PT1520018E

PT1520018E - Processo para a produção de uma preparação de trombina com inactivação viral

Info

Publication number: PT1520018E
Application number: PT03738334T
Authority: PT
Inventors: Caroline Connolly; Christopher Hardway; David Evans; Peter Feldman
Original assignee: Nhs Blood & Transplant
Priority date: 2002-07-10
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2007-04-30
Also published as: BR0312522A; GB0216002D0; IL165989A0; BRPI0312522B1; CA2491718C; US20060134769A1; AU2003244858B2; MXPA05000393A; ECSP055586A; PL208219B1; IL201146A; IL165989A; DE60311990D1; EP1520018B1; BRPI0312522B8; AU2003244858A1; NO20050090L; US8435779B2; EP1520018A1; NZ537502A

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO DE TROMBINA COM INACTIVAÇÃO VIRAL" A presente invenção refere-se um processo para a preparação de trombina com inactivação virai e a produtos preparados por estes processos. A trombina é uma protease de plasma multifuncional produzida na corrente sanguínea através da activação do seu precursor inactivo, a protrombina (também conhecida como factor II) . A protrombina é ela mesma activada pela acção do factor X activado (factor Xa) . Uma das funções principais da trombina no plasma sanguíneo é a conversão do fibrinogénio solúvel em fibrina insolúvel, no passo final da cascata de coagulação do sangue. Os monómeros de fibrina produzidos pela acção da trombina agrupam-se entre si e, em seguida, reticulam-se, para formar um coágulo de sangue. A trombina é utilizada em terapia tanto isoladamente como em combinação com o fibrinogénio nos assim chamados cicatrizantes de fibrina, para conseguir a hemostase, para cicatrizar feridas e para a adesão controlada de tecido.

Para todas as aplicações clínicas, é importante possuir trombina altamente pura, de modo a minimizar quaisquer efeitos secundários indesejáveis que resultam da presença de, por exemplo, outras proteases ou factores de coagulação, ou outros componentes contaminantes. Além disso, é altamente desejável que a trombina para uso clínico, em particular, se esta derivar de fontes humanas ou animais, seja tratada para inactivar quaisquer 1 vírus no sangue que possam estar presentes, por exemplo, vírus de hepatite ou HIV. São conhecidos na técnica vários métodos de inactivação de vírus, que incluem a pasteurização, tratamento térmico a seco e tratamento com solvente-detergente (Pathogen Inactivation of labile blood products, Council of Europe Expert Committee in Blood Transfusion Study Group on Pathogen Inactivation in Labile Blood Products, Transfusion Medicine, 2001, 11, 149-175) . É igualmente desejável que se removam ou reduzam outros agentes patogénicos, por exemplo, os agentes causadores de Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (TSE), que se crê, actualmente, serem priões. O tratamento térmico a seco é conhecido como sendo eficaz para a inactivação tanto de vírus com envelope como de alguns sem envelope, enquanto o tratamento com solvente-detergente é conhecido como sendo eficaz para a inactivação de vírus com envelope (i. e., revestidos com lípidos), tal como a hepatite B. O tratamento com solvente-detergente é actualmente um método habitualmente utilizado para a inactivação de vírus de produtos do sangue destinados ao uso clínico.

No passado, a activação de protrombina para trombina foi, muitas vezes, provocada pela adição de iões cálcio e tromboplastina (factor III) . A tromboplastina seria derivada de fontes humanas ou animais e, por consequência, uma fonte de possível contaminação do produto final. A Patente US 5304372 divulga um processo para a preparação de um concentrado de trombina humana a partir da fracção PPSB de plasma. O processo compreende a activação da protrombina na fracção PPSB, para produzir trombina pela adição de cloreto de cálcio, seguida pelo tratamento com solvente-detergente no produto resultante, para inactivar vírus. De acordo com a Patente US 5304372, o tratamento com solvente-detergente não 2 pode ser efectuado no material de partida PPSB, porque este eliminaria outros factores, tais como fosfolipidos, necessários para a reacção de activação de protrombina para trombina. 0 documento EP-A-0378798 divulga um processo para a preparação de trombina, que compreende a absorção do factor II a partir do plasma ou fracções de plasma sobre um suporte sólido, a activação do factor II sobre o suporte sólido para a trombina e, em seguida, a eluição da trombina. A Patente US 5714370 divulga a preparação de trombina a partir de protrombina com inactivação virai, que utiliza sais activos na coagulação para efectuar a activação da protrombina para trombina. O único método divulgado para a inactivação de virus da protrombina é o tratamento térmico. O Relatório Anual de 1993 da Dr. Karl Landsteiner Foundation on research at CLB (o Laboratório Central do serviço de transfusão de sangue da Cruz Vermelha dos Países Baixos) também relatou na página 10, que a activação com iões cálcio da protrombina tratada com solvente-detergente para formar trombina, foi apenas realizada com êxito na presença de fosfolipidos adicionados.

Seria vantajoso fornecer um método para a preparação de trombina a partir de protrombina, que tivesse experimentado um passo de inactivação de vírus com solvente-detergente, para remover os vírus com envelope. Seria igualmente vantajoso evitar completamente a utilização de outros produtos biológicos e, em particular, derivados de animais, por exemplo, tromboplastina, para activar a protrombina, dado que tais produtos podem servir como uma fonte de vírus infecciosos ou outros contaminantes indesejáveis, durante o processo de fabrico. 3

Num aspecto, a presente invenção fornece, em consequência, um primeiro método para a preparação de trombina com inactivação virai, compreendendo os passos de: (a) inactivação de virus com solvente-detergente de uma solução compreendendo protrombina e factor X; (b) carregamento do produto do passo (a) sobre um meio de permuta aniónica; (c) lavagem do meio para remover os reagentes utilizados para a inactivação de virus com solvente-detergente no passo (a); e (d) activação da protrombina no meio, para formar trombina, mediante a adição de iões metálicos. De uma forma preferida, os iões metálicos são iões metálicos divalentes, tais como iões magnésio e/ou cálcio.

De uma forma preferida, a trombina é, em seguida, eluída selectivamente a partir do meio de permuta aniónica.

Em alternativa, pode-se carregar uma solução compreendendo protrombina e factor X sobre um meio de permuta aniónica e realizar-se a inactivação do virus com solvente-detergente no meio. A presente invenção, em consequência, também fornece uma alternativa ao método anterior, em que os passos (a) e (b) são substituídos pelos passos (a') e (b'): (a') carregamento de uma solução compreendendo protrombina e factor X sobre um meio de permuta aniónica; e (b') inactivação de vírus com solvente-detergente da protrombina e factor X no meio. Os restantes passos 4 deste método alternativo são idênticos aos restantes passos do primeiro método descrito anteriormente. 0 método compreendendo os passos (a) e (b) é preferido ao método que compreende os passos (a') e (b'), dado que é mais fácil verificar a obtenção das condições de inactivação necessárias antes do carregamento sobre o meio. 0 material de partida para o processo da invenção pode ser qualquer solução que compreenda protrombina e factor X,

incluindo fracções de plasma ou protrombina e/ou factor X derivado por expressão de genes, por exemplo, em cultura celular ou espécies transgénicas, e protrombina e/ou factor X produzido por quaisquer outros métodos sintéticos. 0 material de partida pode ser preparado por qualquer método apropriado conhecido na técnica. De uma forma preferida, o material de partida é um complexo de protrombina ou um seu derivado que contém protrombina e factor X. 0 complexo de protrombina pode ser preparado por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por adsorção sobre meios de permuta aniónica a partir de sobrenadante crioprecipitado e eluição subsequente (P.A.

Feldman, L. Harris, M.E. Haddon, D.R. Evans e J.K. Smith,

Thrombosis Research, 1986, Suplemento VI:36, incorporado por referência) . Numa forma de realização preferida, o material de partida é o concentrado de complexo de protrombina (PCC), que foi preparado sob condições que minimizam o nível de factor de coagulação VII e de factores de coagulação activados no complexo de protrombina. 0 assim chamado "PCC de três factores" é, por consequência, um material de partida mais preferido do que o "PCC de quatro factores". 0 passo de inactivação de vírus com solvente-detergente é realizado utilizando reagentes e métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, os documentos US 4481189, US 4613501 e 5 US 4540573, todas incorporadas por referência). Os solventes apropriados incluem o fosfato de tri-n-butilo (TNBP) . Os detergentes apropriados incluem polissorbato (Tween) 80, polissorbato (Tween) 20 e TritonX-100. Uma combinação particularmente preferida é polissorbato 80 e TNBP. Numa forma de realização preferida, a solução contendo protrombina e o factor X é agitada com os reagentes de solvente e detergente. A inactivação de virus é realizada a uma temperatura e para um tempo suficientes para inactivar quaisquer virus com envelope que possam estar presente. Por exemplo, o tratamento com solvente-detergente pode ser efectuado durante cerca de 1 a cerca 24 horas, a uma temperatura de cerca de 4 a cerca de 37 °C, por exemplo, pelo menos durante cerca de 6 horas a uma temperatura de cerca de 23-27 °C. A solução contendo protrombina e o factor X tratada com solvente-detergente é, então carregada num permutador aniónico apropriado, sob condições tais que a protrombina e o factor X se ligam a meios de permuta aniónica. Se necessário, a solução tratada com solvente-detergente é primeiro diluída para reduzir a força iónica para uma que seja apropriada para a ligação da protrombina e do factor X sobre o permutador aniónico. Os meios de permuta aniónica apropriados estão disponíveis comercialmente, e incluem DEAE Sepharose CL6B, fornecido pela Amersham Biosciences e Fractogel EMD DEAE 650 (S), fornecido pela Merck. De uma forma preferida, o meio de permuta aniónica está presente numa coluna, para facilitar a lavagem e eluição. De uma forma preferida, se for utilizado um meio de permuta aniónica durante a preparação do material de partida, por exemplo, para a captura de protrombina e/ou factor X a partir de um material de fonte tal como plasma, então o mesmo meio de permuta aniónica é utilizado para o processo da invenção, de modo a minimizar a exposição a diferentes reagentes. 6

Após carregamento, o meio de permuta aniónica é lavado com um ou mais tampões de lavagem apropriados, para remover a proteína não ligada ou fracamente ligada e os reagentes com solvente-detergente. Os tampões de lavagem devem estar isentos de reagentes que possam produzir trombina a partir da protrombina ligada. A protrombina ligada é, em seguida, activada para formar trombina, pela adição de iões metálicos apropriados, de uma forma preferida, iões metálicos divalentes, tais como iões magnésio ou cálcio, de uma forma muito preferida, iões cálcio. Podem utilizar-se combinações de mais do que um tipo de ião metálico para a activação, por exemplo, uma mistura de iões cálcio e magnésio. De uma forma preferida, os iões metálicos são adicionados sob a forma de um tampão de activação e estão presentes numa concentração de entre cerca de 1 e cerca de 40 mM, de uma forma mais preferida, entre cerca de 1,5 e cerca de 17 mM e, de uma forma muito preferida, cerca de 2 mM no tampão. A protrombina ligada é incubada com os iões metálicos para um tempo suficiente e a uma temperatura apropriada, para que a reacção de activação prossiga. A temperatura deve ser suficientemente elevada para a reacção prosseguir, mas não tão elevada que as proteínas presentes sejam desnaturadas ou quaisquer microrganismos contaminantes sejam induzidos a crescer. A reacção é, de uma forma preferida, realizada a ou abaixo de cerca de 26 °C, por exemplo, a 10-26 °C, de uma forma mais preferida, a cerca da temperatura ambiente (20 °C) ou abaixo, durante cerca de 19-85 horas, de uma forma mais preferida, 19-65 horas e, de uma forma ainda mais preferida, durante cerca de 40-65 horas. Por exemplo, as condições de incubação apropriadas podem ser durante cerca de 65 horas a cerca de 20 °C. 7

Sem pretender vincular-se a qualquer teoria, crê-se que é a combinação dos iões metálicos (e. g., cálcio) e o meio de permuta aniónica ao qual a protrombina é ligada, que permite a activação da protrombina para formar trombina, sem a necessidade de adição de quaisquer outros agentes de activação, por exemplo, tromboplastina. Os iões metálicos activam o factor X na fracção adsorvida, para formar o factor Xa, e o factor Xa por sua vez, activa a protrombina para formar trombina. É igualmente possível carregar factor X com inactivação virai por solvente-detergente sobre o meio de permuta aniónica e activá-lo para formar o factor Xa, através da adição de iões metálicos antes da adição da protrombina ao meio de permuta aniónica. 0 factor Xa converte, em seguida, a protrombina em trombina sobre o meio. A presente invenção proporciona, em consequência, um segundo método para a preparação de trombina com inactivação virai, compreendendo os passos de: (a) inactivação de vírus por solvente-detergente de uma solução compreendendo o factor X; (b) carregamento do produto de passo (a) sobre um meio de permuta aniónica; (c) lavagem do meio, para remover os reagentes utilizados para a inactivação do vírus com solvente-detergente no passo (a); (d) activação do factor X sobre o meio, para formar o factor Xa mediante a adição de iões metálicos; e (e) carregamento de protrombina com inactivação virai sobre o meio de permuta aniónica, tal que é produzida trombina.

De uma forma preferida, a trombina é, em seguida, eluida selectivamente a partir do meio de permuta aniónica. Igualmente de uma forma preferida, os iões metálicos são iões metálicos divalentes, tais como iões magnésio e/ou cálcio. 0 material de partida para o segundo processo da invenção, podem ser quaisquer soluções que compreendam separadamente protrombina e factor X, incluindo fracções de plasma, protrombina e/ou factor X derivado pela expressão de genes, por exemplo, em cultura celular ou espécies transgénicas, e protrombina e/ou factor X produzido por outros métodos sintéticos. Os materiais de partida podem ser preparados por qualquer método apropriado conhecido na técnica. As condições apropriadas de inactivação de vírus, carregamento e activaçâo para o segundo método da invenção, são como descritas anteriormente para o primeiro método da invenção.

Após a activaçâo do factor X para formar o factor Xa, o meio de permuta aniónica pode ser opcionalmente lavado, utilizando um tampão apropriado, para remover os iões metálicos antes de se adicionar a protrombina.

Depois da conversão de protrombina em trombina, a trombina pode ser recuperada pela eluição com um tampão de recuperação apropriado. A força iónica e o pH do tampão de recuperação são, de uma forma preferida, escolhidos para remover selectivamente a trombina e deixar outras proteínas, por exemplo, qualquer protrombina não convertida, ligada ao meio de permuta aniónica. 0 pH do tampão de recuperação utilizado deve ser inferior ao pi da trombina, tal que a trombina não se ligue ao permutador aniónico. 0 pH apropriado para o tampão de recuperação é pH 8. De uma forma preferida, os tampões utilizados para lavagem, 9 activação e recuperação, não contêm quaisquer sais de fosfato, de modo a evitar a precipitação de fosfato de cálcio insolúvel durante o processo de fabrico. A trombina produzida é altamente purificada e concentrada e pode ser formulada directamente, sem purificação posterior. Em alternativa, podem ser realizados passos de purificação adicionais, se desejado. Por exemplo, a solução de trombina obtida a partir dos meios do permutador aniónico, pode ser submetida a passos adicionais de redução ou inactivação do virus. Por exemplo, a solução pode ser filtrada através de um filtro de remoção de virus, tal como um filtro Planova 15N. Essa filtração pode também servir para remover o agente causador de Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (TSE).

Uma vez separado do meio de permuta aniónica, o produto de trombina pode ser formulado para armazenagem de longa duração, antes do uso clínico. De uma forma preferida, a solução de trombina é liofilizada, opcionalmente na presença de um ou mais estabilizantes para auxiliar a limitar a desnaturação durante a liofilização e qualquer tratamento térmico subsequente. Os estabilizantes apropriados incluem hidratos de carbono, tais como a sacarose, rafinose ou trealose, e iões metálicos divalentes, tal como os iões cálcio. Particularmente preferida é uma combinação de iões cálcio e um hidrato de carbono, tal como a sacarose. De uma forma preferida, é evitada a utilização de estabilizantes de proteínas, tais como albumina, de modo a minimizar possíveis fontes de contaminação no produto final.

As condições de liofilização apropriadas incluem a secagem primária a uma temperatura de cerca de -35 °C e uma pressão de cerca de 100-130 microbar (10-13 Pa), seguida por secagem secundária a uma temperatura de cerca de +35 °C e uma pressão de cerca 30 microbar (3 Pa). 10 0 produto de trombina liofilizado pode ser submetido a um passo adicional de inactivação do virus por tratamento térmico, por exemplo, aquecendo a cerca de 80 °C, durante cerca de 72 horas ou 100 °C, durante 24 horas. Verificou-se que uma combinação de iões cálcio e um hidrato de carbono, tal como a sacarose, estabiliza eficazmente a trombina produzida de acordo com a invenção, durante o tratamento térmico terminal para inactivar os virus. É desejável, para produtos derivados do sangue, que se submetam a pelo menos dois passos separados de inactivação ou redução de virus durante o fabrico. Uma vantagem do processo da invenção é que permite a realização de passos múltiplos de inactivação ou redução de virus diferentes, de modo a inactivar ou reduzir tanto os virus com envelope como os sem envelope, e outros agentes patogénicos, por exemplo, os agentes causadores de TSE. O tratamento com solvente-detergente é conhecido por quebrar os envelopes lipidicos de virus com envelope, enquanto a filtração separa as partículas segundo um determinado tamanho e o tratamento térmico inactiva os vírus termicamente instáveis. É desejável, para incorporar passos múltiplos de inactivação ou redução que são baseados em diferentes princípios, de modo a remover ou reduzir tantos agentes patogénicos diferentes quanto possível. Numa forma de realização preferida, o processo compreende um passo adicional de inactivação ou redução de vírus adicional, além do tratamento com solvente-detergente. Numa forma de realização mais preferida, o processo compreende dois passos adicionais de redução ou inactivação de vírus, além do tratamento com solvente-detergente. De uma forma preferida, o processo compreende um passo físico de remoção de vírus (e. g., nanofiltração) e um passo de inactivação de vírus, além do tratamento com solvente-detergente. 11

Outra vantagem do processo da invenção, é que a activação da protrombina e purificação da trombina resultante podem ser conseguidas utilizando o mesmo tipo de meio de permuta aniónica que se utilizou anteriormente para preparar a protrombina e o material de partida do factor X. A formulação do produto também utiliza reagentes que já foram utilizados no processo de preparação. Isto minimiza a exposição da trombina a uma multiplicidade de reagentes, o que é benéfico no fabrico de um produto farmacêutico. Uma vantagem adicional do processo, é que minimiza a ameaça à integridade de outras operações de fabrico, colocada pelo possível contacto com a protease de trombina altamente potente. Isto pode ser normalmente evitado apenas pela separação da instalação de fabrico da trombina de outro equipamento e actividades na fábrica. Tal separação é dispendiosa e de trabalho intensivo. Igualmente, o processamento dos intermediários com inactivação virais (e. g., tratados com solvente-detergente) tem que ser executado numa área de fabrico separada e isolada, para evitar qualquer contaminação subsequente. A incapacidade da técnica anterior em produzir trombina após tratamento com solvente-detergente, requeria a utilização de um espaço de fabrico significativamente mais separado e riscos adicionais no manuseamento do produto durante a transferência de passo para passo. Complementarmente, existia também o risco potencial para o pessoal de fabrico, do manuseamento de uma protease, que pode ter efeitos trombóticos significativos se introduzida inadvertidamente na sua circulação. Estes problemas são minimizados pela utilização do processo da invenção, porque: (a) o tratamento prévio com solvente-detergente significa que a trombina produzida não necessita de ser processada em numerosas áreas de fabrico diferentes, cada uma das quais tendo que ser isolada das outras actividades; 12 (b) o número de passos de fabrico (particularmente após a produção de trombina a partir de protrombina) é minimizado; e (c) o rendimento é suficiente para proporcionar quantidades significativas de trombina a partir de volumes muito pequenos.

Deste modo, o confinamento do processo é grandemente simplificado. É igualmente vantajoso limitar a exposição do produto a múltiplos reagentes diferentes durante o fabrico, dado que tais reagentes podem servir como uma fonte de contaminação ou modificação indesejáveis do produto. A minimização do número de reagentes e passos requeridos para o fabrico de trombina a partir de protrombina é uma vantagem adicional do processo da invenção. A trombina preparada utilizando o processo da invenção pode ser utilizada clinicamente, isoladamente ou em combinação com fibrinogénio num kit de cicatrização de fibrina. 0 seguinte é uma descrição mais pormenorizada de formas de realização preferidas do processo da invenção.

Remoção de crioprecipitado a partir do plasma 0 plasma humano congelado é condicionado em redor de -11 °C, descongelado a cerca de +1 °C e o crioprecipitado recolhido por centrifugação. 0 sobrenadante é designado por sobrenadante crioprecipitado (CPS). 13

Captura do complexo de protrombina a partir do sobrenadante crioprecipitado

Adsorção do complexo de protrombina a partir do sobrenadante crioprecipitado

Adiciona-se o meio de permuta aniónica, tal como DEAE Sepharose CL-6B, ao CPS em proporções de, por exemplo, ~10 mL de meio de permuta aniónica cheio por quilograma de CPS. Agita-se a mistura durante um tempo apropriado e, em seguida, o meio (incluindo a proteina adsorvida) é recuperado a partir do CPS, por exemplo, por centrifugação.

Eluição do complexo de protrombina 0 meio de permuta aniónica recuperado é suspenso num tampão adequado e cheio numa coluna de cromatografia. 0 meio é lavado com um tampão de baixo teor salino, para remover as proteínas fracamente ligadas e indesejadas. As condições de carregamento e lavagem são controladas para minimizar especificamente o nível do factor de coagulação VII e dos factores de coagulação activados no complexo de protrombina eluído. 0 meio é em seguida lavado com um tampão de eluição com um alto teor salino, para recuperar o complexo de protrombina. 0 pico da proteína é recolhido selectivamente, para evitar a contaminação do complexo de protrombina com factores de coagulação activados. 0 eluato pode ser armazenado congelado.

Tratamento com solvente-detergente A solução do complexo de protrombina é filtrada através de 14 um filtro de tamanho de poro de 0,4 5 μιη ou inferior. Os reagentes com solvente-detergente são em seguida adicionados e a mistura é agitada a uma temperatura e durante um espaço de tempo conhecido, para inactivar quaisquer vírus com envelope que possam estar presentes.

Cromatografia de activação da protrombina

Diluição do complexo de protrombina tratado com solvente--deterqente O complexo de protrombina tratado com solvente-detergente é em seguida diluído com, por exemplo, água, para reduzir a força iónica da solução para uma que seja apropriada para a ligação sobre um permutador aniónico.

Carregamento do segundo permutador aniónico A solução de proteína diluída é bombada através de uma coluna contendo um meio de permuta aniónica cheio. De modo vantajoso, este pode ser o mesmo meio do que o utilizado para a preparação da protrombina e do factor X a partir do CPS ou de outra fonte. A contaminação microbiológica durante a produção de trombina é minimizada pela higienização apropriada do meio de permuta aniónica e pela filtração de tampões para remover a contaminação bacteriana (e. g., por utilização de filtros de 0,2 μιη) . O meio é lavado com o tampão utilizado para equilibrar a coluna, para remover a proteína fracamente ligada e os reagentes com solvente-detergente, e para equilibrar o meio com sais tampão que são os mais favoráveis para os passos de processamento subsequentes. O meio é em seguida lavado com 15 aproximadamente 1 volume de coluna de um tampão contendo cálcio, por exemplo, o tampão de equilíbrio mais cloreto de cálcio 2 mM.

Incubação por activação

As saídas da coluna são fechadas e a coluna é mantida a uma temperatura pré-determinada, para um período de tempo definido, por exemplo, 65 horas a 20 °C. Durante a incubação, a protrombina é convertida em trombina.

Recuperação da trombina

No final da incubação, a coluna é lavada com o tampão de equilíbrio, para recuperar a trombina. As proteínas não afectadas pela incubação por activação permanecem ligadas ao meio, dado que as condições utilizadas para esta lavagem, em termos de pH, componentes do tampão e força iónica, são as mesmas que as utilizadas para a lavagem após carregamento da coluna. A trombina não se liga aos permutadores aniónicos a pH abaixo do seu pi, assim que é lavada pelo tampão. Por exemplo, a pH 8, a trombina não se liga aos permutadores aniónicos, mas o seu precursor, a protrombina, liga-se. O pico que é eluído, é recolhido em fracções, os primeiros volumes de coluna de efluente da coluna são de trombina de baixa pureza e contêm a maioria de qualquer trombina degradada ou danificada que possa estar presentes. Os volumes de coluna seguintes são de pureza mais elevada e, se separados dos primeiros volumes de coluna, podem ser utilizados sem purificação posterior. Em alternativa, todo o efluente da coluna pode ser recolhido e posteriormente purificado. 16

Filtração do vírus

Pode utilizar-se um passo adicional de redução do vírus. 0 eluato da coluna que contém a trombina pode ser filtrado através de um filtro de remoção de vírus validado, tal como um filtro Planova 15N. Essa filtração pode também remover ou reduzir outros agentes patogénicos, por exemplo, os agentes causadores de TSE.

Formulação A trombina é agora formulada e ajustada à sua potência alvo, para armazenagem de longa duração antes do uso clínico. Um método recomendado é a adição de um hidrato de carbono, tal como sacarose, e cálcio, para uma concentração alvo de cloreto de sódio e, em seguida, secar-se por congelação a solução. Antes da liofilização, o produto formulado pode ser filtrado através de um filtro de esterilização (e. g., um filtro de 0,2 μιη) como requerido para uso farmacêutico.

Tratamento térmico terminal A formulação seca por congelação pode ser tratada termicamente de modo terminal para inactivar quaisquer vírus que possam estar presentes. A trombina preparada através da utilização do processo da invenção pode ser utilizada clinicamente, isoladamente ou em combinação com fibrinogénio, num kit de cicatrização de fibrina. Em consequência, a presente invenção também proporciona trombina 17 obtida de acordo com o processo da invenção, para utilização em terapia, e kits farmacêuticos que compreendem trombina obtida de acordo com o processo da invenção, em combinação com fibrinogénio. Os kits preferidos são os que compreendem trombina preparada de acordo com o processo da invenção e fibrinogénio preparado de acordo com o pedido de patente co-pendente do Reino Unido da Requerente, intitulado "Process and Composition", apresentado a 10 de Julho de 2002. A invenção será ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos. A preparação de PCC é descrita em: Feldman P A, Bradbury P I, Williams J D, Sims G E C, McPhee J W, Pinnell Μ A, Harris L, Crombie GI, Evans D R, "Large scale preparation and biochemical characterisation of a new high purity factor IX concentrate prepared by metal chelate affinity chromatography", Blood Coagulation and Fibrinolysis 1994; 5:939-948. O pH das soluções foi ajustado mediante a utilização de concentrações apropriadas de hidróxido de sódio, para aumentar o pH ou ácido clorídrico, para reduzir o pH.

Mediu-se a trombina pelo ensaio de coagulação, que mede o tempo para coagular uma amostra de fibrinogénio e/ou pelo ensaio cromogénico, que mede a absorvância de um cromóforo libertado pela clivagem mediada por trombina, de um péptido sintético. Tais métodos de ensaio são conhecidos dos especialistas na técnica.

Ensaio de coagulação da trombina 0 padrão é calibrado em relação a um padrão 18 internacionalmente aceite, e é diluído em tampão de ensaio, tal como trometamol 50 mM, cloreto de sódio 100 mM, albumina a 1%, pH 7,5, para uma gama apropriada de concentrações, por exemplo, de 1 a 7 iu/mL. As amostras são diluídas dentro desta gama de concentrações.

Os tempos de coagulação das soluções de trombina diluídas são medidos após a adição de fibrinogénio humano a uma concentração fixa. A relação entre as amostras de ensaio e o padrão, permite em seguida o cálculo da concentração de trombina na amostra, expressa em unidades internacionais (iu) por mL.

Ensaio cromogénico da trombina O padrão é calibrado em relação a um padrão internacionalmente aceite, e é diluído em tampão de ensaio, tal como trometamol 50 mM, cloreto de sódio 100 mM, albumina a 0,1%, pH 7,3, para uma gama apropriada de concentrações, por exemplo, de 0,5 a 5 iu/mL. As amostras são diluídas dentro desta gama de concentrações. A trombina diluída é em seguida adicionada a um substrato cromogénico (por exemplo, S-2238 da Chromogenix) e a mistura é incubada para um período de tempo definido. Em seguida, pára-se a reacção mediante a adição de, por exemplo, ácido acético. A absorvância da solução é em seguida medida a 405 nm (para S-2238). A concentração de trombina é proporcional à cor revelada e a concentração da amostra pode ser interpolada a partir da linha padrão. 19

Exemplo 1: Cromatografia de activação da protrombina. Tampões de trometamol e incubação a 20 °C durante 62,5 horas

Diluíram-se 1,19 kg de complexo de protrombina tratado com solvente-detergente com 2,50 kg de água, para reduzir a sua condutividade de 26,4 mS/cm para 9,28 mS/cm. A solução foi em seguida titulada para pH 8,0. Esta solução foi carregada sobre uma coluna encamisada de 5 cm de diâmetro, cheia com um leito de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrada com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Após carregamento, o meio foi lavado com 15 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, para remover os reagentes com solvente-detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi em seguida lavado com 1 volume da coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. Fecharam-se as saídas da coluna. Fez-se circular água a 20 °C através da camisa.

Após 62,5 horas, parou-se a circulação de água. O meio foi lavado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0 para recuperar a trombina produzida durante a incubação. Os primeiros 3 volumes de coluna de efluente da coluna, que continham 3,8 milhões de unidades internacionais (iu) de actividade de coagulação da trombina, foram descartados, dado que a actividade de coagulação específica foi inferior a 2.000 iu/mg de proteína total. Os 11 volumes de coluna de efluente seguintes, que continham 2,8 milhões iu de actividade de coagulação, possuíam uma actividade específica de 2.400 iu/mg e foram reunidos para processamento posterior, sem necessidade de passos adicionais de purificação da proteína. 20

Exemplo 2: Cromatografia de activação da protrombina. Tampões de citrato-fosfato e DEAE Sepharose

Diluíram-se 4,4 kg de complexo de protrombina tratado com solvente-detergente com 6,3 kg de água, para reduzir a sua condutividade para 9,3 mS/cm. A solução foi em seguida titulada para pH 8,0. Carregaram-se 7,1 kg desta solução sobre uma coluna de 9 cm de diâmetro, cheia com um leito de 12,5 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrada com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 68,5 mM, pH 8,0. Após carregamento, o meio foi lavado com 11 volumes de coluna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 68 mM, pH 8,0, para remover os reagentes com solvente-detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi em seguida lavado com 1 volume de coluna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 64 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. Fecharam-se as saídas da coluna. Armazenou--se a coluna à temperatura ambiente.

Após cerca de 64 horas, o meio foi lavado com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 68 mM, pH 8,0, para recuperar a trombina produzida durante a incubação. Recuperou-se um total de 11 milhões iu de actividade de coagulação da coluna, dos quais 3,8 milhões iu possuíam uma actividade específica de > 2.000 iu/mg e foram reunidos para processamento posterior, sem necessidade de passos adicionais de purificação da proteína.

Exemplo 3: Cromatografia de activação da protrombina. Tampões de citrato-fosfato e Fractogel EMD DEAE 650 (S)

Diluíram-se 148 mL de complexo de protrombina tratado com solvente-detergente com 121 mL de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, pH 9,0, para reduzir a sua condutividade para 16 mS/cm. A solução foi em seguida titulada para pH 8,0. Carregaram-se 111 g 21 desta solução sobre uma coluna de 1 cm de diâmetro, cheia com 10 mL de Fractogel EMD DEAE 650 (S), equilibrada com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 137 mM, pH 8,0. Após carregamento, o meio foi lavado com 12 volumes de coluna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 137 mM, pH 8,0, para remover os reagentes com solvente-detergente e a proteina fracamente ligada. O meio foi em seguida lavado com 1 volume de coluna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 129 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. Fecharam-se as saídas da coluna. Armazenou-se a coluna à temperatura ambiente.

Após cerca de 64 horas, o meio foi lavado com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 129 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0, para recuperar a trombina produzida durante a incubação. Recuperou-se um total de 0,4 milhões iu de actividade de coagulação da coluna, dos quais 0,3 milhões iu possuíam uma actividade específica > 2.000 iu/mg e foram reunidos para processamento posterior, sem necessidade de passos adicionais de purificação da proteína.

Exemplo 4

Tampões de trometamol e incubação a 10, 14,5 e 22 °C, durante cerca de 64 horas

Diluíram-se 195 g de complexo de protrombina tratado com solvente-detergente com 424 g de água, para reduzir a sua condutividade de 28,9 mS/cm para 9,39 mS/cm. A solução foi, em seguida, titulada para pH 8,0 com hidróxido de sódio 1 M. Carregaram-se cerca de 140 g desta solução sobre três colunas encamisadas de 1 cm de diâmetro, com um leito de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Após carregamento, o meio foi 22 lavado com 10 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, para remover os reagentes de solvente--detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi em seguida lavado com 1 volume de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, e cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. Fecharam-se as saídas da coluna. Uma coluna foi deixada à temperatura ambiente (21,8 °C ± 0,4 °). As restantes foram mantidas a 10 0 ou 14,5 °C, mediante a circulação de água arrefecida através das camisas das colunas.

Após cerca de 64 horas, alterou-se a temperatura nas camisas para 18 °C e parou-se o arrefecimento das camisas. O meio foi lavado com trometamol 10 mM, e cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, para recuperar a trombina produzida durante a incubação. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1

Coluna Temperatura Actividade de coagulação da trombina de incubação, Total Total > 2000 °C recuperado, iu iu/mg, iu 1 10 212000 149000 2 14,5 293000 174000 3 22 353000 142000

Exemplo 5

Tampões de trometamol e incubação a 15, 23 e 26 °C, durante cerca de 64 horas

Diluíram-se 458 g de complexo de protrombina tratado com solvente-detergente com 977 g de água, para reduzir a sua 23 condutividade de 28,9 mS/cm para 9,39 mS/cm. A solução foi em seguida titulada para pH 8,0 com hidróxido de sódio 1 M.

Carregaram-se cerca de 140 g desta solução sobre três colunas encamisadas de 1,6 cm de diâmetro, cheias com um leito de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibradas com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Após carregamento, o meio foi lavado com 10 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, para remover os reagentes com solvente-detergente e a proteína fracamente ligada. 0 meio foi em seguida lavado com 1 volume de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0.

Fecharam-se as saídas da coluna. Fez-se em seguida circular água através das colunas das camisas, a 15, 23 e 26 °C.

Após 65 horas, parou-se a circulação de água. O meio foi lavado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, para recuperar a trombina produzida durante a incubação. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2

Coluna Temperatura Actividade de coagulação da trombina de incubação, Total Total > 2000 °C recuperado, iu iu/mg, iu 1 15 864000 423000 2 23 756000 284000 3 26 800000 128000 24

Exemplo 6

Tampões de trometamol e incubação à temperatura ambiente, durante 16, 40 e 64 horas

Diluíram-se 248 g de complexo de protrombina tratado com solvente-detergente com 523 g de água, para reduzir a sua condutividade de 26,9 mS/cm para 9,33 mS/cm. A solução foi em seguida titulada para pH 8,0. Carregaram-se cerca de 195 g desta solução sobre cada uma de três colunas de 1 cm de diâmetro, cheias com um leito de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibradas com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Após carregamento de cada coluna, o meio foi lavado com 10 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, para remover os reagentes com solvente-detergente e a proteína fracamente ligada. O meio foi em seguida lavado com 1 volume de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 5 mM, pH 8,0. Fecharam-se as saídas da coluna. Armazenaram-se as colunas à temperatura ambiente.

Armazenaram-se as três colunas durante 16 horas, 40 horas, e 64 horas. No final de cada incubação, o meio foi lavado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, para recuperar a trombina produzida durante a incubação. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3

Coluna Incubação, Actividade de coagulação da trombina horas Total Total > 2000 recuperado, iu iu/mg, iu 1 16 30700 0 2 40 407000 197000 3 64 500000 158000 25

Exemplo 7: Mecanismo de produção da trombina

Efectuaram-se experiências para determinar o mecanismo de activação da protrombina para trombina no processo da invenção.

Materiais

Protrombina com inactivação virai purificada. Factor X com inactivação virai purificado. Antitrombina com inactivação virai. A protrombina e o factor X tinham sido inactivados por tratamento com solvente e detergente, utilizando fosfato de tri-n-butilo e polissorbato 80. A antitrombina tinha sido inactivada de virus por tratamento térmico. Método

Encheram-se três colunas cromatográficas com gel de permuta aniónica DEAE Sepharose CL-βΒ e equilibraram-se em tampão de trometamol-NaCl. As três colunas foram, em seguida, utilizadas como se descreve na Tabela 4, e os produtos em seguida ensaiados quanto à actividade da trombina. 26

Tabela 4

Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Carregar protrombina Carregar Factor X Carregar Factor X Lavagem com tampão de Lavagem com tampão Lavagem com tampão equilíbrio de equilíbrio de equilíbrio Incubação com tampão Incubação com tampão Incubação com tampão de cálcio de cálcio de cálcio Eluição com tampão de Lavagem com tampão Lavagem com tampão equilíbrio de equilíbrio de equilíbrio Carregar protrombina Carregar antitrombina Eluição com tampão Lavagem com tampão de equilíbrio de equilíbrio Carregar protrombina Eluição com tampão de equilíbrio

Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5

Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Protrombina total carregada, iu 2039 2044 2061 Factor X total carregado aplicado, u 0 1222 1196 Antitrombina aplicada, u 0 0 850 Trombina produzida, iu por iu de protrombina < 0,07 113 < 0,07

Os resultados mostram que a trombina não pode ser produzida a partir de protrombina com inactivação virai, exclusivamente 27 pelo cálcio (Coluna 1) . A trombina pode ser produzida a partir de protrombina com inactivaçâo virai por incubação com factor X com inactivaçâo virai, que foi incubado anteriormente com cálcio, e o cálcio é em seguida removido, antes do contacto com a protrombina (Coluna 2) . A trombina não pode ser produzida a partir de protrombina com inactivaçâo virai por incubação com factor X com inactivaçâo virai que foi anteriormente incubado com cálcio, se o factor X/factor Xa é em seguida inactivado com antitrombina e tanto o cálcio com a antitrombina são removidos antes do contacto com a protrombina (Coluna 3). 0 mecanismo de produção de trombina no processo da invenção, requer que o factor X seja activado pelo cálcio e a protrombina, para em seguida ser activado para trombina pela acção de factor X activado (i. e., factor Xa), em vez de directamente pelo cálcio. Em consequência, a protrombina isolada não é um material de partida apropriado para utilização no processo da invenção.

Exemplo 8: Carência de produção de trombina, utilizando unicamente protrombina purificada e cálcio

Separou-se a protrombina (Factor II) a partir de outras proteínas do factor de coagulação do complexo de protrombina após tratamento virucida com solvente e detergente, pela passagem através de uma coluna Chelating Sepharose carregada com cobre.

Esta solução proteica foi utilizada na presença do solvente de co-purificação e dos reagentes detergentes (SD), ou foi separada a partir do solvente e reagentes detergentes, por nova cromatografia em gel de permuta aniónica de DEAE Sepharose. 28 A protrombina em solução foi incubada a pH 6,5 com tampão de cloreto de cálcio 40 mM a 25 °C, durante 3 horas. Mediu-se em seguida a actividade da trombina.

Os resultados são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6

Amostras Actividade da trombina após 3 horas, iu/mL Protrombina com SD Inferior a 0,05 Protrombina após remoção de SD Inferior a 0,05

Os resultados confirmam que a protrombina humana isolada não foi convertida em trombina pela acção de iões cálcio isoladamente, após experimentar um processo de inactivação do vírus com solvente-detergente, independentemente de se os reagentes de SD foram removidos ou não, antes da adição dos iões cálcio. Em consequência, a protrombina isolada não é um material de partida apropriado para utilização no processo da invenção.

Exemplo 9: Carência de produção de trombina pela acção de cálcio no complexo de protrombina, durante ou após tratamento com reagentes de solvente-detergente

Incubaram-se amostras de três concentrados diferentes de complexo de protrombina (contendo os factores II, IX e X) com cloreto de cálcio 20 mM em solução e ensaiaram-se quanto à actividade da trombina após incubação durante 3 horas e 5 horas.

As amostras de complexo de protrombina (PCC) derivadas de plasma humano, foram: 29 A: eluato de PCC a partir de cromatografia de permuta aniónica de CPS. B: eluato de PCC contendo detergente de polissorbato 80 a 1% e solvente de fosfato de tri-n-butilo (TNBP) a 0,3%. C: PCC tratado com solvente-detergente, do qual se removeu o solvente-detergente.

Nenhum dos materiais do complexo de protrombina utilizados nestas experiências foi activado durante o seu fabrico, tanto intencionalmente como não intencionalmente, como se determinou pelos ensaios NAPTT e FCT para os factores de coagulação activados.

Os resultados são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7

Amostra Trombina após 3 horas, iu/mL Trombina após 5 horas, iu/mL A 619 1168 B Inferior a 1 3,48 C Inferior a 1 2,02

Os resultados mostram que se produziu trombina desprezável a partir do complexo de protrombina (não activada) em solução, após se ter sido tratado com solvente-detergente, independentemente de se o solvente-detergente permaneceu na preparação no momento de incubação com cálcio (comparar os resultados para a amostra A com os para as amostras B e C). Isto confirmou o ensinamento da técnica anterior de que o cálcio isoladamente não foi suficiente para activar o complexo de 30 protrombina tratado com solvente-detergente. Constitui uma caracteristica essencial do processo da invenção, que a protrombina tratada com solvente-detergente que contém o material, seja carregada sobre um meio de permuta aniónica, de modo a que se produza trombina.

Exemplo 10

Activação com iões cálcio ou magnésio

Diluiram-se 249 mL de complexo de protrombina tratado com solvente-detergente com 150 mL de água desionizada, para reduzir a sua condutividade para 16 mS/cm. A solução foi em seguida titulada para pH 8,0 com hidróxido de sódio 1 M. Carregaram-se 82 a 87 g desta solução em cada uma de três colunas de 1 cm de diâmetro, cada uma cheia com 10 mL de DEAE Sepharose CL6B, equilibrado com citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 137 mM, pH 8,0. Após carregamento, o meio foi lavado com 10 volumes de coluna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 137 mM, pH 8,0, para remover os reagentes com solvente--detergente e a proteina fracamente ligada. O meio foi, em seguida, lavado com 1 volume de coluna de tampão de activação, quer citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 129 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0 (coluna 1), quer citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 129 mM, cloreto de magnésio 2 mM, pH 8,0 (coluna 2), ou citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloreto de sódio 129 mM, cloreto de cálcio 2 mM, cloreto de magnésio 2 mM, pH 8,0 (coluna 3). Fecharam-se as saidas da coluna. Armazenaram-se as colunas à temperatura ambiente.

Após cerca 64 horas, o meio foi lavado com o tampão de activação para recuperar a trombina produzida durante a incubação. Os resultados são mostrados na Tabela 8. 31

Tabela 8

Coluna Actividade cromogénica de Ião metálico no trombina total recuperada tampão de activação 1 178000 iu Cálcio 2 66500 iu Magnésio 3 256000 iu Cálcio/magnésio

Exemplo 11: Formulação

Formulou-se uma solução de trombina de vírus filtrado, preparada como no Exemplo 1, para trometamol 10 mM, NaCl 200 mM, CaCl2 40 mM, sacarose a 2%, pH 7,0 e ajustou-se a potência para cerca 500 iu de actividade de coagulação de trombina/mL. Repartiram-se 5 mL desta solução por frascos de vidro e secou-se por congelação. O material seco por congelação foi tratado termicamente a 80 °C, durante 72 horas. Em 3 séries, conseguiu--se uma recuperação média de 98% para a actividade de coagulação da trombina através da liofilização e uma média de 98% através do tratamento térmico.

Exemplo 12: Formulação

Formulou-se a solução de trombina a aproximadamente 1250 iu de actividade de coagulação/mL. Todas as formulações continham trometamol 10 mM e cloreto de sódio 200 mM, a pH 7,0. Adicionalmente, continham os componentes adicionados mostrados mais adiante. As soluções foram deitadas em frascos, 2 mL por frasco. Os frascos foram liofilizados e tratados termicamente a seco a 80 °C, durante 72 horas. Os frascos foram, em seguida, 32 reconstituídos com água e ensaiados, para determinar a actividade da trombina. A actividade da trombina foi comparada com a actividade da trombina em amostras tomadas antes da liofilização. Os resultados são mostrados na Tabela 9.

Tabela 9 [Cloreto de cálcio], mM Componentes adicionais Recuperação da actividade de coagulação através da liofilização e do tratamento térmico 2 - 59% 10 - 69% 40 - 88% 2 sacarose a 1% 88% 2 sacarose a 2% 93% 2 trealose a 1% 98% 2 rafinose a 1% 88% 2 albumina humana a 1% 60% 2 PEG 4000 a 1% 78%

Os resultados mostraram que o estabilizante convencional da albumina não proporcionou estabilidade através da liofilização e do tratamento térmico. Outras combinações de cálcio e hidrato de carbono conferiram uma estabilidade melhorada através da liofilização e do tratamento térmico.

Exemplo 13: Formulação de trombina, liofilização e tratamento térmico

Formulou-se a solução de trombina a 500 iu/mL (enchimento 33 de 5 mL). Todas as formulações também continham trometamol 10 mM e sódio 200 mM, a pH 7,0 e, adicionalmente, continham os componentes mostrados mais adiante. As soluções foram deitadas em frascos, 5 mL por frasco. Os frascos foram liofilizados e tratados termicamente a seco a 80 °C, durante 72 horas ou a 100 °C, durante 24 horas. Os frascos foram, em seguida, reconstituídos com água e ensaiados, para determinar a actividade da trombina. A actividade da trombina foi comparada com a actividade da trombina em amostras tomadas antes da liofilização. Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10 [Cloreto de cálcio], mM Componentes adicionais Volume de enchimento, mL Recuperação da actividade de coagulação através da liofilização e do tratamento térmico 80 °C /72 horas 100 °C /24 horas 2 sacarose a 2% 5 79% — 40 sacarose a 2% 5 97% 89% 2 trealose a 1% 5 92% 73%

Os resultados mostraram que a formulação óptima foi trometamol 10 mM e sódio 200 mM a pH 7,0, mais cloreto de cálcio 40 mM e sacarose a 2%.

Exemplo 14: Preparação de Trombina

Diluíram-se 1,17 kg de complexo de protrombina tratado com solvente-detergente com 2,58 kg de água, para reduzir a sua condutividade de 27,5 mS/cm para 9,12 mS/cm. A solução foi em 34 seguida titulada para pH 8,0 com hidróxido de sódio 0,5 M. Carregou-se esta solução sobre uma coluna encamisada de 5 cm de diâmetro, cheia com um leito de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrada com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Após carregamento, o meio foi lavado com 15 volumes de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, para remover os reagentes com solvente--detergente e a proteina fracamente ligada. O meio foi em seguida lavado com 1 volume de coluna de trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. Fecharam-se as saídas da coluna. Fez-se circular água a 20 °C através da camisa da coluna.

Após 64 horas, parou-se a circulação de água. O meio foi lavado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0, para recuperar a trombina produzida durante a incubação. Os primeiros 4 volumes de coluna de efluente da coluna continham 4,3 milhões unidades internacionais (iu) de actividade de coagulação da trombina, com uma actividade de coagulação específica inferior a 2000 iu/mg de proteína total. Os 9 volumes de coluna de efluente seguintes, que continham 2,2 milhões iu de actividade de coagulação, a uma actividade específica de 2100 iu/mg, foram congelados a -40 °C e mantidos para processamento posterior.

Descongelaram-se e filtraram-se 900 g do eluato congelado, utilizando um filtro para vírus Planova 15N, que tinha sido equilibrado com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. Houve uma recuperação medida de 95% da actividade de coagulação da trombina através de congelar/descongelar e 102% através da filtração do vírus. O filtrado foi em seguida formulado para trometamol 10 mM, cloreto de sódio 200 mM, cloreto de cálcio 40 mM, sacarose a 2%, 35 pela adição de um tampão apropriado. A solução foi diluída para uma concentração de actividade de coagulação de trombina estimada de 550 iu/mL, com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 200 mM, cloreto de cálcio 40 mM, sacarose a 2%, pH 7,0 e, em seguida, titulada com ácido clorídrico 0,5 M para pH 7,0.

Esta solução foi em seguida filtrada através de um filtro de esterilização de 0,2 μιη e em seguida deitada em frascos, 5 g de solução por frasco. Os frascos foram secos por congelação e em seguida tratados termicamente a seco a 80 °C, durante 72 horas. Houve uma recuperação medida de 97% da actividade de coagulação da trombina através da filtração de esterilização, 102% através da liofilização e 100% através do tratamento térmico a seco.

Exemplo 15: Tempos de incubação

Diluíram-se 150 mL de complexo de protrombina tratado com solvente-detergente com água, para reduzir a condutividade para aproximadamente 9,3 mS/cm. A solução foi em seguida titulada para pH 8,0. Esta quantidade foi carregada sobre cada uma de quatro colunas, cheias com 12,5-12,9 mL de DEAE Sepharose CL6B, que tinha sido equilibrada com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, pH 8,0. As colunas foram em seguida lavadas com o mesmo tampão, para remover os reagentes com solvente-detergente e a proteína fracamente ligada. As colunas foram em seguida lavadas com trometamol 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, cloreto de cálcio 2 mM, pH 8,0. Fecharam-se as saídas da coluna e isolaram-se as colunas à temperatura ambiente (aproximadamente a 20 °C), durante períodos entre 35 e 85 horas. No final de cada período, uma das colunas foi lavado com trometamol 10 mM, NaCl 110 mM, pH 8,0, para recuperar a trombina produzida. Os 36 resultados são mostrados na Tabela 11:

Tabela 11

Coluna Incubação (horas) Actividade de coagulação da trombina Total recuperado (iu) Total > 2000 iu/mg (iu) 1 35 229344 144751 2 45 267860 144463 3 65 289359 128578 4 85 266844 101687

Existe uma tendência geral de aumento do rendimento (unidades totais), mas uma diminuição da pureza (unidades > 2000 iu/mg) com o aumento do tempo de incubação. Um especialista pode escolher o tempo de incubação, para se obter o equilíbrio mais favorável entre o rendimento total e a pureza, em qualquer situação particular.

Lisboa, 29 de Março de 2007 37

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a preparação de trombina com inactivação virai, compreendendo os passos de: (a) inactivação de virus com solvente-detergente, de uma solução compreendendo protrombina e factor X; (b) carregamento do produto do passo (a) sobre um meio de permuta aniónica; (c) lavagem do meio para remover os reagentes utilizados para a inactivação de virus com solvente-detergente no passo (a); e (d) activação da protrombina sobre o meio, para formar trombina pela adição de iões metálicos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a solução compreendendo protrombina e factor X é um complexo de protrombina.
3. Método para a preparação de trombina com inactivação virai, compreendendo os passos de: (a) inactivação de vírus com solvente-detergente, de uma solução compreendendo o factor X; (b) carregamento do produto do passo (a) sobre um meio de permuta aniónica; (c) lavagem do meio para remover os reagentes 1 utilizados para a inactivação de vírus com solvente-detergente no passo (a); (d) activação do factor X no meio, para formar o factor Xa pela adição de iões metálicos; e (e) carregamento de protrombina com inactivação virai sobre o meio de permuta aniónica, tal que se produza trombina.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que os iões metálicos são iões metálicos divalentes.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que os iões metálicos divalentes são iões magnésio e/ou cálcio.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo ainda o passo de: (e) eluição selectiva da trombina a partir do meio de permuta aniónica.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, compreendendo ainda os passos de: (f) passagem do produto do passo (e) através de um filtro que retém os aqentes patogénicos; (g) adição de um ião metálico divalente e um hidrato de carbono ao produto do passo (f), e (h) liofilização e tratamento térmico do produto do passo (g), para inactivar o vírus. 2 Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que os passos (a) e (b) são substituídas pelos passos (a') e (b' ) : (a1) carregamento de uma solução compreendendo protrombina e factor X, sobre um meio de permuta aniónica; e (b') inactivação de vírus com solvente-detergente da protrombina e do factor X no meio. Lisboa, 29 de Março de 2007