eles podem ser aplicados em uma variedade de soluções e podem ser submetidos a operações farmacêuticas convencionais, tal como esterilização e/ou podem conteradjuvantes convencionais, tal como conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, tampões etc.

[0120]Assim, para administração, os compostos da presente invenção são normalmente combinados com um ou mais adjuvantes apropriados para a via de administração indicada. Por exemplo, eles podem ser misturados com lactose, sacarose, amido em pó, celulose ésteres de ácidos alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais sódio e cálcio de ácidos fosfórico e sulfúrico, acácia, gelatina, alginato de sódio, polivinil pirrolidina e/ou polivinil álcool, e comprimidos ou encapsulados para administração convencional. Alternativamente, eles podem ser dissolvidos em solução salina, água, polietileno glicol, propileno glicol, soluções coloidais de carboximetil celulose, etanol, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, goma tragacanto e/ou vários tampões.

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Outros adjuvantes e modos de administração são bem conhecidos na técnica farmacêutica. O carreador ou diluente pode incluir material com atraso de tempo, tal como gliceril monoestearato ou gliceril diestearato isoladamente ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica.

[0121]Em aplicações terapêuticas, os compostos da presente invenção podem ser administrados a um paciente mamífero em uma quantidade suficiente para reduzir ou inibir a indicação desejada. As quantidades eficazes para esse uso dependem de fatores que incluem, mas não estão limitados, à via de administração, ao estágio e à gravidade da indicação, ao estado geral de saúde do mamífero, e ao julgamento do médico que está prescrevendo. Os compostos da presente invenção são seguros e eficazes em uma ampla faixa de dosagem. No entanto, entender-se-á que as quantidades de pihdoxamina realmente administradas serão determinadas por um médico, face às circunstâncias relevantes acima.

[0122]Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis dos compostos adequados para uso nos métodos da invenção incluem sais derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como ácido clorídrico, nítrico, fosfóhco, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fluorídrico, fosforoso e similares, bem como os sais derivados de ácidos orgânicos não tóxicos, tal como ácidos monocarboxílicos e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenil-substituídos, ácidos hidróxialcanoicos, ácidos alcanodioicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos, etc. Tais sais incluem, assim, sulfato, pirossulfato, bissulfato, sulfito, bissulfito, nitrato, fosfato, monohidrogenofosfato, di-hidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, cloreto, brometo, iodeto, acetato, trifluoroacetato, propionato, caphlato, isobutirato, oxalato, malonato, sucinato, suberato, sebacato, fumarato, mandelato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, ftalato, benzenossulfonato, toluenossulfonato, fenilacetato, citrato, lactato e, maleato, tartarato, metanossulfonato e similares. São também considerados os sais de aminoácidos tais como arginato e similares e

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34/54 gluconato, galacturonato, n-metil glutamina, etc. (ver, por exemplo, Berge e outros, J. Pharmaceutical Science, 66: 1 a 19 (1977)).

[0123]Os sais de adição de ácido dos compostos básicos são preparados colocando-se em contato a forma de base livre com uma quantidade suficiente do ácido desejado para produzir o sal da maneira convencional. A forma de base livre pode ser regenerada colocando-se em contato a forma de sal com uma base e isolando-se a base livre da maneira convencional. As formas de base livre diferem das suas respectivas formas de sal em algumas propriedades físicas, tal como a solubilidade em solventes polares, mas, de outro modo, os sais são equivalentes à sua respectiva base livre para os fins da presente invenção.

[0124]Os indivíduos, particularmente indivíduos com alto risco de desenvolver aterosclerose, podem ser tratados através da administração de um ou mais dos compostos descritos acima. Como mencionado anteriormente, a dosagem exata dependerá do composto particular que está sendo administrado e será determinada usando procedimentos bem conhecidos na técnica, equilibrando toxicidade e eficácia terapêutica. Os compostos também podem ser administrados a animais para estudar seu efeito no desenvolvimento de placas ateroscleróticas. Nestes casos, as dosagens são limitadas apenas pela toxicidade. Também dever-se-ia reconhecer que os compostos inibitórios podem ser administrados como os únicos agentes ativos em uma forma de dosagem, ou podem ser combinados com outros fármacos para melhorar a eficácia geral.

[0125]Assim, outra modalidade da presente invenção é uma composição para uso no tratamento, prevenção ou melhora de aterosclerose, onde a composição compreende um composto com uma estrutura representada pela seguinte fórmula:

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[0126]em que:

[0127JR é N ou C;

[0128]R2 é independentemente H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R2, R3 e R4, e podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[0129]Rs é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2 ou Rs para formar um anel de C38 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[0130]R4 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[0131 ]Rs é uma ligação, H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C310 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou R4 para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

[0132]e estereoisômeros e análogos dos mesmos; e um carreador farmaceuticamente aceitável.

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[0133]Exemplos

[0134]Além dos exemplos mostrados acima, os exemplos a seguir demonstram certas modalidades da presente invenção. Todos os exemplos devem ser interpretados como exemplificativos de certos aspectos da presente invenção e não devem ser interpretados como limitantes dos mesmos.

[0135]Abreviações: 2-HOBA, 2-hidroxibenzilamina; 4-HOBA, 4-hidroxibenzilamina; MDA, malondialdeído; 4-HNE, 4-hidroxinonenal; IsoLGs, isolevuglandinas; HDL, lipoproteínas de alta densidade; LDL, lipoproteínas de baixa densidade; LDLR, receptor de lipoproteína de baixa densidade; ApoAI, apolipoproteína Al; ApoB, apolipoproteína B; ROS, espécies reativas do oxigênio; IL, interleucina.

[0136]Materiais e métodos:

[0137]Camundongos: Camundongos Ldr^/_ e WT em C57BL/6 foram obtidos a partir de Jackson Laboratory. Os protocolos animais foram realizados de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Vanderbilt. Os camundongos foram mantidos em uma dieta com ração ou dieta do tipo ocidental contendo 21% de gordura do leite e 0,15% de colesterol (Teklad). Camundongos fêmeas com oito semanas de idade foram camundongos pré-tratados com veículo isoladamente (Água) ou contendo 1 g / L de 4-HOBA ou 1 g / L de 2HOBA. Após duas semanas, os camundongos continuaram recebendo tratamento e receberam uma dieta ocidental por 16 semanas para induzir hipercolesterolemia e aterosclerose.

[0138]Cultura de células: Macrófagos peritoneais foram isolados de camundongos 72 horas após a injeção de 3% de tioglicato e mantidos em DMEM mais 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) como descrito anteriormente. As células endoteliais da aorta humana (HAECs) foram obtidas a partir de Lonza e mantidas em meio basal 2 de células endoteliais mais 1% de FBS e fatores de crescimento essenciais (Lonza).

[0139]lsolamento de HDL a partir do plasma de camundongo e medição da

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37/54 capacidade de HDL de reduzir o colesterol de macrófagos: O HDL foi isolado a partir do plasma de camundongo usando o Kit de Purificação de HDL (Cell BioLabs, Inc.) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, as lipoproteínas contendo apoB e o HDL foram precipitados sequencialmente com sulfato de dextrano. O HDL foi então ressuspenso e lavado. Depois de remover o sulfato de dextrano, o HDL foi dialisado contra PBS. Para medir a capacidade do HDL de reduzir o colesterol dos macrófagos, os macrófagos apoE’⁷’ foram enriquecidos com colesterol por incubação por 48h em DMEM, contendo 100 pg de proteína / ml de LDL acetilado. As células foram então lavadas e incubadas por 24h em DMEM isoladamente ou com 25 pg de proteína / ml de HDL. O colesterol celular foi medido antes e após a incubação com HDL usando um ensaio enzimático de colesterol, conforme descrito.

[0140]Medição de MDA-LDL, MDA-HDL e MDA-ApoAI: O sanduíche ELISA foi usado para medir os níveis plasmáticos de MDA-LDL e MDA-HDL seguindo as instruções do fabricante (Cell BioLabs, Inc.). Resumidamente, amostras isoladas de LDL ou HDL e padrões de MDA-HDL foram adicionados a placas revestidas com antiMDA e, após o bloqueio, as amostras foram incubadas com anticorpo primário biotinilado anti-apoB ou anti-ApoAI. As amostras foram então incubadas por 1 h com conjugado de estreptavidina - enzima e 15 min com solução de substrato. Depois de parar a reação, o O.D. foi medido no comprimento de onda de 450 nm. MDA-ApoAI foi detectado no plasma de camundongos por imunoprecipitação de ApoAI e western blotting. Resumidamente, 50 pl de plasma de camundongo foram preparados com 450 μΙ do tampão de lise IP (Pierce) mais mistura inibidora de protease a 0,5% (Sigma), e imunoprecipitado com 10 pg de anticorpo policlonal contra ApoAI de camundongo (Novus). Então 25 pl de esferas magnéticas (Invitrogen) foram adicionados, e a mistura foi incubada durante 1 hora a 4^o C com rotação. As esferas magnéticas foram então coletadas, lavadas três vezes, e foi adicionado às esferas tampão de amostra SDS-PAGE com β-mercaptoetanol. Após incubação a 70° C por 5 min, o campo

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38/54 magnético foi aplicado ao Suporte de Separação Magnética (New England), e o sobrenadante foi utilizado para detectar ApoAI ou MDA de camundongo. Para Western blotting, 30 a 60 pg de proteínas foram resolvidos por eletroforese NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) e transferidos para membranas de nitrocelulose (Amersham Bioscience). As membranas foram sondadas com anticorpos primários de coelho específicos para ApoAI (Novus) ou MDA (sinalização celular) e anticorpo secundário marcado com fluorescência IRDye 680 (LI-COR). As proteínas foram visualizadas e quantificadas pelo software Odyssey 3.0 Quantification (LI-COR).

[0141]Modificação de HDL e LDL com MDA: O MDA foi preparado imediatamente antes do uso por hidrólise ácida rápida de maloncarbonil bis-(dimetilacetal) como descrito. Resumidamente, 20 μΙ de HCI a 1 M foram adicionados a 200 μΙ de maloncarbonil bis-(dimetilacetal) e a mistura foi incubada por 45 min em temperatura ambiente. A concentração de MDAfoi determinada por absorbância a 245 nm, usando o fator coeficiente 13, 700 M-1 cm-1. HDL (10 mg de proteína/mL) e doses crescentes de MDA (0, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) foram incubadas a 37° C por 24 h em tampão fosfato de sódio a 50 mM (pH7,4) contendo DTPA a 100 μΜ. As reações foram iniciadas adicionando MDA e interrompidas por diálise de amostras contra PBS a 4^o C. O LDL (5 mg / mL) foi modificado in vitro com MDA (10 mM) na presença de veículo isoladamente ou com 2-HOBA a 37° C por 24 h em tampão fosfato de sódio 50 mM (pH7,4) contendo DTPA a 100 μΜ. As reações foram iniciadas adicionando MDA e interrompidas por diálise de amostras contra PBS a 4^o C. As amostras de LDL foram incubadas por 24 horas com macrófagos e o teor de colesterol das células foi medido usando um ensaio enzimático de colesterol, como descrito.

[0142]Análises de aterosclerose e coloração por imunofluorescência em seções transversais: A extensão da aterosclerose foi examinada tanto em seções transversais da aorta proximal coradas com Oil-Red-O quanto por análise en face usando o sistema de imagiologia KS300 (Kontron Elektronik GmbH). Para coloração por

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39/54 imunofluorescência, seções transversais de 5 pm da aorta proximal foram fixadas em acetona fria (Sigma), bloqueadas em Background Buster (Innovex), incubadas com anticorpos primários indicados (MDA e CD68) a 4^o C durante a noite. Após incubação com anticorpos secundários marcados com fluorescência a 37° C durante 1 hora, o núcleo foi contracorado com Hoechst. As imagens foram capturadas com um microscópio de fluorescência (Olympus 1X81) e software SlideBook 6 (IntelligenceImage) e quantificadas usando o software Imaged (NIH).

[0143]Apoptose celular in vitro e análise de apoptose e eferocitose de lesão: A apoptose celular foi induzida conforme indicado e detectado por coloração com Anexina V marcada com fluorescência e quantificada por citometria de fluxo (BD 5 LSRII) ou por contagem de células positivas para anexina V em imagens capturadas em um microscópio de fluorescência. As células apoptóticas na lesão aterosclerótica foram medidas por coloração TlINEL de seções transversais da aorta proximal aterosclerótica, como descrito anteriormente. As células TUNEL-positivas não associadas a macrófagos vivos foram consideradas células apoptóticas livres e as células apoptóticas associadas a macrófagos foram consideradas fagocitadas como uma medida da eferocitose da lesão, como descrito anteriormente.

[0144]Coloração tricrômica de Masson: A coloração tricrômica de Masson foi aplicada para medir o teor de colágeno da lesão aterosclerótica, a espessura da capa fibrosa e o tamanho do núcleo necrótico, seguindo as instruções do fabricante (Sigma) e conforme descrito anteriormente. Resumidamente, seções transversais de 5 pm da raiz da aorta proximal aterosclerótica foram fixadas com solução de Bouin, coradas com hematoxilina para núcleos (preto), escarlate de biebhch e ácido fosfotúngstico / fosfomolíbdico para citoplasma (vermelho), e azul de anilina para colágeno (azul). As imagens foram capturadas e analisadas quanto ao teor de colágeno, espessura da capa aterosclerótica e núcleo de necrose pelo software ImageJ, conforme descrito anteriormente.

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[0145]lsolamento de RNA e RT-PCR em tempo real: 0 RNA total foi extraído e purificado usando o kit Aurum Total RNA (Bio-Rad) de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA complementar foi sintetizado com a transcriptase reversa iScript (Bio-Rad). A quantificação relativa do mRNA alvo foi realizada usando iniciadores específicos, sonda SYBR (Bio-Rad) e polimerase iTaqDNA (Bio-Rad) no termociclador IQ5 (Bio-Rad) e normalizada com 18S, como descrito anteriormente. Os iniciadores 18S, IL-1 β e TNF-a utilizados foram como descritos anteriormente.

[0146]Estatística: Os dados são apresentados como média ± SEM. A normalidade das populações da amostra foi examinada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, e as diferenças entre os valores médios foram determinadas pela ANOVA de uma via (pósteste de Bonferroni), teste de Kruskal-Wallis (comparação múltipla de Bunn), teste de Mann-Whitney e Teste t de Student usando o GraphPad PRISM. A significância foi estabelecida para p < 0,05.

[0147]Resultados:

[0148]O tratamento com 2-HOBA atenua a aterosclerose sem alterar o colesterol plasmático em camundongos Ldr^/_: Os camundongos LdlrT⁷’foram alimentados com uma dieta ocidental por 16 semanas e foram tratados continuamente com veículo isoladamente (água) ou água contendo 2-HOBA ou 4-HOBA, um análogo não reativo. O tratamento com 2-HOBA reduziu a extensão de aterosclerose aórtica proximal em 31,1% e 31,5%, em comparação com o tratamento com veículo ou 4-HOBA, respectivamente (Figuras 1A e IB). Além disso, uma análise en face da aorta demonstra que o tratamento de camundongos Ldr^/_ com 2-HOBA reduziu a aterosclerose em 60,3% e 59,1% em comparação com a administração de veículo e 4-HOBA, respectivamente (Figuras 1C e 1D). Em comparação com a administração de veículo ou 4-HOBA, o tratamento com 2-HOBA não afetou o peso corporal (dados não mostrados). Além disso, os níveis plasmáticos de colesterol total e triglicerídeos não foram significativamente diferentes entre os três grupos de camundongos (Figura

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1E). Assim, pela primeira vez, os presentes inventores demonstram que o tratamento com 2-HOBA diminui significativamente o desenvolvimento de aterosclerose em um modelo experimental de camundongo sem alterar os níveis plasmáticos de colesterol e triglicerídeos. Consistente com os efeitos de 2-HOBA na aterosclerose devido ao sequestro de aldeído, os níveis de MDA na aorta proximal foram reduzidos em 68,5% e 66,8% em camundongos tratados com 2-HOBA em comparação com camundongos tratados apenas com veículo ou 4-HOBA (Figuras 2A e 2B).

[0149]O tratamento com 2-HOBA promove a formação de placas ateroscleróticas mais estáveis em camundongos Ldr^/_ hipercolesterolêmicos: Como placas vulneráveis exibem maior risco de eventos cardiovasculares agudos, os presentes inventores examinaram os efeitos do tratamento com 2-HOBA na estabilização de placas quantificando o teor de colágeno da lesão aterosclerótica, a espessura da capa fibrosa e o núcleo necrótico (Figuras 3A-3D). Com comparação com a administração de veículo ou 4-HOBA, o tratamento com 2-HOBA aumentou o teor de colágeno da aorta proximal em 2,7 e 2,6 vezes, respectivamente (Figuras 3A e 3B). Além disso, a espessura da capa fibrosa foi 2,31 e 2,29 vezes maior nas lesões de camundongos tratados com 2-HOBA versus camundongos tratados com veículo e 4-HOBA (Figuras 3A e 3C). É importante ressaltar que a % de área necrótica na aorta proximal diminuiu 74,8% e 73,5% em camundongos tratados com 2-HOBA versus veículo e 4-HOBA (Figuras 3A e 3D). Tomados em conjunto, esses dados mostram que o 2-HOBA suprime a formação de placas vulneráveis nos camundongos Ldr^/_ hipercolesterolêm icos.

[0150]O tratamento com 2-HOBA promove a sobrevida celular e a eferocitose e reduz a inflamação: Como a morte celular aumentada e a eferocitose insuficiente promovem a formação do núcleo necrótico e a desestabilização das placas ateroscleróticas, os presentes inventores examinaram a seguir os efeitos do tratamento com 2-HOBA na morte celular e na eferocitose em lesões ateroscleróticas

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42/54 na aorta proximal (Figuras 4A-4D). Em comparação com o tratamento com veículo ou 4-HOBA, o número de células TUNEL-positivas foi reduzido em 72,9% e 72,4% na lesão aórtica proximal de camundongos tratados com 2-HOBA (Figuras 4A e 4C). Consistente com o sequestro de dicarbonila lipídica reativa, mantendo eferocitose eficiente, o número de células TUNEL-positivas não associadas a macrófagos aumentou em 1,9 e 2,0 vezes nas lesões de camundongos tratados com veículo e 4HOBA versus 2-HOBA (Figuras 4B e 4D). O exame in vitro do sequestro de dicarbonila com 2-HOBA na suscetibilidade de macrófagos e células endoteliais à apoptose em resposta ao tratamento com H2O2 demonstra que, em comparação com a incubação com veículo ou 4-HOBA, o 2-HOBA diminuiu acentuadamente o número de células apoptóticas tanto nos macrófagos quanto em culturas celulares endoteliais (Figuras 5A e 5B). Além disso, o tratamento com 2-HOBA reduziu significativamente a resposta inflamatória dos macrófagos ao LDL oxidado, como mostrado pelos níveis reduzidos de mRNA IL-1 β IL-6 e TNF-α (Figuras 5C-5E). Resultados similares na resposta inflamatória de macrófagos ao H2O2 foram observados com o tratamento com 2-HOBA versus veículo ou com 4-HOBA (Figuras 5F-5H). Tomados em conjunto, esses dados mostram que 0 tratamento com 2-HOBA mantém eferocitose eficiente in vivo e evita apoptose e inflamação em resposta ao estresse oxidativo.

[0151 ]Efeitos de 2-HOBA na modificação e função das lipoproteínas de MDA e o impacto da hipercolesterolemia familiar no teor e na função do aducto de lipoproteínas MDA: À medida que a modificação do LDL melhora a formação de células espumosas, os presentes inventores examinaram os efeitos do sequestro in vivo de dicarbonila no teor de MDA-LDL plasmático (Figura 6A). Em comparação com o tratamento com veículo ou 4-HOBA, os níveis plasmáticos de MDA-LDL foram reduzidos em 57% e 54% em camundongos Ldlr^/_ tratados com 2-HOBA (Figura 6A). Além disso, o sequestro de dicarbonila com 2-HOBA versus veículo durante a modificação in vitro de LDL com MDA reduziu a capacidade do LDL de aumentar o acúmulo de colesterol

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43/54 em macrófagos (Figura 6B). O exame do teor plasmático de MDA-LDL do controle versus indivíduos FH homozigotos revelou que os pacientes FH aumentaram os aductos de MDA-LDL. Como a modificação oxidativa do HDL prejudica suas funções, os presentes inventores examinaram a seguir os efeitos do tratamento com 2-HOBA no teor e na função do HDL MDA. O tratamento de camundongos Ldlr^/_ com 2-HOBA reduziu os níveis plasmáticos de MDA-HDL em 57% e 56% (Figura 7A) em comparação com o tratamento com veículo ou 4-HOBA. Em seguida, os presentes inventores examinaram a formação do aducto de ApoAI MDA imunoprecipitando a apoAI a partir do plasma e western blotting com um anticorpo para MDA. Após 16 semanas na dieta do tipo ocidental, os camundongos Ldlr⁷’ tratados com veículo ou 4-HOBA aumentaram acentuadamente os níveis plasmáticos de MDA-apoAI e reduziram os níveis plasmáticos de apoAI em comparação aos camundongos Ldlr^/_ que consomem uma dieta de ração (Figuras 7B e 7C). Em contraste, o tratamento de camundongos Ldlr^/_ que consomem uma dieta ocidental com 2-HOBA reduziu drasticamente os aductos plasmáticos de MDA-apoAI e aumentou os níveis de apoAI (Figuras 7B e 7C). É importante ressaltar que o HDL isolado de camundongos Ldlr-/tratados com 2-HOBA foi 2,2 e 1,7 vezes mais eficiente na redução dos estoques de colesterol nas células espumosas de macrófagos ApoE’⁷’ versus veículo e camundongos tratados com 4-HOBA (Figura 7D). Consistente com a modificação de dicarbonila de HDL, desempenhando um papel no comprometimento da função do HDL, a modificação in vitro de HDL com MDA prejudicou a capacidade do HDL de reduzir o teor de colesterol das células espumosas de macrófagos de maneira dosedependente (Figura 7E). É importante ressaltar que o plasma de indivíduos humanos com pré- e pós-LDL-aférese FH homozigótica (LA) apresentaram 5,9 vezes e 5,6 vezes mais aductos de MDA-HDL em comparação com o plasma de controle (Figura 7F). Além disso, o HDL de FH versus indivíduos de controle não tem a capacidade de reduzir o teor de colesterol dos macrófagos ApoE’⁷’ enriquecidos com colesterol

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44/54 (Figura 7G). Em conjunto, o sequestro de dicarbonila com 2-HOBA evita a formação de células espumosas de macrófagos, reduzindo a modificação de LDL por dicarbonilas e melhorando a capacidade líquida de efluxo de colesterol HDL. Além disso, estes exemplos mostram que o sequestro de dicarbonilas lipídicas reativas com modalidades da presente invenção é uma abordagem terapêutica em humanos, uma vez que LDL e HDL de indivíduos com FH homozigótico contêm MDA aumentado e melhoram a formação de células espumosas.

[0152]Discussão:

[0153]A peroxidação lipídica induzida por estresse oxidativo tem sido implicada no desenvolvimento de aterosclerose. Defeitos genéticos e/ou fatores ambientais causam um desequilíbrio entre o estresse oxidativo e a capacidade do corpo de neutralizar ou desintoxicar os efeitos nocivos dos produtos de oxidação. O grande conjunto de evidências experimentais que implicam um papel importante da peroxidação lipídica na patogênese de aterosclerose estimulou um enorme interesse no potencial de antioxidantes para prevenir doenças card iovascu lares ateroscleróticas. Embora alguns estudos com antioxidantes dietários em humanos tenham demonstrado reduções na aterosclerose e eventos cardiovasculares, a maioria dos grandes estudos clínicos com antioxidantes não demonstrou nenhum benefício em termos de eventos cardiovasculares reduzidos. As possíveis razões para o fracasso desses ensaios na redução de eventos cardiovasculares incluem doses inadequadas de antioxidantes sendo usadas nos ensaios e a inibição da sinalização de ROS normal que pode ser antiaterogênica. O tratamento com sequestrantes de espécies de dicarbonilas reativas derivadas da peroxidação lipídica representa uma nova estratégia terapêutica alternativa que inibirá os efeitos adversos de ROS sem destruir a sinalização normal mediada por ERO.

[0154]No presente estudo, os presentes inventores procuraram examinar o potencial de uma nova classe de antioxidante, o sequestrante de dicarbonila lipídica reativa,

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45/54 para impedir o desenvolvimento de aterosclerose em camundongos Ldr⁷’. A peroxidação lipídica nos tecidos I células ou no sangue produz várias dicarbonilas altamente reativas que incluem malondialdeído, isolevuglandinas e 4-oxo-nonenal. Esses eletrófilos podem se ligar covalentemente ao DNA, proteínas e fosfolipídios, causando alterações nas funções celulares e das lipoproteínas. Os presentes inventores são os primeiros a examinar os efeitos do sequestro de aldeídos na aterosclerose, e os presentes inventores demonstram que o 2-HOBA, um sequestrante de aldeído reativo, reduz significativamente o desenvolvimento da aterosclerose no modelo de camundongo Ldr^/_ hipercolesterolêmico (Figura 1). É importante ressaltar que estes estudos mostram que o tratamento com 2-HOBA melhora significativamente as características da estabilidade da placa aterosclerótica, como evidenciado pela diminuição da necrose e aumento da espessura da capa fibrosa e do teor de colágeno (Figura 3). Assim, o sequestro de aldeído usando 2HOBA oferece potencial terapêutico na redução do risco de eventos clínicos resultantes da formação de placas ateroscleróticas vulneráveis. Além disso, o sequestro de dicarbonila reduziu a modificação de MDA in vivo do HDL, melhorando assim sua capacidade de efluxo de colesterol (Figura 7). Além disso, a modificação com MDA foi aumentada no FH-HDL, o que provavelmente contribuiu para a formação aprimorada de células espumosas induzida por seu HDL (Figura 7). Tomados em conjunto, o sequestro de dicarbonila usando 2-HOBA oferece benefício terapêutico na redução do desenvolvimento da aterosclerose e o risco de eventos clínicos resultantes da formação de placas ateroscleróticas vulneráveis.

[0155]As modalidades da presente invenção demonstram que o 2-HOBA reduz o desenvolvimento da aterosclerose sem diminuir os níveis de colesterol no plasma (Figura 1). Sem estar limitado pela teoria ou mecanismo, os efeitos ateroprotetores de 2-HOBA provavelmente são devidos ao sequestro de dicarbonilas bioativas. O fato de os efeitos de 2-HOBA serem mediados por sua ação como sequestrantes de

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46/54 dicarbonila é ainda mais suportado pela constatação de que ο 4-HOBA, um isômero geométrico de 2-HOBA, que não é um sequestrante, não é ateroprotetor. A prevenção da aterosclerose pela remoção de dicarbonilas reforça substancialmente a hipótese de que essas dicarbonilas contribuem para a patogênese da aterogênese.

[0156]O HDL medeia uma série de funções ateroprotetoras e há evidências de que marcadores de disfunção de HDL, tal como capacidade diminuída do efluxo de colesterol, podem ser um melhor indicador do risco de CAD do que os níveis de HDLC. Já foi demonstrado que pacientes com FH apresentam diminuição da capacidade de efluxo de colesterol HDL, indicativa de HDL disfuncional. Os presentes inventores mostram que o consumo de uma dieta ocidental por camundongos Ldr^/_ resulta em formação aprimorada de aducto MDA-apoAI (Figura 7), e que o tratamento com 2HOBA reduz drasticamente a modificação de apoAI e HDL com MDA. Da mesma forma, os pacientes com FH aumentaram os níveis plasmáticos de aductos MDA-HDL. Além disso, a modificação in vitro do HDL resultou em menor capacidade de efluxo líquido de colesterol, o que é consistente com os estudos de Shao e colegas demonstrando que a modificação de apoAI livre de lipídios com MDA bloqueia o efluxo de colesterol mediado por ABCA1. Estudos também demonstraram que o uso prolongado de tabaco provoca aumento da formação de aductos de MDA-HDL, e a cessação do tabagismo leva a uma melhor função do HDL com maior capacidade de efluxo de colesterol. De acordo com esses resultados, descobriu-se que o HDL isolado de camundongos tratados com 2-HOBA versus veículo e 4-HOBA aumentou a capacidade de reduzir as reservas de colesterol nas células espumosas de macrófagos (Figura 7). Além disso, o FH-HDL aumentou acentuadamente os aductos de MDA e reduziu severamente a capacidade de reduzir o estoque de colesterol de macrófagos antes e depois de LDL-aférese (Figura 7). Assim, é provável que um dos mecanismos ateroprotetores de 2-HOBA previna a formação de aductos dicarbonila das proteínas HDL, preservando assim a função do efluxo líquido do colesterol HDL.

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Além de diminuir a modificação oxidativa do HDL, estes estudos mostram que o tratamento com 2-HOBA diminui bastante a modificação com MDA in vivo e in vitro do LDL. Estudos demonstraram que a modificação com MDA de LDL promove a formação de células espumosas e uma resposta inflamatória. De forma importante, a neutralização de aductos de MDA-apoB com anticorpos aumenta muito a regressão da aterosclerose em camundongos Ldr^/_ transgênicos com apoB100 humano. Assim, é provável que a diminuição da aterosclerose com o tratamento com 2-HOBA também se deva em parte à diminuição da modificação com dicarbonila de apoB.

[0157]Existem evidências de que o aumento do estresse oxidativo nas células arteriais íntimas é essencial para induzir o estresse ER, a inflamação e a morte celular na aterogênese. Em particular, a eferocitose eficiente e a morte celular limitada são cruciais para prevenir a necrose e a característica de inflamação excessiva da placa vulnerável. Os presentes inventores demonstraram que o tratamento com 2-HOBA promove características de placas ateroscleróticas mais estáveis em camundongos Ldr^/_ (Figura 3). Os presentes inventores também mostraram que o tratamento com 2HOBA diminuiu o teor do aducto de MDA da lesão aterosclerótica (Figura 2), suportando a capacidade de sequestro de dicarbonila no íntimo arterial para limitar a morte celular induzida por estresse oxidativo e a desestabilização das placas. Assim, uma modalidade da presente invenção é o sequestro de dicarbonilas com 2-HOBA in vitro para limitar a apoptose induzida por estresse oxidativo em células endoteliais e macrófagos (Figura 5). A morte celular diminuída é provavelmente devida em parte à resposta inflamatória bastante reduzida ao estresse oxidativo resultante a partir do sequestro de dicarbonila com 2-HOBA (Figura 5). É importante ressaltar que o tratamento com 2-HOBA de acordo com a presente invenção manteve a eferocitose eficiente e reduziu o número de células mortas nas lesões ateroscleróticas (Figura 4). Como um resultado, o sequestro de dicarbonila com 2-HOBA promoveu a formação de placas estáveis com necrose diminuída e aumentou o teor de colágeno e a

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48/54 espessura da capa fibrosa (Figura 3). Portanto, a capacidade do 2-HOBA de limitar a morte e a inflamação nas células arteriais em resposta ao estresse oxidativo e promover a eferocitose eficiente na parede da artéria fornece um novo mecanismo ateroprotetor pelo qual o sequestro de dicarbonila promove características de estabilização de placa e reduz a formação de lesões ateroscleróticas.

[0158]Em conclusão, os métodos da presente invenção suprimem o desenvolvimento de aterosclerose em camundongos hipercolesterolêmicos Ldr⁷’. O tratamento com 2-HOBA diminuiu a formação de aductos de MDA-apoAI, mantendo assim a função HDL eficiente. Além disso, a prevenção de aductos de MDA-apoB diminui a formação de células espumosas e a inflamação. Finalmente, dentro da lesão aterosclerótica, o sequestro de dicarbonila limitou a morte celular, a inflamação e a necrose, estabilizando assim efetivamente as placas ateroscleróticas. Como o efeito ateroprotetor do tratamento com 2-HOBA é independente de qualquer ação sobre os níveis de colesterol no plasma, a presente invenção também atende a uma necessidade sentida de diminuir terapeuticamente o risco de CAD residual que persiste em pacientes tratados com inibidores de HMG-CoA redutase.

[0159]Referências

[0160]1. Linton, M.F., Yancey, P.G., Davies, S.S., Jerome, W.G.J., Linton, E.F., e Vickers, K.C. 2000. The Role of Lipids and Lipoproteins in Atherosclerosis.

[0161 ]2. Sampson, U.K., Fazio, S., e Linton, M.F. 2012. Residual cardiovascular risk despite optimal LDL cholesterol reduction with statins: the evidence, etiology, and therapeutic challenges. Curr Atheroscler Rep 14: 1 a 10.

[0162]3. Anderson, T.J. 1997. Oxidative stress, endothelial function and coronary atherosclerosis. Cardiologia 42: 701 a 714.

[0163]4. Aviram, M. 2011. Atherosclerosis: cell biology and lipoproteins-inflammation and oxidative stress in atherogenesis: protective role for paraoxonases. Curr Opin Lipidol 22: 243 a 244.

Petição 870190110811, de 30/10/2019, pág. 55/68

49/54

[0164]5. Peluso, I., Morabito, G., Urban, L, loannone, F., e Serafini, M. 2012. Oxidative stress in atherosclerosis development: the central role of LDL and oxidative burst. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 12: 351 a 360.

[0165]6. Kontush, A., Lindahl, M., Lhomme, M., Calabresi, L., Chapman, M.J., e Davidson, W.S. 2015. Structure of HDL: particle subclasses and molecular components. Handb Exp Pharmacol 224: 3 a 51.

[0166]7. Riwanto, M., Rohrer, L., von Eckardstein, A., e Landmesser, U. 2015. Dysfunctional HDL: from structure-function-relationships to biomarkers. Handb Exp Pharmacol 224: 337 a 366.

[0167)8. Linton, M.F., Tao, H., Linton, E.F., e Yancey, P.G. 2017. SR-BI: A Multifunctional Receptor in Cholesterol Homeostasis and Atherosclerosis. Trends Endocrinol Metab.

[0168]9. Brewer, H.B., Jr., e Rader, D.J. 1991. HDL: structure, function and metabolism. Prog Lipid Res 30: 139 a 144.

[0169)10. Xi, H., Akishita, M., Nagai, K., Yu, W., Hasegawa, H., Eto, M., Kozaki, K., e Toba, K. 2007. Potent free radical scavenger, edaravone, suppresses oxidative stress-induced endothelial damage and early atherosclerosis. Atherosclerosis 191: 281 a 289.

[0170]11. Vasdev, S., Gill, V.D., e Singal, P.K. 2006. Modulation of oxidative stressinduced changes in hypertension and atherosclerosis by antioxidants. Exp Clin Cardiol 11: 206 a 216.

[0171 ]12. Guo, L., Chen, Z., Amarnath, V., Yancey, P.G, Van Lenten, B.J., Savage, J.R., Fazio, S., Linton, M.F., e Davies, S.S. 2015. Isolevuglandin-type lipid aldehydes induce the inflammatory response of macrophages by modifying phosphatidylethanolamines and activating the receptor for advanced gly cation endproducts. Antioxid Redox Signal 22: 1633 a 1645.

[0172]13. Kirabo, A., Fontana, V., de Faria, A.P., Loperena, R., Galindo, C.L., Wu,

Petição 870190110811, de 30/10/2019, pág. 56/68

50/54

J., Bikineyeva, A.T., Dikalov, S., Xiao, L, Chen, W., e outros, 2014. DC isoketalmodified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest 124: 4642 a 4656.

[0173]14. Davies, S.S., Bodine, C, Matafonova, E., Pantazides, B.G., BernoudHubac, N., Harrison, F.E., Olson, S.J., Montine, T.J., Amarnath, V., e Roberts, L.J., 2nd. 2011. Treatment with a gamma-ketoaldehyde scavenger prevents working memory deficits in hApoE4 mice. J Alzheimers Dis 27: 49 a 59.

[0174]15. Davies, S.S., Brantley, E.J., Voziyan, P. A., Amarnath, V., Zagol-lkapitte, I., Boutaud, 0., Hudson, B.G., Oates, J.A., e Roberts, L.J., 2nd. 2006. Pyridoxamine analogues scavenge lipid-derived gamma-ketoaldehydes and protect against H202mediated cytotoxicity. Biochemistry 45: 15756 a 15767.

[0175]16. Zagol-lkapite, I., Sosa, I.R., Oram, D., Judd, A., Amarnath, K., Amarnath, V., Stec, D., Oates, J. A., e Boutaud, O. 2015. Modification of platelet proteins by malondialdehyde: prevention by dicarbonyl scavengers. J Lipid Res 56: 2196 a 2205.

[0176]17. Sidorova, T.N., Yermalitskaya, L.V., Mace, L.C., Wells, K.S., Boutaud, 0., Prinsen, J.K., Davies, S.S., Roberts, L.J., 2nd, Dikalov, S.I., Glabe, C.G, e outros, 2015. Reactive gamma-ketoaldehydes promote protein misfolding and preamyloid oligomer formation in rapidly-activated atrial cells. J Mol Cell Cardiol 79: 295 a 302.

[0177]18. Leopold, J. A. 2015. Antioxidants and coronary artery disease: from pathophysiology to preventive therapy. Coron Artery Dis 26: 176 a 183.

[0178]19. Roberts, L.J., 2nd, Oates, J.A., Linton, M.F., Fazio, S., Meador, B.P., Gross, M.D., Shyr, Y., e Morrow, J.D. 2007. The relationship between dose of vitamin E and suppression of oxidative stress in humans. Free Radic Biol Med 43: 1388 a 1393.

[0179]20. Amarnath, V., Amarnath, K., Amarnath, K., Davies, S., e Roberts, L.J., 2nd. 2004. Pyridoxamine: an extremely potent scavenger of 1,4-dicarbonyls. Chem Res Toxicol 17: 410 a 415.

Petição 870190110811, de 30/10/2019, pág. 57/68

51/54

[0180]21. Nakajima, T., Davies, S.S., Matafonova, E., Potet, F., Amarnath, V., Tailman, K.A., Serwa, R.A., Porter, N.A., Balser, J.R., Kupershmidt, S., e outros, 2010. Selective gamma-ketoaldehyde scavengers protect Navi.5 from oxidant-induced inactivation. J Mol Cell Cardiol 48: 352 a 359.

[0181]22. Amarnath, V., e Amarnath, K. 2015. Scavenging 4-Oxo-2-nonenal. Chem Res Toxicol 28: 1888 a 1890.

[0182]23. Zagol-lkapitte, I., Amarnath, V., Bala, M., Roberts, L.J., 2nd, Oates, J.A., e Boutaud, 0. 2010. Characterization of scavengers of gamma-ketoaldehydes that do not inhibit prostaglandin biosynthesis. Chem Res Toxicol 23: 240 a 250.

[0183]24. Zagol-lkapitte, I., Matafonova, E., Amarnath, V., Bodine, C.L., Boutaud, 0., Tirana, R.G., Oates, J.A., Roberts li, L.J., e Davies, S.S. 2010. Determination of the Pharmacokinetics and Oral Bioavailability of Salicylamine, a Potent gammaKetoaldehyde Scavenger, by LC/MS/MS. Pharmaceutics 2: 18 a 29.

[0184]25. Tao, H., Yancey, P.G., Babaev, V.R., Blakemore, J.L., Zhang, Y., Ding, L, Fazio, S., e Linton, M.F. 2015. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Racl signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. J Lipid Res 56: 1449 a 1460.

[0185]26. Robinet, P., Wang, Z., Hazen, S.L., e Smith, J.D. 2010. A simple and sensitive enzymatic method for cholesterol quantification in macrophages and foam cells. J Lipid Res 51: 3364 a 3369.

[0186]27. Shao, B., Pennathur, S., Pagani, I., Oda, M.N., Witztum, J.L., Oram, J.F., e Heinecke, J.W. 2010. Modifying apolipoprotein A-l by malondialdehyde, but not by an array of other reactive carbonyls, blocks cholesterol efflux by the ABCA1 pathway. J Biol Chem 285: 18473 a 18484.

[0187]28. Hartig, S.M. 2013. Basic image analysis and manipulation in Image! Curr Protoc Mol Biol Chapter 14:Unitl4 15.

[0188]29. Livak, K.J., e Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of relative gene expression

Petição 870190110811, de 30/10/2019, pág. 58/68

52/54 data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25: 402 a 408.

[0189]30. Pirinccioglu, A.G., Gokalp, D., Pihnccioglu, M., Kizil, G., e Kizil, M. 2010. Malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl (PCO) levels as biomarkers of oxidative stress in subjects with familial hypercholesterolemia. Clin Biochem 43: 1220 a 1224.

[0190]31. Rodenburg, J., Vissers, M.N., Wiegman, A., Miller, E.R., Ridker, P.M., Witztum, J.L., Kastelein, J.J., e Tsimikas, S. 2006. Oxidized low-density lipoprotein in children with familial hypercholesterolemia and unaffected siblings: effect of pravastatin. J Am Coll Cardiol 47: 1803 a 1810.

[0191 ]32. Mollazadeh, H., Carbone, F., Montecucco, F., Pirro, M., e Sahebkar, A. 2018. Oxidative burden in familial hypercholesterolemia. J Cell Physiol.

[0192]33. Rahman, T., Hamzan, N.S., Mokhsin, A., Rahmat, R., Ibrahim, Z.O., Razali, R., Thevarajah, M., and Nawawi, H. 2017. Enhanced status of inflammation and endothelial activation in subjects with familial hypercholesterolaemia and their related unaffected family members: a case control study. Lipids Health Dis 16:81.

[0193]34. Yang, C.Y., Raya, J.L., Chen, H.H., Chen, C.H., Abe, Y., Pownall, H.J., Taylor, A.A., e Smith, C.V. 2003. Isolation, characterization, and functional assessment of oxidatively modified subfractions of circulating low-density lipoproteins. Arterioscler Thromb Vase Biol 23: 1083 a 1090.

[0194]35. Calderon, J.C., Fernandez, A.Z., e Maria de Jesus, A.I. 2008. [Atherosclerosis, oxidative stress and physical activity. Review], Invest Clin 49: 397 a 410.

[0195]36. Davies, S.S., e Zhang, L.S. 2017. Reactive Carbonyl Species ScavengersNovel Therapeutic Approaches for Chronic Diseases. Curr Pharmacol Rep 3: 51 a 67.

[0196]37. Fisher, E.A., Feig, J.E., Hewing, B., Hazen, S.L., e Smith, J.D. 2012. Highdensity lipoprotein function, dysfunction, and reverse cholesterol transport. Arterioscler Thromb Vase Biol 32: 2813 a 2820.

Petição 870190110811, de 30/10/2019, pág. 59/68

53/54

[0197]38. Rohatgi, A., Khera, A., Berry, ID., Givens, E.G., Ayers, C.R, Wedin, K.E., Neeland, I.J., Yuhanna, I.S., Rader, D.R., de Lemos, J.A., e outros, 2014. HDL cholesterol efflux capacity and incident cardiovascular events. N Engl J Med 371: 2383 a 2393.

[0198]39. Khera, A.V., Cuchel, M., de la Llera-Moya, M., Rodrigues, A., Burke, M.F., Jafri, K., French, B.C., Phillips, J.A., Mucksavage, M.L., Wilensky, R.L., e outros, 2011. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med 364: 127 a 135.

[0199]40. Takata, K., Imaizumi, S., Kawachi, E., Suematsu, Y., Shimizu, T., Abe, S., Matsuo, Y., Tsukahara, H., Noda, K., Yahiro, E., e outros, 2014. Impact of cigarette smoking cessation on high-density lipoprotein functionality. Circ J 78: 2955 a 2962.

[0200]41. Amaki, T., Suzuki, T., Nakamura, F., Hayashi, D., Imai, Y., Morita, H., Fukino, K., Nojiri, T., Kitano, S., Hibi, N., e outros, 2004. Circulating malondialdehyde modified LDL is a biochemical risk marker for coronary artery disease. Heart 90: 1211 a 1213.

[0201 ]42. Schiopu, A., Frendeus, B., Jansson, B., Soderberg, I., Ljungcrantz, I., Araya, Z., Shah, P.K., Carlsson, R., Nilsson, J., e Fredrikson, G.N. 2007. Recombinant antibodies to an oxidized low-density lipoprotein epitope induce rapid regression of atherosclerosis in apobec-l(-/-)/low-density lipoprotein receptor(-/-) mice. J Am Coll Cardiol 50: 2313 a 2318.

[0202]43. Tsimikas, S., Miyanohara, A., Hartvigsen, K., Merki, E., Shaw, P.X., Chou, M.Y., Pattison, J., Torzewski, M., Sollors, J., Friedmann, T., e outros, 2011. Human oxidation-specific antibodies reduce foam cell formation and atherosclerosis progression. J Am Coll Cardiol 58: 1715 a 1727.

[0203]44. Hjerpe, C, Johansson, D., Hermansson, A., Hansson, G.K., e Zhou, X. 2010. Dendritic cells pulsed with malondialdehyde modified low density lipoprotein aggravate atherosclerosis in Apoe(-/-) mice. Atherosclerosis 209: 436 a 441.

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54/54

[0204]45. Scull, CM., e Tabas, I. 2011. Mechanisms of ER stress-induced apoptosis in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vase Biol 31: 2792 a 2797.

[0205]46. Bryk, D., Olejarz, W., e Zapolska-Downar, D. 2017. The role of oxidative stress and NADPH oxidase in the pathogenesis of atherosclerosis. Postepy Hig Med Dosw (Online) 71: 57 a 68.

[0206]47. Tabas, I. 2007. Apoptosis and efferocytosis in mouse models of atherosclerosis. Curr Drug Targets 8: 1288 a 1296.

[0207]A invenção sendo assim descrita, seria óbvio que a mesma pode variar de várias maneiras. Tais variações que seriam óbvias para um versado na técnica devem ser consideradas como essência desta descrição.

[0208]Salvo indicação em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, propriedades tal como condições de reação e assim por diante utilizadas na Especificação devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo “cerca de”. Consequentemente, a menos que indicado ao contrário, os parâmetros numéricos estabelecidos na Especificação e Reivindicações são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se deseja determinar pela presente invenção.

[0209]Apesar de as faixas numéricas e parâmetros apresentando o amplo escopo da invenção serem aproximações, os valores numéricos apresentados nas seções experimentais ou nas seções de exemplo são relatados com a maior precisão possível. Qualquer valor numérico, no entanto, contém inerentemente certos erros resultantes necessariamente do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste.

Claims (10)

1. Método de tratamento de aterosclerose ou prevenção da progressão de aterosclerose, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade de tratamento uma quantidade eficaz de ao menos um composto sequestrante de γ-ΚΑ.

2. Método de tratamento, prevenção ou melhora de aterosclerose, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade de tratamento um composto da seguinte fórmula:

em que:

R é N ou C;

R2 é independentemente H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído com um ou mais R2, R3 e R4, e pode ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

R3 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 pode ciclizar com um ou mais R2 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

R₄é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou

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2/8 mais FU, R2 e R3 pode ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

Rs é uma ligação, H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C310 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 pode ciclizar com um ou mais R2, R3 ou R4 para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

e estereoisômeros e análogos dos mesmos.

3. Método de tratamento, prevenção ou melhora de aterosclerose, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade de tratamento um composto da seguinte fórmula:

em que:

R é N ou C;

R2 é independentemente H, alquila substituído ou não substituída;

R3 é H, halogênio, alcóxi, hidroxila, nitro;

R4 é H, alquila, carboxila substituída ou não substituída; e estereoisômeros e análogos dos mesmos, desde que R2 não seja -CH2-OH quando R é N, R4 é H e R2 é CH3.

4. Método, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 composto é da seguinte fórmula:

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3/8

ou um análogo sequestrante de γ-ΚΑ do mesmo.

5. Método, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é da seguinte fórmula:

ou um análogo sequestrante de γ-ΚΑ do mesmo.

6. Método, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é da seguinte fórmula:

Petição 870190108979, de 25/10/2019, pág. 14/20

4/8

ou um análogo sequestrante de γ-ΚΑ do mesmo.

7. Método, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é da seguinte fórmula:

ou um análogo sequestrante de γ-ΚΑ do mesmo.

8. Método para a fabricação de um medicamento para tratamento, prevenção ou melhora de aterosclerose, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende combinar um composto tendo uma estrutura representada pela seguinte fórmula:

Petição 870190108979, de 25/10/2019, pág. 15/20

5/8

em que:

R é N ou C;

R2 é independentemente H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído com um ou mais R2, R3 e R4, e pode ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

R3 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel com C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 pode ciclizar com um ou mais R2 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

R4 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel com C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 pode ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

Rs é uma ligação, H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C310 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou R4 para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N; e estereoisômeros e análogos dos mesmos; ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos ou um derivado farmaceuticamente aceitável dos mesmos;

Petição 870190108979, de 25/10/2019, pág. 16/20

6/8 com urn carreador farmaceuticamente aceitável.

9. Composto para uso no tratamento, prevenção ou melhora de aterosclerose, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula:

em que:

R é N ou C;

R2 é independentemente H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído com um ou mais R2, R3 e R4, e pode ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

R3 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 pode ciclizar com um ou mais R2 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

R4 é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 pode ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

Rs é uma ligação, H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C310 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído

Petição 870190108979, de 25/10/2019, pág. 17/20

7/8 por um ou mais FU, FU e FU podem ciclizar com um ou mais FU, R3 ou R4 para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

e estereoisômeros e análogos dos mesmos.

10. Composição para uso no tratamento, prevenção ou melhora de aterosclerose, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um composto com uma estrutura representada pela seguinte fórmula:

em que:

R é N ou C;

R2 é independentemente H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R2, R3 e R4, e podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

Rsé H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 pode ciclizar com um ou mais R2 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

R₄é H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, C3-10 cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 pode ciclizar com um ou mais R2, R3 ou Rs para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

Petição 870190108979, de 25/10/2019, pág. 18/20

8/8

Rs é uma ligação, H, hidróxi, halogênio, nitro, CF3, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, Caio cicloalquila, anel de C3-8 membros contendo C, O, S ou N, opcionalmente substituído por um ou mais R4, R2 e R3 podem ciclizar com um ou mais R2, R3 ou R4 para formar um anel de C3-8 membros opcionalmente substituído contendo C, O, S ou N;

e estereoisômeros e análogos dos mesmos; e um carreador farmaceuticamente aceitável.