MX2007014726A - Tratamiento combinado que comprende un compuesto diarilurea y una pi3, akt cinasa o inhibidores mtor (rapamicina) para tratamiento de cancer. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con composiciones farmaceuticas y composiciones para tratar cancer, que comprende un compuesto diarilurea, por ejemplo metilamida de acido 4{4-[3-(4-cloro-3-trifluorometilfenil)-ureido]-3-fluorofenoxi}-pi ridino-2-carboxilico y un inhibidor de la via de senalizacion pI3K/AKT. El inhibidor de la via de senalizacion PI3K/AKI comprende inhibidores PI3 (como celecoxilo, viridinas, wortmaninas), inhibidores de AKT cinasa (como perifosina, triciribina) e inhibidores de mTOR {como rapamicinas, temsirolimus y evorolimus}.

Description

TRATAMIENTO COMBINADO QUE COMPRENDE UN COMPUESTO DIARILUREA Y UNA PI3, AKT CINASA O INHIBIDORES DE MTOR (RAPAMICINA) PARA TRATAMIENTO DE CÁNCER ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los compuestos de diarilurea, por ejemplo la metilamida del ácido 4 { - [3- ( -cloro-3-trifluorometilfenil) -ureido] -3-fluorofenoxi } -piridin-2-carboxílico como se describe, por ejemplo en el documento de E.U.A. 20050038080 son agentes potentes anticancerígenos y antiangiogénicos que poseen diversas actividades que incluyen actividad inhibidora sobre las moléculas de señalización VEGFR, PDGFR, raf, p38 y/o flt-3-cinasa. La vía RAS/RAF/MEK/ERK está involucrada en la proliferación, diferenciación y transformación celulares y está implicada en muchos cánceres. La vía de señalización PI3K/AKT es otra vía fisiológica importante en las células. Media estímulos extracelulares que incluyen factores de crecimiento, citocinas, adhesión célula-célula y célula-matrices extracelulares (Vivanco and Sawyers, Nat Rev Cáncer, 2: 489-501, 2002, Downward, Curr Opin Cell Biol, 10: 262-267, 1998). La vía AKT parece estar activa en muchos tipos de cáncer humano (Nicholson and Anderson, Cell Signal, 14: 381-395, 2002) .

REF. : 187991 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN i La presente invención proporciona combinaciones de I medicamentos, composiciones y métodos para tratar enfermedades y condiciones que incluyen pero que no se limitan a trastornos ' proliferativos de las células (tales como cáncer) inflamación, I trastornos inmunomoduladores y condiciones relacionadas con agioténesis anormal o indeseable. Las combinaciones de medicamento comprenden un compuesto de fórmula I y por lo menos un segundo compuesto que es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT. Los métodos pueden comprender, por ejemplo, administrar un compuesto de diarilurea como se describe en lo siguiente y un inhibidor de la vía de señalización, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y derivados de los mismos, etcétera. La vía de señalización de fosfatidilinositol-3- ' cinasa (PI3K) y AKT (proteína cinasa B) regulan una variedad • de procedimientos biológicos que incluyen supervivencia celular, proliferación celular, crecimiento celular y movilidad celular. Las anomalías en la señalización PI3K-AKT ¡ contribuyen a la patogénesis en muchas enfermedades y condiciones que incluyen trastornos proliferativos de las células (tal como cáncer) , inflamación y trastornos ! inmunomoduladores. Muchos factores de crecimiento y de supervivencia activan a los miembros de la familia PI3K para convertir específicamente una molécula de señalización lipídica, PIP2 en otra, PI(3,4,5)P3. El producto fosforilado recluta a miembros de la familia Akt a la membrana plasmática interna, estimulando su actividad de proteína cinasa. Hasta ahora se han identificado muchos efectores Akt involucrados en varios procedimientos biológicos. Por ejemplo, las Akt cinasas median la supervivencia celular a través de fosforilación e inactivación de componentes de la maquinaria apoptósica. La vía de señalización PI3K/AKT incluye a cualquier miembro o componente que participe en la cascada de transducción de señal. Estos incluyen, pero no se limitan, por ejemplo a PI3-cinasa, Akt-cinasa, FKBP12, mTOR (objetivo de rapamicina en mamífero; también conocido como FRAP, RAFT1 o RAPT1), RAPTOR (proteína asociada reguladora si TOR), TSC (complejo de esclerosis tuberosa) , PTEN, (homólogo de fosfatasa y tensina) y efectores posteriores de los mismos. Las combinaciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar y/o evitar cualquier condición y/o enfermedad relacionada con cualquiera de las actividades mencionadas antes. Un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT es un compuesto que inhibe a uno o más miembros de la cascada de transducción de señal mencionados antes. Aunque tales compuestos se pueden denominar como inhibidores de vía, la presente invención incluye el uso de estos inhibidores para tratar cualquiera de las enfermedades o condiciones mencionadas, no importando el mecanismo de acción o la manera en que se obtiene el efecto terapéutico. En realidad, se reconoce que dichos compuestos pueden tener más de un objetivo y que la actividad inicial reconocida por un compuesto puede no ser la actividad que posee in vivo cuando se administra a un sujeto, o por medio del cual obtiene su eficacia terapéutica. Por lo tanto, la descripción de un compuesto como un inhibidor de la vía o proteína objetivo (por ejemplo Akt o mTOR) indica que un compuesto posee dicha actividad, pero de ninguna manera limita a un compuesto que tenga dicha actividad cuando se utiliza como el agente terapéutico o profiláctico. Los ejemplos de miembros de la familia AKT incluyen: Aktl, Akt2 (comúnmente sobreexpresado en tumores; Bellacosa et al., Inc . J. Cáncer, 64:280-285, 1995) y Akt3. Los ejemplos de miembros de la familia PI3K incluyen: pllO-a, pllO-ß, pllO-d y pllO? (catalítico) . Los ejemplos de inhibidores de la vía de señalización PI3K/AKT incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a FTY 720 (por ejemplo, Lee et al., Carínogenesis , 25(12) :2397-2405, 2004); UCN-01 (por ejemplo A ornphimoltham et al., Clin Cáncer Res . , 10(12 Pt l):4029-37, 2004). Los ejemplos de inhibidores de fosfatidilinositol-3-cinasa (Pl3-cinasa) incluyen, pero no se limitan, por ejemplo a: celecoxib y análogos de los mismos tales como OSU-03012 y OSU-03013 (por ejemplo, Zhu et al., Cáncer Res., 64 (12) :4309-18, 2004) ; análogos de 3-desoxi-D-mio-inositol (por ejemplo Solicitud de E.U.A. No. 20040192779; Meuillet et al., Oncol . Res . , 14:513-27, 2004), tal como PX-316; análogos de 2' -sustituido, 3' -desoxi-fosfatidil-mio-inositol (por ejemplo Tabellini et al., Br. J. Haema tol . , 126(4) ;584-82, 2004) . derivados heteroarilo fusionados (Patente de E.U.A.

No. 6,608,056); derivados 3- (imidazol [1, 2-a] piridin-3-ilo) (por ejemplo patentes de E.U.A. Nos. 6,403,588 y 6,653,320); Ly294002 (por ejemplo Vlahos, et al., J. Biol . , Chem . , 269(7) 5241-5248, 1994); derivados de quinazolina-4-ona tales como IC486068 (por ejemplo, Solicitud de E.U.A. No. 20020161014; Geng et al., Cáncer Res . , 64:4893-99, 2004); derivados de benzo (b) tiofeno sustituidos con 3-(hetero) ariloxi (por ejemplo WO 04 108715; también WO 04 108713) ; viridinas, que incluye viridinas semisintéticas tales como PX-866 (éster ( ÍS, 4E, 10R, 11R, 13S, 14R) - [4-dialilaminómetilen-6-hidroxi-1-metoximetil-10, 13-dimetil-3,7, 17-tioxo-l,3,4,7,10, 11,12,13,14,15,16, 17-dodecahidro-2-oxa-ciclopenta [a] fenantren-11-ílico de ácido acético) (por ejemplo Ihle et al., Mol Cáncer Ther . , 3(7): 763-72, 2004; Solicitud de E.U.A. No. 20020037276; Patente de E.U.A. 5,726,167); y wortmanina y derivados de los mismos (por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,504,103; 5,480,906, 5,468,773; 5,441,947; 5,378,725; 3,668,222). Los ejemplos de inhibidores de Akt-cinasa (también conocida como proteína cinasa B) incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, Akt-1-1 (inhibe Aktl) (Barnett et al., Biochem J. , 385 (Pt.2) :399-408, 2005) ; Akt-1-1,2 (inhibe Akl y 2) (Barnett et al., Biochem , J. , 385 (Pt. 2):399-408, 2005; API-59CJ-0me (por ejemplo Jin et al., Br . J.

Cáncer. , 91:1808-12, 2004); compuestos de 1-H-imidazo [4, 5-c] piridinilo (por ejemplo WO05011700) ; indol-3-carbinol y derivados de los mismos (por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 6,656,963; Sarkar and Li, JJ Nutr. , 134(12 Suppl) : 3493S-3498S, 2004); perifosina (por ejemplo, interfiere con la localización en membrana de Akt; Dasmahapatra et al., Clin . Cáncer Res . , 10 ( 15) ; 5242-52, 2004); análogos de lípido de fosfatidilinositol éter (por ejemplo Gills and Dennis, Expert . Opin . Investig. Drugs , 13:787-97, 2004); triciribina (TCN o API-2 o identificador NCI: NSC 154020; Yang et al., Cáncer Res., 64:4394-9, 2004). Los ejemplos de inhibidores de mTOR incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a mejorador de FKBP12; rapamicinas y derivados de las mismas que incluyen: CCI-779 (temsirolimus) RAD001 (Everolimus; WO 9409010); TAFA93 y AP23573; rapálogos, por ejemplo los descritos en WO 98/02441 y WO 01/14387, por ejemplo AP23573, AP23464, AP23675 o AP23841; 40- (2-hidroxietil) rapamicina, 40- [3-hidroxi (hidroximetil) metilpropanoato] -rapamicina (también denominado CC1779) , 40-epi- (tetrazolit) -rapamicina (también denominado ABT578), 32-desoxirapamicina, 16-pentiniloxi-32 (S) -dihidrorrapamicina y otros derivados descritos en el documento WO 05005434; derivados descritos en los documentos USP 5,258,389, WO 94/090101, WO 92/05179, USP 5,118,677, USP 5,118,678, USP 5,100,883, USP 5,151,413, USP 5,120,842, WO 93/111130, WO 94/02136, WO 94/02485, WO 95/14023, WO 94/02136, WO 95/16691 (por ejemplo SAR 943), EP 509795, WO 96/41807, WO 96/41807 y USP 5,256,790; derivados de rapamicina que contienen fósforos (por ejemplo WO 05016252); derivados de 4H-l-benzopiran-4-ona (por ejemplo , Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/528,340). Ejemplos de compuestos en uso preclínico o clínico que incluyen, por ejemplo AP23573, AP24841, CCI-779 y RAD001. Ejemplos de inhibidores de fosfat?d?lmos?tol-3-cinasa (Pl3-cinasa) de interés son wortmanma y los derivados o análogos de los mismos y sales de wortmanina farmacéuticamente aceptables y sus derivados y análogos. En consecuencia, los métodos de esta invención incluyen el uso de inhibidores de PI3-cmasa de fórmula W: wortmanma (W) derivados o análogos del compuesto de fórmula W, sales farmacéuticamente aceptables del compuesto de fórmula W y sales farmacéuticamente aceptables de los derivados o análogos del compuesto de fórmula W. La referencia a los derivados y análogos de wortmanina o el compuesto de "fórmula W" en la presente se pretende que incluya los derivados y análogos identificados en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,504,103; 5,480,906, 5,468,773; 5,441,947; 5,378,725; 3,668,222. Los derivados adecuados y análogos del compuesto de fórmula W incluyen: a) compuestos de fórmula Wl en donde R es H ( 11-desacetoxiwortmanina) o acetoxi y R' es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, b) compuestos de ?9, 11-deshidrodesacetoxiwortmanina y fórmula W2 en donde R' es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, c) compuestos de 17 ( -dihidro-wortmanina de fórmula en donde R es H o acetoxi y R' es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono y R" es H, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -C(0)OH o -C (O) O-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; d) ácido de anillo A abierto o éster de compuestos de wortmanina de fórmula W4 en donde Ri es H, metilo o etilo y R2 es H o metilo, e) derivados 11-sustituidos y 17-sustituidos de wortamina de fórmula W5 en donde R es =0 u -0(C0)R6, R3 es =0, -OH o -0(C0)R6 cada R6 es independientemente fenilo, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido en R4 es =0 o -OH, R3 no es =0. El compuesto con la estructura de fórmula (I) el cual corresponde a la metilamida del ácido 4 { - [3- (4-cloro-3-trifluorometilfenil) -ureido] -3-fluorofenoxi } -piperidin-2-carboxílico, sales, polimorfos, solvatos, hidratos, metabolitos y fármacos precursores farmacéuticamente aceptables de los mismos se denominan colectivamente en la presente como los "compuestos de fórmula I" . La fórmula (I) es como se indica a continuación: En donde la forma plural de las palabras compuestos, sales y similares utilizadas en la presente, se considera que significa también un compuesto, sal o similar solo. A menos que se indique de otra manera, el término alquilo de 1 a 6 átomos de carbono significa grupos alquilo de cadena lineal, ramificada o cíclica que tiene de 1 a 6 átomos de carbono los cuales pueden ser cíclicos, lineales o ramificados con ramificación única o múltiple. Dichos grupos incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, secbutilo, terbutilo, ciclopropilo, ciclobutilo y similares. La presente invención también se relaciona con formas útiles de los compuestos como se describen en la presente, tales como sales y metabolitos farmacéuticamente aceptables. La presente invención también se relaciona con fármacos precursores del compuesto de fórmula (I). El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de adición de ácido inorgánica u orgánica relativamente no tóxica de un compuesto de la presente invención. Véase, por ejemplo, S. M. Berge. et al . Pharmaceuticals Salts", JJ Pharm . Sci . 1977, 66, 1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas obtenidas al hacer reaccionar el compuesto principal, que funciona como una base, con un ácido inorgánico u orgánico para formar una sal, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metansulfónico, ácido camforsulfónico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico y ácido cítrico. Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen aquellas en las cuales el compuesto principal funciona como un ácido y se hace reaccionr con una base apropiada para formar, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio y colina. Los expertos en la técnica reconocerán además que las sales de adición de ácido de los compuestos que se reclaman se pueden preparar por reacción de los compuestos con el ácido inorgánico u orgánico apropiado vía cualquiera de numerosos métodos conocidos. Alternativamente, las sales de metal alcalino y alcalinotérreo se preparan al hacer reaccionar los compuestos de la invención con la base apropiada vía una variedad de métodos conocidos.

Las sales representativas de los compuestos de esta invención incluyen sales no tóxicas convencionales y sales de amonio cuaternario las cuales se forman, por ejemplo, a partir de ácidos o bases inorgánicas u orgánicas por medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, dichas sales de adición de ácido incluyen; acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, cinamato, ciclopentanpropionato digluconato, dodecilsulfato, etansulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, hidroyoduro, 2-hidroxietansulfonato, itaconato, lactato, maleato, mandelato, metansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 2-fenilpropinoato, picrato, pivalato, propionato, succinato, sulfonato, tartrato, tiocianato, tosilato, trifluorometansulfonato y undecanoato. Las sales de base incluyen sales de metal alcalino tales como sales de potasio y sodio, sales de metal alcalinotérreo tales como sales de calcio y magnesio y sales de amonio con bases orgánicas tales como diciciohexilamina y N-metil-D-glucamina . Adicionalmente, los grupos que contienen nitrógeno básico se pueden cuaternizar con dichos agentes como haluros de alquilo inferior tales como cloruros, bromuros y yoduros de: metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo como sulfato de dimetilo, dietilo y dibutilo; y sulfatos de diamilo, haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de: decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de arilo o aralquilo como bromuros de bencilo y fenetilo y otros haluros de aralquilo monosustituidos o haluros de aralquilo polisustituidos . Para los propósitos de la invención, los solvatos son aquellas formas de los compuestos en donde las moléculas de solvente forman un complejo en el estado sólido e incluyen, pero no se limitan, por ejemplo a etanol y metanol. Los hidratos son una forma específica de solvatos, en donde la molécula de solvente es agua. Algunos agentes farmacológicamente activos se pueden modificar adicionalmente con grupos funcioales lábiles que se separan después de administración in vivo para suministrar un agente activo de origen y un grupo derivatizante farmacológicamente inactivo. Estos derivados, denominados comúnmente como fármacos precursores se pueden utilizar, por ejemplo, para alterar las propiedades fisicoquímicas del agente activo, para dirigir al agente activo hacia un tejido específico, para alterar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del agente activo y para reducir los efectos secundarios indeseables. Los fármacos precursores de la invención incluyen, por ejemplo, los esteres de los compuestos apropiados de esta invención que son esteres farmacéuticamente aceptables bien tolerados tales como esteres de alquilo que incluyen esteres de: metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo o pentilo. Se pueden utilizar esteres adicionales tales como fenilalquilo de 1 a 5 átomos de carbono, aunque se prefiere el éster de metilo. Los métodos los cuales se pueden utilizar para sintetizar otros fármacos precursores se describen en las siguientes revisiones del tema, las cuales se incorporan en la presente como referencia en la descripción de estos métodos de síntesis: • Higuchi, TJ ; Stella, V. eds. Produgs As Novel Drug Delivery Systems . ACS ?ymposium Series. American Chemical Society: Washington, DC (1975) . • Roche, E. B. Design of Biopharmaceuti cal Properties through Produgs and Analogs . American Pharmaceutical Association: Washington, DC (1977). Sinkula, A. A.; Yalkowsky, S. H. J Pharm Sci . 1875, 64 , 181-210. • Stella, V. J. ; Charman, W. N. Naringrekar, V. H. Drugs 1985, 29, 455-473. Bundgaard H., ed Design of Prodrugs . Elsevier: Nueva York (1985) . Stella, V. J.; Him elstein, K, J. J. Med. Chem . 1980, 23, 1275-1282.

Han, H-K; Amidon, G. L. AAPS Pharmsci 2000, 2 , 1- 11. Denny, W. A. Eur. J. Med. Chem . 2001, 36, 577-595. • Wermuth, C. G. in Wermuth, C. G. ed. The Pra ctice of Medicinal Chemistry Academic Press: San Diego (1996), 697-715. • Balant, L. P.; Doelker, E. in Wolff, M. E. ed. Burgers Medicinal Chemistry And Drug Discovery John Wiley & Sons: Nueva York (1997), 949-982.

Los metabolitos de los compuestos de esta invención incluyen derivados oxidados de los compuestos de fórmula I, en donde uno o más nitrógenos están sustituidos con un grupo hidroxi; los cuales incluyen derivados con el átomo de nitrógeno del grupo piridina en la forma de óxido, denominados en la técnica como 1-oxo-piridina o tienen un sustituyente hidroxi, denominado en la técnica como 1-hidroxi-piridina.

Métodos Generales de Preparación Los compuestos de la invención se pueden preparar mediante el uso de reacciones y procedimientos químicos conocidos como se describe, por ejemplo, en la siguiente solicitud internacional publicada WO 2005/009961. Los compuestos de fórmula I se han caracterizado previamente por tener diversas actividades que incluyen inhibir la vía Raf/MEK/ERK, raf cinasa, p38 cinasa, VEGFR cinasa y PDGFR cinasa. Estas actividades y su uso para tratar diversas enfermedades y condiciones se describen, por ejemplo, en WO 2005/009961, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

Indicaciones Las combinaciones de medicamento de la presente invención se pueden utilizar para tratar cualquier enfermedad o condición que esté relacionada o que sea mediada por las vías celulares, moduladas por los compuestos que comprenden las combinaciones. Estas vías incluyen, pero no se limitan a vías de señalización las cuales comprenden, por ejemplo, VEGFR, VEGFR2, Raf/Mek/Erk, Akt/PI3K, MTOR, PTEN, etcétera (véase también lo anterior) . Las combinaciones de medicamento pueden ser útiles para tratar enfermedades que están relacionadas o que son mediadas por mutaciones en uno o más genes presentes en estas vías, que incluyen mutaciones asociadas con cáncer en PTEN, ras, Raf, Akt, PI3K, etcétera. Como se menciona en lo anterior, aunque los compuestos pueden ser conocidos como inhibidores específicos, la presente invención incluye cualquier efecto disminuyente o terapéuticos sin importar el mecanismo de acción o cómo se obtiene. La combinación de medicamentos puede tener una o más de las siguientes actividades que incluyen: antiproliferativa, antitumoral; antiangiogénica; inhibidora de proliferación de células endoteliales o tumorales; antineoplásica; inmunosupresora; inmunomoduladora; promotora de apoptosis, etcétera. Las condiciones o enfermedades que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen trastornos proliferativos (tal como cáncer), trastornos inflamatorios, trastornos inmunomoduladores, alergia, enfermedades autoinmunes (tales como artritis reumatoide o esclerosis múltiple), angiogénesis anormal o excesiva, etcétera. Cualquier tumor o cáncer puede ser tratado e incluye, pero no se limita a cánceres que tienen una o más mutaciones en raf-VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-ß, Flt-3, ras, PTEN, Akt, PI3K, mTOR, así como cualquier miembro corriente arriba o corriente debajo de las vías de señalización de los cuales son una parte. El tumor o cáncer se puede tratar con una combinación de medicamentos de la presente invención sin importar el mecanismo que es responsable de la misma. Se pueden tratar cánceres de cualquier órgano incluyendo cánceres, pero sin limitarse a, por ejemplo, cáncer de colon, páncreas, mama, próstata, hueso, hígado, riñon, pulmón, testículos, piel, páncreas, estómago, próstata, ovario, útero, cabeza y cuello, células sanguíneas, linfa, etcétera. Las neoplasias pueden ser tratados de acuerdo con la presente invención incluyen especialmente, pero no se limitan a tumores cerebrales, cáncer de mama, sarcoma óseo (por ejemplo osteosarcoma y sarcoma de Ewings) , bronquial premaligno, cáncer endometrial, glioblastoma, cánceres malignos hematológicos, carcinoma hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, neoplasmas renales, leucemia, leimiosarcoma, liposarcoma, linfoma, enfermedad de Lhermitte-Duclose, glioma maligno, melanoma, melanoma maligno, metástasis, mieloma múltiple, metaplasia mieloide, síndromes mieloplásicos, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma de células renales (por ejemplo avanzado, avanzado refractario) , rabdomiosarcoma, sarcoma de tejido suave, carcinoma epitelial escamoso de la piel, cánceres asociados con pérdida de la función de PTEN; Akt activado (por ejemplo tumores nulos PTEN y tumores con mutaciones ras) . Los ejemplos de cáncer de mama incluyen, pero no se limitan a carcinoma invasivo de los ductos, carcinoma invasivo de los lóbulos, carcinoma de los ductos in situ y carinoma lobular in si tu . Los ejemplos de cánceres de las vías respiratorias, incluyen, pero no se limitan a carcinoma de pulmón microcítico, amicrocítico, adenoma bronquial y blastoma pleuropulmonar . Los ejemplos de cánceres de cerebro incluyen, pero no se limitan a daño cerebral, glioma hipoftálmico, astrocitoma cereberal y cerebral, meduloblastoma, ependimoma y tumor neuroectodérmico y pineal. Los tumores de los órganos reproductivos masculinos incluyen, pero no se limitan a cáncer de próstata y testicular. Los tumores de los órganos reproductores femeninos, incluyen, pero no se limitan a cáncer endometrial, cervical, ovárico, vaginal y vulvar así como sarcoma del útero. Los tumores del tracto digestivo incluyen, pero no se limitan a colon, colorrectal, esofágico, de la vesícula biliar, gástrico, pancreático, rectal, del intestino delgado y cánceres de las glándulas salivales. Los tumores de las vías urinarias incluyen, pero no se limitan a vejiga, pene, riñon, pelvis renal, uréter y cáncer uretral. Las neoplasias en los ojos, incluyen, pero no se limitan a melanoma intraocular y retinoblastoma. Los ejemplos de cáncer hepático incluyen, pero no se limitan a carcinoma hepatocelular (carcinomas de células hepáticas con o sin variante fibrolamelar) , colangiocarcinoma (carcinoma del ducto biliar intrahepático) y colangiocarcinoma hepatocelular mixto. Las neoplasias de piel incluyen, pero no se limitan a carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, cáncer cutáneo de células de Merkel y cáncer cutáneo sin melanoma. Las neoplasias de las vías respiratorias y digestivas altas incluyen, pero no se limitan a cánceres laríngeo, hipofaríngeo, nasofaríngeo y/u orofaríngeo y cáncer de los labios y de la cavidad bucal. Los linfomas incluyen, pero no se limitan a linfoma relacionado con SIDA, linfoma no Hodgkiniano, linfoma de linfocitos T cutáneo, enfermedad de Hodgkin y linfoma del sistema nervioso central. Los sarcomas incluyen, pero no se limitan a sarcoma del tejido suave, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfosarcoma y rabdomiosarcoma . Las leucemias incluyen, pero no se limitan a leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia de tricoleucocitos . Además de inhibir la proliferación de células tumorales, las combinaciones de medicamentos de la presente invención también pueden provocar regresión de tumor, por ejemplo una disminución en el tamaño de un tumor o en el grado de cáncer en el cuerpo. Se da preferencia al tratamiento de melanoma, cáncer renal, cáncer hepatocelular, cáncer pulmonar amicrocítico, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama o cáncer pancreático.

Las condiciones y trastornos relacionados con angiogénesis también se pueden tratar con combinaciones de medicamento de la presente invención. La expresión inapropiada y ectópica de angiofénesis puede ser perjudicial para un organismo. Muchas condiciones patológicas están relacionadas con el crecimiento de vasos sanguíneos extraños. Estos incluyen, por ejemplo, retinopatía diabética, glaucoma neovascular, psoriasis, fibroplasias retrocristalinas, angiofibroma, inflamación, restenosis, etcétera. Además, el suministro sanguíneo aumentado que se relaciona con tejido canceroso y neoplásico, alienta el crecimiento lo que genera un agrandamiento rápido del tumor y metástasis. Además, el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos en un tumor proporciona una vía de escape de células renegade, que alientan la metástasis y la consecuente dispersión del cáncer. Los sistemas útiles para modular la angiogénesis incluyen, por ejemplo, neovascularización de explantes de tumor (por ejemplo las Patentes de E.U.A. Nos. 5,192,744; 6,024,688), análisis en membrana corioalantoides de pollo (CAM, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, Taylor and Folkman, Nature, 297:307-312, 1982; Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140, 125-1263, 1998), análisis de células endoteliales capilares bovinas (BCE, por sus siglas en inglés) (por ejemplo Patente de E.U.A. No. 6,024,688; Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol., 198: 440-450, 1991), análisis de migración y análisis de inhibición de crecimiento de HUVEC (siglas en inglés para célula endotelial vascular de cordón umbilical humano) (por ejemplo Patente de E.U.A. No. 6,060,449). Además, los sistemas útiles para modular linfangiogénesis, incluyen por ejemplo, el modelo de oreja de conejo (por ejemplo Szuba et al., FASEB J. , 16 ( 1 ): 1985-7 , 2002). La modulación de angiogénesis se puede determinar por cualquier método adecuado. Por ejemplo, el grado de vascularidad de tejido se determina típicamente al establecer el número y densidad de vasos presentes en una muestra dada. Por ejemplo, se puede calcular la densidad de microvasos (MVD, por sus siglas en inglés) al contar el número de grupos endoteliales en un campo microscópico de alta potencia o al detectar un marcador específico para endotelio microvascular u otros marcadores de vasos sanguíneos en crecimiento o establecidos, tales como CD31 (también conocida como molécula de adhesión plaquetaria-células endoteliales o PECAM, por sus siglas en inglés) . Se puede utilizar un anticuerpo CD31 en métodos inmunohistológicos convencionales para inmunoteñir secciones de tejido como se describe, por ejemplo en Penfold et al., Br. J. Oral and Maxill. Surg., 34; 37-41; Patente de E.U.A. No. 6,017,949; Dellas et al., Gyn. Oncol., 67:27-33, 1997; y otros. Otros marcadores para angiogénesis incluyen, por ejemplo, Vezfl (por ejemplo Xiang et al., Dev. Bio., 206:123-141, 1999), angiopoyetina, Tie-1 y Tie-2 (por ejemplo Sato et al., Nature, 376:70-74, 1995). Las combinaciones de medicamentos de esta invención también tienen una actividad terapéutica amplia para tratar o evitar el progreso de una gama amplia de enfermedades tales como condiciones inflamatorias, restenosis coronaria, angiogénesis asociada a tumor, aterosclerosis, enfermedades autoinmunes, inflamación, ciertas enfermedades renales asociadas con proliferación de células glomerulares o del mesangio y enfermedades oculares relacionadas con proliferación de vasos de la retina, psoriasis, cirrosis hepática, diabetes, aterosclerosis, restenosis, restenosis de injerto vascular, restenosis en endoprótesis vascular, angiogénesis, enfermedades oculares, fibrosis pulmonar, bronquiolitis oblitertiva, nefritis glomerular y artritis reumatoide. La presente invención también proporciona el tratar, evitar, modular, etcétera una o más de las siguientes condiciones en humanos y/u otros mamíferos: retinopatía que incluye retinopatía diabética, oclusión isquémica de la vena de la retina, retinopatía de premadurez, y degeneración macular relacionada con la edad. Artritis reumatoide, psoriasis o trastorno buloso asociado con formación de vejigas subepidérmicas que incluye penfigoide buloso, eritema multiforme o dermatitis herpetiforme, fiebre reumática, resorción ósea, osteoporosis postmenopáusica, septicemia, septicemia por gram negativos, choque septicémico, choque endotóxico, síndrome de choque tóxico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, enfermedad de intestino inflamatorio (enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) , reacción de Jarisch-Herxheimer, asma, síndrome de malestar respiratorio adulto, enfermedad fibrótica pulmonar aguda, sarcoidosis pulmonar, enfermedad respiratoria alérgica, silicosis, neumoconiosis de trabajadores del carbón, daño alveolar, insuficiencia hepática, hepatopatía durante inflamación aguda, hepatitis alcohólica grave, paludismo (paludismo por Plasmodi um falciparum y paludismo cerebral) , diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM, por sus siglas en inglés) , insuficiencia cardíaca congestiva, daño posterior a cardiopatía, aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer, encefalitis aguda, daño al cerebro, esclerosis múltiple (desmieliniación y pérdida de oligodendrocitos en esclerosis múltiple) , cáncer avanzado, cáncer maligno linfoide, pancreatitis, sanado de heridas dañado en infección, inflamación y cáncer, síndromes mielodisplásicos, lupus eritematoso sistémico, cirrosis hepática, necrosis de intestino, daño/toxicidad por radiación después de administración de anticuerpos monoclonales, reacción de rechazo inverso (daño por isquemia-reperfusión y rechazos de aloinjertos de riñon, hígado, corazón y piel), rechazo de aloinjerto pulmonar (bronquitis obliterativa) o complicaciones debido a sustitución total de la cadera, y una enfermedad infecciosa seleccionada de tuberculosis, infección por Helicobacter pylori durante enfermedad de úlcera péptica, enfermedad de Chagas que resulta de infección por Tripanosoma cruzi, efecto de la toxina similar a Shiga que resulta de infección por E . coli , efectos de la enterotoxina A que resulta de la infección por Staphylococcus , infección meningocócica e infecciones por Borrelia burgdorferi , Treponema pallidum , citomegalovirus, virus de influenza, virus de encefalomielitis de Theiler y virus de inmunodeficiencia humana (VIH), papiloma, blastoglioma, sarcoma de Kaposi, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, astrocitoma, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin, enfermedad de Burkitt, artritis, artritis reumatoide, retinopatía diabética, angiogénesis, restenosis, restenosis en endoprótesis vascular, restenosis de injerto vascular, fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, ateroesclerosis, glomerulonefritis, nefropatía diabética, síndrome de micoangiopatía trómbica, rechazo de transplante, psoriasis, diabetes, sanado de heridas, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, trastornos hiperinmunes, hemangioma, angiogénesis del miocardio, vascularización colateral coronaria y cerebral, isquemia, enfermedades de la córnea, rubeosis, glaucoma nevoascular, degeneración macular de retinopatía de premadurez, sanado de heridas, úlcera, enfermedades relacionadas con Helicobacter, fracturas, endometriosis, una condición diabética, fiebre de rascado de gato, hiperplasia tiroidea, asma o edema posterior a quemaduras, traumatismo, enfermedad pulmonar crónica, apoplejía, pólipos, quistes, sinovitis, inflamación crónica y alérgica, síndrome de hiperestimulación del ovario, edema pulmonar y cerebral, queloide, fibrosis, cirrosis, síndrome de túnel metacarpiano, síndrome de malestar respiratorio adulto, ascitis, una condición ocular, una condición cardiovascular, enfermedad de Crow-Fukase (POEMS), enfermedad de Crohn, glomerulonofritis, osteartritis, esclerosis múltiple, rechazo de injertos, enfermedad de Lyme, septicemia, enfermedad de von Hippel Lindau, penfigoides, enfermedad de Paget, enfermedad renal poliquística, sarcoidosis, tiroiditis, síndrome de hiperviscosidad, enfermedad de Osler-Weber-Rendu, enfermedad pulmonar oclusiva crónica, radiación, hipoxia, preeclampsia, menometrorragia, endometriosis, infección por herpes simple, retinopatía isquémica, angiogénesis de la córnea, herpes Zoster, virus de inmunodeficiencia humana, parapoxivirus, protozoarios, toxoplasmosis, espondilartritis, espondilitis anquilosante, Morbus Bechterew, ifluencia aviar que incluye por ejemplo el serotipo H5N1 y efusiones asociadas a tumor y edema. La presente invención proporciona métodos para tratar cualquiera de las enfermedades y/o condiciones mencionadas antes (incluyendo aquellas mencionadas en cualquiera de las referencias citadas) que comprende administrar cantidades eficaces de un compuesto de fórmula I y por lo menos un segundo compuesto que es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT (por ejemplo rapamicina o un derivado o análogo de rapamicina, o wortmanina o un derivado o análogo de wortmanina) . Una "cantidad eficaz" es la cantidad del compuesto que es útil para obtener el resultado deseado, por ejemplo para tratar la enfermedad o condición. La presente invención también se relaciona con método para inhibir angiogénesis en un sistema que comprende células, que comprende administrar al sistema una combinación de cantidades eficaces de compuestos descritos en la presente. Un sistema que comprende células puede ser un sistema in vivo tal como un tumor en un paciente, órganos aislados, tejidos o células, sistemas de análisis in vitro (CAM, BCE, etcétera) , modelos animales (por ejemplo in vivo, subcutáneos, modelos de cáncer), hospedadores en necesidad de tratamiento (por ejemplo hospedadores que padecen de enfermedades que tienen un componente angiogénico tal como cáncer; que experimentan restenosis), etcétera. Además, las combinaciones de medicamentos se puede administrar para modular uno o más de los siguientes procedimientos, crecimiento celular (por ejemplo proliferación) , crecimiento de células tumorales (que incluye, por ejemplo, diferenciación, supervivencia celular y/o proliferación) regresión de tumor, crecimiento de células endoteliales (que incluye, por ejemplo, diferenciación, supervivencia celular y/o proliferación) , angiogénesis (crecimiento de vaso sanguíneo) , angiogénesis y/o hematopoyesis (por ejemplo proliferación, desarrollo de linfocitos T, etcétera) . Los compuestos o combinaciones de medicamentos de la presente invención se pueden administrar en cualquier forma por cualquier ruta eficaz que incluye, por ejemplo, oral, parenteral, enteral, intravenosa, intraperitoneal, tópica, transdérmica (por ejemplo utilizando un parche estándar) , oftálmica, nasal, local, no oral, tal como en aerosol, inhalación, subcutánea, intramuscular, bucal, sublingual, rectal, vaginal, intra-arterial e intratecal, etcétera. Se pueden administrar solos o en combinación con cualquier ingrediente, activo o inactivo. Se pueden administrar en cualquier dosificación eficaz, por ejemplo, desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal total. Las combinaciones de la presente invención se pueden administrar en cualquier momento y en cualquier forma eficaz.

Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar simultáneamente, por ejemplo, como una composición única o unidad de dosificación (por ejemplo una pildora o un líquido que contiene ambas composiciones) o se pueden administrar como composiciones separadas pero al mismo tiempo (por ejemplo, cuando un medicamento se administra intravenosamente y el otro se administra por vía oral o intramuscular. Los medicamentos también se pueden administrar secuencialmente en momentos diferentes. Los agentes se pueden formular convencionalmente para obtener las tasas de liberación deseadas por períodos de tiempo prolongados, por ejemplo 12 horas, 24 horas. Esto se puede obtener mediante el uso de agentes y/o sus derivados los cuales tienen semividas metabólicas adecuadas y/o mediante el uso de formulaciones de liberación controlada. Las combinaciones de medicamentos pueden ser sinergísticas, por ejemplo, cuando la acción conjunta de los medicamentos es tal que el efecto combinado es mayor que la suma algebraica de sus efectos individuales. De esta manera se pueden administrar cantidades reducidas de los medicamentos, por ejemplo para reducir la toxicidad u otros efectos perjudiciales o no deseados y/o utilizando las mismas cantidades a las utilizadas cuando los agentes se administran solos, pero obteniendo una mayor eficacia, por ejemplo, al tener una acción antiproliferativa o proapoptócica más potente.

Los compuestos o combinaciones de medicamentos de la presente invención se pueden combinar adicionalmente con cualquier otro aditivo adecuado o portador farmacéuticamente aceptable. Estos aditivos incluyen cualquiera de las sustancias ya mencionadas así como cualquiera de aquellos utilizados convencionalmente, tales como aquellos descritos en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro and Gennaro, eds, 20 edición, Lippincott Williams & Wilkins, 2000) ; Theory and Practice of Industrial Pharmacy (Lachman et al., eds., 3ra edición, Lippincott Williams & Silkins, 1986); Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (Swarbrick and Boylan, eds., 2da edición, Marcel Dekker, 2002). Estos se pueden denominar en la presente como "portadores farmacéuticamente aceptable" para indicar que se combinan con el medicamento activo y se pueden administrar de manera segura a un sujeto con propósitos terapéuticos. Además, los compuestos o combinaciones de medicamentos de la presente invención se pueden administrar con otros agentes activos o tratamientos (por ejemplo radiación) que se utilizan para tratar cualquiera de las enfermedades y/o condiciones mencionadas antes. La presente invención proporciona combinaciones de por lo menos un compuesto de fórmula I y por lo menos un segundo compuesto el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT útil para tratar la enfermedad o trastorno. Las "combinaciones" para propósitos de la invención incluyen: composiciones únicas o formas de dosificación las cuales contienen por lo menos un compuesto de fórmula I y por lo menos un segundo compuesto el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT; paquetes de combinación que contienen por lo menos un compuesto de fórmula I y por lo menos un segundo compuesto el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT para ser administrado de manera concurrente o secuencial; kits los cuales comprenden por lo menos un compuesto de fórmula I y por lo menos un segundo compuesto el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT empacado separado uno del otro como dosificaciones unitarias o como dosificaciones unitarias independientes con o sin instrucciones de que se administren de manera concurrente o secuencial; y formas de dosificación independiente separadas de por lo menos un compuesto de fórmula I y por lo menos un segundo compuesto el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT el cual coopera para obtener un efecto terapéutico, por ejemplo, profilaxis o tratamiento de la misma enfermedad, cuando se administra de manera concurrente o secuencial.

La dosificación de cada agente de la combinación se puede seleccionar con referencia al otro y/o el tipo de enfermedad y/o estado de la enfermedad con el fin de proporcionar la actividad terapéutica deseada. Por ejemplo, los ingredientes activos en combinación pueden estar presentes y se pueden administrar en una combinación fija. El término "combinación fija" se pretende aquí que signifique formas farmacéuticas en las cuales están presentes los componentes en una proporción fija que proporcione la eficacia deseada. Estas cantidades se pueden determinar de manera sistemática para un paciente en particular en donde se utilizan diversos parámetros para seleccionar la dosificación apropiada (por ejemplo otro tipo de cáncer, edad del paciente, estado de enfermedad, salud del paciente, peso, etcétera) o las cantidades pueden ser relativamente estándar. La combinación puede comprender cantidades eficaces de por lo menos un compuesto de fórmula I y por lo menos un segundo compuesto el cual es inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT, el cual obtiene una mayor eficacia terapéutica que cuando cualquiera de los compuestos se utiliza solo. La combinación puede ser útil para producir regresión de tumor, para producir estabilidad de enfermedad, para evitar o reducir metástasis u otros criterios de valoración terapéuticos, en donde el efecto terapéutico no se observa cuando los agentes se utilizan solos o cuando se observa un efecto incrementado cuando se administra la combinación. Las proporciones relativas de cada compuesto en la combinación también se pueden seleccionar en base en sus mecanismos de acción respectivos y la biología de la enfermedad. Por ejemplo, las mutaciones activantes del gen B-RAF se observa además de 60% de los melanomas humanos y una composición para el tratamiento de melanoma puede comprender ventajosamente un compuesto de fórmula I en una cantidad más potente que la del compuesto el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT. En comparación; cuando un cáncer se asocia con una mutación en la vía de señalización PI3K/AKT (por ejemplo cánceres de ovario y mama), un agente el cual tenga actividad en esta vía de señalización puede estar presente en cantidades mayores en relación al inhibidor de la vía Ref/MEK/ERK. Las proporciones relativas de cada compuesto pueden variar ampliamente y esta invención incluye combinaciones para tratar cáncer en donde las cantidades del compuesto de fórmula I y el segundo agente activo se pueden ajustar rutinariamente de manera que ambas estén presentes en cantidades mayores. La liberación de uno o más agentes de la combinación también se puede controlar, cuando sea apropiado, para proporcionar la actividad terapéutica deseada cuando está en una forma de dosificación única, en un paquete de combinación, en un kit o cuando esté en forma de dosificación independientes separadas.

Análisis La actividad de las combinaciones de la presente invención se puede determinar de acuerdo con cualquier método eficaz in vi tro o in vivo .

Actividad de cinasa La actividad de cinasa se puede determinar de manera sistemática utilizando métodos de análisis convencionales. El análisis para cinasa típicamente comprende a la enzima cinasa, sustratos, amortiguadores y componentes de un sistema de detección. Un análisis típico para cinasa involucra la reacción de una proteína cinasa con un sustrato peptídico y ATP, tal como 32P-ATP para producir un producto final fosforilado (por ejemplo, una fosfoproteína cuando se utiliza un sustrato peptídico) . El producto final resultante se puede detectar utilizando cualquier método adecuado. Cuando se utiliza ATP radioactivo se puede separar una fosfoproteína marcada radioactivamente de ?-32P-ATP que no ha reaccionado utilizando una membrana de afinidad o electroforesis en gel, y después se visualiza en el gel utilizando autorradiografía o se detecta con un contador de centelleo. También se pueden utilizar métodos no radioactivos. Los métodos pueden utilizar un anticuerpo el cual reconoce al sustrato fosforilado, por ejemplo un anticuerpo anti-fosfotirosina. Por ejemplo, se puede incubar una enzima cinasa con un sustrato en presencia de ATP y amortiguador de cinasa bajo condiciones las cuales son eficaces para que la enzima fosforile al sustrato. La mezcla de reacción se puede separar, por ejemplo electroforéticamente y después se puede medir la fosforilación del sustrato, por ejemplo mediante la prueba Western blotting utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina. El anticuerpo se puede marcar con una marca detectable, por ejemplo una enzima tal como HRP, avidina o biotina, reactivos quimioluminiscentes, etcétera. Otros métodos pueden utilizar los formatos de ELISA, separación por membrana de afinidad, análisis de polarización de fluorescencia, análisis luminiscentes, etcétera. Una alternativa al formato radioactivo es la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia separada en tiempo (TR-FRET, por sus siglas en inglés) . Este método sigue la reacción de cinasa estándar, en donde un sustrato, por ejemplo poli(GluTyr) biotinado se fosforila por una proteína cinasa en presencia de ATP. El producto final se puede detectar con un anticuerpo fosfoespecífico de quelato de europio (anti-fosfotirosina o fosfoserina/trionina) y estreptavidina-APC, la cual se une al sustrato biotinado. Estos dos componentes se unen espacialmente por la unión y la transferencia de energía del anticuerpo fosfoespecífico al receptor (SA-APC) produce una lectura fluorescente en un formato homogéneo.

Actividad de Raf/MEK/ERK Se puede' realizar un análisis de c-Raf cinasa con la enzima c-Raf activada (fosforilada) por Lck cinasa. Se produce c-Raf activada por Lck (Lck/c-Raf) en célula de insecto Sf9 por coinfección de células con baculovirus que expresan, bajo el control del promotor de polihedrina, GST-c-Raf (desde el aminoácido 302 al aminoácido 648) y Lck (longitud completa) . Ambos baculovirus se utilizan a una multiplicidad de infección de 2.5 y las células se cosechan 48 horas después de la infección. Se produce proteína MEK-1 en célula de insecto Sf9 al infectar células con el baculovirus que expresa la proteína de fusión GST-MEK-1 (longitud completa) a una multiplicidad de infección de 5 y al cosechar las células 48 horas después de la infección. Se utiliza un procedimiento de purificación similar para GST-c-raf 302-648 y GST-MEK-1. Las células transfectadas se suspenden a 100 mg de biomasa de células húmedas por ml en un amortiguador que contiene fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 7.3, Tritón X-100 0.5% y la combinación de inhibidor de proteasa. Las células se rompen con un homogeneizador Polytron y se centrifugan a 30,000 g durante 30 minutos. El sobrenadante de los 30,000 g se aplica sobre GSH-Sepharose . La resina se lava con un amortiguador que contiene Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 150 mM y Tritón X-100 0.01%. Las proteínas etiquetadas con GST se eluyen con una solución que contiene glutation 100 mM, Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 150 mM y Tritón X-100 0.01%. Las proteínas purificadas se dializan en amortiguador que contiene Tris 20 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM y Glicerol 20%. Los compuestos de prueba inicialmente se diluyen en DMSO utilizando diluciones triples a concentraciones concentradas que varían típicamente de 50 µM a 20 nM (por ejemplo, concentraciones finales en el análisis pueden variar de 1 µM a 0.4 nM) . El análisis bioquímico de c-Raf se realiza como un análisis de estera de filtro radioactivo en placas de polipropileno Costar de 96 pozos (Costar 3365) . Las placas se cargan con 75 µl de solución que contiene HEPES 50 M, pH 7.5, NaCl 70 mM, 80 ng de Lck/c-Raf y 1 µg de MEK-1. Posteriormente se agregan a la reacción 2 µl de compuestos individuales ¡ diluidos de manera seriada antes de la adición de ATP. La reacción se inicia con 25 µl de solución de ATP que contiene ATP 5 µM y [33P]-ATP 0.3 µCi. Las placas se sellan y se incuban a 32 °C durante 1 hora. La reacción se suspende con la adición de 50 µl de ácido fosfórico 4% y se cosecha en estera de filtro P30 (PerkinElmer) utilizando un cosechador Wallac Tomtec. Las esteras de filtro se lavan en ácido fosfórico 1% primero y el segundo lugar con H20 desionizada. Los filtros se secan en un horno de microondas, se enjuagan en fluido de centelleo y se leen en un contador Wallac 1205 Betaplate (Wallac Inc., Atlanta, GA, E.U.A.) . Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición. % de inhibición = [100- (Tib/Ti) ] x 100 en donde Tib = (cuentas por minuto con inhibidor) -( fondo) Ti = (cuentas por minuto sin inhibidor) - (fondo) La actividad Raf también se puede monitorear para su capacidad para iniciar la cascada lo que genera la fosforilación de ERK (es decir, raf/MEK/ERK) , lo que resulta en fosfo-ERK. Un inmunoanálisis Bio-Plex fosfo-ERKl/2 se puede realizar como sigue: Un inmunoanálisis de 96 pozos fosfo-ERK (pERK) utilizando una plataforma de citometría de flujo láser se establece para medir la inhibición de pERK basal en las líneas de células. Se colocan en placas células MDA-MB-231 a 50,000 células por pozo en placas de microtitulación de 96 pozos en medio de crecimiento completo. Para efectos de los compuestos de prueba sobre la inhibición de pERKl/2 basal, el día siguiente después de la colocación en placa se transfieren células MDA-MB-231 a DMEM con BSA 0.1% y se incuban con los compuestos de prueba diluidos 1:3 hasta una concentración final de 3 mM a 12 nM en DMSO 0.1%. Las células se incuban con los compuestos de prueba durante 2 horas, se lavan y se lijan en amortiguador A de lisis y de célula completa Bio-Plex. Las muestras se diluyen con amortiguador B 1:1 (v/v) y se transfieren directamente a una placa de análisis o se congelan a -80°C hasta que se procesan. Se incuban 50 ml de lisado de células MDA-MB-231 diluidas con aproximadamente 2,000 esferas Bio-Plex de 5 micrómetros conjugados con anticuerpo anti-ERK1/2 durante la noche en un agitador a temperatura ambiente. Al día siguiente, se realiza el inmunoanálisis indirecto (tipo emparedado) de fosfo-ERKl/2 biotinado, las esferas se lavan 3 veces durante cada incubación y después se utilizan 50 ml de PE-estreptavidina como un reactivo de revelado. Las unidades de fluorescencia relativa de pERKl/2 se detectan al contar 25 esferas de células de flujo Bio-Plex (sonda) de alta sensibilidad. Se calcula la CI50 al tomar células no tratadas como máximo y sin células (únicamente esferas) como fondo.

Actividad de Fosfatidilinositol-3-cinasa Se puede determinar la actividad de PKI3 de manera sistemática, por ejemplo utilizando kits disponibles comercialmente (por ejemplo, Perkin-Elmer, FlashPlate Platform), Frew et al., Anticancer Res . , 14 ( 6B) : 242-8 , 1994. Véanse también las publicaciones incluidas bajo inhibidores de PKI3.

Actividad de Akt Se puede aislar AKT de células de insecto que expresen AKT1 con etiqueta His (aminoácidos 136-480) como se describe en WO 05011700. La células que se expresan se usan en HEPES 25 mM, NaCl 100 mM, imidazol 20 mM; pH 7.5 utilizando un kit polytron (5 ml de amorgiguador de lisis/g de célula). Los residuos de células se separan por centrifugación a 28,000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se filtra a través de un filtro de 4.5 micrómetros y después se carga en una columna de niquel-quelante preequilibrada con amortiguador de lisis. La columna se lava con 5 volúmenes de columna (CV) de amortiguador de lisis y después con 5 CV de amortiguador B 20%, en donde el amortiguador B es HEPES 25 mM, NaCl 100 mM, imidazol 300 mM; pH 7. Se eluye AKT1 etiquetado con His (aminoácidos 136-480) con un gradiente lineal 20-100% de amortiguador B sobre 10 CV. Se acumula AKTI etiquetado con His (136-480) y se diluye 3 veces con amortiguador C, en donde el amortiguador C es HEPES 25 mM, pH 7. La muestra después se somete a cromatografía sobre una columna Q-Sepharose HP preequilibrada con amortiguador C. La columna se lava con 5 CV de amortiguador C, después se eluye en etapas con 5 CV de 10% de D, 5 CV de 20% de D, 5 CV de 30% de D, 5 CV de 50% de D y 5 CV de 100% de D; en donde el amortiguador D es HEPES 25 mM, NaCl 1000 mM; pH 7.5. Se acumula y concentra AKTI etiquetado con His (aminoácidos 136-480) que contienen fracciones en un concentrador de límite de peso molecular de 10 kDa. Se cromatografía AKT1 etiquetado con His (aminoácidos 136-480) sobre una columna de filtración en gel Superdex 75 preequilibrada con HEPES 25 mM , NaCl 200 mM, DTT 1 mM; pH 7.5. Las fracciones de AKT1 etiquetadas con His (aminoácidos 136-480) se examinan utilizando SDS-PAGE y espectrometría de masas. La proteína se acumula, se concentra y se almacena a 80°C. AKT2 etiquetado con His (aminoácidos 138-481) y AKT3 etiquetado con His (aminoácidos 135-479) se pueden aislar y purificar de una manera similar. Los compuestos de análisis de enzima AKT se pueden probar para determinar la actividad inhibidora de proteína serina cinasa AKT en análisis de fosforilación de un sustrato. Este análisis examina la capacidad de compuestos orgánicos de moléculas pequeñas para inhibir la fosforilación de serina de un sustrato peptídico. Los análisis de fosforilación de sustrato utilizan los dominios catalíticos de AKT 1, 2 ó 3. AKT 17 2 y 3 también están disponibles comercialmente de Upstate USA, Inc. El método mide la capacidad de la enzima aislada para catalizar la transferencia de ?-fosfato a partir de ATP sobre la serina - 72 residuo de un péptido sintético biotinado (Biotin-ahx-ARKRERAYSFGHHA-amida) . La fosforilación del sustrato se puede detectar por el siguiente procedimiento descrito en WO 05011700. Los análisis se realizan en placas blancas de 384 pozos de fondo en U. Se incuba enzima AKT activada 10 nM durante 40 minutos a temperatura ambiente en el volumen de análisis de 20 µl que contiene MOPS 50 mM, pH 7.5, MgCl2 20 M , ATP 4 µM, péptido 8 µM, 0.04 µCi de [g- 33P] ATP/pozo, CHAPS 1 mM , DTT 2 mM y 1 µl de compuesto de prueba en DMSO 100%. La reacción se detiene por la adición de 50 µl de mezcla de esferas SPA (PBS de Dulbecco sin Mg2+ y Ca2+, Tritón X-100 0.1%, EDTA 5 mM, ATP 50 µM, esferas de SPA recubiertas con estreptavidina 2.5 mg/ml) . La placa se sella, se permite que las esferas sedimenten durante la noche después la placa se somete a conteo en un contador de centelleo de microplaca Packard Topcount (Packard Instrument Co., Meriden, CT) . Los datos para las respuestas de dosis se pueden graficar como % de control calculado con la fórmula de reducción de datos 100* (U1-C2) / (C1-C2) versus concentración del compuesto en donde U es el valor desconocido, Cl es el valor de control promedio obtenido para DIVISO, y C2 es el valor control promedio obtenido para EDTA O.lM. Los datos se ajustan a la curva descrita por: y = (Vmax* x)K + x) ) en donde Vmax es la asímptota superior y K es CI50.

Proliferación de células Un ejemplo de un análisis de proliferación de células se describe en los ejemplos siguientes. No obstante, los análisis de proliferación se pueden realizar por cualquier método adecuado. Por ejemplo, el análisis de proliferación de células de carcinoma de mama se puede llevar a cabo como sigue. Otros tipos de células se pueden substituir para la línea de células MDA-MB-231. Las células de carcinoma de mama humano (MDA MB-231, NCI) se cultivan en medio de crecimiento estándar (DMEM) suplementado con FBS inactivado por calor 10% a 37°C en C02 5% (vol/vol) en un incubador con humidi f icador . Las células se siembran en placa a una densidad de 3,000 células por pozo en 90 µl de medio de crecimiento en un recipiente de cultivo de 96 pozos. Con el fin de determinar los valores T0h CTG, 24 horas después de la colocación en placa, se agregan a cada pozo 100 µl de reactivo luminiscente CellTi ter-Glo (Promega) y se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se registra la luminiscencia en un instrumento Wallac Víctor II. El reactivo CellTiter-Glo resulta en lisis celular y generación de una señal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente, lo que a su vez es directamente proporcional al número de células presentes. Los compuestos de prueba se disuelven en DMSO 100% para preparar concentrados 10 mM . Los concentrados se diluyen adicionalmente 1:400 en medio de crecimiento para proporcionar concentrados de trabajo de 25 µl de compuesto de prueba en DMSO 0.25%. Los compuestos de prueba se diluyen de manera seriada en medio de crecimiento que contiene DMSO 0.25% para mantener concentraciones constantes de DMSO para todos los pozos. Se agregan 60 µl del compuesto de prueba diluido a cada pozo de cultivo para proporcionar un volumen final de 180 µl. Las células con y sin compuestos de prueba individuales se incuban durante 72 horas, momento en el cual se mide la luminiscencia dependiente de ATP como se ha descrito previamente, para proporcionar valores T72h. Opcionalmente, se pueden determinar los valores CI50 con el programa de análisis de mínimos cuadrados utilizando concentración de compuesto versus porcentaje de inhibición. % de inhibi ción = [ 1 - ( T 2 horas prueba- T0 horas ) / ( ?2 h control~T? horas ) ] x 100 , en donde T 2 oras prueba = luminiscencia dependiente de ATP a las 72 horas en presencia del compuesto de prueba T72 horas control = luminiscencia dependiente de ATP a las 72 horas en ausencia del compuesto de prueba To horas = luminiscencia dependiente de ATP en el tiempo 0.

Angiogénesis Un modelo útil de estudio de angiogénesis se basa en la observación de que, cuando se reconstituye la matriz de membrana basamental, tal como Matrigel, suplementado con factor de crecimiento (por ejemplo FGF-1) se inyecta subcutáneamente en un animal hospedador, las células endoteliales se reclutan en la matriz, formando vasos sanguíneos nuevos durante un período de varios días. Véase, por ejemplo, Passaniti et al., Lab . In ves t . , 67:519 528, 1992. Al muestrear el extracto en momentos diferentes se puede realizar una disección temporal del angiogénesis lo que permite la identificación de los genes involucrados en todas las etapas de angiogénesis que incluyen, por ejemplo, migración de células endoteliales en la matriz, concordante con células endoteliales a la vía de angiogénesis, elongación y formación de células en espacios similares a sacos y establecimiento de capilares funcionales que comprenden estructuras conectadas y lineales que contienen eritrocitos. Para estabilizar el factor de crecimiento y/o para frenar su liberación de la matriz, el factor de crecimiento se puede unir a heparina u otro agente estabilizante. La matriz también se puede suministrar por reinfusión periódicamente con factor de crecimiento para incrementar y extender el procedimiento angiogénico. Otros sistemas útiles para estudiar angiogénesis incluyen, por ejemplo, neovascularización de explantes de tumor (por ejemplo las Patentes de E.U.A. Nos. 5,192,744; 6,024,688), análisis de membrana corioalantoides de pollo (CAM, por sus siglas en inglés) (por ejemplo Taylor and Folkman, Nature, 297:307-312, 1982; Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140, 1255-1263, 1998), análisis de células endoteliales capilares bovinas (BCE, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,024,688; Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol., 198; 440-450, 1991), análisis de migración, análisis de inhibición de crecimiento de HUVEC (célula entotelial vascular de cordón umbilical humano) (por ejemplo Patente de E.U.A. No. 6,060,449) . La presente invención proporciona una o más de las siguientes características. Un método para tratar cualquiera de las enfermedades y/o condiciones mencionadas en lo anterior, que comprende administrar cantidades eficaces de un compuesto de fórmula I y un segundo compuesto el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT. Un método para modular (por ejemplo inhibir) una o más de las actividades mencionadas antes, que comprende administrar cantidades eficaces de un compuesto de fórmula I y un segundo compuesto, el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT. Combinaciones que comprenden un compuesto de fórmula I y un segundo compuesto el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT. Sin elaboración adicional, se considera que una persona experta en la técnica, puede, utilizando la descripción precedente, usar la presente invención en su extensión más completa. Por lo tanto, las siguientes modalidades específicas preferidas se deben considerar únicamente como ilustrativas y no limitantes del resto de la descripción de manera alguna. La totalidad de la descripción y todas las patentes y publicaciones mencionadas en lo anterior y en lo siguiente se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una combinación, caracterizada porque comprende : un compuesto de fórmula I o una sal, polimorfo, solvato, hidrato, metabolito o fármaco precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, y por lo menos un segundo compuesto el cual es un inhibidor de la vía de señalización PI3K/AKT.
2. 2. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el segundo compuesto es celecoxib, OSU-03012, OSU-03013, PX-316, derivados de 2'-sustituido, 3' desoxi-fosfatidil-mio-inositol, derivados de 3-(im?dazo[l,2-a]piridin-3-?lo) , Ly294002, IC486068, derivados de benzo (b) tiofeno sustituidos con 3- (hetero) ariloxi, PX-866, perifosina, triciribina, mejorador FKBP12, análogos de lípido de fosfatidilinositol éter, wortmanina o rapamicina o derivados de los mismos o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. 3. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el segundo compuesto es un compuesto de wortmanina de fórmula W: un derivado o análogo de un compuesto de wortmanina de fórmula W, una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de wortmanina de fórmula W o una sal farmacéuticamente aceptable del derivado o análogo del compuesto de wortmanina de fórmula W.
4. 4. La combinación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el derivado o análogo de la fórmula W se selecciona de: a) compuestos de fórmula Wl en donde R es H ( 11-desacetoxiwortmanina) o acetoxi y R' es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, b) compuestos de ?9, 11-deshidroacetoxiwortmanina de fórmula W2 en donde R' es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, c) compuestos de 17 (a-dihidro-wortmanina de fórmula w3¡ en donde R es H o acetoxi y R' es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono y R" es H, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -C(0)OH o -C (O) O-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; d) un ácido o éster de anillo A abierto de compuestos de wortmanina de fórmula W4 en donde Ri es H, metilo o etilo y R2 es H o metilo , e) derivados 11-sustituidos y 17-sustituidos de wortmanina de fórmula W5 en donde R4 es =0 u -0(C0)R6, R3 es =0, -OH o -0(C0)R6 cada R6 es independientemente fenilo, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido, en R4 es =0 o -OH, R3 no es =0.
5. 5. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el segundo compuesto es un inhibidor de Akt-cinasa.
6. 6. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el segundo compuesto es Akt-1-1, Akt-1-1-2, API-59CJ-0me, derivados de 1-H-imidazo [4, 5-c] piridinilo, indol-3-carbinol y derivados de los mismos, perifosina, análogos de lípido de fosfatidilinositol éter, triciribina o una sal faracéuticamente aceptable del mismo.
7. 7. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el segundo compuesto es un inhibidor mTOR.
8. 8. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el segundo compuesto es rapamicina, temsirolimus, Everolimus; AP23573; AP23675, AP23464, AP23841, 40- (2-hidroxietil) rapamicina, 40-[3-hidroxi (hidroximetil) metilpropanoato] -rapamicina, 40-epi- (tetrazolit) -rapamicina, 32-desoxirapamicina o 16-pentiniloxi-32 (S) -dihidrorrapamicina, SAR 943 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. 9. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un compuesto de fórmula (I) y wortmanina.
10. 10. La combinación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un compuesto de fórmula (I) y rapamicina.
11. 11. La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque las : cantidades de los ingredientes activos de la combinación son sinergísticos .
12. 12. La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizada porque es tratar cáncer.
13. 13. La combinación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el cáncer es melanoma, cáncer hepatocelular, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama o cáncer pancreático.
14. 14. Un método para tratar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar cantidades eficaces de un compuesto de fórmula I o una sal, polimorfo, solvato, hidrato, metabolito o fármaco precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, y de un segundo compuesto el cual es un inhibidor de vía de señalización PI3K/AKT.
15. 15. Un procedimiento para fabricar una combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque es para tratar cáncer.
16. 16. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el cáncer es melanoma, cáncer hepatocelular, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama o cáncer pancreático.