BRPI0312522B1 - método para a preparação de trombina vírus-inativada - Google Patents
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Abstract
"método para a preparação de trombina inativada por vírus, trombina, formulação farmacêutica, e, kit farmacêutico". um método para a preparação de trombina inativada por vírus compreendendo a inativação de vírus por solvente-detergente de uma solução compreendendo protrombina e fator x, o carregamento de fator x e protrombina inativada por vírus para cima de um meio de troca aniônica, a lavagem do meio para recuperar os reagentes usados para a inativação de vírus por solvente-detergente, e a ativação da protrombina sobre o meio para formar trombina pela adição de íons de metal, preferivelmente íons de cálcio. a trombina é então preferivelmente seletivamente eluída do meio de troca aniônica.
Description
“MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE TROMBINA VÍRUSINATTVADA”
A presente invenção refere-se aos processos para a preparação de trombina vírus-inativada, e aos produtos preparados por estes processos.
A trombina é uma protease de plasma multifuncional gerada na corrente sanguínea por intermédio da ativação de seu precursor inativo, protrombina (também conhecida como fator Π). A protrombina é propriamente ativada pela ação de fator X ativado (fator Xa). Uma das funções principais da trombina no plasma sanguíneo é a conversão de 10 fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel na etapa final da cascata de coagulação do sangue. Os monômeros de fibrina produzidos pela ação da trombina se agrupam juntos e são então reticulados para formarem um coágulo sanguíneo. A trombina é usada em terapia tanto sozinha quanto em combinação com fibrinogênio nos denominados vedantes de fibrina para se 15 obter hemostasia, para fechar ferimentos e para adesão controlada de tecido.
Para todas as aplicações clínicas, é importante que se tenha trombina elevadamente pura com o propósito de minimizar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis resultantes de, por exemplo, a presença de outras proteases ou fatores de coagulação, ou de outros componentes contaminantes. 20 Em adição, é elevadamente desejável que trombina para uso clínico, em particular se for derivada de fontes animais ou humanas, seja tratada para inativar quaisquer vírus originários do sangue que possam estar presentes, por exemplo vírus da hepatite ou HIV. Vários métodos de inativação de vírus são conhecidos na arte, incluindo pasteurização, tratamento térmico seco e 25 tratamento com solvente-detergente (Patbogen Inactivation of Labile Blood Products, Council of Europe Expert Committee and Blood Transfusion Study Group on Phatogen Inactivation in Labile Blood Products, Transfusion Medicine, 2001, 11, 149-175). Também é desejável que outros patógenos sejam removidos ou reduzidos, por exemplo os agentes causadores de
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Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (TSE), correntemente sendo, como se acredita, os príons.
O tratamento térmico seco é, como se sabe, efetivo para a inativação de vírus tanto envelopados quanto não envelopados, enquanto que o tratamento com solvente-detergente é, como se sabe, efetivo para a inativação de vírus envelopados (isto é revestidos de lipídeo) tal como da hepatite B. O tratamento com solvente-detergente é agora um método comumente usado para a inativação de vírus de produtos de sangue intencionados para uso clínico.
No passado, a ativação de protrombina para trombina era muitas vezes realizado pela adição de íons de cálcio e tromboplastina (fator ΙΠ). A tromboplastina seria derivada de fontes animais ou humanas e era portanto uma fonte de contaminação possível do produto final.
US 5.304.372 descreve um processo para a preparação de um concentrado de trombina humana a partir de fração PPSB de plasma. O processo compreende a ativação da protrombina na fração de PPSB para produzir trombina pela adição de cloreto de cálcio, seguida pelo tratamento com solvente-detergente do produto resultante para inativar os vírus. De acordo com US 5.304.372 o tratamento com solvente-detergente não pode ser realizado no material inicial de PPSB porque eliminaria outros fatores tais como fosfolipídeos necessários para a reação de ativação de protrombina para trombina.
EP-A-0.378.798 descreve um processo para a preparação de trombina que compreende a absorção de fator Π do plasma ou de frações de plasma para cima de um veículo sólido, ativação do fator Π sobre o veículo sólido para trombina e então eluição da trombina.
US 5.714.370 descreve a preparação de trombina a partir de protrombina vírus-inativada usando sais coagulavelmente ativos para efetuar a ativação de protrombina para trombina. O único método descrito para a
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 16/50 inativação de vírus da protrombina é tratamento térmico.
O 1993 Annual Report de dr. Karl Landsteiner Foundation sobre a pesquisa em CLB (o serviço de transfusão de sangue do Laboratório Central da Cruz Vermelha dos Países-Baixos) também relatou na página 10 que a ativação de protrombina tratada com solvente-detergente para formar trombina com íons de cálcio foi apenas bem sucedido na presença de fosfolipídeos adicionados.
Seria vantajosa a provisão de um método para a preparação de trombina a partir de protrombina que tem sofrido uma etapa de inativação de vírus por solvente-detergente para remover os vírus envelopados. Também seria vantajosa a evitação do uso completo de outros produtos biológicos e particularmente derivados de animal, por exemplo tromboplastina, para ativar a protrombina, visto que tais produtos podem servir como uma fonte de vírus infecciosos ou outros contaminantes indesejáveis durante o processo de fabricação.
Em um aspecto, a presente invenção portanto proporciona um primeiro método para a preparação de trombina vírus-inativada compreendendo as etapas de:
(a) inativação de vírus por solvente-detergente de uma solução compreendendo protrombina e fator X;
(b) carregamento do produto da etapa (a) para cima de um meio de troca aniônica;
(c) lavagem do meio para remover os reagentes usados para a inativação de vírus por solvente-detergente na etapa (a); e (d) ativação da protrombina sobre o meio para formar trombina pela adição de íons de metal. Preferivelmente os íons de metal são íons de metal divalente tais como íons de magnésio e/ou de cálcio.
Preferivelmente, a trombina é então seletivamente eluida do meio de troca aniônica.
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Altemativamente, uma solução compreendendo protrombina e fator X pode ser carregada para cima de um meio de troca aniônica e inativação de vírus por solvente-detergente pode ser realizada sobre o meio. A presente invenção portanto também proporciona uma alternativa ao método acima na qual as etapas (a) e (b) são substituídas pelas etapas (á) e (b'):
(a') carregamento de uma solução compreendendo protrombina e fator X para cima de um meio de troca aniônica; e (b') inativação de vírus por solvente-detergente da trombina e do fator X sobre o meio. As etapas restantes deste método alternativo são idênticas às etapas restantes do primeiro método descrito acima. O método compreendendo as etapas (a) e (b) é preferido sobre o método compreendendo as etapas (a') e (b'), visto que é mais fácil de verificar a realização das condições de inativação necessárias antes do carregamento para cima do meio.
O material inicial para o processo da invenção pode ser qualquer solução que compreenda protrombina e fator X, incluindo frações de plasma ou protrombina e/ou fator X derivados por expressão de gene por exemplo em cultura celular ou espécies transgênicas, e protrombina e/ou fator X produzidos por quaisquer outros métodos sintéticos. O material inicial pode ser preparado por qualquer método adequado conhecido na arte. Preferivelmente, o material inicial é um complexo de protrombina ou um seu derivado que contém tanto protrombina quando fator X. O complexo de protrombina pode ser preparado por métodos conhecidos na arte, por exemplo por adsorção sobre meios de troca aniônica a partir de sobrenadante de crioprecipitado e subseqüente eluição (P. A. Feldman, L. Harris, Μ. E. Haddon, D. R. Evans e J. K. Smith, Thrombosis Research, 1986, Supplement VI:36, incorporado como referência). Em uma modalidade preferida, o material inicial é concentrado de complexo de protrombina (PCC) que tem sido preparado sob condições que minimizam o nível de fator VII de
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 18/50 coagulação e fatores de coagulação ativados no complexo de protrombina. O denominado PCC de três fatores é portanto um material inicial mais preferido do que o PCC de quatro fatores.
A etapa de inativação de vírus por solvente-detergente é realizada usando reagentes e métodos conhecidos na arte (veja por exemplo US 4.481.189, US 4.613.501 e US 4.540.573, todas as quais são por meio desta aqui incorporadas como referências). Solventes apropriados incluem fosfato de tri-n-butila (TNBP). Detergentes adequados incluem polissorbato (Tween) 80, polissorbato (Tween) 20 e Triton X-100. Uma combinação particularmente preferida é polissorbato 80 e TNBP. Em uma modalidade preferida, a solução contendo protrombina e fator X é agitada com os reagentes solvente e detergente. A inativação de vírus é conduzida em uma temperatura e por um tempo suficientes para inativar quaisquer vírus envelopados que possam estar presentes. Por exemplo, o tratamento com solvente-detergente pode ser realizado de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, em uma temperatura de cerca de 4°C a cerca de 37°C, por exemplo por pelo menos cerca de 6 horas em uma temperatura de cerca de 23-27°C.
A solução contendo fator X e protrombina tratada com solvente-detergente é então carregada para cima de um trocador de ânions adequado sob condições tais que a protrombina e o fator X se ligam no meio de troca aniônica. Se necessário, a solução tratada com solvente-detergente é primeiro diluída para reduzir a força iônica para uma que seja adequada para ligar a protrombina e o fator X sobre o trocador aniônico. Meios de troca aniônica adequados estão comercialmente disponíveis, e incluem SEAE Sepharose CL6B fornecido por Amersham Biosciences e Fractogel EMD DEAE 650 (S) fornecido por Merck. Preferivelmente, o meio de troca aniônica está presente em uma coluna para facilitar a lavagem e a eluição. Preferivelmente, se um meio de troca aniônica foi usado durante a preparação do material inicial, por exemplo para a captura de protrombina e/ou fator X de
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 19/50 um material fonte tal como plasma, então o mesmo meio de troca aniônica será utilizado para o processo da invenção com o objetivo de minimizar a exposição a reagentes diferentes.
Após o carregamento, o meio de troca aniônica é lavado com um ou mais tampões de lavagem apropriados para remover a proteína fracamente ligada ou não ligada e os reagentes solvente-detergente. Os tampões de lavagem devem estar livres de reagentes que possam gerar trombina a partir de protrombina ligada.
A protrombina ligada é então ativada para formar trombina pela adição de íons de metal suficientes, preferivelmente íons de metal divalente tais como íons de magnésio ou de cálcio, mais preferivelmente íons de cálcio. Combinações de mais do que um tipo de íon de metal podem ser usadas para a ativação, por exemplo uma mistura de íons de cálcio e de magnésio. Preferivelmente, os íons de metal são adicionados na forma de um tampão de ativação e estão presentes em uma concentração entre cerca de 1 mM e cerca de 40 mM, preferivelmente entre cerca de 1,5 mM e cerca de 17 mM, e mais preferivelmente de cerca de 2 mM no tampão.
A protrombina ligada é incubada com os íons de metal por um tempo suficiente e em uma temperatura adequada para a reação de ativação se processar. A temperatura deve ser suficientemente alta para a reação ocorrer mas não tão alta que as proteínas presentes sejam desnaturadas ou quaisquer microorganismos contaminantes sejam encorajados a crescerem. A reação é preferivelmente realizada a ou abaixo de cerca de 26°C, por exemplo a 1026°C, com maior preferência a cerca de a temperatura ambiente (20°C) ou abaixo, por cerca de 19-85 horas, com maior preferência 19-65 horas e ainda mais preferivelmente por cerca de 40-65 horas. Por exemplo, condições de incubação adequadas podem ser por cerca de 65 horas a cerca de 20°C.
Sem o desejo de se ligar a qualquer teoria, acredita-se que é a combinação de íons de metal (por exemplo de cálcio) e o meio de troca
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 20/50 aniônica no qual a protrombina é ligada que permite a ativação da protrombina para formar trombina sem a necessidade da adição de quaisquer outros reagentes de ativação, por exemplo tromboplastina. Os íons de metal ativam o fator X na fração adsorvida para formar fator Xa, e o fator Xa por sua vez ativa a protrombina para formar trombina. Também é possível carregar o fator X inativado por vírus por solvente-detergente para cima do meio de troca aniônica e ativá-lo para formar fator Xa pela adição de íons de metal antes de a protrombina ser adicionada no meio de troca aniônica. O fator Xa então converte a protrombina em trombina sobre o meio.
A presente invenção portanto também proporciona um segundo método para a preparação de trombina vírus-inativada compreendendo as etapas de:
(a) inativação de vírus por solvente-detergente de uma solução compreendendo fator X;
(b) carregamento do produto da etapa (a) para cima de um meio de troca aniônica;
(c) lavagem do meio para remover os reagentes usados para a inativação de vírus por solvente-detergente na etapa (a);
(d) ativação do fator X sobre o meio para formar fator Xa pela adição de íons de metal; e (e) carregamento de protrombina vírus-inativada para cima do meio de troca aniônica de tal modo que trombina seja gerada.
Preferivelmente, a trombina é então seletivamente eluída do meio de troca aniônica. Também preferivelmente os íons de metal são íons de metal divalente tais como íons de cálcio e/ou de magnésio.
O material inicial para o segundo processo da invenção pode ser quaisquer soluções que compreendem separadamente protrombina e fator X, incluindo frações de plasma, protrombina e/ou fator X derivados por expressão de gene, por exemplo em cultura celular ou espécies transgênicas, e
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 21/50 protrombina e/ou fator X produzidos por quaisquer outros métodos sintéticos. Os materiais iniciais podem ser preparados por qualquer método adequado conhecido na arte. Condições adequadas de inativação de vírus adequada, carregamento e ativação para o segundo método da invenção são como descritas acima para o primeiro método da invenção.
Após a ativação do fator X para formar fator Xa, o meio de troca aniônica pode ser opcionalmente lavado usando um tampão adequado para remover os íons de metal antes de a protrombina ser adicionada.
Após a conversão de protrombina para trombina, a trombina pode ser recuperada pela eluição com um tampão de recuperação apropriado. A força iônica e o pH do tampão de recuperação são preferivelmente escolhidos para seletivamente remover a trombina e para deixar as outras proteínas, por exemplo qualquer protrombina não convertida, ligada no meio de troca aniônica. O pH do tampão de recuperação usado deve estar abaixo do pi da trombina de modo que a trombina não se ligue no trocador aniônico. Um pH adequado para o tampão de recuperação é pH 8. Preferivelmente, os tampões usados para lavagem, ativação e recuperação não contêm quaisquer sais de fosfato, com o propósito de evitar a precipitação de fosfato de cálcio insolúvel durante o processo de fabricação.
A trombina produzida está elevadamente purificada e concentrada e pode ser formulada sem purificação adicional. Altemativamente, etapas de purificação adicionais podem ser realizadas se desejadas. Por exemplo, a solução de trombina obtida do meio de troca aniônica pode ser submetida a outras etapas de inativação ou redução de vírus. Por exemplo, a solução pode ser filtrada através de um filtro de remoção de vírus tal como filtro Planova 15N. Tal filtração também pode servir para remover o agente causador de Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (TSE).
Uma vez separado do meio de troca aniônica, o produto de
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 22/50 trombina pode ser formulado para armazenagem de longa duração antes do uso clínico. Preferivelmente, a solução de trombina é seca por congelamento, opcionalmente na presença de um ou mais estabilizadores para ajudar a limitar a desnaturação durante a secagem por congelamento e qualquer tratamento térmico subseqüente. Estabilizadores adequados incluem carboidratos tais como sacarose, rafinose ou trealose e íons de metal divalente tais como íons de cálcio. Particularmente preferida é uma combinação de íons de cálcio e um carboidrato tal como sacarose. Preferivelmente, o uso de estabilizadores proteínicos tal como albumina é evitado de modo a minimizar as possíveis fontes de contaminação no produto final.
As condições de secagem por congelamento adequadas incluem secagem primária em uma temperatura de cerca de -35°C e em uma pressão de cerca de 10-13 Pa, seguida por secagem secundária em uma temperatura de +35°C e uma pressão de cerca de 3 Pa.
O produto de trombina seco por congelamento pode ser submetido a uma outra etapa de inativação de vírus por tratamento térmico, por exemplo aquecimento para cerca de 80°C por cerca de 72 horas ou 100°C por 24 horas. Tem sido verificado que uma combinação de íons de cálcio e um carboidrato tal como sacarose eficientemente estabiliza a trombina produzida de acordo com a invenção durante o tratamento térmico terminal para inativar vírus.
É desejável que produtos derivados de sangue sofram pelo menos duas etapas separadas de redução ou inativação de vírus durante a manufatura. Uma vantagem do processo da invenção é que ele permite a realização de múltiplas etapas diferentes de redução ou inativação de vírus, com o objetivo de inativar ou reduzir vírus tanto envelopados quanto não envelopados, e outros patógenos, por exemplo os agentes causadores de TSE. É sabido que o tratamento com solvente-detergente rompe o envelope lipídico dos vírus envelopados, enquanto que a filtração separa partículas acima de um
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 23/50 certo tamanho e o tratamento térmico inativa termicamente os vírus instáveis. É desejável a incorporação de múltiplas etapas de redução ou inativação que se baseiam em princípios diferentes, com o objetivo de remover ou reduzir tantos patógenos diferentes quanto possível. Em uma modalidade diferente, o 5 processo compreende uma outra etapa de inativação ou redução de vírus em adição ao tratamento com solvente-detergente. Em uma modalidade mais preferida, o processo compreende duas outras etapas de inativação ou redução de vírus em adição ao tratamento com solvente-detergente. Preferivelmente, o processo compreende uma etapa de remoção física de vírus (por exemplo 10 nanofiltração) e uma etapa de inativação de vírus térmica seca em adição ao tratamento com solvente-detergente.
Outra vantagem do processo da invenção é que a ativação de protrombina e a purificação da trombina resultante podem ser alcançadas usando o mesmo tipo de meio de troca aniônica que o previamente usado para 15 preparar o material inicial de protrombina e fator X. A formulação do produto também utiliza reagentes que já têm sido usados no processo preparativo. Isto minimiza a exposição da trombina a uma multiplicidade de reagentes, o que é benéfico na fabricação de um produto farmacêutico. Uma outra vantagem do processo é que ele minimiza a ameaça à integridade das outras operações de 20 fabricação posta pelo contacto possível com a trombina-protease elevadamente potente. Isto pode ser evitado normalmente apenas pela segregação da instalação de fabricação de trombina do outro equipamento e de outras atividades da fábrica. Tal segregação é cara de intensiva em trabalho. Também, o processamento de intermediários inativado por vírus 25 (por exemplo tratados com solvente-detergente) tem que ser feito em uma área de fabricação separada, isolada para evitar qualquer contaminação subseqüente. A incapacidade da arte anterior de gerar trombina após o tratamento com solvente-detergente requereu o uso de espaço de fabricação significativamente mais segregado e riscos adicionais no manuseio do produto
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 24/50 durante a transferência de etapa a etapa. Adicionalmente, também houve o risco potencial para o pessoal de fabricação do manuseio de protease que pode ter efeitos trombóticos significativos se inadvertidamente introduzida na circulação deles. Estes problemas são minimizados pelo uso do processo da invenção porque (a) o tratamento com solvente-detergente anterior significa que a trombina gerada não necessitou ser processada em numerosas áreas de fabricação diferentes, cada uma das quais teria que ser isolada das outras atividades;
(b) o número de etapas de fabricação (particularmente após a geração de trombina a partir de protrombina) é minimizado; e (c) o rendimento é suficiente para proporcionar quantidades significativas de trombina a partir de volumes muito pequenos. Assim o refreamento do processo é grandemente simplificado.
Também é vantajoso limitar a exposição do produto a múltiplos reagentes diferentes durante a fabricação, visto que tais reagentes podem servir como uma fonte de contaminação ou de modificação indesejável do produto. Minimização do número de reagentes e de etapas requeridos para a fabricação de trombina a partir de protrombina é uma outra vantagem do processo da invenção.
A trombina preparada usando o processo da invenção pode ser usada clinicamente, quer sozinha quer em combinação com fibrinogênio em um kit de vedação de fibrina. A presente invenção portanto também proporciona trombina obtida de acordo com um processo da invenção, para uso em terapia, e kits farmacêuticos compreendendo trombina obtida de acordo com um processo da invenção em combinação com fibrinogênio. Preferidos são os kits compreendendo trombina preparada de acordo com um processo da invenção e fibrinogênio preparado de acordo com o pedido PCT copendente do requerente de número (desconhecido) intitulado de Process
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 25/50 for the preparation of fibrinogênio depositado aos 7 de julho de 2003 reivindicando prioridade do pedido de patente UK de número 0216001.8 depositado aos 10 de julho de 2002, cuja descrição é por meio desta aqui incorporada como referência.
A invenção será agora adicionalmente ilustrada com referência aos seguintes exemplos não limitantes.
Remoção de crioprecipitado do plasma
Plasma humano congelado é condicionado a cerca de -11°C, descongelado para cerca de +1°C e o crioprecipitado é coletado por centrifugação. o sobrenadante é chamado de sobrenadante do crioprecipitado (CPS).
Captura de complexo de protrombina do sobrenadante de crioprecipitado Adsorção do complexo de protrombina do sobrenadante de crioprecipitado
Meio de troca aniônica, tal como DEAE Sepharose CL-6B, é adicionado em CPS em proporções de, por exemplo, ~10 ml de meio de atuação compactado por quilograma de CPS. A mistura é agitada por um tempo adequado e então o meio (incluindo proteína adsorvida) é recuperada do CPS, por exemplo por centrifugação.
Eluição do complexo de protrombina
O meio de troca aniônica recuperado é suspenso em um tampão adequado e compactado em uma coluna de cromatografia. O meio é lavado com um tampão baixo em sal para remover as proteínas fracamente ligadas e não desejadas. As condições de carregamento e de lavagem são controladas para especificamente minimizar o nível de fator VII de coagulação e de fatores de coagulação ativados no complexo de protrombina eluído. O meio é então lavado com um tampão de eluição alto em sal para recuperar o complexo de protrombina. O pico de proteína é seletivamente coletado para evitar a contaminação do complexo de protrombina com fatores de coagulação ativados. O eluato pode ser armazenado congelado.
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Tratamento com solvente-detergente
A solução de complexo de protrombina é filtrada através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 gm ou menor. Os reagentes solventedetergente são então adicionados e a mistura é agitada em uma temperatura e 5 por um período de tempo conhecidos para inativar quaisquer vírus envelopados que possam estar presentes.
Cromatografia de ativação de protrombina
Diluição do complexo de protrombina tratado com solvente-detergente
O complexo de protrombina tratado com solvente-detergente é 10 então diluído com, por exemplo, água para reduzir a força iônica da solução para uma que seja adequada para ligação em um trocador de ânions. Carregamento de segundo trocador de ânions
A solução de proteína diluída é bombeada através de uma coluna contendo um meio de troca aniônica compactado. Vantajosamente, 15 este pode ser o mesmo meio usado para a preparação de protrombina e fator X a partir de CPS ou de outra fonte. Contaminação microbiana durante a geração de trombina é minimizada por sanitização adequada do meio de troca aniônica e por filtração dos tampões para remover contaminação bacteriana (por exemplo pelo uso de filtros de 0,2 gm). O meio é lavado com tampão 20 usado para equilibrar a coluna, para remover proteína fracamente ligada e os reagentes solvente e detergente, e para equilibrar o meio com sais tampão que são mais favoráveis para as etapas de processamento subseqüentes. O meio é então lavado com aproximadamente 1 volume de coluna de um tampão contendo cálcio, por exemplo o tampão de equilíbrio mais cloreto de cálcio 2 25 mM.
Incubação de ativação
As saídas da coluna são fechadas e a coluna é mantida em uma temperatura predeterminada por um período de tempo definido, por exemplo, 65 horas a 20°C. Durante a incubação a protrombina é convertida em
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 27/50 trombina.
Recuperação de trombina
No final da incubação, a coluna é lavada com o tampão de equilíbrio para recuperar a trombina. Proteínas não afetadas pela incubação de ativação permanecem ligadas no meio visto que as condições usadas para esta lavagem, em termos de pH, componentes de tampão e força iônica, são iguais àquelas utilizadas para a lavagem após o carregamento da coluna. A trombina não se liga nos trocadores aniônicos em pHs abaixo de seu pi de modo que é removida por lavagem pelo tampão. Por exemplo, em pH 8 a trombina não se liga nos trocadores aniônicos mas seu precursor, protrombina se liga.
O pico que é eluído é coletado em frações, os primeiros volumes de coluna do efluente da coluna são de trombina de menor pureza e contêm a maior parte de qualquer trombina degradada ou danificada que possa estar presente. Os volumes de coluna seguintes são de pureza maior e se separados dos primeiros volumes de coluna podem ser usados sem purificação adicional. Altemativamente, todo o efluente da coluna pode ser coletado e purificado ainda mais.
Filtração de vírus
Uma outra etapa de redução de vírus pode ser usada. O eluato da coluna contendo trombina pode ser filtrado através de um filtro removedor de vírus validado tal como um filtro Plano va 15N. Tal filtração também pode remover ou reduzir outros patógenos, por exemplo os agentes causadores de TSE.
Formulação
A trombina é agora formulada e ajustada para sua potência alvo para armazenagem de longa duração antes do uso clínico. Um método recomendado é a adição de um carboidrato, tal como sacarose, e de cálcio, em uma concentração de cloreto de sódio alvo e depois a secagem por congelamento da solução. Antes da secagem por congelamento o produto
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 28/50 formulado pode ser filtrado através de um filtro de esterilização (por exemplo filtro de 0,2 gm) como requerido para uso farmacêutico.
Tratamento térmico terminal
A formulação seca por congelamento pode ser terminalmente termicamente tratada para inativar quaisquer vírus que possam estar presentes.
A trombina preparada usando o processo da invenção pode ser utilizada clinicamente, quer sozinha quer em combinação com fibrinogênio em um kit de vedação de fibrina. A presente invenção portanto também proporciona trombina obtida de acordo com o processo da invenção, para uso em terapia, e kits farmacêuticos compreendendo trombina obtida de acordo com o processo da invenção em combinação com fibrinogênio. Preferidos são os kits compreendendo trombina preparada de acordo com um processo da invenção e fibrinogênio preparado de acordo com o pedido copendente do Reino Unido do requerente intitulado de Process and composition depositado aos 10 de julho de 2002.
A invenção será adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.
A preparação de PCC é descrita em: Feldman P A, Bradbury P I, Williams J D, Sims G E C, McPhee J W, Pinnell Μ A, Harris L, Crombie G I, Evans D R, Large scale preparation and biochemical characterisation of a new high purity factor IX concentrate prepared by metal chelate affinity chromatography, Blood Coagulation and Fibrinolysis 1994;5:939-948.
O pH das soluções foi ajustado usando concentrações adequadas de hidróxido de sódio para aumentar o pH ou de ácido clorídrico para reduzir o pH.
Trombina foi medida pelo ensaio de coagulação que mede o tempo de coagulação de uma amostra de fibrinogênio e/ou pelo ensaio cromogênico que mede a absorbância de um cromóforo liberado pela clivagem mediada por trombina de um peptídeo sintético. Tais métodos de
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Ensaio de coagulação de trombina
O padrão é calibrado versus um padrão intemacionalmente aceito, e é diluído em tampão de ensaio, tal como trometamol 50 mM, cloreto de sódio 100 mM, albumina 1%, pH 7,5, para uma faixa de concentrações adequada, por exemplo 1 ui/ml a 7 ui/ml. As amostras são diluídas para dentro desta faixa de concentrações.
Os tempos de coagulação das soluções de trombina diluída são medidos após a adição de fibrinogênio humano em uma concentração fixada. A relação entre as amostras de teste e o padrão então permite o cálculo da concentração de trombina na amostra, expressada em unidades internacionais (ui) por ml.
Ensaio cromogênico de trombina
O padrão é calibrado versus um padrão intemacionalmente aceito, e é diluído em tampão de ensaio, tal como trometamol 50 mM, cloreto de sódio 100 mM, albumina 1%, pH 7,3, para uma faixa de concentrações adequada, por exemplo 0,5 ui/ml a 5 ui/ml. As amostras são diluídas para dentro desta faixa de concentrações.
A trombina diluída é então adicionada em um substrato cromogênico (por exemplo S-223 de Chromogenix) e a mistura é incubada por um período de tempo definido. A reação é então interrompida pela adição, por exemplo, de ácido acético. A absorbância da solução é então medida a 405 nm (para S-2238). A concentração de trombina é proporcional à cor desenvolvida e a concentração de amostra pode ser interpolada da linha padrão.
Exemplo 1: Cromatografia de ativação de protrombina Tampões de trometamol e incubação a 20°C por 62,5 horas
1,19 kg de complexo de protrombina tratado com solventedetergente foram diluídos com 2,50 kg de água para reduzir sua condutividade
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 30/50 de 26,4 mS/cm para 9,28 mS/cm. A solução foi então titulada para pH 8,0. Esta solução foi carregada para cima de uma coluna encamisada de 5 cm de diâmetro recheada com um leito de altura de 13 cm de DEAE Sepharose CL6B, equilibrada com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 5 8,0. Após o carregamento o meio foi lavado com 15 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para remover os reagentes solvente e detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi então lavado com 1 volume de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. As saídas da coluna foram 10 fechadas. Água a 20°C foi circulada através da camisa.
Após 62,5 horas, a circulação de água foi interrompida. O meio foi lavado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para recuperar a trombina gerada durante a incubação. Os primeiros 3 volumes de coluna de efluente da coluna que continham 3,8 milhões de 15 unidades internacionais (ui) de atividade de coagulação de trombina foram descartados visto que a atividade de coagulação específica foi menor do que 2.000 ui/mg de proteína total. Os seguintes 11 volumes de coluna de efluente que continham 2,8 milhões de ui de atividade de coagulação tiveram uma atividade específica de 2.400 ui/mg e foram reunidos para processamento 20 adicional, sem a necessidade de etapas adicionais de purificação de proteína.
Exemplo 2: cromatografia de ativação de protrombina
Tampões de citrato-fosfato e DEAE Sepharose
4,4 kg de complexo de protrombina tratado com solventedetergente foram diluídos com 6,3 kg de água para reduzir sua condutividade 25 para 9,3 mS/cm. A solução foi então titulada para pH 8,0. 7,1 kg desta solução foram carregados para cima de uma coluna de 9 cm de diâmetro recheada com um leito de altura de 12,5 cm de DEAE Sepharose CL6B, equilibrada com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 68,5 mM, pH 8,0. Após o carregamento o meio foi lavado com 11 volumes de coluna de
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 31/50 citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 68 mM, pH 8,0 para remover os reagentes solvente e detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi então lavado com 1 volume de coluna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 64 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. As saídas da coluna foram fechadas. A coluna foi armazenada na temperatura ambiente.
Após cerca de 64 horas, o meio foi lavado com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 68 mM, pH 8,0 para recuperar a trombina gerada durante a incubação. Um total de 11 milhões de ui de atividade de coagulação foi recuperado da coluna cujos 3,8 milhões de ui tinham uma atividade específica > 2.000 ui/mg e foi reunido para processamento adicional, sem a necessidade de etapas adicionais de purificação de proteína. Exemplo 3: cromatografia de ativação de protrombina Tampões de citrato-fosfato e Fractogel EMD DEAE 650 (S)
148 ml de complexo de protrombina tratado com solventedetergente foram diluídos com 121 ml de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, pH 9,0 para reduzir sua condutividade para 16 mS/cm. A solução foi então titulada para pH 8,0. 111 g desta solução foram carregados para cima de uma coluna de diâmetro de 1 cm recheada com 10 ml de Fractogel EMD DEAE 650 (S), equilibrada com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódiol37 mM, pH 8,0. Após o carregamento o meio foi lavado com 12 volumes de coluna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 137 mM, pH 8,0 para remover os reagentes solvente e detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi então lavado com 1 volume de coluna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 129 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. As saídas da coluna foram fechadas. A coluna foi armazenada na temperatura ambiente.
Após cerca de 64 horas, o meio foi lavado com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 129 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0 para recuperar a trombina gerada durante a incubação. Um total de 0,4 milhão
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 32/50 de ui de atividade de coagulação foi recuperado da coluna cujo 0,3 milhão de ui tinha uma atividade específica > 2.000 ui/mg e foi reunido para processamento adicional, sem a necessidade de etapas adicionais de purificação de proteína.
Exemplo 4
Tampões de trometamol e incubação a 10°C, 14,5°C e 22°C por cerca de 64 horas
195 g de complexo de protrombina tratado com solventedetergente foram diluídos com 424 g de água para reduzir sua condutividade 10 de 28,9 mS/cm para 9,39 mS/cm. A solução foi então titulada para pH 8,0 com hidróxido de sódio 1 M. Cerca de 140 g desta solução foram carregados para cima de colunas encamisadas de 1 cm de diâmetro recheadas com um leito de altura de 13 cm de DEAE Sepharose CL6B, equilibradas com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Após o carregamento o 15 meio foi lavado com 10 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para remover os reagentes solvente e detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi então lavado com 1 volume de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. As saídas das colunas foram fechadas. Uma coluna foi deixada na 20 temperatura ambiente (21,8°C±0,4°C). As outras foram mantidas a 10°C ou 14,5°C pela água de circulação resfriada através das camisas das colunas.
Após cerca de 64 horas, a temperatura nas camisas foi mudada para 18°C e o resfriamento na camisa foi interrompido. O meio foi lavado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para recuperar a 25 trombina gerada durante a incubação. Os resultados são mostrados na Tabela 1.
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Tabela 1
| Coluna | Temperatura de incubação, °C | Atividade de coagulação de trombina | |
| Total recuperada, ui | Total > 2.000 ui/mg, ui | ||
| 1 | 10 | 212.000 | 149.000 |
| 2 | 14,5 | 293.000 | 174.000 |
| 3 | 22 | 353.000 | 142.000 |
Exemplo 5
Tampões de trometamol e incubação a 15°C, 23°C e 26°C por cerca de 64 horas
458 g de complexo de protrombina tratado com solventedetergente foram diluídos com 977 g de água para reduzir sua condutividade de 28,9 mS/cm para 9,39 mS/cm. A solução foi então titulada para pH 8,0 com hidróxido de sódio 1 M. Cerca de 140 g desta solução foram carregados para cima de colunas encamisadas de 1,6 cm de diâmetro recheadas com um leito de altura de 13 cm de DEAE Sepharose CL6B, equilibradas com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Após o carregamento o meio foi lavado com 10 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para remover os reagentes solvente e detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi então lavado com 1 volume de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. As saídas das colunas foram fechadas. Água foi circulada através das camisas das colunas a 15°C, 23°C e 26°C.
Após 65 horas, a circulação de água foi interrompida. O meio foi lavado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para recuperar a trombina gerada durante a incubação. Os resultados são mostrados na Tabela 2.
Tabela 2
| Coluna | Temperatura de incubação, °C | Atividade de coagulação de trombina | |
| Total recuperada, ui | Total > 2.000 ui/mg, ui | ||
| 1 | 15 | 864.000 | 423.000 |
| 2 | 23 | 756.000 | 284.000 |
| 3 | 26 | 800.000 | 128.000 |
Exemplo 6
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 34/50
Tampões de trometamol e incubação na temperatura ambiente por 16 horas, 40 horas e 64 horas
248 g de complexo de protrombina tratado com solventedetergente foram diluídos com 523 g de água para reduzir sua condutividade de 26,9 mS/cm para 9,33 mS/cm. A solução foi então titulada para pH 8,0. Cerca de 195 g desta solução foram carregados para cima de colunas encamisadas de 1 cm de diâmetro recheadas com um leito de altura de 13 cm de DEAE Sepharose CL6B, equilibradas com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Após o carregamento de cada coluna, o meio foi lavado com 10 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para remover os reagentes solvente e detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi então lavado com 1 volume de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 5 mM, pH 8,0. As saídas das colunas foram fechadas. As colunas foram armazenadas na temperatura ambiente.
As três colunas foram armazenadas por 16 horas, 40 horas, e 64 horas. No final de cada incubação o meio foi lavado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para recuperar a trombina gerada durante a incubação. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3
| Coluna | Horas de incubação | Atividade de coagulação de trombina | |
| Total recuperada, ui | Total > 2.000 ui/mg, ui | ||
| 1 | 16 | 30.700 | 0 |
| 2 | 40 | 407.000 | 197.000 |
| 3 | 64 | 500.000 | 158.000 |
Exemplo 7: Mecanismo de geração de trombina
Experimentos foram realizados para determinar o mecanismo de ativação de protrombina para trombina no processo da invenção. Materiais
Protrombina vírus-inativada purificada
Fator X inativado por vírus purificado
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Antitrombina vírus-inativada
A protrombina e o fator X têm sido inativados pelo tratamento com solvente e detergente usando fosfato de tri-n-butila e polissorbato 80. A antitrombina tem sido vírus-inativada pelo tratamento térmico.
Método
Três colunas de cromatografia foram recheadas com gel de troca aniônica DEAE Sepharose CL-6B e equilibradas em tampão de trometamol - NaCl. As três colunas foram então usadas como descrito na Tabela 4, e os produtos foram então testados para a atividade de trombina.
Tabela 4
| Coluna 1 | Coluna 2 | Coluna 3 |
| Carga de Protrombina | Carga de Fator X | Carga de Fator X |
| Lavagem com tampão de equilíbrio | Lavagem com tampão de equilíbrio | Lavagem com tampão de equilíbrio |
| Incubação com tampão de cálcio | Incubação com tampão de cálcio | Incubação com tampão de cálcio |
| Eluição com tampão de equilíbrio | Eluição com tampão de equilíbrio | Eluição com tampão de equilíbrio |
| Protrombina carregada | Carga de Antitrombina | |
| Eluição com tampão de equilíbrio | Lavagem com tampão de equilíbrio | |
| Carga de Protrombina | ||
| Eluição com tampão de equilíbrio |
Os resultados são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5
| Coluna 1 | Coluna 2 | Coluna 3 | |
| Protrombina total carregada, ui | 2039 | 2044 | 2061 |
| Fator X total carregado, u | 0 | 1222 | 1196 |
| Antitrombina aplicada, u | 0 | 0 | 850 |
| Trombina gerada, ui por ui de protrombina | <0,07 | 113 | <0,07 |
Os resultados mostram que a trombina não pode ser gerada da protrombina vírus-inativada exclusivamente pelo cálcio (Coluna 1). A 15 trombina pode ser gerada da protrombina vírus-inativada pela incubação com fator X inativado por vírus que havia sido previamente incubado com cálcio e o cálcio então removido antes do contacto com a protrombina (Coluna 2). A
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 36/50 trombina não pode ser gerada da protrombina vírus-inativada pela incubação com fator X inativado por vírus que havia sido previamente incubado com cálcio, se o fator X/fator Xa foi então inativado com antitrombina e tanto o cálcio quanto a antitrombina foram removidos antes do contacto com a 5 protrombina (Coluna 3).
O mecanismo de geração de trombina no processo da invenção requer que o fator X seja ativado pelo cálcio e que a protrombina seja então ativada para trombina pela ação do fator X ativado (isto é fator Xa), em vez de diretamente pelo cálcio. A protrombina isolada portanto não é um material 10 inicial adequado para uso no processo da invenção.
Exemplo 8: falta de geração de trombina usando apenas protrombina purificada e cálcio
Protrombina (Fator II) foi separada de outras proteínas de fator de coagulação de complexo de protrombina após o tratamento virucida com 15 solvente e detergente, pela passagem através de uma coluna Chelating Sepharose carregada de cobre.
Esta solução de proteína foi quer usada na presença de reagentes solvente e detergente (SD) de co-purificação, quer foi separada dos reagentes solvente e detergente por re-cromatografia sobre gel de troca 20 aniônica DEAE Sepharose.
A protrombina em solução foi incubada em pH 6,5 com tampão de cloreto de cálcio 40 mM a 25°C por 3 horas. A atividade de trombina foi então medida.
Os resultados são mostrados na Tabela 6.
Tabela 6
| Amostras | Atividade de trombina após 3 horas, ui/ml |
| Protrombina com SD | menor do que 0,05 |
| Protrombina após remoção de SD | menor do que 0,05 |
Os resultados confirmam que a protrombina humana isolada não foi convertida em trombina pela ação de íons de cálcio sozinhos após
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 37/50 sofrer um procedimento de inativação de vírus por solvente-detergente, independente de se os reagentes SD foram removidos ou não antes da adição dos íons de cálcio. A protrombina isolada portanto não é um material inicial adequado para uso no processo da invenção.
Exemplo 9: falta de geração de trombina pela ação de cálcio sobre o complexo de protrombina durante ou após o tratamento com os reagentes solvente-detergente
Amostras de três diferentes complexos de protrombina (contendo fatores Π, IX e X) foram incubadas com cloreto de cálcio 20 mM em solução e ensaiadas para a atividade de trombina após a incubação por 3 horas e 5 horas.
As amostras de complexo de protrombina (PCC) derivadas de plasma humano foram:
A: eluato de PCC da cromatografia de troca aniônica de CPS.
B: eluato de PCC contendo 1% de detergente polissorbato 80 e 0,3% de solvente fosfato de tri-n-butila (TNBP).
C: PCC tratado com solvente-detergente do qual o solventedetergente havia sido removido.
Nenhuns dos materiais de complexo de protrombina usados nestes experimentos foram ativados durante sua manufatura, quer intencional quer intencionalmente, como determinado pelos testes NAPTT e FCT para fatores de coagulação ativados.
Os resultados são mostrados na Tabela 7.
Tabela 7
| Amostra | Trombina após 3 horas, ui/ml | Trombina após 5 horas, ui/ml |
| A | 619 | 1168 |
| B | menor do que 1 | 3,48 |
| C | menor do que 1 | 2,02 |
Os resultados mostram que trombina desprezível foi gerada do complexo de protrombina (não ativado) em solução após ter sido tratado com
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 38/50 solvente-detergente independentemente de se o solvente-detergente permaneceu na preparação no momento da incubação com cálcio (comparar os resultados da amostra A com aquelas dos exemplos B e C). Isto confirmou a arte anterior ensinando que o cálcio sozinho não foi suficiente para ativar o 5 complexo de protrombina tratado com solvente-detergente. Uma característica essencial do processo da invenção é que o material contendo protrombina tratado com solvente-detergente é carregado para cima de um meio de troca aniônica com o objetivo de trombina ser gerada.
Exemplo 10
Ativação com íons de cálcio e de magnésio
249 ml de complexo de protrombina tratado com solventedetergente foram diluídos com 150 ml de água deionizada para reduzir sua condutividade para 16 mS/cm. A solução foi então titulada para pH 8,0 com hidróxido de sódio 1 M. 82 g a 87 g desta solução foram então carregados 15 para cima de cada uma de três colunas de 1 cm de diâmetro, recheadas cada uma com 10 ml de DEAE Sepharose CL6B, equilibradas com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 137 mM, pH 8,0. Após o carregamento, o meio foi lavado com 10 volumes de coluna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 137 mM, pH 8,0 para remover os reagentes solvente e 20 detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi então lavado com 1 volume de coluna de tampão de ativação, quer citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 129 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0 (coluna 1), quer com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 129 mM, cloreto de magnésio 2 mM, pH 8,0 (coluna 2), ou com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, 25 cloreto de sódio 129 mM, cloreto de cálcio 2 mM, cloreto de magnésio 2 mM, pH 8,0 (coluna 3). As saídas das colunas foram fechadas. As colunas foram armazenadas na temperatura ambiente.
Após 64 horas, o meio foi lavado com o tampão de ativação para recuperar a trombina gerada durante a incubação. Os resultados são
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 39/50 mostrados na Tabela 8.
Tabela 8
| Coluna | Atividade cromogênica de trombina total recuperada | Ion de metal no tampão de ativação |
| 1 | 178.000 ui | Cálcio |
| 2 | 66.500 ui | Magnésio |
| 3 | 256.000 ui | Cálcio / Magnésio |
Exemplo 11: Formulação
Solução de trombina filtrada do vírus preparada como no
Exemplo 1 foi formulada para trometamol 10 mM, NaCI 200 mM, CaCl2 40 mM, sacarose 2%, pH 7,0 e potência ajustada para cerca de 500 ui de atividade de coagulação de trombina / ml. 5 ml desta solução foram dispensados para dentro de frascos de vidro e secos por congelamento. O material seco por congelamento foi termicamente tratado a 80°C por 72 horas. Em 3 corridas uma recuperação média de 98% de atividade de coagulação de trombina foi alcançada por meio da secagem por congelamento e uma média de 98% por intermédio do tratamento térmico.
Exemplo 12: Formulação
Solução de trombina foi formulada a aproximadamente 1250 ui de atividade de coagulação / ml. Todas as formulações continham trometamol 10 mM e cloreto de sódio 200 mM em pH 7,0. Adicionalmente, continham os componentes adicionados mostrados abaixo. As soluções foram envasadas para frascos, 2 ml por frasco. Os frascos foram secos por congelamento e termicamente tratados a seco a 80°C por 72 horas. Os frascos foram então reconstituídos com água e ensaiados para determinar a atividade de trombina. A atividade de trombina foi comparada com a atividade de trombina em amostra obtidas antes da secagem por congelamento. Os resultados são mostrados na Tabela 9.
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 40/50
Tabela 9
| [Cloreto de cálcio], mM | Componentes adicionais | Recuperação da atividade de coagulação através de secagem por congelamento e tratamento térmico |
| 2 | - | 59% |
| 10 | - | 69% |
| 40 | - | 88% |
| 2 | 1% sacarose | 88% |
| 2 | 2% sacarose | 93% |
| 2 | 1% trealose | 98% |
| 2 | 1% rafinose | 88% |
| 2 | 1% albumina humana | 60% |
| 2 | 1%PEG4OOO | 78% |
Os resultados mostraram que o estabilizador albumina convencional não proporciona estabilidade através de secagem por congelamento e tratamento térmico. Outras combinações de cálcio e 5 carboidrato deram estabilidade melhorada através de secagem por congelamento e tratamento térmico.
Exemplo 13: Formulação de trombina, secagem por congelamento e tratamento térmico
Solução de trombina foi formulada a 500 ui/ml (quantidade de 10 5 ml). Todas as formulações também continham trometamol 10 mM e sódio
200 mM em pH 7,0 e adicionalmente continham os componentes mostrados abaixo. As soluções foram envasadas em frascos, 5 ml por frasco. Os frascos foram secos por congelamento e termicamente tratados a 80°C por 72 horas ou a 100°C por 24 horas. Os frascos foram então reconstituídos com água e 15 ensaiados para determinar a atividade de trombina. A atividade de trombina foi comparada com a atividade de trombina em amostras obtidas antes da secagem por congelamento. Os resultados são mostrados na Tabela 10.
Tabela 10
| [Cloreto de cálcio], mM | Componentes adicionais | Volume envasado, ml | Recuperação da atividade de coagulação através de secagem por congelamento | |
| 80°C/72 horas | 100°C/24 horas | |||
| 2 | 2% de sacarose | 5 | 79% | - |
| 40 | 2% de sacarose | 5 | 97% | 89% |
| 2 | 1% de trealose | 5 | 92% | 73% |
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 41/50
Os resultados mostraram que a formulação ótima foi trometamol 10 mM e sódio 200 mM em pH 7,0 mais cloreto de cálcio 40 mM e 2% de sacarose.
Exemplo 14: Preparação de trombina
1,17 kg de complexo de protrombina tratado com solventedetergente foram diluídos com 2,58 kg de água para reduzir sua condutividade de 27,5 mS/cm para 9,12 mS/cm. A solução foi então titulada para pH 8,0 com hidróxido de sódio 0,5 M. Esta solução foi carregada para cima uma coluna encamisada de diâmetro de 5 cm recheada com um leito de altura de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrada com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Após o carregamento o meio foi lavado com 15 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para remover os reagentes solvente e detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi então lavado com 1 volume de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. As saídas da coluna foram fechadas. Água a 20°C foi circulada através da camisa da coluna.
Após 64 horas, circulação de água foi interrompida. O meio foi lavado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para recuperar a trombina gerada durante a incubação. Os primeiros 4 volumes de efluente da coluna continham 4,3 milhões de unidades internacionais (ui) de atividade de coagulação de trombina com uma atividade de coagulação específica menor do que 2.000 ui/mg de proteína total. Os seguintes 9 volumes de coluna de efluente que continham 2,2 milhões de ui de atividade de coagulação em uma atividade específica de 2.100 ui/mg foram congelados a -40°C e mantidos para processamento posterior.
900 g do eluato congelado foram descongelados e filtrados usado um filtro de vírus Planova 15N que havia sido equilibrado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Houve uma
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 42/50 recuperação medida de 95% da atividade de trombina através do congelamento/descongelamento e de 102% através da filtração de vírus.
O filtrado foi então formulado para trometamol 10 mM, cloreto de sódio 200 mM, cloreto de cálcio 40 mM, 2% de sacarose, pela adição de um tampão adequado. A solução foi diluída para uma concentração atividade de coagulação de trombina estimada de 550 ui/ml com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 200 mM, cloreto de cálcio 40 mM, 2% de sacarose, pH 7,0, e então titulada com ácido clorídrico 0,5 M para pH 7,0.
Esta solução foi então filtrada através de um filtro de esterilização de 0,2 gm e então envasada para dentro de frascos, 5 g de solução por frasco. Os frascos foram secos por congelamento e então termicamente tratados a seco a 80°C por 72 horas. Houve uma recuperação medida de 97% da atividade de coagulação de trombina através da filtração de esterilização, de 102% através da liofilização e de 100% através do tratamento térmico a seco.
Exemplo 15: Tempos de incubação
150 ml de complexo de protrombina tratado com solventedetergente foram diluídos com água para reduzir a condutividade para aproximadamente 9,3 mS/cm. A solução foi então titulada para pH 8,0. Esta quantidade foi carregada para cima de cada uma de quatro colunas recheadas com 12,5-12,9 ml de DEAE Sepharose CL6B, que haviam sido equilibradas com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. As colunas foram então lavadas com o mesmo tampão para remover os reagentes solventedetergente e a proteína fracamente ligada. As colunas foram então lavadas com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, as saídas da coluna foram fechadas e as colunas foram isoladas na temperatura ambiente (aproximadamente 20°C) por períodos entre 35 horas e 85 horas. No final de cada período, uma das colunas foi lavada com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para recuperar a trombina gerada. Os resultados são
Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 43/50 mostrados na Tabela 11.
Tabela 11
| Coluna | Incubação(horas) | Atividade de coagulação de trombina | |
| Total recuperada (ui) | Total > 2.000 ui/mg (ui) | ||
| 1 | 35 | 229.344 | 144.751 |
| 2 | 45 | 267.860 | 144.463 |
| 3 | 65 | 289.359 | 128,578 |
| 4 | 85 | 266.844 | 101.687 |
Há uma tendência geral de rendimento crescente (unidades totais) mas de pureza decrescente (unidades > 2.000 ui/mg) com tempo de incubação crescente. Uma pessoa experiente pode escolher o tempo de incubação para dar o balanço mais favorável entre o rendimento total e a pureza em qualquer situação específica.
Claims (8)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para a preparação de trombina vírus-inativada, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) inativação de vírus por solvente-detergente de uma solução compreendendo protrombina e fator X;(b) carregamento do produto da etapa (a) para cima de um meio de troca aniônica;(c) lavagem do meio para remover os reagentes usados para a inativação de vírus por solvente-detergente na etapa (a); e (d) ativação da protrombina sobre o meio para formar trombina pela adição de íons de metal.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução compreendendo protrombina e fator X é um complexo de protrombina.
- 3. Método para a preparação de trombina vírus-inativada, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) inativação de vírus por solvente-detergente de uma solução compreendendo fator X;(b) carregamento do produto da etapa (a) para cima de um meio de troca aniônica;(c) lavagem do meio para remover os reagentes usados para a inativação de vírus por solvente-detergente na etapa (a);(d) ativação do fator X sobre o meio para formar fator Xa pela adição de íons de metal; e (e) carregamento de protrombina vírus-inativada para cima do meio de troca aniônica de tal modo que trombina seja gerada.
- 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de la 3, caracterizado pelo fato de que os íons de metal são íons de metal divalente.Petição 870180133475, de 24/09/2018, pág. 45/50
- 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os íons de metal divalente são íons de cálcio e/ou de magnésio.
- 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de1 a 5, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de (e) eluição seletiva da trombina do meio de troca aniônica.
- 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender as etapas de (f) passagem do produto da etapa (e) através de um filtro que retém patógenos;(g) adição de um íon de metal divalente e de um carboidrato no produto da etapa (f), e (h) secagem por congelamento e tratamento térmico do produto da etapa (g) para inativar vírus.
- 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são substituídas pelas etapas (a') e (b'):(a') carregamento de uma solução compreendendo protrombina e fator X para cima de um meio de troca aniônica; e (b') inativação de vírus por solvente-detergente da protrombina e do fator X sobre o meio.
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Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006011161A2 (en) * | 2004-06-29 | 2006-02-02 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Process for the preparation of virus-safe biological fluids |
| EP1685852A1 (en) * | 2005-02-01 | 2006-08-02 | Fondation pour la Recherche Diagnostique | Set of disposable bags for viral inactivation of biological fluids |
| US20060270015A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Dan Pawlak | Thrombin purification |
| EP1913138B1 (en) | 2005-07-29 | 2016-08-24 | Abbott Laboratories GmbH | Processes for the manufacture of pancreatin powder with low virus content |
| US11266607B2 (en) | 2005-08-15 | 2022-03-08 | AbbVie Pharmaceuticals GmbH | Process for the manufacture and use of pancreatin micropellet cores |
| US9198871B2 (en) | 2005-08-15 | 2015-12-01 | Abbott Products Gmbh | Delayed release pancreatin compositions |
| US10072256B2 (en) | 2006-05-22 | 2018-09-11 | Abbott Products Gmbh | Process for separating and determining the viral load in a pancreatin sample |
| WO2007135125A1 (en) * | 2006-05-22 | 2007-11-29 | Solvay Pharmaceuticals Gmbh | Process for separating and determining the viral load in a pancreatin sample |
| US7774628B2 (en) * | 2006-05-25 | 2010-08-10 | Foundry Networks, Inc. | Enabling/disabling power-over-ethernet software subsystem in response to power supply status |
| KR20100134078A (ko) * | 2008-04-16 | 2010-12-22 | 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼 | 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법 |
| JP5442310B2 (ja) * | 2009-04-23 | 2014-03-12 | 旭化成メディカル株式会社 | トロンビン溶液の調製方法 |
| US8945895B2 (en) * | 2009-07-31 | 2015-02-03 | Baxter International Inc. | Methods of purifying recombinant ADAMTS13 and other proteins and compositions thereof |
| AU2015252061A1 (en) * | 2009-07-31 | 2015-11-19 | Baxalta GmbH | Method for Purifying Recombinant ADAMTS13 and Other Proteins and Compositions Thereof |
| SE1050124A1 (sv) * | 2010-02-08 | 2011-08-09 | Linkoping Biocontrols Ab | Stabil lösning |
| CN102357259A (zh) * | 2011-07-28 | 2012-02-22 | 王珊珊 | 一种生物蛋白海绵及其制备方法 |
| WO2013180647A1 (en) * | 2012-05-31 | 2013-12-05 | Agency For Science, Technology And Research | Chromatographic purification of immunoglobulin g preparations with particles having multimodal functionalities |
| US9932388B2 (en) | 2014-11-13 | 2018-04-03 | Hemarus Therapeutics Limited | Chromatographic process for producing high purity fibrinogen and thrombin |
| CN113754757B (zh) * | 2021-07-01 | 2024-06-14 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种人纤维蛋白原的制备方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3336631A1 (de) * | 1983-10-08 | 1985-04-18 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur pasteurisierung von plasma oder von konzentraten der blutgerinnungsfaktoren ii, vii, ix und x |
| DE3843126C3 (de) * | 1988-12-22 | 1994-10-06 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Thrombinkonzentrates |
| IE73210B1 (en) | 1990-01-24 | 1997-05-07 | Warner Lambert Co | Process for the production of thrombin and high purity thrombin preparation thereby obtained |
| EP0443724B1 (en) * | 1990-02-20 | 1999-03-17 | Baxter International Inc. | Viral-safe purified human thrombin |
| FR2679251B1 (fr) * | 1991-07-18 | 1993-11-12 | Nord Assoc Essor Transfusion San | Procede de preparation d'un concentre de thrombine humaine destine a un usage therapeutique. |
| AT398079B (de) * | 1991-11-04 | 1994-09-26 | Immuno Ag | Präparation mit thrombinaktivität sowie verfahren zu ihrer herstellung |
| DE4137996A1 (de) | 1991-11-19 | 1993-05-27 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung eines virussicheren thrombinkonzentrates |
| AT397390B (de) * | 1992-04-06 | 1994-03-25 | Immuno Ag | Verfahren zur spaltung von proteinen |
| GB9503750D0 (en) * | 1995-02-24 | 1995-04-12 | Common Services Agency | Thrombin preparation |
| AT500670A1 (de) * | 1999-05-19 | 2006-02-15 | Bio & Bio Licensing Sa | Arzneimittel zur lokalen anwendung |
| US6245548B1 (en) * | 2000-03-09 | 2001-06-12 | American National Red Cross | Activation of pure prothrombin to thrombin with about 30% to about 40% sodium citrate |
| DE10012732A1 (de) * | 2000-03-18 | 2001-09-20 | Aventis Behring Gmbh | Thrombin-Zubereitungen und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| IL136552A (en) | 2000-06-05 | 2005-05-17 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Method for the inactivation of viruses by a solvent - detergent combination and by nanofiltration |
| US20030133829A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-17 | Baxter Healthcare Corporation | Process for inactivating pathogens in a biological material |
-
2002
- 2002-07-10 GB GBGB0216002.6A patent/GB0216002D0/en not_active Ceased
-
2003
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