MXPA05000393A - Proceso para producir una preparacion de trombina con virus inactivados. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe un metodo para la preparacion de trombina con virus inactivados que comprende inactivacion de virus con, solvente y detergente de una solucion que comprende protrombina y factor X, cargar la protrombina y el factor X de virus inactivados sobre un medio de intercambio anionico, lavar el medio para remover los reactivos usados para la inactivacion de virus con solvente y detergente y activar la protrombina sobre el medio para formar trombina mediante la adicion de iones metalicos, de preferencia iones de calcio. La trombina despues se eluye, de preferencia selectivamente desde el medio de intercambio anionico.

Description

PROCESO PARA PRODUCIR UNA PREPARACION DE TRO BINA CON VIRUS INACTIVADOS DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a procesos para la preparación de trombina con virus inacti ados y a los productos preparados mediante estos procesos . La trombina es una proteasa de plasma multifuncional generada en la corriente sanguínea por medio de la activación de su precursor inactivo, la protrombina (también conocida como factor II) . La protrombina se activa esta misma mediante la acción del factor X activado (factor Xa) . Una de las funciones principales de la trombina en el plasma de la sangre es convertir el fibrinógeno soluble en fibrina insoluble en la etapa final de la cascada de coagulación de la sangre. Los monómeros de fibrina producidos mediante la acción de la trombina se agrupan entre sí y después se reticulan para formar un coágulo de sangre. La trombina se usa en terapia sola y en combinación con el fibrinógeno en los cicatrizantes llamados de fibrina, para lograr la hemostasis, para cicatrizar heridas y para la adhesión controlada de tejido. Para todas las aplicaciones clínicas, es importante tener trombina altamente pura para minimizar cualesquiera efectos colaterales indeseables que resultan de, por ejemplo, REF. : 161259 la presencia de otras proteasas o factores de coagulación, u otros componentes contaminantes. Además, es altamente deseable que la trombina para el uso clínico, en particular si se deriva de fuentes humanas o animales, se trate para inactivar cualquier virus en la sangre que pudiera estar presente, por ejemplo virus de hepatitis o HIV. Son conocidos en la técnica diferentes métodos de inactivación, que incluyen, pasteurización, tratamiento térmico seco y tratamiento con solvente-detergente (Pathogen Inactivation of Labile Blood Products, Council of Europe Expert Comittee and Blood Transfusión Study Group on Pathogen Inactivation in Labile Blood Products, Transfusión Medicine, 2001, 11, 149-175) . También es deseable que se eliminen o reduzcan otros patógenos, por ejemplo los agentes causales de Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (TSE, por sus siglas en inglés) , que se cree actualmente que son priones . El tratamiento térmico seco se conoce que es efectivo para la inactivación de virus cubiertos y algunos descubiertos, mientras que el tratamiento con solvente-detergente se conoce que es efectivo para la inactivación de virus cubiertos (es decir, recubiertos con lípidos) tal como hepatitis B. El tratamiento con solvente-detergente es un método usado ahora comúnmente para la inactivación de virus de los productos de la sangre destinados para el uso clínico. En el pasado, la activación de protrombina a trombina a menudo se llevó a cabo por medio de la adición de iones de calcio y txomboplastina (factor III) . La tromboplastina sería derivada de las fuentes humana y animal y por lo tanto, fue una fuente de contaminación posible del producto final . US 5,304,372 describe un proceso para la preparación de un concentrado de trombina humana de la fracción de PPSB de plasma. El proceso comprende la activación de la protrombina en la fracción PPSB para producir trombina mediante la adición de cloruro de calcio, seguido del tratamiento con solvente-detergente en el producto resultante para inactivar los virus. De acuerdo con US 5,304,372 el. tratamiento con solvente-detergente no puede llevarse a cabo en el material iniciador de PPSB porque eliminaría otros factores, tales como los fosfolípidos necesarios para la reacción de activación de la protrombina a la trombina. EP-A-0 , 378 , 798 describe un proceso para la preparación de trombina que comprende absorber el factor II del plasma o las fracciones de plasma sobre un soporte sólido, activar el factor II sobre el soporte sólido a la trombina y después eluir la trombina. US 5,714,370 describe la preparación de trombina a partir de protrombina con virus inactivados usando sales que pueden coagular de forma activa para efectuar la activación de la protrombina a trombina. El único método descrito para la inactivación de virus de la protrombina es el tratamiento térmico . El Reporte Anual de 1993 del Dr. Karl Landsteiner Foundation on research at CLB (el Laboratorio Central del servicio de transfusión sanguínea del Netherlands Red Cross) también reportó en la página 10, que la activación de la protrombina tratada con solvente-detergente para formar trombina con iones de calcio, fue únicamente exitosa en presencia de fosfolípidos adicionados. Sería ventajoso proporcionar un método para la preparación de trombina a partir de protrombina que ha experimentado una etapa de inactivación de virus con solvente-detergente para remover los virus cubiertos. También sería ventajoso evitar completamente el uso de otros productos biológicos y particularmente derivados de animales, por ejemplo tromboplastina, para activar la protrombina, ya que tales productos pueden servir como una fuente de virus infecciosos u otros contaminantes indeseables durante el proceso de manufacturación . Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un primer método para la preparación de trombina con virus inactivados que comprende las etapas de: (a) inactivación del virus con solvente-detergente de una solución que comprende protrombina y factor X; (b) cargar el producto de la etapa (a) sobre un medio de intercambio aniónico; (c) lavar el medio para remover los reactivos usados para la inactivación del virus con solvente-detergente en la etapa (a) ; y (d) activar la protrombina sobre el medio para formar trombina mediante la adición de iones metálicos. De preferencia los iones metálicos son iones metálicos divalentes, tales como iones de magnesio y/o calcio. De preferencia, la trombina después se eluye selectivamente desde el medio de intercambio anionico. De manera alternativa, una solución que comprende protrombina y el factor X puede cargarse sobre un medio de intercambio anionico y la inactivación de los virus con solvente-detergente llevado a cabo en el medio. Por lo tanto, la presente invención también proporciona una alternativa para el método anterior, en donde las etapas (a) y (b) se reemplazan por las etapas (a') y (b') : (a') cargar una solución que comprende protrombina y el factor X sobre un medio de intercambio anionico; y (b') inactivación del virus con solvente-detergente de la protrombina y el factor X sobre ¦ el medio. Las - etapas restantes de este método alternativo son idénticas a las etapas restantes del primer método descrito anteriormente . El método que comprende las etapas (a) y (b) se prefiere sobre el método que comprende las etapas (a' ) y (b' ) , ya que es más fácil de verificar la realización de las condiciones de inactivación necesarias antes de cargar sobre el medio. El material iniciador para el proceso de la invención puede ser cualquier solución que comprenda protrombina y factor X, incluyendo las fracciones de plasma o la protrombina y/o factor X derivado de la expresión génica, por ejemplo en el cultivo celular o especies transgénicas y la protrombina y/o factor X producido por cualesquiera otros métodos sintéticos. El material iniciador puede prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica. De preferencia, el material iniciador es un complejo de protrombina o un derivado del mismo, que contiene la protrombina y el factor X. El complejo de protrombina puede prepararse mediante los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante adsorción sobre un medio de intercambio aniónico del sobrenadante crioprecipitado y la elución subsecuente (P.A. Feldman, L. Harris, M.E. Haddon, D.R. Evans and J.K. Smith, Thrombosis Research, 1986, Suplemento VI: 36, incorporado por referencia) . En una modalidad preferida, el material iniciador es el concentrado del complejo de protrombina (PCC, por sus siglas en inglés) que se ha preparado bajo las condiciones que minimizan el nivel de coagulación del factor VII y los factores de coagulación activados en el complejo de protrombina. Por lo tanto, el llamado "PCC del factor tres" es un material iniciador más preferido que el "PCC del factor cuatro" .

La etapa de inactivación del virus con solvente-detergente se lleva a cabo usando los reactivos y métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo, US 4,481,189, US 4,613,501 y US 4,540,573) todos incorporados por referencia). Los solventes apropiados incluyen tri-n-butilfosfato (TNBP) . Los detergentes apropiados incluyen polisorbato (T een) , 80, polisorbato (Tween) 20 y Triton-X-100. Una combinación particularmente preferida es polisorbato 80 y TNBP. En una modalidad preferida, la protrombina y la solución que contiene el factor X se agita con los reactivos de solvente y detergente . La inactivación del virus se lleva a cabo a una temperatura y durante un tiempo suficiente para inactivar cualesquiera virus cubiertos que pudieran estar presentes . Por ejemplo, el tratamiento con solvente-detergente puede llevarse a cabo durante aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas, a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 37°C, por ejemplo por lo menos aproximadamente 6 horas a una temperatura de aproximadamente 23-27°C. La protrombina tratada con solvente-detergente y la solución que contiene el factor X después se carga sobre un intercambiador aniónico apropiado, bajo condiciones de modo que la protrombina el factor X se enlacen al medio de intercambio aniónico. Si es necesario, la solución tratada con solvente-detergente se diluye primero para reducir la concentración iónica a una que es apropiada para enlazar la protrombina y el factor X sobre el intercambiador aniónico. Los medios de intercambio aniónico apropiados están disponibles comercialmente e incluyen DEAE Sepharose CL6B suministrado por Amersham Biosciences y Practogel EMD DEAE 650 (S) suministrado por Merck. De preferencia, el medio de intercambio aniónico está presente en una columna para facilitar el lavado y la elución. De preferencia, si se usó un medio de intercambio aniónico durante la preparación del material iniciador, por ejemplo para la captura de protrombina y/o factor X de un material de fuente, tal como plasma, entonces se usa el mismo medio de intercambio aniónico para el proceso de la invención para minimizar la exposición a diferentes reactivos. Después de la carga, el medio de intercambio aniónico se lava con uno o más amortiguadores de lavado apropiados para remover la proteína no unida o débilmente unida y los reactivos con solvente-detergente. Los amortiguadores de lavado deberán estar libres de reactivos que pudieran generar trombina de la protrombina unida. La protrombina unida después se activa para formar trombina mediante la adición de iones metálicos apropiados, de preferencia iones metálicos divalentes, tales como iones de magnesio o calcio, más preferentemente iones de calcio. Pueden usarse combinaciones de más de un tipo de ión metálico para la activación, por ejemplo una mezcla de iones de calcio y magnesio. De preferencia, los iones metálicos se adicionan en la forma de un amortiguador de activación y están presentes en una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40 mM, más preferentemente entre aproximadamente 1.5 y aproximadamente 17 mM, y más preferentemente aproximadamente 2 mM en el amortiguador. La protrombina enlazada se incuba con los iones metálicos durante un tiempo suficiente y a una temperatura apropiada para que proceda la reacción de activación. La temperatura deberá ser suficientemente alta para que proceda la reacción, pero no tan alta como para que las proteínas se desnaturalicen o se induzca el crecimiento de cualesquiera microorganismos contaminantes. La reacción se lleva a cabo preferentemente en o por debajo de aproximadamente 26°C, por ejemplo a 10°-26°C, más preferentemente a aproximadamente la temperatura ambiente (20°C) o por debajo, durante aproximadamente 19-85 horas, más preferentemente 19-65 horas y aún más preferentemente durante aproximadamente 40-65 horas. Por ejemplo, las condiciones de incubación apropiadas pueden ser durante aproximadamente 65 horas a aproximadamente 20°C. Sin ser vinculado con ninguna teoría, se cree que es la combinación de los iones metálicos (por ejemplo, calcio) y el medio de intercambio aniónico al cual se enlaza la protrombina lo que permite la activación de la protrombina, para formar trombina sin la necesidad de adicionar ningún agente de activación adicional, por ejemplo tromboplastina. Los iones metálicos activan el factor X en la fracción adsorbida para formar el factor Xa, y el factor Xa en cambio activa la protrombina para formar la trombina. También es posible cargar el factor X de virus inactivados con solvente-detergente sobre el medio de intercambio aniónico y activarlo para formar el factor Xa mediante la adición de iones metálicos, antes de que se adicione la protrombina al medio de intercambio aniónico. El factor Xa después convierte la protrombina a trombina sobre el medio. Por lo tanto, la presente invención proporciona un segundo método para la preparación de trombina de virus inactivado que comprende las etapas de: (a) inactivación del virus con solvente-detergente de una solución que comprende el factor X; (b) cargar el producto de la etapa (a) sobre un medio de intercambio aniónico,- (c) lavar el medio para remover los reactivos usados para la inactivación del virus con solvente-detergente en la etapa (a) ; (d) activar el factor X en el medio para formar el factor Xa mediante la adición de iones metálicos; y (e) cargar la protrombina de virus inactivados sobre el medio de intercambio aniónico de modo que se genere trombina.

De preferencia^ la trombina después se eluye selectivamente desde el medio de intercambio aniónico. También, de preferencia los iones metálicos son iones metálicos divalentes, tal como iones de magnesio y/o calcio.

El material iniciador para el segundo proceso de la invención puede ser cualquier solución que comprenda separadamente protrombina y el factor X, incluyendo fracciones de plasma, protrombina y/o factor X derivados de la expresión génica, por ejemplo en el cultivo celular o especies transgénicas y la protrombina y/o factor X producidos por cualesquiera otros métodos sintéticos. Los materiales iniciadores pueden prepararse mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica. Las condiciones apropiadas de inactivación del virus, carga y activación para el segundo método de la invención son como se describen anteriormente para el primer método de la invención. Después de la activación del factor X para formar el factor Xa, el medio de intercambio aniónico puede lavarse opcionalmente usando un amortiguador apropiado para remover los iones metálicos antes de que se adicione la protrombina.

Después de la conversión de protrombina a trombina, la trombina puede recuperarse mediante la elución con un amortiguador de recuperación apropiado. La concentración iónica y el pH del amortiguador de recuperación se eligen, de preferencia, para remover selectivamente la trombina y dejar otras proteínas, por ejemplo cualquier protrombina sin convertir, enlazada al medio de intercambio aniónico. El pH del amortiguador de recuperación usado deberá estar por debajo del pl de la trombina, de modo que la trombina no se enlace al intercambiador aniónico. Un pH apropiado para el amortiguador de recuperación es pH 8. De preferencia, los amortiguadores usados- para el lavado, activación y recuperación no contienen ningunas sales de fosfato, para evitar la precipitación de fosfato de calcio insoluble durante el proceso de manufacturación. La trombina producida es . altamente purificada y concentrada y puede formularse directamente sin purificación adicional. Alternativamente, pueden llevarse a cabo si se desea etapas de purificación adicionales. Por ejemplo, la solución de trombina obtenida de los medios del intercambiador aniónico puede someterse a las etapas adicionales de reducción o inactivación del virus . Por ejemplo, la solución puede filtrarse a través de un filtro de remoción del virus, tal como un filtro Planova 15N. La filtración también puede servir para remover el agente causal de Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (TSE) . Una vez que se separa del medio de intercambio aniónico, el producto de trombina puede formularse para el almacenamiento a largo plazo antes del uso clínico. De preferencia, la solución de trombina se seca por congelado, opcionalmente en presencia de uno o más estabilizadores para ayudar a limitar la desnaturalización durante el secado por congelado, y cualquier tratamiento térmico subsecuente. Los estabilizadores apropiados incluyen carbohidratos, tales como sacarosa, rafañosa o trehalosa e iones metálicos di alentes, tales como iones de calcio. Se prefieren particularmente una combinación de iones de calcio y un carbohidrato, tal como sacarosa. De preferencia, se evita el uso de estabilizadores de proteínas, tal como albúmina para minimizar las posibles fuentes de contaminación en el producto final . Las condiciones de secado por congelado apropiadas incluyen secado primario a una temperatura de aproximadamente -35°C y a una presión de aproximadamente 100-130 microbar (10-13 Pa) , seguido del secado secundario a una temperatura de aproximadamente +35 °C y a una presión de aproximadamente 30 microbar (3 Pa) . El producto de trombina secado por congelado puede someterse a una etapa de inactivación de virus adicional mediante el tratamiento térmico, por ejemplo calentando a aproximadamente 80°C durante aproximadamente 72 horas ó 100°C durante 24 horas. Una combinación de iones de calcio y un carbohidrato, tal como sacarosa, se ha encontrado que estabiliza eficientemente la trombina producida de acuerdo con la invención durante el tratamiento térmico terminal para inactivar los virus. Es deseable que los productos derivados de la sangre se sometan a por lo menos dos etapas separadas de inactivación o reducción de virus durante la manufactura. Una ventaja del proceso de la invención es que permite que se lleven a cabo múltiples etapas de inactivación o reducción de virus diferentes, para inactivar o reducir los virus cubiertos y descubiertos, y otros patógenos, por ejemplo los agentes causales de TSE . El tratamiento con solvente-detergente se conoce que corta los virus cubiertos y descubiertos con lípidos, mientras que la filtración separa las partículas en un cierto tamaño y el tratamiento térmico inactiva los virus térmicamente inestables. Es deseable incorporar múltiples etapas de inactivación o reducción que se basen en diferentes principios, para remover o reducir tantos patógenos diferentes como sea posible. En una modalidad preferida, el proceso comprende una etapa adicional de inactivación o reducción de virus, además del tratamiento con solvente-detergente. En una modalidad más preferida, el proceso comprende dos etapas adicionales de reducción o inactivación de virus, además del tratamiento con solvente-detergente. De preferencia, el proceso comprende una etapa física de remoción de virus (por ejemplo, nanofiltración) y una etapa de inactivación de virus térmica seca además del tratamiento con solvente-detergente.

Otras ventaja del proceso de la invención es que la activación de la protrombina y la purificación de la trombina resultante puede lograrse usando el mismo tipo de medio de intercambio aniónico como se usó anteriormente para preparar la protrombina y el material iniciador del factor X. La formulación del producto también usa reactivos que ya se han usado en el proceso de preparación. Esto minimiza la exposición de la trombina a una multiplicidad de reactivos, que es benéfica en la manufactura de un producto farmacéutico. Una ventaja adicional del proceso es que minimiza el riesgo de la integridad de otras operaciones de manufacturación planteadas por el posible contacto con la trombina proteasa altamente potente. Esto puede evitarse normalmente únicamente mediante la segregación de la planta de manufacturación de trombina de otro equipo y actividades en la industria. Tal segregación es costosa de labor intensiva. También, el procesamiento de los intermediarios de virus inactivados (por ejemplo, tratados con solvente-detergente) tiene que hacerse en un área de manufacturación separada, aislada, para evitar cualquier contaminación subsecuente. La incapacidad del arte previo de generar trombina después del tratamiento con solvente-detergente requirió el uso de espacio de manufacturación significativamente más segregado y riesgos adicionales en el manejo del producto durante la transferencia de etapa a etapa. Adicionalmente, también hubo el riesgo potencial de los empleados de manufacturación del manejo de una proteasa que pudo tener efectos trombóticos significativos si se introdujera inadvertidamente en su circulación. Estos problemas se minimizan mediante el uso del proceso de la invención porgue : (a) antes del tratamiento con solvente-detergente significa que la trombina generada no necesitó procesarse en numerosas áreas de manufacturación diferentes, cada una de las cuales tendría que ser aislada de otras actividades; (b) se minimiza el número de etapas de manufacturación (particularmente después de la generación de trombina a partir de protrombina) ; y (c) el rendimiento es suficiente para proporcionar cantidades significativas de trombina de volúmenes muy pequeños . De esta manera, la contención del proceso se simplifica considerablemente . También es ventajoso limitar la exposición del producto a múltiples reactivos diferentes durante la manufactura, ya que tales reactivos pueden servir como una fuente de contaminación indeseable o modificación del producto. Minimizando el número de reactivos y las etapas requeridas para la manufactura de la trombina a partir de la protrombina, es una ventaja adicional del proceso de la invención. La trombina preparada usando el proceso de la invención puede usarse clínicamente, ya sea sola o en combinación con fibrinógeno en un kit de cicatrización de fibrina. Por lo tanto, la presente invención proporciona la trombina obtenida de acuerdo con un proceso de la invención, para el uso en terapia, y kits farmacéuticos que comprenden la trombina obtenida de acuerdo con un proceso de la invención en combinación con fibrinógeno. Se prefieren los kits que comprenden la trombina preparada de acuerdo con un proceso de la invención y el fibrinógeno preparado de acuerdo con la solicitud del PCT co-pendiente del solicitante No. (desconocido) titulada "Processes for the preparation of fibrinogen" (Procesos para la preparación de fibrinógeno) presentada el 7 de julio de 2003, que reivindica la prioridad de la solicitud de patente UK No. 0216001.8 presentada el 10 de julio de 2002, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia. Lo siguiente es una descripción más detallada de las modalidades preferidas del proceso de la invención.

Remoción del crioprecipitado del plasma El plasma congelado de humano se acondiciona a alrededor de -11°C, se descongela a aproximadamente +1°C y el crioprecipitado se colecta por centrifugación. El sobrenadante se denomina sobrenadante de crioprecipitado (CPS) .

Captura del complejo de protrombina del sobrenadante de crioprecipitado Adsorción del complejo de protrombina del sobrenadante crioprecipitado El medio de intercambio ani nico, tal como DEAE Sepharose CL-6B, se adiciona a CPS en proporciones de, por ejemplo, -10 mi de medio de intercambio aniónico empacado por kilogramo de CPS . La mezcla se agita durante un tiempo apropiado y después el medio (incluyendo la proteína adsorbida) se recupera del CPS, por ejemplo mediante centrifugación.

Elución del complej o de protrombina El medio de intercambio aniónico recuperado se suspende en un amortiguador apropiado y se empaca en una columna de cromatografía. El medio se lava con un amortiguador de bajo contenido salino para remover las proteínas enlazadas débilmente e indeseadas . Las condiciones de carga y lavado se controlan para minimizar específicamente el nivel del factor VI de coagulación y los factores de coagulación activados en el complejo de la protrombina eluida. El medio después se lava con un amortiguador de elución de alto contenido salino para recuperar el complejo de protrombina. El pico de la proteina se colecta selectivamente para evitar la contaminación del complejo de protrombina con los factores de coagulación activados. El eluato puede almacenarse congelado.

Tratamiento con solvente-detergente La solución del complejo de protrombina se filtra a través de un filtro de poro de 0.45 µ?? o más pequeño. Los reactivos con solvente-detergente después se adicionan y la mezcla se agita a una temperatura y durante un tiempo conocido para activar cualesquiera virus cubiertos que pudieran estar presentes .

Cromatografía de activación de protrombina Dilución del complejo de protrombina tratado con solvente-detergente El complejo de protrombina tratado con solvente-detergente después se diluye con, por ejemplo, agua, para reducir la concentración iónica de la solución a una que sea apropiada para unirse sobre un intercambiador aniónico.

Carga del segundo intercambiador aniónico La solución de la proteína diluida se bombea a través de una columna que contiene un medio de intercambio aniónico empacado. De manera ventajosa, éste puede ser el mismo medio que el usado para la preparación de la protrombina y el factor X del CPS u otra fuente. La contaminación microbiológica durante la generación de trombina se minimiza mediante la sanitización apropiada del medio de intercambio aniónico y mediante la filtración de los amortiguadores, para remover la contaminación bacteriana (por ejemplo, mediante el uso de filtros de 0.2 µt?) . El medio se lava con el amortiguador usado para equilibrar la columna, para remover la proteína enlazada débilmente y los reactivos con solvéntedetergente, y para equilibrar el medio con las sales amortiguadoras que son más favorables para las etapas de procesamiento subsecuentes . El medio después se lava con aproximadamente 1 volumen de columna de un amortiguador que contiene calcio, por ejemplo el amortiguador de equilibrio más cloruro de calcio 2 mM.

Incubación por activación Las salidas de la columna se cierran y la columna se mantiene a una temperatura predeterminada durante un tiempo definido, por ejemplo, 65 horas a 20°C. Durante la incubación, la protrombina se convierte a la trombina.

Recuperación de la trombina A final de la incubación, la columna se lava con el amortiguador de equilibrio para recuperar la trombina. Las proteínas no afectadas por la incubación por activación permanecen unidas al medio, ya que las condiciones usadas para este lavado, en términos de pH, componentes del amortiguador y concentración iónica, son las mismas que las usadas para el lavado después de la carga de la columna. La trombína no se une a los intercambiadores iónicos a pHs abajo de su pl, así que se lava mediante el amortiguador. Por ejemplo, a pH 8 la trombina no se une a los intercambiadores iónicos, pero su precursor, la protrombina sí. El pico que se eluye se colecta en fracciones, los primeros volúmenes de la columna del efluente de la columna son de trombina de menor pureza y contienen más de cualquier trombina degradada o dañada que pudiera estar presente. Los siguientes volúmenes de la columna son de pureza mayor y si se separan de los volúmenes de la primera columna pueden usarse sin purificación ' adicional . Alternativamente, todo el efluente de la columna puede colectarse y purificarse adicionalmente .

Filtración del virus Puede usarse una etapa de reducción del virus . El eluato de la columna que contiene trombina puede filtrarse a través de un filtro de remoción de virus validado, tal como un filtro Planova 15N. La filtración también puede remover o reducir otros patógenos, por ejemplo los agentes causales de TSE.

Formulación La trombina se formula y se ajusta ahora a su potencia objetivo para el almacenamiento a largo plazo antes del uso clínico. Un método recomendado es la adición de un carbohidrato, tal como sacarosa y calcio, a una concentración de cloruro de sodio objetivo y después secarse por congelado la solución. Antes del secado por congelado, el producto formulado puede filtrarse a través de un filtro esterilizado (por ejemplo, un filtro de 0.2 µp?) conforme se requiera para el uso farmacéutico.

Tratamiento térmico terminal La formulación secada por congelado puede tratarse con calor terminalmente para inactivar cualesquiera virus que pudieran estar presentes. La trombina preparada usando el proceso de la invención puede usarse clínicamente, ya sea sola o en combinación con fibrinógeno en un kit de cicatrización de fibrina. Por lo tanto, la presente invención también proporciona la trombina obtenida de acuerdo con el proceso de la invención, para el uso en terapia, y kits farmacéuticos que comprenden la trombina obtenida de acuerdo con el proceso de la invención en combinación con fibrinógeno. Se prefieren los kits que comprenden trombina, de acuerdo con el proceso de la invención y el fibrinógeno preparado de acuerdo con la solicitud de patente co-pendiente del Reino Unido del solicitante titulada "Process and Composition" (Proceso y Composición) presentada el 10 de julio de 2002. La invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes . La preparación de PCC se describe en: Feldman P A, Bradbury P I, Williams J D, Sims G E C, cPhee J W, Pinnell M A, Harris L, Crombie G I, Evans D R, "Large scale preparation and biochemical characterisat on of a new high purity factor IX concéntrate prepared by metal chelate affinity chromatography" , Blood Coagulation and Fibrinolysis 1994; 5:939-948. El pH de las soluciones se ajustó usando las concentraciones apropiadas de hidróxido de sodio para aumentar el pH o ácido clorhídrico para reducir el pH. La trombina se midió mediante la prueba de coagulación que mide el tiempo para coagular una muestra de fibrinógeno y/o por la prueba cromogénica que mide la absorbancia de un cromóforo liberado por el corte mediado por la trombina de un péptido sintético. Tales métodos de prueba son conocidos por los experimentados en la técnica.

Prueba de coagulación, de trombina El estándar se calibra contra un estándar aceptado internacionalmente, y se diluye en el amortiguador de prueba, tal como trometamol 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, albúmina al 1%, pH 7.5, a un intervalo de concentraciones apropiado, por ejemplo, 1 a 7 iu/ml . Las muestras se diluyen para estar dentro del intervalo de concentraciones. Los tiempos de coagulación de las soluciones de trombina diluidas se miden después de la adición de fibrinogeno humano a una concentración fijada. La relación entre las muestras de prueba y el estándar después permite el cálculo de la concentración de trombina en la muestra, expresada en unidades internacionales (iu) por mi.

Prueba cromogénica de trombina El estándar se calibra contra un estándar aceptado internacionalmente, y se diluye en el amortiguador de prueba, tal como trometamol 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, albúmina al 0.1%, pH 7.3, a un intervalo de concentraciones apropiado, por ejemplo, 0.5 a 5 iu/ml. Las muestras se diluyen para estar dentro del intervalo de concentraciones . La trombina diluida después se adiciona a un sustrato cromogénico (por ejemplo S-2238 de Chromogenix) y la mezcla se incuba durante un periodo de tiempo definido. La reacción después se detiene mediante la adición de, por ejemplo, ácido acético. La absorbancia de la solución después se mide a 405 nm (para S-2238) . La concentración de la trombina es proporcional al color desarrollado y la concentración de la muestra puede interpolarse de la linea estándar.

Ejemplo 1; Cromatografía de activación de protrombina Amortiguadores de trometamol e incubación a 20°C durante 62.5 horas . 1.19 kg del complejo de protrombina tratado con solvente-detergente se diluyó con 2.50 kg de agua para reducir su conductividad de 26.4 mS/cm a 9.28 mS/cm. La solución después se tituló a pH 8.0. Esta solución se cargó en una columna enchaquetada de 5 cm de diámetro empacada con un lecho de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrado con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0. Después de cargar, el medio se lavó con 15 volúmenes de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0 para remover los reactivos del solvente-detergente y la proteína débilmente enlazada. El medio después se lavó con 1 volumen de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 8.0. Las salidas de la columna se cerraron. Se circuló agua a 20°C a través de -la chaqueta.

Después de 62.5 horas, se detuvo la circulación del agua. El medio se lavó con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0 para recuperar la trombina generada durante la incubación. Los primeros 3 volúmenes de la columna del efluente de la columna que contuvieron 3·.8 millones de unidades internacionales (iu) de actividad de coagulación de trombina, se desecharon ya que la actividad de coagulación específica fue menor de 2000 iu/mg de proteína total. Los siguientes 11 volúmenes de la columna del efluente que contuvieron 2.8 millones iu de actividad de coagulación, tuvieron una actividad especifica de 2400 iu/mg y se acumularon para el procesamiento adicional, sin la necesidad de etapas de purificación adicionales de la proteína.

Ejemplo 2: Cromatografía de activación de protrombina Amortiguadores de citrato-fosfato y DEAE Sepharose 4.4 kg del complejo de protrombina tratado con solvente -detergente se diluyó con 6.3 kg de agua para reducir su conductividad a 9.3 mS/cm. La solución después se tituló a pH 8.0. Se cargaron 7.1 kg de esta solución sobre una columna de 9 cm de diámetro empacada con un lecho de 12.5 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrado con citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 68.5 mM, pH 8.0. Después de cargar, el medio se lavó con 11 volúmenes de columna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 68 mM, pH 8.0 para remover los reactivos del solvente-detergente y la proteína débilmente enlazada. El medio después se lavó con 1 volumen de columna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, , cloruro de sodio 64 ttiM, cloruro de calcio 2 mM, H 8.0. Las salidas de la columna se cerraron. La columna se almacenó a temperatura ambiente . Después de aproximadamente 64 horas, el medio se lavó con citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 68 mM, pH 8.0 para recuperar la trombina generada durante la incubación. Se recuperaron un total de 11 millones iu de la actividad de coagulación de la columna, de los cuales 3.8 millones iu tuvieron una actividad específica de >2000 iu/mg y se acumularon para el procesamiento adicional, sin la necesidad de etapas de purificación adicionales de la proteina .

Ejemplo 3: Cromatografía de activación de protrombina Amortiguadores de citrato-fosfato y Fractogel EMD DEAE 650 (S) 148 mi del complejo de protrombina tratado con solvente-detergente se diluyó con 121 mi de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, pH 9.0 para reducir su conductividad a 16 mS/cm. La solución después se tituló a pH 8.0. Se cargaron 111 g de esta solución sobre una columna de 1 cm de diámetro empacada con 10 mi de Fractogel EMD DEAE 650 (S) , equilibrado con citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 137 mM, pH 8.0. Después de cargar, el medio se lavó con 12 volúmenes de columna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 137 mM, pH 8.0, para remover los reactivos con solvente-detergente y la protelna débilmente enlazada. El medio después se lavó con 1 volumen de columna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 129 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 8.0. Las salidas de la columna se cerraron. La columna se almacenó a temperatura ambiente . Después de aproximadamente 64 horas, el medio se lavó con citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 129 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 8.0 para recuperar la trombina generada durante la incubación. Un total de 0.4 millones iu de actividad de coagulación se recuperaron de la columna, de los cuales 0.3 millones iu tuvieron una actividad especifica de >2000 iu/mg y se acumularon para el procesamiento adicional, sin la necesidad de etapas de purificación adicionales de la proteína.

Ejemplo 4 Amortiguadores de trometamol e incubación a 10, 14.5 y 22 °C durante aproximadamente 64 horas . 195 g del complejo de protrombina tratado con solvente-detergente se diluyó con 424 g de agua, para reducir su conductividad de 28.9 mS/cm a 9.39 mS/cm. La solución después se tituló a pH 8.0 con hidróxido de sodio 1M. Se cargaron aproximadamente 140 g de esta solución sobre tres columnas enchaquetadas de 1 cm de diámetro empacadas con un lecho de 13 de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrado con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, H 8.0. Después de cargar, el medio se lavó con 10 volúmenes de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0, para remover los reactivos con solvente-detergente y la proteína débilmente enlazada. El medio después se lavó con 1 volumen de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 8.0. Las salidas de la columna se cerraron. Una columna se dejó a temperatura ambiente (21.8°C + 0.4°C). Las otras se mantuvieron a 10° ó 14.5°C circulando agua enfriada a través de las chaquetas de la columna. Después de aproximadamente 64 horas, la temperatura en las chaquetas se cambió a 18 °C y se detuvo el enfriamiento de la chaqueta. El medio se lavó con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0 para recuperar la trombina generada durante la incubación. Los resultados se muestran en la Tabla Tabla 1 Ejemplo 5 Amortiguadores de trometamol e incubación a 15, 23 y 26°C durante aproximadamente 64 horas. 458 g del complejo de protrombina tratado con solvente-detergente se diluyó con 977 g de agua para reducir su conductividad de 28.9 mS/cm a 9.39 mS/cm. La solución después se tituló a pH 8.0 con hidróxido de sodio 1M. Aproximadamente 140 g de esta solución se cargó sobre tres columnas enchaquetadas de 1.6 cm de diámetro empacadas con lecho de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrado con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0. Después de cargar, el medio se lavó con 10 volúmenes de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0 para remover los reactivos con solvente-detergente y la proteina débilmente enlazada. El medio después se lavó con 1 volumen de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 8.0. Las salidas de la columna se cerraron. Después se circuló agua a través de las chaquetas de la columna a 15°, 23° y 26°C. Después de 65 horas, se detuvo la circulación de agua. El medio se lavó con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0, para recuperar la trombina generada durante la incubación. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Ejemplo 6 Amortiguadores de trometamol e incubación a temperatura ambiente durante 16, 40 y 64 horas. 248 g del complejo de protrombina tratado con solvente-detergente se diluyó con 523 g de agua para reducir su conductividad de 28.9 mS/cm a 9.33 mS/cm. La solución después se tituló a pH 8.0. Aproximadamente 195 g de esta solución se cargó sobre cada una de tres columnas de 1 cm de diámetro empacadas con lecho de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrado con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0. Después de cargar cada columna, el medio se lavó con 10 volúmenes de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0 para remover los reactivos con solvente-detergente y la proteína débilmente enlazada. El medio después se lavó con 1 volumen de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, cloruro de calcio 5 M, pH 8.0. Las salidas de la columna se cerraron. La columna se almacenó a temperatura ambiente. Las tres columnas se almacenaron durante 16 horas, 40 horas y 64 horas. Al final de cada incubación, el medio se lavó con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0 para recuperar la trombina generada durante la incubación. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 Ejemplo 7: Mecanismo de generación de trombina Se realizaron experimentos para determinar el mecanismo de activación de la protrombina a trombina en el proceso de la invención.

Materiales Protrombina purificada con virus inactivados Factor X purificado con virus inactivados Antitrombina con virus inactivados La protrombina y el factor X se habían inactivado por tratamiento con solvente y detergente usando fosfato de tri-n-butilo y polisorbato 80. La antitrombina se había inactivado de virus por tratamiento térmico.

Método Se empacaron tres columnas de cromatografía con el gel de intercambio aniónico DEAE Sepharose CL-6B ,y se equilibraron en amortiguador de trometamol-NaCl . Las tres columnas después se usaron como se describe en la Tabla 4, y los productos después se probaron para la actividad de trombina .

Tabla 4 Columna 1 Columna 2 Columna 3 Protrombina Factor X cargado Factor X cargado cargada Equilibrio Equilibrio Equilibrio Lavado con Lavado con Lavado con Amortiguador Amortiguador Amortiguador Incubación con Incubación con Incubación con amortiguador de amortiguador de amortiguador de calcio calcio calcio Equilibrio Equilibrio Equilibrio Elución con Lavado con Lavado con amortiguador amortiguador amortiguador Protrombina Antitrombina cargada cargada Columna 1 Columna 2 Columna 3 Equilibrio Equilibrio Elución con Lavado con amortiguador amortiguador Protrombina cargada Equilibrio Elución con amortiguador Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Columna 1 Columna 2 Columna 3 Protrombina total 2039 2044 2061 cargada, iu Factor X total 0 1222 1196 cargado aplicado, u Antitrombina 0 0 850 aplicada, u Columna 1 Columna 2 Columna 3 Trombina generada, <0.07 113 <0.07 iu por iu de protrombina Los resultados muestran que la trombina no puede generarse a partir de la protrombina con virus activados exclusivamente por el calcio (Columna 1) . La trombina puede generarse a partir de protrombina con virus inactivados por incubación con el factor X con virus inactivados, el cual se ha incubado anteriormente con calcio, y el calcio después se remueve antes del contacto con la protrombina (Columna 2) . La trombina no puede generarse a partir de protrombina con virus inactivados por incubación con el factor X con virus inactivados, el cual se ha incubado anteriormente con calcio, si el factor X/factor Xa después se inactiva con antitrombina y el calcio y la antitrombina se remueven antes del contacto con la protrombina (Columna 3) . El mecanismo de generación de trombina en el proceso de la invención requiere que el factor X sea activado por el calcio y la protrombina para después activarse a la trombina mediante la acción del factor X activado (es decir, el factor Xa), en lugar de directamente por el calcio. Por lo tanto, la protrombina aislada no un material iniciador apropiado para el uso en el proceso de la invención.

Ejemplo 8; Carencia de generación de trombina usando únicamente protrombina purificada y calcio La protrombina (Factor II) se separó de otras proteínas del factor de coagulación del complejo de protrombina después del tratamiento virucida con solvente y detergente, mediante el paso a través de una columna Chelating Sepharose cargada con cobre . Esta solución de proteína se usó en presencia del solvente de co-purificación y los reactivos detergentes (SD) o se separó del solvente y los reactivos detergentes mediante re-cromatografía en un gel de intercambio aniónico de DEAE Sepharose . La protrombina en solución se incubó a pH 6.5 con amortiguador de cloruro de calcio 40 mM a 25°C durante 3 horas. Después se midió la actividad de la trombina. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 Los resultados confirman que la protrombina aislada de humano no se convirtió en trombina mediante la acción de iones de calcio únicamente después de experimentar un procedimiento de inactivación de virus con solvente-detergente, sin tener en cuenta si los reactivos de SD se removieron o no antes de la adición de los iones de calcio. Por lo tanto, la protrombina aislada no es un material iniciador apropiado para el uso en el proceso de la invención.

Ejemplo 9: Carencia de generación de trombina por la acción del calcio sobre el complejo de protrombina durante o después del tratamiento con reactivos de solvente-detergente. Muestras de tres concentrados diferentes del complejo de protrombina (que contienen los factores II, IX y X) se incubaron con cloruro de calcio 20 mM en solución y se probaron para la actividad de trombina después de la incubación durante 3 horas y 5 horas. Las muestras del complejo de protrombina (PCC) derivadas de plasma de humano fueron: A: eluato de PCC de cromatografía de intercambio aniónico de CPS . B: eluato de PCC que contiene detergente de polisorbato 80 al 1% y solvente de fosfato de tri-n-butilo (TnBP) al 0.3%. C: PCC tratado con solvente y detergente del cual se ha removido el solvente y el detergente. Ninguno de los materiales del complejo de protrombina usados en estos experimentos, se activaron durante su manufactura, ya sea intencional o no intencionalmente, como se determina por las pruebas NAPTT y FCT para los factores de coagulación activados. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7 Muestra Trombina después de 3 Trombina después de horas, iu/ml 5 horas, iu/ml A 619 1168 B Menos de 1 3.48 C Menos de 1 2.02 Los resultados muestran que se generó trombina despreciable del complejo de protrombina (no activada) en solución después de que se había tratado con solvente y detergente, sin tener en cuenta si el solvente y detergente permaneció en la preparación en el momento de la incubación con calcio (comparar los resultados para la muestra A con los de las muestras B y C) . Esto confirmó la enseñanza del arte previo que el calcio solo no fue suficiente para activar el complejo de protrombina tratado con solvente-detergente. Es una característica esencial del proceso de la invención que la protrombina tratada con solvente-detergente que contiene el material, se carga sobre un medio de intercambio aniónico para que se genere trombina.

E emplo 10 Activación con iones de calcio y magnesio 249 mi del complejo de protrombina tratado con solvente-detergente se diluyó con 150 mi de agua desionizada para reducir su conductividad a 16 mS/cm. La solución después se tituló a pH 8.0 con hidróxido de sodio 1M. 82 a 87 g de. esta solución se cargaron en cada una de tres columnas de 1 cm de diámetro, cada una empacada con 10 mi de DEAE Sepharose CL6B, equilibrado con citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 137 mM, pH 8.0. Después de cargar, el medio se lavó con 10 volúmenes de columna de citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 137 mM, pH 8.0, para remover los reactivos de solvente y detergente y la proteina débilmente enlazada. El medio después se lavó con 1 volumen de columna de amortiguador de activación, ya sea citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 129 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 8.0 (columna 1) o citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 129 mM, cloruro de magnesio 2 mM, pH 8.0 (columna 2) o citrato 8 mM, fosfato 10 mM, cloruro de sodio 129 mM, cloruro de calcio 2 mM, cloruro de magnesio 2 mM, pH 8.0 (columna 3). Las salidas de la columna se cerraron. Las columnas se almacenaron a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 64 horas, el medio se lavó con el amortiguador de activación para recuperar la trombxna generada durante la incubación. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8 Columna Actividad cromogénica de Ión metálico en el trombina total recuperada amortiguador- de activación 1 178,000 iu Calcio 2 66,500 iu Magnesio 3 256,000 iu Calcio/Magnesio Ejemplo 11: Formulación Una solución de trombina en la que se filtró el virus preparada como en el Ejemplo 1, se formuló a trometamol 10 mM, NaCl 200 mM, CaCl2 40 mM, sacarosa al 2%, pH 7.0 y se ajustó la potencia a aproximadamente 500 iu de actividad de coagulación de trombina/ml . 5 mi de esta solución se repartió en ampolletas de vidrio y se secaron por congelado. El material secado por congelado se trató con calor a 80°C durante 72 horas. En 3 corridas, se alcanzó un promedio de recuperación de 98% para la actividad de coagulación de trombina por medio del secado por congelado y un promedio de 98% por medio del tratamiento térmico .

Ejemplo 12: Formulación Se formuló la solución de trombina a aproximadamente 1250 iu de actividad de coagulación/ml . Todas las formulaciones contuvieron trometamol 10 mM y cloruro de sodio 200 mM a pH 7.0. Adicionalmente, contuvieron los componentes adicionados mostrados a continuación. Las soluciones se llenaron en ampolletas, 2 mi por ampolleta. Las ampolletas se secaron por congelado y se trataron con calor seco a 80°C durante 72 horas . Las ampolletas después se reconstituyeron con agua y se probaron para determinar la actividad de trombina. La actividad de trombina se comparó con la actividad de trombina en las muestras tomadas antes del secado por congelado. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Los resultados mostraron que el estabilizador de albúmina convencional no proporcionó estabilidad a través del tratamiento de secado por congelado y térmico. Otras combinaciones del calcio y carbohidrato dieron estabilidad mejorada a través del tratamiento de secado por congelado y térmico .

Ejemplo 13: Formulación de trombina, tratamiento de secado por congelado y térmico Se formuló una solución de trombina a 500 iu/ml (5 mi de llenado) . Todas las formulaciones también contuvieron trometamol 10 mM y sodio 200 mM a pH 7.0 y contuvieron adicionalmente los componentes mostrados a continuación. Las soluciones se llenaron en ampolletas, 5 mi por ampolleta. Las ampolletas se secaron por congelado y se trataron con calor a 80°C durante 72 horas ó 100°C durante 24 horas. Las ampolletas después se reconstituyeron con agua y se probaron para determinar la actividad de trombina. La actividad de trombina se comparó con la actividad de trombina en las muestras tomadas antes del secado por congelado . Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10 Los resultados mostraron que la formulación óptima fue de trometamol 10 mM y sodio 200 mM a pH 7.0 más cloruro de calcio 40 mM y sacarosa al 2%.

Ejemplo 14: Preparación de trombina 1.17 kg del complejo de protrombina tratado con solvente-detergente se diluyó con 2.58 kg de agua para reducir su conductividad de 27.5 mS/cm a 9.12 mS/cm. La solución después se tituló a pH 8.0 con hidróxido de sodio 0.5 M. Esta solución se cargó en una columna enchaquetada de 5 cm de diámetro empacada con un lecho de 13 cm de altura de DEAE Sepharose CL6B, equilibrado con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0. Después de cargar, el medio se lavó con 15 volúmenes de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0 para remover los reactivos de solvente-detergente y la proteína débilmente enlazada. El medio después se lavó con 1 volumen de columna de trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 8.0. Las salidas de la columna se cerraron. Se recirculó agua a 20°C a través de la chaqueta de la columna. Después de 64 horas, la circulación del agua se detuvo. El medio se lavó con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0 para recuperar la trombina generada durante la incubación. Los primeros 4 volúmenes del efluente de la columna contuvieron 4.3 millones de unidades internacionales (iu) de actividad de coagulación de trombina con una actividad de coagulación de trombina específica menor de 2000 iu/mg de proteína total . Los siguientes 9 volúmenes del efluente de la columna que contuvieron 2.2 millones iu de actividad de coagulación a una actividad específica de 2100 iu/ml se congelaron a -40°C y se mantuvieron para el procesamiento adicional . 900 g del eluato congelado se descongeló y se filtró usando un filtro para virus Planova 15N, que se había equilibrado con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0. Hubo una recuperación medida de 95% de la actividad de coagulación de trombina a través del congelado/descongelado y 102% a través de la filtración del virus. El filtrado después se formuló a trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, cloruro de calcio 40 mM, sacarosa al 2%, mediante la adición de un amortiguador apropiado. La solución se diluyó a una concentración de actividad de coagulación de trombina estimada de 550 iu/ml con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 200 mM, cloruro de calcio 40 mM, sacarosa al 2%, pH 7.0 y después se tituló con ácido clorhídrico 0.5 M a pH 7.0-. Esta solución después se filtró a través de un filtro de esterilización de 0.2 µt? y después se llenó en ampolletas, 5 g de solución por ampolleta. Las ampolletas se secaron por congelado y después se trataron con calor seco a 80°C durante 72 horas. Hubo una medida de recuperación de 97% de la actividad de coagulación de trombina a través de la filtración esterilizada, 102% a través de la liofilización y 100% a través del tratamiento con calor seco.

Ejemplo 15: Tiempos de incubación 150 mi del complejo de protrombina tratado con solvente-detergente se diluyó con agua para reducir su conductividad a aproximadamente 9.3 mS/cm. La solución después se tituló a pH 8.0. Esta solución se cargó en cada una de cuatro columnas empacadas con un 12.5-12.9 mL de DEAE Sepharose CL6B, que habla sido equilibrado con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, pH 8.0. Las columnas después se lavaron con el mismo amortiguador para remover los reactivos de solvente-detergente y la proteina débilmente enlazada. Las columnas después se lavaron con trometamol 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, cloruro de calcio 2 mM, pH 8.0, las salidas de las columnas se cerraron y las columnas se aislaron a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) durante periodos entre 35 y 85 horas. Al final de cada periodo, una de las columnas se lavó con trometamol 10 mM, NaCl 110 mM, pH 8.0 para recuperar la trombina generada. Los resultados se muestran en la Tabla 11: Tabla 11 Columna Incubación Actividad de coagulación de (horas ) trombina Recuperado Total >2000 total (iu) iu/mg (iu) 1 35 229, 344 144, 751 2 45 267, 860 144, 463 3 65 289,359 128,578 4 85 266, 844 101, 687 Hay una tendencia general de aumento en el rendimiento (unidades totales) , pero disminución de la pureza (unidades >2000 iu/mg) con aumento en el tiempo de incubación. Una persona experimentada puede elegir el tiempo de incubación para dar el balance más favorable entre el rendimiento total y la pureza en cualquier situación particular. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para la preparación de trombina con virus inactivados, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) inactivación del virus con solvente-detergente de una solución que comprende protrombina y factor X; (b) cargar el producto de la etapa (a) sobre un medio de intercambio aniónico; (c) lavar el medio para remover los reactivos usados para la inactivación del virus con solvente-detergente en la etapa (a) ; y (d) activar la protrombina sobre el medio para formar trombina mediante la adición de iones metálicos. 2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución que comprende la protrombina y el factor X es un complejo de protrombina. 3. Un método para la preparación de trombina con virus inactivados, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) inactivación del virus con solvente-detergente de una solución que comprende el factor X; (b) cargar el producto de la etapa (a) sobre un medio de intercambio aniónico; (c) lavar el medio para remover los reactivos usados para la inactivación del virus con solvente y detergente en la etapa (a) ; (d) activar el factor X sobre el medio para formar el factor Xa mediante la adición de iones metálicos; y (e) cargar la protrombina con virus inactivados sobre el medio de intercambio aniónico de modo que se genere trombina . 4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los iones metálicos son iones metálicos divalentes. 5. Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los iones metálicos divalentes son iones de magnesio y/o calcio. 6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende además la etapa de: (e) eluir selectivamente la trombina del medio de intercambio aniónico 7. Un método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además comprende las etapas de: (f) pasar el producto de la etapa (e) a través de un filtro que mantiene patógenos; (g) adicionar un ión metálico divalente y un carbohidrato al producto de la etapa (f) , y (h) secar por congelado y tratar con calor el producto de la etapa (g) para inactivar los virus. 8. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las etapas (a) y (b) se reemplazan por las etapas (a') y (b' ) : (a' ) cargar una solución que comprende protrombina y el factor X sobre un medio de intercambio aniónico y (b') inactivación del virus con solvente-detergente de la protrombina y el factor X sobre el medio. . La trombina, caracterizada porque se prepara de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 10. La trombina, caracterizada porque se prepara de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para uso en terapia. 11. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende la trombina preparada de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 12. Un kit farmacéutico, caracterizado porque comprende la trombina preparada de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 junto con fibrinogeno. 13. Un kit de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el fibrinogeno se prepara por un método que comprende las etapas de: (a) cargar una solución que comprende fibrinógeno sobre una matriz de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados bajo condiciones de modo que el fibrinógeno se enlaza a la matriz, y (b) eluir selectivamente el fibrinógeno de la matriz.