BRPI0610048A2 - terapia de combinação que compreende um composto de diaril uréia e uma pi3, akt quinase ou inibidores de mtor (rapamicinas) para o tratamento de cáncer - Google Patents

Abstract

TERAPIA DE COMBINAçAO QUE COMPREENDE UM COMPOSTO DE DIARIL URéIA E UMA PI3, AKT QUINASE OU INIBIDORES DE MTOR (RAPAMICINAS) PARA O TRATAMENTO DE CáNCER. A presente invenção refere-se às composições farmacêuticas e combinações para o tratamento de câncer, que compreendem um composto de diaril uréia, por exemplo, metilamida de ácido 4{4-113-(4-cloro-3-trifluormetilfenil)-ureido]-3-fluorfenóxi}-piridina-2-ca rboxílico e um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT. O inibidor da via de sinalização PI3K/AKI compreende inibidores de PI3 (como celecoxib, viridinas, wortmaninas), inibidores da AKT quinase (como perifosina, triciribina) e inibidores de mTOR (como rapamicinas, temsirolimus e everolimus).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIA DECOMBINAÇÃO QUE COMPREENDE UM COMPOSTO DE DIARIL URÉIAE UMA PI3, AKT QUINASE OU INIBIDORES DE MTOR (RAPAMICINAS)PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER".

Antecedentes da Invenção

Compostos de diaril uréia, por exemplo, metilamida de ácido 4{4-[3-(4-cloro-3-trifluormetilfenil)-ureido]-3-fluorfenoxi}-piridina-2-carboxílico,como descrito, por exemplo, em US 20050038080, são agentes anticâncer eantiangiogênicos potentes que possuem várias atividades, incluindo ativida-de inibidora sobre as moléculas de sinalização de VEGFR, PDGFR, raf, p38e/ou flt-3 quinase. A via RAS/RAF/MEK/ERK está envolvida na proliferação,diferenciação e transformação celulares, e está implicada em muitos cânce-res. A via de sinalização PI3K/AKT é outra via fisiológica importante nas cé-lulas. Ela medeia os estímulos extracelulares, incluindo fatores de cresci-mento, citocinas, adesão célula-célula e matrizes celulares-extracelulares(Vivanco e Sawyers, A/aí. fíev. Câncer, 2: 489-501, 2002, Downward, Curr.Opin. Cell. Biol., 10: 262-267, 1998). A via AKT parece estar ativa em muitostipos de cânceres humanos (Nicholson e Anderson, Cell Signal, 14: 381-395, 2002).

Descrição da Invenção

A presente invenção fornece combinações de fármacos, compo-sições e métodos para o tratamento de doenças e condições, que incluem,sem limitação, distúrbios proliferativos celulares (como, por exemplo, cân-cer), inflamação, distúrbios imunomoduladores e condições associadas àangiogênese anormal ou indesejável. As combinações de fármacos compre-endem um composto de fórmula I e pelo menos um segundo composto queé um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT. Os métodos podem compre-ender, por exemplo, a administração de um composto de diaril uréia, comodescrito abaixo, e um inibidor da via de sinalização, sais farmaceuticamenteaceitáveis destes, e derivados destes etc.

A via de sinalização de fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e AKT(proteína quinase B) regula diversos processos biológicos, incluindo a so-brevida celular, proliferação celular, crescimento celular e motilidade celular.Anormalidades na sinalização PI3K-AKT contribuem para a patogênese devárias doenças e condições, incluindo distúrbios proliferativos celulares (co-mo, por exemplo, câncer), inflamação e distúrbios imunomoduladores.

Muitos fatores de crescimento e de sobrevida ativam membrosda família PI3K para converter especificamente uma molécula de sinalizaçãolipídica, PIP2, em outra, PI(3,4,5)P3. O produto fosforilado recruta membrosda família Akt até a membrana plasmática interna, estimulando sua atividadede proteína quinase. Até hoje, foram identificados muitos efetores de Aktenvolvidos em vários processos biológicos. Por exemplo, as Akt quinasesmedeiam a sobrevida celular através da fosforilação e inativação de compo-nentes do maquinário apoptótico. A via de sinalização PI3K/AKT incluiquaisquer membros ou componentes que participam da cascata de transdu-ção de sinal. Esses incluem, sem limitação, por exemplo, PI3-quinase, Akt-quinase, FKBP12, mTOR (alvo mamífero de rapamicina; também conhecidocomo FRAP, RAFT1 ou RAPT1), RAPTOR (proteína reguladora associada,se mTOR), TSC (complexo da esclerose tuberosa), PTEN, (homólogo defosfatase e tensina) e efetores abaixo destes.

As combinações da presente invenção podem ser usadas paratratar e/ou evitar qualquer condição e/ou doença associada a uma das ativi-dades mencionadas anteriormente.

Um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT é um composto queinibe um ou mais membros da cascata de transdução de sinal mencionadosanteriormente. Embora tais compostos possam ser chamados de inibidoresda via, a presente invenção inclui o uso desses inibidores para tratar qual-quer uma das doenças ou condições mencionadas, independentemente domecanismo de ação ou de como o efeito terapêutico é obtido. Na verdade,reconhece-se que esses compostos podem ter mais de um alvo, e a ativida-de inicial reconhecida para um composto pode não ser a atividade que elepossui in vivo quando administrado a um indivíduo, ou pela qual ele obtémsua eficácia terapêutica. Dessa forma, a descrição de um composto comoum inibidor que tem como alvo uma via ou proteína (por exemplo, Akt oumTOR) indica que um composto possui tal atividade, mas de modo algumrestringe um composto como tendo aquela atividade quando usado como umagente terapêutico ou profilático.

Exemplos de membros da família AKT incluem: Akt1, Akt2 (co-mumente superexpresso em tumores; Bellacosa et al, Int. J. Câncer, 64:280-285, 1995) e Akt3.

Exemplos de membros da família PI3K incluem: p110-alfa, p110-beta, p110-delta, e p110-gama (catalítico).

Exemplos de inibidores da via de sinalização PI3K/AKT incluem,sem limitação, por exemplo, FTY720 (por exemplo, Lee et al, Carcinogene-sis, 25(12): 2.397-2.405, 2004);

UCN-01 (por exemplo, Amornphimoltham et al, Clin. CâncerRes., 10 (12 Pt 1): 4.029-37, 2004).

Exemplos de inibidores da fosfatidilinositol-3-quinase (PI3-quinase) incluem, sem limitação, por exemplo, celecoxib e análogos destes,tais como OSU-03012 e OSU-03013 (por exemplo, Zhu et al, Câncer Res.,64(12): 4.309-18, 2004);

análogos de 3-desóxi-D-mio-inositol (por exemplo, Pedido U.S.

Ne 20040192770; Meuillet et al, Oncol. Res., 14: 513-27, 2004) como, porexemplo, PX-316;

análogos de 3'-desóxi-fosfatidil-mio-inositol 2'-substituído, (porexemplo, Tabellini et al, Br. J. Haematol., 126(4): 574-82, 2004);

derivados fundidos de heteroaril (Patente U.S. NQ 6.608.056);

derivados de 3-(imidazo[1,2-a]piridin-3-il) (por exemplo, Patentes

U.S. Nos 6.403.588 e 6.653.320);

Ly294002 (por exemplo, Vlahos, et al, J. Bioi, Chem., 269(7)5.241-5.248,1994);

derivados de quinazolina-4-ona como, por exemplo, IC486068(por exemplo, Pedido U.S. Ne 20020161014; Geng et al, Câncer Res., 64:4.893-99,2004);

derivados de benzo(b)tiofeno 3-(hetero)arilóxi substituído (porexemplo, WO 04 108715; também WO 04 108713);viridinas, incluindo viridinas semi-sintéticas como, por exemplo,PX-866 (éster de ácido (1S,4E,10R,11R,13S,14R)-[4-clialilaminometileno-6-hidróxi-1-metoximetil-10,13-dima-til-3,7,17-trioxo-1,3,4,7,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahidro-2-oxa-ciclopenta[a]fenantren-11-il acético) (por exemplo, Ihle et al, Mol. Câncer Ther., 3(7): 763-72, 2004;Pedido U.S. Ne 20020037276; Patente U.S. 5.726.167); e

wortmanina e derivados desta (por exemplo, Patente U.S. Nos5.504.103, 5.480.906. 5.468.773, 5.441.947, 5.378.725, 3.668.222).

Exemplos de inibidores da Akt-quinase (também conhecida co-mo proteína quinase B) incluem, sem limitação, por exemplo,

Akt-1-1 (inibe Akt1) (Barnett et al, Biochem. J., 385 (Pt.2): 399-408, 2005);

Akt-1-1,2 (inibe Ak1 e 2) (Barnett et al, Biochem. J., 385 (Pt.2):399-408, 2005);

API-59CJ-Ome (por exemplo, Jin et al, Br. J. Câncer., 91: 1.808-12, 2004);

compostos de 1-H-imidazo[4,5-c]piridinail (por exemplo,W005011700);

indol-3-carbinol e derivados deste (por exemplo, Patente U.S.Nos 6.656.963; Sarkar e Li, J. Nutr., 134(12 Supl.): 3.493S-3.498S, 2004);

perifosina (por exemplo, interfere com localização Akt na mem-brana; Dasmahapatra et al, Clin. Câncer Res., 10(15): 5.242-52, 2004);

análogos lipídicos de éter de fosfatidilinositol (por exemplo, Gillse Dennis, Expert. Opin. Investig. Drugs, 13: 787-97, 2004);

triciribina (TCN ou API-2 ou NCI identificador: NSC 154020;

Yang et al, Câncer Res., 64: 4.394-9, 2004).

Exemplos de inibidores de mTOR incluem, sem limitação, porexemplo,

intensificador de FKBP12;

rapamicinas e derivados destas, incluindo: CCI-779 (temsiroli-mus), RAD001 (Everolimus; WO 9409010), TAFA93 e AP23573; análogos,por exemplo, como descritos em WO 98/02441 e WO 01/14387, por exem-pio, AP23573, AP23464, AP23675 ou AP23841; 40-(2-hidroxietil)-rapamicina, 40-[3-hidróxi(hidroximetil) metilpropanoato]-rapamicina (tambémchamada CC1779), 40-epi-(tetrazolil)rapamicina (também chamadaABT578), 32-desoxo-rapamicina, 16-pentinilóxi-32(S)-diidro-rapamicina, eoutros derivados descritos em WO 05005434; derivados descritos em USP5.258.389, WO 94/090101, WO 92/05179, USP 5.118.677, USP 5.118.678,USP 5.100.883, USP 5.151.413, USP 5.120.842, WO 93/111130, WO94/02136, WO 94/02485, WO 95/14023, WO 94/02136, WO 95/16691 (porexemplo, SAR 943), EP 509795, WO 96/41807, WO 96/41807 e USP5.256.790; derivados de rapamicina que contêm fósforo (por exemplo, WO05016252);

derivados de 4H-1-benzopiran-4-ona (por exemplo, Pedido Pro-visório U.S. Ne 60/528.340).

Exemplos de compostos em uso pré-clínico ou clínico incluem,por exemplo, AP23573, AP23841, CCI-779 e RAD001.

Exemplos de inibidores da fosfatidilinositol-3-quinase (PI3-quinase) de interesse são wortmanina e os derivados ou análogos destas, eos sais farmaceuticamente aceitáveis de wortmanina e seus derivados e a-nálogos. Conseqüentemente, os métodos desta invenção incluem o uso dosinibidores de PI3-quinase de fórmula W:

<formula>formula see original document page 6</formula>

derivados ou análogos do composto de fórmula W, sais farmaceuticamenteaceitáveis do composto de fórmula W e sais farmaceuticamente aceitáveisdos derivados ou análogos do composto de fórmula W.

A referência aqui feita aos derivados e análogos de wortmaninaou ao composto de "fórmula W" visa a incluir os derivados e análogos identi-ficados nas Patentes U.S. Nos 5.504.103, 5.480.906. 5.468.773, 5.441.947,5.378.725, 3.668.222. Derivados e análogos adequados do composto defórmula W incluem:

a) Compostos de fórmula W1:

<formula>formula see original document page 7</formula>

em que R é H-(11-desacetoxiwortmanina) ou acetóxi e R' é CrC6 alquila,

b) Compostos A9,11-desidro-desacetoxiwortmanina de fórmula W2:

<formula>formula see original document page 7</formula>

em que R'é Ci-Côalquila.

c) Compostos 17(a-diidro-wortmanina) de fórmula W3:

<formula>formula see original document page 7</formula>

em que R é H ou acetóxi e R' é d-C6 alquila e R" é H, Ci-C6 alquila, -C(0)OH ou -C(0)0-Ci-C6 alquila;d) Ácido ou éster de anel A aberto de compostos wortmanina de fórmula W4:

<formula>formula see original document page 8</formula>

em que é H, metila ou etila e R2 é H ou metila ou

e) Derivados 11-substituídos e 17-substituídos de wortmanina de fórmula W5:

<formula>formula see original document page 8</formula>

em que R4 é =0 ou -0(C0)R6, R3 é =0, -OH ou -0(CO)R6, cada R6 é inde-pendentemente fenila, CrC6 alquila ou CrC6 alquila substituído, em que R4 é=0 ou -OH, R3 não é =0.

O composto com a estrutura de fórmula (I) que corresponde àmetilamida de ácido 4{4-[3-(4-cloro-3-trifluormetilfenil)-ureido]-3-fluorfenoxi}-piridina-2-carboxílico, sais farmaceuticamente aceitáveis, polimorfos, solva-tos, hidratos, metabólitos e pró-fármacos destes, é aqui denominado coleti-vamente "compostos de fórmula I". A fórmula (I) é a seguinte:

<formula>formula see original document page 8</formula>Quando for aqui usada a forma plural compostos, sais, e seme-lhantes, isso também visará significar um único composto, sal, ou semelhante.

O termo Ci-6 alquila, a menos que indicado de forma diferente,significa grupos alquila lineares, de cadeia ramificada ou cíclicos, que pos-suem de um a seis átomos de carbono, que podem ser cíclicos, lineares ouramificados com uma única ramificação ou com múltiplas ramificações. Taisgrupos incluem, por exemplo, metila, etila, n-propila, isopropila, n- butila, iso-butila, sec-butila, terc-butila, ciclopropila, ciclobutila e semelhantes. A pre-sente invenção também está relacionada às formas úteis dos compostosaqui descritos, tais como sais e metabólitos farmaceuticamente aceitáveis. Apresente invenção também está relacionada aos pró-fármacos do compostode fórmula (I). O termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um salrelativamente atóxico de adição de ácidos inorgânicos ou orgânicos de umcomposto da presente invenção. Por exemplo, vide S. M. Berge, et al"Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei. 1977, 66, 1-19. Sais farmaceutica-mente aceitáveis incluem aqueles obtidos por reação do composto principal,que funciona como uma base, com um ácido inorgânico ou orgânico paraformar um sal, por exemplo, sais de ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácidofosfórico, ácido metanossulfônico, ácido canforsulfônico, ácido oxálico, ácidomaléico, ácido suecínico e ácido cítrico. Sais farmaceuticamente aceitáveistambém incluem aqueles nos quais o composto principal funciona como umácido e é reagido com uma base apropriada para formar, por exemplo, saisde sódio, potássio, cálcio, magnésio, amônio e colina. Aqueles versados natécnica reconhecerão ainda que os sais de adição de ácido dos compostosreivindicados podem ser preparados por reação dos compostos com o ácidoinorgânico ou orgânico apropriado por meio de diversos métodos conheci-dos. Alternativamente, sais de metais alcalinos e de metais alcalinos terro-sos são preparados por reação dos compostos da invenção com a base a-propriada por meio de diversos métodos conhecidos.

Sais representativos dos compostos desta invenção incluem os sais atóxicosconvencionais e os sais de amônio quaternário que são formados, por e-xemplo, a partir de ácidos ou bases inorgânicas ou orgânicas por meios bemconhecidos na técnica. Por exemplo, tais sais de adição de ácido incluemacetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzoato, benzenossulfona-to, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, cinamato, ciclopen-tanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, gli-coheptanoato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridra-to, hidrobrometo, hidroiodeto, 2-hidroxietanossulfonato, itaconato, lactato,maleato, mandelato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato,nitrato, oxalato, pamoato, pectinato, persulíato, 3-fenilpropionato, picrato,pivalato, propionato, succinato, sulfonato, tartarato, tiocianato, tosilato, triflu-ormetanossulfonato e undecanoato.

Sais de bases incluem sais de metal alcalino, tais como sais depotássio e sódio, sais de metal alcalino terroso, tais como sais de cálcio emagnésio, e sais de amônio com bases orgânicas, tais como diciclohexila-mina e N-metil-D-glucamina. Adicionalmente, grupos contendo nitrogêniobásico podem ser quaternizados com agentes como haletos de alquila inferi-or, tais como cloretos, brometos e iodetos de metila, etila, propila e butila;sulfatos de dialquila, sulfato de como dimetila, dietila e dibutila; e sulfatos dediamila, haletos de cadeia longa, tais como cloretos, brometos e iodetos dedecila, laurila, miristila e estrearila, haletos de arila ou aralquila, como brome-tos de benzila e fenetila e outros haletos de aralquila monossubstituídos ouhaletos de aralquila polissubstituídos.

Solvatos para as finalidades da invenção são aquelas formasdos compostos nas quais moléculas solventes formam um complexo no es-tado sólido e incluem, sem limitação, por exemplo, etanol e metanol. Hidra-tos são uma forma específica de solvatos, nos quais a moléculas solvente éágua.

Certos agentes farmacologicamente ativos podem ainda ser mo-dificados com grupos funcionais lábeis que são clivados após administraçãoin vivo para fornecer o agente ativo parente e o grupo de derivação farmaco-logicamente inativo. Esses derivados, comumente denominados pró-fármacos, podem ser usados, por exemplo, para alterar as propriedades físi-co-químicas do agente ativo, para direcionar o agente ativo para um tecidoespecífico, para alterar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmi-cas do agente ativo e para reduzir os efeitos colaterais indesejáveis. Os pró-fármacos da invenção incluem, por exemplo, os ésteres de compostos apro-priados desta invenção que sejam bem tolerados, ésteres farmaceuticamen-te aceitáveis, tais como alquil ésteres incluindo metila, etila, propila, isopropi-la, butila, isobutila ou pentil ésteres. Ésteres adicionais como, por exemplo,fenil-CrC5 alquil, podem ser usados, embora metil éster seja preferido.

Métodos que podem ser usados para a síntese de outros pró-farmacos são descritos nas revisões seguintes sobre o assunto, que são aquiincorporadas por referência quanto à descrição desses métodos de síntese:

- Higuchi, T.; Stella, V. eds. Prodrugs As Novel Drug DeliverySystems. "ACS Symposium Series". American Chemical Society: Washing-ton, DC (1975).

- Roche, E.B. Design of Biopharmaceutical Properties throughProdrugs and Analogs. American Pharmaceutical Association: Washington,DC (1977).

- Sinkula, A.A.; Yalkowsky, S.H. J. Pharm. Sei. 1975, 64, 181 - 210.

- Stella, V.J.; Charman, W.N. Naringrekar, V.H. Drugs 1985, 29,455-473.

- Bundgaard, H., ed. Design of Prodrugs. Elsevier: Nova York(1985).

- Stella, V.J.; Himmelstein, K.J. J. Med. Chem. 1980, 23, 1.275-1.282.

- Han, H-K; Amidon, G.L. AAPS Pharmsci2000, 2, 1-11.

- Denny, W.A. Eur. J. Med. Chem. 2001, 36, 577-595.

- Wermuth, CG. em Wermuth, C. G. ed. The Practice of Medici-nal Chemistry, Academic Press: San Diego (1996), 697-715.

- Balant, L.P.; Doelker, E. em Wolff, M. E. ed. Burgers MedicinalChemistry And Drug Discovery, John Wiley & Sons: Nova York (1997), 949-982.Os metabólitos dos compostos desta invenção incluem deriva-dos oxidados dos compostos de fórmula I, em que um ou mais dos nitrogê-nios são substituídos com um grupo hidróxi; que inclui derivados nos quais oátomo de nitrogênio do grupo piridina está na forma oxido, denominada téc-nica 1-oxo-piridina, ou tem um substituinte hidróxi, denominado técnica 1-hidróxi-piridina.

Métodos Gerais de Preparação

Os compostos da invenção podem ser preparados com o uso dereações químicas e procedimentos conhecidos como descrito, por exemplo,no pedido publicado internacional WO 2005/009961.

Os compostos de fórmula I foram caracterizados previamentecomo tendo várias atividades, incluindo a inibição da via Raf/MEK/ERK, deraf quinase, de p38 quinase, de VEGFR quinase, de PDGFR quinase. Essasatividades e seu uso no tratamento de várias doenças e condições são des-critos, por exemplo, em WO 2005/009961, que é aqui incorporada por refe-rência em sua totalidade.

Indicações

As combinações de fármacos da presente invenção podem serutilizadas para o tratamento de qualquer doença ou condição que esteja as-sociada ou mediada pelas vias celulares moduladas pelos compostos quecompreendem as combinações. Essas vias incluem, sem limitação, vias desinalização que compreendem, por exemplo, VEGFR, VEGFR2,Raf/Mek/Erk, Akt/PI3K, MTOR, PTEN etc. (vide também acima). As combi-nações de fármacos podem ser úteis para o tratamento de doenças que es-tão associadas ou que são mediadas por mutações em um ou mais dos ge-nes presentes nessas vias, incluindo mutações associadas ao câncer emPTEN, ras, Raf, Akt, PI3K etc.

Como mencionado anteriormente, embora os compostos pos-sam ser conhecidos como inibidores específicos, a presente invenção incluiqualquer efeito atenuante ou terapêutico, independentemente do mecanismode ação ou de como ele é obtido.

A combinação de fármacos pode ter uma ou mais das seguintesatividades, incluindo, atividade antiproliferativa, antitumoral, antiangiogênica,de inibição da proliferação de células endoteliais ou tumorais, antineoplásica,imunossupressora, iunomoduladora, promotora de apoptose etc.

Condições ou doenças que podem ser tratadas de acordo com apresente invenção incluem distúrbios proliferativos (como, por exemplo, cân-cer), distúrbios inflamatórios, distúrbios imunomoduladores, alergia, doençasautoimunes (como, por exemplo, artrite reumatóide ou esclerose múltipla),angiogênese anormal ou excessiva etc.

Qualquer tumor ou câncer pode ser tratado, incluindo, sem limi-tação, cânceres que possuem uma ou mais mutações em raf, VEGFR-2,VEGFR-3, PDGFR-beta, Flt-3, ras, PTEN, Akt, PI3K, mTOR, além de qual-quer membro acima ou abaixo das vias de sinalização das quais fazem par-te. Um tumor ou câncer pode ser tratado com uma combinação de farmacosda presente invenção, independentemente do mecanismo que é responsávelpor ele. Podem ser tratados cânceres de qualquer órgão, incluindo, sem limi-tação, por exemplo, cânceres do cólon, pâncreas, mama, próstata, ósseo,hepático, renal, pulmonar, do testículo, pele, pâncreas, estômago, próstata,ovário, útero, cabeça e pescoço, células sangüíneas, linfáticos etc.

Cânceres que podem ser tratados de acordo com a presenteinvenção incluem, especialmente, sem limitação, tumores cerebrais, câncerde mama, sarcoma ósseo (por exemplo, osteossarcoma e sarcoma de E-wing), pré-malignidade brônquica, câncer endometrial, glioblastoma, malig-nidades hematológicas, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, neo-plasias renais, leucemia, leimiossarcoma, lipossarcoma, linfoma, doença deLhermitte-Duclose, glioma maligno, melanoma, melanoma maligno, metásta-ses, mieloma múltiplo, metaplasia mielóide, síndromes mieloplasicas, câncerpulmonar de célula não pequena, câncer pancreático, câncer de próstata,carcinoma de célula renal (por exemplo, avançado, avançado refratário),rabdomiossarcoma, sarcoma de tecidos moles, carcinoma da pele de célulaepitelial escamosa, cânceres associados à perda de função de PTEN; Aktativada (por exemplo, tumores com PTEN null e tumores com mutações deras).Exemplos de câncer de mama incluem, sem limitação, carcino-ma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductal in situ ecarcinoma lobular in situ.

Exemplos de cânceres do trato respiratório incluem, sem limita-ção, carcinoma pulmonar de célula pequena, carcinoma pulmonar de célulanão pequena, adenoma brônquico e blastoma pleuropulmonar.

Exemplos de cânceres cerebrais incluem, sem limitação, gliomado tronco cerebral e hipotalâmico, astrocitoma cerebelar e cerebral, medulo-blastoma, ependimoma e tumor neuroectodérmico e pineal.

Tumores dos órgãos reprodutores masculinos incluem, sem limi-tação, câncer prostático e testicular. Tumores dos órgãos reprodutores femi-ninos incluem, sem limitação, câncer endometrial, cervical, ovariano, vaginale vulvar, além de sarcoma do útero.

Tumores do trato digestivo incluem, sem limitação, câncer anal,do cólon, cólon-retal, esofagiano, da vesícula biliar, gástrico, pancreático,retal, do intestino delgado e da glândula salivar.

Tumores do trato urinário incluem, sem limitação, câncer da be-xiga, do pênis, renal, da pélvis renal, do ureter e uretral.

Cânceres oculares incluem, sem limitação, melanoma e retino-blastoma intra-oculares.

Exemplos de cânceres hepáticos incluem, sem limitação, carci-noma hepatocelular (carcinomas de célula hepática, com ou sem variantefibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma de dueto biliar intra-hepático) ecolangiocarcinoma hepatocelular misto.

Cânceres de pele incluem, sem limitação, carcinoma de célulasescamosas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, câncer cutâneo de cé-lula de Merkel e câncer de pele não melanoma.

Cânceres da cabeça e pescoço incluem, sem limitação, cânce-res laríngeos, hipofaríngeos, nasofaríngeos e/ou orofaríngeos, e câncer doslábios e da cavidade oral.

Linfomas incluem, sem limitação, linfoma relacionado à AIDS,linfoma não Hodgkin, linfoma cutâneo de células T, doença de Hodgkin elinfoma do sistema nervoso central.

Sarcomas incluem, sem limitação, sarcoma de tecidos moles,osteossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfossarcoma e rabdomiossar-coma.

Leucemias incluem, sem limitação, leucemia mielóide aguda,leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóge-na crônica e leucemia de células pilosas.

Além da inibição da proliferação de células tumorais, as combi-nações de farmacos da presente invenção também podem produzir regres-são tumoral, por exemplo, uma diminuição do tamanho de um tumor ou daextensão do câncer no corpo.

Prefere-se o tratamento de melanoma, câncer renal, câncer he-patocelular, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer ovariano, cân-cer de próstata, câncer cólon-retal, câncer de mama ou câncer pancreático.

Condições e distúrbios relacionados à angiogênese também po-dem ser tratados com as combinações de farmacos da presente invenção. Aexpressão inadequada e ectópica da angiogênese também pode ser danosaao organismo. Várias condições patológicas estão associadas ao crescimen-to de vasos sangüíneos anômalos. Essas incluem, por exemplo, retinopatiadiabética, glaucoma neovascular, psoríase, fibroplasias retrolentais, angiofi-broma, inflamação, re-estenoses etc. Além disso, o suprimento sangüíneoaumentado associado ao tecido canceroso e neoplásico encoraja o cresci-mento, levando a um rápido aumento do tumor e às metástases. Além disso,o crescimento de novos vasos sangüíneos em um tumor fornece uma via deescape para células renegadas, estimulando as metástases e a conseqüentedisseminação do câncer.

Sistemas úteis para a modulação da angiogênese incluem, porexemplo, a neovascularização de explantes tumorais (por exemplo, PatentesU.S. Nos 5.192.744 e 6.024.688), ensaio de membrana corioalantóica de ga-linha (CAM) (por exemplo, Taylor e Folkman, Nature, 297: 307-312, 1982;Eliceiri et al, J. Cell Biol., 140, 1.255-1.263, 1998), ensaio de célula endotelialcapilar bovina (BCE) (por exemplo, Patente U.S. NQ 6.024.688; Polverini,P.J. et al, Methods Enzymol.., 198: 440-450, 1991), ensaios de migração eensaio de inibição de crescimento HUVEC (célula endotelial vascular do cor-dão umbilical humano) (por exemplo, Patente U.S. NQ 6.060.449). Além dis-so, sistemas úteis para a modulação da liníangiogênese, incluem, por exem-pio, modelo de orelha de coelho (por exemplo, Szuba et al, FASEB J.,16(14): 1.985-7, 2002).

A modulação da angiogênese pode ser determinada por métodoadequado. Por exemplo, o grau de vascularização tecidual é tipicamentedeterminado avaliando-se o número e a densidade de vasos presentes emcerta amostra. Por exemplo, a densidade de microvasos (MVD) pode serestimada contando-se o número de agrupamentos endoteliais em um campomicroscópico de alto poder, ou detectando-se um marcador específico parao endotelio microvascular ou outros marcadores de crescimento ou de vasossangüíneos estabelecidos como, por exemplo, CD31 (também conhecidocomo molécula de adesão plaqueta-célula endotelial ou PECAM). Um anti-corpo CD31 pode ser empregado em métodos imunoistológicos convencio-nais para cortes de imunocoloração de tecidos, como descrito, por exemplo,por Penfold et al, Br. J. Oral e Maxill. Surg., 34: 37-41; Patente U.S. NQ6.017.949; Dellas et al, Gyn. Oncol., 67: 27-33, 1997; e outros. Outros mar-cadores para angiogênese incluem, por exemplo, Vezfl (por exemplo, Xianget al, Dev. Bio., 206: 123-141, 1999), angiopoietina, Tie-1 e Tie-2 (por exem-plo, Sato etal, Nature, 376: 70-74, 1995).

As combinações de fármacos desta invenção também possuemuma ampla atividade terapêutica para tratar ou evitar a progressão de umaampla gama de doenças, tais como condições inflamatórias, re-estenosescoronárias, angiogênese associada a tumores, aterosclerose, doenças auto-imunes, inflamação, certas doenças renais associadas à proliferação de cé-lulas glomerulares ou mesangiais e doenças oculares associadas à prolife-ração de vasos retinianos, psoríase, cirrose hepática, diabetes, aterosclero-se, re-estenoses, re-estenoses de enxertos vasculares, estenose dentro deendopróteses (stent), angiogênese, doenças oculares, fibrose pulmonar,bronquiolite obliterativa, nefrite glomerular e artrite reumatóide.A presente invenção também permite o tratamento, prevenção,modulação etc. de uma ou mais das seguintes condições em seres humanose/ou em outros mamíferos: retinopatia, incluindo retinopatia diabética, oclu-são isquêmica da veia retiniana, retinopatia da prematuridade e degenera-ção macular relacionada à idade; artrite reumatoide, psoríase, ou distúrbiobolhoso associado à formação subepidérmica de bolhas, incluindo penfigói-de bolhoso, eritema multiforme ou dermatite herpetiforme, febre reumática,reabsorção óssea, osteoporose pós-menopausa, sépsis, sépsis por gram-negativos, choque séptico, choque endotóxico, síndrome do choque tóxico,síndrome da resposta inflamatória sistêmica, doença inflamatória do intestino(doença do Crohn e colite ulcerativa), reação de Jarisch-Herxheimer, asma,síndrome do sofrimento respiratório do adulto, doença pulmonar fibróticaaguda, sarcoidose pulmonar, doença respiratória alérgica, silicose, pneumo-coniose dos trabalhadores em minas de carvão, lesão alveolar, insuficiênciahepática, doença hepática durante inflamação aguda, hepatite alcoólica gra-ve, malária (malária Plasmodium falciparum e malária cerebral), diabetesmelito não insulinodependente (NIDDM), insuficiência cardíaca congestiva,lesão após doença cardíaca, aterosclerose, mal de Alzheimer, encefalite a-guda, lesão cerebral, esclerose múltipla (desmielinização e perda de oligo-dendrócitos na esclerose múltipla), câncer avançado, malignidade linfóide,pancreatite, deficiência da cicatrização de feridas na infecção, inflamação ecâncer, síndromes mielodisplásica, lúpus eritematoso sistêmico, cirrose bili-ar, necrose intestinal, lesão por radiação/toxicidade após administração deanticorpos monoclonais, reação hospedeiro versus enxerto (lesão isquêmicapor reperfusão e rejeições de aloenxertos do rim, fígado, coração e pele),rejeição de aloenxerto pulmonar (bronquite obliterativa) ou complicaçõescausadas por substituição total do quadril, e doença infecciosa selecionadade tuberculose, infecção por Helicobacter pilori durante doença ulcerosapéptica, doença de Chagas causada por infecção por Trypanosoma cruzi,efeitos de toxina Shiga-//7ce resultante de infecção por E. coli, efeitos de ente-rotoxina A resultantes de infecção por Staphylococcus, infecção meningocó-cica, e infecções por Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, citomegaloví-rus, vírus da influenza, vírus da encefalomielite de Theiler e pelo vírus daimunodeficiência humana (HIV), papiloma, blastoglioma, sarcoma de Kaposi,melanoma, câncer pulmonar, câncer ovariano, câncer de próstata, carcino-ma de células escamosas, astrocitoma, câncer da cabeça, câncer do pesco-ço, câncer da bexiga, câncer de mama, câncer cólon-retal, câncer da tireoi-de, câncer pancreático, câncer gástrico, carcinoma hepatocelular, leucemia,linfoma, doença de Hodgkin, doença de Burkitt, artrite, artrite reumatóide,retinopatia diabética, angiogênese, re-estenoses, re-estenoses dentro deendopróteses, re-estenoses de enxertos vasculares, fibrose pulmonar, cirro-se hepática, ate rose le rose, glomerulonefrite, nefropatia diabética, síndromesde microangiopatia trômbica, rejeição de transplantes, psoríase, diabetes,cicatrização de feridas, inflamação e doenças neurodegenerativas; distúrbioshiperimunes, hemangioma, angiogênese miocárdica, vascularização colate-ral coronária e cerebral, isquemia, doença corneana, rubeose, glaucoma ne-ovascular, degeneração macular, retinopatia da prematuridade, cicatrizaçãode feridas, doenças relacionadas à ulcera por Helicobacter, fraturas, endo-metriose, uma condição diabética, febre da arranhadura do gato, hiperplasiada tireoide, asma ou edema após queimaduras, trauma, doença pulmonarcrônica, acidente vascular cerebral, pólipos, cistos, sinovite, inflamação crô-nica e alérgica, síndrome de hiperestimulação ovariana, edema pulmonar ecerebral, quelóide, fibrose, cirrose, síndrome do túnel do carpo, síndrome dosofrimento respiratório do adulto, ascite, uma condição ocular, uma condiçãocardiovascular, doença de Crow-Fukase (POEMS), doença do Crohn, glo-merulonefrite, osteoartrite, esclerose múltipla, rejeição de enxertos, doençade Lyme, sépsis, doença de von Hippel-Lindau, penfigóide, doença de Pa-get, doença policística do rim, sarcoidose, tireoidite, síndrome de hipervisco-sidade, doença de Osler-Weber-Rendu, doença pulmonar obstrutiva crônica,radiação, hipóxia, pré-eclampsia, menometrorragia, endometriose, infecçãopor Herpes simplex, retinopatia isquêmica, angiogênese corneana, HerpesZoster, vírus da imunodeficiência humana, parapoxvírus, protozoários, toxo-plasmose, espôndilo-artrite, espondilite anquilosante, doença de Bechterew,influenza aviaria, incluindo, por exemplo, sorotipo H5N1, e efusões e edemaassociadas a tumores.

A presente invenção fornece métodos de tratamento de qualqueruma das doenças e/ou condições mencionadas anteriormente (incluindo a-quelas mencionadas em qualquer uma das referências citadas), que com-preendem a administração de quantidades eficazes de um composto de fór-mula I e de pelo menos um segundo composto que é um inibidor da via desinalização PI3K/AKT (por exemplo, rapamicina ou um derivado ou análogode rapamicina, ou wortmanina ou um derivado ou análogo de wortmanina).Uma "quantidade eficaz" é a quantidade do composto que é útil para obter oresultado desejado, por exemplo, para tratar a doença ou condição.

A presente invenção também está relacionada aos métodos deinibição da angiogênese em um sistema que compreende células, que com-preendem a administração ao sistema de uma combinação de quantidadeseficazes de compostos aqui descritos. Um sistema que compreende célulaspode ser um sistema in vivo, por exemplo, um tumor em um paciente, órgãosisolados, tecidos ou células, sistemas de ensaios in vitro (CAM, BCE etc),modelos animais (por exemplo, modelos in vivo, subcutâneos, de câncer),hospedeiros que necessitam de tratamento (por exemplo, hospedeiros quesofrem de doenças que possuem um componente angiogenico como, porexemplo, câncer; que apresentam re-estenoses) etc.

Além disso, as combinações de fármacos podem ser administra-das para modular um ou mais dos seguintes processos: crescimento celular(por exemplo, proliferação), crescimento de células tumorais (incluindo, porexemplo, diferenciação, sobrevida e/ou proliferação celular), regressão tu-moral, crescimento de células endoteliais (incluindo, por exemplo, diferenci-ação, sobrevida e/ou proliferação celular), angiogênese (crescimento de va-sos sangüíneos), angiogênese e/ou hematopoiese (por exemplo, prolifera-ção, desenvolvimento de células T etc).

Os compostos ou as combinações de fármacos da presente in-venção podem ser administrados em qualquer forma por qualquer via eficaz,incluindo, por exemplo, oral, parenteral, enteral, intravenosa, intraperitoneal,tópica, transdérmica (por exemplo, com o uso de um emplastro padrão), of-tálmica, nasal, local, não oral, por exemplo, aerossol, inalação, subcutânea,intramuscular, bucal, sublingual, retal, vaginal, intra-arterial e intratecal etc.

Eles podem ser administrados isoladamente ou em combinação com qual-quer ingrediente(s), ativo ou inativo. Eles podem ser administrados em qual-quer dosagem eficaz, por exemplo, de cerca de 0,1 a cerca de 200 mg/kg dopeso corporal total.

As combinações da presente invenção podem ser administradasem qualquer momento e em qualquer forma eficaz. Por exemplo, os com-postos podem ser administrados simultaneamente, por exemplo, como umacomposição ou unidade de dosagem única (por exemplo, uma pílula ou lí-quido que contém ambas as composições), ou eles podem ser administra-dos como composições separadas, mas ao mesmo tempo (por exemplo, umfármaco é administrado por via intravenosa e o outro é administrado por viaoral ou intramuscular). Os fármacos também podem ser administrados se-qüencialmente em momentos diferentes. Os agentes podem ser formuladosconvencionalmente para se obter as taxas de liberação desejadas ao longode períodos de tempo prolongados, por exemplo, 12 horas, 24 horas. Issopode ser obtido com o uso de agentes e/ou seus derivados que possuammeias-vidas metabólicas adequadas, e/ou com o uso de formulações de libe-ração controlada.

As combinações de fármacos podem ser sinérgicas, por exem-plo, em que a ação unida desses fármacos é tal que o efeito combinado émaior do que a soma algébrica de seus efeitos individuais. Dessa forma,quantidades reduzidas dos fármacos podem ser administradas, por exemplo,com redução da toxicidade ou de outros efeitos deletérios ou indesejados,e/ou com o uso das mesmas quantidades usadas quando os agentes sãoadministrados isoladamente, mas obtendo-se maior eficácia, por exemplo,tendo uma ação antiproliferativa e pró-apoptótica mais potente.

Compostos ou combinações de fármacos da presente invençãopodem ainda ser combinados com qualquer outro aditivo adequado ou veí-culo farmaceuticamente aceitável. Tais aditivos incluem qualquer uma dassubstâncias já mencionadas, além de qualquer uma daqueles usados con-vencionalmente, tais como aqueles descritos em "Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy" (Gennaro e Gennaro, eds, 20ã edição, LippincottWilliams & Wilkins, 2000); "Theory e Practice of Industrial Pharmacy" (Lach-man et al, eds., 3ã edição, Lippincott Williams & Wilkins, 1986); "Enciclopédiaof Pharmaceutical Technology" (Swarbrick e Boylan, eds., 2- edição, MareeiDekker, 2002). Essas podem ser aqui citadas como "veículos farmaceutica-mente aceitáveis" para indicar que estão combinados com o fármaco ativo eque podem ser administrados com segurança a um indivíduo para fins tera-pêuticos.

Além disso, compostos ou combinações de fármacos da presen-te invenção podem ser administrados com outros agentes ativos ou terapias(por exemplo, radiação) que são utilizados para tratar qualquer uma das do-enças e/ou condições mencionadas anteriormente.

A presente invenção fornece combinações de pelo menos umcomposto de Fórmula I e pelo menos um segundo composto que é um inibi-dor da via de sinalização PI3K/AKT útil no tratamento de uma doença oudistúrbio. "Combinações" para as finalidades da invenção incluem:

- composições ou formas de dosagem únicas que contêm pelomenos um composto de Fórmula I e pelo menos um segundo composto queé um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT;

- pacotes de combinação que contêm pelo menos um compostode Fórmula I e pelo menos um segundo composto que é um inibidor da viade sinalização PI3K/AKT, a serem administrados concomitante ou seqüenci-almente;

-kits que compreendem pelo menos um composto de Fórmula I epelo menos um segundo composto que é um inibidor da via de sinalizaçãoPI3K/AKT, embalados separadamente um do outro como dosagens unitáriasou como dosagens unitárias independentes, com ou sem instruções paraque sejam administrados concomitante ou seqüencialmente; e

-formas de dosagem independentes separadas de pelo menosum composto de Fórmula I e pelo menos um segundo composto que é uminibidor da via de sinalização PI3K/AKT, que cooperam para obter um efeitoterapêutico, por exemplo, profilaxia ou tratamento da mesma doença, quan-do administradas concomitante ou seqüencialmente.

A dosagem de cada agente da combinação pode ser seleciona-da com relação à outra e/ou ao tipo de doença e/ou ao estado de doença afim de fornecer a atividade terapêutica desejada. Por exemplo, os agentesativos na combinação podem estar presentes e ser administrados em umacombinação fixa. "Combinação fixa" nesta especificação visa a significarformas farmacêuticas nas quais os componentes estão presentes em umaproporção fixa que fornece a eficácia desejada. Essas quantidades podemser determinadas rotineiramente para um paciente em particular, em que sãoutilizados vários parâmetros para selecionar a dosagem apropriada (por e-xemplo, tipo de câncer, idade do paciente, estado da doença, saúde do pa-ciente, peso etc), ou as quantidades podem ser relativamente padronizadas.

A combinação pode compreender quantidades eficazes de pelomenos um composto de Fórmula I e de pelo menos um segundo compostoque é um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT, que obtém uma maior efi-cácia terapêutica do que quando um dos compostos é usado isoladamente.

A combinação pode ser útil para produzir a regressão tumoral, para produzira estabilidade da doença, para evitar ou reduzir metástases, ou para outrosfins terapêuticos, em que o efeito terapêutico não é observado quando osagentes são usados isoladamente, ou em que um efeito aumentado é obser-vado quando a combinação é administrada.

As proporções relativas de cada composto na combinação tam-bém podem ser selecionadas com base nos seus respectivos mecanismosde ação e na biologia da doença. Por exemplo, mutações de ativação dogene B-RAF são observadas em mais de 60% dos melanomas humanos, euma composição para o tratamento de melanoma pode compreender vanta-josamente um composto de fórmula I em uma quantidade mais potente doque o composto que é um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT. Em com-paração, quando um câncer estiver associado a uma mutação na via de si-nalização PI3K/AKT (por exemplo, cânceres ovarianos e de mama), um a-gente que tenha atividade nessa via de sinalização poderá estar presenteem quantidades mais potentes em relação ao inibidor da via Ref/MEK/ERK.As proporções relativas de cada composto podem variar amplamente, e estainvenção inclui combinações para o tratamento de câncer nas quais asquantidades do composto de fórmula I e do segundo agente ativo podem serajustadas rotineiramente de tal forma que um deles esteja presente emquantidades maiores.

A liberação de um ou mais agentes da combinação também po-de ser controlada, quando apropriado, para fornecer a atividade terapêuticadesejada quando em uma forma de dosagem única, pacote de combinação,kit ou quando em formas de dosagem independentes separadas.

Ensaios

A atividade das combinações da presente invenção pode serdeterminada de acordo com qualquer método eficaz in vitro ou in vivo.

Atividade de Quinase

A atividade de quinase pode ser determinada rotineiramentecom o uso de métodos convencionais de ensaio. Ensaios de quinase tipica-mente compreendem a enzima quinase, substratos, tampões e componentesde um sistema de detecção. Um ensaio de quinase típico envolve a reaçãode uma proteína quinase com um substrato peptídico e um ATP como, porexemplo, 32P-ATP, para produzir um produto final fosforilado (por exemplo,uma fosfoproteína quando for usado um substrato peptídico). O produto finalresultante pode ser detectado com o uso de qualquer método adequado.Quando for utilizado ATP radioativo, uma fosfoproteína marcada radioativa-mente poderá ser separada do gama-32P-ATP não reagido com a utilizaçãode uma membrana de afinidade ou eletroforese em gel, e depois visualizadano gel com o uso de auto-radiografia, ou detectada com um contador de cin-tilação. Métodos não radioativos também podem ser utilizados. Os métodospodem utilizar um anticorpo que reconhece o substrato fosforilado, por e-xemplo, um anticorpo anti-fosfotirosina. Por exemplo, a enzima quinase podeser incubada com um substrato na presença de ATP e tampão de quinasesob condições que são eficazes para que a enzima fosforile o substrato. Amistura de reação pode ser separada, por exemplo, por eletroforese, e de-pois a fosforilação do substrato pode ser medida, por exemplo, por Westernblotting com o uso de um anticorpo anti-fosfotirosina. O anticorpo pode sermarcado com um marcador detectável, por exemplo, uma enzima como, porexemplo, HRP, avidina ou biotina, reagentes quimioluminescentes etc. Ou-tros métodos podem utilizar formatos de ELISA, separação por membranade afinidade, ensaios de polarização de fluorescência, ensaios luminescen-tes etc.

Uma alternativa a um formato radioativo é a transferência deenergia por ressonância de fluorescência resolvida por tempo (TR-FRET).

Esse método segue a reação de quinase padrão, em que um substrato, porexemplo, poli(GluTyr) biotinilado, é fosforilado por uma proteína quinase napresença de ATP. O produto final pode ser detectado com um anticorpo deeurópio quelado fosfo-específico (anti-fosfotirosina ou fosfoserina/treonina) eestreptavidina-APC, que se liga ao substrato biotinilado. Esses dois compo-nentes são reunidos espacialmente mediante ligação, e a transferência deenergia do anticorpo fosfo-específico para o receptor (SA-APC) produz umaleitura fluorescente no formato homogêneo.

Atividade de Raf/MEK/ERK

Um ensaio de c-Raf quinase pode ser realizado com uma enzi-ma c-Raf ativada (fosforilada) por Lck quinase. Lck-ativada c-Raf (Lck/c-Raf)é produzida em células de inseto Sf9 por co-infecção das células com bacu-lovírus que expressam, sob o controle do promotor de poliedrina, GST-c-Raf(do aminoácido 302 ao aminoácido 648) e Lck (de comprimento total). Am-bos os baculovírus são usados na multiplicidade de infecções de 2,5, e ascélulas são coletadas 48 horas pós-infecção.

A proteína MEK-1 é produzida em células de insetos Sf9 por in-fecção das células com os baculovírus que expressam a proteína de fusãoGST-MEK-1 (de comprimento total) na multiplicidade de infecções de 5, ecoleta das células 48 horas pós-infecção. Um procedimento de purificaçãosimilar é usado para GST-c-Raf 302-648 e GST-MEK-1.

As células transfectadas são suspensas em 100 mg de biomas-sa úmida de células por ml em um tampão contendo 10 mM de fosfato desódio, 140 mM de cloreto de sódio pH 7,3, Triton X-100 0,5% e o coquetel deinibidor de protease. As células são rompidas com um homogeneizadorPolytron e centrifugadas a 3.000 g por 30 minutos. O sobrenadante de30.000 g é aplicado sobre GSH-Sefarose. A resina é lavada com um tampãocontendo 50 mM de Tris, pH 8,0, 150 mM de NaCI e Triton X-100 0,01%. Asproteínas marcadas com GST são eluídas com uma solução contendo 100mM de Glutationa, 50 mM de Tris, pH 8,0, 150 mM de NaCI e Triton X-1000,01%.

As proteínas purificadas são dialisadas em um tampão contendo20 mM de Tris, pH 7,5, 150 mM de NaCI e Glicerol 20%.

Os compostos de teste são diluídos serialmente em DMSO u-sando diluições de três vezes para concentrações de estoque que variam detipicamente de 50 uM a 20 nM (por exemplo, as concentrações finais no en-saio podem variar de 1 uM a 0,4 nM). O ensaio bioquímico de c-Raf é reali-zado como um ensaio radioativo "filtermat" em placas de polipropileno de 96cavidades Costar (Costar 3365). As placas são carregadas com 75 ul de so-lução contendo 50 mM de HEPES pH 7,5, 70 mM de NaCI, 80 ng de Lck/c-Raf e 1 ug de MEK-1. Subseqüentemente, 2 ul dos compostos individuaisdiluídos serialmente são adicionados à reação, antes da adição de ATP. Areação é iniciada com 25 ul de solução de ATP contendo 5 uM de ATP e 0,3uCi de [33P]-ATP. As placas foram seladas e incubadas a 32°C por 1 hora. Areação é extinta com a adição de 50 ul de ácido fosfórico 4% e colhida comfiltermats P30 (PerkinElmer) usando uma colheitadeira Wallac Tomtec. Osfiltermats são lavados com ácido fosfórico 1% primeiro e depois com H20deionizada. Os filtros são secos em um microondas, embebidos em líquidode cintilação e lidos em um contador Wallac 1205 Betaplate (Wallac Inc.,Atlanta, GA, E.U.A.). Os resultados são expressos como percentual de inibi-ção.

% de Inibição = [100-(Tib/Ti)] x 100

em que

Tib = (contagens por minuto com inibidor) - (nível de fundo)Ti = (contagens por minuto sem inibidor) - (nível de fundo)A atividade de Raf também pode ser monitorada por sua capaci-dade para iniciar a cascata que leva à fosforílação de ERK (ou seja,raf/MEK/ERK), que resulta em fosfo-ERK. Um imunoensaio Bio-Plex Fosfo-ERK1/2 pode ser realizado da seguinte forma:

Um imunoensaio de 96 cavidades de fosfo-ERK (pERK) utilizan-

do uma plataforma de citometria de fluxo a laser foi estabelecido para medira inibição de pERK basal em linhagens celulares. Células MDA-MB-231 sãoplaqueadas a 50.000 células por cavidade em placas de microtitulação de 96cavidades em meio de crescimento completo. Para os efeitos dos compostosde teste sobre a inibição de pERK1/2 basal, no dia seguinte após o plaque-amento, as células MDA-MB-231 são transferidas para DMEM com BSA0,1% e incubadas com compostos de teste diluídos a 1:3 até uma concen-tração final de 3 mM a 12 nM em DMSO 0,1%. As células são incubadascom compostos de teste por 2 horas, lavadas e lisadas em tampão A de lisede célula inteira Bio-Plex. As amostras são diluídas com tampão B 1:1 (v/v) etransferidas diretamente para a placa de ensaio ou congeladas a -802C atéserem processadas. Cinqüenta ml de lisados diluídos de célula MDA-MB-231 são incubados com cerca de 2.000 glóbulos Bio-Plex de 5 mícrons con-jugados a um anticorpo anti-ERK1/2 de um dia para o outro em um agitadorem temperatura ambiente. No dia seguinte, é realizado o imunoensaio emsanduíche de fosfo-ERK1/2 biotinilado, os glóbulos são lavados 3 vezes du-rante cada incubação, e depois são usados 50 ml de PE-estrepavidina comoreagente de desenvolvimento. As unidades de fluorescência relativa depERK1/2 são detectadas pela contagem de 25 glóbulos com fluxo de célulasBio-Plex (sonda) em sensibilidade elevada. A IC5o é calculada tomando-secélulas não tratadas como máximo e nenhuma célula (apenas glóbulos) co-mo nível de fundo.

Atividade de fosfatidilinositol 3-quinase

A atividade de PKI3 pode ser determinada rotineiramente, porexemplo, com a utilização de kits disponíveis comercialmente (por exemplo,Perkin- Elmer, FlashPlate Platform), Frew et al, Anticancer Res., 14(6B):2.425-8, 1994.Vide também as publicações listadas sob inibidores de PKI3.Atividade de Akt

AKT pode ser isolada de células de insetos que expressamAKT1 "H\s-tagged" (aa 136-480), como descrito em WO 05011700. As célu-las que expressam são lisadas em 25 mM de HEPES, 100 mM de NaCI, 20mM de imidazol; pH 7,5, com o uso de um politron (5 ml de tampão de lise/gde células). Os restos celulares são removidos por centrifugação a 28.000 xg por 30 minutos. O sobrenadante é filtrado através de um filtro de 4,5 mí-crons e depois carregado em uma coluna quelante de níquel pré-equilibradacom tampão de lise. A coluna é lavada com 5 volumes da coluna (CV) detampão de lise, e depois com 5 CV de tampão B 20%, em que o tampão B écomposto por 25 mM de HEPES, 100 mM de NaCI, 300 mM de imidazol; pH7. AKT1 "H'\s-tagged" (aa 136-480) é eluída com um gradiente linear 20-100% de tampão B sobre 10 CV. As frações que eluem AKT1 H\s-tagged(136-480) são reunidas em um pool e diluídas três vezes com tampão C, emque tampão C é formado por 25 mM de HEPES, pH 7. A amostra é entãocromatografada sobre uma coluna de Q-Sefarose HP pré-equilibrada comtampão C. A coluna é lavada com 5 CV de tampão C, e depois eluída poretapas com 5 CV de D 10%, 5 CV de D 20%, 5 CV de D 30%, 5 CV de D50% e 5 CV de D 100%; em que o tampão D é formado por 25 mM de HE-PES, 1.000 mM de NaCI; pH 7,5.

As frações contendo AKT1 H\s-tagged (aa 136-480) são reuni-das em pool e concentradas em um concentrador com valor de corte do pe-so molecular de 10 kDa. AKT1 H\s-tagged (aa 136-480) é cromatografadasobre uma coluna de filtração em gel de Superdex 75 pré-equilibrada com 25mM de HEPES, 200 de mM NaCI, 1 mM de DTT; pH 7,5. As frações deAKT1 H\s-tagged (aa 136-480) são examinadas com o uso de SDS-PAGE eespectroscopia de massa. A proteína é reunida em pool, concentrada e esti-cada a 80°C.

AKT2 H\s-tagged (aa 138-481) e AKT3 H\s-tagged (aa 135-479)podem ser isoladas e purificadas de forma similar.

Os compostos do ensaio da enzima AKT podem ser testadosquanto à atividade inibidora de AKT proteína serina quinase em ensaios defosforilação de substrato. Esse ensaio examina a capacidade de compostosde pequenas moléculas orgânicas para inibir a fosforilação de serina de umsubstrato peptídico. Os ensaios de fosforilação de substrato usam os domí-nios catalíticos de AKT 1, 2 ou 3. AKT 17 2 e 3 também são disponíveis co-mercialmente por Upstate EUA, Inc. O método mede a capacidade da enzi-ma isolada para catalisar a transferência do gama-fosfato de ATP sobre oresíduo 72 - serina - de um peptídeo sintético biotinilado (Biotina-ahx-ARKRERAYSFGHHA-amida). A fosforilação do substrato pode ser detecta-da pelo procedimento seguinte, descrito em WO 05011700.

Os ensaios são realizados em placas brancas de 384 cavidadescom fundo em "U". Dez nM de enzima AKT ativada são incubados por 40minutos em temperatura ambiente em um volume de ensaio de 20 pi con-tendo 50 mM de MOPS, pH 7,5, 20 mM de MgCI2, 4 uM de ATP, 8 uM deDTT e 1 ul de composto de teste em DMSO 100%. A reação é interrompidapela adição de 50 ul de mistura de glóbulo SPA (PBS de Dulbecco, semMg2+ e Ca2+, Triton X-100 0,1%, 5 mM de EDTA, 50 uM de ATP, 2,5 mg/mlde glóbulos de SPA cobertos com estreptavidina). A placa é selada, permite-se que os glóbulos fiquem em repouso de um dia para o outro, e depois aplaca é contada em um contador de cintilação de microplacas Packard Top-count (Packard Instrument Co., Meriden, CT).

Os dados para dose-resposta podem ser classificados como %do Controle calculado com a fórmula de redução de dados 100*(U1-C2)/(C1-C2) versus concentração de composto, em que U é o valor desconhecido,C1 é o valor médio de controle obtido para DIVISO, e C2 é o valor médio decontrole obtido para 0,1 M de EDTA. Os dados são ajustados para a curvadeserta por: y = ((Vmax * x) K + x)), em que Vmax é a assíntota superior e K éa IC5o.

Proliferação celular

Um exemplo de um ensaio de proliferação celular é descrito nosExemplos abaixo. No entanto, ensaios de proliferação podem ser feitos porqualquer método adequado. Por exemplo, um ensaio de proliferação celularde carcinoma de mama pode ser efetuado da forma seguinte. Outros tiposde células podem ser substituídos pela linhagem de células MDA-MB-231.

Células de carcinoma de mama humano (MDA MB-231, NCI)são cultivadas em meio de crescimento padrão (DMEM) suplementado comFBS inativado pelo calor 10% a 37?C em C02 5% (vol/vol) em uma incubado-ra umidificada. As células são plaqueadas em uma densidade de 3.000 célu-las por cavidade em 90 ul de meio de crescimento em uma placa de culturade 96 cavidades. A fim de determinar os valores T0h CTG, 24 horas após oplaqueamento, 100 ul de reagente luminescente CelITiter-GIo (Promega) sãoadicionados a cada cavidade e incubados em temperatura ambiente por 30minutos. A luminescência é registrada em um instrumento Wallac Victor II. Oreagente CelITiter-GIo causa a lise das células e a geração de um sinal lu-minescente proporcional às quantidades de ATP presentes, as quais, porsua vez, são diretamente proporcionais ao número de células presente.

Os compostos de testes são dissolvidos em DMSO 100% parapreparar 10 mM de estoques. Os estoques são adicionalmente diluídos a1:400 em meio de crescimento, para gerar estoques de trabalho de 25 uMde composto de teste em DMSO 0,25%. Os compostos de teste são diluídosserialmente em meio de crescimento contendo DMSO 0,25% para manterconcentrações constantes de DMSO para todos os cavidades. Sessenta ulde composto de teste diluído são acrescentados a cada cavidade de culturapara gerar um volume final de 180 ul. As células com e sem compostos deteste individuais eram incubadas por 72 horas, quando então a luminescên-cia dependente de ATP era medida, como descrito previamente, para geraros valores de T72n. Opcionalmente, os valores de IC5o podem ser determina-dos com um programa de análise dos quadrados mínimos usando concen-tração de composto versus percentual de inibição.

% de InibiçãO = [1 -(T72h teste - T0h)/(T72hs controle - T0h)] x 100

em que

T72h teste = luminescência dependente de ATP em 72 horas napresença de composto de teste

T72n ctroie = luminescência dependente de ATP em 72 horas naausência de composto de teste

T0h = luminescência dependente de ATP no Momento Zero.Angiogenese

Um modelo útil para o estudo da angiogenese se baseia na ob-servação de que, quando uma matriz de membrana basal reconstituída, porexemplo, Matrigel, suplementada com fator de crescimento (por exemplo,FGF-1), é injetada subcutaneamente em um animal hospedeiro, células en-doteliais são recrutadas para a matriz, formando novos vasos sangüíneos aolongo de um período de vários dias. Vide, por exemplo, Passaniti et al, Lab.Invest., 67: 519-528, 1992. Colhendo-se amostras do extrato em momentosdiferentes, a angiogenese pode ser temporalmente dissecada, o que permitea identificação de genes envolvidos em todos os estágios da angiogenese,incluindo, por exemplo, migração de células endoteliais para a matriz, com-prometimento de células endoteliais com a via da angiogenese, alongamentodas células e formação de espaços saculares e estabelecimento de capila-res funcionais que compreendem estruturas conectadas e lineares que con-têm células sangüíneas vermelhas. Para estabilizar o fator de crescimentoe/ou tornar mais lenta sua liberação pela matriz, o fator de crescimento podeser unido à heparina ou outro agente estabilizante. A matriz também podeser periodicamente re-infundida com fator de crescimento para intensificar eprolongar o processo angiogênico.

Outros sistemas úteis para o estudo da angiogenese incluem,por exemplo, neovascularização de explantes tumorais (por exemplo, Paten-tes U.S. Nos 5.192.744; 6.024.688), ensaio de membrana corioalantóica degalinha (CAM) (por exemplo, Taylor e Folkman, Nature, 297: 307-312, 1982;Eliceiri et al, J. Cell Biol., 140, 1.255-1.263, 1998), ensaio de célula endotelialcapilar bovina (BCE) (por exemplo, Patente U.S. N9 6.024.688; Polverini,P.J. et al, Methods Enzymoi, 198: 440-450, 1991), ensaios de migração,ensaio de inibição de crescimento HUVEC (célula endotelial vascular do cor-dão umbilical humano) (por exemplo, Patente U.S. N9 6.060.449).

A presente invenção fornece uma ou mais das seguintes carac-terísticas:Um método de tratamento de qualquer uma das doenças e/oucondições mencionadas anteriormente, que compreende a administração dequantidades eficazes de um composto de fórmula I e de um segundo com-posto que é um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT.

Um método de modulação (por exemplo, de inibição) de uma oumais das atividades mencionadas anteriormente, que compreende a admi-nistração de quantidades eficazes de um composto de fórmula I e de umsegundo composto que é um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT.

Combinações que compreendem um composto de fórmula I eum segundo composto que é um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT.

Sem mais elaboração, acredita-se que aqueles versados na téc-nica podem, com a utilização da descrição precedente, utilizar a presenteinvenção em toda a sua extensão. As modalidades preferidas específicas aseguir devem, portanto, ser consideradas como meramente ilustrativas, e demodo algum limitantes do restante da revelação. Toda a revelação e todasas patentes e publicações citadas acima e abaixo são aqui incorporadas porreferência em sua totalidade.

Claims (16)

1. Combinação que compreende um composto de fórmula I <formula>formula see original document page 32</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável, polimorfo, solvato, hidrato, metabóli-to ou forma de pró-fármaco dos mesmos, e pelo menos um segundo com-posto que é um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT.

2. Combinação de acordo com a reivindicação 1, em que o refe-rido segundo composto é celecoxib, OSU-03012, OSU03013, PX-316, deri-vados de 3'-desóxi-fosfatidil-mio-inositol 2'-substituído, derivados de 3-(imidazo[1,2a]piridina-3-il), Ly294002, IC486068, derivados de 3-(hetero)arilóxi substituído benzo(b)tiofeno, PX-866, perifosina, triciribina, in-tensificador de FKBP12, análogos lipídicos de éter de fosfatidilinositol, wort-manina ou rapamicina ou derivados destes, ou um sal farmaceuticamenteaceitável destes.

3. Combinação de acordo com a reivindicação 1, em que o refe-rido segundo composto é um composto de wortmanina de fórmula W: <formula>formula see original document page 32</formula> um derivado ou análogo de um composto de wortmanina de fórmula W, umsal farmaceuticamente aceitável do composto de wortmanina de fórmula W,ou um sal farmaceuticamente aceitável do derivado ou análogo do compostode wortmanina de fórmula W.

4. Combinação de acordo com a reivindicação 3, em que o refe-rido derivado ou análogo da fórmula W é selecionado de:a) Compostos de fórmula W1:<formula>formula see original document page 33</formula>em que R é H-(11-desacetoxiwortmanina) ou acetóxi e R' é CrC6alquila,b) Compostos A9,11-desidro-desacetoxiwortmanina de fórmula W2:<formula>formula see original document page 33</formula>em que R' é Ci-Cô alquila,c) Compostos 17(a-diidro-wortmanina) de fórmula W3:<formula>formula see original document page 33</formula>em que R é H ou acetóxi e R' é CrC6 alquila e R" é H, d-C6 alquila,-C(0)OH ou -C(0)0-CrC6 alquila;d) Ácido ou éster de anel A aberto de compostos wortmanina de fórmula W4:<formula>formula see original document page 34</formula> em que é H, metila ou etila e R2 é H ou metila oue) Derivados 11-substituídos e 17-substituídos de wortmanina de fórmula W5: <formula>formula see original document page 34</formula> em que R4 é =0 ou -0(CO)R6, R3 é =0, -OH ou -0(CO)R6, cada R6 é inde-pendentemente fenila, CrC6 alquila ou CrC6 alquila substituída, em que R4é =0 ou -OH, R3 não é =0.

5. Combinação de acordo com a reivindicação 1, em que o refe-rido segundo composto é um inibidor de Akt-quinase.

6. Combinação de acordo com a reivindicação 1, em que o refe-rido segundo composto é Akt-1-1, Akt-1-1,2, API-59CJ-Ome, derivados de 1-H-imidazo[4,5-c]piridinail, indol-3-carbinol e derivados dos mesmos, perifosi-na, análogos lipidicos de éter de fosfatidilinositol, triciribina, ou um sal farma-ceuticamente aceitável dos mesmos.

7. Combinação de acordo com a reivindicação 1, em que o refe-rido segundo composto é um inibidor de mTOR.

8. Combinação de acordo com a reivindicação 1, em que o refe-rido segundo composto é rapamicina, temsirolimus, everolimus, AP23573,AP23675, AP23464, AP23841, 40-(2-hidroxietil)rapamicina, 40-[3-hidróxi(hidroximetil)-metilpropanoato]-rapamicina, 40-epi-(tetrazolil)-rapamicina, 32-desoxo-rapamicina ou 16-pentinilóxi-32(S)-diidro-rapamicina,SAR 943 ou um sal íarmaceuticamente aceitável dos mesmos.

9. Combinação de acordo com a reivindicação 1, que compre-ende um composto de fórmula (I) e wortmanina.

10. Combinação de acordo com a reivindicação 1, que compre-ende um composto de fórmula (I) e rapamicina.

11. Combinação de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 10, em que as quantidades dos ingredientes ativos da combinaçãosão sinérgicas.

12. Combinação de acordo com a qualquer uma das reivindica-ções 1 a 11, para o tratamento de câncer.

13. Combinação de acordo com a reivindicação 12, em que oreferido câncer é melanoma, câncer hepatocelular, carcinoma de célula re-nal, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer ovariano, câncer depróstata, câncer cólon-retal, câncer de mama ou câncer pancreático.

14. Método para o tratamento de câncer em um indivíduo quenecessite deste que compreende a administração de quantidades eficazesde um composto de fórmula I<formula>formula see original document page 35</formula>ou um sal íarmaceuticamente aceitável, polimorfo, solvato, hidrato, metabóli-to ou pró-fármaco dos mesmos, e de um segundo composto que é um inibi-dor da via de sinalização PI3K/AKT.

15. Processo para a fabricação de uma combinação como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, para o tratamento de câncer.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que o referi-do câncer é melanoma, câncer hepatocelular, carcinoma de célula renal,câncer pulmonar de célula não pequena, câncer ovariano, câncer de prósta-ta, câncer cólon-retal, câncer de mama ou câncer pancreático.