RU2752089C1

RU2752089C1 - Применение соединения для получения лекарственного средства для лечения церебральной микроангиопатии

Info

Publication number: RU2752089C1
Application number: RU2020123500A
Authority: RU
Inventors: Гуанмэй ЯНЬ; Вэй ИНЬ; Лунсян ШЭН; Бинчжэн ЛУ; Ицзюнь ХУАН; Суйчжэнь ЛИНЬ
Original assignee: Гуанчжоу Селлпротек Фармасьютикал Ко., Лтд
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2021-07-22
Also published as: KR102466251B1; TW201932115A; KR20200104361A; CA3087115C; CN109985049B; AU2018396895B2; CA3087115A1; JP7097444B2; EP3733190A4; CN109985049A; IL275686B2; US11911396B2; US20200330483A1; AU2018396895A1; IL275686A; PT3733190T; WO2019129179A1; ES2951306T3; EP3733190B1; IL275686B1

Abstract

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к применению соединения формулы I:(I),или его дейтерированного соединения, или фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения церебральной микроангиопатии у пациента, причем церебральная микроангиопатия представляет собой церебральное микрокровотечение, и R1представляет собой H, алкил или терминальный алкенил, содержащий от 1 до 5 атомов углерода, или -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2. Изобретение обеспечивает применение соединений, которые значительно улучшают выведение внесосудистого гемоглобина и, таким образом, могут быть применены для лечения церебральной микроангиопатии. 12 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым фармацевтическим применениям 5α-андрост-3β,5,6β-триола («Триола») и его аналогов, в частности, к применениям этих соединений для лечения церебральной микроангиопатии.

Уровень техники

Мелкие сосуды головного мозга относятся к мелким перфорирующим артериям и мелким артериям (диаметром 40 ~ 200 мкм), капиллярам и мелким венам головного мозга, которые формируют основной элемент кровоснабжения тканей головного мозга и играют важную роль в поддержании функции головного мозга⁽¹⁾. Вместе крупные и мелкие сосуды головного мозга формируют сосудистую сеть. Они существуют в виде непрерывной структуры, сообща зависят от гемодинамики и сообща подвержены влиянию факторов риска. В связи с этим патологические изменения крупных и мелких сосудов головного мозга теоретически должны демонстрировать параллельную корреляцию в отношении степени тяжести. Однако в клинической практике часто наблюдается несоответствие между этими двумя типами сосудов. Например, часто встречаются пациенты с тяжелой церебральной микроангиопатией, но без осложнения в виде стеноза крупной мозговой артерии, и наоборот⁽²⁾.

Церебральная микроангиопатия (ЦМА) относится к синдромам клинических, когнитивных, визуализируемых и патологических проявлений, вызванным различными поражениями мелких сосудов⁽³⁾. Традиционно ее относят к клиническим и визуализируемым проявлениям, вызванным поражениями мелких перфорирующих артерий и мелких артерий. Клинически ЦМА проявляется в основном в виде инсульта (небольшого глубокого инфаркта, кровоизлияния в мозг), когнитивных и эмоциональных расстройств и общего ухудшения функционального состояния. При визуализации заболевание проявляется в виде лакунарного инфаркта (ЛИ), лакуны, поражений белого вещества (ПБВ), расширенного периваскулярного пространства (РПП) и церебральных микрокровотечений (ЦМК) и так далее⁽¹⁾.

Специфический патогенез ЦМА связан с нарушением функции эндотелия сосудов, повреждением гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), воспалительными механизмами, генетическими факторами и ишемическим гипоперфузионным поражением, среди которых основным механизмом является повреждение ГЭБ. Повреждение и разрушение ГЭБ приводит к увеличению проницаемости, которое создает возможность попадания компонентов крови из сосудов в окружающие ткани и паренхиму головного мозга, что вызывает соответствующие патофизиологические изменения, приводящие к ассоциированной с ЦМА визуальной картине и патологическим изменениям⁽⁴⁾.

Церебральное микрокровотечение является одним из проявлений церебральной микроангиопатии и представляет собой субклиническое повреждение паренхимы головного мозга, вызванное микроангиопатией в головном мозге. Оно характеризуется небольшой утечкой крови, и эритроциты, выходящие за пределы сосудов, визуально проявляются в виде отложений гемосидерина. В зависимости от давности поражения, вокруг сосудов могут быть видны свежие эритроциты, отложившиеся гранулы гемосидерина или макрофаги, поглощающие гемосидерин.

ЦМК проявляется в виде очагов поражений, характеризующихся незначительной потерей сигнала на T2-взвешенных изображениях (или других изображениях, взвешенных по магнитной восприимчивости), с ореолами вокруг очагов поражений. Очаги поражения обычно имеют диаметр от 2 до 5 мм, не более 10 мм⁽⁵⁾. Эти очаги поражения на МР изображениях называются «зона отсутствия сигнала», «артефакт магнитной восприимчивости», «черная дыра», «пятно», «микрокровотечение», «старое микрокровотечение (old microbleed, OMB)», «многоочаговое поражение, характеризующееся потерей сигнала» или «микрокровоизлияние (МК)». Обычно оно локализовано в участках, соединяющих кору и подкорковые структуры головного мозга, ядре серого вещества в глубокой коре, белом веществе полушарий головного мозга, стволе головного мозга и мозжечке. Изображения, взвешенные по магнитной восприимчивости (SWI), характеризуются большей чувствительностью при выявлении ЦМК, чем T2-взвешенные изображения в импульсной последовательности градиентного эха (T2*ВИ-GRE).

Предположительно, ЦМК в основном являются бессимптомными и не имеют острых клинических проявлений. В исследованиях было показано, что церебральные микрокровотечения некоторым образом связаны с возрастом, факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, дегенерацией белого вещества, инсультом и постинсультными аффективными расстройствами. Кроме того, церебральное микрокровотечение также является важной патологической причиной поражения головного мозга при острой и хронической высотной болезни⁽⁶⁾. Церебральное микрокровотечение было обнаружено в ткани головного мозга⁽⁷⁾ или сетчатке⁽⁸⁾ при МР визуализации в ходе патологоанатомического исследования пациентов с высотной болезнью или обследования выживших после высотного отека мозга. При использовании МРТ в режиме изображений, взвешенных по магнитной восприимчивости (SWI), для изучения церебральных микрокровотечений у пациентов с хронической горной болезнью (ХГБ) было обнаружено, что 11 из 20 (55 %) пациентов с подтвержденной ХГБ имели церебральные микрокровотечения, и доля положительных случаев церебральных микрокровотечений, выявленных в группе пациентов с ХГБ, была значительно выше, чем в нормальной популяции⁽⁹⁾.

Широкое применение тромболитических средств (таких как тканевой активатор плазминогена (t-PA), стрептокиназа (SK)), антикоагулянтов (таких как варфарин) и антитромбоцитарных средств (таких как аспирин) в антитромботической терапии привело к значительному повышению частоты возникновения первичного внутримозгового кровоизлияния (ВМК), связанного с приемом лекарственных средств. В исследованиях при сравнении пациентов с ВМК, связанным с приемом варфарина, и пациентов со спонтанным ВМК было показано, что ЦМК чаще обнаруживали у первых. Текущие исследования позволяют предположить, что ЦМК ассоциировано с повышенным риском кровотечения, связанного с приемом антикоагулянтов. Риск ВМК, связанного с приемом аспирина, значительно возрастает с увеличением числа очагов ЦМК. Метаанализ, проведенный при сравнении пациентов, принимавших аспирин, с пациентами, не принимавшими аспирин, показал наличие связи между ЦМК и ВМК (ОШ = 1,7). В другом исследовании было показано, что у пациентов с инсультом, которые принимали статины (такие как аторвастатин) в высоких дозах, частота возникновения ВМК была немного выше. Частота возникновения ЦМК в долях головного мозга у пациентов, принимающих статины, примерно в два раза выше, чем у пациентов, не принимающих статины, но для других отделов мозга значимых различий обнаружено не было, из чего можно сделать вывод, что статины могут повышать риск кровотечения у пациентов с церебральной амилоидной ангиопатией.

Оперативное вмешательство также может вызывать повреждение центральной нервной системы, включая непосредственное повреждение нервной ткани в результате оперативного вмешательства в органы центральной нервной системы (включая головной мозг и нотохорд) и гистопатологические изменения в нервной системе, вызванные изменениями кровоснабжения и кровотечением во время проведения оперативного вмешательства, включая отек тканей, кровотечение, микрокровотечения, инфаркт и микроинфаркт. Часто проводимые оперативные вмешательства, которые вызывают повреждение центральной нервной системы, включают, но не ограничиваются перечисленными, клипирование или эмболизацию аневризмы сосудов головного мозга, резекцию опухоли головного мозга и другие оперативные вмешательства, непосредственно затрагивающие центральную нервную систему.

Однако в настоящее время по-прежнему отсутствуют эффективные лекарственные средства для лечения церебральных микрокровотечений. Большое клиническое значение имеет обеспечение лекарственного средства, которое могло бы облегчать или устранять последствия церебральных микрокровотечений.

Раскрытие сущности изобретения

В основе настоящего изобретения лежит обнаруженный его авторами факт того, что соединения формулы I улучшают выведение свободного гемоглобина из ткани головного мозга, и согласно настоящему изобретению предложено новое применение соединений формулы I:

(I)

для лечения церебральной микроангиопатии, где R₁ представляет собой H, алкил или терминальный алкенил, содержащий от 1 до 5 атомов углерода, или -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы I:

(I),

или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения церебральной микроангиопатии, где R₁ представляет собой H, алкил или терминальный алкенил, содержащий от 1 до 5 атомов углерода, или -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

В одном варианте реализации R₁ предпочтительно представляет собой H, и соединение представляет собой 5α-андрост-3β,5,6β-триол (далее иногда сокращенно называемый «Триол»). В одном варианте реализации R₁ выбран из группы, состоящей из -CHCH₂CH₃, -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ и -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

В некоторых вариантах реализации церебральная микроангиопатия предпочтительно представляет собой церебральное микрокровотечение. В некоторых вариантах реализации церебральное микрокровотечение представляет собой спонтанное церебральное микрокровотечение, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом лекарственных средств, или травматическое церебральное микрокровотечение. В некоторых вариантах реализации спонтанное церебральное микрокровотечение представляет собой возрастное церебральное микрокровотечение, гипертоническое церебральное микрокровотечение, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с острой высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с хронической высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с ишемическим инсультом, или церебральное микрокровотечение, ассоциированное с геморрагическим инсультом. В некоторых вариантах реализации церебральное микрокровотечение, связанное с приемом лекарственных средств, представляет собой церебральное микрокровотечение, связанное с приемом тромболитических средств, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом антикоагулянтов, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом средств, препятствующих агрегации тромбоцитов, или церебральное микрокровотечение, связанное с приемом статинов. В некоторых вариантах реализации травматическое церебральное микрокровотечение представляет собой церебральное микрокровотечение, вызванное оперативным вмешательством.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения церебрального микрокровотечения у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества соединения формулы I:

(I),

или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы I, или его дейтерированное соединение или фармацевтически приемлемую соль, где R₁ представляет собой H, алкил или терминальный алкенил, содержащий от 1 до 5 атомов углерода, или -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

В одном варианте реализации R₁ предпочтительно представляет собой H. В одном варианте реализации R₁ выбран из группы, состоящей из -CHCH₂CH₃, -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ и -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

В некоторых вариантах реализации церебральное микрокровотечение у пациента подтверждают с помощью МРТ. В некоторых вариантах реализации пациент страдает от спонтанного церебрального микрокровотечения, церебрального микрокровотечения, связанного с приемом лекарственных средств, или травматического церебрального микрокровотечения. В некоторых вариантах реализации спонтанное церебральное микрокровотечение представляет собой возрастное церебральное микрокровотечение, гипертоническое церебральное микрокровотечение, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с острой высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с хронической высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с ишемическим инсультом, или церебральное микрокровотечение, ассоциированное с геморрагическим инсультом. В некоторых вариантах реализации церебральное микрокровотечение, связанное с приемом лекарственных средств, представляет собой церебральное микрокровотечение, связанное с приемом тромболитических средств, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом антикоагулянтов, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом средств, препятствующих агрегации тромбоцитов, или церебральное микрокровотечение, связанное с приемом статинов. В некоторых вариантах реализации травматическое церебральное микрокровотечение представляет собой церебральное микрокровотечение, вызванное оперативным вмешательством.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено соединение формулы I:

(I),

или его дейтерированное соединение или фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения церебрального микрокровотечения у пациента, где R₁ представляет собой H, алкил или терминальный алкенил, содержащий от 1 до 5 атомов углерода, или -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ улучшения выведения свободного гемоглобина, локализованного вне сосудов головного мозга, у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества соединения формулы I:

(I),

или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы I, или его дейтерированное соединение, или фармацевтически приемлемую соль, где R₁ представляет собой H, алкил или терминальный алкенил, содержащий от 1 до 5 атомов углерода, или -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ выведения свободного гемоглобина, локализованного вне сосудов головного мозга, у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества соединения формулы I:

(I),

Присутствие свободного гемоглобина обусловлено спонтанным церебральным микрокровотечением, церебральным микрокровотечением, связанным с приемом лекарственных средств, или травматическим церебральным микрокровотечением. В некоторых вариантах реализации спонтанное церебральное микрокровотечение представляет собой возрастное церебральное микрокровотечение, гипертоническое церебральное микрокровотечение, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с острой высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с хронической высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с ишемическим инсультом, или церебральное микрокровотечение, ассоциированное с геморрагическим инсультом. В некоторых вариантах реализации церебральное микрокровотечение, связанное с приемом лекарственных средств, представляет собой церебральное микрокровотечение, связанное с приемом тромболитических средств, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом антикоагулянтов, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом средств, препятствующих агрегации тромбоцитов, или церебральное микрокровотечение, связанное с приемом статинов. В некоторых вариантах реализации травматическое церебральное микрокровотечение представляет собой церебральное микрокровотечение, вызванное оперативным вмешательством.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения церебральной микроангиопатии у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы I:

(I),

или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли, или введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы I или его дейтерированное соединение или фармацевтически приемлемую соль, где R₁ представляет собой H, алкил или терминальный алкенил, содержащий от 1 до 5 атомов углерода, или -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

В некоторых вариантах реализации церебральная микроангиопатия представляет собой церебральное микрокровотечение. В некоторых вариантах реализации церебральное микрокровотечение у пациента подтверждают с помощью МРТ. В некоторых вариантах реализации пациент страдает от спонтанного церебрального микрокровотечения, церебрального микрокровотечения, связанного с приемом лекарственных средств, или травматического церебрального микрокровотечения. В некоторых вариантах реализации спонтанное церебральное микрокровотечение представляет собой возрастное церебральное микрокровотечение, гипертоническое церебральное микрокровотечение, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с острой высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с хронической высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с ишемическим инсультом, или церебральное микрокровотечение, ассоциированное с геморрагическим инсультом. В некоторых вариантах реализации церебральное микрокровотечение, связанное с приемом лекарственных средств, представляет собой церебральное микрокровотечение, связанное с приемом тромболитических средств, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом антикоагулянтов, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом средств, препятствующих агрегации тромбоцитов, или церебральное микрокровотечение, связанное с приемом статинов. В некоторых вариантах реализации травматическое церебральное микрокровотечение представляет собой церебральное микрокровотечение, вызванное оперативным вмешательством.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Острая гипобарическая гипоксия вызывала увеличение области локализации свободного гемоглобина вне сосудов ткани префронтальной коры головного мозга яванских макаков (Macaca fascicularis). A. Результат иммунофлуоресцентной визуализации ткани головного мозга яванских макаков, где маркер клеток эндотелия сосудов CD31 показан в виде сигнала красного цвета, который свидетельствовал о расположении кровеносного сосуда, а контур сосуда показан с помощью пунктирной линии; внесосудистый свободный гемоглобин показан в виде сигнала зеленого цвета; и ядра показаны в виде сигналов синего цвета. B. СИФ (среднюю интенсивность флуоресценции) количественно определяли с использованием программного обеспечения Nikon NIS-Element. Показан результат статистической обработки относительных значений интенсивности флуоресценции внесосудистого свободного гемоглобина, локализованного в ткани головного мозга яванских макаков, при этом статистические расчеты выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Даннетта, **, p < 0,01, н.з., различия статистически не значимы, n = 4. НН: группа с нормобарической нормоксией; ГГ: группа с гипобарической гипоксией; ГГ + Триол: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили Триол; ГГ + ПРОГ: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили контрольный препарат. ПРОГ представляет собой контрольный препарат прогестерон.

Фиг. 2. Активация микроглии в ткани префронтальной коры головного мозга яванских макаков. A. Результат детекции Iba-1 в ткани префронтальной коры головного мозга яванских макаков посредством иммуногистохимического окрашивания, Iba-1 служит маркером активации микроглии. Черная масштабная шкала соответствует 25 мкм, а красная масштабная шкала соответствует 200 мкм. B. Результат статистической обработки относительных значений оптической плотности для Iba-1. Сканирование оптической плотности на иммуногистохимических изображениях для каждой группы проводили с использованием программного обеспечения Image pro plus с получением значений оптической плотности, которые затем нормализовали по группе НН. НН: группа с нормобарической нормоксией (n = 4); ГГ: группа с гипобарической гипоксией (n = 4); ГГ + Триол: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили Триол (n = 3); ГГ + ПРОГ: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили контрольный препарат (n = 4). Статистические расчеты выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Даннетта. ***, p < 0,01, н.з., различия статистически не значимы.

Фиг. 3. Триол значительно снижал экспрессию факторов воспаления ИЛ-6, ИЛ-1β и ФНО-α в ткани головного мозга яванских макаков. A. Экспрессия белков факторов воспаления ИЛ-6, ИЛ-1β и ФНО-α в ткани префронтальной коры головного мозга яванских макаков. B. Результат статистической обработки относительных значений, характеризующих интенсивность окрашивания белковых зон на черно-белом изображении. НН: группа с нормобарической нормоксией (N = 3); ГГ: группа с гипобарической гипоксией (N = 3); ГГ + Триол: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили Триол (N = 3); ГГ + ПРОГ: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили контрольный препарат (N = 3). Значения, характеризующие интенсивность окрашивания зон на черно-белом изображении, получали посредством сканирования с использованием программного обеспечения Image Lab, а относительные значения получали после нормализации по α-тубулину. Статистические расчеты выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Даннетта, и в случае последнего каждую группу сравнивали с группой ГГ, *, p < 0,05; **, p < 0,01.

Фиг. 4. Триол улучшал выведение свободного гемоглобина в ткани головного мозга за счет увеличения содержания белков CD163 и гемоксигеназы-1 (HO-1). A. Экспрессия белков скэвенджер-рецептора гемоглобина CD163 и гемоксигеназы HO-1 в ткани префронтальной коры головного мозга яванских макаков. B. Результат статистической обработки относительных значений, характеризующих интенсивность окрашивания белковых зон на черно-белом изображении. Значения, характеризующие интенсивность окрашивания зон на черно-белом изображении, получали посредством сканирования с использованием программного обеспечения Image Lab, а относительные значения получали после нормализации по α-тубулину. НН: группа с нормобарической нормоксией (N = 3); ГГ: группа с гипобарической гипоксией (N = 3); ГГ + Триол: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили Триол (N = 3); ГГ + ПРОГ: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили прогестерон (N = 3). Статистические расчеты выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Даннетта, и в случае последнего каждую группу сравнивали с группой ГГ, *, p < 0,05; н.з., различия статистически не значимы.

Фиг. 5. Триол восстанавливал сниженную экспрессию CD163 и уменьшал активацию микроглии, вызванную гипобарической гипоксией. A. Результат детекции CD163 и Iba-1 в ткани головного мозга яванских макаков посредством иммунофлуоресцентной визуализации. B. Результат статистической обработки относительных значений интенсивности флуоресценции CD163 и Iba-1. C. Корреляционный анализ относительных значений интенсивности флуоресценции CD163 и Iba-1. НН: группа с нормобарической нормоксией; ГГ: группа с гипобарической гипоксией; ГГ + Триол: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили Триол; ГГ + ПРОГ: группа с гипобарической гипоксией, которой вводили прогестерон. Статистические расчеты выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Даннетта, и в случае последнего каждую группу сравнивали с группой ГГ, ***, p < 0,001.

Фиг. 6. Гипоксия усиливала воспалительную активацию микроглии, вызванную присутствием свободного гемоглобина. A. После стимуляции микроглии BV2 под действием свободного гемоглобина в течение различных периодов времени осуществляли иммунофлуоресцентную визуализацию для детекции маркера активации микроглии CD11b. Масштабная шкала соответствует 25 мкм. B. Результат статистической обработки относительных значений интенсивности флуоресценции CD11b, представленной на фиг. A. Статистические расчеты выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Даннетта, *, p < 0,05; **, p < 0,01. C. После стимуляции микроглии BV2 под действием свободного гемоглобина в течение различных периодов времени осуществляли иммунофлуоресцентную визуализацию для детекции маркера активации микроглии Iba-1, и выявляли морфологические изменения микроглии с помощью окрашивания фаллоидином. D. Результат статистической обработки относительных значений интенсивности флуоресценции Iba-1, представленной на фиг. C. Статистические расчеты выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Даннетта, *, p < 0,05; **, p < 0,01. E. Клетки BV2 стимулировали воздействием свободного гемоглобина в течение различных периодов времени, и определяли содержание белка CD11b посредством вестерн-блоттинга. F. После стимуляции микроглии BV2 под действием свободного гемоглобина в течение 6 часов определяли экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов и хемокинов посредством количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). G. Гипоксия усиливала повышение экспрессии белков микроглиальных факторов воспаления ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6, вызванное присутствием свободного гемоглобина, но не оказывала влияния на противовоспалительный фактор ИЛ-4.

Фиг. 7. Подавление повышения экспрессии CD163 с помощью РНК-интерференции устраняло ингибирующее действие Триола в отношении повышения экспрессии Iba-1 и CD11b, индуцированного гипоксией и гемоглобином. Трансфекцию клеток BV2 фрагментом миРНК CD163 No.01 и, соответственно, скремблированным интерферирующим фрагментом, который выступал в качестве отрицательного контроля (ОК), проводили с использованием реагентов RNAiMAX в соответствии с инструкциями производителя, затем к клеткам BV2 добавляли среду для культивирования, содержащую или не содержащую 10 мкМ Триола, и клетки BV2 стимулировали путем добавления 20 мкМ гемоглобина и обработки, вызывающей гипоксию, при которой содержание кислорода составляло 1 %, в течение 6 часов, после чего собирали образцы белков и определяли экспрессию маркеров активации микроглии Iba-1 и CD11b посредством вестерн-блоттинга.

Подробное описание изобретения

В настоящем документе термин «композиция» относится к составу, подходящему для введения предполагаемому животному-субъекту в терапевтических целях, содержащему по меньшей мере один фармацевтически активный компонент, такой как соединение. Необязательно, композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает, что вещество не обладает таким свойством, которое, с учетом заболевания или состояния, подлежащего лечению, и соответствующего пути введения, способствует тому, что компетентные и предусмотрительные практикующие врачи будут избегать введения вещества пациенту. Например, в случае инъекционных препаратов часто требуется, чтобы такое вещество было по существу стерильным.

В настоящем документе термины «терапевтически эффективное количество» и «эффективное количество» означают, что вещество и количество вещества являются эффективными для предотвращения, облегчения или устранения одного или более симптомов заболевания или состояния и/или увеличения выживаемости субъекта, получающего лечение.

Термин «церебральная микроангиопатия» или «ЦМА» относится к синдрому клинических, когнитивных, визуализируемых и патологических проявлений, вызванному различными поражениями мелких перфорирующих артерий и мелких артерий (диаметром 40 ~ 200 мкм), капилляров и мелких вен головного мозга. В предпочтительном варианте реализации «церебральная микроангиопатия» проявляется в виде повреждения гематоэнцефалического барьера, и разрушение гематоэнцефалического барьера приводит к увеличению проницаемости, которое создает возможность попадания компонентов крови из сосудов в окружающие ткани и паренхиму головного мозга, что вызывает соответствующие патофизиологические изменения, приводящие к ассоциированной с ЦМА визуальной картине и патологическим изменениям. В конкретном варианте реализации «церебральная микроангиопатия» не включает геморрагический инсульт.

Термин «церебральное микрокровотечение» относится к кровотечению в участке головного мозга, диаметр которого составляет менее 1 см. Церебральные микрокровотечения могут быть обнаружены с помощью МРТ головного мозга (включая МРТ в режиме T2*ВИ-GRE) и могут представлять собой «бессимптомное церебральное микрокровотечение», при котором симптомы не проявляются, или могут быть ассоциированы с такими симптомами как транзиторные или постоянные очаговые двигательные или сенсорные нарушения, атаксия, афазия, дизартрия (то есть представлять собой «симптоматическое церебральное микрокровотечение»⁽¹⁰⁾). В некоторых вариантах реализации церебральное микрокровотечение проявляется в виде значительного увеличения области локализации внесосудистого свободного гемоглобина.

Термин «спонтанное церебральное микрокровотечение» в настоящем документе относится к внутримозговому кровотечению, вызванному спонтанным разрывом сосудов головного мозга (обычно вен или капилляров), произошедшим по различным причинам в условиях отсутствия травмы. Спонтанное церебральное кровотечение является многофакторным заболеванием, на которое влияют факторы окружающей среды и генетические факторы. Например, пожилой возраст тесно связан со спонтанным церебральным микрокровотечением (возрастное церебральное микрокровотечение). Спонтанное церебральное микрокровотечение, вызванное заболеванием, включает микрокровотечения, вызванные гипертонией (такой как длительная гипертония), ишемическим инсультом и геморрагическим инсультом, и указанные виды микрокровотечений в настоящем документе называются, соответственно, «гипертоническое церебральное микрокровотечение», «церебральное микрокровотечение, ассоциированное с ишемическим инсультом» и «церебральное микрокровотечение, ассоциированное с геморрагическим инсультом». Другие факторы окружающей среды или факторы наличия заболеваний также могут являться причинами церебрального микрокровотечения, и авторы настоящего изобретения ожидают, что настоящее изобретение может быть применено для лечения этих конкретно не указанных церебральных микрокровотечений.

Термин «церебральное микрокровотечение, связанное с приемом лекарственных средств» в настоящем документе относится к церебральному микрокровотечению, вызванному приемом лекарственных средств. Эти лекарственные средства могут включать, но не ограничиваются перечисленными, тромболитические средства, антикоагулянты, средства, препятствующие агглютинации тромбоцитов, или статины.

Наряду с широким применением тромболитической терапии, тромболитические средства также претерпели развитие от первого поколения до третьего поколения. Ранние тромболитические средства первого поколения представляют собой стрептокиназу (SK), урокиназу (UK), люмброкиназу, проурокиназу, стафилокиназу, ацилированный метоксибензоилом активирующий комплекс стрептокиназы и плазминогена и антитромботический фермент из змеиного яда. Тромболитическое средство второго поколения «Алтеплаза» представляет собой рекомбинантный активатор плазминогена тканевого типа (t-PA), который является первым в мире генно-инженерным рекомбинантным тромболитическим средством, разработанным и выведенным на рынок компанией Genentech в США. В настоящее время тромболитические средства претерпели развитие до третьего поколения. Типичным средством является "Ретеплаза", разработанная компанией Boehringer Mannheim GmbH в Германии в 1996 году. Ретеплаза представляет собой лекарственное средство на основе модифицированного белка. Она является мутантной формой рекомбинантного активатора плазминогена тканевого типа человека, которая содержит делецию и обладает такими преимуществами как длительный период полувыведения, сильный тромболитический эффект и незначительные побочные эффекты. Все тромболитические средства третьего поколения, находящиеся в стадии исследования и разработки, представляют собой варианты t-PA, такие как TNKase (тенеплаза, TNK-t-PA), монтеплаза, ланотеплаза (натеплаза, n-PA) и так далее. Общими характеристиками тромболитических средств третьего поколения являются способности быстро растворять тромбы, открывать закупоренные коронарные артерии и восстанавливать кровообращение, при этом частота излечения составляет от 73 % до 83 %.

Антикоагулянтные средства, также известные как антикоагулянты, применяют для предотвращения и лечения заболеваний, сопровождающихся внутрисосудистой эмболией или тромбозом, и для предотвращения инсульта или других тромботических заболеваний. Антикоагулянты, наиболее часто применяемые в клинической практике, включают: парентеральные антикоагулянты (такие как гепарин, эноксапарин, тиатарпарин (tiatarparin), ардепарин), кумариновые антикоагулянты (такие как варфарин, дикумарин, нитрат кумарина), антикоагулянты для применения in vitro (такие как цитрат натрия), ингибиторы тромбина (такие как гирудин, аргатробан).

Средства, препятствующие агглютинации тромбоцитов, можно разделить на четыре категории в зависимости от места действия и пути введения лекарственного средства: (1) ингибиторы циклооксигеназы (ингибиторы тромбоксана A2, салициловая кислота): широко используемым препаратом являются таблетки аспирина. (2) Ингибиторы фосфодиэстеразы, такие как цилостазол (Плетал), дипиридамол (Персантин) и так далее. Цилостазол (Плетал) ингибирует активность фосфодиэстеразы тромбоцитов и клеток гладкой мускулатуры сосудов, увеличивает концентрацию цАМФ в тромбоцитах и гладкой мускулатуре и более эффективно ингибирует тромбоциты, чем аспирин и тиклопидин (Тиклид), оказывает диссоциирующее действие на агрегаты тромбоцитов и является предпочтительным лекарственным средством при заболеваниях периферических сосудов. В клинической практике цилостазол применяют в основном для лечения местных заболеваний, таких как хронические окклюзионные артериальные язвы, боль и ощущение холода. Он применяется у пациентов с перемежающейся хромотой без сердечной недостаточности и может улучшить симптомы и увеличить расстояние, которое пациент способен преодолеть. Обычная доза дипиридамола (Персантина) для перорального введения может повышать частоту возникновения инфаркта миокарда, вызванного физической нагрузкой, у пациентов со стабильной стенокардией, поэтому в настоящее время его применение ограничено пациентами с инсультом и без ишемической болезни сердца в анамнезе. Дипиридамол не рекомендован пациентам с ишемической болезнью сердца. (3) Антагонисты рецептора АДФ (тиофенпиридины), такие как клопидогрел (Плавикс, Talcom), тиклопидин (Тиклид, Ticlop и так далее) и так далее. (4) Антагонисты гликопротеина IIb/IIIa тромбоцитов (антагонисты рецептора ГП IIb/IIIa), такие как как моноклональное антитело абциксимаб, пептидный ингибитор эптифибатид и непептидный ингибитор тирофибан и так далее.

Статины, также известные как ингибиторы редуктазы 3-гидрокси-3-метилглутарилкофермента A (ГМГ-КоA), могут значительно уменьшать содержание холестерина (ОХ), липопротеинов низкой плотности (Х-ЛПНП) и апоB (аполипопротеина) и в то же время уменьшать содержание триглицеридов (ТГ) и немного увеличивать содержание липопротеинов высокой плотности (Х-ЛПВП). Они подходят для лечения первичной гиперхолестеринемии и смешанной гиперлипидемии и в настоящее время являются очень важными лекарственными средствами для предотвращения и лечения гиперхолестеринемии и атеросклероза. Лекарственные средства первого поколения, представленные в настоящее время на рынке, включают ловастатин и симвастатин; лекарственные средства второго поколения включают правастатин и флувастатин; лекарственные средства третьего поколения включают аторвастатин, розувастатин и питавастатин.

Термин «травматическое церебральное микрокровотечение» в настоящем документе относится к внутримозговому микрокровотечению, вызванному травмой, такой как внутримозговое микрокровотечение, вызванное травмой вследствие оперативного вмешательства, умеренной травмой головного мозга (ТГМ) или хронической черепно-мозговой травмой. Термин «оперативное церебральное микрокровотечение» или «церебральное микрокровотечение, вызванное оперативным вмешательством» относится к внутримозговому микрокровотечению, вызванному оперативным вмешательством. В некоторых вариантах реализации оперативное вмешательство относится к оперативному вмешательству, непосредственно затрагивающему центральную нервную систему. В некоторых вариантах реализации оперативное вмешательство относится к клипированию или эмболизации аневризмы сосудов головного мозга или резекции опухоли головного мозга.

Соединение формулы I, или его дейтерированное соединение или фармацевтически приемлемая соль

Соединения, подходящие для способов или применений в соответствии с настоящим изобретением, включают соединение формулы I:

(I),

или его дейтерированное соединение или фармацевтически приемлемую соль, где R₁ представляет собой H, алкил или терминальный алкенил, содержащий от 1 до 5 атомов углерода, или -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂, которое в настоящем документе также упоминается как «соединение согласно настоящему изобретению». В одном варианте реализации R₁ представляет собой H, и соединение представляет собой 5α-андрост-3β,5,6β-триол (далее иногда сокращенно называемый «Триол»), имеющий структуру формулы II:

(II)

Было подтверждено, что Триол представляет собой нейропротекторный агент, эффективный против острого гипоксически-ишемического поражения головного мозга.

В одном варианте реализации R₁ представляет собой -CHCH₂CH₃, и соединение представляет собой 17-пропиленандрост-3β,5α,6β-триол. В одном варианте реализации R₁ представляет собой -CH(CH₃)₂, и соединение представляет собой 17-изопропиландрост-3β,5α,6β-триол. В одном варианте реализации R₁ представляет собой -CH(CH₂)₃CH₃, и соединение представляет собой 17-бутиландрост-3β,5α,6β-триол. В одном варианте реализации R₁ представляет собой -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂, и соединение представляет собой холестан-3β,5α,6β-триол.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены в форме фармацевтически приемлемых солей. Требуемые формы фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничиваются перечисленными, моно-, ди-, три- и тетрасоли. Фармацевтически приемлемые соли нетоксичны в том количестве и той концентрации, которые применяют для введения. Получение таких солей может упрощать применение в фармакологических целях за счет изменения физических свойств соединения без препятствования проявлению его физиологических эффектов. Полезные с точки зрения применения изменения физических свойств включают снижение температуры плавления для упрощения введения через слизистые оболочки и повышение растворимости для упрощения введения более высоких концентраций лекарственных средств.

Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли, такие как соли, содержащие сульфат, хлорид, гидрохлорид, фумарат, малеат, фосфат, сульфамат, ацетат, цитрат, лактат, тартрат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, циклогексилсульфамат и хинат. Фармацевтически приемлемые соли могут быть получены из кислот, таких как хлористоводородная кислота, малеиновая кислота, серная кислота, фосфорная кислота, сульфаминовая кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, молочная кислота, винная кислота, малоновая кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, циклогексилсульфаминовая кислота, фумаровая кислота и хинная кислота.

В случае наличия кислотных функциональных групп, таких как группы карбоновых кислот или фенольные группы, фармацевтически приемлемые соли также включают основно-аддитивные соли, такие как соли, содержащие бензатинпенициллин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этаноламин, трет-бутиламин, этилендиамин, меглумин, прокаин, алюминий, кальций, литий, магний, калий, натрий, аммоний, алкиламин и цинк. Такие соли можно получить с применением подходящих соответствующих оснований.

Фармацевтически приемлемые соли можно получить стандартными способами. Например, соединение в форме свободного основания можно растворить в подходящем растворителе, таком как водный раствор или водно-спиртовой раствор, содержащий подходящую кислоту, и затем раствор упаривают для выделения. В другом примере соль получают с помощью реакции свободного основания с кислотой в органическом растворителе.

Таким образом, например, если конкретное соединение представляет собой основание, целевая фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим способом, доступным в данной области техники, например путем обработки свободного основания неорганической кислотой, такой как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и тому подобное, или органической кислотой, такой как уксусная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, миндальная кислота, фумаровая кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, гликолевая кислота, салициловая кислота, кислота на основе пиранозида, такая как глюкуроновая кислота или галактуроновая кислота, α-гидроксикислота, такая как лимонная кислота или винная кислота, аминокислота, такая как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, ароматическая кислота, такая как бензойная кислота или коричная кислота, сульфоновая кислота, такая как п-толуолсульфоновая кислота или этансульфоновая кислота или тому подобное.

Аналогичным образом, если конкретное соединение представляет собой кислоту, целевая фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим способом, например путем обработки свободной кислоты неорганическим основанием или органическим основанием, таким как амин (первичный, вторичный или третичный амин), гидроксиды щелочных металлов или гидроксиды щелочноземельных металлов или тому подобное. Типичные примеры подходящих солей включают органические соли, полученные из аминокислот (таких как L-глицин, L-лизин и L-аргинин), аммиака, первичных, вторичных и третичных аминов и циклических аминов (таких как гидроксиэтилпирролидин, пиперидин, морфолин и пиперазин), и неорганические соли, полученные из натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития.

Фармацевтически приемлемые соли соединений могут существовать в виде комплексов. Примеры комплексов включают комплексы 8-хлортеофиллина (такие как, например, дименгидринат: комплекс (1:1) дифенгидрамина и 8-хлортеофиллина; Драмамин) и различные комплексы, содержащие циклодекстрин.

Настоящее изобретение также включает применение фармацевтически приемлемых дейтерированных соединений или других нерадиоактивных замещенных соединений. Дейтерирование представляет собой замещение одного или более или всех атомов водорода в активной группе молекулы лекарственного средства изотопом дейтерием. Поскольку он нетоксичен и нерадиоактивен и примерно в 6-9 раз более стабилен по сравнению со связью углерод-водород, он может закрыть сайт, подвергающийся метаболизации, и продлить период полувыведения лекарственного средства, что в результате позволяет уменьшить терапевтическую дозу без влияния на фармакологическую активность лекарственного средства, и, соответственно, дейтерирование считают превосходным способом модификации.

Фармацевтическая композиция

В другом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество соединения формулы I, или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель.

В настоящем изобретении «фармацевтическая композиция» относится к композиции, содержащей соединение формулы I и фармацевтически приемлемый носитель, где указанное соединение и фармацевтически приемлемый носитель присутствуют в композиции в форме смеси. В общем композиция будет применена для лечения субъекта-человека. Однако она также может быть применена для лечения аналогичных или тех же самых состояний у других животных-субъектов. В этом контексте термины «субъект», «животное-субъект» и аналогичные термины относятся к человеку и позвоночным, отличным от человека, таким как млекопитающие, такие как отличные от человека приматы, животные для спортивного и коммерческого применения, такие как лошади, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, грызуны и домашние животные (такие как собаки и кошки).

Подходящая лекарственная форма частично зависит от способа применения или пути введения, например она может быть предназначена для перорального, трансдермального, трансмукозального введения, введения посредством ингаляции или инъекции (парентерального введения). Такие лекарственные формы должны обеспечивать доставку соединения в клетки-мишени. Другие факторы хорошо известны в данной области техники и включают такие аспекты как токсичность и лекарственные формы, обеспечивающие отсроченное действие соединения или композиции.

Для получения композиции можно применять носители или вспомогательные вещества. Носители или вспомогательные вещества могут быть выбраны для упрощения введения соединения. Примеры носителей включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара (такие как лактоза, глюкоза или сахароза) или типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоль и физиологически совместимые растворители. Примеры физиологически совместимых растворителей включают растворы, содержащие стерильную воду для инъекций (ВДИ), солевые растворы и глюкозу.

Композицию или компоненты композиции можно вводить посредством различных путей, включая внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, пероральный, трансмукозальный, ректальный, трансдермальный или ингаляционный пути введения. В некоторых вариантах реализации предпочтительными являются инъекции или лиофилизированные порошки для инъекций. Для перорального введения, например, соединение может быть приготовлено в виде обычных пероральных лекарственных форм, таких как капсулы и таблетки, и жидких препаратов, таких как сиропы, эликсиры и концентрированные капли.

Фармацевтические препараты для перорального введения могут быть получены, например, путем объединения композиции или ее компонентов с твердыми вспомогательными веществами, необязательно, измельчения полученной смеси и обработки смеси частиц после добавления подходящих адъювантов (при необходимости) с получением таким образом таблеток или драже. Подходящие вспомогательные вещества представляют собой, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) и/или поливинилпирролидон (ПВП, повидон). При необходимости могут быть добавлены разрыхлители, такие как перекрестно-сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или их соли, такие как альгинат натрия.

В качестве альтернативы, можно использовать инъекции (парентеральное введение), например внутримышечную, внутривенную, внутрибрюшинную и/или подкожную инъекцию. Для введения посредством инъекции композицию согласно настоящему изобретению или ее компоненты готовят в виде стерильного жидкого раствора, предпочтительно в физиологически совместимом буфере или растворе, таком как солевой раствор, раствор Хэнка или раствор Рингера. Кроме того, композиция или ее компоненты могут быть приготовлены в виде твердой формы и повторно растворены или суспендированы непосредственно перед применением. Также они могут быть получены в виде лиофилизированного порошка.

Введение также можно осуществлять посредством трансмукозального, местного или трансдермального путей. Для трансмукозального, местного или трансдермального введения при получении состава применяют вещества, обеспечивающие проникновение, подходящие для подлежащего проникновению барьера. Такие вещества, обеспечивающие проникновение, в общем известны в данной области техники и включают, например, в случае трансмукозального введения соли желчных кислот и производные фузидовой кислоты. Кроме того, для стимулирования проникновения могут быть использованы детергенты. Трансмукозальное введение, например, может осуществляться с помощью назального спрея или суппозитория (через прямую кишку или влагалище).

Эффективное количество различных компонентов для введения может быть определено с применением стандартных процедур с учетом таких факторов как IC₅₀ соединения, биологический период полувыведения соединения, возраст, размер и масса тела субъекта и ассоциированные с субъектом состояния. Важность этих и других факторов хорошо известна специалистам в данной области техники. Как правило, доза будет составлять от примерно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг массы тела субъекта, подлежащего лечению, предпочтительно от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг. Могут быть использованы многократные дозы.

Композиция согласно настоящему изобретению или ее компоненты также могут быть применены в комбинации с другими терапевтическими агентами для лечения этого же заболевания. Такое комбинированное применение включает введение этих соединений и одного или более других терапевтических агентов в разные моменты времени или одновременное применение этих соединений и одного или более других терапевтических агентов. В некоторых вариантах реализации дозировка одного или более соединений согласно настоящему изобретению или других терапевтических агентов, применяемых в комбинации, может быть изменена с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, например доза может быть снижена по сравнению с той, в которой соединение или терапевтический агент применяют отдельно.

Следует понимать, что комбинированное применение или комбинация включает применение вместе с другими видами терапии, лекарственными средствами, медицинскими процедурами и так далее, при этом другие виды терапии или процедуры могут быть применены в момент времени, отличный от времени введения композиции согласно настоящему изобретению или ее компонентов (например, с коротким временным промежутком (таким как несколько часов, таким как 1, 2, 3, 4-24 часа) или с более длительным временным промежутком (таким как 1-2 дня, 2-4 дня, 4-7 дней, 1-4 недели)), или одновременно с композицией согласно настоящему изобретению или ее компонентами. Комбинированное применение также включает применение вместе с однократными или нечасто применяемыми видами терапии или медицинскими процедурами (такими как оперативное вмешательство), сопровождаемое введением композиции согласно настоящему изобретению или ее компонентов за короткий период времени или более длительный период времени до или после других видов терапии или процедур. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложена доставка композиции согласно настоящему изобретению или ее компонентов и одного или более других фармацевтических терапевтических агентов, и их доставку осуществляют посредством одного и того же или разных путей.

Комбинированное введение посредством любого из путей введения включает доставку композиции согласно настоящему изобретению или ее компонентов и одного или более других фармацевтических терапевтических агентов в виде любого состава посредством одного и того же пути введения, включая составы, в которых два соединения химически связаны друг с другом и при введении сохраняют свойственную им терапевтическую активность. В одном аспекте настоящего изобретения другое терапевтическое средство может быть введено совместно с композицией согласно настоящему изобретению или ее компонентами. Комбинированное применение путем совместного введения включает введение совместного состава или соединений, химически связанных друг с другом, или введение в течение короткого периода времени (например, в течение одного часа, в течение 2 часов, в течение 3 часов, не более 24 часов) двух или более соединений в виде отдельных составов, которые вводят посредством одного и того же или разных путей.

Совместное введение отдельных составов включает совместное введение путем доставки с помощью одного устройства, например одного и того же устройства для ингаляции, одного и того же шприца и так далее, или введение с помощью разных устройств в течение короткого периода времени друг относительно друга. Получение совместного состава соединения согласно настоящему изобретению и одного или более дополнительных фармакотерапевтических средств, доставка которых осуществляется посредством одного и того же пути введения, включает совместное приготовление веществ таким образом, что они могут быть введены с помощью одного устройства, включая объединение различных соединений в одном составе или модификацию соединений таким образом, что они становятся химически связанными друг с другом, но тем не менее сохраняют свою биологическую активность. Такие химически связанные друг с другом соединения могут содержать линкер, который разделяет два активных ингредиента, при этом линкер по существу сохраняется в организме или может разлагаться в организме.

Способ и применение

В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы I или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения церебральной микроангиопатии. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложено применение соединения формулы I или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли для лечения церебральной микроангиопатии. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения церебральной микроангиопатии у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества соединения формулы I, или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли, или описанной выше фармацевтической композиции.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ улучшения выведения свободного гемоглобина, локализованного вне сосудов головного мозга, у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества соединения формулы I, или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли, или описанной выше фармацевтической композиции. В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ выведения свободного гемоглобина, локализованного вне сосудов головного мозга, у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества соединения формулы I, или его дейтерированного соединения или фармацевтически приемлемой соли, или описанной выше фармацевтической композиции.

Примеры

Пример 1. Триол значительно снижает экспрессию воспалительных цитокинов, индуцируемую активацией микроглии под действием свободного гемоглобина

Методы

Иммунофлуоресцентная визуализация срезов тканей: Толщина парафиновых срезов составляла 5 мкм. В случае свежих парафиновых срезов их сушили при 37°C в течение ночи, а затем сушили при 55°C в течение 30 минут. Срезы быстро помещали в ксилол для депарафинизации. После полной депарафинизации в ксилоле 3 раза в течение 10 мин осуществляли градиентную регидратацию с использованием последовательно абсолютного этанола-95 % этанола-90 % этанола-80 % этанола-70 % этанола-50 % этанола-бидистиллированной воды (ddH₂O). После регидратации срезы помещали в раствор для восстановления антигенных свойств, содержащий ЭДТА, для высокотемпературного демаскирования антигенов с помощью микроволнового излучения. После завершения демаскирования срезы оставляли для самопроизвольного охлаждения до комнатной температуры. Инкубация с первичными антителами: воду вокруг ткани собирали с помощью впитывающей бумаги, образец обводили карандашом для иммуногистохимических исследований, добавляли первичное антитело, разбавленное раствором для разведения антител DAKO, и инкубировали во влажной камере при 4°C в течение ночи в темноте. После уравновешивания при комнатной температуре в течение 10 минут образец промывали ФСБТ (фосфатно-солевым буфером, содержащим твин) 3 раза по 5 минут. Добавляли вторичное антитело, конъюгированное с флуоресцентной меткой и имеющее специфичность к соответствующему виду, и затем инкубировали во влажной камере при комнатной температуре в темноте в течение 1 ч. Образец промывали 3 раза ФСБТ и окрашивали с помощью раствора для окрашивания ядер Hochest33342, разбавленного DAKO, при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут, после чего промывали ФСБТ 3 раза по 5 минут. Срезы заключали с помощью водорастворимых агентов для заключения, и далее получали изображения с помощью лазерного конфокального микроскопа. Методика визуализации посредством конфокальной микроскопии была такой же, как и методика проведения иммунофлуоресцентного анализа клеток. Анализ интенсивности флуоресценции на изображениях, полученных с помощью конфокального микроскопа, выполняли с использованием программного обеспечения NIS-Elements Analysis, и затем результаты нормализовали по интенсивности флуоресценции на единицу площади в соответствии со встроенной шкалой.

Иммуногистохимическое окрашивание ткани головного мозга яванских макаков: Эксперимент проводили в соответствии со стандартными иммуногистохимическими методиками следующим образом: толщина парафиновых срезов ткани префронтальной коры яванских макаков составляла 5 мкм, и свежие парафиновые срезы сушили в течение ночи при 37°C. Депарафинизация: парафиновые срезы сушили при 55°C в течение 30 минут и затем быстро помещали в ксилол для депарафинизации, для полной депарафинизации их помещали в ксилол 3 раза на 10 мин. Регидратация: градиентную регидратацию осуществляли посредством погружения последовательно в абсолютный этанол-95 % этанол-90 % этанол-80 % этанол-70 % этанол-50 % этанол-ddH₂O, каждый раз на 3 мин. После регидратации срезы помещали в раствор для восстановления антигенных свойств, содержащий ЭДТА, для высокотемпературного демаскирования антигенов с помощью микроволнового излучения в течение 30 мин. После завершения демаскирования срезы оставляли для самопроизвольного охлаждения до комнатной температуры. Инкубация с первичными антителами: воду вокруг ткани собирали с помощью впитывающей бумаги, образец обводили карандашом для иммуногистохимических исследований, добавляли первичное антитело, разбавленное раствором для разведения антител DAKO, и инкубировали во влажной камере при 4°C в течение ночи в темноте. После уравновешивания при комнатной температуре в течение 10 минут образец промывали ФСБТ 3 раза по 5 минут. Добавляли вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), разбавленное раствором для разведения антител DAKO, и инкубировали при комнатной температуре во влажной камере в течение 1 ч. Затем образец промывали 3 раза ФСБТ, после чего добавляли диаминобензидин (ДАБ) для проявки с помощью окрашенного субстрата, при этом следили за тем, чтобы время окрашивания каждого среза было одинаковым. Образец промывали 1 раз ФСБТ и подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином в течение 10 с. Срезы осторожно промывали проточной водой и затем промывали один раз ФСБ. Дегидратация: градиентную дегидратацию осуществляли посредством погружения последовательно в ddH₂O-50 % этанол-70 % этанол-80 % этанол-90 % этанол-95 % этанол-абсолютный этанол, каждый раз на 3 мин. Пермеабилизация: пермеабилизацию проводили с помощью ксилола 3 раза по 10 мин. Заключение: заключение осуществляли с помощью нейтральной смолы, разведенной в ксилоле. Через два часа агент для заключения затвердевал, и образец был готов к процедуре получения изображений. Визуализация: фотографии срезов в светлом поле получали с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Nikon ECLIPSE Ti-U путем подбора подходящей величины экспозиции и баланса белого для фона и сохранения настроенных параметров съемки для получения изображений срезов от каждой группы с использованием нескольких полей зрения и нескольких значений кратности увеличения.

Вестерн-блоттинг: 1) Подготовка образцов белка (см. инструкции к реагенту для получения белковых лизатов M-PER): после обработки клеток в течение заданного промежутка времени среду удаляли и затем клетки промывали предварительно охлажденным до 4°C ФСБ (0,01 M, pH 7,2 ~ 7,3) 3 раза. Добавляли 150-200 мкл реагента для получения белковых лизатов M-PER, смешанного с ингибитором протеаз (ФМСФ, 100X), и осуществляли лизис на льду в течение 10 минут для обеспечения полного разрушения клеток. После сбора лизата фрагменты клеток удаляли посредством центрифугирования при 4°C и 12000 об/мин в течение 15 минут. 2) Количественное определение белка с применением бицинхониновой кислоты (BCA) (см. инструкции к набору для количественного определения белка методом BCA): соответствующие компоненты добавляли в 96-луночный планшет для детекции в соотношении раствор реагента для количественного определения A:раствор B:ddH₂O:белок = 100:2:7,5:5, и добавляли стандартные растворы альбумина с равномерно увеличивающейся концентрацией для построения стандартной кривой. Каждый образец вносили в 3 лунки. После добавления образцов планшет осторожно перемешивали с помощью устройства типа «вортекс» и инкубировали в термостате при 37°C в течение 30 минут для завершения биуретовой реакции. После завершения реакции определяли величину поглощения в каждой лунке при длине волны 562 нм с помощью спектрофотометра для прочтения микропланшетов. Стандартную кривую для определения концентрации белка получали с использованием средних значений ОП для стандартных растворов, и коэффициент корреляции r² > 0,99 считали показателем достаточной степени линейности. После расчета концентрации белка в образцах от каждой группы с использованием стандартной кривой концентрацию в каждом образце корректировали путем добавления белкового лизата и 5X буфера для внесения проб в лунки геля таким образом, чтобы обеспечить одинаковую концентрацию во всех образцах. Осуществляли денатурацию белков до первичной структуры путем инкубации в кипящей воде при 100°C в течение 5 минут. Для перемещения образцов со стенки на дно пробирок их центрифугировали при 12000 g в течение 5 с. 3) Электрофорез в полиакриламидном геле: разделяющий гель с подходящей концентрацией готовили с учетом молекулярной массы целевого определяемого белка, и после затвердевания разделяющего геля готовили концентрирующий гель, со вставленной гребенкой во избежание пенообразования. После полного затвердевания концентрирующего геля наносили образцы белка и предокрашенный цветной маркер молекулярной массы, и проводили электрофорез при постоянном напряжении с использованием системы для электрофореза Bio-Rad. Электрофорез прекращали в момент отделения целевого белка, который устанавливали по маркеру молекулярной массы. 4) Перенос белков на мембрану (влажный перенос): вырезали фрагмент поливинилиденфторидной (ПВДФ) мембраны подходящего размера с защитным липким слоем и предварительно активировали в метаноле. Электрофоретический гель после вырезания помещали между ПВДФ мембраной и губчатой прокладкой с получением четырехслойной структуры типа «сэндвич», позволяющей избежать образования пузырьков воздуха. Мембрану и гель, заключенные между прокладками, помещали в камеру для электропереноса белков на мембрану и наливали внутрь предварительно охлажденный буфер для влажного переноса, и осуществляли электроперенос в условиях постоянного напряжения 100 В. Время переноса регулировали в соответствии с молекулярной массой целевого белка. 5) Блокирование: ПВДФ мембрану извлекали после завершения переноса, промывали раствором для промывки мембран TBST (солевым буферным раствором триса, содержащим твин) 3 раза по 5 мин. Готовили 5 % раствор сухого обезжиренного молока в TBST, и ПВДФ мембрану блокировали в 5 % растворе сухого обезжиренного молока при комнатной температуре в течение 1 часа. 6) Инкубация с антителами: после блокирования мембрану промывали 3 раза по 5 мин 5 % промывочным раствором TBST. Мембрану разрезали в соответствии с молекулярной массой целевого белка на несколько полос, которые помещали в емкость с ячейками. Добавляли соответствующие первичные антитела и инкубировали в течение ночи в шейкере при 4°C. После завершения инкубации с первичными антителами мембрану промывали 3 раза по 5 мин 5 % промывочным раствором TBST. Добавляли вторичные антитела против видов, из которых были получены соответствующие первичные антитела, помещали на низкоскоростной шейкер и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. 7) Экспозиция на пленку и проявка: мембрану промывали 3 раза по 5 мин 5 % промывочным раствором TBST. В кассету добавляли проявляющие растворы A и B в соотношении 1:1 и затем перемешивали. ПВДФ мембрану погружали в проявляющий раствор на 1 мин и затем экспонировали на пленке для блоттинга и проявляли с помощью системы для хемилюминесцентной детекции Bio-Rad, и анализировали полученные изображения с использованием программного обеспечения Image Lab.

Статистическая обработка: Результаты экспериментов выражали как среднее значение ± стандартное отклонение, а статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения SigmaPlot. p < 0,05 означает, что различие является статистически значимым. Другие специальные методы описаны в примечании.

Результаты

С помощью гипобарической камеры для моделирования острой гипобарической гипоксии, вызванной быстрым достижением плато, авторы настоящего изобретения имитировали подъем яванских макаков с высоты 320 метров над уровнем моря до высоты 7500 метров в течение 190 минут и дальнейшее пребывание яванских макаков на высоте 7500 метров в течение 48 часов, что являлось моделью быстрого достижения чрезвычайно большой высоты в экспериментальных условиях. По мере увеличения высоты у яванских макаков проявлялись заметные симптомы острой высотной болезни, такие как рвота, атаксия и спутанность сознания, что свидетельствовало об успешном воспроизведении модели острой высотной болезни у приматов, отличных от людей, представляющих собой яванских макаков. При проведении классических поведенческих, патологических и биохимических исследований было показано, что острая гипобарическая гипоксия приводила к значительному ухудшению координации скелетных мышц, изменению вакуолизации структуры ткани головного мозга, увеличению содержания воды в головном мозге, отеку сосудов головного мозга и дегенеративному поражению нейронов у яванских макаков, что указывало на то, что острая гипобарическая гипоксия вызывала значительное повреждение головного мозга.

С целью исследования способности гемоглобина вызывать поражение ткани головного мозга яванских макаков в условиях острой гипобарической гипоксии авторы настоящего изобретения осуществили иммунофлуоресцентное окрашивание ткани префронтальной коры головного мозга яванских макаков. Результаты показаны на фиг. 1. Область локализации внесосудистого свободного гемоглобина была значительно увеличена в группе с острой гипобарической гипоксией по сравнению с группой с нормобарической нормоксией (фиг. 1A), тогда как в группе, получавшей Триол, эта область была значительно меньше (фиг. 1B). Иммуногистохимическая детекция маркера активации микроглии Iba-1 (связывающей ионизированный кальций адаптерной молекулы 1) в префронтальной коре головного мозга яванских макаков показала, что острая гипобарическая гипоксия вызывала увеличение количества микроглиальных филаментов или ламеллярных псевдоподий, что соответствовало морфологическим изменениям, характерным для состояния активации, и повышение экспрессии Iba-1 (фиг. 2A), тогда как в группе, получавшей Триол, количество клеток с характерной для состояния активации морфологией уменьшалось, а экспрессия Iba-1 значительно снижалась (фиг. 2B). Далее исследовали влияние острой гипобарической гипоксии на экспрессию предшественников и зрелых форм воспалительных цитокинов ИЛ-6 (интерлейкина 6), ФНО-α (фактора некроза опухоли альфа) и ИЛ-1β (интерлейкина 1 бета) в ткани префронтальной коры головного мозга яванских макаков с использованием вестерн-блоттинга. Результаты показали, что введение в состояние острой гипобарической гипоксии вызывало значительное повышение экспрессии этих факторов воспаления, при этом Триол значительно снижал уровни экспрессии этих воспалительных цитокинов (фиг. 3A и 3B).

Пример 2. Триол значительно восстанавливает выведение гемоглобина в ткани головного мозга

CD163 представляет собой один из молекулярных маркеров макрофагов M2 и обладает противовоспалительной активностью. Его функция заключается в участии во внутриклеточном выведении молекул гемоглобина, и он выступает в качестве единственного скэвенджер-рецептора гемоглобина у млекопитающих. Комплекс гемоглобина и гаптоглобина подвергается CD163-опосредованному фагоцитозу в макрофагах/микроглии, а затем транспортируется через эндосомы в лизосомы для деградации с образованием гема, который далее расщепляется под действием HO-1 с образованием Fe²⁺, CO и биливердина, а Fe²⁺ и биливердин далее окисляются до Fe³⁺ и билирубина.

С целью исследования влияния гипобарической гипоксии на выведение гемоглобина авторы настоящего изобретения в первую очередь выполнили анализ экспрессии CD163 и подлежащего регуляции CD163 ключевого фермента HO-1, лимитирующего скорость деградации гема, в ткани префронтальной коры головного мозга яванских макаков. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что острая гипобарическая гипоксия вызывала значительное снижение экспрессии CD163 (фиг. 4A и 4B), которая могла быть в значительной степени восстановлена путем введения Триола. В подтверждение литературных данных, гемоксигеназа HO-1 демонстрировала повышающую регуляцию под действием стресса, вызванного гипобарической гипоксией, и в этом эксперименте введение Триола дополнительно приводило к повышению экспрессии HO-1.

Для дальнейшего анализа взаимосвязи между изменением экспрессии CD163 и изменением экспрессии маркера активации микроглии Iba1 осуществляли иммунофлуоресцентное окрашивание ткани префронтальной коры головного мозга яванских макаков. Острая гипобарическая гипоксия вызывала значительное снижение экспрессии CD163 (фиг. 5A и 5B), сопровождающееся повышением экспрессии Iba1; и когда сниженная экспрессия CD163 была в значительной степени восстановлена путем введения Триола, это сопровождалось снижением экспрессии Iba1; а контрольный препарат прогестерон не устранял вызванное гипоксией подавление экспрессии CD163, при этом экспрессия Iba1 повышалась.

Приведенные выше результаты показывают, что CD163 и Iba1 характеризуются противоположными профилями экспрессии, и это убедительно указывает на то, что свободный гемоглобин является фактором, индуцирующим воспаление в микроглии при повреждении головного мозга, вызванном острой гипобарической гипоксией, и гипоксия существенно ингибирует CD163-опосредованное выведение гемоглобина.

Пример 3. Триол ослабляет воспалительную активацию микроглии BV2 за счет улучшения выведения гемоглобина

Методы

Культивирование клеток: Клетки микроглии BV2 восстанавливали из стока и культивировали в среде DMEM, содержащей 10 % ФБС. По достижении плотности клеток примерно 80 % проводили субкультивирование и посев клеток. Плотность посева клеток составляла примерно 4,0-5,0 × 10⁵/мл.

Обработка клеток, вызывающая гипоксию: После запуска программы для обработки клеток на станции для моделирования состояния гипоксии устанавливали параметры газового состава на величины 1 % кислорода и 5 % углекислого газа. Исследование можно было начинать после стерилизации ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут по достижении стабильной концентрации газов. Перед обработкой, вызывающей гипоксию, культуральную среду заменяли на свежую и затем культуральную чашку или планшет для конфокальной микроскопии помещали в станцию для моделирования состояния гипоксии. В обозначенные моменты времени после начала обработки культуральную чашку быстро вынимали и осуществляли фиксацию клеток или получение белкового лизата.

Обработка гемоглобином: Готовили стоковый раствор 10 мМ свободного гемоглобина в стерильной воде, хранили при 4°C, разбавляли культуральной средой и добавляли в культуральную чашку для получения определенной конечной концентрации. При совместной стимуляции под действием 20 мкМ гемоглобина и гипоксии клетки сначала стимулировали свободным гемоглобином и затем культуральную чашку немедленно помещали в станцию для моделирования состояния гипоксии для проведения обработки, вызывающей гипоксию.

Иммунофлуоресцентная визуализация клеток: Клетки высевали в специальную чашку для лазерной конфокальной микроскопии, после прикрепления клеток культуральную среду заменяли на свежую среду, содержащую сыворотку, и затем клетки стимулировали с помощью соответствующего способа стимуляции гемоглобином, обработки, вызывающей гипоксию, или совместной обработки с последующей фиксацией. В первую очередь удаляли среду, клетки промывали 3 раза 0,3 % ФСБТ, затем для фиксации клеток добавляли 4 % параформальдегид на 20 мин. Далее клетки промывали 3 раза 0,3 % ФСБТ и подвергали перфорации с помощью Тритона X-100 в течение 15 минут. Затем клетки промывали 3 раза 0,3 % ФСБТ, соответствующее первичное антитело разбавляли раствором для разведения антител DAKO и перемешивали и затем добавляли к клеткам, после чего помещали их в закрытую влажную камеру и инкубировали в течение ночи на шейкере при 4°C. После уравновешивания при комнатной температуре клетки промывали 3 раза 0,3 % ФСБТ. Вторичное антитело, конъюгированное с флуоресцентной меткой, разбавляли до определенной концентрации раствором для разведения антител DAKO и затем добавляли к образцу, после чего помещали образец во влажную камеру в темноте и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Промывали 3 раза 0,3 % ФСБТ, раствор для окрашивания ядер Hochest33342 разбавляли раствором для разведения антител DAKO, перемешивали и добавляли к образцу, после чего помещали образец во влажную камеру в темноте и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации образец промывали один раз ФСБ и добавляли 300 мкл ФСБ, и образец был готов к процедуре получения изображений. Изображения получали с использованием конфокального микроскопа Nikon A1. После запуска программы регулировали интенсивность излучения лазера и время экспозиции для каждого канала и затем сохраняли параметры съемки для получения фотографий образцов от каждой группы. Анализ интенсивности флуоресценции на изображениях, полученных с помощью конфокального микроскопа, выполняли с использованием программного обеспечения NIS-Elements Analysis, и значения интенсивности флуоресценции на одну клетку нормализовали по количеству клеток.

Вестерн-блоттинг: Так же, как в примере 1.

Амплификация методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени (кОТ-ПЦР): 1) Экстракция общей РНК: следовали инструкциям по применению реагента для экстракции Тризола (Trizol). В обозначенный момент времени после начала обработки клеток среду удаляли и клетки дважды промывали ФСБ. Добавляли 1 мл Тризола для пипетирования подвергаемых лизису клеток (количества указанных ниже реагентов рассчитаны на 1 мл Тризола). Добавляли 200 мкл хлороформа, интенсивно перемешивали вручную, затем инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Центрифугировали при 12000 g при 4°C в течение 15 минут и переносили 400 мкл верхней водной фазы в новую пробирку, добавляли 400 мкл изопропилового спирта, осторожно перемешивали вручную и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Центрифугировали при 12000 g при 4°C в течение 10 минут и удаляли супернатант. Добавляли 500 мкл предварительно охлажденного 75 % этанола, после чего центрифугировали при 7500 g при 4°C в течение 10 мин и осторожно удаляли супернатант. После высушивания на воздухе осадок РНК растворяли путем добавления необходимого количества воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC). 2) Количественное определение РНК: количественное определение РНК выполняли с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 в режиме определения концентрации нуклеиновых кислот, и определяли отношение ОП при длинах волн 260/280 нм, при этом значение указанного отношения в диапазоне 1,8-2,0 считали показателем хорошего качества выделенного материала. 3) Реакция обратной транскрипции: общее количество РНК в каждой реакционной смеси составляло 2 мкг, объем раствора олиго dT составлял 1 мкл, и объем реакционной смеси доводили до 13 мкл с помощью воды, обработанной DEPC. После центрифугирования и перемешивания реакционную смесь помещали в термостат с температурой 65 °C и проводили предварительную денатурацию в течение 5 мин. После денатурации смесь немедленно помещали на лед, добавляли 4 мкл буфера для реакции обратной транскрипции, 2 мкл смеси 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов (dNTP), 1 мкл раствора обратной транскриптазы. После центрифугирования и перемешивания проводили реакцию обратной транскрипции. Для реакции обратной транскрипции использовали следующие условия: 42°C, 60 мин - 70°C, 10 мин - 4°C. 4) Параметры реакции амплификации методом кПЦР: реакционная смесь для амплификации методом кПЦР представляла собой: 5 мкл готовой смеси для ПЦР с красителем SYBR Green, 1 мкл кДНК, 2 мкл праймера, 2 мкл ddH₂O, не содержащей РНКаз. Параметры цикла были следующими: стадия первичной денатурации: 95°C, 15 мин; стадия циклов амплификации (40 циклов): 95°C, 10 с-56°C, 20 с-72°C, 30 с; стадия построения кривых плавления: 95°C, 15 с-60°C, 60 с-95°C, 15 с-60°C, 60 с. 5) Обработка данных: анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения для системы быстрого ПЦР в режиме реального времени Applied Biosystem 7500 fast real-time PCR версии 2.0.5, и относительную экспрессию генов количественно определяли с использованием формулы RQ = 2^-ΔΔCt.

Результаты

Для изучения способности свободного гемоглобина непосредственно вызывать активацию микроглии в первую очередь использовали гемоглобин для стимуляции микроглии с целью наблюдения изменений показателей ее активации. Результаты экспериментов по стимуляции микроглии BV2 под действием свободного гемоглобина in vitro в течение различных периодов времени показали, что через 24 часа клетки BV2 демонстрировали характерную для состояния активации морфологию, представленную в виде увеличения размера тела клетки и увеличения и разрастания нитевидных псевдоподий (фиг. 6A и 6C). В то же время экспрессия молекулярных маркеров активации микроглии Iba-1 (фиг. 6D) и CD11b (фиг. 6B и 6E) также значительно повышалась в результате стимуляции под действием свободного гемоглобина (фиг. 6B и 6D). Описанные выше результаты иммунофлуоресцентной визуализации в ткани головного мозга яванских макаков были дополнительно подтверждены в экспериментах с применением вестерн-блоттинга (фиг. 6E). В соответствии с этими наблюдениями, стимуляция под действием свободного гемоглобина приводила к значительному повышению экспрессии уровней мРНК воспалительных цитокинов микроглии ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 (как показано на фиг. 6F), что указывало на то, что свободный гемоглобин вызывал воспалительную активацию клеток микроглии.

Для анализа влияния гипоксии на активацию микроглии, опосредованную свободным гемоглобином, микроглию непосредственно стимулировали свободным гемоглобином и в то же время клетки подвергали обработке, вызывающей гипоксию, при которой содержание кислорода составляло 1 %. Было обнаружено, что гипоксия усиливала увеличение содержания белков микроглиальных воспалительных цитокинов, вызванное присутствием свободного гемоглобина. Эти факторы воспаления включали ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6, но гипоксия не оказывала значительного влияния на противовоспалительный цитокин ИЛ-4 (фиг. 6G). Эти результаты показывают, что гипоксия может усиливать активацию микроглии, вызванную присутствием свободного гемоглобина.

Было обнаружено, что в микроглии ткани мозга яванских макаков Триол повышал экспрессию скэвенджер-рецептора гемоглобина CD163 и подлежащей регуляции CD163 молекулы HO-1. Далее для подавления экспрессии CD163 в клеточной модели in vitro применяли РНК-интерференцию. После обработки, вызывающей гипоксию, и активации микроглии посредством стимуляции гемоглобином был проведен анализ для установления того, может ли РНК-интерференция, нацеленная на CD163, устранять ингибирующее действие Триола в отношении активации микроглии. На фиг. 7 показано, что подавление экспрессии CD163 с помощью РНК-интерференции устраняло ингибирующее действие Триола в отношении повышения экспрессии Iba-1 и CD11b в клетках микроглии, активированных гипоксией и гемоглобином, а экспрессия Iba-1 и CD11b вновь повышалась, что указывало на то, что Триол предотвращал воспалительную активацию микроглии за счет улучшения CD163-опосредованного выведения свободного гемоглобина с участием клеток.

Таким образом, свободный гемоглобин вызывает активацию микроглии, а Триол уменьшает активацию микроглии, вызванную присутствием свободного гемоглобина, за счет восстановления экспрессии скэвенджер-рецептора CD163.

Ссылки

1. Expert Consensus Group for Diagnosis and Treatment of Cerebral Small Vessel Diseases. Expert Consensus for Diagnosis and Treatment of Cerebral Small Vessel Diseases, Chinese Clinicians, Vol. 42, No. 1, 2014: 84-87.

2. Zhu Yicheng. Important issues in clinical research of cerebral small vessel diseases, Chinese Journal of Stroke, December 2015, Vol. 10 No. 12: 996-999.

3. Wardlaw JM,Smith C,Dichgans M. Mechanisms of sporadic cerebral small vessel disease: insights from neuroimaging. Lancet Neurol,2013,12 :483-497.

4. Li Feng, Tan Shouwen, Li Ying, Xu Chitian. Blood-brain barrier integrity and cerebral small vessel disease, International Journal of Cerebrovascular Diseases, 2017,25(3): 239-243.

5. Zhang Zhijie, Yang Wanyong, Xu Anding. Cerebral microbleeds. Chinese Journal of Internal Medicine. 2015;54(4):371-4.

6. Clarke, C. (2006). Acute mountain sickness: medical problems associated with acute and subacute exposure to hypobaric hypoxia. Postgraduate medical journal 82, 748-753.

7. Wilson, M.H., Newman, S., and Imray, C.H. (2009). The cerebral effects of ascent to high altitudes. The Lancet Neurology 8, 175-191.

8. Willmann, G., Fischer, M.D., Schatz, A., Schommer, K., and Gekeler, F. (2013). Retinal vessel leakage at high altitude. Jama 309, 2210-2212.

9. Yuan Qiang, Use value of MRI magnetic sensitivity weighted imaging in cerebral microbleeds in chronic high altitude disease, 2015, Master's thesis of Imaging Medicine and Nuclear Medicine of Qinghai University.

10. Greenberg SM, Vernooij MW, Cordonnier C, et al. Cerebralmicrobleeds: a guide to detection and interpretation. Lancet Neurol.2009;8:165-74.

Claims

1. Применение соединения формулы I:

(I),

или его дейтерированного соединения, или фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения церебральной микроангиопатии у пациента,

причем церебральная микроангиопатия представляет собой церебральное микрокровотечение, и

при этом R₁ представляет собой H, алкил или терминальный алкенил, содержащий от 1 до 5 атомов углерода, или -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

2. Применение по п. 1, где R₁ представляет собой H.

3. Применение по п. 1, где R₁ выбран из группы, состоящей из -CHCH₂CH₃, -CH(CH₃)₂, -CH(CH₂)₃CH₃ и -CH(CH₃)(CH₂)₃CH(CH₃)₂.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где церебральное микрокровотечение представляет собой спонтанное церебральное микрокровотечение, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом лекарственных средств, или травматическое церебральное микрокровотечение.

5. Применение по п. 4, где спонтанное церебральное микрокровотечение представляет собой возрастное церебральное микрокровотечение, гипертоническое церебральное микрокровотечение, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с острой высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с хронической высотной болезнью, церебральное микрокровотечение, ассоциированное с ишемическим инсультом, или церебральное микрокровотечение, ассоциированное с геморрагическим инсультом.

6. Применение по п. 4, где церебральное микрокровотечение, связанное с приемом лекарственных средств, представляет собой церебральное микрокровотечение, связанное с приемом тромболитических средств, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом антикоагулянтов, церебральное микрокровотечение, связанное с приемом средств, препятствующих агрегации тромбоцитов, или церебральное микрокровотечение, связанное с приемом статинов.

7. Применение по п. 4, где травматическое церебральное микрокровотечение представляет собой церебральное микрокровотечение, вызванное оперативным вмешательством.

8. Применение по п. 7, где оперативное вмешательство представляет собой оперативное вмешательство, непосредственно затрагивающее центральную нервную систему.

9. Применение по п. 7, где оперативное вмешательство представляет собой клипирование или эмболизацию аневризмы сосудов головного мозга или резекцию опухоли головного мозга.

10. Применение по любому из пп. 1-3, где церебральная микроангиопатия является бессимптомной.

11. Применение по любому из пп. 1-3, где церебральная микроангиопатия сопровождается симптомами.

12. Применение по любому из пп. 1-3, где пациент представляет собой человека.

13. Применение по любому из пп. 1-3, где церебральная микроангиопатия проявляется в виде значительного увеличения области локализации свободного гемоглобина вне сосудов головного мозга.