KR102466251B1 - 뇌소혈관 질환 치료용 약물 제조에서의 화합물의 응용 - Google Patents

뇌소혈관 질환 치료용 약물 제조에서의 화합물의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 5α-안드로스트-3β,5,6β트리올 및 이의 유사체, 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 환자의 뇌소혈관 질환 치료용 약물 제조에서의의 응용을 공개한다. 상기 뇌소혈관 질환은 바람직하게는 뇌 미세 출혈이다. 상기 뇌 미세 출혈은 자발성 뇌 미세 출혈, 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 외상성 뇌 미세 출혈이다. 본 발명은 이러한 화합물이 혈관 외부의 헤모글로빈의 제거를 현저히 증가함으로써 뇌소혈관 질환 치료에 사용될 수 있음을 증명한다.

Description

뇌소혈관 질환 치료용 약물 제조에서의 화합물의 응용
본 발명은 5α-안드로스트-3β,5,6β트리올(5α-androst-3β,5,6β-triol, "Triol")및 이의 유사체의 의약적 새로운 용도에 관한 것으로 구체적으로 뇌소혈관 질환 치료에서의 이러한 화합물의 응용에 관한 것이다.
뇌소혈관은 뇌의 작은 천공 동맥 및 소동맥(직경40 ~200μm), 모세 혈관 및 소정맥을 지칭하고 이들은 뇌 조직에 혈액을 공급하는 기본 단위를 구성하며 뇌 기능의 유지에 중요한 작용을 한다(1). 뇌의 크고 작은 혈관이 공통으로 뇌혈관 수상구조(vascular tree)를 구성하고 이들은 구조적으로 연속되어 공통으로 혈역학의 영향을 받으며 공통으로 위험 요소에 노출되므로 뇌의 크고 작은 혈관 질환은 이론적으로 심각한 평행 관련성을 가져야 한다. 하지만 임상 작업에서 흔히 양자의 불일치성이 발견되고 예컨대 심각한 뇌소혈관 병변이 있지만 뇌의 대동맥 협착증으로 합병되지 않는 환자가 종종 발견되며 그 반대도 마찬가지이다(2).
뇌소혈관 질환(cerebral small vessel disease, CSVD)은 상기 소혈관의 다양한 병변으로 인한 임상적, 인지적, 영상학적 및 병리적 표현의 증후군을 지칭한 것으로(3), 습관적으로는 작은 천공 동맥 및 소동맥 병변으로 인한 임상적 및 영상학적 표현이다. CSVD는 주로 졸중(심부 소경색, 뇌출혈), 인지, 정서 장애 및 전체적인 기능 저하가 돌출한 임상적 표현이고 영상학적으로 열공성 경색(lacunar infarction, LI), 열공(lacune), 뇌백질 병변(white matter lesions, WML), 혈관 주위 간극 확장(enlarged perivascular space, EPVS) 및 뇌 미세 출혈(cerebral microbleeds, CMB) 등으로 돌출하게 표현된다(1).
CSVD의 구체적인 발병 메커니즘은 혈관 내피 기능 장애, 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB) 손상, 염증 메커니즘, 유전적 요소, 허혈성 저관류 손상과 관련되는데 여기서 BBB 손상은 핵심 메커니즘이다. BBB 손상 및 파괴는 투과성을 증가시키고 혈액 성분은 혈관 주위의 조직 및 뇌실질으로 유출되어 상응한 병리 생리학적 변화를 초래하여 CSVD와 관련된 영상학 및 병리학적 변화를 일으킨다(4).
뇌 미세 출혈은 뇌소혈관 질환 표현의 일종으로 뇌의 미세 소혈관 병변으로 인한 뇌실질 전임상 손상이고 미량 혈액 유출을 특징으로 하고 적혈구가 혈관 외부로 유출되어 헤모시데린 함유 영상을 발생할 수 있으며 병변의 진행에 따라 혈관 주위에 신선한 적혈구가 보이거나 또는 헤모시데린 함유 과립이 침적되거나 또는 헤모시데린 함유 대식세포가 포집될 수 있다.
CMB는 T2* 가중 서열(또는 자화율에 민감한 다른 서열)에서 작은 영역 신호가 결실된 병소로 표현되고 병소 주위는 블루밍이 있다. 병소의 직경은 일반적으로 2~5 mm이고 ??대 10 mm이다(5). MRI영상에서 이러한 병소를 "신호 음성(signal void)", "감수성 아티팩트(susceptibility artifact)", "블랙홀(black hole)”, "도트(dot)”, “미세 출혈(microbleed)”, "낡은 미세 출혈(old microbleed, OMB)”, "다병소성 신호 결실 손상(multifocal signal loss lesion)” 또는 "미세 출혈(microhemorrhage, MH)”이라 지칭한다. 이는 통상적으로 피질과 피질의 아래 경계의 영역, 피질 심부의 회백질핵, 대뇌 반구의 백질, 뇌간 및 소뇌에 분포된다. 자화강조영상 서열(SWI)이 CMBs에 대한 민감율은 T2*W-GRE서열보다 높다.
CMB는 대부분 무증상으로 간주되고 급성 임상 표현이 없다. 연구에 따르면ㅍ뇌 미세 출혈은 연령, 심혈관 위험 요소, 뇌백질 변성, 뇌졸중, 졸중 후 정서 장애와 일정한 관계가 있다. 이 밖에, 뇌 미세 출혈은 또한 급성 및 만성 고산병의 뇌 손상의 중요한 병리학적 원인이고(6) 고산병 환자 부검 또는 고소 뇌부종 생존자의 MRI영상학 검사에서 뇌조직(7) 또는 시망막(8)에 미세 출혈 현상이 존재하는 것이 발견되었다. MRI 자화강조영상(Susceptibilit1y weighted imaging,SWI)을 사용하여 만성 고산병 환자(Chronic mountain sickness, CMS)의 뇌 미세 출혈에 대하여 검사를 진행한 결과 확진된 20명의 CMS 환자 중 11명이 뇌 미세 출혈(55%)로 검출되고 CMS군에서 뇌 미세 출혈의 양성률은 정상인보다 현저히 높았다(9).
혈전 용해 약물(예컨대 조직 플라스미노겐 활성제(Tissue plasminogen activator, t-PA), 스트렙토키나제(Streptokinase, SK)), 항응고 약물(예컨대 와파린), 항혈소판 약물(예컨대 아스피린)은 항혈전 치료에서 광범위하게 사용되어 약물 관련 원발성 뇌출혈(ICH)의 발생률을 현저히 증가시킨다. 연구에 따르면 와파린 관련 ICH 환자를 자발성 ICH 환자와 비교하면 CMB는 전자에서 더 흔히 볼 수 있다. 현재 연구에 따르면 CMB는 항응고 약물과 관련된 출혈 위험 증가와 관련이 있다. 아스피린 관련 ICH의 위험은 CMB 병소의 개수의 증가에 따라 증가된다. 메타 분석에 따르면, 아스피린 복용자와 비복용자를 비교하면 CMB와 ICH는 관련성(OR=1.7)이 있다. 또 다른 연구에 따르면 고용량의 스타틴계 약물(예컨대 아토르바스타틴)을 복용하는 뇌졸중 환자의 ICH의 발생률은 약간 증가한 것으로 나타났다. 스타틴계 복용자의 뇌엽 CMB의 발생률은 약 비스타틴계 복용자의 2배이고 다른 부위의 CMB의 두 개의 군은 현저한 차이가 없으며 스타틴계 약물이 뇌아밀로이드 혈관 질환 환자의 출혈 위험을 증가시킬 수 있음을 사시한다.
외과 수술은 또한 중추 신경계의 손상을 일으킬 수 있는데 중추 신경계(뇌 및 척삭을 포함함)에서 수행되는 외과 수술이 신경 조직에 대한 직접적인 손상 및 수술 과정에서의 혈액 공급, 출혈 등 변화로 인한 조직 부종, 출혈, 미세 출혈, 경색 및 미세 경색을 포함하는 신경계의 조직 병리를 지칭한다. 중추 신경계 손상을 유발하는 일반적인 수술은 뇌동맥류 클리핑 또는 폐색술, 뇌종양 절제술 및 중추 신경계와 직접 관련된 수술을 포함한다.
그러나 현재 임상에서 뇌 미세 출혈 치료를 위한 효과적인 약물이 여전히 부족하다. 뇌 미세 출혈을 완화시키거나 제거하는 약물을 제공하는 것은 중요한 임상적 의미가 있다.
본 발명은 뇌조직이 유리 헤모글로빈을 제거하는 능력을 향상시키는 식I의 화합물에 대한 발명자의 발견에 기초하여 뇌소혈관 질환을 치료하는 식I 화합물의 새로운 용도를 제공한다.
Figure 112020077242323-pct00001
(식I)
여기서 R1은 H, 1개 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 말단 알케닐기 또는 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이다.
따라서, 본 발명은 한편으로 뇌소혈관 질환 치료용 약물 제조에서의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 응용을 제공하는데,
Figure 112020077242323-pct00002
(식I)
여기서 R1은 H, 1개 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 말단 알케닐기 또는 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이다.
하나의 실시형태에서 R1은 바람직하게는 H이고 즉 상기 화합물은 5α-안드로스트-3β,5,6β-트리올(5α-androst-3β,5,6β-triol, 이하 때로는 “Triol”로 약칭함)이다. 하나의 실시형태에서 R1은 -CHCH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)3CH3 및 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 상기 뇌소혈관 질환은 바람직하게는 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 뇌 미세 출혈은 자발성 뇌 미세 출혈, 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 외상성 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 자발성 뇌 미세 출혈은 연령 관련 뇌 미세 출혈, 고혈압 뇌 미세 출혈, 급성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 만성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 허혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈 또는 출혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 약물 관련 뇌 미세 출혈은 혈전 용해성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항응고성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항혈소판 응집 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 스타틴계 약물 관련 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 외상성 뇌 미세 출혈은 수술로 인한 뇌 미세 출혈이다.
본 발명은 다른 한편으로 환자의 뇌 미세 출혈을 치료하는 방법을 제공하는데 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하고,
Figure 112020077242323-pct00003
(식I)
여기서 R1은 H, 1개 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 말단 알케닐기 또는 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이다.
하나의 실시형태에서 R1은 바람직하게는 H이다. 하나의 실시형태에서 R1은 -CHCH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)3CH3 및 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 상기 환자의 뇌 미세 출혈은 MRI에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서 상기 환자는 자발성 뇌 미세 출혈, 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 외상성 뇌 미세 출혈을 앓고 있다. 일부 실시형태에서 상기 자발성 뇌 미세 출혈은 연령 관련 뇌 미세 출혈, 고혈압 뇌 미세 출혈, 급성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 만성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 허혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈 또는 출혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 약물 관련 뇌 미세 출혈은 혈전 용해성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항응고성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항혈소판 응집 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 스타틴계 약물 관련 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 외상성 뇌 미세 출혈은 수술로 인한 뇌 미세 출혈이다.
본 발명은 또 다른 한편으로 환자의 뇌 미세 출혈의 치료에 사용되는 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는데,
Figure 112020077242323-pct00004
(식I),
여기서 R1은 H, 1개 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 말단 알케닐기 또는 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이다.
하나의 실시형태에서 R1은 바람직하게는 H이다. 하나의 실시형태에서 R1은 -CHCH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)3CH3 및 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 상기 환자의 뇌 미세 출혈은 MRI에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서 상기 환자는 자발성 뇌 미세 출혈, 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 외상성 뇌 미세 출혈을 앓고 있다. 일부 실시형태에서 상기 자발성 뇌 미세 출혈은 연령 관련 뇌 미세 출혈, 고혈압 뇌 미세 출혈, 급성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 만성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 허혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈 또는 출혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 약물 관련 뇌 미세 출혈은 혈전 용해성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항응고성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항혈소판 응집 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 스타틴계 약물 관련 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 외상성 뇌 미세 출혈은 수술로 인한 뇌 미세 출혈이다.
본 발명은 또 다른 한편으로 환자의 뇌혈관 외부의 유리 헤모글로빈의 제거를 증가시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하고,
Figure 112020077242323-pct00005
(식I),
여기서 R1은 H, 1개 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 말단 알케닐기 또는 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이다.
하나의 실시형태에서 R1은 바람직하게는 H이다. 하나의 실시형태에서 R1은 -CHCH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)3CH3 및 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2로부터 선택된다.
본 발명은 또 다른 한편으로 환자의 뇌혈관 외부의 유리 헤모글로빈을 제거하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하고,
Figure 112020077242323-pct00006
(식I),
여기서 R1은 H, 1개 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 말단 알케닐기 또는 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이다.
하나의 실시형태에서 R1은 바람직하게는 H이다. 하나의 실시형태에서 R1은 -CHCH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)3CH3 및 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2로부터 선택된다.
상기 유리 헤모글로빈은 자발성 뇌 미세 출혈, 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 외상성 뇌 미세 출혈로 야기된 것이다. 일부 실시형태에서 상기 자발성 뇌 미세 출혈은 연령 관련 뇌 미세 출혈, 고혈압 뇌 미세 출혈, 급성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 만성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 허혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈 또는 출혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 약물 관련 뇌 미세 출혈은 혈전 용해성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항응고성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항혈소판 응집 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 스타틴계 약물 관련 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 외상성 뇌 미세 출혈은 수술로 인한 뇌 미세 출혈이다.
본 발명은 또 다른 한편으로 환자의 뇌소혈관 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하되,
Figure 112020077242323-pct00007
(식I),
여기서 R1은 H, 1개 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 말단 알케닐기 또는 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이다.
하나의 실시형태에서 R1은 바람직하게는 H이다. 하나의 실시형태에서 R1은 -CHCH2CH3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)3CH3 및 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 상기 뇌소혈관 질환은 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 환자의 뇌 미세 출혈은 MRI에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서 상기 환자는 자발성 뇌 미세 출혈, 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 외상성 뇌 미세 출혈을 앓고 있다. 일부 실시형태에서 상기 자발성 뇌 미세 출혈은 연령 관련 뇌 미세 출혈, 고혈압 뇌 미세 출혈, 급성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 만성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 허혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈 또는 출혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 약물 관련 뇌 미세 출혈은 혈전 용해성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항응고성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항혈소판 응집 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 스타틴계 약물 관련 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 외상성 뇌 미세 출혈은 수술로 인한 뇌 미세 출혈이다.
도1. 급성 저압 저산소로 인한 시노몰구스 원숭이의 전전두엽 피질 뇌 조직에서 유리 헤모글로빈의 혈관 외부 분포를 증가시킨다. A. 시노몰구스 원숭이의 뇌 조직 면역 형광 영상이고 여기서 혈관 내피 세포 마커 CD31은 적색 신호를 나타내며 혈관 위치를 나타내고 점선은 혈관 프로파일을 나타내며 유리 헤모글로빈은 녹색으로 나타나고 세포핵은 청색으로 나타난다. B. MFI(Mean Fluorescence Intensity) 상대 형광 강도는 Nikon NIS-Element 소프트웨어를 사용하여 정량화된다. 시노몰구스 원숭이의 뇌 조직 혈관 외부에 분포된 유리 헤모글로빈은 상대 형광 강도로 통계하고 단일 요소 분산 분석법 및 Dunnutt's t test 양자 비교법을 사용하여 통계 및 검사를 진행하며 **, p＜0.01, n.s., 통계학적 차이가 없고 n=4이다. NN: 정상 압력 및 정상 산소군; HH: 저압 저산소군; HH+Triol: 저압 저산소 Triol 투여군; HH+PROG: 저압 저산소 대조 약물 투여군. PROG는 대조 약물 프로게스테론(progesterone)을 지칭한다.
도2. 시노몰구스 원숭이 전전두엽 피질 뇌 조직에서 미세 아교 세포의 활성화. A. 시노몰구스 원숭이 전전두엽 피질 뇌 조직Iba-1 면역 조직 화학 염색이고 Iba-1은 미세 아교 세포 활성화의 marker이다. 흑색 scale bar는 25 μm이고 적색 scale bar는 200 μm이다. B. Iba-1 상대 광학 밀도값의 통계. image pro plus소프트웨어를 사용하여 각 군의 면역 조직 화학 이미지에 대하여 광학 밀도 스캔하여 광학 밀도값을 얻은 후, NN군에 따라 표준화 처리를 진행한다. NN: 정상 압력 및 정상 산소군(n=4); HH: 저압 저산소군(n=4); HH+Triol: 저압 저산소 Triol 투여군(n=3); HH+PROG: 저압 저산소 대조 약물 투여군(n=4). 단일 요소 분산 분석법 및 Dunnutt's t test 양자 비교법을 사용하여 통계 및 검사를 진행하고 ***, p＜0.01, n.s., 통계학적 차이가 없다.
도3. Triol은 시노몰구스 원숭이 뇌 조직의 염증 인자IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 발현량을 현저히 감소시킨다. A. 시노몰구스 원숭이 전전두엽 뇌 조직의 염증 인자IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 단백질 발현 수준; B. 단백질의 상대적 그레이 스케일값의 통계. NN: 정상 압력 및 정상 산소군(N=3); HH: 저압 저산소군(N=3); HH+Triol: 저압 저산소 Triol 투여군(N=3); HH+PROG: 저압 저산소 대조 약물 투여군(N=3). 그레이 스케일값은 Image Lab소프트웨어로 스캔하여 획득하고 α-Tubulin에 대한 표준화를 통해 상대값을 얻는다. 단일 요소 분산 분석법 및 Dunnutt's t test 양자 비교법을 사용하여 통계 및 검사를 진행하고 양자를 비교할 경우 각 군을 모두 HH군과 비교하며 *, p＜0.05; **, p＜0.01이다.
도4. Triol은 CD163 및 힘옥시게나제(Heme Oxygenase-1, HO-1)의 단백질 수준을 상향 조절하여 뇌 조직이 유리 헤모글로빈에 대한 제거 능력을 향상시킨다. A. 시노몰구스 원숭이 전전두엽 뇌 조직에서 헤모글로빈 스캐빈저 수용체CD163 및 힘옥시게나제HO-1의 단백질 발현 수준; B. 단백질의 상대적 그레이 스케일값의 통계. 그레이 스케일값은 Image Lab소프트웨어로 스캔하여 획득하고 α-Tubulin에 대한 표준화를 통해 상대값을 얻는다. NN: 정상 압력 및 정상 산소군(N=3); HH: 저압 저산소군(N=3); HH+Triol: 저압 저산소 Triol 투여군(N=3); HH+PROG: 저압 저산소 프로게스테론 투여군(N=3). 단일 요소 분산 분석법 및 Dunnutt's t test 양자 비교법을 사용하여 통계 및 검사를 진행하고 양자를 비교할 경우 각 군을 모두 HH군과 비교하며 *, p＜0.05; n.s., 통계학적 차이가 없다.
도5. Triol은 저압 저산소로 인한 CD163하향 조절 및 미세 아교 세포의 활성화를 회복시킨다. A. 시노몰구스 원숭이 뇌 조직CD163 및 Iba-1의 이중 염색 면역 형광 영상. B. CD163 및 Iba-1의 상대 형광 강도 통계. C. CD163 및 Iba-1의 상대 형광 강도의 관련성 분석. NN: 정상 압력 및 정상 산소군; HH: 저압 저산소군; HH+Triol: 저압 저산소 Triol 투여군; HH+PROG: 저압 저산소 프로게스테론 투여군. 단일 요소 분산 분석법 및 Dunnutt's t test 양자 비교법을 사용하여 통계 및 검사를 진행하고 양자를 비교할 경우 각 군을 모두 HH군과 비교하며 ***, p＜0.001이다.
도6. 저산소는 유리 헤모글로빈으로 인한 미세 아교 세포 염증 활성화를 악화시킨다. A. 유리 헤모글로빈은 미세 아교 세포BV2를 상이한 시간 동안 자극한 후 면역 형광으로 미세 아교 세포 활성화 마커CD11b를 검출한다. scale bar는 25 μm이다. B. 도A에서 CD11b의 상대 형광 강도의 통계는 단일 요소 분산 분석법 및 Dunnutt's t test 양자 비교법을 사용하여 통계 및 검사를 진행하고 *, p＜0.05; **, p＜0.01이다. C. 유리 헤모글로빈은 미세 아교 세포BV2를 상이한 시간 동안 자극한 후 면역 형광으로 미세 아교 세포 활성화 마커Iba-1을 검출하며 팔로이딘으로 염색하여 미세 아교 세포의 형태학적 변화를 나타낸다. D. 도C에서 Iba-1상대 형광 강도의 통계는 단일 요소 분산 분석법 및 Dunnutt's t test 양자 비교법을 사용하여 통계 및 검사를 진행하고 *, p＜0.05; **, p＜0.01이다. E. 유리 헤모글로빈은 미세 아교 세포BV2를 상이한 시간 동안 자극한 후 western blot으로 CD11b단백질 수준을 검출한다. F. 유리 헤모글로빈은 6시간 후의 미세 아교 세포BV2를 자극한 후 qPCR로 염증성 사이토카인 및 케모카인의 mRNA 발현 수준을 검출한다. G. 저산소는 유리 헤모글로빈으로 인한 미세 아교 세포염증 인자TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 단백질 수준의 발현을 증가시키고 항염 인자IL-4에 영향을 미치지 않는다.
도7. CD163발현의 상향 조절을 저애한 후, Triol이 저산소 및 헤모글로빈에 의해 유도되는 Iba-1 및 CD11b을 상향 조절하는 억제 작용을 취소한다. 제조 업체의 설명서에 따라 RNAiMAX을 사용하여 CD163 01번 및 스크램블링된 간섭 세그먼트NC를 BV2 세포에 형질 감염시킨 후, BV2세포 배지에 10 μM Triol을 넣거나 또는 넣지 않고 처리하여 20 μM의 헤모글로빈 및 1%의 저산소 조건에서 BV2세포를 6시간 동안 자극한 후 단백질 샘플을 수집하며 Western blot으로 미세 아교 세포 활성화 마커Iba-1 및 CD11b의 발현을 검출한다.
본문에 사용된 바와 같이 용어 "조성물"은 치료 목적으로 의도된 동물 대상체에게 투여하기에 적합한 제제를 지칭하고 이는 화합물과 같은 적어도 하나의 약물 활성 조성 성분을 함유한다. 선택적으로, 상기 조성물은 적어도 하나의 약물학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 함유한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 상기 물질이 이러한 특성을 갖지 않음을 나타내고 즉 치료할 질환 또는 병증 및 각각의 투여 경료를 고려할 때, 상기 특성은 이성적이고 신중한 의학 종사자가 환자에게 상기 물질을 투여하는 것을 피할 수 있도록 한다. 예를 들어, 주사 가능한 물질일 경우, 이러한 물질은 기본적으로 무균인 것이 통상적으로 요구된다.
본문에서, 용어 "치료 유효량" 및 "유효량"은 상기 물질 및 물질의 양이 질환 또는 병증의 하나 또는 다수의 증상을 예방, 완화 또는 개선시키고 및/또는 치료를 받는 대상체의 생존을 연장시킴에 있어서 효과적인 것을 나타낸다.
용어 “뇌소혈관 질환” 또는 “CSVD”는 뇌의 작은 천공 동맥 및 소동맥(직경40~200μm), 모세 혈관 및 소정맥의 다양한 병변으로 인한 임상적, 인지적, 영상학적 및 병리적 표현의 증후군을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서 “뇌소혈관 질환”은 손상된 혈액 뇌 장벽, 혈액 뇌 장벽 파괴는 투과성을 증가시키고 혈액 성분은 혈관 주위의 조직 및 뇌실질으로 유출되어 상응한 병리 생리학적 변화를 초래하여 CSVD와 관련된 영상학 및 병리학적 변화를 일으킨다. 특정된 실시형태에서 상기 “뇌소혈관 질환”은 출혈성 뇌졸중을 포함하지 않는다.
용어 "뇌 미세 출혈"은 뇌에서 직경이 약 1cm보다 작은 영역 내의 출혈을 지칭한다. 뇌 미세 출혈은 뇌의 MRI(T2*가중 GRE MRI를 포함함)를 통해 검출될 수 있고 무증상인 "무증상 뇌출혈"일 수 있거나 일시적 또는 영구적 국소 운동 또는 감각 장애, 운동 실조증, 실어증, 구어 장애 등 증상과 관련되며 즉 "증상성 뇌출혈"(10)이다. 일부 실시형태에서 뇌 미세 출혈은 혈관 외부 유리 헤모글로빈의 분포가 현저히 증가된 것으로 표현된다.
용어 "자발성 뇌 미세 출혈"은 본문에서 비외상성 경우에 다양한 원인으로 인한 뇌혈관(통상적으로 정맥 또는 모세 혈관임)의 자발성 파열로 인한 뇌내 출혈을 지칭한다. 자발성 뇌출혈은 다중 요소 질환으로 환경 및 유전적 요소의 공통적인 작용을 받는다. 예컨대, 고령은 자발성 뇌 미세 출혈과 밀접히 관련된다(연령 관련 뇌 미세 출혈). 질환으로 인한 자발성 뇌 미세 출혈은 고혈압(예컨대 장기 고혈압), 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중 등을 포함하고 상응하게 본문에서 "고혈압 뇌 미세 출혈", "허혈성 뇌졸중 동반되는 뇌 미세 출혈" 및 "출혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈"이라 지칭한다. 다른 환경 요소 또는 질환 요소는 또한 뇌 미세 출혈을 야기할 수 있고 본 발명은 구체적으로 열거되지 않은 이러한 뇌 미세 출혈의 치료에 적용될 수 있을 것으로 예상된다.
용어 "약물 관련 뇌 미세 출혈"은 본문에서 약물로 인한 뇌내 미세 출혈을 지칭한다. 이러한 약물은 혈전 용해 약물, 항응고 약물, 항혈소판 응집 약물 또는 스타틴계 약물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
혈전 용해 치료의 광범위한 적용에 따라 혈전 용해 약물은 또한 제1세대에서 제3세대로 발전했다. 초기의 제1세대의 혈전 용해 약물은 스트렙토키나아제(Streptokinase, SK), 우로키나아제(Urokinase, UK), 룸브로키나아제(Lumbrokinase), 프로우로키나아제(Pro-urokinase), 스타필로키나아제(Staphylokinase), 메톡시벤조일플라스미노겐스트렙토 키나아제 활성제, 뱀독 항혈전 효소이다. 제2세대 혈전 용해 약물alteplase(중국 제품명은 알테플라제임)는 재조합 조직형 플라스미노겐 활성제(t-PA)이고 이는 세계에서 첫번째 유전자 재조합 혈전 용해 약물이며 미국 Genetech회사에서 개발하여 출시한 것이다. 현재 혈전 용해 약물은 제3세대로 발전했다. 1996년 독일 베링거만하임(Boehringer Mannheim GmbH)회사에서 연구 제조한 Reteplase(제품명Retavase, 레테플라제)는 그 중에서 대표적이다. 레테플라제는 단백질 변형 약물로서 재조합 인간 조직형 피브리노클라아제 프로활성제 결실 변이체이고 반감기가 길며 혈전 용해 작용이 강하고 부작용이 작은 등 장점을 갖는다. 연구 개발 중인 제3세대 혈전 용해 약물은 모두 t-PA변이체이고 예컨대 TNKase(teneplase, TNK-t-PA), Monteplase, La noteplase(nateplase, n-PA) 등이다. 제3세대 혈전 용해 약물의 공통한 특징은 혈전을 신속하게 용해시키고 막힌 관상 동맥을 개통하며 혈액 순환을 회복시키고 치유율은 73％~83％에 도달한다.
항응고 약물은 또한 혈액 항응고 약물이라 지칭하고 혈관 내 색전 또는 혈전에 의해 형성되는 질환을 예방 및 치료하며 중풍 또는 다른 혈전성 질환을 예방한다. 임상적으로 가장 자주 사용되는 항응고 약물은 비경구 항응고제(예컨대 헤파린, 에녹사파린, 티아타르파린, 아디파린), 쿠마린 항응고제(예컨대 와파린, 디큐마롤, 쿠마린니트레이), 체외 항응고 약물(예컨대 구연산 나트륨), 트롬빈 억제제(예컨대 히루딘, 알가트로반)을 포함한다.
항혈소판 응집 약물은 약물의 작용 부위, 경로에 따라 4가지 종류로 분류될 수있다. (1)시클로옥시게나제 억제제(트롬복산A2억제제, 살리실산): 통상적인 약물은 아스피린 정제이다. (2)포스포디에스테라아제 억제제: 예컨대 실로스타졸(프레탈), 디피리다몰(페르산틴) 등이다. 실로스타졸(프레탈)은 혈소판 및 혈관 평활근 포스포디에스테라아제 활성 억제하고 혈소판 및 평활근 내의 cAMP 농도를 증가시키며 아스피린, 티클로피딘(티클리드)보다 더 강력하게 혈소판을 억제하고 혈소판 응집 덩어리를 해리하며 말초 혈관 질환의 우선적인 약물이다. 임상에서 주로 만성 동맥 폐색성 궤양, 통증 및 냉감과 같은 국소성 질환 치료에 사용되고 심장 기능 부전이 없는 간헐적 부딪힘 환자에게 사용되어 증상을 개선하며 보행 거리를 향상시킨다. 정상 조제량의 디피리다몰(페르산틴)을 경구 복용하면 안정성 협심증 환자의 운동으로 유발된 심근 경색의 발생률을 증가시킬 수 있으므로 현재 졸중 병력이 있고 관상 동맥 심장 질환이 없는 환자에게 사용되는 것으로 제한되어 있으며 관상 동맥 심장 질환 환자가 단독으로 디피리다몰을 사용하는 것을 권장하지 않는다. (3)ADP 수용체 길항제(티오펜피리딘계): 예컨대 클로피도그렐(플라빅스, 탤컴), 티클로피딘(Ticlopidine)(티클리드, 티클리드, 티클로피딘 히드로클로라이드) 등이다. (4)혈소판 당 단백질Ⅱb/Ⅲ길항제(GPⅡb/Ⅲa 수용체 길항제) 예컨대 단일 클론 항체 엡시시마브(abciximab)이고 중국 별명 "항혈소판 응집 단일 클론 항체"이며 펩티드 억제제 엡티피바티드(eptifibatide ) 및 비펩티드 억제제 티로피반(tirofiban) 등이다.
스타틴계 약물은 또한 3-히드록시3-메틸글루타릴코엔자임A(HMG-CoA) 환원 효소 억제제라 지칭하고 콜레스테롤(TC), 저밀도 지단백질(LDL-C) 및 apoB(아포 지질 단백질)을 현저히 감소시키는 동시에 트리글리세리드(TG)를 감소시키며 고밀도 지단백질(HDL-C)을 약간 증가시킨다. 원발성 고콜레스테롤 혈증 및 혼합형 고지혈증에 적용되고 현재 고콜레스테롤 혈증 및 죽상 동맥 경화 질환을 예방 및 치료하는 아주 중요한 약물이다. 현재 출시된 제1세대 약물은 로바스타틴 및 심바스타틴을 포함하고 제2세대 약물은 프라바스타틴 및 플루바스타틴을 포함하며 제3세대 약물은 아토르바스타틴, 로수바스타틴 및 피타바스타틴을 포함한다.
용어 "외상성 뇌 미세 출혈" 또는 "외상성 뇌 미세 출혈"은 본문에서 외상으로 인한 예컨대 수술-유도 외상, 경미한 두개 뇌 손상(TBI) 또는 만성 두개 뇌 외상으로 인한 뇌내 미세 출혈과 같은 뇌내 미세 출혈을 지칭한다. 용어 “수술-유도 뇌 미세 출혈” 또는 “수술로 인한 뇌 미세 출혈”은 수술로 인한 뇌내 미세 출혈을 지칭한다. 일부 실시형태에서 상기 수술은 중추 신경계와 직접 관련된 수술이다. 일부 실시형태에서 상기 수술은 뇌동맥류 클리핑 또는 폐색술 또는 뇌종양 절제술을 지칭한다.
식I의 화합물, 이의 중수소화물 및 약학적으로 허용 가능한 염
본 발명의 방법 또는 응용에 사용될 수 있는 화합물은 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하되,
Figure 112020077242323-pct00008
(식I)
여기서 R1은 H, 1개 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 말단 알케닐기 또는 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이고 또한 본문에서 "본 발명의 화합물"로 지칭된다. 하나의 실시형태에서 여기서 R1은 H이고 즉 상기 화합물은 5α-안드로스트-3β,5,6β-트리올(5α-androst-3β,5,6β-triol, 이하 때로는 “Triol”로 약칭함), 구조식은 식(II)에 도시된 바와 같다. 업계에서는 이미 Triol이 급성 허혈성 저산소성 뇌손상에 효과적인 뉴런 보호제라는 것이 확인되었다.
Figure 112020077242323-pct00009
(식II)
하나의 실시형태에서 R1은 -CHCH2CH3이고 상기 화합물은 17-프로필리덴-안드로스트-3β,5α,6β-트리올이다. 하나의 실시형태에서 R1은 -CH(CH3)2이고 상기 화합물은 17-이소프로필-안드로스트-3β,5α,6β-트리올이다. 하나의 실시형태에서 R1은-CH(CH2)3CH3이고 상기 화합물은 17-부틸-안드로스트-3β,5α,6β-트리올이다. 하나의 실시형태에서 R1은 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이고 상기 화합물은 콜레스탄-3β, 5α, 6β-트리올이다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 조제될 수 있다. 예기되는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태는 단일염, 이중염, 트리염, 테트라염 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용 가능한 염은 이들이 투여되는 양 및 농도 하에서는 무독성이다. 이가 생리적 효과를 발휘하는데 영향을 주지 않는 경우, 화합물의 물리적 특성을 변화시킴으로써 이러한 염의 제조는 약리학적 응용에 용이할 수 있다. 물리적 성질의 유용한 변화는 용융점을 낮추어 경점막 투여하고 및 용해도를 증가하여 더 높은 농도의 약물을 투여하는 것을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 염은 황산염, 염화염, 염화수소산염, 푸마르산염, 말레산염, 인산염, 설파믹산염, 아세트산염, 시트르산염, 젖산, 주석산염, 메탄설폰산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염, 시클로헥실설파민산염 및 퀴네이트를 함유하는 염과 같은 산 부가염을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산으로부터 획득할 수 있고 상기 산은 예컨대 염산, 말레산, 황산, 인산, 아미노설폰산, 아세트산, 시트르산, 젖산, 주석산, 말론산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 시클로헥실설파민산, 푸마르산 및 퀸산 등과 같다.
예컨대 카르복실산 또는 페놀과 같은 산성 작용기가 존재할 경우, 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 예컨대 벤자틴페니실린, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에탄올아민, tert-부틸아민, 에틸렌디아민, 메글루민, 프로카인, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 암모늄, 알킬아민 및 아연을 함유하는 염과 같은 염기 부가염을 포함한다. 적합한 상응한 염기를 사용하여 이러한 염을 제조할 수 있다.
표준 기술을 통해, 약학적으로 허용 가능한 염을 제조할 수 있다. 예를 들어, 유리 염기 형태의 화합물을 적합한 용매 예컨대 적절한 산을 함유하는 수용액 또는 물-알코올 용액에 용해시킨 후, 용액을 증발시켜 분리시킨다. 다른 구현예에서, 유리 염기 및 산을 유기 용매에서 반응시켜 염을 제조한다.
따라서, 예를 들어 만약 특정된 화합물이 염기인 경우, 본 분야에서 얻을 수 있는 임의의 적합한 방법을 통해 필요한 약학적으로 허용 가능한 염을 제조할 수 있고 예를 들어 무기산 또는 유기산으로 유리 염기를 처리하며 상기 무기산은 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 및 유사산이고 상기 유기산은 예컨대 아세트산, 말레산, 숙신산, 만델산, 푸마르산, 말론산, 피루브산, 옥살산, 글리콜산, 살리실산, 글루쿠론산 또는 갈락투론산 등과 같은 피라노시딜산(pyranosidyl acid), 시트르산 또는 주석산과 같은 α-히드록시산, 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 아미노산, 벤조산 또는 계피산과 같은 방향족산, p-톨루엔설폰산 또는 에탄설폰산 또는 유사체와 같은 황산이다.
마찬가지로, 만약 특정된 화합물이 산일 경우, 임의의 적합한 방법을 통해 필요한 약학적으로 허용 가능한 염을 제조할 수 있고 예를 들어 무기 염기 또는 유기 염기로 유리 산을 처리하며 상기 무기 염기 또는 유기 염기는 예컨대 아민(1차 아민, 2차 아민 또는 3차 아민), 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 또는 유사체이다. 적합한 염의 예시적인 예는 아미노산(예컨대 L-글리신, L-리신 및 L-아르기닌), 암모니아, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 및 시클릭아민(예컨대 히드록시에틸피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린 및 피페라진)로부터 유도되는 유기염, 및 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 알루미늄 및 리튬으로부터 유도되느 무기염을 포함한다.
화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 착화합물로서 존재할 수 있다. 착화합물의 예는 8-클로로테오필린 착화합물(유사하게 예를 들어, 디멘히드리네이트: 디펜히드라민8-클로로테오필린(1:1)착화합물; 디멘히드리네이트) 및 시클로덱스트린을 포함하는 다양한 착화합물을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 화합물을 사용하는 약학적으로 허용 가능한 중수소화 화합물 또는 다른 비방사성 치환 화합물을 포함한다. 중수소화는 약물 활성 분자 라디칼의 하나 또는 복수개 또는 모든 수소를 동위 원소 중수소로 대체하는 것이므로 무독성 무방사성이고 또한 탄소-수소 결합보다 약 6~9배 더 안정적이기 때문에 대사 부위를 폐쇄하여 약물의 반감기를 연장시킴으로써 치료제의 양을 감소시키는 동시에 약물의 약리적 활성에 영향을 주지 않으며 우수한 변형 방법으로 간주된다.
약물 조성물
본 발명은 다른 한편으로 약물 조성물을 제공하는데, 유효량의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
본 발명에서, “약물 조성물”은 식I 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 지칭하고 여기서 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체는 혼합된 형태로 조성물에 존재한다. 상기 조성물은 일반적으로 인간 대상체의 치료에 사용된다. 그러나, 이들은 또한 다른 동물 대상체에서 유사하거나 또는 동일한 병증을 치료하는데 사용될 수 있다. 본문에서, 용어 “대상체”, “동물 대상체” 및 유사한 용어는 인간 및 비인간 척추 동물을 지칭하고 예를 들어 비인간 영장류와 같은 포유 동물, 말, 소, 돼지, 양, 설치류 동물 및 애완 동물(예컨대 개 및 고양이)과 같은 경쟁 동물 및 상업 동물을 지칭한다.
적합한 제형은 용도 또는 예컨대 경구, 경피, 경점막, 흡입 또는 주사(위장 밖)와 같은 투여 경로에 부분적으로 의존한다. 이러한 제형은 상기 화합물이 표적 세포에 도달할 수 있도록 하여야 한다. 다른 요소는 본 분야에 잘 알려져 있고 예컨대 독성 및 화합물 또는 조성물의 효과를 지연시키는 제형과 같은 고려 사항을 포함한다.
담체 또는 부형제는 조성물 생산에 사용될 수 있다. 상기 담체 또는 부형제는 화합물의 투여를 촉진하도록 선택될 수 있다. 담체의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당(예컨대 락토스, 글루코스 또는 수크로스), 또는 전분 유형, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 폴리에틸렌글리콜 및 생리학적 상용성 용매를 포함한다. 생리학적 상용성 용매의 예는 주사용 물(WFI) 무균 용액, 염 용액 및 글루코스를 포함한다.
정맥 내, 복강 내, 피하, 근육 내, 경구, 경점막, 직장, 경피 또는 흡입을 포함하는 상이한 경로를 통해 조성물 또는 조성물의 조성 성분을 투여할 수 있다. 일부 실시형태에서 주사제 또는 동결 건조된 분말 주사제가 바람직하다. 경구 투여의 경우, 예를 들어 화합물은 캡슐, 정제와 같은 통상적인 경구 제형, 및 시럽, 엘릭시르제 및 농축된 적제와 같은 액체 제제로 조제될 수 있다.
경구 용도의 약물 제제를 획득할 수 있고 예를 들어 조성물 또는 이의 조성 성분을 고체 부형제와 조합하고 선택적으로 연마되어 형성된 혼합물, 및 적합한 보조제를 첨가한 후(필요한 경우) 과립의 혼합물을 가공함으로써 정제 또는 당의정을 획득한다. 적합한 부형제는 특히 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당과 같은 충진제; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거갠스검, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP: 포비돈(povidone))과 같은 셀룰로오스 제제이다. 필요한 경우, 예컨대 가교된 폴리비닐피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 예컨대 나트륨알기네이트와 같은 이들의 염 등 붕해제를 넣을 수 있다.
선택적으로, 근육 내, 정맥 내, 복강 내의 및/또는 피하와 같은 주사(위장 밖 투여)를 사용할 수 있다. 주사에 있어서, 본 발명의 조성물 또는 이의 조성 성분은 무균 액체 용액으로 조제되고 바람직하게는 예컨대 식염수 용액, Hank 용액 또는 Ringer 용액과 같은 생리적으로 상용하는 버퍼 또는 용액이다. 이 밖에, 조성물 또는 이의 조성 성분은 고체 형태로 조제될 수 있고 사용하기 전에 재용해시키거나 또는 현탁시킨다. 또한 동결 건조 분말 형태로 생산될 수 있다.
또한 경점막, 국소 또는 경피 방식을 통해 투여될 수 있다. 경점막, 국소 또는 경피 투여에 있어서 처방에서 침투할 배리어에 적합한 침투제를 사용한다. 이러한 침투제는 본 분야에서 공지된 것으로 예컨대 경점막 투여를 위한 담즙염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 이 밖에, 세제는 침투를 촉진시킬 수 있다. 경점막 투여는 예를 들어 비강 스프레이 또는 좌약(직장 또는 질)에 의한 것일 수 있다.
표준 절차를 통해 투여할 각종 조성 성분의 유효량을 결정할 수 있고 고려할 요소는 예컨대 상기 화합물IC50, 상기 화합물의 생물학적 반감기, 대상체의 연령, 크기, 체중 및 대상체와 관련된 병증과 같다. 이러한 요소 및 다른 요소의 중요성은 본 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 일반적으로, 투여량은 치료할 대상체의 약 0.01mg/kg 내지 50mg/kg 사이에 있고 바람직하게는 0.lmg/kg 내지 20mg/kg 사이에 있다. 투여량을 여러번 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 이의 조성 성분은 또한 동일한 질환을 치료하는 다른 치료제와 결합하여 사용할 수 있다. 이러한 결합 사용은 상이한 시간에 이러한 화합물 및 하나 또는 다수의 다른 치료제를 투여하거나 또는 이러한 화합물 및 하나 또는 다수의 다른 치료제를 동시에 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서 본 발명의 하나 또는 다수의 화합물 또는 결합 사용한 다른 치료제의 조제량을 보정할 수 있고 예를 들어, 본 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법을 통해 단독으로 사용되는 화합물 또는 치료제의 조제량을 감소시킨다.
결합 사용 또는 병용은 다른 요법, 약물, 의학 절차 등과 함께 사용하는 것을 포함하는 것을 이해하여야 하고 여기서 상기 다른 요법 또는 절차는 본 발명의 조성물 또는 이의 조성 성분과 상이한 시간(예컨대, 단기적으로(예컨대 1, 2, 3, 4-24시간과 같이 몇시간) 또는 더 긴 시간(예컨대 1-2일, 2-4일, 4-7일, 1-4주) 또는 본 발명의 조성물 또는 다른 조성 성분과 동일한 시간에 투여될 수 있다. 결합 사용은 한번 또는 빈번하지 않게 투여되는 요법 또는 의학 절차(예컨대 수술)와 함께 사용되어 본 발명의 조성물 또는 이의 조성 성분이 상기 다른 요법 또는 절차 전 또는 후의 단기적 또는 긴 시간 내에 투여되는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서 본 발명은 본 발명의 조성물 또는 이의 조성 성분 및 하나 또는 다수의 다른 약물 치료제를 전달하기 위한 것으로 동일한 또는 상이한 투여 경로를 통해 전달된다.
임의의 투여 경로의 결합 투여는 동일한 투여 경로를 통해 본 발명의 조성물 또는 이의 조성 성분 및 하나 또는 다수의 다른 약물 치료제를 임의의 제제 형태로 함께 전달하는 것을 포함하고 두 가지 화합물이 화학적으로 연결되며 이들이 투여될 경우 각각의 치료 활성을 유지하는 제제를 포함한다. 다른 한편, 상기 다른 약물 요법은 본 발명의 조성물 또는 이의 조성 성분과 공통으로 투여될 수 있다. 공통으로 투여된 결합 사용은 공제제(co-formulation) 또는 화학적으로 연결된 화합물의 제제 또는 단기적으로(예컨대, 1시간, 2시간, 3시간, 24시간까지) 투여하는 두 가지 또는 여러 가지 독립 제제 형태의 화합물을 포함하고 이들은 동일하거나 또는 상이한 경로로 투여된다.
독립적인 제제의 공통 투여는 예컨대 동일한 흡입 장치, 동일한 주사기 등 하나의 장치를 통해 전달되는 공통 투여 또는 단기적으로 상이한 장치에 의해 투여되는 것을 포함한다. 동일한 투여 경로를 통해 전달되는 본 발명의 화합물 및 하나 또는 다수의 별도의 약물 요법의 공제제는 재료를 함께 제조하여 이들이 하나의 장치를 통해 투여되도록 하는 것을 포함하고 상이한 화합물을 하나의 제제에 조합시키거나 또는 화합물이 보정되어 이들이 화학적으로 함께 연결되지만 여전히 각각의 생물학적 활성을 유지하는 것을 포함한다. 이러한 화학적으로 연결된 화합물은 두 개의 활성 성분을 분리하는 링커를 포함할 수 있고 상기 링커는 체내에서 기본적으로 유지되거나 또는 체내에서 분해될 수 있다.
방법 및 응용
본 발명은 다른 한편으로 뇌소혈관 질환 치료용 약물 제조에서의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 응용을 제공한다. 상응하게, 본 발명은 뇌소혈관 질환 치료에서의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다. 상응하게, 본 발명은 환자의 뇌소혈관 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 환자에게 유효량의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 상기 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또 다른 한편으로 환자의 뇌혈관 외부의 유리 헤모글로빈의 제거를 증가시키는 방법을 제공하는데, 이는 상기 환자에게 유효량의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 상기 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또 다른 한편으로 환자의 뇌혈관 외부의 유리 헤모글로빈을 제거하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 환자에게 유효량의 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 상기 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서 상기 뇌소혈관 질환은 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 환자의 뇌 미세 출혈은 MRI에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서 상기 환자는 자발성 뇌 미세 출혈, 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 외상성 뇌 미세 출혈을 앓고 있다. 일부 실시형태에서 상기 자발성 뇌 미세 출혈은 연령 관련 뇌 미세 출혈, 고혈압 뇌 미세 출혈, 급성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 만성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 허혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈 또는 출혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 약물 관련 뇌 미세 출혈은 혈전 용해성 약물 관련 뇌 미세 출혈 항응고성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항혈소판 응집 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 스타틴계 약물 관련 뇌 미세 출혈이다. 일부 실시형태에서 상기 외상성 뇌 미세 출혈은 수술로 인한 뇌 미세 출혈이다.
실시예
실시예1. Triol은 유리 헤모글로빈에 의한 미세 아교 세포의 활성화로 인한 염증성 사이토카인의 발현을 현저히 감소시킨다.
방법
조직 절편 면역 형광 영상: 파라핀 절편의 절편 두께는 5μm이고 신선한 파라핀 절편을 37℃에서 하룻밤 건조시킨 후 55℃에서 30min 동안 건조시키며 절편을 신속하게 자일렌에 넣어 탈립시키고 자일렌으로 10min*3번 충분히 탈랍시킨 후, 순차적으로 무수 에탄올-95% 에탄올-90% 에탄올-80% 에탄올-70% 에탄올-50% 에탄올-ddH2O로 구배 재수화를 진행한다. 재수화시킨 후 절편을 EDTA 항원 복구액에 넣어 마이크로파 고온 복구를 진행한다. 복구가 완성된 후 자연적으로 실온으로 온도를 낮춘다. 1차 항체 부화: 흡수지로 조직 주위의 수분을 흡수하고 면역 조직화 펜으로 샘플에 원을 그리며 DAKO 항체 희석액으로 희석한 1차 항체를 넣고 습윤한 키트에서 해빛을 피한 4℃에서 하룻밤 부화시킨다. 실온에서 10분 동안 평형시킨 후 PBST로 매번 5min씩 3번 세척한다. 상응한 종속의 형광 2차 항체를 추가하고 습윤한 키트에서 실온에서 해빛을 피하여 1h 동안 부화시킨다. PBST로 3번 세척하고 DAKO로 희석한 Hochest33342 염색액을 실온에서 해빛을 피하여 10min 동안 염색하며 PBST로 매번 5min씩 3번 세척한다. 수용성 실링 시트를 레이저 공초점 현미경을 사용하여 영상화시킨다. 공초첨 촬영 방법은 세포 면역 형광과 동일하다. NIS-Elements Analysis 소프트웨어를 사용하여 공초점 영상의 형광 강도 분석을 진행하고 내장 스케일에 따라 단위 면적의 조직 형광 강도를 표준화시킨다.
시노몰구스 원숭이 뇌 조직 면역 조직 화학 염색: 본 실험은 통상적인 면역 조직 화학의 조작 절차에 따라 수행되고 구체적으로 하기와 같다. 시노몰구스 원숭이 전전두엽 피질 조직 파라핀 절편의 두께는 5 μm이고 신선한 파라핀 절편을 37℃에서 하룻밤 건조시키며 파라핀 절편을 55℃에서 30min 동안 건조시키고 절편을 신속하게 자일렌에 넣어 탈립시키며 자일렌으로 10min*3번 충분히 탈랍시키고 순차적으로 무수 에탄올-95% 에탄올-90% 에탄올-80% 에탄올-70% 에탄올-50% 에탄올-ddH2O에 담그어 매번 3min씩 구배 재수화시킨 후 절편을 EDTA항원 복구액에 넣어 30min 마이크로파 고온 복구시킨다. 복구가 완성된 후 자연적으로 실온으로 온도를 낮춘다. 1차 항체 부화: 흡수지로 조직 주위의 수분을 흡수하고 면역 조직화 펜으로 샘플에 원을 그리며 DAKO 항체 희석액으로 희석한 1차 항체를 넣고 습윤한 키트에서 해빛을 피한 4℃에서 하룻밤 부화시킨다. 실온에서 10분 동안 평형시킨 후 PBST로 매번 5min씩 3번 세척한다. DAKO항체 희석액으로 희석한 HRP 2차 항체를 습윤한 키트에서 실온에서 1h 동안 부화시킨다. PBST로 3번 세척하고 DAB를 적가하여 기질 발색을 진행하며 매 하나의 절편의 발색 시간은 동일하고 PBST로 1번 세척하며 헤마톡실린으로 10s 동안 재차 염색시킨다. 흐르는 물을 사용하여 절편을 부드럽게 세척하고 PBS로 절편을 1번 씻는다. 탈수: 순차적으로 ddH2O-50% 에탄올-70% 에탄올-80% 에탄올-90% 에탄올-95% 에탄올-무수 에탄올을 사용하여 매번 3min 동안 담그고 구배 재수화시킨다. 투화: 자일렌을 사용하여 10min*3번 투화시킨다. 실링 시트: 자일렌으로 희석된 중성 수지 실링 시트를 사용하여 2h 후 실링제는 응고되어 촬영에 사용될 수 있다. 촬영: Nikon ECLIPSE Ti-U역형광 현미경을 사용하여 절편을 촬영하고 적합한 노출 강도 및 배경 화이트 평형을 조절하며 촬영 조절을 고정하여 각군의 절편에 대하여 멀티 뷰 다중 배수의 촬영을 진행한다.
면역 블롯팅: 1)단백질 샘플 제조(M-PER 단백질 분해액 설명서 참조): 세포를 지정된 시간 동안 처리한 후 배지를 제거하고 4℃의 사전 냉각된 PBS(0.01M pH7.2~7.3)로 3번 세척하여 배지를 깨끗이 세척한다. 프로테아제 억제제(PMSF 100 X)를 혼합한 M-PER 단백질 분해액 150-200ul를 넣고 얼음에서 10min 동안 분해시켜 세포가 충분히 분해되도록 한다. 분해물을 수집한 후 4℃의 12000rpm에서 15min 동안 저온 원심 분리시켜 세포 파편을 제거한다. 2)BCA단백질 정량(BCA 단백질 정량 키트의 설명서 참조): 정량 시약 A액: B액: ddH2O: 단백질=100:2:7.5:5의 비율에 따라 96웰 검출 플레이트에 상응한 조성 성분을 넣고 구배 농도로 희석한 단백질 표준품을 넣어 표준 커브를 플롯팅한다. 매 하나의 샘플은 3개의 다중 웰을 설치한다. 샘플을 첨가한 후 천천히 진탕하고 37℃ 인큐베이터에서 30min 동안 부화시켜 뷰렛 반응을 완료한다. 반응을 완료한 후 마이크로 플레이트 리더로 562nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 검출한다. 표준품 OD 평균값을 사용하여 단백질 농도의 표준 커브를 제작하고 관련 계수 r2 > 0.99는 선형적으로 우수한 것으로 간주된다. 표준 커브를 사용하여 각 군의 샘플의 단백질 농도를 계산한 후 단백질 분해액 및 5 X loading buffer를 사용하여 각 샘플의 농도를 동일한 농도로 조절한다. 100℃의 끓는 물에서 5min 동안 끓여 단백질이 1차 구조로 변성시킨다. 12000g에서 5s 동안 원심 분리시키고 관벽의 샘플을 저부로 이동시킨다. 3)폴리아크릴아미드겔 전기 영동: 검출하고자 하는 표적 단백질의 분자량에 따라 적합한 농도의 분리겔을 조제하고 분리겔이 응고된 후 농축겔을 조제하며 기포가 발생하는 것을 방지하기 위해 빗을 삽입한다. 농축겔이 완전히 응고된 후, 채색의 사전 염색 marker 및 단백질 샘플을 넣고 Bio-Rad 전기 영동 시스템을 사용하여 정전압 전기 영동을 진행한다. marker에 의해 지시된 표적 단백질이 분리된 후 전기 영동을 정지한다. 4)필름 전사(습식 전사법): 적절한 크기의 PVDF필름을 잘라서 접착하고 메탄올에 사전 활성화시키고 전기 영동된 겔을 절단한 후, PVDF필름 및 스폰지로 4층의 중간층으로 클램핑하여 기포가 발생하는 것을 방지한다. 중간층을 전기 전사 필름 탱크에 넣고 사전 냉각된 습식 전사 buffer를 넣으며 100V의 정전압 조건에서 전사시킨다. 표적 단백질 분자량의 크기에 따라 전사 필름 시간을 조정한다. 5)밀폐: 필름 전사가 완료된 후 PVDF 필름을 꺼내어 TBST 필름 세척액에서 5min/번씩 3번 세척한다. TBST를 사용하여 5%의 탈지 분유를 조제하고 PVDF 필름을 5%의 탈지 분유로 실온에서 1h 동안 밀폐시킨다. 6)항체 부화: 밀폐가 완료된 후, 5%의 TBST 필름 세척액으로 필름을 5min/번씩 3번 세척한다. 표적 단백질 분자량의 크기에 따라 필름을 약간의 밴드로 자르고 각각 이격층 상자에 넣으며 대응되는 1차 항체를 넣고 4℃의 진탕기에서 1차 항체를 하룻밤 부화시킨다. 1차 항체 부화가 완료된 후, 5%의 TBST 필름 세척액으로 5min/번씩 3번 세척한다. 대응되는 1차 항체 종속에 길항하는 2차 항체를 저속 진탕기에 넣고 실온에서 1h 동안 부화시킨다. 7)노출 및 현상: 5%의 TBST필름 세척액으로 5min/번씩 3번 세척한다. 어두운 키트에 1:1의 비율로 현상액 A액과 B액을 넣고 균일하게 혼합한다. PVDF필름을 현상액에 1min 동안 담근 후, Bio-Rad 화학 발광 시스템을 사용하여 노출 및 현상시키고 Image Lab 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석한다.
통계학적 처리: 실험 결과는 평균±표준 편차로 표시되고 SigmaPlot 소프트웨어를 사용하여 통계학적 분석을 진행한다. P＜0.05는 차이가 통계학적 의미가 있음을 표시한다. 다른 특수한 방법은 도면의 비고를 참조한다.
결과
고원 저압창을 사용하여 고원에 대한 빠른 접근으로 인한 급성 저압 저산소를 시뮬레이션하고 시노몰구스 원숭이를 해발 320m에서 7500m로 상승시키는데 소요 시간은 190분이며 이 후 7500m 높이에서 시노몰구스 원숭이를 48시간 동안 처리하고 실험 조건 하에서 고해발에 신속하게 도달하도록 시뮬레이션한다. 해발이 상승함에 따라, 시노몰구스 원숭이는 예컨대 구토, 운동 실조증, 의식 혼동 등 현저한 급성 고산병 증상을 나타냈고 비인간인 시노몰구스 원숭이의 급성 고산병 모델의 복제가 성공하였음을 나타낸다. 전형적인 행위학, 병리학 및 생물 화학 등 검출을 적용한 결과, 급성 저압 저산소가 시노몰구스 원숭이의 골격 근육 협조성이 현저히 하강하고 뇌 조직 구조의 액포화가 변화되며 뇌의 함수량이 증가하고 뇌 조직의 혈관성 부종 및 뉴런의 변성 손상은 급성 저압 저산소가 현저한 뇌손상을 일으키는 것을 나타낸다.
시노몰구스 원숭이 뇌 조직에 손상을 유발하는 급성 저압 저산소로 인한 헤모글로빈의 가능성을 연구하기 위하여 시노몰구스 원숭이의 전전두엽 피질 뇌 조직을 면역 형광 염색한다. 결과는 도1에 도시된 바와 같이, 정상 압력 및 정상 산소군과 비교하면 급성 저압 저산소군에는 현저히 증가된 혈관 외부 유리 헤모글로빈의 분포가 존재하나(도1A), Triol처리군에는 분포가 현저히 감소되었다(도1B). 나아가 시노몰구스 원숭이의 전전두엽 피질에 미세 아교 세포 활성화 마커Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule 1)의 면역 조직 화학적 염색을 진행한 결과, 급성 저압 저산소로 인한 미세 아교 세포의 실크 형상 또는 플레이트 형상의 위족이 증가하고 활성화 형태 변화 및 Iba-1발현량의 증가로 표현되나(도2A), Triol처리군 활성화 형태의 세포 개수는 감소되며 Iba-1의 발현은 현저히 감소되었다(도2B). 시노몰구스 원숭이 전전두엽 피질 뇌 조직에서, 면역 블롯팅을 적용하여 급성 저압 저산소가 염증성 사이토카인IL-6(Interleukin 6), TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 및 IL-1β(Interleukin 1 beta)의 전구체 및 전단된 성숙한 형태의 영향을 분석한 결과, 급성 저압 저산소 처리는 이러한 염증 인자의 발현을 현저히 증가시키나 Triol은 이러한 염증성 사이토카인의 발현 수준을 현저히 감소시킨다(도3A 및 도3B).
실시예2. Triol은 뇌 조직의 헤모글로빈 제거 능력을 현저히 회복시킨다.
CD163은 항염증 활성을 갖는 M2형 대식 세포의 분자 마커 중 하나이고 포유 동물에서 유일한 헤모글로빈 스캐빈저 수용체로서 헤모글로빈 분자의 세포 내 제거에 참여하는 기능을 한다. 헤모글로빈 및 합토그로빈의 복합체는 대식 세포/미세 아교 세포에서 CD163 매개된 포집 과정을 거친 후, 엔도솜을 리소좀에 운반하여 분해되어 헴을 생성하고 헴은 또한 HO-1의 작용 하에서 분해되어 Fe2+, CO 및 빌리베르딘을 생성하나 Fe2+ 및 빌리베르딘은 Fe3+ 및 빌리루빈으로 추가로 산화된다.
저압 저산소가 헤모글로빈 제거 능력에 대한 영향을 분석하기 위해 먼저 시노몰구스 원숭이 전전두엽 피질 뇌 조직의 CD163 및 그 다운 스트림의 헴이 주요 속도 제한 효소HO-1의 발현 수준을 분해시키는 것을 검출한다. 발명자들은 급성 저압 저산소로 인해 CD163의 발현이 현저히 감소되나(도4A 및 도4B) 이러한 CD163의 발현의 감소는 Triol에 의해 현저히 회복될 수 있음을 발견하였다. 문헌의 보도와 일치한 것은 힘옥시게나제HO-1은 저압 저산소 후 피자극적으로 상향 조절되나 본 실험에서 Triol의 처리는 HO-1의 발현 수준을 더 상향 조절시킨다.
시노몰구스 원숭이 전전두엽 뇌 조직의 면역 형광 염색을 적용하여 CD163의 발현 변화와 미세 아교 세포 활성화 마커Iba1 사이의 관련성을 추가로 분석한다. 급성 저압 저산소로 인해 CD163의 발현이 현저히 감소되나(도5A 및 도5B) Iba1의 발현은 상승하고 이러한 CD163의 발현의 감소가 Triol에 의해 발현이 상향 조절되어 현저히 회복될 경우, Iba1의 발현의 감소를 동반하며 대조 약물 프로게스테론은 저산소로 인한 CD163의 발현 억제를 취소하지 않았고 이때 Iba1의 발현은 상승한다.
상기 결과는 CD163과 Iba1의 발현 모드가 상반되는 것을 나타내고 유리 헤모글로빈은 급성 저압 저산소성 뇌 손상 미세 아교 세포의 염증 유발 요소이며 CD163 매개된 헤모글로빈 제거가 저산소에 의해 심각하게 억제됨을 유력하게 시사한다.
실시예3. Triol은 헤모글로빈의 제거를 강화시킴으로써 미세 아교 세포BV2의 염증활성화를 감소시킨다.
방법
세포 배양: 미세 아교 세포BV2가 재생한 후 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 배양하고 세포 밀도가 80% 정도에 도달하면 계대 배양 종자 플레이트를 사용하며 세포의 접종 밀도는 약 4.0-5.0Х105 /mL이다.
저산소 처리: 저산소 워크스테이션 세포 프로그램이 작동된 후 기체 조건을 1%의 산소 및 5%의 이산화탄소로 설정하고 자외선으로 30min 동안 멸균하며 기체 농도가 안정된 후 시험을 시작한다. 세포를 저산소 처리하기 전에 먼저 신선한 배지로 교체하고 다시 페트리 접시 또는 공초첨 플레이트를 저산소 워크스테이션에 놓는다. 지정된 시간 동안 처리한 후 페트리 접시를 신속하게 꺼내어 세포 고정 또는 단백질 분해 등 단계를 수행한다.
헤모글로빈 처리: 유리 헤모글로빈을 멸균수를 사용하여 10mM의 모액으로 조제하고 4℃에서 보관하며 배지를 사용하여 희석하고 페트리 접시에 넣어 지정된 최종 농도에 도달시킨다. 20μM의 헤모글로빈 및 저산소가 공통으로 자극할 경우, 먼저 세포를 유리 헤모글로빈으로 자극하고 다시 페트리 접시를 저산소 워크스테이션에 놓아 저산소 처리를 진행한다.
세포 면역 형광 영상: 세포를 레이저 공초첨 전용 접시에 접종시키고 벽에 밀착시킨후 신선한 혈청 배지로 교체하며 대응되는 헤모글로빈 자극, 저산소 처리 또는 공통으로 처리한 후 세포를 고정시킨다. 먼저 배지를 제거하고 0.3%의 PBST로 3번 세척한 후 4%의 파라포름알데히드로 세포를 20min 동안 고정하며 0.3%의 PBST로 3번 세척하고 Triton X-100으로 15min 동안 천공하며 0.3%의 PBST로 3번 세척하고 DAKO항체 희석액으로 대응되는 1차 항체를 희석하며 균일하게 혼합한 후, 세포에 적가하고 어둡고 습윤한 키트에 넣으며 4℃의 진탕기에서 하룻밤 부화시키고 실온에서 평형시킨 후, 0.3%의 PBST로 3번 세척한다. DAKO항체 희석액으로 특정된 농도의 형광 2차 항체를 희석한 후 샘플에 적가하고 습윤한 키트에 넣어 해빛을 피하여 실온에서 1h 동안 부화시키며 0.3%의 PBST로 3번 세척하고 DAKO항체 희석액으로 Hochest33342핵 염색액을 희석하며 균일하게 혼합한 후 샘플에 적가하고 습윤한 키트에 넣어 실온에서 15min 동안 부화시키며 부화를 완료한 후, PBS로 1번 세척하고 300ul의 PBS를 넣고 촬영할 수 있다. Nikon A1 공초첨 현미경을 사용하여 촬영하고 프로그램을 시작한 후 각 채널의 레이저 강도와 노출 시간을 조정한 후, 촬영 조건을 고정하고 각 군의 샘플을 촬영한다. NIS-Elements Analysis소프트웨어를 사용하여 공초첨 이미지의 형광 강도 분석을 진행하고 세포 개수에 따라 단위 세포 형광 강도를 표준화시킨다.
면역 블롯팅: 실시예1과 동일하다.
실시간 정량적 역전사 PCR증폭(qRT-PCR): 1)전체 RNA의 추출: Trizol추출 시약 설명서에 따라 진행한다. 세포를 지정된 시간 동안 처리한 후 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척하여 배지를 깨끗이 세척한다. 1ml의 Triol을 넣어 세포를 충분히 분해시킨다(이하 시약은 모두 1ml의 Trizol로 계산함). 200ul의 클로로포름을 넣고 손으로 격렬하게 혼합한 후 실온에서 3min 동안 방치한다. 4℃의 12000g에서 15min 동안 원심 분리시켜 상층의 수상 400ul을 새로운 튜브에 넣고 400ul의 이소프로판올을 첨가하며 손으로 흔들면서 균일하게 혼합하고 실온에서 20min 동안 방치한다. 4℃의 12000g에서 10min 동안 원심 분리시켜 상청액을 제거한다. 500ul의 사전 냉각된 75%의 에탄올, 4℃의 7500g에서 10min 동안 원심 분리시키고 상청액을 조심스럽게 제거한다. 공기 건조 후 적정량의 DEPC수를 넣어 RNA 침전을 용해시킨다. 2)RNA 정량: Nanodrop 2000 핵산 정량기를 사용하여 RNA를 정량화하고 260/280nm의 파장에서의 OD비율을 측정하며 비율은 1.8-2.0범위가 품질이 우수한 것으로 간주된다. 3)역전사 반응: 각 반응 시스템에서 RNA 총량은 2ug, oligo dT 1ul이고 DEPC수를 사용하여 반응 시스템을 13ul로 조정한다. 원심 분리시켜 균일하게 혼합한 후 65℃에서 5min 동안 사전 변성시킨다. 사전 변성시킨 후 즉시 얼음 위에 놓고 RT Reaction Buffer 4ul, dNTP 2ul, Reverse Transcriptase 1ul를 넣는다. 원심 분리시켜 균일하게 혼합한 후 역전사 반응시킨다. 역전사 반응 조건은 42℃60min - 70℃10min-4℃이다. 4) qPCR 증폭 잔응 파라미터: qPCR 증폭 반응 시스템: SYBR Green Mix 5ul, cDNA 1ul, primer 2ul, RNase free ddH2O 2ul. 순환 파라미터: Holding stage: 95℃15min; Cycling stage(40 cycles): 95℃10s-56℃20s-72℃30s; Melt Curve stage: 95℃15s-60℃60s-95℃15s-60℃60s. 5)데이터 처리: Applied Biosystem 7500 fast real-time PCR software v2.0.5를 사용하여 데이터 분석을 진행하고 상대 유전자 발현량은 공식 RQ =2 -ΔΔCt방법을 사용하여 정량화한다.
결과
유리 헤모글로빈이 미세 아교 세포의 활성화를 직접 유발할 수 있는 지의 여부를 연구하기 위해, 먼저 헤모글로빈을 적용하여 미세 아교 세포를 자극하여 이의 활성화 지표의 변화를 관찰한다. 결과, 체외에서 직접 유리 헤모글로빈을 사용하여 미세 아교 세포BV2를 상이한 시간 동안 자극하면, 24시간 동안 BV2는 활성화 형태를 나타내고 세포체가 증가하며 실크 형상 위족이 증가하고 연장하는 것으로 나타나며(예컨대 도6A 및 도6C) 동시에 미세 아교 세포 활성화 분자 마커Iba-1(예컨대 도6D) 및 CD11b(예컨대 도6B 및 도6E)의 발현량은 또한 유리 헤모글로빈의 자극에 의해 현저히 상향 조절되고(예컨대 도6B 및 도6D) 면역 블롯팅 실험은 상기 시노몰구스 원숭이 뇌 조직에서 면역 형광의 시험 결과를 추가로 검증한다(도6E). 이러한 관찰과 일치한 것은, 유리 헤모글로빈의 자극으로 인한 미세 아교 세포 염증성 사이토카인TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 수준의 발현은 현저히 증가하고(예컨대 도6F) 유리 헤모글로빈으로 인한 미세 아교 세포의 염증 활성화를 표시한다.
유리 헤모글로빈에 의해 매개된 미세 아교 세포 활성화에 대한 저산소의 영향을 분석하기 위해 미세 아교 세포에 유리 헤모글로빈의 직접적인 자극을 제공하는 동시에 세포에 1%의 산소를 갖는 저산소 처리한 결과 저산소가 유리 헤모글로빈으로 인한 미세 아교 세포의 염증성 사이토카인 단백질 수준의 증가를 격화시키고 이러한 염증 인자는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6을 포함하지만 항염증 사이토카인IL-4에는 현저한 영향을 미치지 않는다(예컨대 도6G). 이러한 결과는 저산소가 유리 헤모글로빈으로 인한 미세 아교 세포 활성화를 격화시킴을 나타낸다.
시노몰구스 원숭이 뇌 조직 미세 아교 세포에서 Triol은 헤모글로빈이 수용체CD163 및 그 다운스트림 분자 HO-1을 제거하는 발현을 상향 조절하고 이체 세포 모델에서 CD163의 RNA간섭을 추가로 적용하며 저산소 및 헤모글로빈의 자극이 미세 아교 세포를 활성화시킨 후 CD163의 간섭이 미세 아교 세포 활성화에 대한 Triol의 억제 작용을 취소할 수 있는 지의 여부를 분석한다. 도7에 도시된 바와 같이, CD163을 간섭한 후 저산소 및 헤모글로빈이 미세 아교 세포의 Iba-1 및 CD11b의 발현을 상향 조절하는 Triol의 억제 작용을 취소하고 Iba-1 및 CD11b의 발현은 상향 조절하는 것으로 회복되는 것은 Triol이 CD163 매개된 세포로 유리 헤모글로빈 제거를 향상시킴으로써 미세 아교 세포의 염증 활성화를 방지한다.
종합해보면 유리 헤모글로빈은 미세 아교 세포의 활성화를 유발하고 Triol은 미세 아교 세포 스캐빈저 수용체CD163의 발현 수준을 회복시킴으로써 유리 헤모글로빈으로 인한 미세 아교 세포의 활성화를 감소시킨다.
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Claims (15)

  1. 식I의 화합물, 이의 중수소화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 환자의 뇌소혈관 질환 치료용 약물로서,
    Figure 112022094409745-pct00010
    (식I)
    R1은 H, 1개 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2이고,
    상기 뇌소혈관 질환은 뇌 미세 출혈인, 약물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 H인, 약물.
  3. 제1항에 있어서,
    R1은 =CHCH2CH3, -CH(CH3)2 및 -CH(CH3)(CH2)3CH(CH3)2로부터 선택되는, 약물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 미세 출혈은 자발성 뇌 미세 출혈, 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 외상성 뇌 미세 출혈인, 약물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 자발성 뇌 미세 출혈은 연령 관련 뇌 미세 출혈, 고혈압 뇌 미세 출혈, 급성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 만성 고산병과 동반되는 뇌 미세 출혈, 허혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈 또는 출혈성 뇌졸중과 동반되는 뇌 미세 출혈인, 약물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 약물 관련 뇌 미세 출혈은 혈전 용해성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항응고성 약물 관련 뇌 미세 출혈, 항혈소판 응집 약물 관련 뇌 미세 출혈 또는 스타틴계 약물 관련 뇌 미세 출혈인, 약물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 외상성 뇌 미세 출혈은 수술로 인한 뇌 미세 출혈인, 약물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 수술은 중추 신경계와 직접 관련된 수술인, 약물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 수술은 뇌동맥류 클리핑 또는 폐색술 또는 뇌종양 절제술인, 약물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌소혈관 질환은 무증상인, 약물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌소혈관 질환은 증상이 있는 것인, 약물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는 인간인, 약물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물은 별도의 치료제를 더 포함하는, 약물.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌소혈관 질환은 뇌혈관 외부의 유리 헤모글로빈의 분포가 현저히 증가되는 것으로 나타나는, 약물.
  15. 삭제
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