MXPA04001868A - Uso de compuestos de pirrol anillados en el tratamiento de la degeneracion del hueso sub-condrial o cartilago articular. - Google Patents

Abstract

El tratamiento o la prevencion de la degeneracion o destruccion del cartilago articular y/o el hueso subcondrial en la articulacion afectada de un mamifero que se realiza mediante la administracion de un compuesto de la formula (I), en donde las variables tienen los significados proporcionados en la presente descripcion. Un compuesto preferido de la formula (I) es la formula (II). Este tratamiento mejora, disminuye, cambia o previene activamente cualquier lesion, dano o perdida, del cartilago articular o el hueso subcondrial despues de la etapa temprana de la degeneracion.

Description

USO DE COMPUESTOS DE P IRROL ANILLADOS EN EL TRATAMIENTO DE LA DEGENERAC IÓN DEL HUESO SUB-CONDRIAL O CARTÍLAGO ARTICULAR.

La presente invención se refiere al uso de compuestos de pirrol anillados y en particular de ML3000, a las sales o derivados de los mismos, en mamíferos como un medio de tratamiento y la prevención de lesiones y pérdida en el hueso subcondrial y/o del cartílago en el hueso en las articulaciones inflamadas de mamíferos. Tal lesión al hueso subcondrial y/o al cartílago es una secuela natural en el procedimiento de la ost eoartritis y sus consecuencias cuando ocurre en el mamífero. La habilidad para lograr este efecto inesperado se refiere como "condroproteccion".

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La antiflogística no esteroridal ( (NASAIDs) , tal como el ácido acetilsalicílico (ASA) , diclofenaco, indomet acina , ibuprofen, y naproxen son ampliamente usado en clínica. Desde el punto de vista farmacológico, estos actúan como inhibidores de la ciclooxigena-sa (COX) . Las pirrolizinas actúan farmacológicamente similar, las cuales son conocidas en numerosas publicaciones. Por ejemplo las pirrolizinas activas antiflogísticamente son descritas en Aren. Pharm. 319, 65-69 (1986); 319, 231-234 (1986) ; 318, 661-663 (1985); 318, 663-664 (1985); 319, 500-505 (1986); 319, 749-755 (1986); 317, 509-514 (1994) ; 330, 307-312 (1997 ) así como en J. Med. Chem 1987, 30, 820-823 y 1994 , 37 , 1894-1897. Además las pirrolizinas se pueden también contemplar en la Patente de USA 5,260,451 (correspondiente a la EP 0397175) así como también en WO 95/32970; WO 95/32971, y WO 95/32972. Estos compuestos están representados por la fórmula estructural: y la división de una fracción del diarilpirrol anillado así como también un tercer residuo ácido R3. Los compuestos están caracterizados por un elevada lipofilicidad, buena biodi sponibilidad , y un promedio de vida en el término medio, s. Drugs of the Future, 1995, 20 (10) : 1007-1009.

Además las pirrolizinas de formación similar se describen en DE 198 45 446.6 y en O 01/05792. Además, las pirrolizinas substituidas de alquilsulfinilbenzoilo y aquilsulfonilbenzoilo , de conformidad a la Patente de USA 4,232,038, tienen propiedades antipiréticas, analgésicas y antiinflamatorias. De conformidad a DE 196 24 290.8 y DE 196 24 189.4 ciertos compuesto de este tipo tienen acción de reducción de lipidos. El ML3000" el ácido ( [ 2 , 2 , -dimetil- 6- ( 4 -clorofenil) -7-fenil-2, 3-dihidro-lH-pirrolidina-5-il] acético de la fórmula (la) es un inhibidor equilibrado doble no-antioxidante de COX y 5-lipoxigenasas (5-LO) (3) . El fármaco es un inhibidor no selectivo de COX, la inhibición de ambos COX-1 y COX-2. Este. fármaco tiene actividad analgésica, antipirética y anti-inflamatoria, y se ha demostrado que tiene una acción anti-inflamatoria potente en un determinado número de modelos de animales que incluyen el edema de la pata inducida de carragenina en la rata y en la artritis adyuvante en la rata ( 4 ) . La ost eoartrit is (OA) es la más común de las enfermedades músculo-esqueletal . Lo que afecta principalmente las articulaciones diartrodiales que soportan el peso, tales como la cadera y la rodilla, aunque también afectan otras articulaciones tales como las articulaciones inter-falanguales y de la espina. Los cambios estructurales de esta enfermedad incluye la erosión progresiva del cartílago articular, la formación de las protuberancias óseas, y en la etapa clínica de la enfermedad, un grado variable de la inflamación sinovial. También se asocia con estos cambios en la remodelación significante del hueso subcondrial, el cual de conformidad a diversos estudios, se piensa que es predominantemente una reabsorción excesiva del hueso, en la etapa temprana de la enfermedad, seguida por la formación excesiva del hueso, conduciendo a la esclerosis del hueso y la reducción del espesor del hueso subcondrial. Los mecanismos que conducen al desarrollo y al progreso de los cambios estructurales se ven en la osteoartritis (0?) son múltiples y complejos y permanecen ampliamente desconocidos. Estos desarrollan no solo el cartílago, en donde un determinado número de cambios morfológicos son observados, aunque también la membrana sinovial la cual es el sitio de una reacción inflamatoria de varios grados de severidad (1) . Existe un determinado número de trayectorias que se piensa que son responsables para el catabolismo de la matriz del cartílago incluyendo la sobre-regulación de los factores solubles, por ejemplo interleukin-l (IL-l), el factor- de necrosis tumoral (TNF- a) , y las prostaglandinas , las cuales pueden inducir la pérdida del cartílago articular. La lesión directa a los condriocitos , también estimulan la actividad de metaloproteasa de la matriz (MMP), por ejemplo colagenasas, estromelisinas y gelátinasas, y la producción de varios reguladores de la inflamación (2) . Lo que ha sido considerado que los procedimientos metabólicos continuamente ocurren en cualquiera de las articulaciones que son necesarias para su reparación y normalización subsiguiente que son sometidas a un daño tal como una lesión traumática. De conformidad -a esto, con el fin de que un compuesto para que sea aceptado como un agente condrioprotector se debe primero ante todo, ser capaz de sustentar tal actividad metabólica del condriocito, por ejemplo de no inhibir o interferir con la replicación celular y la biosintesis de los componentes de la matriz los cuales son partes del procedimiento de mejoramiento. En este aspecto, el especialista en la materia, reconocerá que la mayoría de NSAIDs tienen una marcada acción inhibitoria en la biosintesis de los componentes principales de la matriz ext racelular . Al mismo tiempo un agente condrioprotector aceptable debe ser capaz de contrarrestar la acción de degradación de los reguladores tales como varias citoquinas, prostaglandinas y proteinasas en el cartílago. De conformidad a esto, se ha aceptado en la técnica, que los fármacos condrioprotectores potenciales deben ser evaluados a sus efectos positivos en las vías anabólicas así como también su habilidad para inhibir los procedimientos catabólicos. Los eventos catabólicos han sido típicamente monitoreados incluyendo, inter alia, la liberación e inhibición de las enzimas de degradación de la matriz, efectos en la biosintesis de la ,prostaglandina y de leucotrieno, y la habilidad del fármaco para inhibir la degradación regulada de IL-1 del cartílago articular. ün determinado número de fármacos similares a NSAIDs, con la actividad dirigida a la inhibición de las enzimas de COX, se han usado durante muchos años. Aunque puede reducir efectivamente los síntomas de la osteoartritis tal como enfermedad, estos han mostrado disponibilidad limitada en la reducción del progreso in vivo de OA experimental (8,9) . Mientras que el tratamiento con Tenidap y Carprofeno, dos NSAIDs, con ambas actividades inhibitorias de ciclooxigenasa-1 (COX-1) y COX-2, se muestra que inhiben los efectos anti-OA (8,9) , otros NSAIDs, tales como el diclofenaco o ASA, que son inefectivos (10) o aún demuestran acelerar el daño del cartílago en el modelo de perro experimental de OA (11) . Similarmente, en humanos, un estudio reciente en pacientes con OA de rodilla, han demostrado que, basados en el criterio de los rayos-X, el tratamiento con el ácido tiaprof énico, un NSAID adicional, en un periodo de 5 años no puede retardar el progreso del daño del cartílago y que la indome t acina aún acelera su progreso (15) . Sorprendentemente, se ha encontrado, que ciertos compuestos de pirrol anillados, tales como ML3000, significativamente reduce el desarrollo de las lesiones en el perro experimental de OA . El efecto protector de estos compuestos es particularmente evidente en la reducción en el desarrollo de las lesiones del cartílago. Este fenómeno esta asociados no solo con una inhibición significativa de ambos de la producción de PGE2 y LTB4, si no que también con una reducción in situ, en los dos factores catabólicos mayores comprendidos en la degradación del cartílago, principalmente el IL-?ß y la colagenasa-1.

Por lo tanto, la presente invención, se refiere al uso de los compuestos de pirrol anillados representados por la fórmula general (I) : En donde X representa CR8R9, s, 0-, NR12 o C ( 0 ) ; A representa CR10R11, o un enlace entre X y el átomo que lleva-los radicales R6 y R7 ; primero de los radicales Rl, R2 , R3 , representa: Arilo opcionalmente substituido con uno o más de los subst ituyentes independientemente seleccionados entre otros el grupo que consiste de halógeno, alquilo, haloalquilo, alcoxi, ariloxi, halogenoalcoxi , alquiltio, hidroxi, nitro, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, sulfamoilo, N-alquilsulfamoilo, N,N- dialquilsulfamoilo, alquilsulfonamido , y alquilsulfon-N-alquilamido, ; o un grupo heterocíclico benzoanillado opcionalmente , mono- o biciclico, aromático o no-aromático que tiene 1, 2, ó 3 heteroátomos independientemente seleccionados de N, 0, y S y opcionalmente estando substituidos con uno o mas de un substituyente independientemente seleccionados entre el grupo que consiste de halógeno, alquilo, halogenoalquilo, alcoxi, ariloxi, halogenoalcoxi, alquiltio, hidroxi, nitro, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, sulfamoilo, N-alquilsulfamoilo, , -dialquilsulfamoilo , alquilsulfonamido , y alquilsulfon-N-alquilamido ; segundo de los radicales Rl, R2, R3 representa Alquilo, opcionalmente substituido con uno mas de uno de los substituyent es independientemente seleccionados entre el grupo que consiste de halógeno, cicloalquilo, alcoxi, trifluorometoxi, hidroxi y trifluorometilo ; Cicloalquilo opcionalmente substituido con uno o más de de uno de los substituyent es independientemente seleccionados del grupo que consiste de halógeno, alquilo, halogenoalquilo, cicloalquilo, alcoxi, halogenoal coxi , e hidroxi; Arilo opcionalmente substituido con uno o mas de uno de los substituyentes independientemente seleccionados entre el grupo que consiste de halógeno, alquilo, halogenoalquilo, alcoxi, ariloxi, halogenoalcoxi , alquiltio, hidroxi, nitro, alquilsulfinilo , alquilsulfonilo , sulfamoilo, N-alquilsulfamoilo , N,N~ dialquilsulfamoilo , alquilsulfonamido , y alquilsulfon-N-alquilamido ; o un grupo heterociclico opcionalmente benzoanillado mono- o bi-ciclico aromático o no-aromático, que tiene 1, 2, o 3 heteroátomos independientemente seleccionados de N, O, y S y estando opcionalmente substituidos con uno o mas de un substituyente independientemente seleccionados entre el grupo que consiste de halógeno, alquilo, halogenoalquilo, alcoxi, ariloxi, halogenoalcoxi, alquiltio, hidroxi, nitro, alquilsulfinilo , alquilsulfonilo , sulfamoilo , N-alquilsulfamollo, , -dialquilsulfamollo, alquilsulfonamido y alquilsulf on-N- al qui lamido ; El tercero de los radicales Rl , R2 , R3, representan H, alquilo, halogenoalquilo , hidroxialquilo , CHO, -COOH, halógeno, ciano, alquilsulfonilo , sulfamoilo ó ?-?, en dónde B representa alquileno ó alquenileno, opcionalment e sustituidos con hidroxi ó alcoxi; Y representa -COOH, S03H, OPO(OH)2, OP(OH)2, -CHO ó tetrazolilo; ó El segundo y el tercero de los radicales Rl , R2 , R3 representan junto con el átomo i al cual se unen al cicloalquilo saturado ó insaturado; R4-R11 que pueden ser los mismos ó diferentes, representan Hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo , hidroxi, COOH, ó aciloxi, en dónde los radicales vecinos pueden estar representados por enlaces ó radicales gemínales, junto con el átomo de carbono al cual se unen que pueden también representar carbonilo ó cicloalquilo; R12 representa Hidrógeno, alquilo ó fenilo, y los isómeros ópticos, sales y derivados fisiológicamente aceptables de los mismos, para el tratamiento ó prevención de la degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial . El término "alquilo, alcoxi, etc" incluye grupos de alquilo lineales ó ramificados tales como CH3, C2H5, n-propilo, CH(CH3)2, n-butilo, CH ( CH3 ) -C2H6, isobutilo, C(CH3)3, n-pentilo ó n-hexilo, en particular CH3, C2H5 ó CH(CH3)2 que tiene preferiblemente - sin que se mencione de otra manera - de 1 a 8 , en particular de 1 a 6 y más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono; como un sustituyante de un radical Rl a R12, alquilo, alcoxi, etcétera, preferiblemente que comprende de 1 a 4 átomos de carbono. El alquilo, alcoxi, etcétera sustituido, incluyen en particular: Halogenoalquilo , es decir alquilo el cual está parcialmente ó completamente sustituido con flúor, cloro, bromo y/o yodo, por ejemplo CH2F, CHF2, CF3, CH2C1, 2-fluoroetilo, 2-cloroetilo ó 2,2,2-trifluoroetilo ; como un sustituyente de un radical Rl a R12 de halogenoalquilo que preferiblemente significa CHF2 y especialmente CF3; Halogenoalcoxi es decir alcoxi el cual está parcial ó completamente sustituido con flúor, cloro, bromo y/o yodo, por ejemplo residuos de halogenoalcoxi correspondientes a los residuos de halogenoalquilo antes mencionados; como un sustituyente de un radical de halogenoalcoxi Rl a R12 que preferiblemente significa OCHF2 y especialmente OCF3; alcoxialquilo, es decir alquilo sustituido por alcoxi, por ejemplo -CH2-OCH3 ó 2-metoxietilo; hidroxialquilo , por ejemplo alquilo el cual es preferiblemente mono-sustituido por hidroxi, por ejemplo hidroximetilo ó 2 -hidroxiet ilo ; trifluoxometilalquilo , es decir alquilo el cual es -preferiblemente mono-sustituido por trifluoromet ilo , por ejemplo los residuos como se describen con relación al hidroxialquilo el cual está sustituido con trifluorometilo en lugar de hidroxi; trifluorometoxialquilo es decir alquilo el cual está -preferiblemente mono-sustituido por trifluorometoxi , por ejemplo los residuos como se describen con respecto al hidroxialquilo los cuales están sustituidos con trifluorometo-xi en lugar de hidroxi; cicloalquilalquilo es decir alquilo el cual está -preferiblemente mono-sustituido por cicloalquilo por ejemplo los residuos como se describen con relación al hidroxialquilo los cuales están sustituidos con ciclopropilo , ciclobutilo, ciclopentilo ó ciclohexilo en lugar de hidroxi. El término "cicloalquilo" incluye los grupos de alquilo mono- ó biciclicos, tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etcétera preferiblemente teniendo -sin que se mencione de otra manera- de 3 a 9, en particular de 3 a 7 y más preferiblemente 5 ó 6 átomos de carbono. El término "alquileno" incluye grupos de alquileno lineales ó ramificados, tales como metileno y etileno, preferiblemente teniendo -sin que se mencione de otra manera- de 1 a 8 , en particular de 1 a 6 y más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. Si el alquileno está sustituido con hidroxilo ó alcoxi, la monosus titución es preferida. El término "alquenileno" incluye los grupos alquileno mono- ó poliinsaturados lineales ó ramificados, tales como etileno, que tienen preferiblemente, sin que se mencione de otra manera-de 2 a 8,· en particular de 2 a 6, y más preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono. Si el alquileno está sustituido con hidroxi ó alcoxi, la monosustitución es preferida. aciloxi significa -OCOR, en dónde R representa alquilo ó arilo. Los. ejemplos preferidos acetiloxi y benciloxi . El -COOalquilo significa alcoxicarbonilo, tal como CO-OCH3, CO-OC2H5, CO-OCH2-C2H6, CO-OCH ( CH3 ) 2 , n-butoxicarbonilo, CO-OCH ( CH3 ) -C2H5 , CO-OCH2-CH ( CH3 ) 2 , CO-OC(CH3)3, en particular CO-OCH3, CO-OC2H5, C0-OCH(CH3)2 ó CO-OCHz-CH (CH3) 2 · El -COOalquilfenilo significa un grupo alcoxicarbonilo el cual está sustituido en la fracción de alquilo con fenilo, tal como benciloxicarbonilo. El alquiltio significa -S-alquilo y también se refiere como a un alquilsulfañilo ó alquilmercapto , tal como SCH3, SC2H5, SCH2-C2H5, SCH(CH3)2, n-butiltio, 1-metilpropilt io , 2-metilpropilt io , SC(CH3)3. El metiltio es preferido. El alquilsulfinilo significa -S ( O) -alquilo y también se refiere al alquilsulfoxo , tal como SO-CH3, SO-CH2H5, n-propilsulfinilo, 1-metilet ilsulfinilo , n-butilsulfinilo , 1-metilpropilsulfinilo, 2 -metilpropilsulfinilo , 1 , 1-dimetiletilsulfinilo . El metilsulfinilo es preferido.

El alquilsulfonilo significa -S ( 0 ) 2-alquilo y también se refiere a alquilsulfona , tal como S02CH3, S02-C2H5, n-propilsulfonilo, S02-CH ( CH3 ) 2 , n-butilsulfonilo , , 1-metilpropilsulfonilo , 2-metilpropilsulfonilo, S02-C(CH3)3. El metilsulfonilo es preferido. Sulfamoilo significa -S(0)2NH2 y también se refiere como al amidosulfonilo ó amida del ácido sulfónico . N-alquilsulfamoilo significa sulfamoilo monosus tituido -S (O) 2NH-alquilo, por ejemplo -S(0)2NH-CH3. N, N-dialquilsulfamoilo significa sulfamoilo monosus tituido -S ( O ) 2-N- ( alquilo ) 2 en dónde los residuos de alquilo N-enlazados pueden ser iguales ó diferentes, por ejemplo -S ( O ) 2N ( CH3 ) 2 · alquilsulfonamido significa -NHS (O) 2-alquilo, tal como NHS02-CH3, NHS02-C2H5, n-propilsulfonamido , NHS02-CH(CH3)2, n-buti 1 sul fonamido , 1-metilpropilsulfonamido, 2 -metilpropilsulfonamido , NHS02-C (CH3) 3. El metilsulfonamido es preferido. El alquilsulfon-N-alquilamido significa - ( alqui 1 ) S ( O ) 2-alquilo en dónde los residuos de alquilo de N- y S-enlazados pueden ser los mismos ó diferentes, por ejemplo ( CH3 ) S02-CH3.

El carbonilo, CHO, -COOH, -S03H significa >C=0, formilo, carboxi, carboxicarbonilo y sulfo respecti amente . El "arilo" preferiblemente significa naftilo y en particular fenilo. El término "halógeno" incluye un átomo de flúor, cloro, bromo ó yodo. Usualmente el flúor y el cloro y en algunos casos también el bromo son preferidos. Los "residuos heterocíclicos" incluyen en particular residuos heterocíclicos de 5- ó 6-miembros los cuales pueden ser mono- ó bicíclicos aromáticos ó no aromáticos y/o benzoanillados . Los ejemplos son residuos heterocíclicos que contienen nitrógeno, tales como pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridazinilo , pirazinilo, indolilo, quinolinilo, especialmente piridilo, pirimidilo e isoquino'linilo . Los residuos aromáticos también incluyen residuos heterocíclicos los cuales contienen un átomo de oxígeno ó un átomo de azufre tal como tienilo, benzotienilo, furanilo y especialmente benzofuranilo . También están incluidos los residuos heterocíclicos los cuales contienen 2 ó más heteroátomos diferentes, tales como tiazolilo, isot iazolilo , tiadia zolilo , isoxazolilo y oxazolilo. El tienilo, piridilo, y tiazolilo son residuos heterociclicos aromáticos preferidos. Los residuos no aromáticos incluyen residuos heterociclicos que contienen nitrógeno, tal como pirrolidinilo, piperidinilo y piperazinilo . Esto también incluye los residuos heterociclicos los cuales contienen 2 ó más de dos heteroátomos diferentes, tales como morfolinilo. Los residuos sustituidos, en particular, alquilo, cicloalquilo , arilo y heteroarilo, son preferiblemente mono-, di- ó t risustituidos . El [a] -anillado puede ser el heterociclo de 6- ó especialmente 5-miembros ó especialmente biciclico, si es aliciclico luego está insaturado ó especialmente saturado y/o sustituido ó insustituido . Los compuestos de pirrol [a] -anillados de la Fórmula (I) incluye en particular aquellos en dónde X representa CR8R9 y A representa un enlace entre X y el átomo que tiene los radicales R6 y R7 (pirrolizinas ) ; X representa CR8R9 y A representa CRlORll (indolizinas) ; X representa NR12 y A representa un enlace entre X y el átomo que tienen los radicales R6 y R7 ( pirrol [ 1 , 2-a ] imidazoles ) ; X representa S y A representa un enlace entre X y el átomo que tienen los radicales R6 y R7 (pirrol [2,1-b] tlazoles) ; X representa S y A representa CRlORll (pirrol [2, 1-b] 1, 3-tiazinas) ; X representa O y A representa CRlORll (pirrol [2 , 1-b] 1 , 3-oxazinas ) ; X representa O y A representa un enlace entre X y el átomo que tienen los radicales R6 y R7 (pirrol [2,1-b] oxazinas) , residuos que no se han mencionado y que tienen los significados antes mencionados. Si el [a] -anillado es un residuo insaturado de 5-miembros, especialmente R4 y R6 representan un enlace tal como por ejemplo el pirrolizina, pirrol [2,1-b]imidazol y pirrol [ 2 , 1-b] tiazol . Si el [a] -anillado es un residuo insaturado de 6-miembros, especialmente R4 y R6 tal como por ejemplo en el pirrol [2,l-b]l,3-tiazina, pirrol [ 2 , 1 -b ] 1 , 3 -oxa z ina ó 5,6-dihidroindol i z ina y opcionalment e también R8 y RIO tal como por ejemplo el indolizina representa un enlace . Sin que se enlace el [a] -anillado especifico, de conformidad a una modalidad particular de la invención, R4-R7 que pueden ser los mismos ó diferentes representan hidrógeno ó alquilo. De conformidad a una modalidad particular adicional de la invención, al menos uno de los radicales R4 , R5, R6 y R7 representan hidroxialquilo , en particular hidroximet ilo , y los radicales restantes entre R4, R5, R6 y R7 independientemente representan H ó alquilo. De conformidad a esta modalidad se prefiere que R4 sea hidroxialquilo, en particular hidroximetilo , y R5 es H ó alquilo, y R6, R7 independientemente son H ó alquilo. De conformidad a una modalidad particular adicional de la invención, uno de los radicales R8 y R9 representan H, alquilo, hidroxialquilo ó alcoxialquilo y el otro representa hidroxilo, alcoxi, carboxilo ó aciloxi, ó R8 y R9 juntos con el átomo de C están unidos a, representando un grupo carbonilo. Las 6 , 7 -dihidro-5H-pirroli z inas son especialmente útiles, por ejemplo compuestos de la Fórmula (I) , en dónde X representa CR8R9, A representa un enlace entre X y el átomo de carbono que tienen los radicales R6 y R7, y R4, R5, R6, R7 , R8 y R9 que pueden ser los mismos ó diferentes, tienen los significados como se han mencionado antes y preferiblemente representan hidrógeno ó alquilo. Las 6, 7-dihidro-5H-pirrolizinas en dónde R4 a R9 son hidrógeno ó al menos uno ó dos radicales R4 a R9, por ejemplo R6 y/o R7 , representan alquilo, en particular metilo, que es especialmente preferido. De conformidad a un aspecto importante de la presente invención, los compuestos de la Fórmula (I) , en dónde el primero y el segundo de los radicales Rl, R2, R3, preferiblemente Rl y R2 , independientemente representa un sistema enriquecido II-electrón seleccionado de arilo y de los residuos heterocí clicos aromáticos, en particular fenilo, opcionalment e sustituido con uno ó más que un sustituyente que en particular está independientemente seleccionado entre el grupo que consiste de halógeno, alquilo y halogenoalquilo , en particular CF3, Rl es preferiblemente fenilo insustituido y R2 es preferiblemente fenilo 4-sustituido los cuales son especialmente útiles. De conformidad a un aspecto importante adicional de la invención, los compuestos de la Fórmula (I), en dónde el tercero de los radicales Rl, R2, R3, preferiblemente R3 representan un residuo ácido tal como COOH ó B-y, en dónde Y es COOH y B preferiblemente 'representa alquileno ó representa un iniciador de un residuo ácido tal como B-Y, en dónde Y es tetrazolilo que es especialmente útil. El uso del ácido [ 6- ( -clorofenil ) -2 , 2-dimetil- 7 -fenil-2, 3-dihidro-lH-pirrolizina-5-il] -acético (ML3000) representado por la Fórmula (la) : Sus sales fisiológicamente aceptables y sus derivados, por ejemplo los esteres fisiológicamente hidroli zables son especialmente preferidos. Las sales fisiológicamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido ó base. Las sales de adición de ácido son, por ejemplo las sales de los compuestos de la Fórmula (I) con los ácidos inorgánicos, tales como el ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico ó ácido fosfórico, ó con ácidos orgánicos, en particular ácidos carboxílieos , por ejemplo ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido mélico, ácido amigdálico, ácido ascórbico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido glucónico ó ácido sulfónico, por ejemplo ácido metanosulfónico , ácido fenilsulfónico y ácido toluenosulfónico y lo similar.

Las sales de adición básicas son por ejemplo, las sales de- los _ compuestos de la Fórmula (I) con bases inorgánicas, tales como hidróxido de sodio ó de potasio ó con bases orgánicas, tales como mono-, di-ó trietanolamina y lo similar. Los derivados fisiológicamente aceptables incluyen en particular los profármacos de los compuestos de la Fórmula (I) los cuales son reconvertidos in vivo a los compuestos de la Fórmula (I) ó una forma reactiva del mismo (metabólico ) . Los ejemplos son ésteres hidrolizables de los compuestos de la Fórmula (I), en dónde el tercero de los radicales Rl, R2, R3 representan un residuo ácido, por ejemplo alquilo (el tercero de los radicales Rl, R2, R3 representan la función COOalquilo), al alquilo (el tercero de los radicales Rl , R2 , R3 comprenden la función COOaralquilo , por ejemplo COOalquilfenilo , pivaloiloximetilo, acetoximetilo , ftalidilo, indanilo y ésteres de metoximetilo del mismo. De conformidad a un aspecto en particular, la presente invención se refiere al uso de los agentes condrioprotectores que son seleccionados entre los compuestos de la Fórmula (I) . El término "agente condrioprotector" como se usa en la presente se entenderá que se refiere a aquellos compuestos cuyo sitio principal de acción es el cartílago. También se apreciara que tales agentes condrioprotectores también tienen acción anti- inflamatoria con relación al sinovial, puede positivamente impactar la biosintesis de las células en el hueso subcondrial y otros tejidos conectivos tales como fibroblastos sinoviales, y puede regular la migración de células inflamatorias asi como para impedir el procedimiento inflamatorio. La presente invención proporciona métodos de tratamiento, y composiciones farmacéuticas útiles en la presente así como también el empaque adecuado, lo cual es aplicado a mamíferos que sufren de ó en el futuro pueden sufrir de lesión, daño ó pérdida del cartílago articular y/o del hueso subcondrial en una ó más de las articulaciones en el mamífero. El uso de los compuestos de la Fórmula (I) tienen ventajas particulares sobre otros NSAIDs, especialmente aquellos que más se usan, los cuales puede exacerbar actualmente el progreso de* la osteoartritis , especialmente cuándo la aplicación en término prolongado está indicada. Es sorprendente que los compuestos de la Fórmula (I) son útiles en el tratamiento ó prevención de tal daño del cartílago articular mientras que simultáneamente no tiene impacto adverso en el transcurso de la inflamación en la articulación del mamífero. La habilidad de los compuestos de la Fórmula (I) para el cambio del procedimiento de la enfermedad el cual conduce últimamente a la destrucción y pérdida del hueso subcondrial y/o del cartílago articular tiene implicaciones para alcanzar la seguridad y el tratamiento efectivo de mamíferos, especialmente aquellos que están en etapas tempranas de la degeneración ó destrucción del hueso subcondrial y/o del cartílago articular. Como se usa en la presente el término "mamífero" significa cualquier mamífero, preferiblemente humanos, gatos, perros ó caballos de los cuales existe un gran número de diferentes razas. De conformidad con la presente invención, el tratamiento ó prevención de la degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial en una ó más articulaciones de un mamífero en necesidad de' tal tratamiento comprende la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva para el tratamiento ó prevención de la degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial, de uno ó más de los compuestos de la Fórmula (I) . Dicho tratamiento ó prevención especialmente comprende mejorar, disminuir, tratar, - cambiar ó prevenir cualquier degeneración ó destrucción, por ejemplo lesión, daño ó pérdida del cartílago articular y/o hueso subcondrial, especialmente después de las etapas tempranas de tal degeneración ó destrucción. La expresión "tratamiento ó prevención" como se usa en la presente con referencia a la administración de los compuestos condrioprotectores de la presente invención, se entenderá que se refiere tanto al objeto terapéutico de la administración asi como también a los resultados terapéuticos actualmente logrados por la administración. Como se ha discutido anteriormente, el grado de la terapia lograda por la administración de los compuestos puede variar desde una mejoría a una reducción significativamente del curso de la enfermedad, y más allá del tratamiento activo de la enfermedad, incluyendo un cambio del proceso de la enfermedad. El •grado más elevado del resultado de la efectividad terapéutica en la prevención de cualquier lesión, daño ó pérdida de cartílago articular y/o del hueso subcondrial posterior a las etapas tempranas de la degeneración en el cartílago articular y/o en el hueso subcondrial. La expresión "etapas tempranas de la degeneración en el cartílago -articular y/o hueso subcondrial" se entenderá que significa el muy al principio de los cambios patológicos iniciales en el cartílago articular y/o hueso subcondrial que define y son el resultado de un proceso de enfermedad. El cartílago es un tejido conectivo fibroso que existe en varias formas, por ejemplo el cartílago hialino, cartílago elástico y fibrocartílago . Es un tejido conectivo que comprende agua, colágeno y protoglicano s los cuales juntos forman un gel de agua reforzado de fibra único el cual está rígido pero elástico y tiene capacidad de absorber los choques considerablemente. El cartílago articular es el cartílago que se encuentra en las articulaciones de los mamíferos. Que comprende células vivas ( condriocitos ) los cuales generan y están rodeados por el material intersticial generalmente referido a la matriz extracelular . Los condriocitos producen la matriz extracelular del cartílago que son altamente activos, y la integridad de esta matriz se mantiene mediante un equilibrio de las citcquinas catabólicas IL-?a, ß y TNFa y las citoquinas anabólicas IGF y TGF ß. Las IL-IOÍ, ß y TNFa actúan mediante la inducción de la producción de las metaloproteasas que degradan la matriz específica, mientras que IGF y ?6Gß actúan como factores de crecimiento mediante la inducción de la producción de los bloques de construcción macro moleculares del cartílago, colágeno y de los proteoglicanos . Otras citoquinas y sus inhibidores asi como los · inhibidores del tejido de la metaloproteasa (TIMP) también influyen en éste equilibrio, referido como la homeostasis de la matriz . El término " metaloproteasa" como se usa en la presente se entenderá que se refiere a las metaloproteasas de la matriz (MMPs) especialmente incluyendo aquellas en esta familia de las enzimas las cuales tienen usualmente concentraciones elevadas durante la degeneración del cartílago articular, por ejemplo las estromelisinas , las colagenasas y las gelatinasas. La colagenasa es generalmente responsable para la degradación del colágeno nativo; la estromelisina es generalmente responsable de la degradación de los proteoglicanos; y la gelatinasa es generalmente responsable para la degradación del colágeno desnaturalizado. Una enzima con propiedades MMP, agrecanasa, está también incluida dentro de este término ya que es responsable de la proteólisis de los agregados de los proteoglicanos del cartílago los cuales están presentes durante las etapas tempranas de la degeneración del cartílago. Las tres colagenasas presentes en el cartílago articular durante las etapas tempranas de la degeneración son colagenasa-1 (MMP-1) , colagenasa-2 (MMP-8), y colagenasa-3 (M P-13) . De las tres estromelisinas , la estromelisina-1 (MMP-3) , estromelisina-2 (MMP-10), y la estromelisina-3 (MMP-11) , únicamente la estromelisina-1 aparece en el cartílago articular durante las etapas tempranas de su degeneración. Debido a que la osteoartrit is está definida como la falla de la articulación diartrodial (sinovial revestido movible) se tiene que en tal articulación existe siempre que se encuentran al menos dos superficies del hueso movibles que se encuentran aunque no están rodeadas por la membrana sinovial, la cual segrega el fluido sinovial, un fluido viscoso alcalino transparente el cual llena la cavidad de la articulación, y el cartílago articular el cual está interpuesto entre las superficies del hueso de la articulación, usualmente en lugar de la membrana sinovial en tal punto. El descubrimiento patológico total temprano en la osteoartritis está modificando el cartílago articular en áreas que cargan habitualment e de la superficie de la articulación, como en el caso de la articulación de la rodilla de los mamíferos especialmente en modelos de la osteoartritis que comprenden el corte transversal del ligamento crucial en la articulación de la rodilla, que consiste del cóndilo femoral y en la meseta tibial. Con el progreso de la osteoartritis , la integridad de la superficie del cartílago se pierde y el cartílago articular delgado con las hendiduras verticales se extienden en lo profundo del cartílago en un procedimiento llamado fibrilación. El movimiento de la articulación puede originar al cartílago fibrilado a que los segmentos liberados se expongan abajo del hueso ( subcondrial ) que luego proporcionan la esclerosis. Los quistes subcondriales también comprendidos se pueden llenar con el fluido sinovial. En las orillas de la articulación los esteofitos se forman (hueso estimulado ) . Los cambios en el hueso subcondrial también tienen una acción en la patología de la degeneración y destrucción del cartílago. Los estudios de las articulaciones de los mamíferos especialmente la de los perros que tienen corte transversal de ligamento crucial anterior revela la esclerosis y la esteopenia subcondrial por ejemplo la pérdida del hueso en la trabícula subcondrial. Después de estos cambios existe un engrosamiento de la placa subcondrial. La pérdida del hueso subcondrial aumenta la tensión mecánica sobre la parte superior del cartílago articular lo que conduce a su degeneración. El engrosamient o posterior de la placa subcondrial negativamente afecta los mecanismos de reparación intrínsecos y por lo tanto contribuye al progreso del rompimiento del cartílago. El rompimiento de la matriz extracelular del cartílago está acompañado por la división mitótica de los condorcitos los cuales luego se forman en conjuntos. Existe una reducción en los componentes de los glicoaminoglicanos del cartílago y de la reducción del prot eogli cano desigual. En la mayoría de las áreas del fibrocart i lago se caracteriza por una matriz extracelular de los conjuntos del colágeno paralelo compacto espeso, reemplazado por el cartílago hialino. Sin embargo no se notará que estos y los cambios patológicos antes descritos en el cartílago articular son característicos de las etapas posteriores de la osteoartritis y que la hipertrofia, por ejemplo el engrosamiento del cartílago articular ocurre primero, como se muestra por el mamífero deficiente crucial, especialmente en el modelo de la articulación de la rodilla del perro. El engrosamiento del cartílago resulta del incremento del contenido de agua, un incremento en la síntesis de los proteoglicanos y un incremento tanto en el contenido como en la concentración de los proteoglicanos en el cartílago articular. Esta etapa de reparación hipertrófica del cartílago articular puede persistir por algún tiempo, pero el tejido del cartílago reparado el cual se forma carece de elasticidad y resistencia para la resistencia mecánica que tiene mediante el cartílago hialino normal. Eventualmente , la producción de proteoglicano se reduce y los condrocitos no son adecuados ampliamente para mantener su matriz extracelular. Esta etapa final resulta en la pérdida del engrosamiento total menor del cartílago articular. Las etapas tempranas de los cambios patológicos cambian la conducción a la lesión del cartílago y pérdida que comprende la reparación intentada a través de la síntesis incrementada' de las macromoléculas de la matriz. Las características del cartílago reparado es deficiente, sin embargo, debido a la composición alterada y a la distribución del componente de glicosaminoglicano y un cambio en su capacidad para agregar con el componente del ácido hialour ónico . Las partículas liberadas durante estos cambios patológicos pueden también conducir a los cambios inflamatorios en la membrana sinovial. Sin embargo, a pesar de la patología privada, las etapas iniciales de la lesión del cartílago y la pérdida puede ser asint omático , con una enfermedad mínima relati amente. De conformidad a esto, un objetivo apropiado es la identificación de los componentes de la matriz extracelular y las citocinas para lo cual se miden los cambios que pueden estar identificados, en lo cual el perfil de un mamífero en las etapas tempranas de la lesión del cartílago y la pérdida anterior a la pérdida del cartílago focal que se puede identificar radiográficamente. El encuentro de este objetivo permitirá la clasificación del diagnóstico de mamíferos los cuales son candidatos para la intervención farmacológica temprana antes de que la degeneración significativa del cartílago ocurra. Estos cambios patológicos en el cartílago articular, incluyen los cambios en la composición, forma y densidad del cartílago articular de la presente, antes del inicio del proceso de la enfermedad, lo que resulta en la degradación de las propiedades benéficas del cartílago articular incluyendo, la resistencia, capacidad de recuperación elasticidad, integridad para la- conformación, y estabilidad, viabilidad, y la habilidad para resistir exitosamente varias clase de resistencia mecánica, especialmente la habilidad para absorber los choques mecánicos estos cambios patológicos en la composición, especialmente incluyen cambios en el tipo y cantidad de glucosaminoglicanos y fibras de colágeno presentes en el cartílago articular. Los cambios patológicos en el hueso subcondrial incluyen la esclerosis del mismo, incrementando la densidad con la reducción de la capacidad de recuperación, y elasticidad del mismo, y una habilidad de reducción para resistir exitosamente las varias clases de esfuerzos mecánicos, especialmente la habilidad para absorber los choques mecánicos. Estos cambios patológicos especialmente incluyen la reparación no propia de micro-fracturas trabeculares con el engro s ami ento trabecular, y los cambios patogénicos en al producción de metabolito osteoblás tico y fenotipo diferenciado. La sinovitis, por ejemplo la inflamación del sinovio, la membrana sinovial, puede contribuir a la patología de la lesión o pérdida del cartílago. La inflamación sinovial esta caracterizada por la infiltración extensa del fluido sinovial mediante las células mono-nucleares, mediante la hiperplesia de la célula de la membrana sinovial, y mediante los agregados linfoides. La sinovitis contribuye significativamente a la lesión del cartílago en reumatoide y otras artropatías inflamatorias . La acción de la inflamación sinovial es las etapas tempranas de OA son menos entendidas, sin embargo, la sinovitis esta presente en el estado clínico de OA. De conformidad a un aspecto de la invención presente, el uso de los compuestos de la fórmula (I) se dirige al tratamiento o prevención de la degeneración o destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial, en donde la degeneración o destrucción se asocia con la osteoartritis . En particular, el uso se dirige al tratamiento o a la prevención de los cambios patológicos comprendidos en lo mismo. Por lo tanto, la presente invención también se refiere al tratamiento de la osteoartritis, en donde el tratamiento esta relacionado mediante el impacto útil terapéuticamente, en el cartílago articular y/o el hueso subcondrial. El tratamiento o la prevención de la degeneración o destrucción de cartílago articular y/o el hueso subcondrial puede también comprender la administración en adición a uno o más que un compuesto de la fórmula (I) , uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste esencialmente de los glicosaminoglicanos polisulfatados (PSGAGA), glucosamina , sulfato de condroitina (CS), ácido hialurónico (AH), polisulfato de pentosan (PPS), deoxiciclina y minociclina. Además, los compuestos de la Fórmula (I) de la presente invención pueden estar combinados con otros ingredientes terapéuticamente activos los cuales son fácilmente evidentes a un experto en la materia en este campo, y el cual usualmente determinará por las circunstancias bajo las cuales el agente terapéutico de la presente invención se administra. Por ejemplo, cuando una articulación empieza a ser infectada seriamente, al mismo tiempo por los microorganismos, por ejemplo, bacterias, hongos, protozoos, virus y lo similar, el n ingrediente activo de la presente invención deseablemente se administra en combinación con uno o más antibióticos, anti-hongos, antiprotozoos, anti-virales o agentes terapéuticos similares . También, el ingrediente activo de la presente invención se puede administrar en combinación con NSAIDs asi también con inhibidores de otros reguladores de la inflamación. Las clases adicionales de tales inhibidores y ejemplos de los mismos, incluyen por ejemplo, antagonistas del receptor-Hi, antagonistas del receptor-B2 y quinina-??; los inhibidores de la pros taglandina , tales como antagonistas del receptor PGD-, PGF-, PGI2-, y antagonistas del receptor-PGE ; inhibidores- ( XA2 ) de tromboxano A2; antagonistas del receptor PGF; oro en la forma del grupo de aurotio junto con varios grupos hidrofí lieos , agentes inmuno-supresores , por ejemplo ciclosporina, azatioprina, y metotrexato, glucocorticoides ant i-inflamatorios por ejemplo dexamet asona ; antibióticos antiparasitarios de espectro amplio, por ejemplo, avemectinas, y las milbemicinas ; penicilamina ; hidroxicloroquina , agentes contra-la gota por ejemplo colchicina inhibidores de la oxidasa de xantina por ejemplo aropurinol y agentes uricosúricos por ejemplo probenesit, sulf inpirazona y benzbromarona . Debido a que las ' etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular son prevalecientes entre los mamíferos geriátricos se apreciará por aquellos expertos en la materia que los compuestos de la Fórmula (I) se pueden administrar en combinación con agentes terapéuticos indicados para el tratamiento de ciertas condiciones de la enfermedad, síndromes y síntomas los -cuales se encuentran ampliamente en mamíferos más viejos. Tales agentes terapéuticos y en algunos síntomas que estos compuestos se pueden usar para el tratamiento que incluye por ejemplo para condiciones del conocimiento para contrarrestar la pérdida de la memoria y el deterioro; y agentes antidisinéticos/antiparkinson, por ejemplo selegelina. Otras clases más amplias de tales agentes terapéuticos incluye antihipertensivos y otros fármacos cardiovasculares indicados para compensar la hipertensión, isquemia al miocardio incluyendo angina, fallas congestivas del corazón, e infarto del miocardio, por ejemplo diuréticos, vasodilatadores tales como hidralazina, antagonistas del receptor ß-adrenérgicos tales como el propanolol, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina-II ( inhibidores-ACE ) tales como enalapril usado para el tratamiento en mamíferos geriátricos con insuficiencia mitral, y enalapril sólo y en combinación con inhibidores de endopeptidasa neutra, antagonistas del receptor de angiotensina II tales como losartan, inhibidores de renin, bloqueadores del canal de calcio tales como nifedipina, agentes simpatolít icos tales como metildopa, agonistas OÍ2- adrenérgicos tales como clonidina, antagonistas del receptor a-adrenérgicos tales como prazosin e inhibidores de HNG-CoA-reductasa (anti-hipercolest erolémicos ) tales como lovastatin ó atorvastat in . Aún otras clases de tales agentes terapéuticos incluyen agentes ant inioplásticos , especialmente fármacos antimicóticos incluyendo los alcaloides vinca tales como vinlastina y vincristina, para el tratamiento de varios cánceres; agentes terapéuticos para el tratamiento de daños renales, fármacos contra la obesidad para el tratamiento de problemas de exceso de peso en mamíferos; fármacos ant i-parásitos para el tratamiento tanto de endo- y ecto-parásitos los cuales afectan comúnmente a los mamíferos; y fármacos anti-prurito para el tratamiento de varios tipos de pruritos en mamíferos. Otros tipos de fármacos que se pueden usar en combinación con los agentes anti-inflamat orios de la presente invención incluye los secretagogues del crecimiento de hormona; analgésicos fuertes; anestésicos locales y sistémicos; y antagonistas de H2~receptor y otros agentes gastroprotectores. Será reconocido por aquellos expertos en ésta técnica que en algunas de las combinaciones anteriores de los agentes terapéuticos serán usados más frecuentemente para el tratamiento de varios síntomas agudos en mamíferos, por ejemplo infecciones bacteriales que ocurren simultáneamente con la enfermedad degenerativa de la articulación. Sin embargo debe ser igual sino de mayor interés en parte de tales personas expertas en el tratamiento de síntomas crónicos en los mamíferos . De conformidad con una dosis la cual se debe usar para éste propósito se contempla que los compuestos de la Fórmula (I) serán administrados en combinación con otras medicaciones usadas en el esquema regular básico para el tratamiento de síntomas crónicos tales como hiperlipidemia . También se entenderá que la administración en tales combinaciones debe asumir un número de diferentes formas y aún está dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, los compuestos de la Fórmula (I) puede simplemente estar formulados con uno ó más de otros agentes terapéuticos los cuales forman la combinación esperada, en una forma de dosificación conveniente, tal como una tableta oral, que contiene todos los fármacos que forman la combinación. La variación de la vida promedio para los diferentes fármacos debe ser de conformidad por aquella persona experta en la preparación de formulaciones mediante la creación de formas de liberación regulada de los fármacos con diferentes tiempos de liberación de manera que la dosificación relativamente uniforme se forme. Un alimento medicado usado como la forma de dosificación también puede ser preparado de conformidad con los principios bien conocidos en la técnica de formulaciones, en la cual los fármacos usados en la combinación están simplemente presentes juntos en la mezcla en la composición del alimento. La presente invención también contempla la co-administración en la cual la combinación de fármacos se logra mediante la administración simultánea de los fármacos que se dan en la combinación. Tal coadministración puede aún ser por medio de diferentes formas de dosificación y vías de administración. La presente invención además contempla el uso de tales combinaciones de conformidad con diferentes pero esquemas de dosificación continuas y regulares con lo cual se desea niveles de plasma de los fármacos comprendidos los cuales se mantienen en los mamíferos que están siendo tratados, aún pensando que los fármacos individuales hacen la combinación que no es administrada a los mamíferos simultáneamente. Estas combinaciones estarán dentro de la experiencia de la técnica para diseñar y administrar. Cuándo los compuestos de la Fórmula (I) existen para usarse como ingredientes activos en los métodos y composiciones de la presente invención, se pueden incorporar en las formas de dosificación farmacéuticas estándar. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden un portador aceptable farmacéuticamente y una cantidad terapéuticamente efectiva para el tratamiento ó prevención de tal degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o el hueso subcondrial, de un compuesto de la Fórmula (I) como se ha definido antes. Por ejemplo, son útiles cuándo se administran en aplicaciones oral ó parenteral sistémica ó local y para este fin se combina con los excipientes, diluyentes y adyuvantes farmacéuticamente usuales, por ejemplo materiales portadores inertes orgánicos e inorgánicos , tales como agua, gelatina, lactosa, almidón, estearato de magnesio, talco, aceites vegetales, gomas, polialquilenoglicoles, etc. Estas preparaciones farmacéuticas pueden ser empleadas en una forma sólida, por ejemplo como tabletas, cápsulas y especialmente en combinación con ó para la mezcla con artículos de alimentos comestibles adecuados para mamíferos; ó se pueden administrar en forma líquida por ejemplo como soluciones y elixires.

Los excipientes y adyuvantes farmacéuticos los cuales se pueden adicionar incluye conservadores, antioxidantes, agentes antimicrobianos y otros estabilizadores; humectantes, emulsificadores y agentes de suspensión y compuestos anti-endurecedores ; fragancias y agentes de coloración; composiciones para mejorar la compresión, ó para crear una liberación retardada-, sostenida-, ó regulada- del ingrediente activo; y varias sales para cambiar la presión osmótica de la preparación farmacéutica ó para actuar como reguladores. Las formas de dosificación particulares las cuales han sido usadas con éxito incluyen una solución mezclada-micelio al 5% de L3000 para la inyección intravenosa, una pasta comestible al 3%, y tabletas orales . La cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la Fórmula (I) como se ha definido se puede administrar sistémicamente al mamífero, en dónde la administración sistémica comprende: (l)la inyección ó infusión en los tejidos adecuados del cuerpo ó cavidades de una composición farmacéutica que contiene el compuesto en la forma liquida adecuada tal como soluciones acuosas, emulsiones ó suspensiones para el suministro intra- ó transdérmico (incluyendo subcutáneo) ó intraespinal especialmente intratecal y más comúnmente el suministro intramuscular ó intravenoso; ó para servir como un depósito para el suministro del mismo; (2) la instilación en los tejidos adecuados del cuerpo ó cavidades de una composición farmacéutica que contiene el compuesto en forma sólida adecuada; por ejemplo que comprende una matriz de materiales bio-compatibles y bio-erosionable en los cuales las partículas de un compuesto condrioprotector sólido de la Fórmula (I) se dispersan, ó en los cuales posiblemente glóbulos ó células aisladas de un compuesto condrioprotector líquido de la Fórmula (I) están atrapados para servir como una composición de implante sólida para el suministro retrasado-sostenido-y/o regulado; ó (3) la ingestión ó administración de una composición farmacéutica que contiene el compuesto en la forma líquida ó sólida adecuada para el suministro transdérmico del mismo por ejemplo un parche transdérmico ó un implante subepidérmico ( subcuticular ) para el suministro peroral del mismo. Un determinado número sustancial de las formas de dosificación descritas en la presente se pueden formular de manera que se proporcione una liberación regulada-, sostenida- y/o retardada del ingrediente activo a partir de su forma de dosificación. Una forma de dosificación de liberación regulada útil de ML3000 de_ conformidad con la presente invención es una que mantiene un nivel de plasma del ML3000 mayor que 100ng/ml para la mayor parte del dia después de una sola dosis oral a 5mg/kg. Las formas de dosificación de liberación regulada oral preferidas de L3000 de conformidad con la presente invención son unas que mantienen una concentración de plasma de ML3000 mayor que 100ng/ml por un periodo de tiempo mayor, que para una forma de dosificación de liberación intermedia de ML3000 que mantiene un nivel de plasma comparable, cuándo la forma de dosificación de liberación intermedia y la forma de dosificación de liberación regulada se administra en la misma dosi s . ' · Las formas de dosificación de ML3000 de liberación intermedia contienen dosis de 2.5 y 5mg/kg que mantienen una concentración de plasma de ML3000 por arriba de 100 y 200 ng/ml por 8 horas respectivamente . Las formas de dosificación peroral preferidas para la administración sistémica son sólidos, por ejemplo composiciones orales comestibles tales como obleas, tabletas, cápsulas, caplets, comestibles que se disuelven rápidamente etc; y líquidos, por ejemplo soluciones, suspensiones, emulsiones etc. Las composiciones farmacéuticas de tipos especiales adecuadas para la administración oral a mamíferos que se pueden usar incluyen pero no se limitan a tales artículos como una pasta oral para suministrarse a la parte posterior de la lengua del mamífero que se está tratando; una forma granular para ser suministrada a través de la incorporación en el alimento que se proporciona al mamífero y una forma masticable en dónde el ingrediente activo se consume cuándo se mastica, ó una forma masticable la cual puede suministrar el ingrediente activo mediante el percolado del cuerpo del material masticable el cual no se consume durante la masticación por el mamífero que se está tratando. La cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la Fórmula (I) como se define puede también ser administrada localmente al mamífero, en dónde la administración local comprende: (1) la inyección ó infusión en el sitio localizado de la degeneración ó de la destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial de una composición farmacéutica que contiene el compuesto de la Fórmula (I) en una forma líquida adecuada para el suministro del mismo, incluyendo los componentes los cuales proporcionan la liberación-retardada, liberación-controlada y/o la liberación-sostenida del compuesto en el sitio localizado; ó para servir como un depósito para el suministro del mismo en dónde la composición proporciona el almacenaje del compuesto y después libera de una manera atrasada-sostenida y/o regulada del mismo; ó (2) la instilación de una composición farmacéutica que contiene el compuesto en forma sólida adecuada para servir como un implante sólido para el suministro del mismo, la composición opcionalmente proporciona la liberación atrasada-, sostenida-, y/o regulada del compuesto al sitio localizado. La administración local se enfoca en los tejidos articulares adecuados en los cuales el compuesto condrioprot ect or de la Fórmula (I) puede ser inyectado, por infusión, implantado, depositado, insertado ó instilado. Tal administración puede incluir pero no se limita a, que es int raart icular , intracondrial , intracostal, intraligamento , intramedular , intramuscular, intraosteal, intr apélvico , ^ intraespinal , int raesternal , intrasinovial , intratarsal, intratecal, ó intravenosa . Las composiciones farmacéuticas en forma liquida que contienen el compuesto condrioprotector de la Fórmula (I) ofrecen la ventaja de permitir las inyecciones de liquido en ó en una proximidad cercana al sitio articular. Mediante inyección del compuesto de la Fórmula (I) directamente en la articulación, es posible lograr una concentración elevada del compuesto en un periodo corto de tiempo, por lo tanto no solo el acceso sust ancialmente incrementado del compuesto a los tejidos de la articulación, y por lo tanto la actividad terapéutica del compuesto de la Fórmula (I) aunque también al mismo tiempo se reduce la ocurrencia de las reacciones adversas y que pueden ocurrir de otra manera. El resultado está en una concentración local elevada del compuesto de la Fórmula (I) con una concentración sistémica correspondientemente baja. Las inyecciones también se pueden hacer de composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto condrioprotector de la Fórmula (I), en dónde la composición farmacéutica está en la forma de liberación-retardada, liberación-regulada ó liberación-sostenida. Estas formulaciones de composición reconocida pueden ser sólidas, semi-sólidas, geles u otras combinaciones liquidas/sólidas en las cuales una matriz erosionable ó series de revestimientos se usan para proporcionar una liberación continua del compuesto de la Fórmula (I) en una cantidad predeterminada ó en cantidades variables si se desea. Los términos de "liberación prolongada" y "acción prolongada" asi también como otros son usados para describir estas formulaciones. Estas varias combinaciones empleadas de los polímeros bio-erosionables , por ejemplo varios polímeros celulósicos y materiales naturales por ejemplo almidón de maíz y estearato de magnesio para obtener un suministro uniforme y/o lento del compuesto de la Fórmula (I) contenido dentro de la matriz. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser inyectadas en el sitio articular si el líquido adecuado ó la suspensión ó puede ser suministrada por otros medios si existe más sólido en forma natural. La cantidad efectiva terapéuticamente para el tratamiento ó la prevención de la degeneración ó destrucción del hueso subcondrial y/o del cartílago articular, del compuesto de la Fórmula (I) , se administra a un mamífero que está siendo tratado en una cantidad expresada como miligramos por kilogramo de peso de cuerpo del mamífero, por día: "mg/kg/día".

La expresión "por día" como se usa en la presente no será interpretada como necesariamente se requiere que cualquier forma de dosificación particular puede ser administrada en un día en base al mamífero que está siendo tratado. La expresión "por día" es meramente una indicación de lo más conveniente pero del segmento arbitrario de tiempo el cual se está usando como parte de la unidad total por medición de la dosis del compuesto condrioprotector que está siendo administrado. La dosis, por ejemplo la cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la Fórmula (I) para el tratamiento ó prevención de la generación ó destrucción del hueso subcondrial y/o del cartílago articular usualmente varía desde 0.1 mg/kg/día a aproximadamente 20.0 mg/kg/día, de preferencia y aproximadamente O.lmg/kg/día a aproximadamente 12.0 mg/kg/día, más preferiblemente de aproximadamente 0.5 mg/kg/día a aproximadamente 10. Omg/ kg/dí a , y más preferiblemente y aproximadamente 0.5 mg/kg/día a aproximadamente 8. Omg/ kg/día . Las formas y las cantidades de la dosificación típica para ML3000 incluyen la administración oral de ML3000 en una cantidad de dosis de 2.5-5. Omg/kg/día por peso de cuerpo. Lo que es necesario para un experto en la materia, no sólo determinar la vía preferida de la administración y la forma y cantidad de dosis correspondiente sino que el experto debe también determinar el régimen de la dosificación, por ejemplo la frecuencia de la dosificación. En términos generales es más similar que la selección debe estar entre una dosis de una vez-un-día (s.i.d.) y una dosis de dos veces-un-dia (b. i. d.) y que el del inicio proporcionará terapia más rápida y profunda mientras que el del final proporcionará una terapia menos profunda y más sostenida. Sin embargo esta generalización no toma en cuenta tales variables importantes como el tipo especifico de la degeneración ó destrucción del hueso subcondrial ó cartílago articular comprendido, el agente terapéutico específico comprendido y sus farmacocinét icas y el paciente específico (mamífero) comprendido. Para un producto aprobado en el marcado, mucho de esta información ya se proporciona mediante los resultados de los estudios clínicos que se llevan a cabo para obtener tal aprobación. En otros casos tal información se puede obtener de una manera directa de conformidad con las enseñanzas y las guías contenidas en la especificación actual tomada para aclarar el conocimiento y la técnica del especialista. Los resultados que son obtenidos también pueden estar correlacionados con los datos de la evaluación correspondiente de un producto aprobado en los mismos ensayos. También se contempla que de conformidad a la presente invención se proporciona también un paquete adecuado para usarse comercialmente para el tratamiento ó la prevención de la degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial en una ó más articulaciones de un mamífero en necesidad de tal tratamiento, que comprende una caja de cartón externa adecuada y un recipiente interno que se puede eliminar; encerrar en el recipiente una forma de dosificación adecuada de un compuesto de la Fórmula (I) como se ha descrito antes y asociada con la caja de cartón ó el recipiente impreso del material de instrucciones y de información, que se puede unir a la caja ó al recipiente que está en la caja ó que se exhibe como una parte integral de la caja de cartón ó del recipiente el material de información y de instrucciones indicando en palabras lo que conviene a un lector de lo mismo de que el ingrediente activo, cuándo se administra a un mamífero en una 'condición de degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial en una ó más de las articulaciones lo que mejorará, reducirá el tratamiento activamente, cambiará ó previene cualquier lesión, ,daño ó pérdida del cartílago articular ó del hueso subcondrial. En una modalidad preferida el paquete comprende la caja de cartón y el recipiente como se ha mencionado anteriormente el cual conformará los requerimientos de regulación relacionados a la venta y al uso de los fármacos para el tratamiento de animales, incluyendo especialmente el material de información y de instrucciones. También se contemplará de conformidad a la presente invención que además proporciona un paquete del tipo inmediatamente antes descrito, que comprende un recipiente adecuado ya mencionado; que encierra en el recipiente una forma de dosis oral de un compuesto de la Fórmula (I); y asociado con el recipiente que tiene impreso el material de información y de instrucciones como se ha descrito anteriormente. El método de la presente invención puede estar definido además para comprender dos etapas básicas: (1) establecer el status de un mamífero candidato como se presenta ó posiblemente estando en un síntoma de degeneración ó de destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial en una ó más articulaciones del mamífero, con lo cual se confirma que el mamífero está en necesidad de tal tratamiento; y después (II) el tratamiento ó la prevención del síntoma mediante la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva para el tratamiento ó prevención de la degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial de un compuesto condrioprotector de la Fórmula (I) . Los varios aspectos de la etapa (II) ya han sido discutidos anteriormente en detalle. De conformidad a esto, los aspectos de la etapa (I) será ahora discutido en detalle. Como para un diagnostico se refiere lo que es el expediente para establecer el status de un mamífero el cual es candidato para el tratamiento de conformidad con la presente invención de manera que ó no el mamífero está presente ó es un prospecto para un síntoma de la degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial en una ó más articulaciones del mamífero. La expresión "presente ó prospecto" como se usa en la presente se entenderá que significa que de conformidad con los métodos discutidos debajo de hacer que la determinación si es posible para identificar un 5 mamífero candidato como ya sea que esté presente en la necesidad de tal tratamiento ó como muy similar ó que espere para estar en necesidad de tal tratamiento en un futuro cercano. La necesidad de ser prospecto para el tratamiento puede ser establecido por aquellas determinaciones de factores positivos desde la experiencia del experto que conduzca directamente a un síntoma de la degeneración ó destrucción del hueso subcondrial y/o cartílago articular. Por ejemplo el Doctor puede establecer a partir del examen químico de un mamífero que tiene displasia incipiente de la cadera, y puede confirmar esta conclusión con una evidencia radiográfica a partir de lo cual se puede determinar de conformidad con los métodos establecidos de la medición del mamífero el cual presentará la displasia de la cadera dentro de un futuro cercano. El status de los mamíferos como están actualmente ó en prospecto en el síntoma de la degeneración ó destrucción y específicamente en las etapas tempranas y por lo tanto en necesidad de tal tratamiento está particularmente determinado por: (A) los resultados positivos del examen clínico artroscópico y la evaluación de las articulaciones del mamífero candidato. El diagnóstico de la displasia de la cadera incipiente ó que se da cuenta ya ha sido discutida. Otros síntomas clínicos y signos deben estar incluidos en aquellos que lograron de su examen directo de las articulaciones del mamífero candidato; (B) la realización de cualquier procedimiento quirúrgico agresivo en una ó más de las articulaciones del mamífero candidato el cual debe estar bajo la mayoría de las circunstancias que son razón suficientes por si mismas para concluir que el tratamiento es necesario. Esto continúa desde el hecho que la cirugía agresiva en la articulación de un mamífero inevitablemente degrada la habilidad de que la articulación soporte su carga acostumbrada tan - eficientemente como antes de la cirugía. La tensión mecánica incrementada sobre la articulación deberá en la experiencia del Doctor experto conducir directamente a las etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular y/o del hueso subcondrial. Tal cirugía en la articulación también produce una efusión de la sangre y otros fluidos que contienen citocinas y otros factores los cuales son agentes que originan la inflamación y por lo tanto permiten su migración en los tejidos sólidos de la articulación, incluyendo el cartílago y/o el hueso subcondrial. El Doctor apreciará que estos también deben conducir directamente a las etapas tempranas de la degeneración del hueso subcondrial y/o del cartílago subcondrial. (C) los resultados positivos de un examen de una ó más articulaciones del mamífero que usa procedimientos no agresivos incluyendo imagen de resonancia magnética y radiográfica (MRI) . La técnica posterior es mejor para la evaluación de los tejidos blandos que es la inicial. El estudio de (MRI) es una técnica para la imagen del cuerpo multiplanar que muestra el incremento de la resolución del contraste del tejido blando. Ya que el (MRI) puede ver los cambios del tejido blando es adecuado para la imagen de la patología en los cambios anteriores en la degradación de el cartílago articular y del hueso subcondrial; (D) los resultados positivos de cualquier prueba bioquímica se realiza en los fluidos del cuerpo ó en el tejido de la articulación del mamífero candidato con relación a una ó más de las siguientes sustancias: int erleukin- Ibet a incrementada (IL-?ß) ; necrosis de tumor incrementado del factor alfa (TNFa) ; la proporción incrementada de la proteína del antagonista del receptor IL-?ß a IL-1 ( IL-IRa ) ; la expresión incrementada de los receptores p55TNF(p55 TNF-R) ; interleukin- 6 incrementado (IL-6) ; el factor inhibitorio de leucemia incrementado (LIF) / el factor-1 de crecimiento similar-insulina reducido ó sin cambiar (IGF-1) el factor beta de crecimiento de transformación reducida ( TGß) ; el factor de crecimiento derivado-plaquetas reducido sin cambiar (PDGF) ; el factor de crecimiento de fibroblastos básico reducido ó sin cambiar (b-FGF) el sulfato de kerafan incrementado; la estromelisina incrementada; la proporción incrementada de estromelisina al inhibidor de tejido de metaloproteasas (TIMP) , la osteocalcin incrementada; la fosfatasa alcalina incrementada; cAMP incrementada que responde al reto de hormonas; el activador de plasminógeno uroquinasa incrementado (uPA) ; la proteina de la matriz oligomérica del cartílago incrementado, y la coliagenasa incrementada. El IL-1 el cual ocurre como IL-?a y IL-?ß es una citocina catabólica la cual regula la lesión del cartílago articular y la pérdida en las articulaciones del mamífero. Lo que actúa por sorpresa la síntesis del colágeno del tipo II que se encuentra en el cartílago articular mientras que se inicia la síntesis del colágeno del tipo I característico de los fibroblastos; mediante la inducción de la producción de enzimas comprendidas en la degradación de la matriz; y mediante la supresión de la habilidad de os condriocitos para sintetizar nuevos proteoglicanos . El número de los receptores IL-1 sobre la superficie de los condriocitos en el cartílago articular en las etapas tempranas de la degeneración las cuales deben estar ocupadas con el fin de obtener la producción de enzimas catabólicas que es solamente un cuarto tan grande como lo que se requiere normalmente (1% contra 4%) . El IL-1 y su regulador IL-1 Ra son producidos en una forma autocrina y paracrina mediante los mismos macrófagos sinoviales; y la producción de IL-1 Ra puede incrementarse en la presenqia del factor de estimulación de colonias de macrófago granulocito (GN-CSF) . Sin embargo existe una disparidad significativa entre la potencia de IL-1 y IL-1 Ra con aproximadamente 130 veces más el IL-1 Ra que es requerido para eliminar los efectos de IL-1 según se mida en los condriocitos y cartílago extraído. Cualquier desequilibrio entre IL-1 y IL-IRa aumentará adicionalmente la degeneración del cartílago art i cul ar . Consecuentemente es también un objetivo apropiado para la medición de los niveles de IL-1 y IL-IRa y sus cantidades en los mamíferos en etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular y los mismos valores en los mamíferos no causan daño de manera que los cambios medidos pueden estar identificados los cuales perfilan a un sujeto mamífero en las etapas tempranas del daño al cartílago y pérdida antes de la pérdida del cartílago focal que puede ser identificado radiográficamente. Estos resultados proporcionan la clasificación del diagnóstico de los mamíferos los cuales son candidatos para la intervención farmacológica temprana antes de que la degeneración significativa de cartílago ocurra. Además la proporción de IL-? y IL-?ß n que secreta macrófagos ocurre en fluido sinovial y en el tejido sinovial de una articulación en las etapas tempranas de la degeneráción del cartílago articular que pueden ser detectadas y que es significativamente mayor que la proporción de las células aisladas similares del fluido sinovial y del tejido sinovial de las articulaciones normales, por ejemplo articulaciones que no están en las etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular. En la presente nuevamente estos resultados proporcionan la clasificación del diagnóstico de los mamíferos los cuales son candidatos para la intervención farmacológica temprana antes de que la degeneración significativa del cartílago ocurra. Aún además, los , cambios en el hueso subcondrial ocurren antes de las alteraciones totales en el cartílago articular que se hace evidente debido a las citocinas responsables para la iniciación y mantenimiento del acceso de ganancia del procedimiento inflamatorio a las capas inferiores del cartílago a través de las micro-fisuras de la zona calcificada. El metabolismo de los condrocitos concerniente es afectado adversamente, y además los condrocitos en la zona media del cartílago articular produce la mayoría de las citocinas, incluyendo aquellas responsables para la iniciación y el mantenimiento del proceso inflamatorio. Estos condrocitos actúan en una modalidad autocrina, por lo que contribuye a la destrucción de su propia matriz extra-celular. El contenido de agua incrementada del cartílago articular también facilita este procedimiento mediante el incremento de la difusión de las citocinas inflamatorias a través de la matriz. Es consecuentemente, un objetivo apropiado para medir los niveles de las varias citocinas inflamatorias producidas por los condriocitos , las células sinoviales, y/o los osteocitos subcondriales en mamíferos, especialmente los caninos durante el procedimiento de la degeneración del cartílago articular, y los mismos valores en mamíferos no causan daño de manera que los cambios que se pueden medir pueden estar identificados el cual perfila un sujeto mamífero en las etapas tempranas de la lesión del cartílago y la pérdida antes de la pérdida del cartílago focal que se puede identificar radiográficamente. Estos resultados proporcionan, el diagnostico, clasificación de los mamíferos que son candidatos para la intervención farmacológica temprana antes de que ocurra la degeneración significativa del cartílago. El factor de necrosis de tumor alfa (TNFa) tiene solo una décima de la potencia del IL-1 con relación a la degeneración del cartílago articular, aunque su concentración en el fluido sinovial se incrementa significativamente en las articulaciones de las rodillas, especialmente con los ligamentos cruzados comparados a los opuestos, de la rodilla sin operar. Existe también la expresión incrementada de los receptores de TNF p55 (TNF-R) en los condriocitos aislados del cartílago articular presente en las articulaciones de las rodillas.

De conformidad a esto, debido a que la TNFa tiene un papel importante en los cambios patológicos los cuales toman lugar en las etapas tempranas de la lesión del cartílago, y la pérdida, es similar a un objetivo apropiado para la medición de los niveles de TNFa y TNF-R en las articulaciones de los mamíferos en las etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular, y los mismos valores en los mamíferos no causan daño de manera que los cambios que se miden pueden identificar el perfil de un sujeto del mamífero, en las etapas tempranas de la lesión y pérdida del cartílago anterior a la pérdida del cartílago focal que se puede identificar radiográficamente. Estos resultados proporcionan la clasificación del diagnóstico de los mamíferos los cuales son candidatos para la intervención farmacológica temprana anterior a que la degeneración significativa del cartílago ocurra. Int erleuquin- 6- (IL-6) es una citocina multi-funcional, pero que tiene una acción inflamatoria y se encuentra en niveles elevados en las articulaciones y en el fluido sinovial, del dañado como se compara a las extremidades de control. La IL-6 es también responsable para el incremento de la expresión de TNF-R sobre los condriocitos e incrementa la producción de prot eoglicano mediante los condriocitos, así como también la inducción de la liberación de glicosaminoglicano . La medición de los niveles de IL-6 en,, las articulaciones, el fluido sinovial y los condriocitos en las articulaciones de mamíferos en las etapas tempranas de la lesión y pérdida del cartílago articular, comparada al control, se puede usar como una herramienta de diagnóstico para la identificación de los mamíferos que son candidatos apropiados para el tratamiento farmacológico, antes de que cualquier pérdida del cartílago focal que es evidente del examen radiográfico . El factor inhibitorio de leucemia (LIF) se produce mediante los monocitos, granulocitos , células T, fibroblastos y otros tipos de células asociadas con las condiciones inflamatorias. Los sinoviocitos y condriocitos sintetizan y secretan el LIF en la presencia de IL-?ß y TNFa. Por lo tanto, la medición del incremento comparativo de los niveles de LIF se pueden usar diagnósticamente para seleccionar los candidatos de los mamíferos para el tratamiento farmacológico de las etapas tempranas de la lesión y pérdida del cartílago articular. La degeneración, lesión y pérdida del cartílago articular en mamíferos se origina mediante el desequilibrio entre las citocinas que impulsan los procesos catabólicos antes descritos y aquellas citocinas las cuales son responsables para el mantenimiento de las respuestas proliferat ivas y sintéticas de los condriocitos en el cartílago. El factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), transforma el factor de crecimiento beta (TGFP), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), y el factor de crecimiento de fibroblastos, por ejemplo, el factor de crecimiento del fibroblasto básico (bFGF) , son todos mitogénicos con relación a los condriocitos y a la síntesis de la matriz estimulada en el cartílago articular. El factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) existe como tipos I y II, y el OGF-1 es un regulador potente en la ' síntesis del cartílago. Además, reduce la degradación e inicia la síntesis de los proteoglicanos aún en la presencia de IL-?ß y TNFa. Los niveles del suero de IGF-1 se mantienen mediante las proteínas de enlazamiento de afinidad elevada (IGF-BPs) y IGF-1 es importante en la producción de hueso y de cartílago. Los niveles de IGF-1 comparados al control permiten la evaluación del diagnóstico de los candidatos de los mamíferos para el tratamiento farmacológico de la degeneración del cartílago articular. La transformación del factor de crecimiento (?TGß) se produce medíante los condriocitos y es un mitógeno poderoso para la producción de tanto el cartílago como el hueso. Además estimula la síntesis de la matriz y tiene actividad anti-inflamatoria . También inhibe la degradación de la matriz mediante la estimulación de la producción del inhibidor de proteasa, y el bloqueo de colagenasa y la liberación de metaloproteasa . Aún además, inicia la reparación del cartílago mediante la estimulación de la producción del colágeno, fibronectina , inhibidores de los activadores de plasminógeno e inhibidores del tejido de la metaloproteasa (TIMP) mediante varias células en la articulación del mamífero. Los niveles del fluido sinovial de GF son bajos en las articulaciones en las etapas tempranas de la lesión y pérdida del cartílago articular. Consecuentemente, los niveles de TGF comparados al control permiten la evaluación del diagnóstico de los candidatos de los mamíferos para el tratamiento farmacológico temprano de la degeneración del cartílago articular. Con la degeneración, progresiva, por ejemplo el catabolismo del cartílago articular en la articulación del mamífero, un determinado número de metabolitos son producidos los cuales son útiles como marcadores en la degeneración del cartílago, ambos como su ocurrencia y. como su avance. Por ejemplo, la degradación del cartílago por IL-1OÍ y IL-?ß o TNFa libera los glicosaminoglicanos (GAGS), el cual se puede medir en el fluido sinovial de un mamífero que se esta ensayando. Además, el cambio de los niveles de GAG después del tratamiento de manera que es posible monitorear el curso de la intervención farmacológica, usando los niveles de GAG del fluido sinovial como un marcador de la producción del cartílago articular. Debido a la degradación del cartílago articular que se relaciona al colágeno así como también a ptros componentes del cartílago, varios productos del colágeno sirven como marcadores de la degradación del cartílago en mamíferos, especialmente la lesión y la pérdida del cartílago articular canino. El colágeno específico del tipo-II rompe los productos por ejemplo de 20-30 neoepitopes de aminoácido, pueden ser identificados en los fluidos del cuerpo tales como .el fluido sinovial, plasma, suero u orina. La , presencia de los neoepitopes en estos fluidos del cuerpo se puede usar como indicadores del inicio de OA y del progreso. El sulfato de queratan es un GAG particular el cual tiene un epitope, 5D4, cuyos niveles en el fluido sinovial se puede usar como un marcador de la lesión y de la pérdida del cartílago articular temprano. Al contrario, los niveles del sulfato de condriotin, otro GAG particular, expresado como un número de epitopes, se asocia con los eventos anabólicos en el cartílago articular de los mamíferos en las etapas tempranas de la pérdida y lesión del cartílago. Los niveles de estos epitopes en el fluido sinovial, particularmente 3B3, 7D4, y 846, pueden ser determinados mediante los anticuerpos monoclonales específicos los cuales lo reconocerán. El epitope 3B3 se expresa sobre las cadenas de sulfato de condroitin del cartílago durante la reparación y la remodelación de la matriz extracelular y consecuentemente, sus niveles en el fluido sinovial se correlaciona inversamente con aquellos del 5D4 mencionado antes. La expresión de 3B3 en PGs sintetizado recientemente en la capa superficial y media superior del cartílago articular significa que 3B3 se asocia con los cambios tempranos en el cartílago articular de los mamíferos en las etapas tempranas de la degeneración del cartílago. De conformidad a esto, la determinación de los niveles de 3B3, en el fluido sinovial de los mamíferos en prueba y en comparación de estos niveles con los valores de control permiten la creación del perfil del diagnóstico de un mamífero que es un candidato apropiado para el tratamiento farmacológico temprano . Los marcadores adicionales de la actividad anabólica del cartílago son los pro-péptidos pro-coliágeno tipo-II (PIP) · El tipo II es el colágeno importante del cartílago articular y se produce mediante los condriocitos de pre-colágeno . Durante el procedimiento de la formación de fibrillas de colágeno, el aminopéptido sin coliágeno y el carboxipropépt ido se dividen y se eliminan en los fluidos del cuerpo con lo cual se pueden medir como la reflexión de la actividad anabólica en el cartílago articular. Los niveles del carboxi-PIIP se elevan y los niveles del fluido sinovial se correlacionan con la evidencia radiográfica de los cambios en el cartílago. De conformidad a esto, la medición de los niveles del carboxi-PIIP en el fluido sinovial y en comparación con los de los controles permite la identificación de los candidatos de los mamíferos para el tratamiento farmacológico temprano. · Un desequilibrio en la proporción de estromelisina/TIMP en el cartílago articular y en los fluidos de la articulación en las etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular es también útil en la identificación de tales mamíferos. Alterando la carga de la articulación después de la lesión origina el exceso de la producción de exceso de estromelisina, una enzima producida mediante los condriocitos y los sinoviocitos bajo la influencia de IL-1. Las concentraciones de la estromelisina están también elevadas en el cartílago fibrilado que están en el cartílago más distantes de la lesión concerniente. Los niveles incrementados de la estromelisina pueden ocurrir para solamente un periodo de tiempo adecuado, aunque el daño a la articulación sobrepase la zona límite del cartílago articular, y alcance en el hueso subcondrial, existe una probabilidad de la degeneración subsiguiente del cartílago articular, que procede usualmente por una rigidez del hueso subcondrial. Además, en el modelo deficiente crucial usado en la detección de las etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular, existe un número incrementado de células concernientes en la síntesis de estromelisina,- IL la, IL-?ß y tres proteína de oncogenos, c-MYC, c-FOS y c-JUN. En el sinovial se ha encontrado principalmente en las células de la linea sinovial, con lo cual en el cartílago las células son los condriocitos sobre las capas medias y superficiales y las células en las áreas fibriladas del límite tibial. Además la estromelisina y la IL-1 difusas en la matriz del cartílago del límite tibial. La estromelisina, la cual degrada los componentes del tejido conectivo incluye los proteoglicanos y el colágeno del tipo IX, que está activamente sintetizado en el sinovial de los mamíferos en las etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular, y es la enzima proteolítica primaria concerniente en la destrucción del cartílago. Los niveles incrementados de la estromelisina mARN son detectables en el sinovial de tales mamíferos, como son incrementados los niveles de la colágenas de mARN. Los niveles incrementados de ambas isoformas de IL-1, aunque especialmente de IL-1ß, estimula la síntesis incrementada de la estromelisina mediante el aumento de la inducción del fibroblasto sinovial de la estromelisina y de la expresión del gen de la coliagenasa. Al mismo tiempo, la IL-1 no induce el mARN del inhibidor del tejido de la met aloprot easa (TIMP) y los niveles de este inhibidor permanecen sin cambiar, mientras que los niveles detectables de las metaloproteasas en el sinovial están incrementadas dramáticamente. Las metaloproteasas son secretadas mediante los condriocitos como las pro-enzimas las cuales deben estar activadas antes de la degradación de las macrorno léculas de la matriz extracelular que se puede realizar. La activación concerniente a una cascada enzimática en la cual las proteasas de la serina incluyen el sistema plasminógeno act ivador/plasmina que tiene un papel clave. La integridad del cartílago articular en la articulación articular en una articulación del mamífero depende de la adecuación del soporte en el cual recibe de la base del hueso el cual lo cubre, por ejemplo, las propiedades estructurales del hueso subcondrial fundamental. La alteración de esta base del hueso precede los cambios degenerativos en el cartílago articular. Estas alteraciones incluyen la rigidez incrementada en el hueso subcondrial, acompañado por la pérdida de la capacidad de absorción brusca. Estos cambios del hueso subcondrial son originados mediante la reparación ínapropiada de las micro-fracturas trabeculares lo cual resulta, a su vez, de la carga excesiva en la articulación. El espesor trabecular del hueso subcondrial es parte de una carga de la alteración del hueso para incrementar la densidad mineral del hueso y/o el volumen en las articulaciones afectadas, las cuales a su vez está originada por una célula del hueso en los osteoblastos, resultando en las características fenotípicas alteradas en estas células similares a los osteoblastos del hueso subcondrial . Estas alteraciones en la densidad del hueso subcondrial no son sola la evidencia de un desequilibrio en el proceso de la remodelación del hueso, sino que también son un ingrediente clave en la pérdida del cartílago focal. La esclerosis del hueso es también debido a la desregulación de este procedimiento de la remodelación del hueso. Además las diferencias relacionadas del sitio en el metabolismo del osteoblasto ocurren, lo cual conduce a la producción de las moléculas de degradación del cartílago diferente. Estos cambios en los metabolitos del osteoblasto a su vez conducen a los cambios correspondientes en el metabolismo del condriocito, proporcionándole más actividad inducida a la citocina de los tipos antes descritos. Estos fenotipos diferenciados y anomalía osteoblástica está caracterizada por los niveles de producción divergente de la osteocalcina , la fosfatasa alcalina, cAMP responsable del desafío de la hormona, el activador del plasminógeno de la uroquinasa (uPA) , y del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) . La evidencia adicional de la actividad del hueso subcondrial intervine en la degeneración del cartílago articular eventual en el espacio estrecho de la articulación el cual se puede medir mediante cintigrafía del hueso. Estos cambios en la actividad del hueso subcondrial están acompañados por los cambios correspondientes en los metabolitos de la célula del hueso específicos, por ejemplo la ost eocalcina . La osteocalcina es una vitamina Independiente, la proteína de hueso de enlace de calcio el cual es la proteína mas abundante sin colágeno en el hueso. Los niveles incrementados de la osteocalcina son un marcador de la producción del hueso en varios estados de la enfermedad, incluyendo particularmente las etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular. El fluido del cuerpo, especialmente los niveles del fluido sinovial de la osteocalcina se correlaciona directamente a los cambios del hueso subcondrial según se mida por cintigrafía . En adición a los marcadores de la actividad del hueso subcondrial como los indicadores de las etapas tempranas de la degeneración del cartílago articular en mamíferos, metabolitos del cartílago y de la actividad del sinovial son también útiles como los marcadores los cuales indican las etapas tempranas de tal degeneración del cartílago. Por ejemplo, la detección de los niveles del suero incrementado de la proteína de la matriz oligomérica del cartílago como un marcador de la producción del cartílago. S imi larment e , la detección de los niveles elevados del hialouronato en los fluidos del cuerpo, especialmente del suero sirve como un marcador de la inflamación sinovial. En ambos casos, el fluido del cuerpo incrementado, especialmente los niveles del suero de estos marcadores del metabolito indica las etapas tempranas de la degeneración el cartílago articular. La expresión "fluido del cuerpo" como se usa en la presente se entenderá que incluye todos aquellos fluidos del cuerpo accesibles usados como especímenes clínicos los cuales pueden contener un compuesto que se prueba por una concentración suficiente en el fluido para estar dentro de los límites de detección del dispositivo de prueba ó del ensayo que se está usando. Los fluidos del cuerpo incluyen aquellos como sangre, suero, plasma, orina, fluido cerebroespinal, fluido sinovial y fluidos intersticial ó extracelular . Las mediciones descritas anteriormente usualmente se conducen in vitro en un espécimen (muestra) que ha sido obtenido del mamífero candidato .

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS. La Figura 1: se muestra la Tabla que menciona el gradiente macroscópico de los cambios del cartílago de los cóndilos femorales y del límite tibial; La Figura 2: muestra la Tabla que menciona el gradiente histológico de la membrana sinovial; La Figura 3: muestra la Tabla que menciona la variación de la célula del cartílago para la colagenasa-1 (MMP-1) y las cantidades de la célula de la membrana sinovial para IL-?ß en perros La Figura : muestra el gradiente histológico del cartílago osteoart rít ico del perro de los cóndilos femorales y del límite tibial; La Figura 5: muestra los niveles de PGE2 en los fluidos sinoviales y LTB4 en las extracciones sinoviales cultivados de los perros os teoartrí ticos ; La Figura 6: muestra la liberación de la osteocalcina mediante los osteoblastos primarios del perro; La Figura 7: muestra la actividad de la fosfatasa alcalina en los osteoblastos primarios del perro; La Figura 8 : muestra la producción de IGF-1 mediante los osteoblastos primarios del perro; La Figura 9: muestra la actividad uPA por los osteoblastos primarios del perro; La Figura 10: muestra la producción PGE2 por los osteoblastos primarios del perro.

DESCRIPCION DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Con el fin de demostrar adicionalmente los métodos y composiciones de la presente invención, se presentan en el párrafo los cuales describen específicamente ejemplos de los procedimientos típicos los cuales pueden ser empleados para llevar a * cabo los métodos. Sin embargo los ejemplos están indicados para ilustrar solamente y no como para que se tomen en cualquier forma de una limitación de la presente invención, para lo cual los fines de las reivindicaciones presentes se anexan a la presente.

EJEMPLO 1 La efectividad terapéutica de ML3000 en el desarrollo de las lesiones en la os teoartritis experimental (OA) del modelo del perro se estudia. En particular la acción de ML3000 en la síntesis de colagenasa-1 (MMP-1) en el cartílago e int erleuquin-1 ß ( IL-1 ß ) en la membrana sinovial así también como en la actividad de la fosfatasa alcalina, la producción de IGF-1, la eliminación de ost eocalcina , PEG2 y la actividad de uPA en ó mediante los osteoblastos primarios se determinan . Grupos experimentales. 21 perros adultos mestizos (de 2 a 3 años de edad) que pesa de 20-25 kilogramos cada uno se usa en este estudio. Se segmenta quirúrgicamente del anterior ligamento crucial (ACL) de la rodilla derecha a través de una herida que se realiza en todos los perros como se describe anteriormente (5,6) . Antes de la cirugía, los animales se anestesian intravenosamente con pent obarbit al de sodio (25mg/kg) y se entuban. Después de la cirugía los perros se mantienen en una granja en dónde están libres para ejercitarse en un corral grande. Los perros se separan al azar en grupos de 3 para el tratamiento. Grupo 1 (n =7 perros) a estos perros se les proporciona un tratamiento de placebo (metilcelulosa encapsulada) (perros OA) ; los grupos 2 y 3 (n =7 perros por grupo) reciben ML3000 encapsulada 2 veces al dia por 8 semanas en una dosis total de 2.5 y 5mg/kg, respectivamente iniciando el día siguiente la cirugía. La medicación se administra 7 días/semana a través del tiempo del estudio. Todos los perros se murieron 8 semanas después de la cirugía . Todos los perros en cada uno de los grupos experimentales completan el estudio. Ningún ciclo clínico de toxicidad se presenta en el perro, incluyendo aquellos relacionados al tracto gastrointestinal, se nota en el grupo de perros tratados con ML3000. El nivel de la actividad diaria es similar en todos los perros de los 3 grupos experimentales, y no hay cambio en el peso del cuerpo de los perros durante el periodo de estudio. Análisis estadístico. Los valores son expresados como + SEM. Los análisis estadísticos se hacen usando una prueba de Mann- hitney U. Los valores P menores que 0.05 son considerados significativos.

Gradiente macroscópico. Inmediatamente después de la muerte la rodilla derecha de cada uno de los perros se somete a disección, se coloca en hielo y el fluido sinovial se aspira. Cada rodilla se examina mediante 2 observadores independientes cubiertos (DVJ, JCF) para los cambios morfológicos comunes incluyendo la presencia de la formación de osteofito y lesiones del cartílago que son previamente descritas (5,6) . El grado de la formación de osteofito se evalúa mediante la medición del ancho máximo (mm) de la punta de cada uno de los cóndilos femorales. Los cambios del cartílago en los cóndilos femorales medio lateral y el límite tibial están evaluados separadamente bajo un microscopio de disección (Stereozoom; Bausch & Lomb, Rochester, NY) . El área de los cambios de la superficie articular se mide y se expresa en mm2. La profundidad de la erosión se mide en una escala de 0-4, como sigue: 0 = superficie que parece normal, 1 = fibrilación mínima ó una decoloración ligeramente amarilla de la superficie, 2 = erosión extendida en las capas superficial ó media, 3 = erosión extendida en las capas profundas, y 4 = erosión extendida al hueso subcondrial . Osteofitos. En los perros OA tratados con placebo, los osteofitos están presentes en 93% de los cóndilos, y sus anchos midieron 4.50 ± 0.66mm. En- los perros tratados con 2.5 mg/kg/día y 5mg/kg/día de ML3000, los osteofitos están presentes en 93% y 86% respectivamente. Las mediciones del ancho de los osteofitos en los dos grupos tratados son más pequeños marginalment e comparados con el grupo 0? tratado con placebo (3.57 ± 0.56 y 3.86 ± 0.66 respectivamente) y estas diferencias no alcanzan significativo estadístico. Cartílago. En los perros ?? tratados con placebo, las lesiones del cartílago de grado moderadamente severo y tamaño están presentes en los cóndilos y en el límite con lesiones más severas en el límite (Figura 1) existe una reducción significante en el tamaño de las lesiones en los cóndilos y en el límite de ambos grupos tratados con ML3000. En el grupo que se les proporciono 2.5 mg/kg/día el tamaño de las lesiones sobre los cóndilos femorales son inferiores a 39% - (P<0.05) y por 45% (P<0.01) en el límite tibial. En el grupo que recibió 5 mg/kg/día el tamaño de las lesiones en los cóndilos femorales son también reducidos (61%, P<0.04) mientras el efecto en el límite tibial que es aproximadamente el mismo como aquel que se encontró en el grupo de 2.5 mg/kg/día (54% ?<0·.001) . Ambas concentraciones de ML3000 reducen significativamente el grado de las lesiones sobre el límite tibial aproximadamente el mismo grado. Aunque las lesiones de los cóndilos femorales del perro tratado muestran una reducción en su grado no alcanza significado estadístico. Membrana sinovial . El fluido sinovial de los perros 0? tratados con placebo es hipertrófico, demostrando una decoloración roja y amarillenta y que contiene un gran número de vasos sanguíneos. En los perros tratados con ML3000, el sonovial es más delgado contenido más poco en los vasos sanguíneos y la decoloración es menos intensa comparada con los perros OA tratados con placebo. Gradiente histológico. La evaluación histológica se realiza en secciones sagitales del cartílago a partir de áreas lesionadas de cada uno de los cóndilos femorales y del límite tibial como se describe en (7.8) . Los especímenes se someten a disección, se fijan en un TissuFix #2 (Laboratories Gilíes Chaput, Montreal, Québec Canadá) y se sumergen en parafina para la evaluación histológica. Varias secciones (5µ??) se tiñen con safranina 0. La severidad de las lesiones OA se mide en la escala de 0 a 14, mediante dos observadores independientes (DJ, JF) usando la escala histológica/histoquímica de Mankin y col (12) . Esta escala evalúa la severidad de las lesiones OA basadas en la pérdida del tinte con safranina O (escala 0-4), los cambios celulares (escala 0-3) invasión de la linea superior mediante los vasos sanguíneos (escala 0-1) y los cambios estructurales (escala 0-6), en dónde 0 = la estructura del cartílago normal, y 6 = erosión del cartílago hacia el hueso subcondrial) este sistema de evaluación se basa en la mayoría de varios de los cambios histológicos dentro de cada una de las secciones del cartílago. Los especímenes representativos de la membrana sinovial de los canales de los compartimientos de la rodilla lateral y media también se someten a disección a partir del tejido inferior. Los especímenes se fijan en TissuFix #2 se sumergen en parafina, se seccionan (5µp?) y se tiñen con hematoxilina y eosina. Dos especímenes de la membrana sinovial de cada uno de los compartimientos son examinados, las selecciones en serie se mide a través de los especímenes y cada uno se evalúan por separado. La evaluación más elevada de cada uno de los especímenes se registra. El promedio se calcula y se considera como una unidad para la rodilla completa. La severidad de la sinovitis se mide en una escala de 0-10 (13) mediante dos observadores independientes (DVJ, JCF) con además las evaluaciones para tres criterios histológicos: hiperplasia de la célula cubierta del sinovial (escala 0-2) hiperplasia vellosa (escala 0-3) y grado de la infiltración celular mediante las células mononucleares y polimorfonucleares (escala 0-5) . Cartílago . El cartílago de los perros ?? tratados con placebo presentan cambios morfológicos que incluyen fibrilación y fisuras, hipercelularidad y clonación, y una pérdida del tinte de safranina O. La evaluación histológica para las lesiones sobre los límites son ligeramente más severos que para aquellos en los cóndilos (Figura 4) .En los perros tratados con ML3000 las lesiones en los cóndilos son menos severas comparadas con los perros OA tratados con placebo, y el significado estadístico se obtiene en el grupo tratado con la dosis más elevada del fármaco (5 mg/kg/día) Esta reducción en la- evaluación histológica es más grande debido a una reducción en la severidad de los cambios estructurales y pérdida del tinte de safranina O. En el límite tibial, una reducción significativa estadísticamente en la severidad de las lesiones (P<0.002 y P<0.02 respectivamente) , se obtiene con ambas dosis de ML3000 (2.5 y 5 mg/kg/día) . Esto resulta de una reducción en la pérdida del tinte de safranina 0 y la severidad de los cambios estructurales en adición a una reducción en la clonación celular. Membrana sinovial . El sinovial de los perros OA tratados con placebo es denso, tiene numerosas vellosidades y muestra hiperplasia de célula revestida por sinovial. En los perros tratados con ML3000, existe una reducción significativa en hiperplasia vellosa en el grupo de 5 mg/kg/dia. Medición de PGE2 en el fluido sinovial. El fluido sinovial se toma al mismo tiempo del sacrificio y se centrifuga (14,000gr, 15 minutos, 4°C) y los sobrenadantes se usan para la determinación de PGE2. El nivel de PGE2 se determina usando un inmunoensayo de la enzima específica (???) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) . Los fluidos sinoviales de los perros OA tratados con placebo contienen un nivel elevado de PGE2Í652.8 + 149.9 pg/ml) . El tratamiento con ML3000 a 2.5 y 5 mg/kg/día reduce marcadamente este nivel (Figura 5) . Producción LTB4 en el cultivo extraído sinovial. Los especímenes representativos de la membrana sinovial de todos los perros se someten a disección asépticamente partiendo del tejido subyacente. Los especímenes se lavan varias veces en un medio Eagle modificado Dulbecco (DMEM; Gipco-BRL Life Technologies, Burlington, Ontario, Canadá), y 150 mg del tejido incubado (duplicado) por 48 horas a 37°C en una atmósfera humidificada de aire 95%/C02 5% en un medio DMEM en la presencia de l g/ml del lipopolisacárido (LPS; Sigma-Aldrich Canadá Oakville, Ontario Canadá) . El LTB4 se extrae del sinovial del cultivo como sigue: las membranas son homogenizadas en una solución reguladora de EIA (fosfato 1M, pH 7.4 que contiene 1% de BSA, NaCl 4M, EDTA lOmM y 0.1% de azida de sodio) y se centrifuga (30,000g, 20 minutos, 4°C) . Los sobrenadantes se recogen y los niveles de LTB4 se determinan usando EIA (Caytnan Chemical) . El sinovial cultivado de los perros OA se prueba con l g/ml de LTS contenido en una cantidad significativa de LTB4 (2.48 ± 0.69 pg/mg de tejido) . Ambos grupos tratados con ML3000 demuestra una reducción significante estadísticamente en los niveles de LTB4 (Figura 5) .

Inmunohis toquimica . Los especímenes de la membrana sinovial y del cartílago son procesados mediante análisis inmunohi st oquímico como se ha descrito anteriormente (7,14) . .Brevemente los especímenes se fijan en una solución reguladora neutra de formalina al 4% por 24 horas, luego se sumerge en parafina. Las secciones de (5µp?) de los especímenes sumergidos en parafina se colocan en platinas Superfrost Plus (Fisher Scientific, Nepean, Ontario Canadá) , se elimina la parafina en tolueno, se deshidrata en series medidas de etanol, y se pre-incuban con condrioitinasa ABC (0.25 unidades/ml) en una solución reguladora salina de fosfato (PBS; Sigma Aldrich Canadá) por 60 minutos a 37°C. Después de esto, los especímenes se lavan en PBS, luegu otra vez en peróxido de hidrógeno al 0.3%/PBS por30 minutos. Las platinas luego se incuban adicionalmente con una solución de blogueo (Dako Diagnostics, Mis s is sauga , Ontario Ca adá) y leche descremada al 5% por 60 minutos. Se marcan y luego se sobreponen con el anticuerpo monoclonal primario contra colagenasa-1 (100 dilución 1:500 , Oncogene Research Products, Cambridge, NA) (cartílago) ó el anticuerpo primario contra IL-?ß (l]ig/ l, dilución 1:50; Biosource International, Camarillo, CA (membrana sinovial) por 18 horas a la temperatura ambiente en una cámara de humidificación .

Cada una de las platinas se lava 3 veces en PBS (pH 7.4) y se tiñe usando el método complejo de Avidin-biotina (paquete de Vectastaina ABC; DAKO Diagnostics Canadá) . Este método comprende la incubación en la presencia del anticuerpo secundario conj ugado-biotina por 30 minutos a la temperatura ambiente seguido por la adición del complejo de avidin-biotin-peroxidasa por 30 minutos. Todas las incubaciones se llevan a cabo en una cámara de humidificación y el color comprendido de 3'3'-diaminobencidina ( DAKO Diagnostics Canadá) que contiene peróxido de hidróxido. Las platinas se tiñen en dirección opuesta con rojo neutro (cartílago) ó hematoxilin/eocina (sinovial). Para la determinación de la especificidad del teñido, 3 procedimientos de control se emplean de conformidad al mismo protocolo experimental: 1) uso de suero inmune absorbido (1 hora, 37°C) con un exceso molar de 20 veces de la colagenasa-1 recombinante ó IL-?ß; 2) la omisión del anticuerpo primario; y 3) la sustitución del anticuerpo primario con un suero preinmune antologo . Los antígenos purificados usados en éste estudio son colagenasa-1 recombinante humana (Oncogeno Research Products) ó IL-?ß recombinante humano (Genzyme Cambridge, MA, USA) . Las varias secciones se hacen de cada uno de los bloques del cartílago, y las platinas de cada uno de los especímenes se procesan para el análisis inmunohistoquímico . Cada una de las secciones se examina bajo un microscopio ligero (Leitz Orthoplan; Hill Leitz, St . Laurent Québec Canadá) y se toma fotografías con una película de Kodak Ektachrome 64 ASA (Kodak, Rochester, NY) . Cartílago (Figura 3) . En los perros tratados con placebo, un gran número de condriocitos en las capas superficiales de los especímenes del cartílago, se tiñen positivos para la colagenasa-1 tanto en los cóndilos como en el límite. En los perros OA tratados con ML3000, ambos cóndilos y los límites presentan una reducción significativa en el promedio de las células de los condriocitos para la colagenasa -1-el efecto el cual es ligeramente más pronunciado en el grupo tratado con la dosis más elevada del fármaco.

Membrana sinovial (Figura 3) . El examen de las muestras del sinovial de los perros OA tratados con placebo muestra la presencia de un gran número de células recubiertas teñidas fuertemente positivas para IL-?ß. En los perros tratados con ML3000 existe una dosis dependiente y reducción significativa en el número de células que muestran teñido positivo para IL-?ß .

Análisis morfométrico.

Cartílago . La cuantif icación de los diferentes antigenos en el cartílago se hace usando un método publicado (7.14) . La presencia del antígeno se estima mediante la determinación del número de condriocitos que se tiñen positivos en la zona superior (capas intermedia superior y superficial) del cartílago. En esta zona, el cartílago se divide en 3 campos microscópicos (X 40; Leitz Diaplan) y se promedia. Para cada uno de los especímenes artríticos, se mide antes de la evaluación tal que una superficie del cartílago intacto puede ser detectada y usada como un marcador para la validación del análisis morf ométrico . El número total de los condriocitos y el número de los condriocitos teñidos positivos para el antígeno específico se determinan. Los resultados finales se expresan como el porcentaje de los • condriocitos que se tiñen positivos para el antígeno (Evaluación celular) con la evaluación máxima siendo 100%. Cada una de las platinas se somete a una doble evaluación enmascarada que resulta en una variación de <5%. Los datos obtenidos de los cóndilos laterales y medios y el límite tibial son considerados como independientes para los fines del análisis estadístico. Membrana sinovial. Para el análisis de la membrana sinovial. Una evaluación de las células de los especímenes diferentes se determina para cada una de las secciones usando un método publicado (8) . Cada uno de los especímenes se divide en 5 campos microscópicos (X 40) al nivel cubierto del fluido sinovial. El porcentaje de las células teñidas positivas para el antígeno específico se evalúa en cada uno de los campos como se ha descrito antes para el cartílago. Las evaluaciones para contar las células se dan separadamente para las células cubiertas del fluido sinovial y el infiltrado celular mono-nuclear con el máximo para cada una de las áreas es 100%.

Análisis de osteoblastos . El final próximo de la tibia se elimina como se describe abajo, se lava en una solución salina fisiológica fría y se coloca en hielo antes y a través de la disección. El límite tibial medio se extrae para preparar las extracciones y los cultivos celulares del hueso primario; ningún tejido del hueso cortical marginal se incluye. El cartílago subyacente se elimina primero del límite tibial, y las extracciones límites se someten a disección exclusivamente a partir de la porción media del límite medio. El tejido del hueso trabecular luego se somete a disección fuera de la placa del hueso subcondrial. Todas las manipulaciones se realizan bajo una amplificación del microscopio para asegurar la eliminación completa del cartílago y del hueso trabecular . Las muestras se usan para preparar los cultivos celulares primarios como se describe en (16), con modificaciones menores. Las muestras del hueso se cortan en piezas pequeñas. (¿mm)2 antes de su digestión secuencial en la presencia de un mg/ml de la colagenasa tipo 1 (SIGMA) en un medio Eagle modificado de Ham F-12 /Dulbecco sin suero (DMEM; SIGMA) a 37°C por 20, 20 y 240 minutos. Este tratamiento elimina tanto las células estrechas de hueso restantes y las adherentes de las piezas de hueso corticales. Después de lavarse con el mismo medio, las piezas del hueso que se sometieron a digestión se cultivan en un medio BGJ que contiene suero de bovino fetal al 20% (FBS; Wisent St . Bruno Québec Canadá. Este medio se reemplaza cada 2 días hasta que las células se observen en cajas Petri, en este tiempo el medio de cultivo se reemplaza con un medio fresco que contiene FBS al 10%, las células se pasan 1 vez en una proporción de 25,000 células/cm2 y se cultivan en placas de 24-huecos (Falcon Lincoln Park, NJ) por 5 días antes del ensayo. Las células obtenidas bajo estas condiciones de cultivo muestran un fenotipo celular similar a los osteoblastos , como se nota en (16) . Las condiciones se realizan por al menos 2 días del cultivo, en la presencia ó ausencia de 50nM de (OH)2D31.25 ( 1 , 25-dihidroxi vitamina D) para la estimulación máxima, en F-12 Ham/DMEM, que contiene FBS atrapado en carbono al 2%, lo cual proporciona una estimulación máxima de la actividad de la fosfatasa alcalina y la secreción de osteocalcina como se nota en (16) . El medio se recoge al final de la incubación y se congela a -80°C antes del ensayo. Las células se lavan 2 veces con una solución salina reguladora de fosfato, pH 7.4 y se solubiliza en una solución reguladora de fosfato- alcalino (lOOmM de glicina, lmm de MgCl2 lmm de ZnCl2, Tritón. X-100 al 1%, pH 10.5) por 60 minutos por agitación a 4°C.

Liberación de osteocalcina. La liberación de osteocalcina se mide en Ham F-12 /DMEM acondicionado (1:1) preparado para los 2 últimos días del cultivo de las células similares a los osteoblastos como se describe en (16), que contiene FBS tratado con carbono al 2%, y en la presencia de 50nM de (OH)2D3 1.25 ó el vehículo (0.1% de etanol) . La osteocalcina naciente se determina usando un inmunoensayo de la enzima específico (Biomedical Technologies, Stoughton, MA) . La detección del límite de este ensayo es de 0.5 ng/ml, FBS tratado con carbono al 10% que contiene <0.1 ng/ml de osteocalcina. Los resultados se muestran en la Figura 6.

Actividad de la fosfatasa alcalina. La actividad de la fosfatasa alcalina celular se determina, en las células usadas para la liberación de osteocalcina, como la liberación de p-nitrofenol hidrolizado a partir del fosfato de p-nitrofenilo (12.5 mM de concentración final) a 37°C por 30 minutos -después de la solubilización de las células en una solución reguladora de fosfatasa alcalina como se ha descrito antes. La fosfatasa alcalina se determina inmediatamente en alícuotas. La determinación de la proteínas se realiza mediante el método de ácido Bicinconí nico descrito en Smith, P.K. Krohn, R.I. ; Hermanson, G . T . ; Malila A.K. ; Gartner, F.H. Provenzano, M.D. y col; "Medición de la proteína que usa ácido Bicinconínico", Anal Biochem, 150, 1985, 76-85. Los resultados se muestran en la Figura 7.

Evaluación de uPA y IGF-1 en osteoblastos primarios . Para la evaluación de Upa y de IGF-1 en medio de acondicionamiento a partir de las células similares a osteoblastos se alimentan con Hará F-12/DMEM, sin PBS pero contiene la mezcla de insulina-bet a-globulina-selenio al 1% (ITS, Sigma) por al menos de dos días de cultivo. Primero se determinan los niveles de uPA mediante el ensayo inmuno absorbente similar a la enzima específica (Elisa; American Diagnostica Greenwich, CT) . Luego se usa el procedimiento descrito en Leprince, P ; Rogister, B Moonen, G.A. ; "Ensayo Colorimétrico Para la Medición Simultánea de los Activadores de Plasminógeno y de los Inhibidores del Activador del Plasminógeno en un Medio Condicionado y Libre de Suero a partir de Células Cultivadas", Anal Biochem, 117, 1989, 341-346, para determinar la actividad de uPA mediante la hidrólisis de sustrato específico de DL-Val-Leu-Arg-p-nitroanilida (Sigma) el cual libera la p-nitroani lina que se puede detectar a 405 mM. Los niveles PAL-1, se determinan mediante Elisa, usando materiales disponibles de American Diagnostica (Greenwich, CT) .

El IGF se determina usando un ensayo de Elisa de alta sensibilidad (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX que no interacciona con la insulina. Los estudios de control internos se realizan con el medio solo que contiene 1% de ITS, y cualquiera de los valores obtenidos se muestran abajo para el limite de la detección. Para el medio de acondicionamiento de las muestras del cultivo celular, 3 ó 4 sobrenadantes se mezclan, se liofilizan, y luego se reconstituyen en una solución reguladora de PBS, de pH 7.4. Las muestras luego se tratan de conformidad al método descrito en Mohán, S., Bautista, C . M . ; Herring, S.J. Linkhart, ?.?.; Baylink, D. J . ; "Desarrollo de métodos válidos para medir los Factores de crecimient o-I y -II similares a la insulina en un medio condicionado de célula de hueso, Endocrinología 126, 1990, 2534-42. Los resultados se muestran en las Figuras 8 y 9.

Evaluación de PGE2 en los osteoblastos primarios. El PGE2 en los osteoblastos primarios se determina esencialmente de la misma manera como se ha descrito antes para el fluido sinovial. Los resultados se muestran en la Figura 10. A partir de los resultados anteriores se puede concluir que el ML3000, un inhibidor doble equilibrado de COX/5-LO, pueden reducir significativamente el desarrollo de OA experimental temprano al mismo tiempo como inhibir in vivo la producción de PGE2 y LTB4 el efecto protector del fármaco está relacionado ampliamente a la inhibición marcada de las trayectorias patof isiológicas de 0? principales - a saber la síntesis mayor de IL-?ß y la colagenasa -1. Algunos de estos efectos parecen ser similares a la inhibición de la producción en exceso de LTB4.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Uso de uno ó más de un compuesto Fórmula ( I ) : En dónde X representa CR8R9, S, O, NR12 ó C(O) A representa CR10R11, o un enlace entre X y el átomo que lleva los radicales R6 y R7 ; El primero de los radicales Rl, R2 , R3f representa: Arilo opcionalmente substituido con uno o más de los substituyentes independientemente seleccionados entre otros el' grupo que consiste de halógeno, alquilo, haloalquilo, alcoxi, ariloxi, hal ogenoalcoxi , alquiltio, hidroxi, nitro, alquilsulfinilo , alquilsul fonilo , sulfamoilo, N-alquil sulfamoilo , N,N- dialquilsulfamoilo, alquilsulfonamido , y alquilsulfon-N-alquilamido , ; o un grupo heterociclico benzoanillado opcionalmente, mono- o bicíclico, aromático o no-aromático que tiene 1, 2, 0 3 heteroátomos independientemente seleccionados de N, O, y S y opcionalmente estando substituidos con uno o mas de un substituyente independientemente seleccionados entre el grupo que consiste de halógeno, alquilo, halogenoalquilo, alcoxi, ariloxi, halogenoalcoxi, alquiltio, hidroxi, nitro, alquilsulfinilo , alquilsulfonilo, sulfamoilo, N-alquilsulfamoilo , N, N-dialquilsulfamollo, alquilsulfonamido , y alquilsulfon-N-alquilamido ; segundo de los radicales Rl, R2 , R3 representa Alquilo, opcionalmente substituido con uno mas de uno de los substituyentes independientemente seleccionados entre el grupo que consiste de halógeno, cicloalquilo , alcoxi, trifluorometoxi, hidroxi y trifluorometilo ; Cicloalquilo opcionalmente substituido con uno o más de de uno de los substituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de halógeno, alquilo, halogenoalquilo, cicloalquilo, alcoxi, halogenoalcoxi, e hidroxi; Arilo opcionalmente substituido con uno o mas de uno de los substituyentes independientemente seleccionados entre el grupo que consiste de halógeno, alquilo, halogenoalquilo , alcoxi, ariloxi, halogenoalcoxi, alquiltio, hidroxi, nitro, alquilsulfinilo , alquilsulfonilo, sulfamoilo, .. N-alquilsulfamoilo , N,N- dialquilsulfamoilo , alquilsulfonamido, y alquilsulfon-N-alquilamido ; o un grupo heterociclico opcionalmente benzoanillado mono- o bi-ciclico aromático o no-aromático, que tiene 1, 2, o 3 heteroátomos independientemente seleccionados de N, O, y S y estando opcionalmente substituidos con uno o mas de un substituyente independientemente seleccionados entre el grupo que consiste de halógeno, alquilo, halogenoalquilo, alcoxi, ariloxi, halogenoalcoxi, alquiltio, hidroxi, nitro, alquilsulfinilo , alquilsulfonilo , sulfamoilo, N-alquilsulfamoilo , N, N-dialquilsulfamoilo , alquilsulfonamido y alquilsulfon-N-alquilamido ; tercero de los radicales Rl, R2 , R3, representan H, alquilo, halogenoalquilo, hidroxialquilo , CHO, -COOH, halógeno, ciano, alquilsulfonilo , sulfamoilo ó B-Y, en dónde B representa alquileno ó alquenil'eno , - opcionalmente sustituidos con hidroxi ó alcoxi; Y representa -COOH, S03H, OPO(OH)2, OP(OH)2, -CHO ó tetrazolilo; ó El segundo y el tercero de los radicales Rl, R2 , R3 representan junto con el átomo al cual se unen al cicloalquilo saturado ó insaturado; R4-R11 que pueden ser los mismos ó diferentes, representan Hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo , alcoxialquilo , hidroxi, COOH, ó aciloxi, en dónde los radicales vecinos pueden estar representados por enlaces ó radicales gemínales, junto con el átomo de carbono al cual se unen que pueden también representar carbonilo ó cicloalquilo; R12 representa Hidrógeno, alquilo ó fenilo, y los isómeros ópticos, sales y derivados fisiológicamente aceptables de los mismos, para el tratamiento ó prevención de la degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial .

2. El uso de un compuesto de conformidad a la reivindicación 1, en dónde el primero y el segundo de los radicales Rl, R2, R3, independientemente representan un arilo opcionalmente sustituido ó el residuo het erocí clico aromático.

3. El uso de un compuesto de conformidad a la reivindicación 1, en dónde el tercero de los radicales Rl, R2 , R3 representan COOH ó B-Y, en dónde

Y es COOH y B representa alquileno. 4. -El uso de un compuesto de conformidad a la reivindicación 2, en dónde el tercero de los radicales Rl, R2, R3 representa COOH ó B-Y, en dónde

Y es COOH y B representa alquileno. 5. -El uso de un compuesto de conformidad a la reivindicación 1, en dónde el compuesto de la Fórmula (I) es el ácido [ 6- ( 4 -clorofenil ) -2 , 2 -dimet il- 7 - fenil-2 , 3 -dihidro-lH-pirroli zina-5-il ] -acético de la Fórmula (la) .

Una sal fisiológicamente aceptable ó un éster fisiológicamente hidrolizable del mismo. 6. -El uso de un compuesto de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en dónde la 'degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o el hueso subcondrial comprende la lesión, daño ó pérdida del cartílago articular y/o del hueso subcondrial .

7. -El uso de un compuesto de conformidad a cualquiera de las r.eivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de una etapa temprana de la degeneración ó destrucción.

8. -El uso de un compuesto de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de un mamífero cuyo estado actual ó probable es un síntoma de la degeneración ó de la destrucción.

9. -El uso de conformidad a la reivindicación 8, en dónde el estado del mamífero como está actualmente ó probable es el síntoma de terminado por uno ó más de lo siguiente: , (A)Los resultados positivos del examen clínico y evaluación de las articulaciones del mamífero, incluyendo la medición del progreso de displasia de la cadera; (B) la realización de cualquier procedimiento quirúrgico agresivo en una ó más de las articulaciones del mamífero; (C) los resultados positivos de un examen en una ó más de las articulaciones del mamífero que usa procedimientos no agresivos incluyendo radiografía e imagen de resonancia magnética (MRI) ; y (D) los resultados positivos de cualquier prueba bioquímica realizada en los fluidos del cuerpo ó en el tejido de la ..articulación del mamífero con relación a una ó más de las siguientes sustancias : (1) int erleukin-lbeta incrementada (IL-?ß) ; (2) factor de necrosis tumoral alfa incrementado ( TNFOÍ ) ; (3) La proporción incrementada de IL-?ß a lL-ß de la proteína antagonista del receptor (IL-IRa) ; (4) expresión incrementada de los receptores p55 TNF (p55 TNF-R) (5) interleukin- 6 (1L-6) incrementada; factor inhibitorio de leucemia incrementado (LIF) ; (6) ifactor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) sin cambiar ó reducido; (7) transformación reducida del factor de crecimiento beta ( GFfi) ; factor de crecimiento derivado-plaquetas reducido ó sin cambiar (PDGF) ; (8) factor de crecimiento de fibroblasto básico reducido ó sin cambiar (b-FGF) ; (9) sulfato de queratan incrementado; (10) metaloproteasa de matriz incrementada (MMPs) incluyendo estromelisina; (11) proporción incrementada de la metaloproteasa de matriz (MMPs) incluyendo est omeli s ina , al inhibidor del tejido de metaloproteasas (TIMP); (12) osteocalcina incrementada; (13) fosfatasa alcalina incrementada; (14) cAMP incrementada en respuesta al reto de hormona ; (15) activador del plasminógeno de uroquinasa incrementada (uPA); (16) prote na de la matriz oligomérica del cartílago incrementada; (17) presencia de los neoepitopes de colágeno específico tipo-II y (18) colagenasa incrementada.

10. -El uso de un compuesto de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en dónde el tratamiento ó prevención comprende la administración del compuesto en una cantidad aproximadamente 1-10 mg/kg/día .

11. -El uso de un compuesto de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en dónde el tratamiento ó prevención incluye la administración en adición a uno ó m de los compuestos de la Fórmula I de uno ó más miembros seleccionados del grupo que consiste esencialmente de " glicoaminoglicano polisulfatado (PSGAG) , glucosamina, sulfato de condroitin (CS), ácido hialurónico (HA), polisulfato de pentosan (PPS) doxiciclina y minociclina.

12. -Una composición farmacéutica que comprende: (A) uno ó más de un compuesto de la Fórmula I como se define en la reivindicación 1; y (B) uno ó más miembros seleccionados del grupo que consiste esencialmente de (1) glicoaminoglicano polisulfatado (PSGAG), glucosamina, sulfato de condroitin (CS), ácido hialurónico (HA), polisulfato de pentosan PPS) , doxiciclina y minociclina.

13. -Una composición farmacéutica de conformidad a la reivindicación 12, en dónde el compuesto de la Fórmula (I) es el ácido [ 6- ( 4-clorofenil) -2 , 2-dimetil-7-fenil-2 , 3-dihidro-lH-pirrolizina-5-] -acético de la Fórmula (la) Una sal fisiológicamente aceptable ó un éster fisiológicamente hidrolizable del mismo.

14. -Un método para el tratamiento ó prevención de la degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial en una ó más de las articulaciones de un mamífero en necesidad de tal tratamiento, que comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva terapéuticamente para el tratamiento ó prevención de la degeneración ó destrucción del cartílago articular y/o del hueso subcondrial, de uno ó más del compuesto de la Fórmula (I) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7