ES2951306T3 - Utilización de compuesto en la preparación de fármaco para tratar la enfermedad de los vasos cerebrales pequeños - Google Patents

Abstract

Se divulga el uso de 5α-androst-3β,5,6β-triol y análogos y compuestos deuterados del mismo o sales farmacéuticamente aceptables del mismo en la preparación de fármacos para tratar la enfermedad cerebral de pequeños vasos de pacientes. La enfermedad de pequeños vasos cerebrales son preferentemente microhemorragias cerebrales. Las microhemorragias cerebrales se refieren a microhemorragias cerebrales espontáneas, microhemorragias cerebrales relacionadas con drogas o microhemorragias cerebrales traumáticas. La presente invención confirma que estos compuestos mejoran significativamente la eliminación de la hemoglobina extravascular y, por tanto, pueden usarse para tratar la enfermedad de los pequeños vasos cerebrales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Utilización de compuesto en la preparación de fárma

Campo técnico

La presente invención se refiere a nuevos usos farmacéuticos del 5a-androst-3p,5,6p-triol ("triol") y sus análogos, en particular a usos de dichos compuestos en el tratamiento de la enfermedad de los vasos cerebrales pequeños.

Antecedentes

Los vasos cerebrales pequeños se refieren a pequeñas arterias perforantes y arterias pequeñas (diámetro entre 40 y 200 |jm), capilares y pequeñas venas cerebrales, que constituyen la unidad básica de riesgo sanguíneo para el tejido cerebral y que desempeñan una función importante en el mantenimiento de la función del cerebro (1). Los vasos grandes y pequeños en el cerebro conjuntamente constituyen el árbol vascular. Son estructuralmente continuos y están afectados conjuntamente por la hemodinámica y expuestos conjuntamente a los factores de riesgo. Por lo tanto, los cambios patológicos de los vasos grandes y pequeños en el cerebro en teoría deberían presentar una correlación paralela en términos de gravedad. Sin embargo, en la práctica clínica, con frecuencia se observa una inconsistencia entre estos dos tipos de vaso. Por ejemplo, con frecuencia se observan pacientes con enfermedad grave de los vasos cerebrales pequeños que no se ve complicada por estenosis de las arterias cerebrales grandes, y a la inversa (2).

La enfermedad de los vasos cerebrales pequeños (EVCP) se refiere a síndromes de manifestaciones clínicas, cognitivas, de imagen y patológicas causadas por diversas lesiones de los vasos pequeños (3). Tradicionalmente se ha referido a las manifestaciones clínicas y de imagen causadas por lesiones en las arterias perforantes pequeñas y en arterias pequeñas. La EVCP principalmente se manifiesta a nivel clínico como ictus (infarto pequeño profundo, hemorragia cerebral), trastornos cognitivos y emocionales, y un deterioro funcional global. En las imágenes se manifiesta en infarto lacunar (IL), lagunas, lesiones en la materia blanca (LMB), espacio perivascular agrandado (EPVA) y microsangrados cerebrales (MSC), etc. (1).

La patogénesis específica de la EVCP se relaciona con la disfunción endotelial vascular, daño a la barrera hematoencefálica (BHE), mecanismos inflamatorios, factores genéticos y lesión isquémica por hipoperfusión, de la que el daño a la BHE es el mecanismo central. El daño y destrucción a la BHE conduce a una permeabilidad incrementada, que permite que los componentes sanguíneos extravasen a los tejidos circundantes y al parénquima cerebral, causando los cambios fisiopatológicos correspondientes, resultando en imágenes y cambios patológicos asociados a la EVCP (4).

El microsangrado cerebral es una de las manifestaciones de la enfermedad de vasos cerebrales pequeños y es un daño subclínico en el parénquima cerebral causado por la enfermedad microvascular en el cerebro. Se caracteriza por una pequeña cantidad de fuga sanguínea y glóbulos rojos que extravasan los vasos, generando imágenes de hemosiderina. Según la edad de la lesión, pueden observarse en torno a los vasos glóbulos rojos nuevos, gránulos depositados de hemosiderina o macrófagos endocitando hemosiderina.

Los MSC se manifiestan como lesiones con una pequeña pérdida de señal en las secuencias ponderadas en T2* (u otras secuencias sensibles a la susceptibilidad) con halos en torno a las lesiones. Las lesiones generalmente presentan un diámetro de entre 2 y 5 mm, hasta 10 mm (5). Estas lesiones en las imágenes de RM se denominan "vacío de señal", "artefacto por susceptibilidad", "agujero negro", "mancha", "microsangrado", "microsangrado antiguo (MSA)", "lesión de pérdida de señal multifocal" o "microhemorragia (MH)". Habitualmente se localizan en la unión entre córtex y subcórtex, el núcleo de materia gris en el córtex profundo, la materia blanca del hemisferio cerebral, el tallo cerebral y el cerebelo. La secuencia de imágenes ponderadas por sensibilidad magnética (PSM) es más sensible a los MSC que la secuencia GRE ponderada por T2*.

Los MSC se consideran mayoritariamente asintomáticos y carecen de manifestaciones clínicas agudas. Los estudios han mostrado que los microsangrados cerebrales presentan una cierta asociación con la edad, factores de riesgo cardiovascular, degeneración de la materia blanca, ictus y trastornos afectivos postictus. Además, el microsangrado cerebral también es una causa patológica importante de lesión cerebral en enfermedades de altura agudas y crónicas (6). El microsangrado cerebral se observa en tejido cerebral (7) o retina (8) en el examen de las imágenes de RM en autopsias de pacientes con enfermedad de altura o supervivientes de edemas cerebrales de gran altitud. Mediante la utilización de las técnicas de imagen de RM ponderada por susceptibilidad (PSM) para examinar microsangrados cerebrales en pacientes con mal de montaña crónico (MMC), se ha encontrado que 11 de cada 20 (55 %) pacientes de MMC confirmados presentaban microsangrados cerebrales y la tasa positiva de microsangrados cerebrales detectados en el grupo de MMC era significativamente más alta que en la población normal (9).

El uso generalizado de los fármacos trombolíticos (tales como el activador del plasminógeno tisular (t-PA, por sus siglas en inglés), la estreptoquinasa (SK)), fármacos anticoagulantes (tales como la warfarina) y fármacos antiplaquetarios (tales como la aspirina) en la terapia antitrombótica ha llevado a un incremento significativo de la incidencia de hemorragia intracerebral (HIC) primaria relacionada con fármacos. Los estudios han mostrado en una comparación entre pacientes de HIC relacionada con warfarina y pacientes de HIC espontánea, que los MSC son más comunes en los primeros. La investigación actual sugiere que los MSC están asociados a un riesgo incrementado de sangrado asociado a fármacos anticoagulantes. El riesgo de HIC relacionada con la aspirina incrementa significativamente el número de lesiones de MSC. Un metaanálisis ha mostrado en una comparación entre usuarios de aspirina y no usuarios de aspirina, que los MSC y la HIC están relacionados (cociente de probabilidades, OR=1,7). Otro estudio ha mostrado que los pacientes con ictus que utilizaban dosis altas de estatinas (tales como atorvastatina) presentaban una incidencia ligeramente incrementada de HIC. La incidencia de MSC en el lóbulo cerebral en usuarios de estatina es aproximadamente el doble que en no usuarios de estatinas, aunque no se observaron diferencias significativas en otras partes, lo que sugiere que las estatinas podrían incrementar el riesgo de sangrado en los pacientes con angiopatía amiloide cerebral.

La cirugía también puede causar daños en el sistema nervioso central, incluyendo daños directos al tejido nervioso por cirugía en el sistema nervioso central (incluyendo el cerebro y el notocordio) y cambios histopatológicos en el sistema nervioso causados por cambios en el suministro sanguíneo y sangrado durante la cirugía, incluyendo edema en los tejidos, sangrado, microsangrados, infarto y microinfarto. Entre las cirugías habituales que causan daños en el sistema nervioso central se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, clipaje de aneurisma cerebral o embolización, resecado de tumor cerebral y otras cirugías que implican directamente el sistema nervioso central.

El documento n.° EP3135288 da a conocer compuestos de a-androstano-3p,5,6p-triol para la utilización en el tratamiento del mal de altura causado por hipoxia hipobárica, y más particularmente, edema cerebral de gran altitud (ECGA).

Sin embargo, actualmente todavía no se dispone de fármacos eficaces para el tratamiento de los microsangrados cerebrales. Es de gran importancia clínica proporcionar un medicamento que alivie o elimine los microsangrados cerebrales.

Sumario

Las referencias a métodos de tratamiento en la presente descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

La presente invención se basa en el resultado de los inventores de que los compuestos de fórmula I mejoran la eliminación de la hemoglobina libre en el tejido cerebral y proporcionan un nuevo uso de los compuestos de fórmula I:

en el tratamiento de la enfermedad de vasos cerebrales pequeños, en el que R1 es H, un alquilo con 1 a 5 átomos de carbono, o -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CHa)₂.

De acuerdo con lo anterior, un aspecto de la presente invención proporciona la utilización de un compuesto de fórmula I:

o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de vasos cerebrales pequeños, en el que R1 es H, un alquilo con 1 a 5 átomos de carbono, o -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

En una realización, R1 es preferentemente H y el compuesto es 5a-androst-3p,5,6p-triol (en ocasiones abreviado como "triol" en lo sucesivo en la presente memoria). En una realización, R1 se selecciona del grupo que consiste en -CHCH²CH³ , -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ y -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

La enfermedad de vasos cerebrales pequeños es el microsangrado cerebral. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral es microsangrado cerebral espontáneo, microsangrado cerebral relacionado con fármacos o microsangrado cerebral traumático. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral espontáneo es el microsangrado cerebral asociado a la edad, el microsangrado cerebral hipertensivo, el microsangrado cerebral asociado al mal de altura agudo, el microsangrado cerebral asociado a mal de altura crónica, el microsangrado cerebral asociado a ictus isquémico, o el microsangrado cerebral asociado a ictus hemorrágico. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral asociado a fármacos es microsangrado cerebral asociado a fármacos trombolíticos, microsangrado cerebral asociado a fármacos anticoagulantes, microsangrado cerebral relacionado con fármacos antiagregación plaquetaria o microsangrado cerebral relacionado con fármacos estatinas. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral traumático es microsangrado cerebral causado por cirugía.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para el tratamiento del microsangrado cerebral en un/a paciente, en el que el método comprende administrar en el/la paciente una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula

o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende el compuesto de fórmula I o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R1 es H, un alquilo con 1 a 5 átomos de carbono, o -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

En una realización, R1 es preferentemente H. En una realización, R1 se selecciona del grupo que consiste en -CHCH²CH³ , -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ y -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral en el/la paciente se ha confirmado mediante RM. En algunas realizaciones, el/la paciente sufre de microsangrado cerebral espontáneo, microsangrado cerebral relacionado con fármacos o microsangrado cerebral traumático. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral espontáneo es el microsangrado cerebral asociado a la edad, el microsangrado cerebral hipertensivo, el microsangrado cerebral asociado al mal de altura agudo, el microsangrado cerebral asociado a mal de altura crónica, el microsangrado cerebral asociado a ictus isquémico, o el microsangrado cerebral asociado a ictus hemorrágico. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral asociado a fármacos es microsangrado cerebral asociado a fármacos trombolíticos, microsangrado cerebral asociado a fármacos anticoagulantes, microsangrado cerebral relacionado con fármacos antiagregación plaquetaria o microsangrado cerebral relacionado con fármacos estatinas. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral traumático es microsangrado cerebral causado por cirugía.

La presente invención proporciona un compuesto de fórmula I:

o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la utilización en el tratamiento del microsangrado cerebral en un/a paciente, en el que R1 es H, un alquilo con 1 a 5 átomos de carbono, o -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

En una realización, R1 es preferentemente H. En una realización, R1 se selecciona del grupo que consiste en -CHCH²CH³ , -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ y -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral en el/la paciente se ha confirmado mediante RM. En algunas realizaciones, el/la paciente sufre de microsangrado cerebral espontáneo, microsangrado cerebral relacionado con fármacos o microsangrado cerebral traumático. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral espontáneo es el microsangrado cerebral asociado a la edad, el microsangrado cerebral hipertensivo, el microsangrado cerebral asociado al mal de altura agudo, el microsangrado cerebral asociado a mal de altura crónica, el microsangrado cerebral asociado a ictus isquémico, o el microsangrado cerebral asociado a ictus hemorrágico. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral asociado a fármacos es microsangrado cerebral asociado a fármacos trombolíticos, microsangrado cerebral asociado a fármacos anticoagulantes, microsangrado cerebral relacionado con fármacos antiagregación plaquetaria o microsangrado cerebral relacionado con fármacos estatinas. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral traumático es microsangrado cerebral causado por cirugía.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para potenciar la eliminación de la hemoglobina libre en el exterior de los vasos cerebrales en un/a paciente, en el que el método comprende administrar en el/la paciente una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I:

o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende el compuesto de fórmula I o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R1 es H, un alquilo con 1 a 5 átomos de carbono, o -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

En una realización, R1 es preferentemente H. En una realización, R1 se selecciona del grupo que consiste en -CHCH²CH³ , -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ y -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para la eliminación de la hemoglobina libre en el exterior de los vasos cerebrales en un/a paciente, en el que el método comprende administrar en el/la paciente una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I:

o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende el compuesto de fórmula I o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R1 es H, un alquilo con 1 a 5 átomos de carbono, o -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

En una realización, R1 es preferentemente H. En una realización, R1 se selecciona del grupo que consiste en -CHCH²CH³ , -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ y -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

La hemoglobina libre está causada por microsangrado cerebral espontáneo, microsangrado cerebral relacionado con fármacos o microsangrado cerebral traumático. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral espontáneo es el microsangrado cerebral asociado a la edad, el microsangrado cerebral hipertensivo, el microsangrado cerebral asociado al mal de altura agudo, el microsangrado cerebral asociado a mal de altura crónica, el microsangrado cerebral asociado a ictus isquémico, o el microsangrado cerebral asociado a ictus hemorrágico. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral asociado a fármacos es microsangrado cerebral asociado a fármacos trombolíticos, microsangrado cerebral asociado a fármacos anticoagulantes, microsangrado cerebral relacionado con fármacos antiagregación plaquetaria o microsangrado cerebral relacionado con fármacos estatinas. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral traumático es microsangrado cerebral causado por cirugía.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para el tratamiento del microsangrado cerebral en un/a paciente, en el que el método comprende administrar en el/la paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I:

o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende el compuesto de fórmula I o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R1 es H, un alquilo con 1 a 5 átomos de carbono, o -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

En una realización, R1 es preferentemente H. En una realización, R1 se selecciona del grupo que consiste en -CHCH²CH³ , -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ y -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

La enfermedad de vasos cerebrales pequeños es el microsangrado cerebral. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral en el/la paciente se ha confirmado mediante RM. En algunas realizaciones, el/la paciente sufre de microsangrado cerebral espontáneo, microsangrado cerebral relacionado con fármacos o microsangrado cerebral traumático. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral espontáneo es el microsangrado cerebral asociado a la edad, el microsangrado cerebral hipertensivo, el microsangrado cerebral asociado al mal de altura agudo, el microsangrado cerebral asociado a mal de altura crónica, el microsangrado cerebral asociado a ictus isquémico, o el microsangrado cerebral asociado a ictus hemorrágico. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral asociado a fármacos es microsangrado cerebral asociado a fármacos trombolíticos, microsangrado cerebral asociado a fármacos anticoagulantes, microsangrado cerebral relacionado con fármacos antiagregación plaquetaria o microsangrado cerebral relacionado con fármacos estatinas. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral traumático es microsangrado cerebral causado por cirugía.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. La hipoxia hipobárica aguda causó un incremento de la distribución extravascular de hemoglobina libre en el tejido cerebral del córtex prefrontal de monos Cynomolgus (Macaca fascicularis). A. Las imágenes de inmunofluorescencia del tejido cerebral de monos Cynomolgus, en los que el marcador de células endoteliales vasculares CD31 muestra una señal roja, que indica la posición de los vasos sanguíneos, mientras que la línea de puntos indica el contorno de los vasos; la hemoglobina libre extravascular se muestra en verde, y el núcleo se muestra en azul. B. La IMF (intensidad media de fluorescencia) se cuantificó utilizando el software Nikon NIS-Element. Se muestran las estadísticas de la intensidad de fluorescencia relativa de la hemoglobina libre extravascular distribuida en el tejido cerebral de monos Cynomolgus y se utilizó el análisis de ANOVA unidireccional y la prueba t de Dunnutt para realizar las pruebas estadísticas, **: p<0,01; ns, no hay diferencia estadística, n=4. NN: grupo de normoxia normobárica; HH: grupo de hipoxia hipobárica; HH Triol: grupo de hipoxia hipobárica con administración de triol; HH+PROG: grupo de hipoxia hipobárica con administración de fármaco de control. PROG representa el fármaco de control progesterona.

Fig. 2. Activación de la microglía en el tejido cerebral del córtex prefrontal de monos Cynomolgus. A. Tinción inmunohistoquímica de Iba-1 del tejido cerebral del córtex prefrontal de monos Cynomolgus; Iba-1 sirve de marcador de activación de la microglía. La barra de escala negra representa 25 μm y la barra de escala roja representa 200 μm. B. Estadísticas de Iba-1 respecto a los valores de densidad óptica. Se utilizó el software Image pro plus para llevar a cabo el escaneo de densidad óptica de las imágenes de inmunohistoquímica de cada grupo para obtener los valores de densidad óptica, que a continuación se normalizaron respecto al grupo NN. NN: grupo de normoxia normobárica (n=4); HH: grupo de hipoxia hipobárica (n=4); HH Triol: grupo de hipoxia hipobárica con administración de triol (n=3); HH+PROG: grupo de hipoxia hipobárica con administración de fármaco de control (n=4). Análisis de ANOVA unidireccional y pruebas t de Dunnutt para llevar a cabo las pruebas estadísticas. ***, p<0,01, n.s., no hay diferencia estadística.

Fig.3. El triol redujo significativamente la expresión de los factores inflamatorios IL-6, IL-1p y TNF-a en el tejido cerebral de los monos Cynomolgus. a. Expresión proteica de los factores inflamatorios IL-6, IL-1p y TNF-a en el tejido cerebral del córtex prefrontal de monos Cynomolgus; B. Estadísticas de los valores relativos de proteína de escaneo gris. NN: grupo de normoxia normobárica (N=3); HH: grupo de hipoxia hipobárica (N=3); HH Triol: grupo de hipoxia hipobárica con administración de triol (N=3); Hh PROG: grupo de hipoxia hipobárica con administración de fármaco de control (N=3). El valor gris se obtuvo mediante escaneo con el software Image Lab y el valor relativo se obtuvo después de normalizar respecto a la a-tubulina. Se utilizó el análisis ANOVA unidireccional y pruebas t de Dunnutt para realizar las pruebas estadísticas; en estas últimas se comparó cada grupo con el grupo HH, *: p<0,05; **: p<0,01.

Fig. 4. El triol potencia la eliminación de la hemoglobina libre en tejido cerebral mediante la regulación positiva de los niveles proteicos de CD163 y heme oxigenasa-1 (HO-1). A. Expresión proteica del receptor secuestrante de hemoglobina CD 163 y de la heme oxigenasa HO-1 en el tejido cerebral del córtex prefrontal de monos Cynomolgus; B. Estadísticas de los valores relativos de proteína de escaneo gris. El valor gris se obtuvo mediante escaneo con el software Image Lab y el valor relativo se obtuvo después de normalizar respecto a la a-tubulina. NN: grupo de normoxia normobárica (N=3); HH: grupo de hipoxia hipobárica (N=3); HH Triol: grupo de hipoxia hipobárica con administración de triol (N=3); HH+PROG: grupo de hipoxia hipobárica con administración de progesterona (N=3). Se utilizó el análisis ANOVA unidireccional y pruebas t de Dunnutt para realizar las pruebas estadísticas; en estas últimas se comparó cada grupo con el grupo H^h , *: p<0,05; n.s., no hay diferencia estadística.

Fig. 5. El triol restauró CD163 regulado negativamente y la activación de la microglía causadas por la hipoxia hipobárica. A. Imágenes de inmunofluorescencia de CD163 e Iba-1 en el tejido cerebral de monos Cynomolgus. B. Estadísticas de intensidad de fluorescencia relativa de CD163 e Iba-1. C. Análisis de correlación de la intensidad de fluorescencia relativa de CD163 e Iba-1. NN: grupo de normoxia normobárica; HH: grupo de hipoxia hipobárica; HH Triol: grupo de hipoxia hipobárica con administración de triol; HH+PROG: grupo de hipoxia hipobárica con administración de progesterona. Se utilizó el análisis ANOVA unidireccional y pruebas t de Dunnutt para realizar las pruebas estadísticas; en estas últimas se comparó cada grupo con el grupo HH, ***: p<0,001.

Fig. 6. La hipoxia exacerbó la activación inflamatoria de la microglía causada por la hemoglobina libre. A. Después de que la hemoglobina libre estimulase la microglía BV2 en diferentes puntos temporales, se llevó a cabo el análisis de inmunofluorescencia para detectar el marcador de activación de la microglía CD11b. La barra de escala representa 25 μm. B. Estadísticas de la intensidad de fluorescencia relativa de CD11b en la fig. A. Se utilizó el análisis de ANOVA unidireccional y pruebas t de Dunnutt para realizar pruebas estadísticas. *: p<0,05; **: p<0,01. C. Después de que la hemoglobina libre estimulase la microglía BV2 en diferentes puntos temporales, se llevó a cabo el análisis de inmunofluorescencia para detectar el marcador de activación de la microglía Iba-1 y la tinción con faloidina mostró cambios morfológicos en la microglía. D. Estadísticas de la intensidad de fluorescencia relativa de Iba-1 en la fig. C. Se utilizó el análisis de ANOVA unidireccional y pruebas t de Dunnutt para realizar pruebas estadísticas. *:p<0,05; **:p<0,01. E. En diferentes puntos temporales en los que se había utilizado hemoglobina libre para estimular BV2, se utilizó la transferencia western para detectar el nivel de proteína CD11b. F. Después de que la hemoglobina libre estimulase la microglía BV2 durante 6 horas, se utilizó la qPCR para detectar la expresión de ARNm de citoquinas proinflamatorias y las quimioquinas. G. La hipoxia exacerbó el incremento de la expresión proteica de los factores inflamatorios de la microglía TNF-a, IL-1p e IL-6 causado por la hemoglobina libre, aunque no presentó ningún efecto sobre el factor antiinflamatorio IL-4.

Fig. 7. Después de interferir en la regulación positiva de la expresión de CD163, se eliminó el efecto inhibidor del triol de la hipoxia y la regulación positiva inducida por hemoglobina de Iba-1 y CD11b. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, se utilizó RNAiMAX para transfectar CD163 n.° 01 y el fragmento de interferencia aleatorizado NC, respectivamente, en las células BV2; a continuación, se añadió el medio de cultivo de células BV2 con o sin triol 10 μM y se estimularon las células Bv2 con hemoglobina 20 μM e hipoxia al 1 % durante 6 horas, y a continuación se recolectaron muestras de proteínas y se detectó mediante transferencia de Western la expresión de los marcadores de activación microglial Iba-1 y CD11b.

Descripción detallada de la invención

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "composición" se refiere a una formulación adecuada para la administración en un sujeto animal deseado con fines terapéuticos, que comprende por lo menos un componente farmacéuticamente activo, tal como un compuesto. Opcionalmente, la composición comprende, además, por lo menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a que la sustancia no presenta la propiedad de que, considerando la enfermedad o afección que debe tratarse y la vía de administración correspondiente, permita que un/a profesional médico/a racional y prudente evite la administración de la sustancia en el paciente. Por ejemplo, para inyectables, con frecuencia se requiere que dicha sustancia sea sustancialmente estéril.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a que la sustancia y la cantidad de la sustancia son eficaces para prevenir, aliviar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o afección, y/o de prolongar la supervivencia del/de la sujeto que recibe el tratamiento.

La expresión "enfermedad de vasos cerebrales pequeños" o "EVCP" se refiere al síndrome de manifestaciones clínicas, cognitivas, de imagen y patológicas causadas por diversas lesiones en arterias perforantes pequeñas y pequeñas arterias (diámetro de 40 a 200 μm), capilares y pequeñas venas en el cerebro. En una realización preferente, "enfermedad de vasos cerebrales pequeños" se manifiesta como una barrera hematoencefálica alterada y la destrucción de la misma conduce a una permeabilidad incrementada, que permite que los componentes sanguíneos extravasen a los tejidos circundantes y al parénquima cerebral, causando los correspondientes cambios fisiopatológicos y resultando en cambios en las imágenes y patológicos de la EVCP. En una realización específica, la "enfermedad de los vasos cerebrales pequeños" no incluye el ictus hemorrágico.

La expresión "microsangrado cerebral" se refiere al sangrado dentro de una región cerebral de menos de aproximadamente 1 cm de diámetro. Pueden detectarse microsangrados cerebrales mediante RM cerebral (incluyendo la RM GRE ponderada en T2*) y puede ser un "microsangrado cerebral asintomático" que no muestre síntomas o puede estar asociado a síntomas, tales como alteraciones motoras o sensoriales focales transitorias o permanentes, ataxia, afasia, disartria (es decir, "microsangrado cerebral sintomático" (10)). En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral se manifiesta como una distribución significativamente incrementada de hemoglobina libre extravascular.

La expresión "microsangrado cerebral espontáneo" en la presente memoria se refiere a sangrado intracerebral causado por la ruptura espontánea de vasos cerebrales (habitualmente venas o capilares) causada por diversas causas bajo condiciones no traumáticas. El sangrado cerebral espontáneo es una enfermedad multifactorial, que se ve afectada por factores ambientales y genéticos. Por ejemplo, la edad avanzada está estrechamente relacionada con el microsangrado cerebral espontáneo (microsangrado cerebral relacionado con la edad). El microsangrado cerebral espontáneo causada por una enfermedad incluye los causados por hipertensión (tal como la hipertensión a largo plazo), el ictus isquémico y el ictus hemorrágico, que de acuerdo con ello se denominan en la presente memoria "microsangrado cerebral hipertensivo", "microsangrado cerebral asociado a ictus isquémico" y "microsangrado cerebral asociado a ictus hemorrágico". Otros factores ambientales o factores de enfermedad también pueden causar microsangrado cerebral, y se espera que la presente invención sea aplicable al tratamiento de estos microsangrados cerebrales no enumerados específicamente.

La expresión "microsangrado cerebral relacionado con un fármaco" se refiere en la presente memoria a microsangrados cerebrales causados por fármacos. Entre estos fármacos pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellos, fármacos trombolíticos, fármacos anticoagulantes, fármacos antiaglutinación plaquetaria o fármacos de estatinas.

Con el uso generalizado de la terapia trombolítica, los fármacos trombolíticos también se han desarrollado desde la primera generación hasta la tercera. Los primeros fármacos trombolíticos, de primera generación, fueron la estreptoquinasa (SK), uroquinasa (UK), lumbroquinasa, prouroquinasa, estafiloquinasa, activador de estreptoquinasa del plasminógeno metoxibenzoilo y el enzima antitrombótico de veneno de serpiente. El fármaco trombolítico de segunda generación "alteplasa" es un activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA, por sus siglas en inglés) recombinante, que es el primer fármaco trombolítico recombinante genético a nivel mundial, desarrollado y comercializado por Genetech en Estados Unidos. Actualmente los fármacos trombolíticos se han desarrollado hasta la tercera generación. La "reteplasa", desarrollada por Boehringer Mannheim GmbH en Alemania en 1996, es un representante. La reteplasa es un fármaco de proteínas modificadas. Es una mutación por deleción del activador del plasminógeno de tipo tisular humano recombinante, y presenta las ventajas de una semivida prolongada, fuerte efecto trombolítico y efectos secundarios pequeños. Los fármacos trombolíticos de tercera generación en investigación y desarrollo son todos variantes del t-PA, tales como TNKasa (teneplasa, TNK-t-PA), monteplasa, La noteplasa (nateplasa, n-PA), etc. Las características comunes de los fármacos trombolíticos de tercera generación son las capacidades de trombolisis rápida, la apertura de las arterias coronarias obstruidas y la restauración de la circulación sanguínea, con una tasa de curación de entre 73 % y 83 %.

Los fármacos anticoagulantes, también conocidos como anticoagulantes, se utilizan para prevenir y tratar las enfermedades de embolismo intravascular o trombosis, y para prevenir ictus u otras enfermedades trombóticas. Entre los anticoagulantes utilizados más frecuentemente en uso clínico se incluyen: anticoagulantes parenterales (tales como heparina, enoxaparina, tiatarparina y ardeparina), anticoagulantes coumarina (tales como warfarina, dicoumarina y nitrato de coumarina), anticoagulantes in vitro (tales como citrato sódico) e inhibidores de la trombina (tales como hirudina y argatrobán).

Los fármacos de aglutinación antiplaquetaria pueden clasificarse en cuatro categorías según el lugar de acción y la vía de administración del fármaco: (1) inhibidores de ciclooxigenasa (inhibidores del tromboxano A2, ácido salicílico): los fármacos utilizados comúnmente son las tabletas de aspirina. (2) inhibidores de fosfodiesterasa: tales como cilostazol (Pletaal), dipiridamol (Persantine), etc. El cilostazol (Pletaal) inhibe la actividad de la fosfodiesterasa plaquetaria y del músculo liso vascular, incrementa la concentración del AMPc en las plaquetas y el músculo liso e inhibe más potentemente las plaquetas que la aspirina y la ticlopidina (Ticlid) y posee un efecto disociativo en los agregados plaquetarios y es el fármaco de elección para la enfermedad vascular periférica. Clínicamente se utiliza principalmente para el tratamiento de enfermedades locales, tales como las úlceras oclusivas arteriales crónicas, el dolor y la sensación de frío. Se utiliza para pacientes con claudicación intermitente sin insuficiencia cardiaca y puede mejorar los síntomas e incrementar la distancia de deambulación. La dosis oral convencional de dipiridamol (Persantine) puede incrementar la incidencia de infarto de miocardio inducido por el ejercicio en pacientes con angina estable, por lo que actualmente se limita a pacientes con antecedentes de ictus y sin enfermedad cardíaca coronaria. El dipiridamol no está recomendado para pacientes con enfermedad cardíaca coronaria. (3) Antagonistas de receptor de ADP (piridinas tiofeno): tales como clopidogrel (Plavix, Talcom), ticlopidina (Ticlid, Ticlop, etc.), etc. (4) Antagonistas de las glucoproteínas IIb/III plaquetaria (antagonistas de receptor de GP IIb/IIIa), tales como el anticuerpo monoclonal abciximab, el inhibidor peptídico eptifibatide y el inhibidor no peptídico tirofibán, etc.

Los fármacos de estatina, también conocidos como inhibidores de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa, pueden reducir significativamente el colesterol (CT), la lipoproteína de baja densidad (C-LDL) y apoB (apolipoproteína) y simultáneamente reducir los niveles de triglicéridos (TG) e incrementar ligeramente las lipoproteínas de alta densidad (C-HDL). Resultan adecuados para la hipercolesterolemia primaria y la hiperlipidemia mixta, y actualmente es un fármaco muy importante para la prevención y el tratamiento de la hipercolesterolemia y la ateroesclerosis. Entre los fármacos de primera generación actualmente en el mercado se incluyen la lovastatina y la simvastatina; entre los fármacos de segunda generación se incluyen la pravastatina y la fluvastatina; entre los fármacos de tercera generación se incluyen la atorvastatina, la rosuvastatina y la pitavastatina.

La expresión "microsangrado cerebral traumático" en la presente memoria se refiere al microsangrado intracerebral causado por traumatismo, tal como el microsangrado intracerebral causado por traumatismos inducidos por cirugía, la lesión cerebral traumática (LCT) leve o el traumatismo craneoencefálico crónico. La expresión "microsangrado cerebral derivado de cirugía" o "microsangrado cerebral inducido por cirugía" se refiere al microsangrado intracerebral causado por cirugía. En algunas realizaciones, la cirugía se refiere a una cirugía que implica directamente el sistema nervioso central. En algunas realizaciones, la cirugía se refiere al clipaje de aneurismas cerebrales o la embolización o resección de tumores cerebrales.

El compuesto de fórmula I o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Entre los compuestos que son aplicables en los métodos o usos de la presente invención se incluyen el compuesto de fórmula I:

o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R1 es H, alquilo con 1 a 5 átomos de carbono, o -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂, que también se denomina en la presente memoria "el compuesto de la presente invención". En una realización, R1 es H y el compuesto es 5a-androst-3p,5,6p-triol (en ocasiones abreviado como "triol" en lo sucesivo en la presente memoria), que presenta la estructura de fórmula II:

Se ha confirmado que triol es un agente neuroprotector eficaz contra el daño cerebral hipóxico por isquemia aguda.

En una realización, R1 es -CHCH²CH³ , y el compuesto es 17-propilén-androst-3p,5a,6p-triol. En una realización, R1 es -CH(CH₃)₂, y el compuesto es 17-isopropil-androst-3p,5a,6p-triol. En una realización, R1 es -CH(CH₂)₃CH₃, y el compuesto es 17-butil-androst-3p,5a,6p-triol. En una realización, R1 es -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂, y el compuesto es colestano-3p,5a,6p-triol.

Los compuestos de la presente invención pueden formularse en la forma de sales farmacéuticamente aceptables. Entre las formas salinas farmacéuticamente aceptables esperadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las sales mono, di, tri y tetra. Las sales farmacéuticamente aceptables son no tóxicas a la cantidad y concentración a la que se administran. La preparación de dichas sales puede facilitar los usos farmacológicos mediante la modificación de las propiedades físicas del compuesto sin evitar que ejerza sus efectos fisiológicos. Entre los cambios útiles de las propiedades físicas se incluyen la reducción del punto de fusión para facilitar la administración transmucosal y el incremento de la solubilidad, para facilitar la administración de concentraciones más altas de fármacos.

Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen sales de adición de ácido, tales como las que contienen sulfato, cloruro, hidrocloruro, fumarato, maleato, fosfato, sulfamato, acetato, citrato, lactato, tartrato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, ciclohexilsulfamato y sales quinato. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse a partir de ácidos, tales como ácido clorhídrico, ácido maleico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido sulfámico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido ciclohexilsulfámico, ácido fumárico y ácido quínico.

En el caso de que haya grupos funcionales ácidos presentes, tales como ácidos carboxílicos, entre las sales farmacéuticamente aceptables también se incluyen sales de adición de base, tales como las que contienen benzatina penicilina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etanolamina, terc-butilamina, etilendiamina, meglumina, procaína, aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio, amonio, alquilamina y cinc. Dichas sales pueden prepararse mediante la utilización de bases correspondientes apropiadas.

Pueden prepararse sales farmacéuticamente aceptables mediante técnicas estándares. Por ejemplo, el compuesto en su forma de base libre puede disolverse en un solvente adecuado, tal como una solución acuosa o una solución de agua y alcohol que contiene un ácido adecuado y después evaporarse la solución para la separación. En otro ejemplo, la sal se prepara haciendo reaccionar la base libre con un ácido en un solvente orgánico.

De esta manera, por ejemplo, en el caso de que el compuesto específico sea una base, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse mediante cualquier método adecuado disponible de la técnica, por ejemplo, mediante tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico o similar, o un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, ácido piranosidílico, tal como ácido glucurónico o ácido galacturónico, ácido a-hidroxi, tal como ácido cítrico o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, ácido aromático, tal como ácido benzoico o ácido cinámico, ácido sulfónico, tal como ácido p-toluenosulfónico o ácido etanosulfónico, o similar.

De manera similar, en el caso de que el compuesto específico sea un ácido, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante tratamiento del ácido libre con una base inorgánica o una base orgánica, tal como una amina (amina primaria, secundaria o terciaria), hidróxidos de metal alcalino o hidróxidos de metal alcalinotérreo, o similares. Entre los ejemplos ilustrativos de sales adecuadas se incluyen sales orgánicas derivadas de aminoácidos (tales como L-glicina, L-lisina y L-arginina), amonio, aminas primarias, secundarias y terciarias, y aminas cíclicas (tales como hidroxietilpirrolidina, piperidina, morfolina y piperazina) y sales inorgánicas derivadas de sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, aluminio y litio.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos pueden existir en forma de complejos. Entre los ejemplos de complejos se incluyen complejos de 8-cloroteofilina (tales como, por ejemplo, complejo de dimenhidrinato:difenhidramina 8-cloroteofilina (1:1); Dramamine) y diversos complejos que comprenden ciclodextrina.

La presente invención pretende incluir, además, la utilización de compuestos deuterados farmacéuticamente aceptables u otros compuestos sustituidos no radioactivos. La deuteración sirve para sustituir uno o más, o la totalidad, de los hidrógenos en el grupo molecular activo del fármaco por el isótopo deuterio. Debido a que es no tóxico y no radioactivo, y es unas 6 a 9 veces más estable que el enlace carbono-hidrógeno, puede cerrar el sitio metabólico y prolongar la semivida del fármaco, reduciendo de esta manera la dosis terapéutica sin afectar a la actividad farmacológica del fármaco; de esta manera, se considera un excelente método de modificación.

Composición farmacéutica

Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En la presente invención, "composición farmacéutica" se refiere a una composición que comprende un compuesto de fórmula I y un portador farmacéuticamente aceptable, en el que el compuesto y el portador farmacéuticamente aceptable están presentes en la composición en una forma mixta. La composición generalmente se utilizará en el tratamiento de sujetos humanos. Sin embargo, también puede utilizarse para tratar afecciones similares o iguales en otros sujetos animales. En este contexto, los términos "sujeto", "sujeto animal" y términos similares se refieren a vertebrados humanos y no humanos, tales como mamíferos, tales como primates no humanos, animales de competición y animales comerciales, tales como equinos, vacunos, porcinos, ovinos, roedores y animales de compañía (tales como perros y gatos).

La forma de dosis apropiada depende en parte de la utilización o vía de administración; por ejemplo, puede ser oral, transdérmica, transmucosal, por inhalación o mediante inyección (parenteral). Dichas formas de dosis deberían permitir que el compuesto alcance las células diana. Otros factores son bien conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen consideraciones tales como la toxicidad y formas de dosis que retrasan que el compuesto o composición ejerza sus efectos.

Pueden utilizarse portadores o excipientes para producir la composición. Los portadores o excipientes pueden seleccionarse para facilitar la administración del compuesto. Entre los ejemplos de portadores se incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares (tales como lactosa, glucosa o sucrosa), o tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicol y solventes fisiológicamente compatibles. Entre los ejemplos de solventes fisiológicamente compatibles se incluyen soluciones de agua estéril para inyección (AEI), soluciones salinas y glucosa.

La composición o componentes de la composición pueden administrarse por diferentes vías, incluyendo las vías intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, oral, transmucosal, rectal, transdérmica o por inhalación. En algunas realizaciones, resultan preferentes las inyecciones o las inyecciones de polvos liofilizados. Para la administración oral, por ejemplo, el compuesto puede formularse en formas de dosis oral convencionales, tales como cápsulas y comprimidos, y preparaciones líquidas, tales como jarabes, elixires y gotas concentradas.

Pueden obtenerse preparaciones farmacéuticas para el uso oral, por ejemplo, mediante combinación de la composición o sus componentes con excipientes sólidos, opcionalmente triturando la mezcla resultante y tratando la mezcla de partículas tras la adición de adyuvantes adecuados (en caso necesario), obteniendo de esta manera comprimidos o grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, agentes de carga, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sucrosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica (CMC) y/o polivinilpirrolidona (PVP; povidona). Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar o ácido algínico, o sus sales, tales como alginato sódico.

Alternativamente, pueden utilizarse inyecciones (administración parenteral), por ejemplo, la inyección intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y/o subcutánea. Para la inyección, la composición de la invención o sus componentes se formulan en forma de una solución líquida estéril, preferentemente en un tampón o solución fisiológicamente compatible, tal como solución salina, solución de Hank o solución de Ringer. Además, la composición o sus componentes pueden formularse en una forma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes del uso. También puede producirse en la forma de polvos liofilizados.

La administración también puede ser por medios transmucosales, tópicos o transdérmicos. Para la administración transmucosal, tópica o transdérmica, en la formulación se utilizan penetrantes adecuados a la barrera que debe permearse. Dichos penetrantes son generalmente conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, sales biliares y derivados de ácido fusídico. Además, para estimular la penetración pueden utilizarse detergentes. La administración transmucosal, por ejemplo, puede ser mediante pulverización nasal o supositorio (vía recto o vagina).

La cantidad eficaz de diversos componentes que deben administrarse puede determinarse mediante procedimientos estándares, considerando factores tales como la IC⁵⁰ del compuesto, la semivida biológica del compuesto, la edad, tamaño y peso corporal del/de la sujeto, y las condiciones asociadas al mismo/a. La importancia de estos y otros factores es bien conocida por el experto ordinario en la materia. Generalmente, la dosis se encontrará comprendida entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 50 mg/kg del/de la sujeto/a que debe tratarse, preferentemente entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg. Pueden utilizarse múltiples dosis.

La composición de la presente invención o sus componentes también pueden utilizarse en combinación con otros agentes terapéuticos para el tratamiento de la misma enfermedad. Dicho uso combinado incluye la administración de estos compuestos y otro u otros agentes terapéuticos en diferentes tiempos, o la utilización simultánea de estos compuestos y otro u otros agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, la dosis de uno o más compuestos de la invención u otros agentes terapéuticos utilizados en combinación, puede modificarse, por ejemplo, mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia, para reducir la dosis respecto al uso del compuesto o agente terapéutico por sí solo.

Debe entenderse que el uso combinado o la combinación incluye el uso con otras terapias, fármacos, procedimientos médicos, etc., en los que las otras terapias o procedimientos pueden administrarse en un tiempo diferente de la composición de la presente invención o sus componentes (p. ej., en un periodo de tiempo corto (tal como unas cuantas horas, tal como 1, 2, 3 o 4 a 24 horas) o en un periodo de tiempo más prolongado (tal como 1 a 2 días, 2 a 4 días, 4 a 7 días, o 1 a 4 semanas) o simultáneamente a la composición de la invención o sus componentes. El uso combinado incluye, además, el uso con terapias o procedimientos médicos de administración una sola vez o de administración infrecuente (tal como una cirugía), acompañadas por la administración de la composición de la invención o sus componentes en un periodo de tiempo corto o un periodo de tiempo más largo antes o después de otras terapias o procedimientos. En algunas realizaciones, la presente invención se utiliza para administrar la composición de la presente invención o sus componentes y otro u otros agentes terapéuticos farmacéuticos y se administran por la misma vía o por vías diferentes.

La administración combinada de cualquiera vía de administración incluye la administración de la composición de la invención o sus componentes y otro u otros agentes terapéuticos farmacéuticos en cualquier formulación por la misma vía de administración incluyendo formulaciones en las que los dos compuestos están unidos químicamente y conservan su actividad terapéutica respectiva al administrarlos. En un aspecto, la otra terapia farmacológica puede coadministrarse con la composición de la invención o sus componentes. La utilización combinada mediante coadministración incluye la administración de la coformulación o compuestos químicamente unidos, o la administración en un periodo de tiempo corto (p. ej., en una hora, en 2 horas, en 3 horas, hasta en 24 horas) de dos o más compuestos en formulaciones independientes, que se administran por la misma vía o por vías diferentes.

La coadministración de formulaciones independientes incluye la coadministración mediante administración con un dispositivo, tal como el mismo dispositivo de inhalación, la misma jeringa, etc., o la administración con diferentes dispositivos separados por un periodo de tiempo corto. Una coformulación de un compuesto de la presente invención y una o más farmacoterapias adicionales administradas por la misma vía de administración incluye preparar los materiales juntos de manera que puedan administrarse con un dispositivo, incluyendo la combinación de diferentes compuestos en una formulación, o la modificación de compuestos de manera que estén químicamente unidos pero que conserven su actividad biológica. Dichos compuestos químicamente unidos pueden incluir un conector que separa los dos ingredientes activos, en donde el conector se mantiene sustancialmente en el cuerpo o puede ser degradado por el cuerpo.

Método y uso

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso del compuesto de fórmula I o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de vasos cerebrales pequeños. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención proporciona el uso del compuesto de fórmula I o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en el tratamiento de la enfermedad de vasos cerebrales pequeños. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un método de tratamiento de la enfermedad de vasos cerebrales pequeños en un paciente, en el que el método comprende administrar en el paciente una cantidad eficaz del compuesto de fórmula I, o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o la composición farmacéutica anteriormente mencionada.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para potenciar la eliminación de la hemoglobina libre presente en el exterior de los vasos cerebrales en un/a paciente, que comprende administrar en el mismo/a una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o la composición farmacéutica anteriormente mencionada. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para la eliminación de la hemoglobina libre en el exterior de los vasos cerebrales en un/a paciente, en el que el método comprende administrar en el/la paciente una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o la composición farmacéutica anteriormente mencionada.

Según la invención, la enfermedad de vasos cerebrales pequeños es el microsangrado cerebral. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral en el/la paciente se ha confirmado mediante RM. En algunas realizaciones, el/la paciente sufre de microsangrado cerebral espontáneo, microsangrado cerebral relacionado con fármacos o microsangrado cerebral traumático. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral espontáneo es el microsangrado cerebral asociado a la edad, el microsangrado cerebral hipertensivo, el microsangrado cerebral asociado al mal de altura agudo, el microsangrado cerebral asociado a mal de altura crónica, el microsangrado cerebral asociado a ictus isquémico, o el microsangrado cerebral asociado a ictus hemorrágico. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral asociado a fármacos es microsangrado cerebral asociado a fármacos trombolíticos, microsangrado cerebral asociado a fármacos anticoagulantes, microsangrado cerebral relacionado con fármacos antiagregación plaquetaria o microsangrado cerebral relacionado con fármacos estatinas. En algunas realizaciones, el microsangrado cerebral traumático es microsangrado cerebral causado por cirugía.

Ejemplos

Ejemplo 1. El triol reduce significativamente la expresión de citoquinas inflamatorias causada por la activación de la microglía por hemoglobina libre.

Métodos

Imágenes de inmunofluorescencia de secciones de tejido: el grosor de las secciones de parafina era de 5 μm. Para las secciones frescas de parafina, se secaron las secciones a 37 °C durante la noche y después se secaron a 55 °C durante 30 minutos. Las secciones se introdujeron rápidamente en xileno para el desparafinado. Después de desparafinarlas totalmente con xileno durante 10 min en 3 ocasiones, se utilizó en serie etanol absoluto-etanol al 95 %, etanol al 90 %-etanol al 80 %-etanol al 70 %-etanol al 50 %-ddH²O para la rehidratación en gradiente. Tras la rehidratación, las secciones se introdujeron en solución de EDTA-reparación de antígeno para la reparación a alta temperatura mediante microondas. Tras finalizar la reparación, se dejó que se enfriasen naturalmente hasta la temperatura ambiente. Incubación de anticuerpos primarios: se absorbió el agua circundante al tejido con papel absorbente, se delimitó con un círculo la muestra utilizando un rotulador de inmunohistoquímica; se añadió anticuerpo primario diluido con dilución de anticuerpos DAKO y se incubó en una caja húmeda a 4 °C durante la noche en la oscuridad. Tras equilibrar a temperatura ambiente durante 10 minutos, a continuación, se lavó con PBST en 3 ocasiones, 5 minutos cada vez. Se añadió anticuerpo secundario fluorescente de la especie correspondiente y después se incubó en una caja húmeda a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 h. Tras lavar con PBST en 3 ocasiones, se tiñó con solución de tinción Hoechst33342 diluida con DAKO a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos, seguido de lavado con PBST 3 veces, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se sellaron con agentes de sellado solubles en agua y después se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio confocal láser. El método para obtener imágenes confocales era el mismo que para la inmunofluorescencia celular. Se utilizó el software de análisis NIS-Elements para analizar la intensidad de fluorescencia de las imágenes confocales, que a continuación se normalizó respecto a la intensidad de fluorescencia por unidad de superficie según la escala integrada.

Tinción inmunohistoquímica de tejido cerebral de monos Cynomolgus: el experimento se llevó a cabo siguiendo procedimientos inmunohistoquímicos rutinarios, de la manera siguiente: el grosor de las secciones de parafina de tejido de córtex prefrontal de monos Cynomolgus era de 5 |jm y las secciones frescas de parafina se hornearon durante la noche a 37 °C. Desparafinado: las secciones de parafina se secaron a 55 °C durante 30 minutos y después se introdujeron rápidamente en xileno para el desparafinado, mediante la inmersión en xileno durante 10 min 3 veces para un desparafinado completo. Rehidratación: para la inmersión se utilizó en serie etanol absoluto-etanol al 95 %-etanol al 90 %-etanol al 80 %-etanol al 70 %-etanol al 50 %-ddH²O, 3 minutos cada vez, para la rehidratación en gradiente. Tras la rehidratación, las secciones se introdujeron en solución de EDTA-reparación de antígeno para la reparación a alta temperatura mediante microondas durante 30 minutos. Tras finalizar la reparación, se dejó que se enfriasen naturalmente hasta la temperatura ambiente. Incubación de anticuerpos primarios: se absorbió el agua circundante al tejido con papel absorbente, se delimitó con un círculo la muestra utilizando un rotulador de inmunohistoquímica; se añadió anticuerpo primario diluido con dilución de anticuerpos DAKO y se incubó en una caja húmeda a 4 °C durante la noche en la oscuridad. Tras equilibrar a temperatura ambiente durante 10 minutos, a continuación, se lavó con PBST en 3 ocasiones, 5 minutos cada vez. Se añadió anticuerpo secundario-HRP diluido en diluyente para anticuerpos DAKO y se incubó a temperatura ambiente en una caja húmeda durante 1 h. A continuación, se lavó 3 veces con PBST, seguido de la adición de DAB para revelar el sustrato, controlando el tiempo de coloración de cada sección para que fuese idéntico. Se lavó 1 vez con PBST, seguido de la contratinción de hematoxilina durante 10 s. Las secciones se enjuagaron suavemente con agua corriente y después se lavaron una vez con PBS. Deshidratación: se utilizó en serie ddH₂O-etanol al 50 %-etanol al 70 %-etanol al 80 %-etanol al 90 %-etanol al 95 %-etanol absoluto mediante inmersión, 3 minutos cada vez, para la deshidratación en gradiente. Permeabilización: se llevó a cabo la permeabilización con xileno 3 veces durante 10 minutos. Sellado: el sellado se llevó a cabo con resina neutra diluida con xileno. Dos horas después, el agente sellado se había solidificado y pudieron obtenerse las imágenes. Obtención de imágenes: Se utilizó un microscopio de fluorescencia invertido Nikon ECLIPSE Ti-U para obtener fotografías de las secciones en el campo brillante, mediante el ajuste de la intensidad de exposición adecuada y el equilibrio de blancos del fondo, y la fijación de los ajustes de disparo para obtener imágenes de cada grupo de secciones desde múltiples perspectivas y múltiples ampliaciones. Transferencia western: 1) Preparación de muestras de proteínas (ver las instrucciones del lisado de proteínas M-PER): Después de procesar las células durante el tiempo especificado, se aspiró el medio y después se lavaron con PBS preenfriado a 4 °C (0,01 M, pH 7,2 a 7,3) 3 veces. Se mezclaron 150 a 200 j l de lisado de proteínas M-PER con inhibidor de proteasas (PMSF 100X), que se lisaron sobre hielo durante 10 minutos para lisar por completo las células. T ras la recolección del lisado, se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugación a 4 °C y a 12.000 rpm durante 15 minutos. 2) Cuantificación de proteínas BCA (ver las instrucciones del kit de cuantificación de proteínas BCA): se añadieron los componentes correspondientes a una placa de detección de 96 pocillos en la proporción de solución de cuantificación de reactivo A: solución B:ddH₂O:proteína=100:2:7,5:5 y se añadieron los estándares de albúmina diluidos en un gradiente de concentraciones, para dibujar una curva patrón. Se proporcionó cada muestra en 3 pocillos. Tras añadir la muestra, se mezcló mediante agitación suave con vórtex y se incubó en un incubador a 37 °C durante 30 minutos para completar la reacción de biuret. Tras la reacción, se detectó la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 562 nm utilizando un lector de microplacas. Se preparó una curva patrón de concentraciones de proteína mediante la utilización del valor promedio de la DO de los patrones y se consideró que un coeficiente de correlación r2>0,99 indicaba una buena linealidad. Tras calcular la concentración de proteína de cada grupo de muestras utilizando la curva patrón, se utilizó el lisado de proteína y el tampón de carga 5X para ajustar la concentración de cada muestra para que presentase la misma concentración. Mediante ebullición en agua hirviendo a 100 °C durante 5 minutos, se desnaturalizó la proteína hasta la estructura primaria. Se llevó a cabo la centrifugación a 12000g durante 5 s para llevar la muestra de las paredes al fondo. 3) Electroforesis en gel de poliacrilamida: se preparó el gel separado con la concentración apropiada según el peso molecular de la proteína diana que debía medirse y se preparó el gel concentrado después de solidificar el gel separado, insertando un peine para evitar la formación de espuma. Tras solidificar completamente el gel concentrado, se cargaron las muestras de marcadores y proteínas preteñidas y se llevó a cabo una electroforesis a presión constante utilizando el sistema de electroforesis Bio-Rad. Se detuvo la electroforesis al separar la proteína diana indicada por el marcador. 4) Transferencia de membrana (transferencia en húmedo): La membrana de PVDF del tamaño apropiado con cola se cortó y se preactivó en metanol. Tras recortar el gel de electroforesis, se creó un sándwich con la membrana de PVDF y esponja para formar un sándwich de cuatro capas para evitar las burbujas de aire. La capa interior se introdujo en un tanque de membrana de electrotransferencia y se vertió tampón de transferencia en húmedo preenfriado y se aplicaron 100 V de tensión constante para la electrotransferencia. Se ajustó el tiempo de transferencia de acuerdo con el peso molecular de la proteína diana. 5) Bloqueo: se extrajo la membrana de PVDF después de completarse la transferencia de membrana, que se lavó en una solución de lavado de membrana de TBST 3 veces, 5 minutos/vez. Se prepararon polvos de leche desnatada al 5 % con TBST y la membrana de PVDF se bloqueó en los polvos de leche desnatada al 5 % a temperatura ambiente durante 1 hora. 6) Incubación de anticuerpos: Tras el bloqueo, la membrana se lavó 3 veces con solución de lavado de TBST al 5 %, 5 min/vez. La membrana se cortó en varias bandas de acuerdo con el peso molecular de la proteína diana, y estas se introdujeron en la caja de compartimientos, respectivamente. Se añadieron los anticuerpos primarios correspondientes y se incubaron durante la noche en un agitador a 4 °C. Tras completar la incubación con anticuerpos primarios, la membrana se lavó 3 veces con solución de lavado de TBST al 5 %, 5 min/vez. Se añadieron los anticuerpos secundarios contra las especies de anticuerpo primario correspondientes, se introdujeron en un agitador de baja velocidad y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. 7) Exposición y revelado: La membrana se lavó 3 veces con solución de lavado de TBST al 5 %, 5 min/vez. Se añadieron las soluciones de revelado A y B al casete en una proporción 1:1 y después se mezclaron. Tras sumergir la membrana de PVDF en la solución de revelado durante 1 min, se expuso y se reveló utilizando un sistema de quimioluminiscencia Bio-Rad y se analizaron las imágenes utilizando el software Image Lab.

Tratamiento estadístico: los resultados experimentales se expresaron como medias ± desviaciones estándar y el análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software SigmaPlot. P<0,05 se refiere a una diferencia estadísticamente significativa. Se muestran otros métodos especiales en la nota.

Resultados

Mediante la utilización de una cámara hipobárica para simular la hipoxia hipobárica aguda causada por la rápida aproximación a la meseta, los presentes inventores llevaron monos Cynomolgus de 320 metros sobre el nivel del mar a 7500 metros en 190 minutos y después se trataron los monos Cynomolgus a la altitud de 7500 metros durante 48 horas, simulando el llegar rápidamente a una altitud extrema bajo las condiciones experimentales. A medida que se incrementaba la altitud, los monos Cynomolgus mostraron síntomas significativos de mal de altura agudo, tales como vómitos, ataxia y confusión, indicando que era una replicación satisfactoria de un modelo de mal de altura agudo de monos de primate no humano Cynomolgus. La utilización de las pruebas clásicas de comportamiento, patológicas y bioquímicas mostraron que la hipoxia hipobárica aguda conducía a una reducción significativa de la coordinación de los músculos esqueléticos, cambios en la vacuolación de la estructura del tejido cerebral, elevación del contenido de agua del cerebro, edema vascular cerebral y lesión por degeneración neuronal en los monos Cynomolgus, indicando que la hipoxia hipobárica aguda había causado un daño cerebral significativo.

Con el fin de investigar la posibilidad de que la hemoglobina cause daños en el tejido cerebral de los monos Cynomolgus bajo hipoxia hipobárica aguda, los presentes inventores llevaron a cabo tinción de inmunofluorescencia del tejido cerebral del córtex prefrontal de monos Cynomolgus. Se muestran los resultados en la fig. 1. En comparación con el grupo de normoxia normobárica, la distribución de hemoglobina libre extravascular se incrementó significativamente en el grupo de hipoxia hipobárica aguda (fig. 1A), mientras que su distribución se redujo significativamente en el grupo de tratamiento con triol ((fig. 1B). La tinción inmunohistoquímica del marcador de activación microglial Iba-1 (molécula adaptadora 1 de unión a calcio ionizado) en el córtex prefrontal de monos Cynomolgus mostró que la hipoxia hipobárica aguda había causado un incremento de los pseudopodios filamentosos 0 lamelares microgliales, mostrando un cambio morfológico de tipo activación y un incremento de la expresión de Iba-1 (fig. 2A), mientras que el número de células en la morfología de tipo activación se había reducido y la expresión de Iba-1 se había reducido significativamente en el grupo de tratamiento de triol (fig. 2B). En el tejido cerebral del córtex prefrontal de monos Cynomolgus, se utilizó adicionalmente la transferencia western para analizar el efecto de la hipoxia hipobárica aguda sobre las formas precursora y madura de las citoquinas inflamatorias IL-6 (interleuquina-6), TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa) e IL-1p (interleuquina-1 beta). Los resultados mostraron que el tratamiento de hipoxia hipobárica aguda causaba un incremento significativo de la expresión de dichos factores inflamatorios, mientras que el triol redujo significativamente los niveles de expresión de dichas citoquinas inflamatorias (figs. 3A y 3B).

Ejemplo 2. El triol restaura significativamente la eliminación de hemoglobina en el tejido cerebral.

CD163 es uno de los marcadores moleculares de los macrófagos M2 que poseen actividad antiinflamatoria. Su función es participar en la eliminación intracelular de las moléculas de inmunoglobulina como único receptor secuestrante de hemoglobina en mamíferos. El complejo de hemoglobina y haptoglobina experimenta fagocitosis mediada por CD163 de los macrófagos/microglía y a continuación es transportador al interior de lisosomas a través de endosomas para la degradación para producir heme, que es degradado adicionalmente por HO-1 para producir Fe2+, CO y biliverdina, y Fe2+ y biliverdina se oxidan adicionalmente a Fe3+ y bilirrubina.

Con el fin de analizar el efecto de la hipoxia hipobárica sobre la eliminación de hemoglobina, los presentes inventores analizaron en primer lugar la expresión de la enzima HO-1 clave limitante de velocidad de degradación de heme cadena abajo en el tejido cerebral del córtex prefrontal de monos Cynomolgus. Los presentes inventores encontraron que la hipoxia hipobárica aguda causaba una regulación negativa significativa de la expresión de CD163 (figs. 4A y 4B) y dicha regulación negativa de la expresión de CD163 pudo ser restaurada significativamente por el triol. Concordando con lo publicado en la literatura, la heme oxigenasa HO-1 estaba regulada positivamente por estrés tras la hipoxia hipobárica, y en este experimento, el tratamiento de triol reguló positivamente de manera adicional la expresión de HO-1.

La tinción de inmunofluorescencia del tejido cerebral de córtex prefrontal de monos Cynomolgus se utilizó para analizar adicionalmente la correlación entre el cambio en la expresión de CD163 y el marcador de activación de la microglía Iba1. La hipoxia hipobárica aguda causó una regulación negativa significativa de la expresión de CD163 (figs. 5A y 5B), acompañada de un incremento de la expresión de Iba1, y al restaurar significativamente dicha regulación negativa de CD163 por el triol, se vio acompañada de una regulación negativa de la expresión de Iba1 y el fármaco de control progesterona no canceló la inhibición de la expresión de CD163 causada por la hipoxia, y la expresión de Iba1 se incrementó en este tiempo.

Los resultados anteriormente proporcionados muestran que los patrones de expresión de CD163 e Iba1 son contrarios, lo que sugiere fuertemente que la hemoglobina libre es un factor inductor inflamatorio de la microglía en el daño cerebral causado por hipoxia hipobárica aguda y que la eliminación mediada por CD163 de la hemoglobina resulta fuertemente inhibida por la hipoxia.

Ejemplo 3. El triol reduce la activación inflamatoria de la BV2 de la microglía mediante la potenciación de la eliminación de la hemoglobina.

Métodos

Cultivo celular: Se recuperaron las células de microglía BV2 y se cultivaron en un medio DMEM que contenía FBS al 10 %. Una vez la densidad celular había alcanzado aproximadamente el 80 %, se llevó a cabo el subcultivo y la siembra. La densidad de siembra celular era de aproximadamente 4,0-5,0x105/ml.

T ratamiento de hipoxia: T ras iniciar el programa celular de una estación de trabajo de hipoxia, se configuró la condición de gases en 1 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono. Tras 30 minutos de esterilización con luz ultravioleta y una vez la concentración de gases era estable, pudo iniciarse el ensayo. Antes del tratamiento de hipoxia, las células se sustituyeron por medio fresco y a continuación se introdujo la placa de cultivo o la placa confocal en la estación de trabajo de hipoxia. Tras un punto temporal de tratamiento designado, se sacó rápidamente la placa de cultivo y se llevó a cabo la fijación celular o la lisis de las proteínas.

Tratamiento de hemoglobina: se preparó hemoglobina libre en una solución madre 10 mM con agua estéril; se almacenó a 4 °C, se diluyó con medio de cultivo y se añadió a la placa de cultivo hasta alcanzar la concentración final especificada. Durante la coestimulación de hemoglobina 20 μM e hipoxia, las células fueron estimuladas en primer lugar con hemoglobina libre y después se introdujo inmediatamente la placa de cultivo en una estación de trabajo de hipoxia para el tratamiento de hipoxia.

Obtención de imágenes celulares de inmunofluorescencia: Las células se sembraron en una placa especial para la obtención de imágenes confocales láser, se sustituyó el medio de cultivo de suero fresco después de la adherencia y después se estimularon con la estimulación de hemoglobina correspondiente, el tratamiento de hipoxia o el cotratamiento, seguido de la fijación. En primer lugar, se aspiró el medio, se lavó 3 veces con PBST al 0,3 %; después, se añadió paraformaldehído al 4 % para fijar las células, durante 20 min. A continuación, se lavaron 3 veces con PBST al 0,3 % y se perforaron con Triton X-100 durante 15 min. Seguidamente, se lavaron 3 veces con PBST al 0,3 % y el anticuerpo primario correspondiente se diluyó con diluyente para anticuerpos DAKO y se mezclaron, y después se añadieron sobre las células, seguido de la introducción en una caja húmeda cerrada e incubación durante la noche a 4 °C en un agitador. Tras equilibrar a la temperatura ambiente, se lavaron con PBST al 0,3 % 3 veces. Se diluyó una concentración específica del anticuerpo secundario fluorescente con diluyente para anticuerpos DAKO y después se añadió sobre la muestra, seguido de la introducción en una caja húmeda en la oscuridad e incubación a temperatura ambiente durante 1 h. Tras el lavado con PBST al 0,3 % 3 veces, se diluyó solución de tinción nuclear Hoechst33342 con diluyente para anticuerpos DAKO y se añadió sobre la muestra después de la mezcla, seguido de la introducción en una caja húmeda en la oscuridad y la incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras la incubación, se lavaron con PBS una vez y se añadieron 300 μl de PBS y ya se pudieron obtener las imágenes. Se utilizó un microscopio confocal Nikon A1 para obtener las imágenes. T ras iniciar el programa, se ajustó la intensidad del láser y el tiempo de exposición de cada canal y después se configuraron las condiciones de la obtención de imágenes a fin de obtener fotografías de cada grupo de muestras. Se llevó a cabo el análisis de la intensidad de fluorescencia de imágenes confocales utilizando el software de análisis NIS-Elements y se normalizó la intensidad de fluorescencia por célula respecto al número de células.

Transferencia western: igual que en el Ejemplo 1.

Amplificación por PCR con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR, por sus siglas en inglés): 1) Extracción del ARN total: Se siguieron las instrucciones del reactivo de extracción Trizol. Tras tratar las células hasta un punto temporal designado, se aspiró el medio y se lavaron dos veces con PBS. Se añadió 1 ml de triol a células lisadas por pipeteado (se calcularon los reactivos siguientes para 1 ml de Trizol). Se añadieron 200 μl de cloroformo, se mezclaron vigorosamente de modo manual y a continuación se dejaron a temperatura ambiente durante 3 min. Se llevó a cabo la centrifugación a 12000g a 4 °C durante 15 minutos y se extrajeron 400 μl de la fase acuosa superior introduciéndolos en un tubo nuevo; se añadieron 400 μl de isopropanol, se mezclaron suavemente de manera manual y se dejaron a temperatura ambiente durante 20 min. La centrifugación se llevó a cabo a 12000g a 4 °C durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. Se añadieron 500 μl de etanol al 75 % preenfriado, seguido de centrifugación a 7500g a 4 °C durante 10 min y se descartó cuidadosamente el sobrenadante. Tras secar al aire, se añadió una cantidad apropiada de DEPC-agua para disolver el precipitado de ARN. 2) Cuantificación del ARN: Se utilizó un cuantificador de ácidos nucleicoso Nanodrop 2000 para cuantificar el ARN y se determinó la proporción de DO a las longitudes de onda de 260/280 nm y se consideró que una proporción de entre 1,8 y 2,0 era de buena calidad. 3) Reacción de transcripción inversa: la cantidad total de ARN en cada sistema de reacción era de 2 μg; 1 μl de oligo dT, y el sistema de reacción se ajustó a 13 μl utilizando DEPC-agua. Tras la centrifugación y mezcla, se sometió a 65 °C y se predesnaturalizó durante 5 min. Inmediatamente después de la desnaturalización, se dejó sobre hielo, se añadieron 4 μl de tampón de reacción de transcriptasa inversa (TR), 2 μl de dNTP y 1 μl de transcriptasa inversa. Tras la centrifugación y mezcla, se llevó a cabo la reacción de transcripción inversa. Las condiciones de transcripción inversa fueron: 42°C 60 min - 70°C 10 min - 4°C. 4) Parámetros de la reacción de amplificación de qPCR; el sistema de reacción de amplificación de qPCR era: 5 |jl de mezcla de verde SYBR, 1 |jl de ADNc, 2 |jl de cebador, 2 |jl de ddH²O libre de ARNasa. Los parámetros de ciclo eran: Etapa de mantenimiento: 95 °C 15 min; etapa de ciclado (40 ciclos): 95 °C 10 s-56 °C 20 s-72 °C 30 s; etapa de curva de fusión: 95 °C 15 s-60 °C 60 s-95 °C 15 s-60 °C 60 s. 5) Procesamiento de los datos: Para el análisis de los datos se utilizó el software de PCR en tiempo real Applied Biosystem 7500 v2.0.5 y se cuantificó la expresión génica relativa utilizando el método de la fórmula R^q = 2 -AACt.

Resultados

Con el fin de explorar si la hemoglobina libre podía causar directamente la activación de la microglía, en primer lugar, se utilizó hemoglobina para estimular la microglía a fin de observar los cambios en sus índices de activación. Mediante la utilización de hemoglobina libre para estimular la microglía BV2 in vitro en diferentes tiempos, los resultados mostraron que, a las 24 horas, BV2 mostraba una morfología de tipo activación, presentando un agrandamiento del cuerpo celular y un incremento y ampliación de los pseudopodios filamentosos (figs. 6A y 6C). Simultáneamente, la expresión de los marcadores moleculares de activación de la microglía Iba-1 (fig. 6D) y CD11 b (figs. 6B y 6E) también resultaron incrementados significativamente por la estimulación por la hemoglobina libre (figs. 6B y 6D). Los experimentos de transferencia western confirmaron adicionalmente los resultados del ensayo de inmunofluorescencia anteriormente mencionados en el tejido cerebral de monos Cynomolgus (fig. 6E). Concordando con dichas observaciones, la estimulación con hemoglobina libre causó un incremento significativo de la expresión del ARNm de las citoquinas inflamatorias de la microglía TNF--a, IL-1p e IL-6 (tal como se muestra en la fig. 6f ), lo que indica que la hemoglobina libre causó la activación inflamatoria de las células de microglía.

Con el fin de analizar el efecto de la hipoxia sobre la activación mediada por hemoglobina libre de la microglía, esta se estimuló directamente con hemoglobina libre y, simultáneamente, se aplicó en las células el tratamiento de hipoxia de 1 % de oxígeno. Se encontró que la hipoxia exacerbaba el incremento de los niveles proteicos de citoquinas inflamatorias de la microglía causado por la hemoglobina libre. Entre estos factores inflamatorios se incluían TNF-a, IL-1p e IL-6, aunque no presentó ningún efecto significativo sobre la citoquina antiinflamatoria IL-4 (fig. 6G). Estos resultados muestran que la hipoxia puede exacerbar la activación microglial causada por la hemoglobina libre.

En la microglía del tejido cerebral de los monos Cynomolgus, se encontró que el triol regulaba positivamente la expresión del receptor secuestrante de hemoglobina CD163 y su molécula cadena abajo, HO-1. La interferencia en el ^a Rⁿ de CD163 se utilizó adicionalmente en un modelo celular in vitro. Tras la hipoxia y activación de la microglía con la estimulación por hemoglobina, se analizó si la interferencia de CD163 podía anular el efecto inhibidor del triol sobre la activación de la microglía. Tal como se muestra en la fig. 7, tras la interferencia de CD163, el efecto inhibidor del triol sobre la regulación positiva de Iba-1 y CD11 b en células de microglía activadas por hipoxia y hemoglobina resultó anulada, y la expresión de Iba-1 y CD11b se reanudó regulada positivamente, indicando que el triol bloquea la activación inflamatoria de la microglía mediante la potenciación mediada por CD163 de la eliminación celular de la hemoglobina libre.

En resumen, la hemoglobina libre causa la activación de la microglía y el triol reduce la activación de la microglía causada por la hemoglobina libre mediante la restauración de la expresión del receptor secuestrante CD163.

Referencias

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2. Zhu Yicheng. Important issues in clinical research of cerebral small vessel diseases, Chinese Journal of Stroke, December 2015, Vol. 10 No. 12: 996-999.

3. Wardlaw JM,Smith C,Dichgans M. Mechanisms of sporadic cerebral small vessel disease: insights from neuroimaging. Lancet Neurol,2013,12 :483-497.

4. Li Feng, Tan Shouwen, Li Ying, Xu Chitian. Blood-brain barrier integrity and cerebral small vessel disease, International Journal of Cerebrovascular Diseases, 2017,25(3): 239-243.

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8. Willmann, G, Fischer, M.D., Schatz, A., Schommer, K., and Gekeler, F. (2013). Retinal vessel leakage at high altitude. Jama 309, 2210-2212.

9. Yuan Qiang, Use value of MRI magnetic sensitivity weighted imaging in cerebral microbleeds in chronic high altitude disease, 2015, Master's thesis of Imaging Medicine and Nuclear Medicine of Qinghai University.

10. Greenberg SM, Vernooij MW, Cordonnier C, et al. Cerebralmicrobleeds: a guide to detection and interpretation. Lancet Neurol.2009;8:165-74.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de fórmula I:

o un compuesto deuterado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la utilización en el tratamiento de la enfermedad de vasos cerebrales pequeños en un paciente,

en el que la enfermedad de vasos cerebrales pequeños es un microsangrado cerebral y

en el que R1 es H, un alquilo con 1 a 5 átomos de carbono o -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

2. Compuesto para la utilización según la reivindicación 1, en el que R1 es H.

3. Compuesto para utilización según la reivindicación 1, en el que R1 se selecciona del grupo que consiste en -CHCH²CH³ , -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ y -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

4. Compuesto para la utilización según la reivindicación 1, en el que el microsangrado cerebral es microsangrado cerebral espontáneo, microsangrado cerebral relacionado con fármacos o microsangrado cerebral traumático.

5. Compuesto según la reivindicación 4, en el que el microsangrado cerebral espontáneo es el microsangrado cerebral asociado a la edad, el microsangrado cerebral hipertensivo, el microsangrado cerebral asociado al mal de altura agudo, el microsangrado cerebral asociado a mal de altura crónico, el microsangrado cerebral asociado a ictus isquémico, o el microsangrado cerebral asociado a ictus hemorrágico.

6. Compuesto para la utilización según la reivindicación 4, en el que el microsangrado cerebral relacionado con fármacos es microsangrado cerebral relacionado con fármacos trombolíticos, microsangrado cerebral asociado a fármacos anticoagulantes, microsangrado cerebral relacionado con fármacos antiagregación plaquetaria o microsangrado cerebral relacionado con fármacos estatinas.

7. Compuesto para la utilización según la reivindicación 4, en el que el microsangrado cerebral traumático es un microsangrado cerebral causado por una cirugía.

8. Compuesto para la utilización según la reivindicación 7, en el que la cirugía es una cirugía que involucra directamente el sistema nervioso central.

9. Compuesto para la utilización según la reivindicación7, en el que la cirugía es clipaje o embolización de aneurisma cerebral, o resección de tumor cerebral.

10. Compuesto para la utilización según la reivindicación 1, en el que la enfermedad de vasos cerebrales pequeños es asintomática.

11. Compuesto para la utilización según la reivindicación 1, en el que la enfermedad de vasos cerebrales pequeños es sintomática.

12. Compuesto para la utilización según la reivindicación 1, en el que el paciente es un ser humano.

13. Compuesto para la utilización según la reivindicación 1, en el que el tratamiento comprende, además, la administración de un agente terapéutico adicional.

14. Compuesto para la utilización según la reivindicación 1, en el que la enfermedad de vasos cerebrales pequeños se manifiesta como una distribución significativamente incrementada de hemoglobina libre en el exterior de vasos cerebrales.