KR20190137904A - 연골형성의 유도 방법 - Google Patents

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KR20190137904A
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benzamide
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피터 지 슐츠
아르납 케이 채터지
티모시 엠 라이트
존 위슬러
바딤 클루시니첸코
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더 스크립스 리서치 인스티튜트
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Abstract

본원에는 관절내 투여를 사용하여 중간엽 줄기 세포를 연골세포로 유도하여 관절염 또는 관절 손상의 향상을 위한 화합물 및 조성물이 기재되어 있다.

Description

연골형성의 유도 방법
교차 참조
본원은 2017년 4월 24일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/489,397을 우선권 주장으로 하며, 그의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
골관절염(OA)은 가장 흔한 근골격 질환을 나타낸다. 대략 4천만명의 미국인이 현재 앓고 있으며, 그 수는 고령화 인구 및 기대 수명의 증가의 결과로서 향후 20년 이내에 6천만명으로 증가되어 장애의 네번째 주요 원인이 될 것으로 예상된다. OA는 관절 연골(관절에 대한 윤활 및 완충을 생성하는 세포 및 기질 포함) 및 관절 연골 아래의 연골하 골 둘다를 포함하는 관절의 퇴행성 쇠약을 특징으로 한다. 통상의 OA 요법은 경구 NSAID 또는 선택적 시클로옥시게나제 2(COX-2) 억제제, 코르티코스테로이드 및 히알루로난과 같은 약제를 사용한 관절내(IA) 주사 및 수술적 접근을 사용한 통증 완화를 포함한다.
중간엽 줄기 세포(MSC)는 성인의 관절 연골에 존재하며, 단리시 시험관내 연골세포 및 기타 중간엽 세포 계통으로 분화되도록 프로그래밍될 수 있다. 부분적으로, 성장 인자(TGF, BMP), 혈청 상태 및 세포-세포 접촉에 의하여 조절된다.
본원에는 피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 개선 방법이 제공되며, 그러한 방법은 피험체의 무릎의 관절 공간에 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 개선 방법은 무릎의 관절 공간에 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 개선 방법은 무릎의 관절 공간에 약 50 ㎍ 내지 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본원에는 피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 개선 방법이 제공되며, 그러한 방법은 피험체의 무릎의 관절 공간에 약 1,000 ㎍ 이하의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 개선 방법은 무릎의 관절 공간에 약 400 ㎍ 이하의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본원에는 피험체에서 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화의 유도 방법이 제공되며, 그러한 방법은 피험체의 무릎의 관절 공간에 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다.
피험체에서 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화의 유도 방법은 무릎의 관절 공간에 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
피험체에서 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화의 유도 방법은 무릎의 관절 공간에 약 50 ㎍ 내지 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본원에는 피험체에서 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화의 유도 방법이 개시되어 있으며, 그러한 방법은 피험체의 무릎의 관절 공간에 약 1,000 ㎍ 이하의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다.
피험체에서 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화의 유도 방법은 무릎의 관절 공간에 약 400 ㎍ 이하의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 피험체에게 연 1회 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 11 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 10 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 9 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 8 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 7 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 6 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 5 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 4 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 3 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 2 개월마다 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 1개월마다 또는 매주 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, 약 25 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, 약 50 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, 약 100 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, 약 150 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, 약 200 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, 약 250 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, 약 300 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, 약 350 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여할 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 약 1 ㎖ 내지 약 5 ㎖의 부피로 투여될 수 있다.
피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 향상 또는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 방법에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 약 5 ㎖ 또는 약 5 ㎖ 이하의 부피로 투여될 수 있다.
도 1은 화합물 A로 10 μM에서 처치 후 실질적인 연골 퇴행 폭을 도시한다.
도 2는 화합물 A로 2주당 1회 10 μM에서 처치 후 조합된 연골 퇴행 폭을 도시한다.
도 3은 비히클 처치된 동물과 비교시 화합물 A로 처치된 동물의 대퇴골을 제외한 총 관절 점수를 도시한다.
도 4는 개의 경골 고평부 및 대퇴골에서 골관절염 병변의 조직학적 분석의 개략도를 도시한다.
도 5는 화합물 A로 처치 후 연골 퇴행 폭을 도시한다.
도 6은 화합물 A로 처치 후 대퇴골에서 연골 병변의 깊이를 도시한다.
도 7은 화합물 A로 처치 후 골 경화증의 레벨을 도시한다.
도 8은 화합물 A로 처치 후 콜라겐 형성 마커 PIINP의 순환 레벨을 도시한다.
도 9는 FLNA에 결합된 시험관내 화합물 A를 도시한다.
도 10은 화합물 A를 통한 CBFβ 핵 국소화의 도입을 도시한다.
참조 문헌 인용
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개개의 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 바와 동일한 정도로 본원에 포함된다.
발명의 상세한 설명
골관절염(OA)은 관절 연골의 점진적인 쇠약을 특징으로 하며, 궁극적으로 윤활 관절의 기능 상실을 초래한다[Reginster, J.Y. and N.G. Khaltaev, Introduction and WHO perspective on the global burden of musculoskeletal conditions. Rheumatology (Oxford), 2002. 41 Supp 1: p. 1-2]. OA는 세포외 기질의 효소 분해, 결핍된 새로운 기질 형성, 세포사 및, 연골 세포의 비정상적인 활성화 및 비대 분화를 포함한 수개의 병원성 기전에 의하여 매개된다[Goldring, M.B. and S.R. Goldring, Articular Articular cartilage and subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis. Ann N Y Acad Sci, 2010. 1192(1): p. 230-7]. OA에 대한 유일한 통상의 치료적 선택은 통증 관리 및 수술적 중재이다[Hunter, D.J., Pharmacologic therapy for osteoarthritis-the era of disease modification. Nat Rev Rheumatol, 2011. 7(1): p. 13-22].
골수 및 대부분의 성인 조직에 존재하는 중간엽 줄기 세포(MSC)는 자가재생 및, 연골세포, 골모세포 및 지방세포를 포함한 각종 세포 계통으로의 분화가 가능하다[Pittenger, M.F., et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999. 284(5411): p. 143-7]. 최근의 연구는 성인 관절 연골이 복수 계통 분화가 가능한 MSC(세포의 약 3%)를 함유한다는 것을 발견하였다. OA 연골에서.상기 세포의 개수는 대략 2배이다. 상기 내재하는 줄기 세포는 여전히 연골세포로의 분화 가능성 및 그에 의한 손상된 연골을 복구하는 능력을 보유한다[Grogan, S.P., et al., Mesenchymal progenitor cell markers in human articular cartilage: normal distribution and changes in osteoarthritis. Arthritis Res Ther, 2009. 11(3): p. R85; Koelling, S., et al., Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell, 2009. 4(4): p. 324-35].
본 발명은 부분적으로 본 발명의 화합물이 중간엽 줄기 세포에서의 연골세포 분화를 자극한다는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 연골세포로의 중간엽 줄기 세포 분화의 유도 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 조성물을 관절, 척추골, 추간판 또는 전신에 투여하여 관절염 또는 관절 손상을 예방 또는 향상하기 위한 본 발명의 화합물 및 조성물의 투여를 제공한다. 특히, 본 개시내용의 화합물은 무릎에 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 투여량으로 관절내 투여한다. 화합물은 단일 투여량으로서 또는 4회 이하의 투여량의 경로로서 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면 매주, 2주, 1개월 또는 3-12 개월마다 반복될 수 있다. 비제한적인 예로서, 투여는 5 주 이하 동안 매주이다. 본원에 사용된 바와 같이, 무릎 또는 무릎의 관절로의 투여는 하나의 무릎으로의 투여를 지칭한다. 그러나, 양무릎은 본원의 화합물로 투여될 수 있다. 예를 들면, 각각의 무릎은 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 본원에 제공된 화합물로 투여된다.
정의
하기 기재에서, 특정한 구체적인 세부사항은 각종 실시양태의 철저한 이해를 제공하기 위하여 설명된다. 그러나, 당업자는 본 발명이 그러한 세부사항 없이 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 기타 예에서, 공지된 구조는 실시양태의 불필요하게 모호한 기재를 피하기 위하여 상세하게 제시 또는 기재하지 않는다. 달리 문맥이 요구하지 않는다면, 하기 명세서 및 청구범위 전체에서, 용어 "포함한다" 및 그의 파생어, 예컨대 "포함하는" 및 "포함한"은 "~을 포함하나 이에 제한되지 않는"과 같은 개방된 포괄적 의미로 이해하여야 한다. 추가로, 본원에 제공된 표제어는 단지 편의상 본원에 제공되며, 청구된 본 발명의 범주 또는 의미를 설명하지 않는다.
본 명세서 전체에서 "하나의 실시양태" 또는 "실시양태"에 관한 지칭은 실시양태와 관련하여 기재된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 그래서, 본 명세서 전체의 다양한 개소에서 어구 "하나의 실시양태에서" 또는 "실시양태에서"의 출현은 반드시 동일한 실시양태를 모두 지칭하지는 않는다. 게다가, 특정한 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 복수형을 포함한다. 또한, 용어 "또는"은 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 "및/또는"을 포함한 그의 의미 내에서 일반적으로 사용될 수 있다는 점에 유의하여야만 한다.
용어 "환자", "대상체" 또는 "개체"는 번갈아 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 이들은 포유동물 및 비포유동물을 포함한 질병 등을 앓고 있는 개체를 지칭한다. 어떠한 용어도 개체가 전문 의료진의 관리 및/또는 감독 하에 있어야만 하는 것은 아니다. 포유동물은 사람, 사람이 아닌 영장류, 예컨대 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 농경용 가축, 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 가축, 예컨대 토끼, 개 및 고양이; 설치류를 포함한 실험실 동물, 예컨대 래트, 마우스 및 기니 피그 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물 강의 임의의 구성원이다. 비포유동물의 예는 조류, 어류 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 몇몇 실시양태에서, 개체는 포유동물이다. 바람직한 실시양태에서, 개체는 사람이다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료" 및 기타 문법적 등가예는 본원에 사용된 바와 같이 질환 또는 병태 또는 그의 하나 이상의 증상의 완화, 약화 또는 향상, 추가의 증상의 예방, 증상의 기저 대사 원인의 향상 또는 예방, 질환 또는 병태의 억제, 예를 들면 질환 또는 병태의 전개의 정지, 질환 또는 병태의 경감, 질환 또는 병태의 복귀의 유발, 질환 또는 병태에 의하여 유발된 병태의 경감 또는 질환 또는 병태의 증상의 중지를 포함하며, 예방을 포함하고자 한다. 그러한 용어는 치료적 이득 및/또는 예방적 이득을 달성하는 것을 추가로 포함한다. 치료적 이득은 치료되는 기저 질병의 근절 또는 향상을 의미한다. 또한, 치료적 이득은 개체가 여전히 기저 질병을 앓고 있음에도 불구하고, 개체에서 호전이 관찰되도록 기저 질병과 관련된 생리학적 증상 중 하나 이상의 근절 또는 향상으로 달성된다. 예방적 이득의 경우, 조성물은 상기 질환의 진단이 이루어지지는 않더라도 특정한 질환을 전개시킬 우려가 있는 개체에게 또는 질환의 생리학적 증상 중 하나 이상을 보고하는 개체에게 투여된다.
용어 "투여하다", "투여하는" , "투여" 등은 본원에 사용된 바와 같이 생물학적 작용의 원하는 부위에 화합물 또는 조성물을 전달하는데 사용될 수 있는 방법을 지칭한다. 그러한 방법은 경구 경로, 십이지장내 경로, 비경구 주사(정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 혈관내 또는 주입 포함), 국소 및 직장 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본원에 기재된 화합물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 투여 기술과 익숙할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 경구 투여된다.
용어 "유효량", "치료적 유효량" 또는 "약학적 유효량"은 본원에 사용된 바와 같이 치료되는 질환 또는 병태의 증상 중 하나 이상을 어느 정도로 경감시킬 투여되는 적어도 하나의 약제 또는 화합물의 충분한 양을 지칭한다. 그 결과는 질환 또는 생물계의 임의의 기타 원하는 변경의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화일 수 있다. 예를 들면, 치료적 용도에 대한 "유효량"은 질환에서 임상적으로 유의한 감소를 제공하는데 필요한 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드를 포함하는 조성물의 양이다. 적절한 "유효"량은 하나의 개체로부터 또 개체까지 상이할 수 있다. 임의의 개체 사례에서의 적절한 "유효"량은 투여량 단계적 증가 실험과 같은 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
제제, 조성물 또는 성분에 관한 용어 "허용 가능한"은 본원에 사용된 바와 같이 치료되는 개체의 일반적인 건강에 대하여 지속적인 유해 효과를 갖지 않는다는 것을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 본원에 사용된 바와 같이 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드의 생물학적 활성 또는 성질을 폐지하지 않으며, 비교적 비독성인 물질, 예컨대 담체 또는 희석제를 지칭하며, 즉 그러한 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 또는 함유되는 조성물의 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본원에 사용된 바와 같이 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드의 유리 산 및 염기의 생물학적 유효성을 보유하며, 생물학적으로 또는 달리 바람직한 염을 지칭한다. N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드는 무기 또는 유기 염기 및 무기 및 유기 산과 반응하여 약학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 그러한 염은 최종 단리 및 정제 중에 또는 그의 유리 염기 형태의 정제된 화합물을 적절한 유기 또는 무기 산과 별도로 반응시키고, 그리하여 형성된 염을 단리시켜 그 현장 내에서 생성될 수 있다.
용어 "약학적 조성물"은 본원에 사용된 바와 같이, 예컨대 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 농조화제, 부형제 등으로 한정되지는 않지만, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 화학적 성분과 임의로 혼합된 생물학적 활성 화합물을 지칭한다.
용어 "담체"는 본원에 사용된 바와 같이 화합물을 세포 또는 조직으로 혼입하는 것을 돕는 비교적 비독성 화학적 화합물 또는 약제를 지칭한다.
용어 "약학적 조합", "추가의 요법을 투여하는", "추가의 치료제를 투여하는"은 본원에 사용된 바와 같이 1종 초과의 성분의 혼합 또는 조합으로부터 발생하는 약학적 요법을 지칭하며, 활성 성분의 고정된 및 비고정된 조합 둘다를 포함한다. 용어 "고정된 조합"은 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 및 적어도 하나의 동시약제가 둘다 단일 실체 또는 투여 형태로 개체에게 동시에 투여된다는 것을 의미한다. 용어 "비고정된 조합"은 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 및 적어도 하나의 동시약제가 변경 가능한 중재 시간 한계로 동시에, 동시발생으로 또는 순차적으로 별도의 실체로서 개체에게 투여된다는 것을 의미하며, 여기서 상기 투여는 개체의 신체에서 유효 레벨의 2종 이상의 화합물을 제공한다. 이들은 또한 칵테일 요법, 예를 들면 3종 이상의 활성 성분의 투여에도 적용된다.
용어 "동시투여", "~와 조합하여 투여되는" 및 그의 문법적 등가예 등은 본원에 사용된 바와 같이 선택된 치료제를 단일의 개체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 의미하며, 약제가 동일하거나 또는 상이한 투여 경로에 의하여 또는 동일하거나 또는 상이한 시간에서 투여되는 치료 섭생을 포함하고자 한다. 몇몇 실시양태에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드는 기타 약제와 동시투여될 것이다. 상기 용어는 약제 및/또는 그의 대사산물 둘다가 동물에 동시에 존재하도록 2종 이상의 약제를 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 이들은 별도의 조성물로의 동시 투여, 상이한 시간에서 별도의 조성물로의 투여 및/또는 약제 둘다가 존재하는 조성물로의 투여를 포함한다. 그래서, 몇몇 실시양태에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 및 기타 약제(들)는 단일 조성물로 투여된다. 몇몇 실시양태에서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 및 기타 약제(들)는 조성물로 혼합된다.
"웨스턴 온타리오 앤 맥매스터 유니버시티즈(Western Ontario and McMaster Universities) 관절염 지수" 또는 "WOMAC"는 관절의 통증, 강직도 및 신체 기능을 포함한 무릎 및 고관절의 골관절염을 갖는 환자의 병태를 평가하기 위하여 의료 종사자에 의하여 사용되는 표준화된 설문지의 널리 사용되는 독점 세트를 지칭한다. WOMAC는 또한 등 통증, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스 및 섬유근육통을 평가하는데 사용되어 왔다. 이는 자가투여될 수 있으며, 1982년 웨스턴 온타리오 앤 맥매스터 유니버시티즈에서 개발되었다. WOMAC는 통증의 경우 5개의 항목(스코어 범위 0-20), 강직도의 경우 2개(스코어 범위 0-8) 및 기능 제한의 경우 17개의 항목(스코어 범위 0-68)을 측정한다. 신체 기능 설문은 계단 사용, 앉아있거나 또는 누운 위치로부터 일어나기, 서 있기, 굽히기, 걷기, 차에 타고 내리기, 쇼핑하기, 양말 신기 또는 벗기, 침대에 눕기, 욕조에 들어가기 및 나오기, 앉기 및 힘든 및 가벼운 가사 노동과 같은 일상 활동을 포함한다.
화합물 A
본원에는 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 제공된다:
Figure pct00001
화합물 A의 추가의 형태
이성질체
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 A는 기하 이성질체로서 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 A는 1개의 이중 결합을 갖는다. 본원에 기재된 화합물 A는 모든 시스, 트랜스, 신, 안티, 엔트게겐(E) 및 주자멘(Z) 이성질체뿐 아니라, 그의 해당 혼합물을 포함한다.
표지된 화합물
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 A는 그의 동위원소 표지된 형태로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 상기 동위원소 표지된 화합물을 투여하여 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 상기 동위원소 표지된 화합물 A를 약학적 조성물로서 투여하여 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 그래서, 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 화합물 A는 하나 이상의 원소가 자연에서 일반적으로 존재하는 원자 질량 또는 질량수와는 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자에 의하여 치환된 사실을 제외하고 화합물 A와 동일한 동위원소 표지된 화합물 A를 포함한다. 본 발명의 화합물로 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소 및 염소의 동위원소, 예컨대 2H, 3H, 13C, 14C, l5N, 180, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F 및 36Cl 각각을 포함한다. 전술한 동위원소 및/또는 기타 원자의 기타 동위원소를 함유하는 본원에 기재된 화합물 A는 본 개시내용의 범주내에 포함된다. 특정한 동위원소 표지된 화합물 A, 예를 들면 방사성 동위원소, 예컨대 3H 및 14C를 혼입한 것이 약물 및/또는 기질 조직 분포 검정에 유용하다. 삼중수소화된, 즉 3H 및 탄소-14, 즉 14C 동위원소는 그의 제조 용이성 및 검출 가능성으로 인하여 특히 바람직하다. 추가로, 중 동위원소, 예컨대 중수소, 즉 2H로의 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들면 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여 요건으로부터 발생하는 특정한 치료적 잇점을 생성한다. 몇몇 실시양태에서, 동위원소 표지된 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 임의의 적절한 방법에 의하여 생성된다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 A는 발색단 또는 형광 모이어티, 생물발광 표지 또는 화학발광 표지의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 수단에 의하여 표지된다.
약학적으로 허용가능한 염
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 A는 약학적으로 허용가능한 염으로서 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 상기 약학적으로 허용가능한 염을 투여하여 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 상기 약학적으로 허용가능한 염을 약학적 조성물로서 투여하여 질환을 치료하는 방법을 포함한다.
약학적으로 허용가능한 염의 예는 화합물 A와 미네랄, 유기 산 또는 무기 염기의 반응에 의하여 생성된 염을 포함하며, 상기 염은 아세트산염, 아크릴산염, 아디프산염, 알긴산염, 아스파르트산염, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 바이술페이트, 바이술파이트, 브로마이드, 부티레이트, 부틴-1,4-디오에이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 카프로에이트, 카프릴레이트, 클로로벤조에이트, 클로라이드, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 데카노에이트, 디글루코네이트, 디히드로겐포스페이트, 디니트로벤조에이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 글리콜레이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 히드록시벤조에이트, γ-히드록시부티레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트, 요오다이드, 이소부티레이트, 락테이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 만델레이트 메타포스페이트, 메탄술포네이트, 메톡시벤조에이트, 메틸벤조에이트, 모노히드로겐포스페이트, 1-나프탈렌술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 피로술페이트, 피로포스페이트, 프로피올레이트, 프탈레이트, 페닐아세테이트, 페닐부티레이트, 프로판술포네이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 술페이트, 술파이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 술포네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 운데코네이트 및 크실렌술포네이트를 포함한다.
추가로, 본원에 기재된 화합물 A는 화합물의 유리 염기 형태를 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 메타인산 등; 및 유기 산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, p-톨루엔술폰산, 타르타르산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 아릴술폰산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-메틸비시클로-[2.2.2]옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-히드록시-2-엔-1-카르복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산 및 뮤콘산을 포함하나 이에 제한되지 않는 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 산과 반응시켜 형성된 약학적으로 허용가능한 염으로서 생성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 그 자체로는 약학적 허용 가능하지 않은 기타 산, 예컨대 옥살산은 본 발명의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 산 부가 염을 얻는데 있어서 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용된다.
몇몇 실시양태에서, 유리 산 기를 포함하는 본원에 기재된 화합물은 적절한 염기, 예컨대 약학적으로 허용가능한 금속 양이온의 수산화물, 탄산염, 중탄산염, 황산염과 암모니아와 또는 약학적으로 허용가능한 유기 1급, 2급, 3급 또는 4급 아민과 반응한다. 대표적인 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 또는 알칼리 토 금속 염 및 알루미늄 염 등을 포함한다. 염기의 예시의 예는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 콜린 히드록시드, 탄산나트륨, N+(C1-4 알킬)4 등을 포함한다.
염기 부가 염의 형성에 유용한 대표적인 유기 아민은 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진 등을 포함한다. 본원에 기재된 화합물은 또한 그들이 함유하는 임의의 염기성 질소 함유 기의 4급화를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 몇몇 실시양태에서, 물 또는 오일 가용성 또는 분산성 생성물은 상기 4급화에 의하여 얻는다.
용매화물
몇몇 실시양태에서, 화합물 A는 용매화물로서 존재한다. 본 발명은 상기 용매화물을 투여하여 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 용매화물을 약학적 조성물로서 투여하여 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
용매화물은 화학량론적 또는 비화학량론적 양의 용매를 함유하며, 몇몇 실시양태에서 약학적으로 허용가능한 용매, 예컨대 물, 에탄올 등을 사용한 결정화 공정 중에 형성된다. 용매가 물인 경우 수화물이 형성되거나 또는 용매가 알콜인 경우 알콜화물이 형성된다. 본원에 기재된 화합물의 용매화물은 본원에 기재된 공정 중에 간편하게 생성되거나 또는 형성될 수 있다. 단지 예로서, 화합물 A의 수화물은 수성/유기 용매 혼합물로부터 디옥산, 테트라히드로푸란 또는 메탄올을 포함하나 이에 제한되지 않는 유기 용매를 사용하여 재결정화에 의하여 간편하게 생성될 수 있다. 게다가, 본원에 제공된 화합물은 비용매화된 형태뿐 아니라, 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화된 형태는 본원에 제공된 화합물 A 및 방법의 목적을 위하여 비용매화된 형태에 해당하는 것으로 간주한다.
호변이성질체
"호변이성질체"는 본원에서 사용된 바와 같이 분자의 하나의 원자로부터 동일한 분자의 또 다른 원자로의 양성자 이동을 지칭한다. 본원에 나타낸 화합물 A는 호변이성질체로서 존재할 수 있다. 호변이성질체는 단일 결합 및 이웃하는 이중 결합의 전환에 의하여 수반되는 수소 원자의 이동에 의한 상호전환 가능한 화합물이다. 호변이성질화가 가능한 결합 배열에서, 호변이성질체의 화학적 평형이 존재할 것이다. 본원에 개시된 화합물 A의 모든 호변이성질체 형태도 고려된다. 호변이성질체의 정확한 비는 온도, 용매 및 pH를 포함한 수개의 요인에 의존한다. 몇몇 사례에서, 화합물 A는
Figure pct00002
로서 존재할 수 있다.
방법
본원에는 포유동물에서 관절염의 치료 방법이 제공되며, 그러한 방법은 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 관절내 주사에 의하여 포유동물의 관절에 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 관절에 주사한다. 예를 들면, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 무릎에 주사한다. 몇몇 사례에서, 화합물 A는 투여 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간 또는 약 10 시간에 전신 흡수되지 않는다. 몇몇 사례에서, 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여한다. 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 단일 투여로서 또는 4회 이하의 투여의 과정으로서 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면 매주, 2주마다, 1개월마다 또는 3-12 개월마다 반복될 수 있다. 비제한적인 예로서, 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월마다 반복된다. 또 다른 비제한적인 예로서, 투여는 5 주 이하 동안 매주 투여된다. 또 다른 비제한적인 예로서, 투여는 2 주마다 투여된다.
본원에는 포유동물에서 골관절염의 치료 방법이 제공되며, 그러한 방법은 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 관절내 주사에 의하여 포유동물의 관절에 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 관절에 주사한다. 예를 들면, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 무릎에 주사한다. 몇몇 사례에서, 화합물 A는 투여 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간 또는 약 10 시간에 전신 흡수되지 않는다. 몇몇 사례에서, 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여한다. 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 단일 투여로서 또는 4회 이하의 투여의 과정으로서 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면 매주, 2주마다, 1개월마다 또는 3-12 개월마다 반복될 수 있다. 비제한적인 예로서, 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월마다 반복된다. 또 다른 비제한적인 예로서, 투여는 5 주 이하 동안 매주 투여된다. 또 다른 비제한적인 예로서, 투여는 2 주마다 투여된다.
본원에는 포유동물에서 관절염 또는 관절 손상의 개선 방법이 제공되며, 그러한 방법은 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 관절내 주사에 의하여 포유동물의 관절에 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 관절에 주사한다. 예를 들면, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 무릎에 주사한다. 몇몇 사례에서, 화합물 A는 투여 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간 또는 약 10 시간에 전신 흡수되지 않는다. 몇몇 사례에서, 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여한다. 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 단일 투여로서 또는 4회 이하의 투여의 과정으로서 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면 매주, 2주마다, 1개월마다 또는 3-12 개월마다 반복될 수 있다. 비제한적인 예로서, 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월마다 반복된다. 또 다른 비제한적인 예로서, 투여는 5 주 이하 동안 매주 투여된다. 또 다른 비제한적인 예로서, 투여는 2 주마다 투여된다.
본원에는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화의 유도 방법이 제공되며, 그러한 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에서 중간엽 줄기 세포를 관절내 주사에 의하여 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에 노출시켜 줄기 세포를 연골세포로 분화를 유도하는 것을 포함한다. 예를 들면, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 관절에 주사한다. 예를 들면, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 무릎에 주사한다. 몇몇 사례에서, 화합물 A는 투여 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간 또는 약 10 시간에 전신 흡수되지 않는다. 몇몇 사례에서, 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여한다. 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 단일 투여로서 또는 4회 이하의 투여의 과정으로서 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면 매주, 2주마다, 1개월마다 또는 3-12 개월마다 반복될 수 있다. 비제한적인 예로서, 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월마다 반복된다. 또 다른 비제한적인 예로서, 투여는 5 주 이하 동안 매주 투여된다. 또 다른 비제한적인 예로서, 투여는 2 주마다 투여된다.
몇몇 실시양태에서, 포유동물은 관절염 또는 관절 손상을 갖지 않지만, 이에 대한 증가된 위험이 있다. 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 임의의 유형의 관절염 또는 관절 손상을 향상시키는데 사용될 수 있는 것으로 고려한다. 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 각종 연골 질환을 향상시키는데 사용될 수 있는 것으로 고려한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 조성물을 투여하여 관절염 또는 관절 손상, 예를 들면 관절염 또는 관절 손상의 유전적 또는 가족 이력이 있거나 또는 관절 수술 이전에 또는 도중인 경우 또는 관절염 또는 관절 손상의 증가된 위험이 있는 기타 상황을 방지한다. 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법으로 치료 또는 예방되는 병태 또는 질병의 예는 전신 류마티스 관절염, 소아 급성 관절염, 골관절염, 퇴행성 디스크 질환, 척추관절병증 및 전신 경화증(피부경화증)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 골관절염을 치료하는데 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 관절염은 골관절염, 외상 관절염, 퇴행성 디스크 질환, 뒤퓌트랑 질환 또는 건 질환일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 외상 손상 또는 연골병증으로 인하여 손상된 연골 조직에서의 연골세포 증식 및 연골 생성을 자극하는 방법을 제공한다. 외상 손상은 관절에 대한 둔기 외상 또는 인대 손상, 예컨대 전십자 인대, 안쪽 측부 인대 파열 또는 반월상연골 파열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 관절로 연결된 표면을 나타내어 특히 치료받기 쉬운 조직의 예는 척추, 어깨, 팔꿈치, 손목, 손가락 관절, 고관절, 무릎, 발목 및 발의 관절을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 치료로부터 이로울 수 있는 질환의 예는 골관절염, 류마티스 관절염, 기타 자가면역 질환 또는 박리성 골연골염을 포함한다. 게다가, 연골 기형은 종종 사람에서 왜소증의 형태로 나타나는데, 이는 화합물, 조성물 및 방법이 이들 환자에게서 유용하다는 것을 시사한다.
본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있는 것으로 고려한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "포유동물"은 사람, 가축 및 농경용 가축 및 동물원, 스포츠 또는 반려 동물, 예컨대 소(예, 젖소), 말, 개, 양, 돼지, 토끼, 염소, 고양이 등을 포함한 포유동물로서 분류되는 임의의 포유동물을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 사람, 개, 고양이 또는 말일 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 사람이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 개, 고양이 또는 말이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 소, 양, 돼지, 염소 또는 토끼이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 가축 동물 또는 가축류이다. 추가의 실시양태에서, 가축 동물 또는 가축류는 개, 고양이 또는 말이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 반려 동물이다. 본원에 사용된 바와 같이, "반려 동물"은 개, 고양이, 설치류 및 토끼를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 반려 동물 또는 가축류이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 가축류이다.
본 발명의 화합물은 또한 중간엽 줄기 세포(MSC)의 연골세포로의 분화의 유도에 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화의 유도 방법을 제공하며, 그러한 방법은 중간엽 줄기 세포를 본 발명의 화합물의 충분량에 노출시켜 줄기 세포의 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 포함한다.
MSC는 골모세포, 연골세포 및 지방세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 수개의 상이한 유형의 세포로 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포이다. 분화는 특수화된 세포 유형이 덜 특수화된 세포 유형으로부터 형성되는, 예를 들면, MSC로부터 연골세포를 형성하는 과정이다. 몇몇 실시양태에서, 그러한 방법은 시험관내 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 그러한 방법은 포유동물에서 생체내 수행되며, 줄기 세포는 포유동물 중에 존재한다. 특정한 실시양태에서, 포유동물은 사람, 개, 고양이 또는 말이다. 특정한 실시양태에서, 포유동물은 사람이다. 특정한 실시양태에서, 포유동물은 개, 고양이 또는 말이다.
포유동물은 중등도 내지 중증 증후성 골관절염을 갖는 것으로 진단 또는 확인될 수 있다. 예를 들면, 포유동물은 중등도 내지 중증 증후성 무릎 골관절염을 갖는 것으로 진단 또는 확인될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 켈그렌-로렌스(Kellgren-Lawrence) 시스템에 의하여 측정시 등급 1(또는 KL-1) 골관절염을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 켈그렌-로렌스 시스템에 의하여 측정시 등급 2(또는 KL-2) 골관절염을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 켈그렌-로렌스 시스템에 의하여 측정시 등급 3(또는 KL-3) 골관절염을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 켈그렌-로렌스 시스템에 의하여 측정시 등급 4(또는 KL-4) 골관절염을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물, 예를 들면 등급 1 골관절염을 갖는 포유동물은 예방적 조치로서 화합물 A를 투여한다.
몇몇 실시양태에서, 포유동물은 무릎의 편측 골관절염을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 무릎의 양측 골관절염을 갖는다.
몇몇 실시양태에서, 포유동물은 과체중 또는 비만이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 약 25 및 약 30 사이의 체질량 지수(BMI), 예를 들면 25, 26, 27, 28 또는 29의 BMI를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 30 이상, 예컨대 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40 또는 40 초과의 BMI를 갖는다.
골관절염의 진행 및/또는 치료를 모니터링하는 한 방법은 관절 공간을 측정하는 것을 포함한다. 연골이 악화되거나 또는 닳아 없어짐에 따라 발병된 관절의 관절 공간의 좁아짐이 관찰될 수 있다(관절 공간 좁아짐). 연골 측정의 어려움을 고려하면, 관절 공간 폭(JSW) 측정은 종종 관절 연골 두께에 대한 대용으로서 간주되는데, 그러한 측정은 2개의 뼈 사이의 거리를 (예를 들면 X선 기술을 사용하여) 측정하는 것을 포함하기 때문이다. 임의의 이론으로 한정하지는 않지만, JSW의 증가는 연골 성장의 지표이다. JSW의 측정 방법은 발병된 관절의 방사선 영상화 이후에 완료될 수 있다. 측정은 캘리퍼 또는 단순 눈금자 및 마이크로미터 아이피스를 사용한 수동 또는 컴퓨터 소프트웨어를 사용한 반자동일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, JSW 측정은 무릎을 촬영한 방사선 영상(예, X선)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 중족지관절, 고정된 굽힘, 반굽힌 전후(AP) 및 리옹-슈스(Lyon-Schuss) 방사선사진 중 하나 이상을 사용하여 측정을 얻을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 서 있는 상태로 촬영한다. 예를 들면, 서 있기, 고정된 굽힘(시나플렉서(Synaflexer)), 후전(PA) 방사선사진.
본원에 제공된 방법은 포유동물에서 화합물 A의 주사 부위 주위의 관절에서 관절 공간 폭의 증가를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 포유동물에서 주사 부위 주위의 관절에서 관절 공간 폭의 약 5% 내지 약 50% 증가, 예를 들면 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48% 또는 약 50%의 주사 부위 주위의 관절에서 관절 공간 폭의 증가를 초래할 수 있다.. 몇몇 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 주사 부위 주위의 관절에서 관절 공간 폭에서 실질적으로 변화가 없는 것으로 나타난다. 그러한 결과는 관절 공간 폭의 추가의 손실이 관찰되지 않았으므로 질환 증상의 중지를 나타낼 수 있다. 본원에 제공된 방법은 화합물 A의 포유동물에서 주사 부위 주위의 관절에서 관절 공간 폭의 약 0.05 ㎜ 내지 약 2 ㎜ 증가를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 포유동물에서 주사 부위 주위의 관절에서 관절 공간 폭의 약 0.05 ㎜; 약 0.1 ㎜; 약 0.15 ㎜; 약 0.2 ㎜; 약 0.25 ㎜; 약 0.3 ㎜; 약 0.35 ㎜; 약 0.4 ㎜; 약 0.45 ㎜; 약 0.5 ㎜; 약 0.55 ㎜; 약 0.6 ㎜; 약 0.65 ㎜; 약 0.7 ㎜; 약 0.75 ㎜; 약 0.8 ㎜; 약 0.85 ㎜; 약 0.9 ㎜; 약 0.95 ㎜; 약 1 ㎜; 약 1.05 ㎜; 약 1.1 ㎜; 약 1.15 ㎜; 약 1.2 ㎜; 약 1.25 ㎜; 약 1.3 ㎜; 약 1.35 ㎜; 약 1.4 ㎜; 약 1.45 ㎜; 약 1.5 ㎜; 약 1.55 ㎜; 약 1.6 ㎜; 약 1.65 ㎜; 약 1.7 ㎜; 약 1.75 ㎜; 약 1.8 ㎜; 약 1.85 ㎜; 약 1.9 ㎜; 약 1.95 ㎜; 또는 약 2 ㎜의 증가를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 투여후 1 주 또는 투여후 2 주 또는 투여후 3 주후 또는 투여후 4 주후 또는 투여후 5 주후 또는 투여후 6 주후 또는 투여후 7 주후 또는 투여후 8 주후 또는 투여후 9 주후 또는 투여후 10 주후 또는 투여후 11 주후 또는 투여후 12 주후 또는 또는 투여후 24 주후 포유동물에서 주사 부위 주위의 관절에서 관절 공간 폭의 증가를 초래할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 화합물 A의 포유동물에서 주사 부위 주위의 관절에서 연골 두께의 증가를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 포유동물에서 주사 부위 주위의 관절에서 연골 두께의 약 5% 내지 약 50%, 예를 들면 주사 부위 주위의 관절에서 연골 두께의 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48% 또는 약 50%의 증가를 초래할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 주사 부위 주위의 관절에서 연골 두께에서 실질적으로 변화를 나타내지 않는다. 상기 결과는 연골 두께에서의 추가의 손실이 관찰되지 않았으므로 질환의 증상의 중지를 나타낼 수 있다. 본원에 제공된 방법은 화합물 A의 포유동물에서 주사 부위 주위의 관절에서 연골 두께의 약 0.05 ㎜ 내지 약 2 ㎜ 증가를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 포유동물에서 주사 부위 주위의 관절에서 연골 두께의 약 0.05 ㎜; 약 0.1 ㎜; 약 0.15 ㎜; 약 0.2 ㎜; 약 0.25 ㎜; 약 0.3 ㎜; 약 0.35 ㎜; 약 0.4 ㎜; 약 0.45 ㎜; 약 0.5 ㎜; 약 0.55 ㎜; 약 0.6 ㎜; 약 0.65 ㎜; 약 0.7 ㎜; 약 0.75 ㎜; 약 0.8 ㎜; 약 0.85 ㎜; 약 0.9 ㎜; 약 0.95 ㎜; 약 1 ㎜; 약 1.05 ㎜; 약 1.1 ㎜; 약 1.15 ㎜; 약 1.2 ㎜; 약 1.25 ㎜; 약 1.3 ㎜; 약 1.35 ㎜; 약 1.4 ㎜; 약 1.45 ㎜; 약 1.5 ㎜; 약 1.55 ㎜; 약 1.6 ㎜; 약 1.65 ㎜; 약 1.7 ㎜; 약 1.75 ㎜; 약 1.8 ㎜; 약 1.85 ㎜; 약 1.9 ㎜; 약 1.95 ㎜; 또는 약 2 ㎜ 증가를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 투여후 1 주 또는 투여후 2 주 또는 투여후 3 주후 또는 투여후 4 주후 또는 투여후 5 주후 또는 투여후 6 주후 또는 투여후 7 주후 또는 투여후 8 주후 또는 투여후 9 주후 또는 투여후 10 주후 또는 투여후 11 주후 또는 투여후 12 주후 또는 또는 투여후 24 주후 포유동물에서 주사 부위 주위의 관절에서 연골 두께의 증가를 초래할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 피험체에서 WOMAC 총 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 대상체에서 기준선으로부터 WOMAC 총 스코어의 감소, 예를 들면 대상체에서 기준선으로부터 적어도 15 포인트의 WOMAC 총 스코어의 감소; 기준선으로부터 적어도 20 포인트의 WOMAC 총 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 적어도 25 포인트의 WOMAC 총 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 투여후 1 주 또는 투여후 2 주 또는 투여후 3 주후 또는 투여후 4 주후 또는 투여후 5 주후 또는 투여후 6 주후 또는 투여후 7 주후 또는 투여후 8 주후 또는 투여후 9 주후 또는 투여후 10 주후 또는 투여후 11 주후 또는 투여후 12 주후 또는 또는 투여후 24 주후 WOMAC 총 스코어의 감소를 초래할 수 있다.
WOMAC 스코어는 개별 통증, 기능 및 강직도 스코어로 세분될 수 있다.
본원에 제공된 방법은 대상체에서 WOMAC 기능 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 대상체에서 기준선으로부터 WOMAC 기능 스코어의 감소, 예를 들면 대상체에서 기준선으로부터 적어도 5 포인트의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 10 포인트의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 15 포인트의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 20 포인트의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 25 포인트의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 30 포인트의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 35 포인트의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 40 포인트의 WOMAC 기능 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 기준선으로부터 WOMAC 기능 스코어의 감소, 예를 들면 기준선으로부터 약 10%의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 15%의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 20%의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 25%의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 30%의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 35%의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 40%의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 45%의 WOMAC 기능 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 50%의 WOMAC 기능 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 투여후 1 주 또는 투여후 2 주 또는 투여후 3 주후 또는 투여후 4 주후 또는 투여후 5 주후 또는 투여후 6 주후 또는 투여후 7 주후 또는 투여후 8 주후 또는 투여후 9 주후 또는 투여후 10 주후 또는 투여후 11 주후 또는 투여후 12 주후 또는 또는 투여후 24 주후 WOMAC 기능 스코어의 감소를 초래할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 대상체에서 WOMAC 통증 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 대상체에서 기준선으로부터 WOMAC 통증 스코어의 감소, 예를 들면, 대상체에서 기준선으로부터 적어도 6 포인트의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 8 포인트의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 10 포인트의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 12 포인트의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 14 포인트의 WOMAC 통증 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 기준선으로부터 WOMAC 통증 스코어의 감소, 예를 들면 기준선으로부터 약 10%의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 15%의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 20%의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 25%의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 30%의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 35%의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 40%의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 45%의 WOMAC 통증 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 50%의 WOMAC 통증 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 투여후 1 주 또는 투여후 2 주 또는 투여후 3 주후 또는 투여후 4 주후 또는 투여후 5 주후 또는 투여후 6 주후 또는 투여후 7 주후 또는 투여후 8 주후 또는 투여후 9 주후 또는 투여후 10 주후 또는 투여후 11 주후 또는 투여후 12 주후 또는 또는 투여후 24 주후 WOMAC 통증 스코어의 감소를 초래할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 대상체에서 WOMAC 강직도 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 대상체에서 기준선으로부터 WOMAC 강직도 스코어의 감소, 예를 들면 대상체에서 기준선으로부터 적어도 2 포인트의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 3 포인트의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 4 포인트의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 5 포인트의 WOMAC 강직도 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 기준선으로부터 WOMAC 강직도 스코어의 감소, 예를 들면 기준선으로부터 약 10%의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 15%의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 20%의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 25%의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 또는기준선으로부터 약 30%의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 35%의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 40%의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 45%의 WOMAC 강직도 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 50%의 WOMAC 강직도 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 투여후 1 주 또는 투여후 2 주 또는 투여후 3 주후 또는 투여후 4 주후 또는 투여후 5 주후 또는 투여후 6 주후 또는 투여후 7 주후 또는 투여후 8 주후 또는 투여후 9 주후 또는 투여후 10 주후 또는 투여후 11 주후 또는 투여후 12 주후 또는 또는 투여후 24 주후 WOMAC 강직도 스코어의 감소를 초래할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 대상체에서 WORMS 스코어(전 장기 자기 공명 영상화 스코어)의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 대상체에서 기준선으로부터 WORMS 스코어의 감소, 예를 들면 대상체에서 기준선으로부터 적어도 10 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 15 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 대상체에서 기준선으로부터 적어도 20 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 25 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 30 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 35 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 40 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 45 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 50 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 55 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 60 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 65 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 70 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 75 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 80 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 85 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 90 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 95 포인트의 WORMS 스코어의 감소; 또는 대상체에서 기준선으로부터 적어도 100 포인트의 WORMS 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 기준선으로부터 WORMS 스코어의 감소, 예를 들면 기준선으로부터 약 10%의 WORMS 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 15%의 WORMS 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 20%의 WORMS 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 25%의 WORMS 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 30%의 WORMS 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 35%의 WORMS 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 40%의 WORMS 스코어의 감소; 기준선으로부터 약 45%의 WORMS 스코어의 감소; 또는 기준선으로부터 약 50%의 WORMS 스코어의 감소를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 투여후 1 주 또는 투여후 2 주 또는 투여후 3 주후 또는 투여후 4 주후 또는 투여후 5 주후 또는 투여후 6 주후 또는 투여후 7 주후 또는 투여후 8 주후 또는 투여후 9 주후 또는 투여후 10 주후 또는 투여후 11 주후 또는 투여후 12 주후 또는 또는 투여후 24 주후 WORMS 스코어의 감소를 초래할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 증가를 초래할 수 있다. 타입 II 콜라겐은 연골 기질의 가장 풍부한 단백질이며, 그러한 분자의 전환율의 변형은 골관절염에서 연골의 점진적인 손실에서 역할하는 것으로 여겨진다. 타입 II 프로콜라겐은 2 종의 스플라이스 형태인 타입 IIA 및 타입 IIB로 합성된다. 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP)는 구체적으로 측정될 수 있으며, 연골세포의 표현형 변화의 생물학적 마커를 나타낼 수 있다. 타입 IIA 프로콜라겐 아미노 말단 프로펩티드(PIIANP)의 혈청 레벨은 무릎 골관절염을 갖는 환자에게서는 감소되는 것으로 나타났다. PIIANP의 혈청 레벨은 타입 II 콜라겐 합성에 대한 잠재적인 바이오마커로서 사용될 수 있다.
본원에 제공된 방법은 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨, 예를 들면 약 5% 및 약 50% 사이의 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 증가 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 5%의 증가; 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 10%의 증가; 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 15%의 증가; 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 20%의 증가; 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 25%의 증가; 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 30%의 증가; 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 35%의 증가; 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 40%의 증가; 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 45%의 증가; 또는 기준선으로부터 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 약 50%의 증가를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 투여후 1 주 또는 투여후 2 주 또는 투여후 3 주후 또는 투여후 4 주후 또는 투여후 5 주후 또는 투여후 6 주후 또는 투여후 7 주후 또는 투여후 8 주후 또는 투여후 9 주후 또는 투여후 10 주후 또는 투여후 11 주후 또는 투여후 12 주후 또는 또는 투여후 24 주후 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP) 혈청 레벨의 증가를 초래할 수 있다.
화합물 A의 제조
본원에는 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화를 유도하고, 포유동물에서 관절염 또는 관절 손상을 향상하기 위한 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 및 상기 화합물의 제조 방법이 기재되어 있다. 화합물 A 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물도 또한 제공된다.
본원에 기재된 화합물 A는 당업자에게 공지된 표준 합성 반응을 사용하거나 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 반응은 화합물 A를 제공하기 위한 선형 시퀀스에 사용될 수 있거나 또는 당업계에 공지된 방법에 의하여 차후에 연결되는 분절을 합성하는데 사용될 수 있다.
화합물 A의 합성에 사용되는 출발 물질은 합성될 수 있거나 또는, 예컨대 알드리치 케미칼 컴파니(Aldrich Chemical Co.)(미국 위스컨신주 밀워키 소재), 바켐(Bachem)(미국 캘리포니아주 토랜스 소재) 또는 시그마 케미칼 컴파니((Sigma Chemical Co.)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 포함하나 이에 제한되지 않는 상업적 공급처로부터 입수할 수 있다. 화합물 A 및 상이한 치환기를 갖는 기타 관련 화합물은 당업자에게 공지된 기술 및 물질, 예를 들면 문헌[March, Advanced Organic Chemistry 4th Ed., (Wiley 1992); Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry 4th Ed., Vols. A and B (Plenum 2000, 2001); Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Ed., (Wiley 1999); Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-17 (John Wiley and Sons, 1991); Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, Volumes 1-40 (John Wiley and Sons, 1991); and Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989)](이들 모두 참조로 그 전문이 포함됨)에 기재된 것을 사용하여 합성될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 화합물의 제조에 대한 일반적인 방법은 당업계에서 공지된 반응으로부터 유도될 수 있으며, 반응은 본원에서 제공된 바와 같은 화학식에서 발견되는 각종 모이어티의 도입을 위하여 당업자가 인지하는 바와 같이 적절한 시약 및 조건의 사용에 의하여 변형될 수 있다.
반응의 생성물은 필요할 경우 여과, 증류, 결정화, 크로마토그래피 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 통상의 기술을 사용하여 단리 및 정제될 수 있다. 상기 물질은 물리적 상수 및 분광 데이타를 포함한 통상의 수단을 사용하여 특징화될 수 있다.
약학적 조성물/제제
또 다른 측면에서, 본원에는 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
몇몇 실시양태에서, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 약학적 조성물로 제제화된다. 약학적 조성물은 활성 화합물을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 불활성 성분을 사용하는 통상의 방식으로 제제화된다. 적절한 제제는 선택된 투여의 경로에 의존한다. 본원에 기재된 약학적 조성물의 개요는 예를 들면 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)]에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 본원에 상기 개시를 위하여 참조로 포함된다.
본원에는 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 불활성 성분을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물은 본원에 기재된 화합물이 조합 요법에서와 같이 기타 활성 성분과 혼합되는 약학적 조성물로서 투여된다. 기타 실시양태에서, 약학적 조성물은 기타 의학적 또는 약학적 약제, 담체, 아주번트, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 포함한다. 기타 실시양태에서, 약학적 조성물은 기타 치료적 유용한 물질을 포함한다.
약학적 조성물은 본원에 사용된 바와 같이 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물과 기타 화학적 성분(즉 약학적으로 허용가능한 불활성 성분), 예컨대 담체, 부형제, 결합제, 충전제, 현탁제, 풍미제, 감미제, 붕해제, 분산제, 계면활성제, 윤활제, 착색제, 희석제, 가용화제, 습윤화제, 가소제, 안정화제, 투과 향상제, 습윤제, 소포제, 산화방지제, 방부제 또는 그의 1종 이상의 조합의 혼합물을 지칭한다. 약학적 조성물은 화합물을 유기체에 투여하는 것을 촉진한다. 본원에 제공된 치료 방법 또는 용도의 실시에서, 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물을 약학적 조성물로 치료되는 질환, 질병 또는 병태를 갖는 포유동물에게 투여한다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 사람, 개, 고양이 또는 말이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 사람이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 개, 고양이 또는 말이다. 치료적 유효량은 질환의 경중도, 대상체의 연령 및 상대적인 건강, 사용되는 화합물의 효능 및 기타 요인에 의존하여 폭넓게 변경될 수 있다. 화합물은 단독으로 사용될 수 있거나 또는 혼합물의 성분으로서 1종 이상의 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사용 액체의 형태로 존재할 수 있다. 본원에 기재된 약학적 조성물은 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 관절내 액체 제제 1 ℓ당 약 0.05 g 내지 약 3 g 사이의 양으로 포함할 수 있다. 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 양은 관절내 액체 제제 1 ℓ당 약 0.05 g, 약 0.06 g, 약 0.07 g, 약 0.08 g, 약 0.09 g, 약 0.1 g, 약 0.2 g, 약 0.3 g, 약 0.4 g, 약 0.5 g, 약 0.6 g, 약 0.7 g 약 0.8 g, 약 0.9 g, 약 1 g, 약 1.1 g, 약 1.2 g, 약 1.3 g, 약 1.4 g, 약 1.5 g, 약 1.6 g, 약 1.7 g 약 1.8 g, 약 1.9 g, 약 2 g, 약 2.1 g, 약 2.2 g, 약 2.3 g, 약 2.4 g, 약 2.5 g, 약 2.6 g, 약 2.7 g 약 2.8 g, 약 2.9 g 또는 약 3 g일 수 있다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사용 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 담체는 수성 담체일 수 있다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사용 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 용매, 공용매, 계면활성제, 완충제, 가용화제, 등장화제, 안정화제, 방부제, 점도 향상제 및 소포제 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 제조 방법은 공지되어 있으며, 당업자에게 자명할 것이며, 예를 들면 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition (Pharmaceutical Press, London, UK. 2012)]을 참조한다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 용매를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 복수의 용매를 추가로 포함할 수 있다. 용매는 폴리에틸렌 글리콜 및 알콜로부터 선택될 수 있다. 용매는 PEG 3350 및 벤질 알콜로부터 선택될 수 있다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 공용매를 추가로 포함할 수 있다. 공용매는 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG 200, PEG 300 또는 PEG 400) 또는 프로필렌 글리콜; 알콜, 예컨대 이소프로판올, 프로판올 또는 에탄올; N,N-디메틸아세트아미드(DMA); N-메틸-2-피롤리돈(NMP); 폴리비닐피롤리돈(PVP), 디메틸술폭시드(DMSO); 및 그의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 계면활성제의 비제한적인 예는 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80 및 폴리소르베이트 85; 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유, 예컨대 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 60 및 폴리옥실 35 피마자유; 소르비탄 지방산 에스테르; 수크로스 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜; 폴리옥시에틸렌 지방산 에테르; 폴리옥실 스테아레이트; 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-(포스포-s-(1-글리세롤)), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-(포스포-rac-(1-글리세롤)), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-(포스포-rac-(1-글리세롤)), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 데옥시콜산, 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dl), 디스테아로일포스파티딜콜린(dl), 도큐세이트 나트륨, 난 인지질, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 글리세릴 트리올레에이트, 수소화된 대두 레시틴, 가수분해된 콩 단백질(효소; 2000 mw), 히드록시에틸피페라진 에탄 술폰산, 레시틴, 미리피륨 클로라이드, n-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-피브(phiv), 올레산, 팔미트산, PEG 식물성 오일, PEG-20 소르비탄 이소스테아레이트, PEG-40 피마자유, 인지질, 폴록사머 188, 폴리에틸렌 글리콜 200, 폴리에틸렌 글리콜 300, 폴리에틸렌 글리콜 3350, 폴리에틸렌 글리콜 400, 폴리에틸렌 글리콜 4000, 폴리에틸렌 글리콜 600, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소듐 콜레스테릴 술페이트, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 n-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리크(glyc), 올레산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 스테아르산, 트리카프릴린을 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 계면활성제 또는 그의 혼합물을 포함한다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 약 5 및 약 9 사이의 pH를 유지하기 위하여 완충제를 추가로 포함할 수 있다. pH는 산, 예컨대 염산을 첨가하여 조절될 수 있다. pH는 주사에 적절한 pH에서 유지될 수 있다. pH는 약 5, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9 또는 약 9의 pH에서 유지될 수 있다. 완충제의 예는 아세트산, 아세트산 무수물, 아디프산, 알라닌, 알부민, 알콜, 알파덱스, 암모니아, 아세트산암모늄, 황산암모늄, 무수 시트르산, 무수 덱스트로스, 무수 락토스, 무수 시트르산삼나트륨, 아르기닌, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 염화칼슘, 칼슘 글루셉테이트, 수산화칼슘, 칼슘, 카프릴산, 이산화탄소, 시트르산 일수화물, 2염기성 인산칼륨, 디에탄올아민, 시트르산이나트륨 세스퀴수화물, 시트르산수소이나트륨, 에데테이트 칼슘 디나트륨, 에데트산이나트륨, 에데트산나트륨, 에데트산, 에탄올아민 히드로클로라이드, 염화제2철, 글루셉테이트 나트륨, 글리신 히드로클로라이드, 글리신, 구아니딘 히드로클로라이드, 히스티딘, 염산, 이소류신, 락트산, 락토비온산, 류신, 리신 아세테이트, 리신, 리신 일수화물, 염화마그네슘, 스테아르산마그네슘, 말레산, 메타인산, 메탄술폰산, 질산, 포스페이트 이온, 인산, 염화칼륨, 수산화칼륨, 인산칼륨(1염기성), 아세트산나트륨, 아스코르브산나트륨, 벤조산나트륨, 중탄산나트륨, 중황산나트륨, 탄산나트륨, 시트르산나트륨, 수산화나트륨, 차아염소산나트륨, 인산나트륨 이수화물, 인산나트륨, 인산나트륨 2염기성 이수화물, 인산나트륨 2염기성 12수화물, 인산나트륨 2염기성, 인산나트륨 2염기성 (무수), 인산나트륨 2염기성 7수화물, 인산나트륨 1염기성(무수), 인산나트륨 1염기성 이수화물, 인산나트륨 1염기성 일수화물, 인산나트륨 1염기성, 황산나트륨(무수), 황산나트륨, 티오글리콜산나트륨, 티오말산나트륨, 티오황산나트륨, 숙신산, 황산, 타르타르산, 타르타르산(dl), 트리플루오로아세트산, 트로만타딘 및 트로메타민을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 가용화제를 추가로 포함할 수 있다. 가용화제의 예는 아세틸트립토판(dl), 알라닌, 알부민(응집됨), 알콜, 알파덱스 강내 분말, 암모니아, 무수 덱스트로스, 무수 락토스, 무수 시트르산삼나트륨, 아르기닌, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 벤질 클로라이드, 베타덱스 술포부틸 에테르 나트륨, 부탄올(혼합된 이성질체), 카프릴산, 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 피마자유, 콜레스테롤, 옥수수유, 면실유, 크레아틴, 크레아티닌, 크로스카르멜로스 소듐, 크로스포비돈, 시스테인 히드로클로라이드, 시스테인, 시스테인(dl), 덱스트란 40, 덱스트란, 디아세틸화 모노글리세리드, 디에탄올아민, 디메틸 술폭시드, 에탄올아민 히드로클로라이드, 에틸 아세테이트, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체(15% 비닐 아세테이트), 감마 시클로덱스트린, 젤라틴, 겐티스산 에탄올아미드, 겐티스산, 글루코놀락톤, 글루쿠론산, 글리세린, 헤타스타치, 사람 알부민 미소구체, 히알루론산나트륨, 히드록시프로필 베타덱스 근육내 주사, 히프로멜로스, 이소프로필 알콜, 메틸셀룰로스, 메틸피롤리돈, 미정질 셀룰로스, N,N-디메틸아세트아미드, 니아신아미드, 올레산, 팔미트산, 땅콩유, PEG 식물성 오일, PEG-20 소르비탄 이소스테아레이트, PEG-40 피마자유, 페닐에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 200, 폴리에틸렌 글리콜 300, 폴리에틸렌 글리콜 3350, 폴리에틸렌 글리콜 400, 폴리에틸렌 글리콜 4000, 폴리에틸렌 글리콜 600, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 양귀비씨 오일, 포비돈 k12, 포비돈 k17, 포비돈, 프롤린, 프로필 갈레이트, 프로필렌 글리콜, 참기름, 대두유, 전분, 스테아르산, 트리메틸실릴 처리된 디메티코놀/트리메틸실록시실리케이트 크로스중합체 및 옐로우 왁스 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 등장화제의 예는 덱스트로스 일수화물, 덱스트로스 용액, 덱스트로스, 디메틸 술폭시드, 프룩토스, 글루코놀락톤, 글루쿠론산, 글리세린, 글리신 히드로클로라이드, 글리신, 구아니딘 히드로클로라이드, 히스티딘, 염산, 고장성 염화나트륨 용액, 이소류신, 이소프로필 알콜, 등장성 염화나트륨 용액, 락트산(dl), 락토비온산, 락토스 일수화물, 락토스, 류신, 리신 아세테이트, 리신, 리신 일수화물, 염화마그네슘, 스테아르산마그네슘, 말레산, 만니톨, 메글루민, 메티오닌, 메틸보론산, 폴리프로필렌 글리콜, 염화칼륨, 수산화칼륨, 인산칼륨(1염기성), 프롤린, 프로필 갈레이트, 프로필렌 글리콜, 사카린 나트륨, 세린, 아세트산나트륨, 아스코르브산나트륨, 벤조산나트륨, 중탄산나트륨, 중황산나트륨, 탄산나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 글루콘산나트륨, 수산화나트륨, 차아염소산나트륨, 락트산나트륨, 인산나트륨 이수화물, 인산나트륨, 인산나트륨 2염기성 이수화물, 인산나트륨 2염기성 12수화물, 인산나트륨 2염기성, 인산나트륨 2염기성(무수), 인산나트륨 2염기성 7수화물, 인산나트륨 1염기성(무수), 인산나트륨 1염기성 이수화물, 인산나트륨 1염기성 일수화물, 인산나트륨 1염기성, 황산나트륨(무수), 황산나트륨, 티오글리콜산나트륨, 티오말산나트륨, 티오황산나트륨, 소르비톨, 숙신산, 수크로스, 황산, 타르타르산, 타르타르산(dl), 트레오닌, 트레할로스, 트리플루오로아세트산, 시트르산삼나트륨 이수화물, 트로메타민, 트립토판, 티로신, 우레아, 우레탄 및 발린 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 안정화제의 예는 아세틸트립토판(dl), 알라닌, 알부민(응집됨), 알콜, 알파덱스 강내 분말, 암모니아, 무수 덱스트로스, 무수 락토스, 무수 시트르산삼나트륨, 아르기닌, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 벤질 클로라이드, 베타덱스 술포부틸 에테르 나트륨, 붕산, 부탄올(혼합 이성질체), 카프릴산, 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 피마자유, 콜레스테롤, 크레아틴, 크레아티닌, 크로스카르멜로스 소듐, 크로스포비돈, 시스테인 히드로클로라이드, 시스테인, 시스테인(dl), 덱스트란 40, 덱스트란, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체(15% 비닐 아세테이트), 젤라틴, 겐티스산 에탄올아미드, 겐티스산, 헤타스타치, 사람 알부민 미소구체, 히알루론산나트륨, 히프로멜로스, 메글루민, 메티오닌, 메틸보론산, 메틸셀룰로스, 메틸피롤리돈, 미정질 셀룰로스, 미리피륨 클로라이드, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-피브, N,N-디메틸아세트아미드, 니아신아미드, 페닐알라닌, 폴리비닐 알콜, 포비돈 K12, 포비돈 K17, 포비돈, 세린, 시트르산나트륨, 글루콘산나트륨, 락트산나트륨, 전분, 트레오닌, 트레할로스, 트리카프릴린, 트리메틸실릴 처리된 디메티코놀/트리메틸실록시실리케이트 크로스중합체, 시트르산삼나트륨 이수화물, 트립토판, 티로신, 우레아 및 발린 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 방부제를 추가로 포함할 수 있다. 방부제의 예는 아세톤 중아황산나트륨, 알파-토코페롤, 염화벤잘코늄, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 벤질 클로라이드, 붕산, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 부틸파라벤, 클로로부탄올, 클로로부탄올 헤미수화물, 크레졸, 디에틸 피로카르보네이트, 에데테이트 칼슘 디나트륨, 에데트산이나트륨, 에데트산나트륨, 에데트산, 헥실레소르시놀, 메타크레졸, 메틸파라벤, 미리피륨 클로라이드, 모노티오글리세롤, 니트로겐, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐리 니트레이트, 중아황산칼륨, 메타중아황산칼륨, 프로필파라벤, 아스코르브산나트륨, 벤조산나트륨, 중황산나트륨, 염소산나트륨, 아디티온산나트륨, 소듐 포름알데히드 술폭실레이트, 요오드화나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨, 타르타르산나트륨, 이산화황, 아황산 및 티메로살 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 점도 향상제를 추가로 포함할 수 있다. 점도 향상제의 예는 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 크로스카르멜로스 소듐, 크로스포비돈, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체(15% 비닐 아세테이트), 젤라틴, 헤타스타치, 사람 알부민 미소구체, 히알루론산나트륨, 히프로멜로스, 메틸셀룰로스, 메틸피롤리돈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 포비돈 K12, 포비돈 K17, 포비돈, 전분 및 트리메틸실릴 처리된 디메티코놀/트리메틸실록시실리케이트 크로스중합체 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 관절내 주사를 위한 액체의 형태로 존재할 수 있으며, 소포제를 추가로 포함할 수 있다. 소포제의 예는 디메티콘, 폴리실록산, 실리콘 및 시메티콘 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
안정성
본원에 기재된 조성물은 냉장된, 주위 및 가속 조건을 포함한 다양한 저장 조건에서 안정하다. 안정하다는 것은 본원에서 사용된 바와 같이 제시된 저장 기간의 종료시 약 95%의 화합물 A의 화합물 및 약 5% 이하의 불순물 또는 관련 물질을 갖는 제제를 지칭한다. 안정성은 HPLC 또는 임의의 기타 공지의 테스트 방법에 의하여 평가된다. 안정한 제제는 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.5%, 약 2%, 약 1.5%, 약 1 % 또는 약 0.5%의 총 불순물 또는 관련 물질을 가질 수 있다. 안정한 제제는 약 5%의 총 불순물 또는 관련 물질을 가질 수 있다. 안정한 제제는 약 4%의 총 불순물 또는 관련 물질을 가질 수 있다. 안정한 제제는 약 3%의 총 불순물 또는 관련 물질을 가질 수 있다. 안정한 제제는 약 2%의 총 불순물 또는 물질을 가질 수 있다. 안정한 제제는 약 1%의 총 불순물 또는 관련 물질을 가질 수 있다. 안정한 제제는 제시된 저장 기간 종료시 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 화합물 A를 가질 수 있다.
냉장된 및 주위 조건에서, 본원에 기재된 제제는 적어도 1 개월 동안 안정하다. 냉장된 및 주위 조건에서, 본원에 기재된 제제는 적어도 30 일, 적어도 29 일, 적어도 28 일, 적어도 27 일, 적어도 26 일, 적어도 25 일, 적어도 24 일, 적어도 23 일, 적어도 22 일, 적어도 21 일, 적어도 20 일, 적어도 19 일, 적어도 18 일, 적어도 17 일, 적어도 16 일, 적어도 15 일, 적어도 14 일, 적어도 13 일, 적어도 12 일, 적어도 11 일, 적어도 10 일, 적어도 9 일, 적어도 8 일, 적어도 7 일, 적어도 6 일, 적어도 5 일, 적어도 4 일, 적어도 3 일, 적어도 2 일 또는 적어도 1 일 동안 안정하다. 몇몇 경우에서, 냉장된 조건은 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃ 또는 약 8℃에서이다. 기타 경우에서, 냉장된 조건은 약 4℃에서이다.
가속된 조건에서, 본원에 기재된 제제는 적어도 1 개월 동안 안정하다. 가속된 조건에서, 본원에 기재된 제제는 적어도 30 일, 적어도 29 일, 적어도 28 일, 적어도 27 일, 적어도 26 일, 적어도 25 일, 적어도 24 일, 적어도 23 일, 적어도 22 일, 적어도 21 일, 적어도 20 일, 적어도 19 일, 적어도 18 일, 적어도 17 일, 적어도 16 일, 적어도 15 일, 적어도 14 일, 적어도 13 일, 적어도 12 일, 적어도 11 일, 적어도 10 일, 적어도 9 일, 적어도 8 일, 적어도 7 일, 적어도 6 일, 적어도 5 일, 적어도 4 일, 적어도 3 일, 적어도 2 일 또는 적어도 1 일 동안 안정하다. 가속된 조건은 주위 수준(예, 25±5℃; 55±10% RH)보다 높은 온도 및/또는 상대 습도(RH)를 포함한다. 몇몇 경우에서, 가속된 조건은 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃ 또는 약 60℃에서이다. 기타 경우에서, 가속된 조건은 65% RH, 약 70% RH, 약 75% RH 또는 약 80% RH 초과이다. 추가의 경우에서, 가속된 조건은 주위 습도에서 약 40℃ 또는 60℃이다. 추가의 경우에서, 가속된 조건은 75±5% RH 습도에서 약 40℃이다. 주위 조건은 주위 레벨(예, 25±5℃; 55±10% RH)에서인 온도 및/또는 상대 습도(RH)를 포함한다. 몇몇 경우에서, 주위 조건은 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃에서이다. 기타 경우에서, 주위 조건은 약 45% RH, 약 50% RH, 약 55% RH, 약 60% RH 또는 약 65% RH이다. 냉장된 조건은 통상의 냉장 유닛에서의 온도 및/또는 상대 습도(RH)(예, 5±3℃)를 포함한다.
투여
화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 투여된 약학적 조성물의 양은 우선 처치되는 포유동물에 의존할 것이다. 약학적 조성물을 사람 개체에게 투여하는 경우에서, 1일 투여량은 통상적으로 개체의 연령, 성별, 식이, 체중, 일반적인 건강 및 반응, 개체의 증상의 경중도, 치료되는 정확한 징후 또는 병태, 치료되는 징후 또는 병태의 경중도, 투여 시간, 조성물의 성향, 배설률, 약물 조합 및 처방하는 의사의 재량에 따라 일반적으로 변경되는 투여량으로 처방하는 의사에 의하여 결정될 것이다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 관절내 주사에 의하여 관절, 예를 들면 무릎에 투여된다. 몇몇 경우에서, 치료는 최적의 투여량보다 적은 더 작은 투여량으로 개시할 수 있으며, 그 후 투여량은 그러한 상황 하에서 최적의 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가될 수 있다. 본원의 조성물의 투여의 양 및 빈도 및 적용 가능할 경우 기타 치료제 및/또는 요법은 상기 기재된 바와 같이 상기 요인을 고려하여 주치의(내과의사)의 판단에 의하여 조절될 수 있다. 그래서, 투여되는 약학적 조성물의 양은 폭넓게 변동될 수 있다.
본원에서 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물의 관절내 투여는 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 양으로 실시될 수 있다. 특정한 치료적 투여량은 예를 들면 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 약 150 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 250 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 약 350 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 550 ㎍, 약 550 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 600 ㎍ 내지 약 650 ㎍, 약 650 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 700 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 약 750 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 800 ㎍ 내지 약 950 ㎍, 약 950 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍ 또는 그들 사이의 임의의 범위를 포함할 수 있다. 몇몇 사례에서, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍을 관절당 투여한다. 몇몇 사례에서, 약 50 ㎍ 내지 약 200 ㎍을 관절당 투여한다. 몇몇 사례에서, 약 200 ㎍ 내지 약 800 ㎍을 관절당 투여한다. 몇몇 사례에서, 치료적 투여량은 약 1,000 ㎍ 미만, 약 900 ㎍ 미만, 약 800 ㎍ 미만, 약 700 ㎍ 미만, 약 600 ㎍ 미만, 약 500 ㎍ 미만, 약 400 ㎍ 미만, 약 300 ㎍ 미만, 약 200 ㎍ 또는 약 100 ㎍ 미만이다. 몇몇 사례에서, 치료적 투여량은 관절당 약 1,000 ㎍을 초과하지 않으며, 약 900 ㎍을 초과하지 않으며, 약 800 ㎍을 초과하지 않으며, 약 700 ㎍을 초과하지 않으며, 약 600 ㎍을 초과하지 않으며, 약 500 ㎍을 초과하지 않으며, 약 400 ㎍을 초과하지 않으며, 약 300 ㎍을 초과하지 않으며, 약 200 ㎍ 또는 약 100 ㎍을 초과하지 않는다. 관절당 특정한 치료적 투여량은 예를 들면 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 약 150 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 250 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 약 350 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 550 ㎍, 약 550 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 600 ㎍ 내지 약 650 ㎍, 약 650 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 700 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 약 750 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 800 ㎍ 내지 약 950 ㎍, 약 950 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍ 또는 그들 사이의 임의의 범위를 포함한다. 몇몇 사례에서, 포유동물당 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍을 투여한다. 몇몇 사례에서, 포유동물당 약 50 ㎍ 내지 약 200 ㎍을 투여한다. 몇몇 사례에서, 포유동물당 약 200 ㎍ 내지 약 800 ㎍을 투여한다. 몇몇 사례에서, 치료적 투여량은 약 1,000 ㎍ 미만, 약 900 ㎍ 미만, 약 800 ㎍ 미만, 약 700 ㎍ 미만, 약 600 ㎍ 미만, 약 500 ㎍ 미만, 약 400 ㎍ 미만, 약 300 ㎍ 미만, 약 200 ㎍ 또는 약 100 ㎍ 미만이다. 몇몇 사례에서, 치료적 투여량은 포유동물당 약 1,000 ㎍을 초과하지 않으며, 약 900 ㎍을 초과하지 않으며, 약 800 ㎍을 초과하지 않으며, 약 700 ㎍을 초과하지 않으며, 약 600 ㎍을 초과하지 않으며, 약 500 ㎍을 초과하지 않으며, 약 400 ㎍을 초과하지 않으며, 약 300 ㎍을 초과하지 않으며, 약 200 ㎍을 초과하지 않거나 또는 약 100 ㎍을 초과하지 않는다. 포유동물당 특정한 치료적 투여량은 예를 들면 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 900 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 150 ㎍, 약 150 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 200 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 250 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 약 300 ㎍ 내지 약 350 ㎍, 약 350 ㎍ 내지 약 400 ㎍, 약 400 ㎍ 내지 약 450 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 550 ㎍, 약 550 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 약 600 ㎍ 내지 약 650 ㎍, 약 650 ㎍ 내지 약 700 ㎍, 약 700 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 약 750 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 800 ㎍ 내지 약 950 ㎍, 약 950 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍ 또는 그들 사이의 임의의 범위를 포함할 수 있다.
화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물의 관절내 투여는 약 10 ㎍, 약 15 ㎍, 약 20 ㎍, 약 25 ㎍, 약 30 ㎍, 약 35 ㎍, 약 40 ㎍, 약 45 ㎍, 약 50 ㎍, 약 55 ㎍, 약 60 ㎍, 약 65 ㎍, 약 70 ㎍, 약 75 ㎍, 약 80 ㎍, 약 85 ㎍, 약 90 ㎍, 약 95 ㎍, 약 100 ㎍, 약 110 ㎍, 약 120 ㎍, 약 130 ㎍, 약 140 ㎍, 약 150 ㎍, 약 160 ㎍, 약 170 ㎍, 약 180 ㎍, 약 190 ㎍, 약 200 ㎍, 약 210 ㎍, 약 220 ㎍, 약 230 ㎍, 약 240 ㎍, 약 250 ㎍, 약 260 ㎍, 약 270 ㎍, 약 280 ㎍, 약 290 ㎍, 약 300 ㎍, 약 310 ㎍, 약 320 ㎍, 약 330 ㎍, 약 340 ㎍, 약 350 ㎍, 약 360 ㎍, 약 370 ㎍, 약 380 ㎍, 약 390 ㎍, 약 400 ㎍, 약 450 ㎍, 약 500 ㎍, 약 550 ㎍, 약 600 ㎍, 약 650 ㎍, 약 700 ㎍, 약 750 ㎍, 약 800 ㎍, 약 850 ㎍, 약 900 ㎍, 약 950 ㎍ 또는 약 1,000 ㎍의 양으로 실시될 수 있다. 몇몇 사례에서, 치료적 투여량은 약 1,000 ㎍을 초과하지 않으며, 약 900 ㎍을 초과하지 않으며, 약 800 ㎍을 초과하지 않으며, 약 700 ㎍을 초과하지 않으며, 약 600 ㎍을 초과하지 않으며, 약 500 ㎍을 초과하지 않으며, 약 400 ㎍을 초과하지 않으며, 약 300 ㎍을 초과하지 않으며, 약 200 ㎍을 초과하지 않거나 또는 약 100 ㎍을 초과하지 않는다. 몇몇 사례에서, 치료적 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 주사로 투여된다. 예를 들면, 치료적 투여량은 1회 투여된다. 또 다른 예로서, 치료적 투여량은 2, 3 또는 4회 투여된다. 몇몇 경우에서, 전술한 범위의 하한보다 낮은 투여량 레벨은 적절량보다 많을 수 있는 한편, 기타 사례에서는 여전히 더 큰 투여량은 예를 들면 상기 더 큰 투여량을 수개의 작은 투여량으로 나누어 임의의 해로운 부작용을 유발하지 않으면서 사용될 수 있다. 실시예에 기재된 조성물의 치료적 투여량도 또한 치료에 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물은 단일 또는 복수회 투여로 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월 또는 12 개월당 1회로 투여된다. 몇몇 사례에서, 조성물은 3 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 4 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 5 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 6 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 7 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 8 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 9 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 10 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 11 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 12 개월당 1회 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 5 주 이하 동안 매주 투여한다.
몇몇 실시양태에서, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물은 약 0.5 ㎖ 내지 약 10 ㎖의 총 부피로 1회 또는 복수회의 투여로 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 약 0.5 ㎖ 내지 약 10 ㎖, 약 0.5 ㎖ 내지 약 9 ㎖, 약 0.5 ㎖ 내지 약 8 ㎖, 약 0.5 ㎖ 내지 약 7 ㎖, 약 0.5 ㎖ 내지 약 6 ㎖, 약 0.5 ㎖ 내지 약 5 ㎖, 약 0.5 ㎖ 내지 약 4 ㎖, 약 0.5 ㎖ 내지 약 3 ㎖, 약 0.5 ㎖ 내지 약 2 ㎖, 약 0.5 ㎖ 내지 약 1 ㎖, 약 1 ㎖ 내지 약 9 ㎖, 약 1 ㎖ 내지 약 8 ㎖, 약 1 ㎖ 내지 약 7 ㎖, 약 1 ㎖ 내지 약 6 ㎖, 약 1 ㎖ 내지 약 5 ㎖, 약 1 ㎖ 내지 약 4 ㎖, 약 1 ㎖ 내지 약 3 ㎖, 약 1 ㎖ 내지 약 2 ㎖, 약 1.5 ㎖ 내지 약 5 ㎖, 약 1.5 ㎖ 내지 약 4 ㎖, 약 1.5 ㎖ 내지 약 3 ㎖, 약 1.5 ㎖ 내지 약 2 ㎖, 약 2 ㎖ 내지 약 5 ㎖, 약 2 ㎖ 내지 약 4 ㎖ 또는 약 2 ㎖ 내지 약 3 ㎖의 총 부피로 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물의 총 부피는 약 10 ㎖를 초과하지 않으며, 약 9 ㎖를 초과하지 않으며, 약 8 ㎖를 초과하지 않으며, 약 7 ㎖를 초과하지 않으며, 약 6 ㎖를 초과하지 않으며, 약 5 ㎖를 초과하지 않으며, 약 4 ㎖를 초과하지 않으며, 약 3 ㎖를 초과하지 않으며, 약 2 ㎖를 초과하지 않거나 또는 약 1 ㎖를 초과하지 않는다. 몇몇 사례에서, 조성물의 총 부피는 약 10 ㎖, 약 9 ㎖, 약 8 ㎖, 약 7 ㎖, 약 6 ㎖, 약 5 ㎖, 약 4 ㎖, 약 3 ㎖, 약 2 ㎖ 또는 약 1 ㎖이다.
몇몇 실시양태에서, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물은 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 1,000 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 900 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 800 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 700 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 600 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 500 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 400 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 300 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 200 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 약 1,000 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 약 900 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 약 800 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 약 700 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 약 600 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 약 500 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 약 400 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖ 내지 약 300 ㎍/㎖ 또는 약 100 ㎍/㎖ 내지 약 200 ㎍/㎖의 화합물의 농도로 투여한다. 몇몇 사례에서, 조성물은 적어도 약 100 ㎍/㎖, 약 150 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖, 약 250 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖, 약 350 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖, 약 450 ㎍/㎖ 또는 약 500 ㎍/㎖의 화합물의 조성으로 투여한다.
조합 치료
본 발명의 화합물 및 조성물은 관절염 또는 관절 손상의 향상에 적절한 기타 성분과 조합하여 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 포유동물에서 관절염 또는 관절 손상 및/또는 관절염 또는 관절 손상과 관련된 증상의 치료에 치료적으로 효과적인 추가의 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 또한 비스테로이드성 소염제(NSAID), 진통제, 글루코코르티코이드, 안지오포이에틴-유사 3 단백질(ANGPTL3) 또는 그의 연골발생 변형체, 경구 연어 칼시토닌, SD-6010(iNOS 억제제), 비타민 D3(콜레칼시페롤), 콜라겐 가수분해물, FGF18, BMP7, 아보카도 대두 비비누화물(ASU) 또는 히알루론산을 포함할 수 있다. ANGPTL3은 WO2011/008773(본원에 그 전문이 포함됨)에 보다 상세하게 기재된다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 소염 활성을 갖는 약제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 아폽토시스 조정제를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 아폽토시스 조정제는 카스파제 억제제이다. 아폽토시스/카스파제 억제제의 비제한적인 일례는 엠리카산이다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 iNOS 억제제를 포함한다. iNOS 억제제의 비제한적인 일례는 SD-6010이다.
NSAIDS는 아스피린, 디플루니살, 살살레이트, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 나프록센, 페노프로펜, 케토프로펜, 덱스케토프로펜, 플루르비프로펜, 옥사프로진, 록소프로펜, 인도메타신, 톨메틴, 술린닥, 에토돌락, 케토롤락, 나부메톤, 디클로페낙, 피옥시캄, 멜록시캄, 테녹시캄, 드록시캄, 로르녹시캄, 이속시캄, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산, 셀로콕시브, 파레콕시브, 에토리콕시브, 루미라콕시브 및 피로콕시브를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
진통제는 아세트아미노펜 및 아편유사제(마약제)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 아편유사제는 덱스트로프로폭시펜, 코데인, 트라마돌, 타펜타돌, 아닐레리딘, 알파프로딘, 페티딘, 히도코돈, 모르핀, 옥시코돈, 메타돈, 디아모르핀, 히드로모르폰, 옥시모르폰, 레보르파놀, 7-히드록시미트라기닌, 부프레노르핀, 펜타닐, 수펜타닐, 브로마돌, 에토르핀, 디히드로에토르핀 및 카르펜타닐을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
글루코코르티코이드는 히드로코르티손, 코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손, 트리암시놀론, 벡클로메타손 또는 플루드로코르티손을 포함하나 이에 제한되지 않는다
화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 관절염 또는 관절 손상 및/또는 관절염 또는 관절 손상과 관련된 증상의 치료에 치료적으로 효과적인 1종 이상의 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 추가의 화합물은 본원에 개시된 화합물과 동시에 또는 순차적으로 통상적으로 사용되는 양으로 및 경로에 의하여 투여될 수 있다. 본원에 개시된 화합물이 1종 이상의 상기 추가의 화합물과 함께 동시에 사용될 경우, 상기 기타 약물 및 본 발명의 화합물을 함유하는 단위 투여 형태의 약학적 조성물이 바람직하다. 그러나, 조합 요법은 또한 본원에 개시된 화합물 및 1종 이상의 추가의 화합물이 상이한 중첩되는 스케쥴로 투여되는 요법을 포함할 수 있다. 또한, 1종 이상의 추가의 화합물과 조합하여 사용시 화합물은 각각 단독으로 사용시보다 더 적은 투여량으로 사용될 수 있는 것으로 고려한다.
상기 조합은 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물과 관절염 또는 관절 손상 및/또는 관절염 또는 관절 손상과 관련된 증상의 치료에 치료적으로 효과적인 1종의 화합물뿐 아니라, 2종 이상의 상기 화합물과의 조합을 포함한다. 마찬가지로, 관절염 또는 관절 손상 및/또는 관절염 또는 관절 손상과 관련된 증상의 치료에 치료적으로 효과적인 화합물과 조합되거나 또는 그 자체로 본원에 개시된 화합물은 골관절염 또는 관절 손상 또는 골관절염 또는 관절 손상과 관련된 병태의 예방, 치료, 제어 또는 향상에 사용되는 기타 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 기타 약물은 본원에 개시된 화합물과 동시에 또는 순차적으로 통상적으로 사용되는 양으로 및 경로에 의하여 투여될 수 있다. 본원에 개시된 화합물 A룰 1종 이상의 기타 약물과 동시에 사용시, 본 발명의 화합물 이외에 상기 기타 약물을 함유하는 약학적 조성물이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 또한 본원에 개시된 화합물 이외에 1종 이상의 기타 활성 성분을 또한 함유하는 것을 포함한다. 본원에 개시된 화합물 대 제2의 활성 성분의 중량비는 변경될 수 있으며, 각각의 성분의 유효 투여량에 의존할 것이다. 일반적으로 각각의 유효 투여량이 사용될 것이다.
약학적 조성물의 투여
한 측면에서, 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물은 관절내 주사에 의하여 투여된다. 몇몇 사례에서, 조성물은 무릎에 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 조성물의 주사 이전에 과잉의 유체는 무릎으로부터 흡입된다. 필요할 경우 초음파를 사용하여 시술을 안내할 수 있다. IA 주사의 경로는 관절에 따라 상이할 수 있으며, 즉 무릎으로의 IA 주사의 경우, 활액막 부피 및 무릎 관절의 기동성은 고관절 또는 척추 관절과는 상이할 것이다.
실시예
실시예 1: 사람 연골세포 분화 검정
사람 MSC(50,000)를 96웰 평판의 각각의 웰에 플레이팅하고, 밤새 배양하였다. 화합물 A(DMSO 용액 중의)를 세포에 1 μM의 최종 농도에서 첨가하고, 세포를 7 일 동안 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 세포를 10% 포르말린 용액으로 실온에서 10 분 동안 고정시키고, 타입 II 콜라겐(압캠(Abcam)), Sox9(산타 크루즈(Santa Cruz)) 및 연골 올리고머 기질 단백질(COMP, 산타 크루즈) 및 형광 표지된 2차 항체(리-코르(Li-Cor))에 대하여 특이성인 항체를 사용하여 면역염색하였다. 염색의 총 강도는 오디세이(Oddyssey) CLx 영상계(리-코르)를 사용하여 측정하였다. 비히클(DMSO)은 연골세포 분화의 기저 레벨을 구하기 위하여 대조군으로서 사용하였다. 결과를 하기 표 1에 제시한다[A: 비히클 대조군에 비하여 >50% 염색 강도 증가; B: 비히클 대조군에 비하여 30-50% 염색 강도 증가].
표 1
Figure pct00003
실시예 2: 화합물 A 세포 생존율 검정
사람 MSC, 연골세포, 골모세포 및 윤활막세포를 384웰 평판에 웰당 10,000개의 세포로 플레이팅하였다. 화합물 A를 100 μM의 최종 농도로 첨가한다. 세포를 48 시간 동안 배양한다. 세포 생존율은 셀 타이터-글로(Cell Titer-Glo)(프로메가(Promega)) 검정에 의하여 인비젼(EnVision) 평판 판독기(퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용하여 분석한다. 아폽토시스 활성은 카스파제(Caspase) 3/7-글로(Glo)(프로메가) 검정에 의하여 인비젼 평판 판독기(퍼킨엘머)를 사용하여 분석한다.
실시예 3: 래트에서 관절내 주사에 의한 화합물 A PK 연구
30 ㎕ 화합물 A 용액(0.1% DMSO를 함유하는 PBS 중의 100 μM)을 각각의 래트의 우측 무릎의 관절 공간에 주사한다. 주사후 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9 및 10 시간에 동물로부터 채혈한다. 동물을 투여후 2 또는 12 시간에 죽인다. 주사한 무릎의 혈장 및 관절 세척액을 수집한다. 주사한 화합물의 양은 LCMS를 사용하여 분석한다.
실시예 4: 래트 내측 반월상연골 파열( MMT ) 골관절염( OA ) 모델
각각의 동물의 우측 무릎의 내측 반월상연골을 수술로 파열시켜 OA를 유도한다. 화합물 A 용액(0.1% DMSO를 함유하는 PBS 중의 30 ㎕의 100 μM)의 투여를 3 주 동안 1주당 1회 투여로 수술후 7 일에 개시한다. 체중 및 보행 장애를 투여 직전에 매주 모니터링한다. 동물을 후술후 28일차에 죽인다. 수술한 무릎의 관절을 처리하고, 연골에 대하여 조직화학적으로 염색하고, 연골을 평가한다.
5% 포름산 탈회제 중에서 4-6 일 후, 수술한 관절을 정면에서 거의 동일하게 절반으로 절단하고, 파라핀에 묻었다. 3개의 구획을 각각 수술한 우측 무릎(g1-8)으로부터 약 200 ㎛ 스텝에서 절단하고, 톨루이딘 블루로 염색한다. 군 1의 좌측 무릎 및 군 9의 우측 무릎은 생성된 단일 구획을 가지며, 이를 톨루이딘 블루로 염색한다.
각각의 수술한 무릎의 3개의 구획 모두를 현미경으로 분석한다. 각각의 슬라이드 상의 2개의 절반에 대한 최악 사례의 시나리오는 일반적인 연골 퇴행, 프로테오글리칸 손실, 콜라겐 손상 및 골증식체 형성에 대하여 구한다. 그 후, 각각의 파라미터에 대한 값을 3개의 구획 전체에 대하여 평균을 구하여 총 주관적 스코어를 구한다.
게다가, 몇몇 파라미터(하기 표시함)의 경우, 경골 고평부 전체에 걸친 영역 차는 각각의 구획을 3개의 구역(1-외부, 2-중간, 3-내부)으로 나누어 고려한다. 수술 OA 모델에서, 3등분 중 외부(z1) 및 중간(z2)은 가장 심각하게 영향을 받았으며, 3등분 중 내부(z3)에서 더 온화한 변화가 존재한다. 구역에 개별적으로 스코어를 매길 경우, 스코어는 영향을 받은 구역의 퍼센트 면적에 기초하여 할당한다. 구역 면적은 접안 마이크로미터를 사용하여 묘사한다.
하기 파라미터를 측정하고 및/또는 스코어를 매긴다:
일반적인 연골 퇴행은 연골세포 사/손실, 프로테오글리칸 손실 및 콜라겐 손실 또는 세동의 중요한 파라미터를 포함한다. 경골에서의 연골 퇴행은 각각의 구역에 대하여 하기 기준을 사용하여 없음 내지 심각함(수치값 0-5)으로 스코어를 매긴다:
·0 = 퇴행 없음
·1 = 최소 퇴행, 기질의 구역 5-10% 내에서 상당한 연골세포 손실의 결과로서 생존 가능하지 않은 것으로 나타남(정상 세포 밀도의 50% 초과). PG 손실은 세포 손실의 부위에서 일반적으로 존재하며, 콜라겐 기질 손실은 존재할 수 있음.
·2 = 온화한 퇴행, 기질의 구역 11-25% 내에서 상당한 연골세포 손실의 결과로서 생존 가능하지 않은 것으로 나타남(정상 세포 밀도의 50% 초과). PG 손실은 세포 손실의 부위에서 일반적으로 존재하며, 콜라겐 기질 손실이 존재할 수 있음.
·3 = 중등도 퇴행, 기질의 구역 26-50% 내에서 상당한 연골세포 손실의 결과로서 생존 가능하지 않은 것으로 나타남(정상 세포 밀도의 50% 초과). PG 손실은 세포 손실의 부위에서 일반적으로 존재하며, 콜라겐 기질 손실은 존재할 수 있음.
·4 = 현저한 퇴행, 기질의 구역 51-75% 내에서 상당한 연골세포 손실의 결과로서 생존 가능하지 않은 것으로 나타남(정상 세포 밀도의 50% 초과). PG 손실은 세포 손실의 부위에서 일반적으로 존재하며, 콜라겐 기질 손실은 존재할 수 있음.
·5 = 중증 퇴행, 기질의 구역 76-100% 내에서 상당한 연골세포 손실의 결과로서 생존 가능하지 않은 것으로 나타남(정상 세포 밀도의 50% 초과). PG 손실은 세포 손실의 부위에서 일반적으로 존재하며, 콜라겐 기질 손실은 존재할 수 있음.
몇몇 사례에서, 화상 분석은 스코어(0-5)보다는 절대 %를 비교할 수 있도록 선택된 구역에서 또는 각각의 구역에서 기질 생존 가능성 및/또는 손실의 정확한 %를 구하는데 사용할 수 있다. 각각의 구역에 대한 데이타를 표현하는 것 이외에 연골 퇴행에 대한 3-구역 합을 계산한다.
병변은 일반적으로 구역 패턴으로 표면 상에 분포되지 않으므로 병변을 구역에 기초하여 분석할 수 없는 것을 제외하고, 대퇴 연골의 평가에 동일한 과정을 적용한다. 하중을 견디는 표면의 전체 폭(대퇴골의 경우 약 2,000 ㎛)을 구하고, 상기 기준을 가장 심각하게 영향을 받은 1/3, 2/3 또는 3/3에 적용한다. 예를 들면, 전체 부위의 1/3(병변이 약 667 ㎛에 걸친 고평부의 중심에 있을 수 있음)이 최소 퇴행을 갖는 경우(총 면적의 5-10%가 연골세포 및/또는 기질의 손실을 가짐), 1의 스코어를 할당한다. 상기 최소 퇴행이 전체 표면(3/3)에 걸쳐 확대될 경우, 스코어는 3이다. 전체 대퇴 연골이 심각한 확산 퇴행의 결과로 존재하지 않을 경우, 스코어는 15이다.
그러한 전체 연골 퇴행 스코어 이외에, 콜라겐 기질 손상에 별도로 스코어를 매기어 약제의 더욱 구체적인 효과를 확인한다. 내측 경골 고평부(2개의 절반 중 가장 심각하게 영향을 받은 구획) 전체에 걸친 콜라겐 손상은 하기의 전체 폭을 측정하여 정량화한다:
·임의의 손상(표재 내지 전체 두께 손실 범위에 걸친 세동).
·심각한 손상(타이드마크에 대한 콜라겐의 전체 손실 또는 거의 전체 손실, >90% 두께)
·현저한 손상(연골 두께의 61-90%에 걸쳐 확대됨)
·중등도 손상(연골 두께의 31-60%에 걸쳐 확대됨)
·온화한 손상(연골 두께의 11-30%에 걸쳐 확대됨)
·최소 손상(표재에 국한, 상부 10%만 영향을 받음)
상기 주관적인 일반 연골 스코어링 이외에, 2개의 연골 퇴행 폭 측정을 실시한다:
·총 경골 연골 퇴행 폭(㎛)은 임의의 유형의 퇴행(세포 손실, 프로테오글리칸 손실 또는 콜라겐 손상)에 의하여 영향을 받은 경골 고평부의 총 정도의 마이크로미터 측정이다. 그러한 측정은 표면 전체에 걸쳐 이웃하는 연골 퇴행을 갖는 골증식체(외부 1/3)의 기원으로부터 접선층 및 그 아래의 연골층이 조직학적으로 정상인 것으로 나타나는 지점까지 확대된다.
·실질적인 연골 퇴행 폭(㎛)은 연골세포 및 프로테오글리칸 손실 둘다가 연골 두께의 50% 초과까지 연장되는 경골 연골 퇴행의 부위를 반영한다. 일반적으로, 콜라겐 손상은 상기 파라미터에 대하여 온화(25% 깊이) 또는 그보다 더 크지만, 연골세포 및 프로테오글리칸 손실은 연골 깊이의 적어도 50% 또는 그보다 더 크게 확대된다.
변경된 부위의 깊이 대 타이드마크에 대한 깊이의 비로서 표현한, 임의의 유형의 병변의 마이크로미터 깊이(연골세포 및 프로테오글리칸 손실 둘다는 콜라겐 기질의 우수한 보유를 가질 수 있으며, 세동은 없음)는 구역의 중간지점에서 경골 표면 전체에 걸쳐 3개의 구역 각각에서 최대 병변 중증도의 부위에서 취한다. 그러한 측정은 존재하는 임의의 유형의 미세 변화의 가장 임계적인 분석이다. 측정을 구역의 중간지점에서 실시할 때 분모는 동화의 비교를 위하여 3개의 구역 각각에서 연골 두께의 평균 측정치로서 역할할 수 있다.
골증식체의 소, 중 및 대로의 스코어링 및 카테고리화는 접안 마이크로미터를 사용하여 실시한다. 골증식체로서 측정 및 지정하기 위하여 주변부 구역 증식 변화는 ≥200 ㎛이어야만 한다. 스코어는 하기 기준에 따라 각각의 구획에서의 최대 골증식체(통상적으로 경골에서 발견됨)인 것으로 할당된다:
·1 = 작음 299 ㎛까지
·2 = 중간 300-399 ㎛
·3 = 큼 400-499 ㎛
·4 = 매우 큼 500-599
·5 = 매우 큼 ≥600
실제의 골증식체 측정(윤활막까지 확대된 가장 먼 거리 지점까지의 타이드마크)도 또한 기록한다.
대퇴 연골 퇴행 스코어 및 경골 연골 퇴행 스코어의 3개의 구역 합(3개의 레벨의 평균)을 합하여 총 연골 퇴행 스코어를 생성한다. 각각의 관절에 대한 평균 골증식체 스코어를 상기 값에 추가하여 총 관절 점수를 생성한다.
화상 분석
연골 기질 보존의 정량화 및 비교를 위하여, 연골 면적 측정은 각각의 동물의 가장 심각하게 영향을 받은 구획으로부터 실시한다. CoolSNAP-Pro 현미경 카메라로 현미경사진을 촬영하고, 이미지프로 플러스(ImagePro Plus) 소프트웨어에 로딩한다. 하기 측정은 리포트에 포함된 페이지당 4개의 현미경사진의 트레이싱으로부터 구한다:
·골증식체의 내부 모서리로부터 측정한 타이드마크로부터 경골 고평부의 9 cm(현미경사진)에 걸친 표면(또는 퇴행된 부위에서의 돌출된 표면)까지의 총 면적
·생존 불가한 기질(50% 미만의 연골세포, 프로테오글리칸 및 무상해 콜라겐를 갖는 연골) 및 전체 부위 내에 기질이 없는 부위
·전체 부위 내에 기질이 없는 부위
생존 불가한 기질의 면적을 전체 면적으로부터 빼서 생존 가능한 기질의 면적을 얻으며, 기질이 없는 면적을 전체 면적으로부터 빼서 임의의 기질(연골세포 및 프로테오글리칸이 있거나 또는 없는 콜라겐 기질)의 면적을 얻는다. 그 후, 이들 두 값을 전체 면적으로부터 다시 비교하여 군 사이를 비교하는 퍼센트 생존 가능한 기질 면적 및 퍼센트 임의의 기질 면적을 유도한다. 비히클 군으로부터의 5개의 좌측 무릎은 정상 대조군으로서 본 과정에 포함시킨다. 그러한 과정을 사용하여 병변 중증도 및 겉보기 치료 효과에 의존하여 전체 표면 또는 선택된 구역을 분석할 수 있다.
활액 반응이 비정상인 경우 기록하며(주로 섬유화이어야 함), 염증 유형 및 정도에 관하여 특징화하지만, OA 스코어에 포함시키지는 않는다.
석회화된 연골 층 및 연골하 골에 대한 손상(모든 구획에 대하여 최악의 사례 시나리오)은 하기 기준을 사용하여 스코어를 매긴다:
·0 = 변화 없음
·1 = 타이드마크에서 증가된 호염기성, 타이드마크의 골편형성 없음, 골수 변화 없음 또는 존재할 경우 최소 및 국소.
·2 = 타이드마크에서 증가된 호염기성, 타이드마크의 석회화된 연골의 최소 내지 온화한 국소 골편형성, 골수에서의 중간엽 변화는 전체 면적의 1/4에 관련되어 있으나, 일반적으로 병변 하의 연골하 영역에 한정된다.
·3 = 타이드마크에서 증가된 호염기성, 석회화된 연골(복수국소)의 온화한 내지 현저한 국소 또는 복수국소 골편형성, 골수에서의 중간엽 변화는 전체 면적의 3/4까지이며, 골수 연골형성의 면적은 명백할 수 있으나, 골단 골로의 관절 연골의 주요 붕괴는 없다(표면에서 뚜렷한 함몰).
·4 = 타이드마크에서 증가된 호염기성, 석회화된 연골의 현저한 내지 중증의 골편형성, 골수 중간엽 변화는 면적의 3/4까지 관련되며, 관절 연골은 골단으로 타이드마크로부터 250 ㎛ 이하의 깊이까지 붕괴되었다(표면 연골에서의 뚜렷한 함몰이 보인다).
·5 = 타이드마크에서 증가된 호염기성, 석회화된 연골의 현저한 내지 중증의 골편형성, 골수 중간엽 변화는 면적의 3/4까지 관련되어 있으며, 관절 연골은 골단으로 타이드마크로보터 250 ㎛ 초과의 깊이까지 붕괴되었다.
게다가, 측정은 구획의 비접선 부위에서 내측 활액막/측부 인대 복원의 두께로 이루어진다.
성장판 두께는 모든 무릎에서 내측 및 측면 성장판의 대략 중간지점(구획의 비접선 부위로 추정함)에서 내측 및 측면 측(2회 측정/관절) 상에서 측정한다.
실시예 5: 관절 및 혈장 래트 샘플에서 화합물 A의 추출 및 정량화
화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물에 대한 LC-MS/MS 분석은 아질런트(Agilent) 1100 HPLC 및 립 테크놀로지즈(Leap Technologies) 오토샘플러가 장착된 API 3000을 사용하여 수행하였다. 2.0×50 ㎜의 치수를 갖는 HPLC 페노메넥스(Phenomenex) 5 미크론, 100 A 루나(Luna) C18 (2) 분석 컬럼(파트 번호 00B-4252-B0)을 30℃의 온도에서 0.6 ㎖/min의 유속, 10 ㎕의 주사 부피 및 6.0 분 실시 시간에서 사용하였다. 이동상 A1은 물 중의 0.1% 포름산이었으며, 이동상 B1은 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산이었다. 구배는 시간 0에서 90% A1/10% B1; 시간 1.0 분에서 90% A1/10% B1; 시간 2.0 분에서 10% A1/90% B1; 시간 4.0 분에서 10% A1/90% B1; 시간 4.10 분에서 90% A1/10% B1; 시간 6.0 분에서 90% A1/10% B1이었다. 분석물 및 내부 표준 정량화는 다중 반응 모니터링(MRM) 정량화 방법을 사용하여 수행하였다. 혈장 중의 노출 및 관절 추출물 중의 관찰된 농도를 투여 및 특정하는데 사용된 특정 방법이 하기 제시되어 있다.
래트 혈장 샘플: 보정 표준 곡선은 대조군 래트 플라즈마 중의 화합물의 농축된 스파이크 용액의 연속 희석에 의하여 생성하였다. 보정 표준물 및 래트 혈장 샘플은 아세토니트릴 및 내부 표준물의 분액을 표준물 및 샘플의 각각의 분액에 첨가하여 단백질 침전에 의하여 생성하였다. 와류 혼합 및 원심분리 후, 각각의 표준물 및 샘플로부터의 상청액의 분액을 물 중의 포름산으로 희석하고, 혼합 및 주사하였다. IA 투여 후(t = 0, 0.5, 1, 2, 4 및 6 시간에서 시작) 수집한 모든 혈장 샘플은 하기 표 2에 제시된 임의의 화합물의 경우 전신 노출이 없다는 것을 나타냈다.
래트 무릎 관절 샘플: 보정 표준 곡선은 내부 표준 희석제 중의 화합물의 농축된, 스파이크 용액의 연속 희석에 의하여 생성하였다. 내부 표준 희석제는 내부 표준 화합물을 아세토니트릴 중의 특정한 농도로 용해시켜 생성하였다. 각각의 시점에 대한 래트 무릎 관절 샘플을 개별적으로 분쇄시키고, 각각의 원심분리관에 옮기고, 1.0 ㎖의 내부 표준 희석제를 첨가하였다. 각각의 원심분리관을 와류 처리하고, 30 분 동안 원심분리하였다. 각각의 시험관으로부터 상청액을 제거하고, 분석용 컬럼에 주입하였다. 게다가, 헤파린 코팅된 시험관에 안구뒤 출혈에 의하여 혈장 샘플을 얻고, -80C에서 보관한 후, 래트 혈장 샘플에 대하여 상기 기재된 프로토콜과 유사하게 처리하였다.
화합물 투여 및 조직 처리: 30 ㎕의 100 μM 화합물 A 용액(0.1% DMSO를 갖는 PBS)을 각각의 동물의 우측 뒤 무릎의 관절내 공간에 주사하였다. 동물을 표시된 시점(0 시간, 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 6 시간)에서 안락사시켰다. 각각의 시점에 4 마리의 동물을 사용하였다. 주사한 무릎 관절을 수거하고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰다. 전체 관절을 냉동시킨 상태로 분말로 분쇄하고, 1 ㎖ 내부 표준물 함유 아세토니트릴과 혼합하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 와류 처리하고, 309 분 동안 원심분리하였다. 각각의 샘플로부터의 상청액은 LC-MS/MS를 사용하여 분석하였다. 하기 표 2에 제시된 데이타는 무릎 추출물 중의 관찰된 농도를 나타낸다. ND = 측정하지 않음.
표 2
Figure pct00004
실시예 6A: 화합물 A의 조성물
주사에 의한 투여에 적절한 비경구 약학적 조성물을 생성하기 위하여, 100　㎎의 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 DMSO 중에 용해시킨 후, 10 ㎖의 0.9% 멸균 염수 용액과 혼합하였다. 혼합물을 주사에 의한 투여에 적절한 투여 단위로 혼입하였다.
실시예 6B: 화합물 A의 조성물
1.0 ℓ의 화합물 A 주사액을 제조하는 배취 포뮬라, 200 ㎍/㎖를 하기 표 3에 제공한다.
표 3: 배취 포뮬라
Figure pct00005
포스페이트 완충제 용액의 제조
완충제 용액을 생성하기 위하여, 인산이나트륨 12수화물을 계량하고, 주사용수(WFI)를 함유하는 비이커에 첨가하였다. 용액을 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 염화나트륨을 계량하고, 완충제 용액에 첨가하였다. 용액을 완전 용해될 때가지 교반하였다. 용액의 pH를 측정하고, 충분한 HCl 용액을 첨가하여 pH 7.9를 달성하였다. WFI를 사용한 QS. pH를 측정하고, 필요할 경우 pH 7.9를 달성하도록 조절하였다.
최종 벌크 약물 용액의 제조
PEG-3350를 무게를 아는 자켓 비이커로 계량하였다. 저울을 영점 보정하고, 폴리소르베이트 80을 자켓 비이커로 계량하였다. 자켓 비이커를 수조에 연결하고, 약 70℃로 설정하여 PEG-3350을 용해시켰다. 화합물 A를 바이알에 직접 계량하였다. 벤질 알콜을 첨가하였다. 자기 교반기를 바이알에 첨가하고, 화합물 A가 완전 용해될 때까지 용액을 교반하였다. 완충제 용액을 계량하여 헹굼액으로서 사용하였다. 화합물 A/벤질 알콜 용액을 PEG-3350/폴리소르베이트 80 용액에 첨가하고, 약물 바이알을 보유된 완충제 용액으로 헹구고, 약물 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 약 10 분 동안 교반하였다. 가열을 중지하고, 약 10 분 동안 교반을 지속하였다. 남겨진 완충제의 첨가량을 계산하고, 비이커로 계량하고, 최종 벌크에 첨가하였다. 실온으로 냉각하였다.
바이알 충전/ 피니쉬
용액을 1개의 0.45 ㎛ 필터 및 2 개의 0.22 ㎛, PVDF 필터를 통하여 연속으로 층류 캐비넷 내부의 쇼트(Schott) 병에 여과하였다. 멸균된 바이알을 충전시켰다. 중지하고, 각각의 바이알을 층류 캐비넷 내에서 크림프(crimp) 처리하였다.
실시예 7: 안정성 데이타
안정성에 대하여 화합물 A 주사 200 ㎍/㎖(실시예 6B로부터)를 두었다. 5 ㎖의 화합물 A 주사액을 함유하는 바이알을 저장시 -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 두었다.
분석 절차
외관: 화합물 A 주사액을 주위 광 하에서 그의 투명도, 색상 및 이물질의 부재에 대하여 조사하였다.
HPLC에 의한 확인: HPLC에 의한 순도/관련 물질
컬럼: 할로(Halo) C18, 150×4.6 ㎜, 2.7 ㎛
컬럼 온도: 30℃
검출 파장: UV@210 nm
오토샘플러 온도: 25℃(제어된 주위)
유속: 1 ㎖/min
주사 부피: 5 ㎕
이동상 A: 물:아세토니트릴:헵타플루오로부티르산(HFBA), 95:5:0.005, v/v/v
이동상 B: 물:아세토니트릴:HFBA, 5:95:0.0075, v/v/v
희석제: 물:아세토니트릴, 50:50, v/v
구배
Figure pct00006
실시 시간: 30 분
적분 시간: 25 분
샘플 제조: 약물 생성물의 일부를 HPLC 바이알에 옮기고, 니트(neat) 주입함
정량화: 정량화 레벨은 ≥0.05%임
pH: USP <791> 방법을 수행하였다.
오스몰 농도: USP <785> 방법을 수행하였음.
미립자 물질: USP <788> 방법을 수행하였음.
멸균: USP <71> 방법을 수행하였음.
세균 내독소: USP <85> 방법을 수행하였음.
내용물 균일성: USP <905> 방법을 수행하였음.
안정성 데이타 표는 하기 표 4 내지 표 10에 제공한다.
표 4: 외관 , 오스몰 농도 및 pH에 대한 안정성 데이타
Figure pct00007
표 5: 현미경으로 보이는 미립자에 대한 안정성 데이타
Figure pct00008
표 6: 검정 안정성 데이타
Figure pct00009
표 7: 순도 안정성 데이타
Figure pct00010
표 8: -20℃에서 안정성
Figure pct00011
표 9: 2 -8℃에서의 안정성
Figure pct00012
표 10: 25℃ /60% RH에서의 안정성
Figure pct00013
실시예 8: 무릎의 골관절염을 갖는 대상체에서 관절내 주사에 의하여 투여된 화합물 A의 안전성, 내약성 , 약물동태학 및 약물동력학을 평가하는 무작위, 이중 맹검, 플라시보 제어된 투여량 단계적 증가 실험
1차 목적
무릎 관절로의 관절내 주사에 의하여 투여시 화합물 A의 안전성 및 내약성을 평가하기 위함
1차 종점
치료로 인한 이상 사례(TEAE)의 발생률, 관련성, 중증도 및 기간
2차 목적
임의의 투여 제한 독성을 확인하고, 화합물 A의 최대 내약 용량을 결정함.
혈장 중 화합물 A의 약물동태학 성질을 결정함
2차 종점
기준선으로부터 임상 실험실 테스트 결과, 활력 징후 또는 심전도(ECG) 결과에서의 변화
신체 검사에 대한 임상적으로 유의적인 발견
하기를 포함한 혈장 중의 화합물 A의 약물동태학 파라미터: 최대 관찰된 혈장 농도(Cmax), 투여량 조절된 Cmax(Cmax/투여량); 최대 관찰된 혈장 농도까지의 시간(Tmax), 혈장 농도 아래의 면적 대 시간 0으로부터 최종 정량 가능한 농도까지의 시간 곡선(AUC0 -t), 투여량 조절된 AUC0 -t(AUC0 -t/투여량), 시간 0으로부터 무한대까지의 AUC(AUC0 -∽), 투여량 조절된 AUC0 -∽(AUC0 -∽/투여량), 말단 소실 속도 상수(λz), 말단 반감기(t½), 겉보기 청소율(CL/F) 및 분포 부피(Vz/F)
탐구 목적
화합물 A의 투여후 연골 및 골관절염 증상에서의 변화를 평가하기 위함
탐구 바이오마커 연구를 위한 생검체 샘플을 수집 및 뱅크(bank) 처리하기 위함
탐구 종점
콜라겐 합성의 약물동력학 마커로서 타입 IIA 콜라겐의 N-프로펩티드(PIIANP)의 혈청 레벨
콜라겐 분해의 약물동력학 마커로서 타입 II 콜라겐의 C-말단 가교 텔로펩티드(CTX-II)의 소변 배설
인덱스 무릎의 전 장기 자기 공명 영상화 스코어(WORMS)에서 기준선으로부터의 변화
웨스턴 온타리오 앤 맥매스터 유니버시티즈 골관절염 지수(WOMAC) 버젼 3.1 총 스코어 및 WOMAC 통증 및 기능 서브스케일(subscale) 스코어의 기준선으로부터의 변화
OA에서 약물 반응과 관련된 탐구 연구에 대한 뱅크 처리된 생검체 샘플의 사용
실험 설계
이는 무릎의 골관절염을 갖는 대상체에게 관절내 주사에 의하여 투여시 화합물 A의 안전성, 내약성, 약물동태학 및 약물동력학을 평가하기 위한 무작위 이중 맹검 플라시보 제어된 실험이다. 모든 대상체는 발병된 무릎에서 화합물 A 또는 플라시보의 5 ㎖ 주사를 수용할 것이다.
본 실험은 화합물 A 또는 플라시보를 수용하도록 무작위로 추출하게 될 피험체의 약 7개의 코호트로 이루어질 것이다. 화합물 A는 1 ㎖당 200 ㎍의 농도의 용액으로서 제공될 것이다. 화합물 A는 하기 코호트에게 1회 투여로서 투여될 것이다:
Figure pct00014
그 다음 투여 코호트로의 단계적 상승의 결정은 스폰서에 의하여 선행 투여 코호트의 8일차 투여후로부터의 모든 이용 가능한 안전성 정보의 (맹검) 검토 후 데이타 안전성 모니터링 위원회(DSMB)의 추천에 기초하여 이루어질 것이다.
화합물 A의 단일 투여의 안전성 및 내약성이 평가되면, 화합물 A의 복수 투여량의 투여를 평가할 것이다. 실험의 복수 투여량의 부분은 단일 투여량의 코호트로부터 29일차 안전성 데이타의 충분한 검토후 개시할 것이다. 실험의 복수 투여량 부분 중에, 화합물 A는 하기 코호트에 4회의 1주당 1회 투여로서 투여될 것이다:
Figure pct00015
실험의 단일 또는 복수의 투여량 부분으로 후속 코호트에게 투여되는 투여량은 예정된 투여가 실험 참여자에게 위험을 초래할 수 있다는 것을 시사하는 임의의 안전성 또는 내약성 문제가 확인될 경우 감소될 수 있다. 추가적인 투여군은 화합물 A의 관찰된 안전성 및 내약성 프로파일 또는 비임상 독성학 실험으로부터의 독성동태학 및 안전성 프로파일에 기초한 안전한 노출 한계 내에서 유지하면서 약물동태학 데이타가 예상되는 투여량보다 높은 것을 허용하는지의 여부에 의존하여 실험에 추가될 수 있다. 실험은 미국에서 약 4개의 지역에서 실시될 것이다. 약 60명의 대상체는 본 시험에 참여하도록 무작위로 추출될 것이다.
통계적 방법
이는 화합물 A의 안전성 및 내약성을 평가하는 1차 목적을 갖는 1상 실험이다. 화합물 A의 약물동태학 및 약물동력학은 2차 및 탐구 종점으로서 평가될 것이다. 각각의 투여 코호트의 제안된 크기는 화합물 A의 안전성 및 내약성의 평가를 허용하며, 더 높은 투여량의 투여로 진행되기 이전에 임의의 잠재적인 안전성 시그날 또는 투여량 제한 독성을 확인하기에 충분한 정보를 제공하도록 선택하였다. 안전성 및 내약성은 치료로 인한 이상 사례(TEAE), 심각한 유해 사례, 임상 실험실 테스트 결과, 활력 징후 측정 및 심전도(ECG) 소견을 요약하여 평가될 것이다. 화합물 A의 안전성 또는 내약성을 평가하기 위하여 공식적인 통계학적 테스트는 실시하지 않을 것이다.
모든 PK 샘플은 LC-MS/MS에 의하여 인증된, 민감한 특정한 방법을 사용하여 분석될 것이다. 시점에 의한 및 처치군에 의한 혈장 농도에 대한 기술 통계학은 관찰 횟수, 산술 평균, 표준 편차, 산술 변동 계수(% CV), 기하 평균, 중간값, 기하 % CV, 최소값 및 최대값을 포함할 것이다. 비구획 방법을 사용하여 혈장 농도 대 시간 데이타는 Cmax, Cmax/투여, Tmax, AUC0 -t, AUC0 -t/투여, AUC0 -∽, AUC0 -∽/투여, λz, 말단 t½, CL/F 및 Vz/F의 PK 파라미터를 유도하는데 사용될 것이다. 처치군에 의한 PK 파라미터에 대한 기술 통계학은 관찰 횟수, 산술 평균, 표준 편차, 산술 변동 계수(% CV), 기하 평균, 중간값, 기하 % CV, 최소값 및 최대값을 포함할 것이다. 투여량 비례성을 탐구할 것이다.
화합물 A의 약물동력학(PD)은 WOMAC에 의하여 평가된 바와 같은 PIIANP, CTX-II, 통증 및 신체 기능을 포함한 수개의 탐구 종점 및 MR 영상화 데이타를 조사하여 평가될 것이다. 상기 종점에 대한 전처리 값은 전처리 측정과 비교할 것이며, 기준선으로부터의 절대값 및 퍼센트 변화 둘다를 요약할 것이다. 시점에 의한 및 처치군에 의한 PD 종점에 대한 기술 통계학은 관찰 횟수, 산술 평균, 표준 편차, 산술 변동 계수(% CV), 중간값, 최소값 및 최대값을 포함할 것이다. PK/PD 종점의 탐구 분석도 또한 수행될 수 있다.
실험 처리
본 실험의 경우, 조사 생성물은 화합물 A 또는 부합하는 플라시보이다. 화합물 A 또는 플라시보는 하기 투여량 레벨에서 단일 투여 코호트에게 투여될 것이다:
·IA 주사당 50 ㎍
·IA 주사당 100 ㎍
·IA 주사당 200 ㎍
·IA 주사당 400 ㎍
화합물 A 또는 플라시보는 1주당 1회로 4 주 동안 하기 투여 레벨에서 복수의 투여 코호트에게 투여될 것이다:
·IA 주사당 100 ㎍
·IA 주사당 200 ㎍
·IA 주사당 400 ㎍
화합물 A는 멸균 용액으로서 1 ㎖당 200 ㎍의 농도로 호박색 유리 바이알에 공급될 것이다. 부합하는 플라시보는 동일한 바이알 내에서 제공될 것이다. 각각의 바이알은 5 ㎖의 화합물 A 또는 플라시보를 함유할 것이다. 바이알은 실험 지역으로의 수송을 위하여 박스에 포장될 것이다. 연구 생성물(IP) 라벨은 프로토콜 번호, 내용물, 로트 번호, 저장 조건 및 연구 용도 주의 설명을 포함할 것이다.
투여
화합물 A 또는 플라시보는 관리 시술의 표준에 따라 초음파 안내된 관절내 주사에 의하여 부위에서 투여될 것이다. 화합물 A 또는 플라시보는 연구 책임자 또는 약제를 무릎 관절에 전달하기 위한 허용된 기술을 훈련받은 또 다른 자격 있는 의사에 의하여 투여되어야 한다. 화합물 A 또는 플라시보의 투여 중에 엄격한 무균 주사 기술을 사용하여야만 한다. 의사는 그의 전문적인 판단을 사용하여 개개의 대상체에 대한 최선의 접근 및 주사 부위를 선택하여야만 한다.
연구 생성물의 주사 이전에 과잉의 유체는 무릎으로부터 흡입시켜야만 한다. 초음파를 사용하여 시술을 안내하여야만 한다. 의사는 실험에 대한 종료 방문 때까지 바늘 위치를 기록하는 초음파 영상을 저장하여야만 한다. 각각의 주사는 5 ㎖의 화합물 A 또는 플라시보로 이루어질 것이다. 대상체는 화합물 A 또는 플라시보를 수용한 후 힘든 활동을 피하고, 부위에 사용된 표준 주사후 관리 지침에 따라 통증을 관리하도록 권고하여야만 한다. 국소화된 통증을 특징으로 하는 주사후 발적은 관절내 무릎 관절 주사 수시간 내에 발생할 수 있다. 이는 일반적으로 48 시간 이내에 해결된다. 주사후 발적의 임의의 경우는 유해 사례로서 보고되어야 한다.
실시예 9: 무릎의 골관절염을 갖는 환자에서 화합물 A의 관절내 주사
연골 복원을 촉진하기 위하여 골관절염을 갖는 것으로 진단된 환자의 무릎에 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 관절내 주사에 의하여 투여한다. 환자는 화합물 A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 1회 주사 또는 복수의 주사를 맞으며, 1회 처치될 수 있거나 또는 규칙적인 기준(3 개월마다 1회, 6 개월마다 1회, 9 개월마다 1회 또는 1년에 1회)으로 처치를 받을 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 투여는 5 주 이하 동안 매주 실시한다.
실시예 10: 래트 내측 반월상연골 파열 모델에서 화합물 A의 투여 빈도의 효과
시약 및 기기
화합물 A에 사용된 비히클은 pH 7.8에서의 3% PEG3350, 0.5% 트윈(Tween)80, 30 mM 인산나트륨 완충제이다. 비히클을 별도로 생성한 후, 화합물 A 분말의 분액에 첨가하고, 혼합물이 맑은 용액이 될 때까지 와류 처리한다. 투여 용액은 3.5 및 0.35 ㎍/㎏(100 μM 및 10 μM 각각)의 투여에 대하여 생성하였다. 투여 부피는 30 ㎕/무릎으로 설정하였다. 투여 용액은 매주 새로이 생성하였다.
동물 모델
14 주령의 루이스 래트 수컷(찰스 리버(Charles River), 미국 뉴욕주 킹스턴 소재)은 실험의 시작에서 300-320 g의 체중 범위에 있었다.
유지 조건
동물을 음식(표준 설치류 사료, 피코랩(Picolab) 설치류, 뉴코(Newco)) 및 물로의 접근이 자유로운 일회용 마이크로아이솔레이터(이노바이브(Innovive), 이노케이지(Innocage) IVC 래트 케이지) 내에서 쌍을 이루어 가두었다. 동물을 12 h:12 h 광 주기(6 am으로부터 6 pm)에서 70-72℉의 온도 범위 및 40% 내지 69%의 습도 범위로 하우징 룸에서 실험 등록전 1 주 동안 시설에 적응하도록 하였다.
수술
래트를 체중에 기초하여 15 마리 래트의 실험군 8개로 분류하였다. 래트를 수술하고, 1 주에 걸쳐 시차를 둔 방식으로 등록하였다(6 일 동안 1일 20 마리 동물 등록). 간략하게, 동물을 케타민/자일라진 칵테일(각각 50 ㎎/㎏ 케타베드(Ketaved) - 헨리 셰인(Henry Schein) 및 5 ㎎/㎏ 자일라진(Xyalzine) - 아니세드(AniSed))로 복강내 주사에 의하여 마취하고, 적절한 진통제(플루닉신(Flunixin), 5 ㎎/㎏ 피하 주사)를 투여하고, 수술 부위를 면도하고, 소독하였다. 작은 절개를 내측 우측 뒤 무릎 상에 만들어 측부 인대를 노출시켰다. 측부 인대를 절단하고, 내측 반월상연골을 노출시키기에 충분하게 관절낭을 개방하였다. 반월상연골을 완전히 절단한 후, 피부 절개를 닫고, 상처에 압력을 가하여 혈종 생성을 방지하였다. 동물을 가열된 담요 위에서 회복하게 하고, 그의 홈 케이지로 돌려보냈다. 샴(sham) 시술은 내측 반월상연골을 절단하지 않은 것을 제외하고, 유사한 방식으로 실시하였다. 모든 수술 시술은 무균 상태로 실시하였으며, 모든 시술은 인스티튜트 IACUC에 의하여 승인되었다. 동물을 투여 전 수술후 관리를 위하여 그 다음 1 주 동안 매일 모니터링하였다. 비정형적 치유(타박상/혈종)를 갖는 임의의 동물은 실험으로부터 배제시키고, 여분의 동물로 대체하였다.
동물을 하기 군으로 등록하였다:
처치군
A. 비히클, 1주당 1회 투여함
B. 화합물 A 3.5 ㎍/㎏; 1.05 ㎍/무릎(100 μM), 1주당 1회 투여함
C. 화합물 A 3.5 ㎍/㎏; 1.05 ㎍/무릎(100 μM), 격주로 투여함
D. 화합물 A 3.5 ㎍/㎏; 1.05 ㎍/무릎(100 μM), 1회 투여함
E. 화합물 A 0.35 ㎍/㎏; 0.105 ㎍/무릎(10 μM), 1주당 1회 투여함
F. 화합물 A 0.35 ㎍/㎏; 0.105 ㎍/무릎(10 μM)), 격주로 1회 투여함
G. 화합물 A 0.35 ㎍/㎏; 0.105 ㎍/무릎(10 μM), 1회 투여함
H. 샴
Figure pct00016
동물을 매주 투여시(8-10 am) 계량하고, 비히클 또는 화합물의 30 ㎕의 표준화된 투여량을 상기 상술된 섭생(군 A, B, E 및 H 1주당 1회 투여함, 군 C 및 F 격주로 투여함 및 군 D 및 G 실험 기간 중 1회 투여함)에 따라 주사에 의하여 관절내 공간에 투여하였다. 27G 니들이 부착된 해밀톤(Hamilton) 주사기를 사용하여 동물에게 투여하였다. 실험 28일차에 동물을 안락사시키고, 말단 혈액 샘플을 수집하고, 무릎을 수거하고, 조직학 분석 및 병리학 스코어링을 위하여 포르말린 병에 넣었다.
데이타 분석 및 통계학적 방법
무릎 관절 조직학의 분석은 볼더 바이오패쓰(Bolder BioPATH)에 의하여 수행하였다. 병변을 특징화하는 각종 측정을 수행하여 병변 깊이, 중증도 및 전체 크기에 기초하여 관절의 스코어를 매겼다.
결과
실험 전반에 걸쳐 동물은 임의의 투여 스케쥴(1주당 1회, 격1주당 1회, 실험당 1회)에서 또는 테스트한 임의의 투여 농도(100 μM 또는 10 μM)에서 화합물 A의 치료로 유해 효과를 나타내지 않았다. 조직학적 분석은 10 μM(0.35 ㎍/㎏; 0.105 ㎍/무릎)의 화합물 A의 처치는 1주당 1회 또는 격주 1회로 투여시 실질적인 연골 퇴행 폭에서의 호전과 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다(도 1: 루이스 래트에게 100 μM(3.5 ㎍/㎏; 1.05 ㎍/무릎) 또는 10 μM(0.35 ㎍/㎏; 0.105 ㎍/무릎)에서의 화합물 A의 투여를 1주당 1회, 격주당 1회 또는 실험 기간 전체 동안 1회 투여하였다. 실험 종료시 무릎을 수거하고, 구획화를 위하여 고정시켰다. 연골 병변의 폭 및 깊이를 측정하고, 스코어를 매겼다. 연골의 50% 초과가 절충되거나 또는 소실되는 병변의 폭을 그 위에 플롯하였다. n=10-15 마리 동물/군,
Figure pct00017
p<0.05 스튜던트 t-테스트 대 비히클). 실질적인 연골 퇴행은 연골 깊이의 50% 초과의 연골세포 및 프로테오글리칸 손실을 반영한다. 통계적으로 유의하지는 않지만, 화합물 A로 처치는 질환 진행으로 인하여 구조 변경이 발생하는 가장 심각한 연골 병변에서의 호전에 대한 경향을 초래하였다. 게다가, 연골 퇴행에서의 중증도 결과의 범위(최소 내지는 중증의 연골 손상 범위)의 조사시, 격주 1회로 10 μM에서 투여된 화합물 A(0.105 ㎍/무릎)는 온화 내지 중증의 스코어로 조합된 연골 퇴행 폭에서의 통계적으로 유의한 호전을 나타냈다(도 2: 루이스 래트에게 100 μM(3.5 ㎍/㎏; 1.05 ㎍/무릎) 또는 10 μM(0.35 ㎍/㎏; 0.105 ㎍/무릎)에서의 화합물 A의 투여를 1주당 1회, 격주당 1회 또는 실험 기간 전체 동안 1회 투여하였다. 실험 종료시 동물을 안락사시키고, 무릎을 수거하고, 조직학을 위하여 고정시켰다. 경골 고평부의 연골에서의 병변은 접안 마이크로미터를 사용하여 측정하였으며, 최소(<10% 손상됨), 온화함(11-25%), 중등도(25-50%), 현저함(51-75%) 및 중증(76-100%)의 병변의 중증도에 기초하여 스코어를 매겼다. 스코어를 매기면, 경골 고평부의 폭을 측정하고, 연골의 전체 폭에 대한 손상된 연골의 비를 계산하고, 제시한다. 군당 n=10-15 마리 동물. *p<0.05 ANOVA(Dunn's 사후 검정) 대 비히클.
Figure pct00018
p<0.05 스튜던트 t-테스트 대 비히클). 10 μM에서 화합물 A의 매주 투여(0.105 ㎍/무릎)는 또한 온화 내지 중증 퇴행 폭에서 감소되는 경향을 나타냈다.
본 실험의 목적은 골관절염의 래트 모델에서의 맥락에서 화합물 A에 대한 다양한 투여 빈도를 탐구하고자 하였다. 설치류 무릎에서의 관절내 주사는 작은 관절로의 주사에서의 크기 및 부피 제한을 고려하면 도전적이며, 침습적일 수 있다. 몇몇 시점에서, 주사 과정 그 자체는 너무 자주 실시하면 대퇴/경골 골 표면에 대한 주사기 끝으로부터의 주사 부위에서의 증가된 염증 또는 잠재적인 의인 손상을 초래할 수 있다. 이는 관절의 부기를 야기하며, 체중 지지에서의 감소 및 무릎 전체의 사용의 방지를 잠재적으로 초래한다. 골관절염의 수술 모델은 모노요오도아세테이트 모델과 같은 관절 질환을 유발하는 화학적 방법과 달리 연골 손상이 발생하며, 퇴행성 병변이 형성되는 발병된 관절을 사용하는 동물에 의존한다. 그러므로, 결과의 해석을 혼란스럽게 하는 관절 그 자체의 과도한 조작을 피하면서 최적량의 화합물의 전달 사이의 균형을 찾아야만 한다. 본 실험에서, 동물에게 화합물 A의 2종의 농도로 1주당 1회, 격주 1회 및 4 주 실험 기간 동안 1회 투여한다. 화합물 A를 선택한 2회의 투여량의 더 낮은 용량으로 격주로 투여시 최적의 효능이 나타났다. 이는 1주당 투여가 상기 모델에서 관절의 지나친 조작이 될 수 있다는 것을 시사한다. 대조적으로, 4주당 1회 투여는 상기 모델에서 연골 퇴행의 질행에 대한 효과를 입증하지 않았다. 격주 1회의 투여는 연골의 10% 초과가 손상되거나 또는 소실되는 연골 병변의 폭에서의 상당한 감소를 나타냈다. 추가적으로, 화합물 A의 효과는 대부분 연골의 50% 초과가 소실된 가장 중증인 연골 결함에서 호전을 나타냈다. 이는 병변의 영역이 연골세포 밀도(50% 미만의 정상 세포 밀도)가 결여되어 있으며, 여기서 화합물 A는 연골세포 증식을 촉진하거나 또는 연골세포 손실을 방지하는 것을 도울 수 있다는 것은 고무적이다. 수술로 유발된 골관절염의 설치류 모델에서, 화합물 A는 관절내 2주당 1회 투여시 최대의 효능을 가졌다.
실시예 11: 래트 내측 반월상연골 파열 모델에서의 화합물 A의 투여량 범위 실험
시약 및 기기
화합물 A에 대한 비히클은 pH 7.8에서의 3% PEG3350, 0.5% 트윈80, 30 mM 인산나트륨 완충제이다. 비히클을 별도로 생성한 후, 화합물 A 분말의 분액에 첨가하고, 혼합물을 와류 처리하여 맑은 용액이 되었다. 투여 용액은 30 μM 내지 0.3 μM 범위 내의 투여를 위하여 생성하였다. 투여 부피는 30 ㎕/무릎으로 설정하였다. 투여 용액은 각각의 투여에 대하여 새로 생성하였다. 투여 용액은 실험 종료시 확인하였다. 양성 대조군 화합물 FGF-18 스톡을 제조업자의 지시사항에 따라 5 mM 트리스(Tris), pH 8.0 중에서 재구성하였다. FGF-18 스톡을 염수 중에서 0.167 ㎎/㎖의 최종 농도로 추가로 희석하였다. 새로운 희석은 주사시 1주당 2회 생성하였다.
동물 모델
14 주령의 루이스 래트 수컷(찰스 리버, 미국 뉴욕주 킹스턴 소재)은 285-327 g의 체중 범위 내에 있었다.
유지 조건
동물을 음식(표준 설치류 사료, 피코랩 설치류, 뉴코) 및 물로의 접근이 자유로운 일회용 마이크로아이솔레이터(이노바이브, 이노케이지 IVC 래트 케이지) 내에서 쌍을 이루어 가두었다. 동물을 12 h:12 h 광 주기(6 am으로부터 6 pm)에서 70-72℉의 온도 범위 및 40% 내지 69%의 습도 범위로 하우징 룸에서 실험 등록전 1 주 동안 시설에 적응하도록 하였다.
수술
래트를 체중에 기초하여 15 마리 래트의 실험군 8개로 분류하였다. 래트를 수술하고, 1 주에 걸쳐 시차를 둔 방식으로 등록하였다(6 일 동안 1일 20 마리 동물 등록). 동물을 케타민/자일라진 칵테일(각각 50 ㎎/㎏ 케타베드 - 헨리 셰인 및 5 ㎎/㎏ 자일라진 - 아니세드)로 복강내 주사에 의하여 마취하고, 적절한 진통제(플루닉신, 5 ㎎/㎏ 피하 주사)를 투여하고, 수술 부위를 면도하고, 소독하였다. 작은 절개를 내측 우측 뒤 무릎 상에 만들어 측부 인대를 노출시켰다. 측부 인대를 절단하고, 내측 반월상연골을 노출시키기에 충분하게 관절낭을 개방하였다. 반월상연골을 완전히 절단한 후, 피부 절개를 닫고, 상처에 압력을 가하여 혈종 생성을 방지하였다. 동물을 가열된 담요 위에서 회복하게 하고, 그의 홈 케이지로 돌려보냈다. 샴 시술은 내측 반월상연골을 절단하지 않은 것을 제외하고, 유사한 방식으로 실시하였다. 모든 수술 시술은 무균 상태로 실시하였으며, 모든 시술은 인스티튜트 IACUC에 의하여 승인되었다. 동물을 투여 전 수술후 관리를 위하여 그 다음 1 주 동안 매일 모니터링하였다. 비정형적 치유(타박상/혈종)를 갖는 임의의 동물은 실험으로부터 배제시키고, 여분의 동물로 대체하였다. 동물을 하기 군으로 등록하였다:
처치군
A. 비히클, 격주로 1회 투여함
B. 화합물 A 1.05 ㎍/㎏; 0.315 ㎍/무릎(30 μM), 격주로 1회 투여함
C. 화합물 A 0.35 ㎍/㎏; 0.105 ㎍/무릎(10 μM), 격주로 1회 투여함
D. 화합물 A 0.105 ㎍/㎏; 0.0315 ㎍/무릎(3 μM), 격주로 1회 투여함
E. 화합물 A 0.35 ㎍/㎏; 0.0105 ㎍/무릎(1 μM), 격주로 1회 투여함
F. 화합물 A 0.0105 ㎍/㎏; 0.00315 ㎍/무릎(0.3 μM), 격주로 1회 투여함
G. FGF-18(5 ㎍/주사), 1주당 2회 투여함
H. 샴
Figure pct00019
동물을 매주 투여시(9 am-12 pm) 계량하고, 30 ㎕의 비히클 또는 화합물의 표준화된 투여량을 상술된 섭생에 따라 관절내 공간으로 주사에 의하여 투여하였다. 군 A-F 및 H에게 격주로 1회 투여하였으며, 군 G에게 실험 기간 전체에 걸쳐 1주당 2회 투여하였다. 27G 니들이 부착된 해밀톤 주사기를 사용하여 동물에게 투여하였다. 실험 28일차에 동물을 안락사시키고, 말단 혈액 샘플을 수집하고, 무릎을 수거하고, 조직학 분석 및 병리학 스코어링을 위하여 포르말린 병에 넣었다.
데이타 분석 및 통계학적 방법
무릎 관절 조직학의 분석은 볼더 바이오패쓰에 의하여 수행하였다. 각종 측정을 수행하여 병변 깊이, 중증도 및 전체 크기에 기초하여 관절의 스코어를 매겼다.
결과
실험 전반에 걸쳐 동물은 테스트한 임의의 투여량(30, 10, 3, 1, 0.3 μM)에서 화합물 A의 치료로 유해 효과를 나타내지 않았다. 30 μM의 투여에서의 화합물 A의 처치(0.315 ㎍/무릎)는 비히클 처치된 동물과 비교시 대퇴골을 제외하고 총 관절 점수를 크게 개선시켰다(도 3: 루이스 래트에게 30 μM(1.05 ㎍/㎏; 0.315 ㎍/무릎) 내지 0.3 μM(0.0105 ㎍/㎏; 0.00315 ㎍/무릎)에서의 화합물 A의 투여를 실험 기간 전체 동안 격주당 1회 투여하였다. 실험 종료시 동물을 안락사시키고, 무릎을 수거하고, 조직학을 위하여 고정시켰다. 관절 스코어는 골증식체 스코어와 조합한 경골 퇴행 스코어(연골 병변의 측정에 기초함)의 합을 반영한다. * p<0.05 크루스칼 왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트(Dunn's 사후 검정) 대 비히클.
Figure pct00020
p<0.05 스튜던트 t-테스트 대 비히클). 대퇴골을 제외한 총 관절 점수는 연골 퇴행을 포함하며, 골증식체는 발병된 경골 전체에 걸쳐 스코어를 매겼다. 화합물 A의 30 μM 투여에 대한 호전 정도는 양성 대조군 참조 화합물인 FGF-18과 동등하였다.
본 실험의 목적은 골관절염의 래트 모델에서 화합물 A의 유효 투여량을 구하기 위함이었다. 관절내 주사에 의하여 30 μM(0.315 ㎍/무릎)로부터 0.3 μM(0.00315 ㎍/무릎) 범위 내의 화합물 A의 투여량으로 격주로 1회 투여하였다. 효능은 30 μM(0.315 ㎍/무릎) 투여에서 입증되었으며, 대퇴골을 제외한 총 관절 점수에서 상당한 호전이 있었다. 본 실험의 결과는 OA의 설치류 모델에서 격주로 1회 투여시 화합물 A의 30 μM(0.315 ㎍/무릎)의 투여량으로 상당한 효능이 발생하였다는 것을 나타낸다.
실시예 12: 골관절염의 개 모델에서의 화합물 A의 효능
화합물 A 분말을 함유하는 바이알을 5% PEG300 중에서 가용화시키고, 와류 처리하여 맑은 용액이 되었다. 이 용액에 95% 염수를 최종 투여 농도(0.0696 ㎎/㎖-200 μM)로 첨가하였다. 그 후, 맑은 용액을 관절내 투여 전 0.45 ㎛ 필터에서 여과하였다. 투여 용액은 투여 당일에 새로 생성하였다.
바이오분석 방법
아세토니트릴, 물(옵티마(Optima), LC/MS 등급) 및 포름산, 99+%(옵티마, LC/MS 등급)를 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)으로부터 구입하였다. 대조군 스프라그 돌리 래트 암컷 혈장(나트륨 헤파린, 0.2μ 여과함)은 바이오레클라메이션(Bioreclamation) IVT로부터 구입하였다. 크로마토그래피 HPLC 컬럼, 루나, 5 ㎛ C18 (2), 50×2.0 ㎜ 및 그의 가드 안전 카트리지 및 홀더는 페노메넥스로부터 구입하였다. HPLC(1100 시리즈)는 아질런트로부터 구입하였다. 질량 분광계, API 3000은 사이엑스(SCIEX)로부터 구입하였다.
분리는 역상 C18 컬럼 상에서 물 중의 0.1% 포름산(A) 및 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산(B)의 이동상을 0.6 ㎖/min에서의 유속으로 사용하는 구배 용출로 수행하였다. 이온화는 화합물 A 및 내부 표준 카르토게닌(Kartogenin) 둘다에 대하여 네가티브 모드(ESI-)로 전기분무를 사용하여 달성하였다. 다중 반응 모니터링(MRM)은 약물 정량화에 사용하였다. 전구체 대 생성물 이온 전이는 347.0>268.9 (m/z)이었다. 내부 표준 카르토게닌에 대한 MRM은 316.0>272.0 (m/z)이었다.
래트 혈장 중의 화합물 A에 대한 표준 곡선의 생성: 화합물 A에 대한 표준 곡선은 래트 대조군 혈장 중의 화합물 A 레벨을 스파이크 처리하여 래트 혈장 중에서 생성하였다. 보정 표준 곡선은 래트 혈장 중에서 1.53 내지 781.3 ng/㎖ 범위 내로 생성하였다. 표준 및 샘플은 둘다 단백질 침전(저온 아세토니트릴 중의 250 ng/㎖에서의 내부 표준, 카르토게닌 또는 KGN 사용) 및 원심분리에 의하여 생성하였다. 그 후, 상청액을 물 용매 중의 0.1% 포름산으로 희석하고, LC-MS-MS 시스템 상에 주입하였다.
동물 모델
12 내지 15 주령의 나이브 비이글 도그 암컷은 5.4 내지 9.3 킬로그램의 체중 범위로 마샬 바이오리소시즈(Marshall BioResouces)(미국 뉴욕주 노쓰 로즈 소재)로부터 구입하였다.
유지 조건
모든 개를 실험 개시 전 31 일 동안 시설에서 순응시켰다. 일반 건강 및 체중에 대하여 실험 등록하기 전에 동물을 사전선별하였다. 모든 동물은 등록시 건강하였다. 동물을 우리당 5 마리의 동물로 우리에 12 시간 광/12 시간 암 주기(6 am/6 pm)로 가두었다. 실내를 1 시간당 10회 초과로 공기 교체로 적어도 60% 새로운 공기로 환기시켰다. 실온을 ASI에 의하여 지시된 SOPs에 따라 유지하였다. 개에게 음식(프로랩(ProLab): 애니멀 다이어트(Animal Diet) 5006) 및 물(염소 처리한 도시 수도물)로 자유로이 접근하게 하였다. 급식 스케쥴에 대한 유일한 예외 사항은 마취 전 금식 기간 동안이었다.
수술
수술적 중재 이전에, 비이글 암컷을 수일 동안 관찰하여 행동 경향(활발한 활동, 무기력 등)을 결정하였다. 목적은 통제된 운동 중이 아니면서 활동 수준 및 관절 사용이 군 사이에서 균일하도록 행동 특징이 모든 군에서 공유되도록 분류 및 확인하기 위함이다. 기질에 의한 분류 이외에, 동물을 또한 체중에 의하여 분류하였으며, 실험 군 사이에 균일하게 분류하였다. 동물을 실험 개시 전 1 시간의 걷기/달리기/놀이의 정확한 관리에 순응하였다.
동물을 하기 3개의 군으로 등록하였다:
Figure pct00021
수술 전 동물에게 금식시키고, 프로포폴(6 ㎎/㎏, IV)로 마취하고, 산소 중의 이소플루란(3-4%)(2 ℓ/min)으로 시술 기간(10-15 분) 동안 유지하였다. 오른쪽 뒤 무릎을 면도하고, 무균 상태로 만들었다. 내측 피부 절개를 만들어서 측부 인대를 노출시켰다. 내측 반월상연골의 일부를 절단하였다(내측 반월상연골 폭의 대략 절반의 쐐기 모양의 것을 제거하였다). 관절낭 및 피하조직을 봉합사로 닫고, 피부를 상처 클립으로 닫았다. 샴 동물은 내측 반월상연골 부분 횡단을 제외하고, 동일한 방식으로 처치하였다. 모든 동물을 투여 전 10-11 일 동안 회복하도록 하였다. 수술 후 3 일에 모든 동물을 1 시간의 연속 운동(걷기/달리기/놀기)의 정확한 관리를 시작하여 동물이 수술받은 다리를 사용하는 것을 확인하며, 상이한 기질의 개의 군에서 병변의 더욱 균일한 형성을 허용하였다.
모든 동물은 실험 기간 동안 1주당 5일 1 시간 동안 운동하였다. 실험 10/11일차에 동물은 매주 화합물의 또는 비히클의 주사를 수술받은 관절에 받기 시작하였다. 혈액 샘플을 또한 화합물 결정을 위하여 모든 동물에게 사전 투여하였다. 동물에게 수술후 10, 17, 24, 31, 38 및 45일차에 투여하였다. 모든 관절내 투여는 관절낭에 주사에 의하여 무릎 인대를 통하여 0.5 ㎖ 주사로 표준화하였다. 동물의 서브세트에서, 최종 투여 PK를 수행하고, 여기서 동물에게 투여하고, 투여후 0.5, 1, 2, 4, 8, 12 및 24 시간에 혈액 샘플을 수집하였다. 요약 데이타는 하기 표 11에 제시한다.
표 11 - 0.035 ㎎/무릎의 화합물 A의 관절내 주사로 처치한 동물의 최종 투여 PK
Figure pct00022
비이글 암컷은 내측 반월상연골 파열 수술을 받아서 골관절염을 유발하였다. 동물을 비히클 또는 화합물 A로 0.035 ㎎/무릎(200 μM) 투여량으로 주당 1회 관절내 주사로 처치하였다. 실험은 6 주 동안 지속하였으며, 6회차 투여 후 화합물 A를 투여한 동물은 PK 특징화를 위하여 최종 일차에 샘플링하였다. 상기 제시된 데이타는 IA 투여 후 혈장 노출에 대한 요약 데이타이다. (a) AUC0-2=투여 개시(0)로부터 2 시간인 최종 정량화 가능한 시점(τ)까지의 혈장 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUC)이었다. ㎍/동물로 나타냈다.
52일차에 동물은 말단 혈액 샘플을 수용하고, 안락사시켰다. 혈장 샘플을 바이오마커 측정에 사용하였다. 소변 및 윤활액을 사체해부시 수집하고, 무릎을 조직학 및 병리학 분석을 위하여 수거하였다.
데이타 분석 및 통계학적 방법
조직학적 처리 및 구획화를 히스토톡스 랩스, 인코포레이티드(HistoTox Labs, Inc.)에서 수행하고, 슬라이드를 볼더 바이오패쓰에서 판독하였다. 골관절염 병변은 병변 크기, 깊이, 경중도 및, 연골하 골 및 골증식체 형성에서의 변화에 기초하여 스코어를 매겼다. 반월상연골 절단의 어느 한 측 상의 대퇴골 및 경골 둘다를 조사하였다. 통계학적 분석은 스튜던트 양측 테스트 또는 맨-휘트니(Mann-Whitney) U 테스트(비모수)를 사용하였다.
말단 혈장 샘플의 경우, 바이오마커 ELISA를 실시하여 PIINP의 레벨을 정량화하였다. 키트 절차는 제조업자의 지시사항에 따라 수행하였다. 데이타를 스튜던트 t-테스트로 분석하였다.
결과
조직학적 스코어링은 총체적 형태학적 스케일로 또는 전방/후방 깊이(레벨 1-3) 또는 경골 고평부 또는 대퇴 관절돌기의 외부/내부 측면(구역 1-4)에 의한 대퇴골 또는 경골의 측면을 조사하여 실시하였다. 상기 분석의 도식은 도 4에 도시하며, 여기서 대표적인 비히클 처치한 무릎을 인디아(India) 잉크로 수거후 염색하고, 촬영하여 개에 존재하는 병변을 예시하였다. 경골 병변을 조사하고, 연골 퇴행 스코어(중증도에 기초함)를 할당하고, 각종 구역 및 레벨에서 연골 병변 깊이(연골 층의 총 깊이에 대한 손상된 연골의 깊이의 비로 나타냄)에 대하여 측정하였다(도 4에 나타냄). 대퇴 병변을 수개의 횡단 레벨로부터 풀링된 데이타를 사용하여 유사한 방식으로 스코어를 매겼다(도 5: 비이글 암컷은 샴 또는 내측 반월상연골 파열 수술을 하여 골관절염을 유발하였다. 비히클 또는 화합물 A를 6 주 동안 1주당 1회 투여한 후, 동물을 안락사시키고, 조직학을 위하여 무릎을 수거하였다. 대퇴 및 경골 병변을 측정하고, 50% 초과의 연골 손실 또는 손상을 나타내는 병변 내의 영역으로서 정의되는 실질적인 대퇴 퇴행으로 스코어를 매겼다. 병변의 전체 폭을 플롯하고, 실질적인 연골 퇴행을 나타내는 병변의 폭을 또한 플롯하였다. n = 군당 9-10마리 비이글. 비히클에 대하여 *p <0.05 및 도 6: 비이글 암컷은 샴 또는 내측 반월상연골 파열 수술을 하여 골관절염을 유발하였다. 비히클 또는 화합물 A를 6 주 동안 매주 투여한 후, 동물을 안락사시키고, 조직학을 위하여 무릎을 수거하였다. 대퇴 병변은 접안 마이크로미터를 사용하여 측정하였다. 전체 연골 층의 깊이에 대한 연골 병변의 깊이의 비를 계산하고, 구역 1-4에 대하여 그 위에 플롯하였다. 화합물 A는 구역 1, 3 및 4에서 대퇴골에서의 연골 병변의 깊이 비 감소에 대하여 상당한 효과를 가졌다. n = 군당 9-10 마리의 비이글. 비히클에 대하여 *p <0.05). 화합물 A는 대퇴골에서 실질적인 연골 퇴행의 정도를 크게 개선시켰으나, 전체 연골 퇴행의 폭에 아무런 효과를 나타내지 않았다(모든 경중도). 이는 화합물 A가 대퇴 연골 병변 중증도에 영향을 미치지만, 전체 연골 크기를 수축시키지 않았다는 것을 나타낸다. 대퇴 병변의 깊이의 보다 상세한 조사는 화합물 A 처치가 다수의 구역 전체에 걸쳐 병변의 깊이에서의 감소와 관련되어 있다는 것을 나타냈다(도 6). 골관절염의 진행에서, 골증식체의 발생은 종종 병변이 존재하는 관절을 안정화시키는 보충적인 효과를 나타낸다. 골증식체는 경골 고평부의 측면 모서리에서의 뼈의 과성장이다. 그러나, 골 경화증의 레벨은 화합물 A로 처치한 동물에서 감소되었다(도 7: 비이글 암컷은 샴 또는 내측 반월상연골 파열 수술을 하여 7 주 실험에 걸쳐 골관절염을 유발하였다. 비히클 또는 화합물 A를 6 주 동안 1주당 1회 투여한 후, 동물을 안락사시키고, 조직학을 위하여 무릎을 수거하였다. 연골하 골의 경화증은 0(경화증이 없는 경우), 1(대퇴골/경골의 폭의 10%가 두꺼워진 골소주를 가짐), 2(폭의 11-30%가 영향을 받음), 3(폭의 31-60%가 영향을 받음), 4(폭의 61-90%가 영향을 받음) 및 5(폭의 >90%가 영향을 받음)의 등급으로 스코어를 매겼다. n = 군당 9-10 마리의 비글. 비히클에 대하여 *p<0.05 ANOVA). 연골하 골의 재형성(경화증)은 또한 기존의 또는 중증의 골관절염의 특징인 사례로서 여겨진다. 혈장 노출은 최종 투여 후 조사하고, 화합물 A는 IA 투여 후 1 시간에 검출되지 않았다(표 1). 말단 혈장 샘플은 바이오마커 측정에 사용하였다. 처치된 바이오마커인 PIINP의 패널 중에서, 새로 합성된 콜라겐 타입 2에 대한 마커(콜라겐 타입 2의 N-말단 서열로부터의 프로-펩티드로부터 유도됨)는 화합물 A로 처치된 개에서 크게 증가되었다(도 8: 비이글 암컷은 샴 또는 내측 반월상연골 파열 수술을 하여 7 주 실험에 걸쳐 골관절염을 유발하였다. 비히클 또는 화합물 A를 6 주 동안 1주당 1회 투여한 후, 동물을 안락사시키고, 말단 혈액 샘플을 수집하였다(말단 샘플은 1 주후 최종 투여이었다). ELISA를 수행하여 혈장 중의 PIINP의 순환 중인 레벨을 검출하였다. n = 군당 9 - 10 마리 비이글. 비히클에 대하여 *p < 0.05 ANOVA).
본 실험의 목적은 개 골관절염의 6 주 모델에서 화합물 A의 효능을 평가하기 위함이다. 화합물 A는 MSC로부터의 연골세포 형성의 추진요인이다. 비이글 암컷은 샴 수술 또는 내측 반월상연골 파열 수술을 하고, 비히클 또는 화합물 A의 1주당 투여를 관절내 주사에 의하여 투여하였다. 모든 동물은 개에서 강하며 균일한 병변 형성을 확인하기 위하여 격렬하게 운동을 시켰다. 무릎의 조직학적 분석은 화합물 A 처치를 받은 동물에서 호전된 것으로 밝혀졌다. 화합물 A로 처치된 동물에서 대퇴골에서의 실질적인 연골 퇴행의 정도에서 상당한 감소가 존재하였다. 화합물 A로 처치한 동물은 또한 덜 중증인 경골 연골 손상을 갖는 것으로 나타났는데, 그러한 효과가 통계적으로 유의적이지는 않았다. 콜라겐 마커 PIINP의 순환중인 레벨에서의 증가와 조합된 상기 데이타는 화합물 A가 연골세포 형성 및 기질 재형성/보존에 영향을 미쳐서 골관절염 결과의 감소를 초래하였다는 것을 시사한다. 병변 스코어링 이외에, 골관절염 병변에 2차적인 말초 효과, 예컨대 연골하 골에서의 변화는 또한 화합물 A 처치시 이로운 효과를 나타냈다. 골증식체(경골 고평부의 측면 모서리에 대한 골 돌출)는 관절염 병변에 2차를 형성하는 보충 관절 안정화 과성장인 것으로 판단된다. 관절을 안정화시키는데 있어서 잠재적으로 이롭기는 하나, 골증식체는 종종 OA 경험자에 대한 고통의 근원이 되며, 관절의 운동 범위를 제한한다. 골증식체 형성 이외에, 연골하 골에서의 변화는 또한 둘다 방사선사진 측정에 의하여 검출될 수 있으므로 임상적으로 관련이 있다. 말기 또는 중증 OA의 더 많은 특징이 있기는 하나, 골 경화증은 연골하 골에서 비가역적인 변화이어서 골 보전성의 상당한 손실로 관절이 더 약하게 된다. 화합물 A 처치는 잠재적으로 상기 처치된 동물에서 나타난 병변 중증도의 감소로 인하여 골 경화증을 개선시켰다. 본 실험은 개 OA의 수술 모델에서 골관절염의 발생에 대한 화합물 A의 상당한 효과를 나타낸다. 처치된 동물은 병변 깊이 및 중증도에서의 감소 및 무처치 동물과 비교시 감소된 골 경화증을 나타냈다. 이는 OA에 대한 잠재적인 치료로서 화합물 A에 대한 가능성을 나타낸다.
실시예 13: 시험관내 FLNA 결합
세포 배양
1차 사람 MSC는 셀 애플리케이션즈(Cell Applications)로부터 구입하였다. hMSC를 중간엽 줄기 세포 확대 배지 중에서 성장시키고, 모든 실험에 대하여 계대(passage) 2 및 8 사이에 사용하였다.
핵 세포 용해물 분할 및 웨스턴 블로팅
hMSC를 화합물 A로 표시된 농도에서 2 시간 동안 처리하고, 빙냉 PBS로 1회 세정하고, 세포 용해 완충제(20 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.1% NP-40, 10% 글리세롤, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일)로 덮고, 얼음 상에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 접시로부터 기계적으로 긁어내고, 가볍게 피펫팅하여 세포 부스러기를 부수었다. 세포 용해물을 2,000 rpm에서 4℃에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 사이토솔 분획으로서 보관하였다. 펠릿을 완충제(20 mM HEPES, pH 7.9, 20% 글리세롤, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일)로 1회 세정하고, 2,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠릿을 핵 추출 완충제(2 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 20% 글리세롤, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일) 중에 현탁시킨 후, 얼음 상에서 ~45 분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 13,000 rpm에서 15 분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상청액을 핵 분획으로서 저장하였다.
단백질을 SDS-PAGE 겔 전기영동을 사용하여 용해시키고, PVDF 멤브레인으로 반건조 블롯팅 세포를 사용하여 옮겼다. 멤브레인을 블로킹 완충제(리코르) 중에 1 시간 동안 실온에서 블로킹한 후, 1차 항체로 블로킹 완충제 중에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 멤브레인을 PBST(0.1% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 포스페이트 완충 염수)로 3회 헹구고, 블로킹 완충제 중의 형광단 접합된 2차 항체로 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, PBST로 적어도 3 회 헹구고, 리-코르 오디세이 CLx 영상계를 사용하여 영상화하였다.
플라스미드 작제 및 단백질 발현
FLNA FC-1 분절 및 친화도 프로브 사이의 시험관내 결합은 상기 기재된 바와 같이 경쟁자로서 화합물 A로 프로브의 농도(0.5 μM)의 50 배의 농도(25 μM)에서 실시하였다.
화합물 A는 시험관내 FLNA로의 결합에서 비오틴-아지드 친화도 프로브와 경쟁한다.
카르토게닌(KGN)의 생물학적 기전은 FLNA와의 후속 상호작용을 확인하는 도구로서 사용되는 비오틴-카르토게닌-아지드(BKA) 친화도 프로브의 합성을 통하여 규명하였다. 그 후, FLNA의 FC-1 분절은 KGN의 결합을 직접 조정하는 것으로 입증되었다. 화합물 A가 그의 기능 성질을 보유하는지를 결정하기 위하여, FLNA FC-1 분절을 BKA로 화합물 A의 부재 또는 존재하에서 인큐베이션하였다. 화합물 A는 프로브가 FLNA의 FC-1 분절로 결합되는 능력을 억제하였다(도 9: FLNA FC-1 분절(10 ㎍/㎖)을 0.5 μM 비오틴-KGN-아지드(BKA)와 함께 25 μM의 화합물 A의 부재 또는 존재하에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, UC 60 ㎚, 30 분 동안 광 가교시키고, 웨스턴 블로팅에 의하여 항비오틴 항체를 사용하여 분석하였다.
화합물 A를 통한 CBFβ 핵 국소화의 유도
종래의 KGN은 CBFβ의 핵 국소화를 증가시키는 것으로 입증되었다. 게다가, 상기 핵 국소화는 연골발생 분화를 시험관내 유도시키기 위하여 KGN을 필요로 하는 것으로 밝혀졌다. CBFβ는 RUNX1로의 결합시 유리질 관절 연골 분화를 촉진시킬 수 있는 임계 전사 보조인자이다. 화합물 A가 그러한 기능을 보유하는지의 여부를 결정하기 위하여, hMSC를 1, 10 및 100 nM 화합물 A인 화합물 A와 함께 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 수집, 세포 용해, 핵 분할 및 웨스턴 블로팅에 의하여 분리하였다. 핵 분획 중의 CBFβ 레벨의 증가는 테스트한 모든 농도에서 화합물 A로 처치 후 나타났다(도 10: 사람 MSC를 화합물 A로 표시된 농도에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 핵 분획을 추출하고, 웨스턴 블로팅에 의하여 항CBFβ 항체를 사용하여 분석하고; 투불린(동일한 핵 분획 중의)을 로딩 대조군으로서 사용하였다).
관절 연골 내의 줄기 또는 선조 세포는 일반적인 유지를 지지하며, 손상 후 조직 복원의 가능한 조정제이다. 화합물 A는 연골 줄기/선조 세포의 성숙한, 건강한 관절 연골세포로의 분화를 촉진하는 저 분자량 임상 후보이며, 발병한 관절로의 직접 주사시 이로울 수 있다. 그러한 보고는 화합물 A 및 필라민 A FC-1 분절 사이의 상호작용 및 연골발생 전사 보조인자 CBFβ의 후속 핵 국소화를 확인한다. 데이타는 화합물 A가 연골세포 분화를 촉진시키기 위하여 모분자인 카르토게닌과 동일한 분자 기전을 표적화한다.
실시예 14: 화합물 A의 시험관내 연골형성
테스트 시스템 및 실험 설계
1차 사람 MSC(40,000)를 96웰 둥근 바닥 세포 배양 플레이트의 각각의 벽에 플레이팅하고, 약하게 원심분리하여 세포가 응집되게 하고, 화합물 A로 표시된 농도(0.1 nM 및 10 μM) 사이에서 7 일 동안 무혈청 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 중에서 처리하였다. RNA를 RNeasy 키트를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 추출하였다. cDNA는 슈퍼스크립트(SuperScript) III 제1가닥 합성 키트를 사용하여 합성하고, 프로테오글리칸 4(PRG4), 성 결정 영역 Y-박스(Box) 9(SOX9) 및 연골-올리고 기질 단백질(COMP)의 전사 레벨은 써모피셔(ThermoFisher)로부터의 택맨(Taqman) 유전자 발현 검정(프로브)을 사용하여 측정하였다.
데이타 분석 및 통계학적 방법
ΔΔCT 방법은 β-액틴을 정규화 대조군으로서 사용하고, ViiA 7 RUO 소프트웨어(써모피셔)를 사용하여 각각의 유전자의 상대적 풍부도를 계산하는데 적용하였다. 각각의 샘플의 각각의 유전자의 풍부도는 DMSO-처치된 대조군에 대한 배율로서 나타냈다. n=3. 각각의 마커 유전자에 대한 투여 반응은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 7 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
결과
투여 반응(0-10 μM)에서 7 일 동안 화합물 A로 1차 사람 MSC의 처치, mRNA의 단리, 역전사 및 qPCR에 이어서, DMSO 단독으로 처치한 세포에 대한 증가 배율을 계산하였다. PRG4의 경우 12-1,000 nM 화합물 A에서 2 배 초과의 증가(EC50~3.9 nM)가 보고되었으며, COMP의 경우 12-1,000 nM에서 3 배 증가(EC50~4.5 nM)가 보고되었으며, SOX9의 경우 4-1,000 nM에서 4 배의 증가(EC50~2.2 nM)가 보고되었다(표 12).
표 12. 화합물 A로 7일 처치후 연골-관련된 유전자의 유도(증가 배율)
Figure pct00023
화합물 A는 MSC의 관절 연골세포로의 분화를 촉진한다. 정량적 RT-PCR을 사용하면 데이타는 화합물 A가 연골세포 분화의 중요 전사 인자를 3 내지 4배로 및 2개의 연골 세포외 단백질(PRG4 및 연골 올리고머 기질 단백질)을 2 내지 3배로 유도시키는 능력을 입증한다. 상기 데이타와 함께 화합물 A가 선조 세포로부터 연골세포 분화를 유도시키는 능력을 확인한다.
실시예 15: 약물동력학 실험
단일 투여 실험
실시예 15a: 래트에서 관절내 단일 투여 약물동태학 실험
무릎 관절 및 혈장 노출은 래트(N=2)에서 화합물 A의 단일 IA 투여(30 ㎕의 100 μM 용액[(디메틸 술폭시드/멸균 염수 비히클) 또는 1.05 ㎍/무릎]) 후 측정하였다. 주사한 전체 무릎은 투여 직후 및 투여후 30, 60 및 120 분에 수거하였다. 혈장 샘플은 또한 동일한 시점에서 수집하였다. IA 주사 직후 무릎에서의 화합물 A 농도는 925.5 ng/㎖이었으나, 120 분에서 LLQ 미만으로 떨어졌다. 화합물 A의 혈장 농도는 33.9(hr*ng/㎖)의 평균AUC(0-inf) 및 53.3 ng/㎖의 평균 Cmax 및 0.481 시간의 t1/2이었다.
실시예 15b: Crl:CD(SD) 래트에서 관절내 급성 독성 실험
화합물 A의 혈장 독성동태학 프로파일은 Crl:CD(SD) 래트 수컷에서 단일 IA 투여 후 측정하였다. 화합물 A를 래트 수컷(5 마리/군)에게 0(비히클: 멸균수 중의 1% 에탄올, 10% PEG3350, 0.5% 트윈80), 70, 200 또는 400 ㎍/㎖의 농도로 관절내 주사(하나의 무릎)에 의하여 30 ㎕의 부피로 1회 투여하였다. 독성동태학 평가를 위하여 군당 추가의 래트 수컷 3 마리에게 화합물 A를 70 또는 400 ㎍/㎖에서 투여하였다. 실행 가능하다면 독성동태학 파라미터를 비구획 약물동태학 분석에 의하여 측정하였다. 대표적인 약물동태학 파라미터는 하기 표 13에 요약한다. 화합물 A 전신 혈장/혈청 노출(평균 Cmax 및 AUC0 -t)은 용량보다 적은 양으로 비례하여 증가하였다. 5.7 배의 투여량 증분(2.1로부터 12 ㎍으로)의 경우, 평균 Cmax 및 AUC0 -t 둘다는 2배 증가하였다. 둘다의 투여량에서 혈장 Tmax는 0.33 시간에서 발생하였다.
표 13: 화합물 A의 단일 관절내 투여량을 투여한 래트 수컷에서의 대표적인 평균 화합물 A 독성동태학 파라미터
Figure pct00024
실시예 15c: Crl:CD(SD) 래트에서 정맥내 급성 독성 실험
화합물 A의 혈장 TK는 Crl:CD(SD) 래트에서 단일 IV 투여 후 측정하였다. 화합물 A를 래트(5마리/성별/군)에게 0(비히클), 1 또는 2.4 ㎎/㎏에서 IV 느린 주사(5 분)에 의하여 1회 투여하였다. 독성동태학 평가의 경우, 추가적인 3 마리 래트/성별/군을 1 또는 2.4 ㎎/㎏ 투여량 군에 추가하였다. 독성동태학 파라미터를 실행 가능할 경우 비구획 분석에 의하여 측정하였다. 대표적인 혈장 약물동태학 파라미터는 하기 표 14에 요약한다. 1 및 2.4 ㎎/㎏에서의 화합물 A의 단일 느린 IV 투여(5 min/래트) 후, Tmax는 0.08 시간에서 발생하였으며, 이는 래트 수컷 및 암컷 모두에서 도시한 제1의 샘플에 해당한다. 2.4 ㎎/㎏을 투여한 동물에서, 평균 Cmax(수컷에서 9,430 ng/㎖; 암컷에서 9,020 ng/㎖)는 1 ㎎/㎏(수컷에서 11,200 ng/㎖; 암컷에서 9,190 ng/㎖)을 투여한 동물에서의 것에 필적하는 반면, 평균 AUC0-t는 1 ㎎/㎏을 투여한 것에 비하여 ㎎/㎏에서 투여한 수컷에서 약 1.8 배 및 암컷에서 2.0 배 더 높았다. 화합물 A의 단일 IV 투여 후, T½은 약 0.3 내지 0.6 시간 범위 내이었다. 종합적으로, 화합물 A 전신 노출(Cmax 및 AUC0 -t)에서의 뚜렷한 성별차는 투여량 섭생에서 관찰되지 않았다.
표 14: 화합물 A의 단일 정맥내 투여량을 투여한 래트의 대표적인 화합물 A 평균 독성동태학 파라미터
Figure pct00025
실시예 15d: 비이글 개에서 관절내 급성 독성 실험
화합물 A의 혈장 및 윤활액 독성동태학 프로파일은 비이글 개 수컷에서 단일 IA 투여 후 측정하였다. 화합물 A를 개(2 마리 수컷/군)에게 1회 투여하고; 각각의 동물에게 하나는 우측 무릎에서 0(비히클)의 농도로 및 하나는 반대측 무릎(좌측)에서 500 ㎕의 일정한 부피로 총 35, 100 및 200 ㎍/개 무릎에 해당하는 70, 200 또는 400 ㎍/㎖의 농도로 2회의 주사를 투여하였다. 독성동태학 파라미터는 비구획 약물동태학 분석에 의하여 측정하였다. 대표적인 약물동태학 파라미터는 하기 표 15에 요약한다. 실험 종료시 윤활액 샘플 중의 화합물 A 농도는 모두 LLQ(0.5 ng/㎖) 미만이었다. 화합물 A 전신 혈장 노출(평균 Cmax 및 AUC0 -t)은 용량보다 더 적은 양으로 비례하여 증가하였다. 2.9 배(35로부터 100 ㎍, 각각 70 및 200 ㎍/㎖에 해당함)의 투여량 증분의 경우, 평균 Cmax 및 AUC0 -t 둘다는 0.7 배 증가하였으며; 5.7 배(35로부터 200 ㎍로, 각각 70 및 400 ㎍/㎖에 해당함)의 투여량 증분의 경우, 평균 Cmax 및 AUC0 -t 둘다는 약 1.5 배 증가하였다. 35, 100 및 200 ㎍의 화합물 A의 투여량에서, 혈장 Tmax는 0.08 내지 1 시간 범위 내이었다.
표 15: 비이글 개에게 단일 관절내 투여 후 혈장 중의 평균 독성동태학 파라미터의 요약
Figure pct00026
복수 투여 실험
실시예 15e: 14 일 회복 기간으로 CD 래트에서 5 주 관절내 반복 독성 실험
Crl:CD(SD) 래트에서 화합물 A의 혈장 독성동태학 프로파일은 복수 투여 IA 독성 실험으로 측정하였다. 화합물 A를 래트(13 마리/성별/군)에게 1주당 1회로 5 주 동안 0(비히클), 70, 140 및 200 ㎍/㎖/주의 공칭 농도로 7, 14 및 20 ㎍/㎏/주(0, 2.1, 4.2 또는 6 ㎍/무릎)에 해당하는 30 ㎕의 고정된 부피로 투여하였다. 주사 부위는 각각의 투여의 경우 우측 대퇴-경골 관절이었다. 3 마리 래트/성별/군을 독성동태학에 대하여 평가하였다. 독성동태학 분석은 비구획 약물동태학 분석에 의하여 수행하였다. 모든 계산은 공칭 샘플링 시간을 사용하였다. 대표적인 약물동태학 파라미터는 하기 표 16에 요약한다. 비히클-대조군 동물로부터 수집하고, 1일차 및 29일차 둘다에서 투여 개시 후 1 시간에 샘플링한 혈장 샘플을 분석하였다. 모든 샘플에서, 화합물 A의 농도는 0.25 ng/㎖의 LLQ 미만이었다. 단일(1일차) 및 반복(29일차) 1주당 1회 화합물 A를 래트 수컷 및 암컷에게 IA 투여한 후, 화합물 A를 투여 개시로부터 적어도 2 시간 이하로 모든 동물의 혈장 중에서 정량화 가능하였다. 중간값으로서 Tmax는 일반적으로 1 시간인 암컷에서 29일차에 7 ㎍/㎏/주를 제외하고, 평가한 모든 투여량 레벨에서 래트 수컷 및 암컷 둘다에서 투여 후 0.33 시간에 발생하였다. 단일(1일차) 반복(29일차) 1주당 1회 IA 투여 후, 화합물 A로의 혈장 전신 노출(평균 Cmax 및 평균 AUC0 -t)은 래트 수컷 및 암컷 모두에서의 증가되는 투여량에 비례하여 증가되었다. 1일차에 2.9배(7로부터 20 ㎍/㎏/주)의 투여량 증분의 경우 평균 Cmax에서 대략 4.1(수컷) 및 3.1(암컷) 배의 증가; 평균 AUC0 -t에서 각각 4.4(수컷) 및 3.2(암컷) 배 증가가 존재하는 반면, 29일차에 평균 Cmax는 약 2.7(수컷) 및 3.2(암컷)배 증가하였으며, 평균 AUC0 -t는 각각 2.7(수컷) 및 2.1(암컷) 배 증가하였다. 일반적으로, 두 성별 모두에서 평가된 전체 투여량 범위에 걸쳐 단일 및 반복 IA 투여 후 화합물 A 전신 노출에서 상당한 차이가 없었다(상당하다는 것은 >2배인 것으로 간주한다).
표 16: 화합물 A의 1주당 5회 관절내 투여량으로 투여된 래트에서 대표적인 평균 화합물 A 혈장 독성동태학 파라미터
Figure pct00027
실시예 15f: 14일 회복 기간으로 CD 래트에서 5 주 정맥내 반복 독성 실험
Crl:CD(SD) 래트에서 화합물 A의 혈장 독성동태학 프로파일은 복수의 IV 독성 실험으로 측정하였다. 화합물 A는 래트(10 마리/성별/군)에게 0, 0.25, 0.75 또는 2.5 ㎎/㎏에서 1주당 1회로 5 주 동안 정맥내(느린 볼루스) 주사에 의하여 10 ㎖/㎏의 투여량 부피로 투여하였다. 추가적인 동물(3 마리/성별/군)에게 화합물 A를 0(비히클), 0.25, 0.75 또는 2.5 ㎎/㎏/주에서 독성동태학 평가를 위하여 투여하였다. 독성동태학 분석은 비구획 약물동태학 분석에 의하여 수행하였다. 모든 계산은 공칭 샘플링 시간을 사용하였다. 대표적인 약물동태학 파라미터는 하기 표 17에 요약한다. 비히클 대조군 동물로부터 수집하고, 1일차 및 29일차 둘다에서 투여 개시로부터 0.33 시간(=20 분)에 샘플링한 혈장 샘플을 분석하였다. 모든 샘플에서, 화합물 A의 농도는 0.25 ng/㎖의 LLQ 미만이었다. 래트 수컷 및 암컷에서 화합물 A의 단일(1일차) 및 반복(29일차) 1주당 1회 IV 투여에 이어서, 화합물 A는 투여 개시로부터 적어도 4 시간 이하에서 모든 동물의 혈장 내에서 정량화 가능하다. Tmax는 주입 개시로부터 평가된 모든 투여량에서 래트 수컷 및 암컷 둘다에서 구한 제1의 샘플에 해당하는 0.08 시간에서 발생하였다. 화합물 A t½는 계산시 두 성별 모두에서 평가된 모든 투여량에서 약 0.36 내지 0.84 시간 범위 내이었다. 단일(1일차) 및 반복(29일차) 1주당 1회 IV 투여 후, Cmax에 대하여 과비례성이 관찰되는 29일차에서 래트 수컷을 제외하고, 화합물 A의 혈장 전신 노출(평균 Cmax 및 평균 AUC0-t로)은 일반적으로 증가되었으며, 두 성별 모두에서 0.75 ㎎/㎏/주까지의 비례성으로부터의 주요 일탈은 없다. 종합적으로 10배 투여량 증분(0.25로부터 2.5 ㎎/㎏/주로)의 경우 화합물 A의 혈장 노출은 1일차에 비례 미만으로 증가된 반면, 평균 Cmax 및 평균 AUC0 -t 둘다는 일반적으로 래트 수컷 및 암컷 둘다에서 증가되는 투여량에 비례하여 증가된다. 일반적으로, 두 성별 모두에서 평가된 전체 투여량 범위에 걸쳐 단일 및 반복 IV 투여 후 화합물 A 전신 노출에서의 상당한 차이는 관찰되지 않았다(여기서 상당한은 >2배인 것으로 고려한다). 종합적으로, 화합물 A 평균 Cmax 및 평균 AUC0 -t에서의 상당한 성별차는 투여량 범위에 걸쳐 1일차 또는 29일차에서 관찰되지 않았다.
표 17: 화합물 A의 1주당 5회 정맥내 투여량으로 투여된 래트에서의 대표적인 평균 혈장 화합물 A 독성동태학 파라미터
Figure pct00028
실시예 15g: 14일 회복 기간으로 비이글 개에서 5 주 관절내 반복 독성 실험
비이글 개에서 화합물 A의 혈장 및 윤활액 독성동태학 프로파일은 복수 투여 IA 독성 실험으로 구하였다. 화합물 A는 개(오른쪽 무릎; 3 마리/성별/군)에게 1주당 1회로 5 주 동안 0, 70, 140 및 200 ㎍/㎖의 공칭 농도로 500 ㎕의 고정된 부피에서 투여하였다(그리하여 0, 35, 70 및 100 ㎍/무릎/주의 공칭 투여량을 제공함). 독성동태학 분석은 비구획 분석에 의하여 수행하였다. 모든 계산은 공칭 샘플링 시간을 사용하였다. 대표적인 혈장 약물동태학 파라미터는 하기 표 18에 요약한다. 비히클 대조군 동물로부터 수집하고, 1일차 및 29일차에서 화합물 A 처치된 동물과 동일한 시점에서 샘플링한 혈장 샘플을 화합물 A의 경우 예상되는 Tmax(1 시간)에서만 분석였다. 분석한 모든 샘플에서, 테스트 항목의 농도는 0.25 ng/㎖인 정량화의 하한 미만이었다. 3.5, 7.0 및 10 ㎍/㎏/주에서 화합물 A의 IA 투여 후, 화합물 A를 투여 후 적어도 3 시간 이하에서 모든 동물의 혈장 중에서 정량화하였다(LLQ = 0.25 ng/㎖). 1일차 및 29일차에서의 Tmax는 일반적으로 수컷 및 암컷 개 둘다에서 0.33 내지 1 시간 범위 내이었다. 1일차 및 29일차 둘다에서의 화합물 A 전신 노출(평균 Cmax 및 AUC0 -t)은 대략 투여량을 비례적으로 증가시켰다. 전체 투여량 범위에 걸친 단일 및 반복 IA 투여 후 화합물 A 전신 노출에서 상당한 차이는 관찰되지 않았다(여기서 상당한은 >2배인 것으로 고려한다). 종합적으로, 화합물 A 전신 노출(Cmax 및 AUC0-t)에서의 상당한 성별 차이는 투여량 범위에 걸쳐 1일차 및 29일차에서 관찰되지 않았다. 실험 종료시 수집한 모든 윤활액 샘플에서, 테스트 항목의 농도는 LLQ(20 ng/㎖) 미만이었다.
표 18: 화합물 A의 1주당 5회 관절내 투여량으로 투여된 개에서의 대표적인 평균 혈장 화합물 A 독성동태학 파라미터
Figure pct00029
실시예 15h: 14 일 회복 기간으로 비이글 개에서 5 주 정맥내 반복 독성 실험
비이글 개에서 화합물 A의 혈장 독성동태학 프로파일은 화합물 A를 개(3 마리/성별/군)에게 0, 0.125, 0.600 및 1.250 ㎎/㎏/주에서 IV 투여에 의하여 5 ㎖/㎏의 투여량 부피에서 및 5 ㎖/min의 주사 속도로 투여하는 반복 투여량 IV 독성 실험으로 구하였다. 독성동태학 분석은 비구획 약물동태학 분석에 의하여 수행하였다. 모든 계산은 공칭 샘플링 시간을 사용하였다. 대표적인 혈장 약물동태학 파라미터는 하기 표 19 및 표 20에 요약한다. 비히클을 투여한 동물로부터 분석한 모든 샘플에서, 테스트 항목의 농도는 LLQ(0.25 ng/㎖) 미만이었다. 수컷 및 암컷 개에게 0.125, 0.600 및 1.250 ㎎/㎏/주에서 화합물 A의 단일 IV 투여 후, 1.250 ㎎/㎏(LLQ = 0.25 ng/㎖)에서 투여시 투여 후 적어도 4 시간 이하 및 투여 후 적어도 12 시간 이하에서 모든 동물의 혈장 중에서 화합물 A를 정량화 가능하였다. 0.125, 0.600 및 1.250 ㎎/㎏/주에서 화합물 A의 IV 투여 후, 1일차 및 29일차에서의 Tmax는 0.17 시간(10 분)에서 발생하였으며, 이는 일반적으로 수컷 및 암컷 개 둘다에서 투여 후 얻은 제1의 샘플에 해당하였다. 반감기(t½), 혈장 청소율(Cl) 및 정상 상태에서의 화합물 A의 분포 부피(Vss)는 화합물 A의 1주당 1회 투여의 1일차 및 5 주후(29일차)에서 유사하였다. 1일차 및 29일차에서의 평균 겉보기 반감기는 수컷 및 암컷 개 둘다에서 0.64 내지 0.93 시간 범위 내이었다. 평균 혈장 청소율(Cl)은 수컷 개에서 435 ㎖/h/㎏ 내지 686 ㎖/h/㎏ 범위 내이었으며, 암컷 개에서는 492 내지 986 ㎖/h/㎏이었다. 평균 분포 부피는 수컷 개에서 440 내지 692 ㎖/㎏ 범위 내이었으며, 암컷 개에서 534 내지 855 ㎖/㎏ 범위 내이었다. 1일차 및 29일차 둘다에서 화합물 A 전신 노출(평균 Cmax 및 AUC0 -t)은 투여량 비례 방식으로 증가되었다. 일반적으로, 전체 투여량 범위에 걸친 단일 및 반복 IV 투여 후 화합물 A 전신 노출에서 상당한 차이는 관찰되지 않았다(여기서 상당한은 >2배인 것으로 고려한다). 종합적으로, 화합물 A 전신 노출(Cmax 및 AUC0 -t)에서의 상당한 성별 차이는 투여량 범위에 걸쳐 1일차 및 29일차에서 관찰되지 않았다.
표 19: 화합물 A의 1주당 5회 정맥내 투여량으로 투여된 수컷 개에서 대표적인 평균 혈장 화합물 A 독성동태학 파라미터
Figure pct00030
표 20: 화합물 A의 1주당 5회 정맥내 투여량으로 투여된 암컷 개에서 대표적인 평균 혈장 화합물 A 독성동태학 파라미터
Figure pct00031

Claims (33)

  1. 피험체의 무릎의 관절 공간에 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는, 피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 개선 방법.
  2. 제1항에 있어서, 무릎의 관절 공간에 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 무릎의 관절 공간에 약 50 ㎍ 내지 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  4. 피험체의 무릎의 관절 공간에 약 1,000 ㎍ 이하의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는, 피험체에서 관절염 또는 관절 손상의 개선 방법.
  5. 제4항에 있어서, 무릎의 관절 공간에 약 400 ㎍ 이하의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  6. 피험체의 무릎의 관절 공간에 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는, 피험체에서 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  7. 제6항에 있어서, 무릎의 관절 공간에 약 10 ㎍ 내지 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 무릎의 관절 공간에 약 50 ㎍ 내지 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  9. 피험체의 무릎의 관절 공간에 약 1,000 ㎍ 이하의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는, 피험체에서 중간엽 줄기 세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  10. 제9항에 있어서, 무릎의 관절 공간에 약 400 ㎍ 이하의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 연 1회 투여하는 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 11 개월마다 투여하는 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 10 개월마다 투여하는 방법.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 9 개월마다 투여하는 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 8 개월마다 투여하는 방법.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 7 개월마다 투여하는 방법.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 6 개월마다 투여하는 방법.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 5 개월마다 투여하는 방법.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 4 개월마다 투여하는 방법.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 3 개월마다 투여하는 방법.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 2 개월마다 투여하는 방법.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 피험체에게 1개월마다 또는 매주 투여하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 25 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 방법.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 방법.
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 150 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 방법.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 200 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 방법.
  28. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 250 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 방법.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 300 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 방법.
  30. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 350 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 방법.
  31. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 400 ㎍의 N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 투여하는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 약 1 ㎖ 내지 약 5 ㎖의 부피로 투여하는 방법.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, N-(4-(2-메톡시에틸)페닐)-2-(메틸술폰아미도)벤즈아미드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 약 5 ㎖ 또는 약 5 ㎖ 이하의 부피로 투여하는 방법.
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