JP2017061539A - Bcat1阻害剤を使用する治療方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼのサイトゾル型(BCAT1)酵素阻害剤を用いる医薬組成物。該BCAT1阻害剤としては、式(1)で表される化合物、特に、R1がメチル基である4−メチル−5−オキソヘキサン酸であることが好ましい。
[R1はH、直鎖又は環状アルキル基、アルキレン基、置換又は非置換の芳香環、アルコキシ又はアルキルアミノ基;X+は陽イオン]
【選択図】図1
Description
インターロイキン−1β(IL−1β)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−10(IL−10)、及びインターフェロン−アルファ(IFN−α)等の炎症性サイトカインの上昇を特徴とする。また、同じサイトカインがこれらの疾患の発症機序において役割を果たす可能性がある(非特許文献4)。
種の形態的に明らかに異なる細胞種、即ち、マクロファージ様滑膜細胞(MLS)及び線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)で構成される。RAの間、CD4+T細胞はマクロファージと共に、またそれほど多くはないがB細胞、形質細胞、星状細胞及び肥満細胞と共に蓄積して滑膜を介し侵入する(これらの細胞は、炎症性シグナルを分泌し、滑膜細胞の活性化を補助する)。MLSからの炎症性サイトカインの分泌は、FLSの活性化をもたらす。活性化されたFLSは、単独で、又はMLSと連携して攻撃的に細胞外マトリクスを分解する。滑膜細胞の過形成は、滑膜表層の肥厚、及びそのパンヌス(関節軟骨及び軟骨下骨へと侵入する組織塊)への転換を生じる。FLSの侵入は、MMP及びカテプシンの分泌を介して軟骨を分解する。さらに、活性化FLS及びT細胞は、前駆体骨髄性細胞の破骨細胞への最終的な分化を担うタンパク質であるNF−κBリガンドの受容体活性化因子(RANKL)を放出する。進行性RAにおいて、破骨細胞形成の増加は、骨浸食をもたらす(非特許文献5)。
によって包含される化合物群から選択される化合物である。
を含む、方法を提供する。この実施形態の態様において、BCAT1阻害剤は、式(1):
によって包含される化合物群から選択される化合物である。この実施形態の態様において、がんはCD147の過剰発現を特徴とし、よって、本発明はCD147を過剰発現するがんを治療する方法を提供する。特定の態様において、D147を過剰発現するがんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、脳腫瘍、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、肝臓がん、頭頸部がん、消化器がん、口腔癌及び白血病からなる群より選択されるがんである。
患に関連する骨量減少である。
本明細書で使用される数量を特定していない単数形("a", "an" and "the")の用語は
、1つ又は複数を意味すると定義され、文脈から不適当でない限り複数を包含する。
及び「治療(treatment)」の用語は、それらの通常かつ慣例の意味を有し、疾患症状の
緩和、疾患症状の再発の阻止又は緩和、疾患症状の重症度及び/又は頻度の減少のうち1つ又は複数を含む。治療は、治療が施されていない被験体に対して約1%〜約100%緩和すること、阻止すること、低減すること、減少すること又は阻害することを意味する。好ましくは、緩和、阻止、低減、減少又は阻害は、約100%、約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%、約5%又は約1%である。治療は、疾患の臨床症状の前、臨床症状と同時、又は臨床症状の発現に際して開始されてもよい。したがって、被験体は、疾患を有していてもよく、又は単に疾患に易罹患性であってもよい。治療の結果は恒久的なものであってもよく、又は数日間(1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間又は7日間)、数週間(1週間、2週間、3週間又は4週間)又は数か月(1カ月間、2カ月間、3カ月間、4カ月間、5カ月間、6カ月間、又はそれ以上)に亘って持続するものであってもよい。
in vitroにおける腫瘍細胞増殖アッセイ
BCAT1阻害剤のがんの成長を抑制する能力を、細胞増殖アッセイを使用してin
vitroで評価する。細胞増殖アッセイは、典型的には、適切な培地中でコンフルエント近くまで細胞株を通例の方法で培養することを含む。その後、細胞をトリプシン処理し、1ウェル当たり2000細胞又は5000細胞で96ウェルプレートに播種する。阻害剤の存在下又は不在下において、細胞を48時間〜96時間培養する。その後、分光光度法(MTTアッセイ、BrdUアッセイ)又は蛍光光度法(Cyquantアッセイ)を使用して細胞増殖を決定する。
BCAT1阻害剤のがんの成長を抑制する能力を、転移性腫瘍の自然発症モデル(spontaneous metastatic tumor model)を使用してin vivoにおいて評価する。このモデルでは、転移誘発(pro-metastatic)細胞株(例えば、MDA−MB−231)の或る特定の細胞数を胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射する。腫瘍細胞を成長させ、腫瘍が触診可能となった場合に治療を開始する。コントロール(治療されていない)マウスの平均腫瘍体積は1000mm3にまで達し、麻酔下で腫瘍を外科的に摘出し、傷を閉じる。治療を更に数週間継続する。実験終了時に動物を屠殺し、標的器官を摘出して転移の存在を調べる。
RAの病理は、滑膜細胞の持続的な活性による炎症性タンパク質の産生と関連する。抗リウマチ薬を、LPS等の炎症性刺激の存在下でのマクロファージ及び線維芽細胞からの炎症性タンパク質の分泌を阻害する能力についてin vitroにおいて試験する。実験終了時に、ELISA又はウェスタン免疫ブロッティング等の免疫学的アッセイを通じて、細胞の馴化培地中に分泌タンパク質が検出される。
CIAは、RAの動物炎症モデルとしてよく知られている。このモデルにおいて、関節炎はアジュバント中の異種II型コラーゲンによる免疫化を介してラット又はマウスにおいて誘発され、動物の体肢における紅斑及び浮腫の存在によって臨床的に明らかとなる。通常、抗リウマチ薬は、関節炎の発現時に又は臨床的な症状発現に際して投与される。実験の間、動物は関節炎の存在をスコアリングされる。
上述の組成物は、局所、経口、直腸又は非経口(静脈、皮下または筋肉内)経路によって投与されてもよい。また、徐放のため疾患部位に埋め込まれる生分解性ポリマーに組み込まれてもよい。組成物の用量は、治療される病状、使用される薬物の活性、投与経路、及び疾患の重症度及び患者の体重等のその他の臨床的因子に依存する。組成物は、具体的な投与経路に適した方法で製剤化される。
賦形剤と組み合わせて投与されてもよい。単独で投与されるか、又は賦形剤と組み合わせて投与されるかにかかわらず、1つ又は複数のBCAT1阻害剤を含む製剤は、特定の疾患又は病状を治療するために有効な量で被験体に投与される。一般に、1つ又は複数のBCAT1阻害剤を含む製剤は、約0.1mg/体重kg〜約10mg/体重kgの量で被験体に投与される。また、許容される範囲として、約0.1mg/kg〜約5mg/kg、0.1mg/kg〜約4mg/kg、0.1mg/kg〜約3mg/kg、0.1mg/kg〜約2mg/kg、0.5mg/kg〜約5mg/kg、1mg/kg〜約5mg/kg、1.5mg/kg〜約5mg/kg及び2mg/kg〜約5mg/kgが挙げられる。製剤中のBCAT1阻害剤の具体的な用量としては、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、及び5mg/kgが挙げられる。しかしながら、被験体に投与される製剤中のBCAT1阻害剤の量は、疾患又は病状の位置、起源、属性、範囲及び重症度、治療される個人の年齢及び状態等によって幅広い範囲で変化する。最終的には、内科医が使用される適切な用量を決定する。また、1つ又は複数のBCAT1阻害剤を含む製剤の投与頻度も、治療される疾患又は病状、及び投与様式を含む因子により変化する。各製剤は、一日に4回、3回、2回独立して投与されるか、又は1日に1回投与されてもよく、隔日、2日おき、3日おき、4日おき、5日おき、1週間に1回、7日おき、8日おき、9日おき、隔週で、月に1回及び隔月で投与されてもよい。
MOHAによるBCAT1酵素活性の阻害
MOHAのBCAT1酵素活性を阻害する能力を、分光光度法により確認した。この実験において、0.1mgのMDA−MB−231腫瘍細胞において見出されるBCAT1を、0.25μLの抗BCAT1抗体及び5μLのプロテインAアガロースビーズ(Invitrogen)を使用して免疫沈降した。ビーズをピリドキサール5’−リン酸(PLP)5μL、硫酸アンモニウム50mM、NADH0.05mM、DTT5mM、α−ケトグルタル酸5mM、ロイシン10mM、及びロイシンデヒドロゲナーゼ(EMD Chemicals)0.
95U、並びに様々な濃度のMOHAを含有する反応緩衝液95μLに添加した。BCAT1結合ビーズの反応混合物への添加は、NADHの消費を導き、これは分光光度法により測定された(励起:330nm〜370nm;発光:450nm)。その後、10分間に亘って蛍光発光の変化率を推定した(10サイクル;1サイクル/分)。アッセイを、96ウェルプレートにおいて3回繰り返し行った。図1は、MOHAが>100nMの濃度でBCAT1の酵素活性を阻害することを示している。
CD147の細胞表面での発現の阻害
MDA−MB−231細胞を35mm培養皿に播種し、約80%培養密度になるまで成長させた。その後、それらを25mMのMOHAで24時間処理した。実験の終わりに、細胞を、使用説明書に従ってEZ−Link Sulfo−NHS−Biotin(Pierce, Thermo Scientific)を使用した表面ビオチン化に供した。細胞溶解に続き、Imm
obilized Neutravidin Biotin Binding Protein(Pierce, Thermo Scientific)を使用して、ビオチン化タンパク質を等量(約0
.4mg)の細胞溶解物から免疫沈降させ、75℃で10分間加熱することによって還元条件下でローディングバッファー中に溶出した。溶出されたビオチン化タンパク質を、SDS−PAGE電気泳動、及びCD147に対するウェスタン免疫ブロッティングに供した。また、この実験は、MOHA処理がん細胞に存在するCD147の総濃度を決定する手段として、非ビオチン化細胞溶解液0.2mgを含んでいた。図2は、MOHAで処理されたMDA−MB−231細胞は、CD147の細胞表面での発現の下方制御を生じることを示している。
MMP2分泌の阻害
ヒト腫瘍におけるMMPの大半が、腫瘍細胞よりも間質線維芽細胞により産生されることから、がんにおけるMMP産生に対するBCAT1阻害剤の効果は、線維芽細胞を使用することによってより良く理解される。96ウェルプレートに播種されたコンフルエントなHDF単層を、2%BSAを含有する無血清DMEM中において、0mM、10mM、又は25mMのMOHAで処理した。培養上清を24時間後に採取した。存在する細胞数に対して標準化した後、馴化培地を非還元条件下でゼラチン酵素電気泳動解析に供した。50mM Tris緩衝溶液(pH7.5)中の2.5%Triton X−100において短い(30分の)インキュベーションを行って分解されたタンパク質を復元した後、ゲルを1%Triton X−100、CaCl2 5mM及びZnCl2 10μΜを含有する50mM Tris(pH7.5)において37℃で16時間インキュベートした。その後、ゲルをBlue Stain Reagent(Thermo Scientific)を使
用して染色した。濃く染色されたタンパク質バックグラウンドに対する消化されたゼラチンの明るい領域として、MMPを可視化した。MMP2は、分子量によって決定される、HDFによって分泌される主要なゼラチナーゼである。図3は、25mMのMOHAでHDFを処理した後にMMP2の濃度が70%まで減少していることを示している。
がん細胞増殖の阻害
MCF−7、MDA−MB−231、MDA−MB−435、又はHT−29がん細胞を、1ウェル当たり2000細胞の細胞密度で96ウェルプレートに播種した。様々な濃度のMOHAで処理する前に、細胞を一晩接着させた。その後、それらを72時間に亘って増殖させた。Cyquant proliferation kit(Invitrogen)を使用してアッセイの最後に細胞数を決定した。図4は、MOHAが、5mM〜10mMのIC50値で腫瘍細胞の細胞増殖を阻害することを示している。
MOHAによる治療後の4T1乳癌を有するマウスの腫瘍成長の抑制
Balb/c雌マウスの乳腺脂肪体に、2×105のマウス4T1乳がん細胞を注入した。腫瘍細胞の接種から3日後に治療を開始し、9日間に亘って継続した。この調査は2つの動物群(n=8/群)を含む。コントロールマウスはビヒクル(PBS)を受け、治療マウスは表示される用量のMOHAの腹腔内投与を毎日受けた。腫瘍細胞の接種から12日後に治療を終了し、MOHAの最後の処置から2日後に終わらせた。図5より、調査
の終了時において、MOHAを受けたマウスは、約50%にも及ぶ原発腫瘍増殖の低減を経験していることが示された。
MOHAによる処理後のLPS刺激マクロファージのTNFα分泌の阻害
ヒト単球THP−1細胞(7.5×104細胞/96ウェルプレートのウェル)に由来するマクロファージを、200nMのPMAで96時間に亘って刺激した後に、MOHA不在下及び種々の濃度のMOHAの存在下において無血清培地中で6時間に亘って1μg/mLのLPSで活性化した。その後、馴化培地を採取し、細胞数当たりに標準化して、Biolegendから入手したELISAキットを使用してTNFαの存在を解析した。図6は
、THP−1由来マクロファージをMOHAで処理した後のTNFα分泌の抑制を示している。
CypA活性化の存在下又は不在下におけるマクロファージのMOHAによる処理後のMMP9分泌の阻害
ヒト単球THP−1細胞に由来するマクロファージを、200nMのPMAで96時間刺激した後に、200ng/mLのシクロスポリンA(CypA)の不在下又は存在下において、無血清培地中で24時間に亘り10mMのMOHAで処理した。接着した細胞に等しい数に対応する馴化培地を、SDS−PAGE電気泳動、及びMMP9に対するウェスタン免疫ブロッティングに供した。タンパク質発現レベルを、Image Jにより推定した。図7は、10mMのMOHAで処理された後の非刺激及びCypA刺激THP−1−由来マクロファージからのMMP9分泌の阻害を示している。
MOHAによる治療後のコラーゲン誘発関節炎(CIA)を伴うマウスにおける関節炎の阻害
6〜8週齢のDBA/1マウスの尾の付け根に、完全フロイントアジュバント中に乳化されたウシII型コラーゲン100mgを皮下注射した。免疫化から21日目に、マウスに不完全フロイントアジュバント中に乳化されたウシII型コラーゲン100mgの追加抗原注射を与えた。この実験には2つの群(n=10)が含まれ、各群は4週間に亘って週末を除き毎日、経口で1000mg/KgのMOHA又はビヒクル(Cremophor El)コントロールを受けた。関節炎の臨床症状が視認され、疾患が確立した場合に治療を開始した。
MOHAによる処理後のMC3T3前駆破骨細胞のRANKL分泌の阻害
MC3T3前駆破骨細胞を、7.5×104細胞/ウェルの細胞密度で96ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。その後、それらを1μg/mLのLPSで刺激し、種々の濃度のMOHAで24時間に亘って処理した。その後、馴化培地を採取し、細胞数当たりに標準化し、Abcamから入手したELISAキットを使用してRANKLの存在を解析
した。図11は、MOHAによる処理後のLPS刺激MC3T3細胞のRANKL分泌の阻害を示している。
Claims (38)
- 被験体においてがんを治療する医薬組成物の調製におけるBCAT1阻害剤及び薬学的に許容される担体の使用。
- 前記陽イオンが、H+、Na+、K+、及びNH4 +からなる群より選択される、請求項2に記載の使用。
- 前記BCAT1阻害剤が、4−メチル−5−オキソヘキサン酸又はその塩である、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記がんが、CD147の過剰発現を特徴とする、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、脳腫瘍、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、肝臓がん、頭頸部がん、消化器がん、口腔癌及び白血病からなる群より選択される、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記被験体がヒトである、請求項1又は2に記載の使用。
- 被験体において自己免疫炎症性疾患を治療する医薬組成物の調製におけるBCAT1阻害剤及び薬学的に許容される担体の使用。
- 前記陽イオンが、H+、Na+、K+、及びNH4 +からなる群より選択される、請求項9に記載の使用。
- 前記BCAT1阻害剤が、4−メチル−5−オキソヘキサン酸又はその塩である、請求項8又は9に記載の使用。
- 前記自己免疫炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、乾癬、及び炎症性腸疾患からなる群より選択される、請求項8又は9に記載の使用。
- 前記被験体がヒトである、請求項8又は9に記載の使用。
- 被験体においてRANKLの過剰発現及び骨量減少を特徴とする病態を治療する医薬組成物の調製におけるBCAT1阻害剤及び薬学的に許容される担体の使用。
- 前記陽イオンが、H+、Na+、K+、及びNH4 +からなる群より選択される、請求項15に記載の使用。
- 前記BCAT1阻害剤が、4−メチル−5−オキソヘキサン酸又はその塩である、請求項14又は15に記載の使用。
- 前記病態が、骨関節炎、骨粗鬆症、歯周病、骨巨細胞腫、及び慢性閉塞性肺疾患に関連する骨量減少からなる群より選択される、請求項14又は15に記載の使用。
- 前記被験体がヒトである、請求項14又は15に記載の使用。
- 被験体においてがんを治療する方法であって、がんを有する被験体に治療的に有効な量のBCAT1阻害剤及び薬学的に許容される担体を投与することを含む、方法。
- 前記陽イオンが、H+、Na+、K+、及びNH4 +からなる群より選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記BCAT1阻害剤が、4−メチル−5−オキソヘキサン酸又はその塩である、請求項20又は21に記載の方法。
- 前記がんが、CD147の過剰発現を特徴とする、請求項20又は21に記載の方法。
- 前記がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、脳腫瘍、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、腎臓がん、皮膚がん、肝臓がん、頭頸部がん、消化器がん、口腔癌及び白血病からなる群より選択される、請求項20又は21に記載の方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項20又は21に記載の方法。
- 被験体において自己免疫炎症性疾患を治療する方法であって、自己免疫炎症性疾患を有する被験体に治療的に有効な量のBCAT1阻害剤及び薬学的に許容される担体を投与することを含む、方法。
- 前記陽イオンが、H+、Na+、K+、及びNH4 +からなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記BCAT1阻害剤が、4−メチル−5−オキソヘキサン酸又はその塩である、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記自己免疫炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、乾癬、及び炎症性腸疾患からなる群より選択される、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項27又は28に記載の方法。
- 被験体において病態を治療する方法であって、RANKLの過剰発現及び骨量減少を特徴とする病態を有する被験体に治療的に有効な量のBCAT1阻害剤及び薬学的に許容される担体を投与することを含む、方法。
- 前記陽イオンが、H+、Na+、K+、及びNH4 +からなる群より選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記BCAT1阻害剤が、4−メチル−5−オキソヘキサン酸又はその塩である、請求項33又は34に記載の使用。
- 前記病態が、骨関節炎、骨粗鬆症、歯周病、骨巨細胞腫、及び慢性閉塞性肺疾患に関連する骨量減少からなる群より選択される、請求項33又は34に記載の方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項33又は34に記載の方法。
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