PL208219B1 - Sposób otrzymywania trombiny po inaktywacji wirusów - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania trombiny po inaktywacji wirusów.

Trombina jest wielofunkcyjną proteazą osocza powstającą w krwiobiegu na drodze aktywacji jej nieaktywnego prekursora, protrombiny (także znanej jako czynnik II). Sama protrombina ulega aktywacji poprzez działanie aktywowanego czynnika X (czynnika Xa). Jedną spośród głównych funkcji trombiny w osoczu krwi jest konwersja rozpuszczalnego fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę w końcowym etapie kaskady krzepnięcia krwi. Monomery fibryny, które powstają dzięki działaniu trombiny, grupują się razem i następnie ulegają usieciowaniu, z wytworzeniem skrzepu krwi. W leczeniu stosuje się samą trombinę i w połączeniu z fibrynogenem, w tak zwanych preparatach fibrynowych w celu uzyskania hemostazy, zamykania ran i kontrolowanej adhezji tkanek.

Do wszystkich zastosowań klinicznych potrzebna jest trombina o dużej czystości aby działania niepożądane związane z jej zastosowaniem były minimalne, np. obecność innych proteaz lub czynników krzepnięcia lub innych składników zanieczyszczających. Ponadto jest szczególnie ważne, aby trombina do zastosowania klinicznego, w szczególności, jeśli jest pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, została przed użyciem poddana obróbce w celu inaktywacji wszelkich potencjalnie występujących wirusów przenoszonych przez krew, np. wirusa zapalenia wątroby lub HIV. W tej dziedzinie znane są różne metody inaktywacji wirusów, obejmujące pasteryzację, obróbkę cieplną na sucho i obróbkę z zastosowaniem układu rozpuszczalnik-detergent (Pathogen Inactivation of labile blood products, Council of Europe Expert Committee in Blood Transfusion Study Group on Pathogen Inactivation in Labile Blood Products, Transfusion Medicine, 2001, 11, 149-175). Pożądane jest także usunięcie lub zmniejszenie liczby innych patogenów, np. wywołujących pasażowalną gąbczastą encefalopatię (TSE), za które obecnie przyjmuje się priony.

Obróbka cieplna na sucho jest skutecznym sposobem inaktywacji zarówno wirusów w otoczkach, jak i niektórych wirusów bez otoczek, podczas gdy obróbka z zastosowaniem układu rozpuszczalnik-detergent jest skuteczna do inaktywacji wirusów w otoczkach (tj. otoczkach lipidowych), takich jak wirus zapalenia wątroby typu B. Obróbka z zastosowaniem układu rozpuszczalnik-detergent jest obecnie powszechnie stosowaną metodą inaktywacji wirusów w produktach krwiopochodnych przeznaczonych do zastosowania klinicznego.

W przeszł ości aktywację protrombiny w trombinę często wywoływano przez dodanie jonów wapnia i tromboplastyny (czynnika III). Tromboplastyna była pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, co stanowiło źródło możliwych zanieczyszczeń produktu końcowego.

W opisie patentowym US 5 304 372 ujawniono sposób wytwarzania koncentratu ludzkiej trombiny z frakcji PPSB osocza. Sposób obejmuje aktywację protrombiny we frakcji PPSB w celu uzyskania trombiny przez dodanie chlorku wapnia, a następnie obróbkę uzyskanego produktu z zastosowaniem układu rozpuszczalnik-detergent w celu inaktywacji wirusów. Według opisu patentowego US 5 304 372 obróbki z zastosowaniem układu rozpuszczalnik-detergent nie można prowadzić na materiale wyjściowym PPSB, ponieważ eliminacji podlegałyby inne czynniki, takie jak fosfolipidy, konieczne do aktywacji konwersji protrombiny w trombinę.

W EP 0 378 798 ujawniono sposób wytwarzania trombiny, który obejmuje absorpcję czynnika II z osocza lub frakcji osocza na stał y noś nik, aktywację czynnika II na sta ł ym noś niku w trombinę i następnie elucję trombiny.

W opisie patentowym US 5 714 370 ujawniono otrzymywanie trombiny z protrombiny po inaktywacji wirusów z zastosowaniem aktywnych soli o właściwościach wywoływania krzepnięcia w celu przeprowadzenia aktywacji protrombiny w trombinę. Jako jedyny sposób inaktywacji wirusów w preparacie protrombiny ujawniono obróbkę cieplną.

W rocznym raporcie z 1993 Fundacji Dr Karla Landsteinera z badań w CLB (Central Laboratory of the Neterlands Red Cross blood transfusion service), na str. 10, znajduje się informacja, że aktywacja protrombiny potraktowanej z zastosowaniem układu rozpuszczalnik-detergent w celu uzyskania trombiny przy użyciu jonów wapnia przebiega pomyślnie jedynie w obecności dodanych fosfolipidów.

Korzystne byłoby opracowanie sposobu otrzymywania trombiny z protrombiny obejmującego etap inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent w celu usunięcia wirusów w otoczkach. Korzystne byłoby także całkowite pominięcie zastosowania innych produktów pochodzenia biologicznego a szczególnie zwierzęcego, np. tromboplastyny, w celu aktywacji protrombiny, ponieważ te produkty jako takie mogą stanowić źródło zakaźnych wirusów lub innych niepożądanych zanieczyszczeń podczas procesu wytwarzania.

PL 208 219 B1

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania trombiny po inaktywacji wirusów, który obejmuje etapy:

(a) inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent w roztworze zawierającym protrombinę i czynnik X, (b) wprowadzenia produktu z etapu (a) do złoża anionowymiennego, (c) przemywania złoża i usunięcia odczynników zastosowanych do inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent według etapu (a) i (d) aktywacji protrombiny w złożu z wytworzeniem trombiny poprzez dodanie jonów metalu. Roztwór zawierający protrombinę i czynnik X stanowi kompleks protrombiny.

Jony metalu są jonami metalu dwuwartościowego, korzystnie jako jony metalu dwuwartościowego stosuje się jony magnezu i/lub wapnia.

W sposobie wedł ug wynalazku dodatkowo wystę puje etap:

(e) selektywnej elucji trombiny ze złoża anionowymiennego.

Korzystnie sposób dodatkowo obejmuje etapy:

(f) przepuszczenia produktu z etapu (e) poprzez filtr zatrzymujący patogeny, (g) dodania jonu metalu dwuwartościowego i węglowodanu do produktu z etapu (f), i (h) liofilizacji i obróbki cieplnej produktu z etapu (g) i inaktywacji wirusów.

Etapy (a) i (b) zastępuje się korzystnie etapami (a') i (b'):

(a') wprowadzenie roztworu zawierającego protrombinę i czynnik X do złoża anionowymiennego i (b') inaktywacja wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent protrombiny i czynnika X w złożu.

Inny sposób otrzymywania trombiny po inaktywacji wirusów, według wynalazku, obejmuje etapy:

(a) inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent w roztworze zawierającym czynnik X, (b) wprowadzenia produktu z etapu (a) do złoża anionowymiennego, (c) przemywania złoża w celu usunięcia odczynników zastosowanych do inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent według etapu (a), (d) aktywacji czynnika X w złożu z wytworzeniem czynnika Xa poprzez dodanie jonów metalu i (e) wprowadzenia protrombiny po inaktywacji wirusów do złoża anionowymiennego i otrzymanie trombiny.

Jony metalu są jonami metalu dwuwartościowego, korzystnie jako jony metalu dwuwartościowego stosuje się jony magnezu i/lub wapnia.

Sposób dodatkowo obejmuje etap:

(e) selektywnej elucji trombiny ze złoża anionowymiennego.

Korzystnie sposób dodatkowo obejmuje etapy:

(f) przepuszczenia produktu z etapu (e) poprzez filtr zatrzymujący patogeny, (g) dodania jonu metalu dwuwartościowego i węglowodanu do produktu z etapu (f) i (h) liofilizacji i obróbki cieplnej produktu z etapu (g) i inaktywacji wirusów.

Etapy (a) i (b) zastępuje się korzystnie etapami (a') i (b'):

(a') wprowadzenie roztworu zawierającego protrombinę i czynnik X do złoża anionowymiennego i (b') inaktywacja wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent protrombiny i czynnika X w złożu.

Trombinę korzystnie selektywnie eluuje się ze złoża anionowymiennego.

Alternatywnie roztwór zawierający protrombinę i czynnik X można wprowadzić do złoża anionowymiennego i poddać inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent w złożu. Przedmiotem wynalazku jest zatem także alternatywny wobec powyższego sposób, w którym etapy (a) i (b) są zastąpione przez etapy (a') i (b'):

(a') wprowadzenia roztworu zawierającego protrombinę i czynnik X do anionowymiennego złoża; i (b') inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent protrombiny i czynnika X w złożu.

Pozostałe etapy tego alternatywnego sposobu są takie same jak pozostałe etapy pierwszego sposobu. Sposób obejmujący etapy (a) i (b) jest korzystniejszy od sposobu obejmującego etapy (a') i (b'), ponieważ ł atwiej moż na zweryfikować uzyskanie odpowiednich warunków inaktywacji przed obciążeniem złoża.

Materiałem wyjściowym dla sposobu według wynalazku może być dowolny roztwór, który zawiera protrombinę i czynnik X, obejmujący frakcje osocza lub protrombinę i/lub czynnik X pochodzące z ekspresji genów np. w hodowli komórkowej lub gatunków transgenicznych oraz protrombinę i/lub czynnik X wytwarzane dowolnymi innymi sposobami syntetycznymi. Materiał wyjściowy można wytworzyć dowolnym odpowiednim sposobem znanym w tej dziedzinie. Materiałem wyjściowym jest korzystnie kompleks protrombiny lub jego pochodna, która zawiera zarówno protrombinę, jak i czynnik X.

PL 208 219 B1

Kompleks protrombiny można wytworzyć sposobami znanymi w tej dziedzinie, np. metodą adsorpcji na złoża anionowymiennego ze sklarowanej cieczy nad krioprecypitatem i późniejszej elucji (P.A.Feldman, L.Harris, M.E.Haddon, D.R.Evans i J.K.Smith, Thrombosis Research, 1986, Suplement VI:36, który załącza się na zasadzie odsyłacza). W korzystnym rozwiązaniu, materiałem wyjściowym jest koncentrat kompleksu protrombiny (PCC) otrzymany w warunkach minimalizujących poziom czynnika krzepliwości VII i w którym czynniki krzepliwości są aktywowane. Tak zwany „trójczynnikowy PCC” jest zatem korzystniejszym materiałem wyjściowym niż „czteroczynnikowy PCC”.

Etap inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent prowadzi się z zastosowaniem odczynników i metod znanych w tej dziedzinie (patrz np. opisy patentowe US 4 481 189, US 4 613 501 i US 4 540 573, wszystkie załącza się na zasadzie odsyłacza). Odpowiednie rozpuszczalniki obejmują fosforan tri-n-butylu (TNBP). Odpowiednie detergenty obejmują polisorbat (Tween) 80, polisorbat (Tween) 20 i Triton X-100. Szczególnie korzystną kombinację stanowi polisorbat 80 i TNBP. W korzystnym rozwiązaniu roztwór zawierający protrombinę i czynnik X miesza się z rozpuszczalnikiem i detergentem. Inaktywację wirusów prowadzi się w stosownej temperaturze i przez czas wystarczający do inaktywacji wszystkich wirusów w otoczkach, które mogą potencjalnie występować. Obróbkę z zastosowaniem układu metodą rozpuszczalnik-detergent można np. prowadzić przez od około 1 do około 24 godzin, w temperaturze od około 4° do około 37°C, np. przynajmniej około 6 godzin w temperaturze około 23-27°C.

Roztwór zawierający protrombinę i czynnik X po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent następnie wprowadza się do odpowiedniego złoża anionowymiennego w takich warunkach, aby protrombina i czynnik X połączyły się ze złożem anionowymiennym. Jeśli to konieczne, roztwór po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent najpierw rozcieńcza się w celu zmniejszenia stężenia jonowego do odpowiedniego do wiązania protrombiny i czynnika X ze złożem anionowymiennym. Odpowiednie złoża anionowymienne są dostępne w handlu i obejmują DEAE Sepharose CL6B dostarczaną przez firmę Amersham Biosciences i Practogel EMD DEAE 650 (S) dostarczany przez firmę Merck.

Złoże anionowymienne korzystnie znajduje się w kolumnie w celu ułatwienia przemywania i elucji. Korzystnie, jeśli złoże anionowymienne stosuje się do wytwarzania materiału wyjściowego, np. do wychwytu protrombiny i/lub czynnika X z materiału źródłowego takiego jak osocze, wówczas takie samo złoże anionowymienne stosuje się w sposobie według wynalazku w celu zminimalizowania udziału różnych odczynników.

Po obciążeniu złoże anionowymienne przemywa się jednym lub większą liczbą odpowiednich buforów do przemywania w celu usunięcia niezwiązanego lub luźno związanego białka i odczynników stosowanych w metodzie rozpuszczalnik-detergent. Bufory do przemywania nie powinny zawierać odczynników, które mogą powodować konwersję związanej protrombiny w trombinę.

Związaną protrombinę następnie aktywuje się z wytworzeniem trombiny przez dodanie odpowiednich jonów metalu, korzystnie jonów metalu dwuwartościowego, takich jak jony magnezu lub wapnia, najkorzystniej jonów wapnia. Do aktywacji można stosować kombinację więcej niż jednego typu jonów metalu, np. mieszaninę jonów wapnia i magnezu. Korzystnie, jony metalu dodaje się w postaci buforu aktywującego i występują one w buforze w stężeniu pomiędzy około 1 i około 40 mM, korzystniej pomiędzy około 1,5 i około 17 mM, a najkorzystniej około 2 mM.

Związaną protrombinę inkubuje się z jonami metalu przez wystarczający okres czasu i w odpowiedniej temperaturze dla reakcji aktywacji. Temperatura powinna być wystarczająco wysoka aby reakcja mogła przebiegać pomyślnie, ale nie za wysoka, aby nie nastąpiła denaturacja obecnych białek lub wzrost zanieczyszczających mikroorganizmów. Reakcję korzystnie prowadzi się w temperaturze równej lub niższej od około 26°C, np. w temperaturze 10°-26°C, korzystniej w temperaturze około pokojowej (20°C) lub niższej, przez około 19-85 godzin, korzystniej 19-65 godzin, a nawet korzystniej przez około 40-65 godzin. Odpowiednie warunki inkubacji obejmują np. około 65 godzin w temperaturze około 20°C.

Nie wiążąc się żadną szczególną teorią przyjmuje się, że to kombinacja jonów metalu (np. wapnia) i złoża anionowymiennego, z którym jest związana protrombina, umożliwia aktywację protrombiny z wytworzeniem trombiny bez konieczności dodawania jakichkolwiek innych środków aktywujących, np. tromboplastyny. Jony metalu aktywują czynnik X w zaadsorbowanej frakcji z wytworzeniem czynnika Xa, a czynnik Xa z kolei aktywuje protrombinę z wytworzeniem trombiny. Możliwe jest też obciążenie złoża anionowymiennego czynnikiem X po inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-deterPL 208 219 B1 gent i jego aktywacja z wytworzeniem czynnika Xa przez dodanie jonów metalu przed wprowadzeniem do złoża anionowymiennego protrombiny. Czynnik Xa następnie umożliwia konwersję protrombiny w trombinę w złożu.

Przedmiotem wynalazku jest również drugi sposób otrzymywania trombiny po inaktywacji wirusów obejmujący etapy:

(a) inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent w roztworze zawierającym czynnik X;

(b) wprowadzenia produktu z etapu (a) do złoża anionowymiennego;

(c) przemywania złoża w celu usunięcia odczynników zastosowanych do inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent według etapu (a);

(d) aktywacji czynnika X w złożu z wytworzeniem czynnika Xa przez dodanie jonów metalu; i (e) wprowadzenia protrombiny po inaktywacji wirusów do złoża anionowymiennego tak, aby powstała trombina.

Następnie trombinę korzystnie selektywnie eluuje się z anionowymiennego złoża. Także korzystnie jonami metalu są jony metalu dwuwartościowego, takie jak jony magnezu i/lub wapnia.

Materiałem wyjściowym do drugiego sposobu według wynalazku mogą być dowolne roztwory, które osobno zawierają protrombinę i czynnik X, obejmujące frakcje osocza, protrombinę i/lub czynnik X pochodzące z ekspresji genu, np. w hodowli komórkowej lub gatunków transgenicznych, oraz protrombinę i/lub czynnik X wytwarzane dowolnymi innymi sposobami syntetycznymi. Materiały wyjściowe można wytworzyć dowolnym odpowiednim sposobem znanym w tej dziedzinie. Odpowiednie warunki inaktywacji wirusów, wprowadzania i aktywacji dla obu sposobów według wynalazku są takie same jak opisano powyżej.

Po aktywacji czynnika X z wytworzeniem czynnika Xa, złoże anionowymienne można ewentualnie przemyć stosując odpowiedni bufor w celu usunięcia jonów metalu przed dodaniem protrombiny.

Po konwersji protrombiny w trombinę, trombinę można odzyskać metodą elucji odpowiednim buforem regeneracyjnym. Stężenie jonowe i wartość pH buforu regeneracyjnego są korzystnie takie, aby umożliwiały selektywne usuwanie trombiny, przy pozostawieniu innych białek, np. nieprzereagowanej protrombiny, związanych z anionowymiennym złożem. Wartość pH zastosowanego buforu regeneracyjnego powinna być mniejsza od wartości pI trombiny tak, aby trombina nie łączyła się ze złożem anionowymiennym. Odpowiednia wartość pH buforu regeneracyjnego wynosi 8. Bufory stosowane do przemywania, aktywacji i regeneracji korzystnie nie zawierają żadnych soli fosforanowych, aby zapobiec wytrącaniu nierozpuszczalnego fosforanu wapnia podczas procesu wytwarzania.

Otrzymana trombina ma wysoki stopień czystości i jest silnie stężona, i można ją komponować bezpośrednio bez dalszego oczyszczania. Alternatywnie, jeśli to pożądane, można przeprowadzić dodatkowe etapy oczyszczania. Na przykład roztwór trombiny po oddzieleniu od złoża anionowymiennego można poddać kolejnym etapom redukcji liczby lub inaktywacji wirusów. Roztwór można np. przesączyć przez filtr usuwający wirusy, taki jak Planova 15N. Taka filtracja może także służyć usuwaniu czynników wywołujących pasażowalną gąbczastą encefalopatię (TSE).

Produkt trombiny po oddzieleniu od złoża anionowymiennego można komponować do przedłużonego przechowywania przed zastosowaniem klinicznym. Korzystnie roztwór trombiny liofilizuje się, ewentualnie w obecności jednego lub większej liczby stabilizatorów, w celu ograniczenia denaturacji podczas liofilizacji i późniejszej obróbki cieplnej. Odpowiednie stabilizatory obejmują węglowodany takie jak sacharoza, rafinoza lub trehaloza, i dwuwartościowe jony metalu takie jak jony wapnia. Szczególnie korzystna jest kombinacja jonów wapnia i węglowodanu takiego jak sacharoza. Korzystnie należy unikać zastosowania stabilizatorów białkowych, takich jak albumina, w celu zminimalizowania możliwych źródeł zanieczyszczeń w produkcie końcowym.

Odpowiednie warunki liofilizacji obejmują suszenie wstępne w temperaturze około -35°C i pod ciśnieniem około 100-130 mikrobarów (10-13 Pa), a następnie suszenie zasadnicze w temperaturze około +35°C i pod ciśnieniem około 30 mikrobarów (3 Pa).

Liofilizowany produkt trombiny można poddać dodatkowemu etapowi inaktywacji wirusów metodą obróbki cieplnej, np. ogrzewać w temperaturze około 80°C przez około 72 godzin lub w temperaturze 100°C przez 24 godziny. Stwierdzono, że kombinacja jonów wapnia i węglowodanu, takiego jak sacharoza, efektywnie stabilizuje trombinę wytwarzaną sposobem według wynalazku podczas finalnej obróbki cieplnej w celu inaktywacji wirusów.

Pożądane jest aby produkty krwiopochodne były poddawane przynajmniej dwóm oddzielnym etapom inaktywacji lub redukcji liczby wirusów podczas wytwarzania. Zaletą sposobu według wynalazku jest możliwość przeprowadzenia wielu różnych etapów inaktywacji lub redukcji liczby wirusów,

PL 208 219 B1 w celu inaktywacji lub zmniejszenia liczby wirusów w otoczkach i bez otoczek, oraz innych patogenów, np. czynników wywołujących TSE. Wiadomo, że obróbka metodą rozpuszczalnik-detergent powoduje rozerwanie otoczek lipidowych wirusów w otoczkach, podczas gdy filtracja oddziela cząstki o określonych wymiarach, a obróbka cieplna inaktywuje termicznie nietrwałe wirusy. Pożądane jest wprowadzenie wielu etapów inaktywacji lub redukcji w oparciu o różne zasady, w celu usunięcia lub zmniejszenia liczby tak wielu różnych patogenów, jak to możliwe. W korzystnym rozwiązaniu sposób obejmuje dodatkowy etap inaktywacji lub redukcji wirusów oprócz obróbki metodą rozpuszczalnik-detergent. W korzystniejszym rozwiązaniu sposób obejmuje dwa dodatkowe etapy redukcji lub inaktywacji wirusów oprócz obróbki metodą rozpuszczalnik-detergent. Sposób korzystnie obejmuje etap fizycznego usuwania wirusów (np. nanofiltrację) i etap inaktywacji wirusów metodą obróbki cieplnej na sucho, oprócz etapu zastosowania metody rozpuszczalnik-detergent.

Inną zaletą sposobu według wynalazku jest fakt, że aktywację protrombiny i oczyszczanie uzyskanej trombiny można przeprowadzić z zastosowaniem takiego samego typu złoża anionowymiennego jak użyte wcześniej do przygotowania materiału wyjściowego zawierającego protrombinę i czynnik X. Do komponowania produktu także stosuje się odczynniki, które już wcześniej użyto w procesie wytwarzania. Działanie to minimalizuje ekspozycję trombiny na wiele różnych odczynników, co jest korzystne w procesie wytwarzania produktu farmaceutycznego. Kolejną zaletą sposobu według wynalazku jest zmniejszenie ryzyka naruszenia integralności innych operacji wytwórczych, co umożliwia kontakt z wysoko aktywną proteazą trombinową. Rutynowo moż na tego uniknąć tylko przez oddzielenie urządzeń do produkcji trombiny od pozostałych urządzeń i operacji w wytwórni. Taki rozdział jest kosztowny i pracochłonny. Ponadto przetwarzanie związków pośrednich po inaktywacji wirusów (np. po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent) należy prowadzić w wydzielonym obszarze produkcyjnym w celu uniknięcia wszelkich następczych zanieczyszczeń. Znane w stanie techniki sposoby otrzymywania trombiny po obróbce z zastosowaniem układu metodą rozpuszczalnik-detergent wymagają wydzielenia obszaru produkcyjnego i dodatkowo są obciążone ryzykiem związanym z obsługą produktu podczas jego transferu z etapu do etapu. Ponadto istnieje także potencjalne ryzyko dla personelu wytwórni wynikające z pracy z proteazami, co może prowadzić do zakrzepów po przypadkowym ich wniknięciu do krwiobiegu. Te problemy minimalizuje zastosowanie sposobu według wynalazku, ponieważ (a) wcześniejsza obróbka metodą rozpuszczalnik-detergent oznacza, że wytwarzana trombina nie wymaga przetwarzania w wielu różnych obszarach produkcyjnych, z których każdy musiałby być oddzielony od pozostałych; (b) liczba etapów wytwórczych (szczególnie po wytworzeniu trombiny z protrombiny) jest mniejsza; i (c) proces jest tak wydajny, że pozwala na wytwarzanie znaczących ilości trombiny z bardzo małych obję tości. Zatem procedura bezpieczeństwa procesu jest znacznie uproszczona.

Korzystne jest także ograniczenie ekspozycji produktu na wiele różnych odczynników podczas wytwarzania, bowiem odczynniki jako takie mogą stanowić źródło niepożądanych zanieczyszczeń lub produktów ubocznych. Zmniejszenie liczby odczynników i etapów wytwarzania trombiny z protrombiny stanowi kolejną zaletę sposobu według wynalazku.

Trombinę otrzymaną sposobem według wynalazku można stosować klinicznie, samodzielnie lub w połączeniu z fibrynogenem w fibrynowym zestawie uszczelniającym, zawierają cych trombinę otrzymaną sposobem według wynalazku opisano, że trombina ma zastosowanie w leczeniu i zestawach farmaceutycznych w połączeniu z fibrynogenem. Zestawy, jak ujawniono, zawierają trombinę i fibrynogen (co opisuje zgłoszenie PCT złożone 7 lipca 2003, opierające się na pierwszeństwie z brytyjskiego zgłoszenia patentowego nr 0216001.8 złożonego 10 lipca 2002 o nieznanym dotąd numerze zatytułowanym „Sposób wytwarzania fibrynogenu”, które załącza się jako odsyłacz).

Korzystne rozwiązania według wynalazku

Usuwanie krioprecypitatu z osocza

Zamrożone ludzkie osocze kondycjonuje się w temperaturze około -11°C, rozmraża do temperatury około +1°C i krioprecypitat zbiera przez odwirowanie. Supernatant nosi w opisie nazwę sklarowanej cieczy nad krioprecypitatem (CPS).

Wychwyt kompleksu protrombiny ze sklarowanej cieczy nad krioprecypitatem

Adsorpcja kompleksu protrombiny ze sklarowanej cieczy nad krioprecypitatem

Złoże anionowymienne, takie jak DEAE Sepharose CL-6B, dodaje się do CPS w proporcjach np. ~10 ml pakowanego złoża anionowymiennego na kilogram CPS. Mieszaninę miesza się przez odpowiedni czas i następnie złoże (zawierające zaadsorbowane białko) oddziela się od CPS, np. przez odwirowanie.

PL 208 219 B1

Elucja kompleksu protrombiny

Oddzielone złoże anionowymienne zawiesza się w odpowiednim buforze i wypełnia nim kolumnę chromatograficzną. Złoże przemywa się małosolnym buforem w celu usunięcia luźno związanego i niepożądanego białka. Warunki wprowadzania do kolumny i przemywania kontroluje się w celu ustalenia specyficznie niskiego poziomu czynnika krzepliwości VII i aktywowanych czynników krzepliwości w wymywanym kompleksie protrombiny. Złoż e następnie przemywa się bogatym w sól buforem eluującym w celu odzyskania kompleksu protrombiny. Frakcję białka zbiera się selektywnie w celu uniknięcia zanieczyszczenia kompleksu protrombiny przez aktywowane czynniki krzepliwości. Eluat można przechowywać zamrożony.

Obróbka metodą rozpuszczalnik-detergent

Roztwór kompleksu protrombiny przesącza się poprzez filtr o wymiarze porów 0,45 μm lub mniejszym. Następnie dodaje się odczynniki stosowane w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent i mieszaninę miesza w temperaturze i przez okres czasu konieczne do inaktywacji wszelkich wirusów w otoczkach, które mogą występować.

Chromatografia aktywująca protrombinę

Rozcieńczenie kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent

Kompleks protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent następnie rozcieńcza się np. wodą w celu zmniejszenia stężenia jonowego roztworu do odpowiedniego dla wiązania ze złożem anionowymiennym.

Obciążanie drugiego złoża anionowymiennego

Rozcieńczony roztwór białka przepompowuje się poprzez kolumnę wypełnioną złożem anionowymiennym. Korzystnie jest to takie same złoże jak użyte do otrzymywania protrombiny i czynnika X z CPS lub innego źródła. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne podczas otrzymywania trombiny minimalizuje odpowiednia sanityzacja złoża anionowymiennego i filtracja buforów, mająca na celu usunięcie zanieczyszczeń bakteryjnych (np. z zastosowaniem filtrów 0,2 μm). Złoże przemywa się buforem użytym do stabilizacji kolumny, w celu usunięcia luźno związanego białka i odczynników stosowanych w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent oraz w celu zrównoważenia złoża przez sole buforujące, które korzystnie stosuje się w późniejszych etapach przetwarzania. Złoże następnie przemywa się w przybliżeniu 1 objętością kolumny buforu zawierającego wapń, np. bufor stabilizujący z 2 mM chlorku wapnia.

Inkubacja

Wyloty kolumny zamyka się i kolumnę pozostawia na ustalony okres czasu we wstępnie określonej temperaturze, np. 65 godzin w temperaturze 20°C. Podczas inkubacji protrombina przekształca się w trombinę.

Odzysk trombiny

Pod koniec inkubacji, kolumnę przemywa się buforem stabilizującym w celu odzyskania trombiny. Białka, które nie przereagowały w etapie inkubacji pozostają związane ze złożem, ponieważ warunki zastosowane w tym etapie przemywania, w sensie wartości pH, składników buforujących i stężenia jonowego, są takie same jak zastosowano do przemywania po obciążeniu kolumny. Trombina nie wiąże się z złożami anionowymiennymi przy wartościach pH poniżej jej pI, zatem jest wymywana przez bufor. Np. przy wartości pH 8 trombina nie jest związana z złożami anionowymiennymi, ale jej prekursor, protrombina, pozostaje związany.

Eluat jest zbierany we frakcjach, a pierwsze objętości eluatu z kolumny zawierają trombinę o mniejszej czystości i dużą ilość zdegradowanej lub uszkodzonej trombiny. Kolejne objętości kolumny zawierają trombinę o większej czystości i po oddzieleniu od pierwszych objętości kolumny można je stosować bez dalszego oczyszczania. Alternatywnie można zebrać całość eluatu z kolumny i oczyścić go w dalszych etapach.

Oddzielanie wirusów przez filtrację

Dodatkowo można zastosować etap redukcji liczby wirusów. Eluat z kolumny zawierający trombinę można przesączyć przez zwalidowany filtr do usuwania wirusów, taki jak Planova 15N. Taka filtracja może także usuwać lub zmniejszać liczbę innych patogenów, np. czynników wywołujących TSE.

Komponowanie preparatu

Na tym etapie przygotowuje się preparat trombiny o ustalonej mocy przeznaczony do przedłużonego przechowywania przed zastosowaniem klinicznym. Zalecany sposób komponowania obejmuje

PL 208 219 B1 dodanie węglowodanu, takiego jak sacharoza, i wapnia, i roztworu chlorku sodu o określonym stężeniu, a następnie liofilizację roztworu. Przed liofilizacją preparat można przesączyć poprzez filtr jałowiący (np. filtr 0,2 μm), jeśli zastosowanie farmaceutyczne tego wymaga.

Końcowa obróbka cieplna

Liofilizowany preparat można poddać na koniec obróbce cieplnej w celu inaktywacji wszelkich wirusów, które mogą występować.

Trombinę otrzymaną sposobem według wynalazku można stosować klinicznie, samodzielnie lub w połączeniu z fibrynogenem w fibrynowym zestawie uszczelniającym. Zestawy zawierają trombinę i fibrynogen otrzymany według brytyjskiego zgłoszenia patentowego zatytułowanego „Sposób i kompozycja”, złożonego 10 lipca 2002.

P r z y k ł a d y

Wytwarzanie PCC opisali: Feldman P A, Bradbury P I, Williams J D, Sims G E C, McPhee J W, Pinnell M A, Harris L, Crombie G I, Evans D R, „Large scale preparation and biochemical characterisation of a new high purity factor IX concentrate prepared by metal chelate affinity chromatography”, Blood Coagulation and Fibrinolysis 1994; 5:939-948.

Wartości pH roztworów uregulowano stosując roztwory wodorotlenku sodu o odpowiednich stężeniach w celu zwiększenia wartości pH lub kwas chlorowodorowy w celu zmniejszenia wartości pH.

Ilość trombiny zmierzono testem krzepnięcia, w którym mierzy się czas krzepnięcia próbki fibrynogenu i/lub testem barwnym, w którym mierzy się absorbancję chromoforu uwalnianego z syntetycznego peptydu za pośrednictwem trombiny. Takie metody testowe są znane fachowcom w tej dziedzinie.

Trombinowy test krzepnięcia

Wzorzec kalibruje się wobec wzorca międzynarodowego i rozcieńcza się buforem testowym, takim jak 50 mM trometamolu, 100 mM chlorku sodu, 1% albuminy, o wartości pH 7,5, do odpowiedniego zakresu stężeń, np. 1 do 7 iu/ml. Próbki rozcieńcza się do stężeń z tego zakresu.

Czasy krzepnięcia rozcieńczonych roztworów trombiny mierzy się po dodaniu ludzkiego fibrynogenu o ustalonym stężeniu. Z proporcji próbek badanych do wzorca oblicza się następnie stężenie trombiny w próbce wyrażone w jednostkach międzynarodowych (iu) na ml.

Trombinowy test barwny

Wzorzec kalibruje się wobec wzorca międzynarodowego i rozcieńcza buforem testowym, takim jak 50 mM trometamolu, 100 mM chlorku sodu, 0,1% albuminy, o wartości pH 7,3, do odpowiedniego zakresu stężeń, np. 0,5 do 5 iu/ml. Próbki rozcieńcza się do stężeń z tego zakresu.

Następnie do barwnego substratu (np. S-2238 z firmy Chromogenix) dodaje się rozcieńczoną trombinę i mieszaninę inkubuje się przez określony czas. Reakcję zatrzymuje się dodając, np. kwas octowy. Następnie mierzy się absorbancję roztworu przy długości fali 405 nm (dla S-2238). Stężenie trombiny jest proporcjonalne do uzyskanego zabarwienia a wartość stężenia próbki można interpolować z krzywej wzorcowej.

P r z y k ł a d 1

Chromatografia aktywująca protrombinę

Bufory z trometamolem i inkubacja w temperaturze 20°C przez 62,5 godziny

1,19 kg kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent rozcieńczono 2,50 kg wody w celu zmniejszenia wartości przewodności właściwej z 26,4 mS/cm do 9,28 mS/cm. Roztwór następnie zmiareczkowano do wartości pH 8,0. Ten roztwór wprowadzono do termostatowanej kolumny o średnicy 5 cm wypełnionej do wysokości 13 cm złożem DEAE Sepharose CL6B, po uprzedniej stabilizacji roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0. Po obciążeniu złoże przemyto 15 objętościami kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu usunięcia odczynników stosowanych w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent i luźno związanego białka. Złoże przemyto następnie 1 objętością kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0. Wyloty kolumny zamknięto. Poprzez płaszcz recyrkulowano wodę o temperaturze 20°C.

Po 62,5 godzinie obieg wody zatrzymano. Złoże przemyto roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu odzyskania trombiny powstałej podczas inkubacji. Pierwsze 3 objętości kolumny eluatu, który zawierał trombinę o wartości aktywności krzepnięcia 3,8 milionów jednostek międzynarodowych (iu) odrzucono, ponieważ specyficzna aktywność krzepnięcia była poniżej 2000 iu/mg całkowitego białka. Następnie zebrano 11 objętości kolumny eluPL 208 219 B1 atu, który zawierał trombinę o wartości aktywności krzepnięcia 2,8 miliona iu o specyficznej aktywności 2400 iu/mg i połączono je do dalszej obróbki bez przeprowadzania dodatkowych etapów oczyszczania białka.

P r z y k ł a d 2

Chromatografia aktywująca protrombinę

Bufory cytrynianowo-fosforanowe i DEAE Sepharose

4,4 kg kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent rozcieńczono 6,3 kg wody w celu zmniejszenia wartości przewodności właściwej do 9,3 mS/cm. Roztwór następnie zmiareczkowano do wartości pH 8,0. 7,1 kg tego roztworu wprowadzono do kolumny o średnicy 9 cm wypełnionej do wysokości 12,5 cm złożem DEAE Sepharose CL6B, po stabilizacji roztworem zawierającym 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 68,5 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0. Po obciążeniu złoże przemyto 11 objętościami kolumny roztworu 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 68 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu usunięcia odczynników stosowanych w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent i luźno związanego białka. Złoże przemyto następnie 1 objętością kolumny roztworu zawierającego 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 64 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0. Wyloty kolumny zamknięto. Kolumnę pozostawiono w temperaturze pokojowej.

Po około 64 godzinach złoże przemyto roztworem zawierającym 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 68 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu odzyskania trombiny powstałej podczas inkubacji. Ogółem z kolumny odzyskano trombinę o wartości aktywności krzepnięcia 11 milionów iu, z czego 3,8 miliona o specyficznej aktywności > 2000 iu/mg połączono do dalszej obróbki bez przeprowadzania dodatkowych etapów oczyszczania białka.

P r z y k ł a d 3

Chromatografia aktywująca protrombinę

Bufory cytrynianowo-fosforanowe i Fractogel BMP DEAE 650 (S)

148 ml kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent rozcieńczono 121 ml roztworu zawierającego 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, o wartości pH 9,0 w celu zmniejszenia wartości przewodności właściwej do 16 mS/cm. Roztwór następnie zmiareczkowano do wartości pH 8,0. 111 g tego roztworu wprowadzono do kolumny o średnicy 1 cm wypełnionej 10 ml Fractogel EMD DEAE 650 (S), po stabilizacji roztworem zawierającym 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 137 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0. Po obciążeniu złoże przemyto 12 objętościami kolumny roztworu zawierającego 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 137 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu usunięcia odczynników stosowanych w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent i luź no związanego białka. Złoże następnie przemyto 1 objętością kolumny roztworu zawierającego 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 129 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0. Wyloty kolumny zamknięto. Kolumnę pozostawiono w temperaturze pokojowej.

Po około 64 godzinach złoże przemyto roztworem zawierającym 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 129 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0 w celu odzyskania trombiny powstałej podczas inkubacji. Ogółem odzyskano trombinę o wartości aktywności krzepnięcia 0,4 miliona iu, z czego 0,3 miliona iu o specyficznej aktywności > 2000 iu/mg połączono do dalszej obróbki bez przeprowadzania dodatkowych etapów oczyszczania białka.

P r z y k ł a d 4

Bufory zawierające trometamol i inkubacja w temperaturze 10, 14,5 i 22°C przez około 64 godziny

195 g kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent rozcieńczono 424 g wody w celu zmniejszenia wartości przewodności właściwej z 28,9 mS/cm do 9,39 mS/cm. Roztwór następnie zmiareczkowano do wartości pH 8,0 z zastosowaniem 1M wodorotlenku sodu. Około 140 g tego roztworu wprowadzono do trzech termostatowanych kolumn o średnicy 1 cm wypełnionych do wysokości 13 cm złożem DEAE Sepharose CL6B, po stabilizacji roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0. Po obciążeniu złoże przemyto 10 objętości kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu usunięcia odczynników stosowanych w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent i luźno związanego białka. Złoże następnie przemyto 1 objętością kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0. Wyloty kolumny zamknięto. Jedną kolumnę pozostawiono w temperaturze pokojowej (21,8°C ± 0,4°). Pozostałe utrzymywano w temperaturze 10° lub 14,5°C przy zastosowaniu cyrkulacji wody chłodzącej w płaszczach kolumn.

PL 208 219 B1

Po około 64 godzinach, temperaturę w płaszczach uregulowano do 18°C i zatrzymano cyrkulację chłodzenia. Złoże przemyto roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu odzyskania trombiny powstałej podczas inkubacji. Wyniki przedstawiono w tabeli 1.

T a b e l a 1

Kolumna	Temperatura inkubacji °C	Aktywność krzepnięcia trombiny
Odzysk ogółem, iu	Ogółem >2000 iu/mg, iu
1	10	212000	149000
2	14,5	293000	174000
3	22	353000	142000

P r z y k ł a d 5

Bufory zawierające trometamol i inkubacja w temperaturze 15, 23 i 26°C przez około 64 godziny

458 g kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent rozcieńczono 977 g wody w celu zmniejszenia wartości przewodności właściwej z 28,9 mS/cm do 9,39 mS/cm. Roztwór następnie zmiareczkowano do wartości pH 8,0 z zastosowaniem 1M wodorotlenku sodu. Około 140 g tego roztworu wprowadzono do trzech termostatowanych kolumn o średnicy 1,6 cm wypełnionych do wysokości 13 cm złożem DEAE Sepharose CL6B, po stabilizacji roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0. Po obciążeniu złoże przemyto 10 objętościami kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu usunięcia odczynników stosowanych w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent i luźno związanego białka. Złoże następnie przemyto 1 objętością kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0. Wyloty kolumny zamknięto. Następnie poprzez płaszcze kolumn recyrkulowano wodę o temperaturze 15°, 23° i 26°C.

Po 65 godzinach, obieg wody zatrzymano. Złoże przemyto roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu odzyskania trombiny powstałej podczas inkubacji. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2

Kolumna	Temperatura inkubacji, °C	Aktywność krzepnięcia trombiny
Odzysk ogółem, iu	Ogółem >2000 iu/mg, iu
1	15	864000	423000
2	23	756000	284000
3	26	800000	128000

P r z y k ł a d 6

Bufory zawierające trometamol i inkubacja w temperaturze pokojowej przez 16, 40 i 64 godziny

248 g kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent rozcieńczono 523 g wody w celu zmniejszenia wartości przewodności właściwej z 26,9 mS/cm do 9,33 mS/cm. Roztwór następnie zmiareczkowano do wartości pH 8,0. Około 195 g tego roztworu wprowadzono do każdej z trzech kolumn o ś rednicy 1 cm wypełnionych do wysokości 13 cm złoż em DEAE Sepharose CL6B, po stabilizacji roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0. Po obciążeniu każdej z kolumn, złoże przemyto 10 objętościami kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu usunięcia odczynników stosowanych w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent i luźno związanego białka. Zło ż e następnie przemyto 1 obję tością kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, 5 mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0. Wyloty kolumny zamknięto. Kolumny pozostawiono w temperaturze pokojowej.

Trzy kolumny pozostawiono odpowiednio na 16 godzin, 40 godzin i 64 godziny. Pod koniec każdej z inkubacji złoże przemyto roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu odzyskania trombiny powstałej podczas inkubacji. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.

PL 208 219 B1

T a b e l a 3

Kolumna	Inkubacja, godziny	Aktywność krzepnięcia trombiny
Odzysk ogółem, iu	Ogółem >2000 iu/mg, iu
1	16	30700	0
2	40	407000	197000
3	64	500000	158000

P r z y k ł a d 7

Mechanizm powstawania trombiny

Doświadczenia przeprowadzono w celu określenia mechanizmu aktywacji protrombiny w trombinę w sposobie według wynalazku.

Materiały

Oczyszczona protrombina po inaktywacji wirusów

Oczyszczony czynnik X po inaktywacji wirusów

Antytrombina po inaktywacji wirusów

Protrombinę i czynnik X inaktywowano metodą rozpuszczalnik-detergent z zastosowaniem fosforanu tri-n-butylu i polisorbatu 80. Antytrombinę inaktywowano metodą obróbki cieplnej.

Metoda

Trzy kolumny chromatograficzne wypełniono żelem anionowymiennym DEAE Sepharose CL-6B i poddano stabilizacji buforem trometamol-NaCl. Następnie uż yto trzy kolumny tak, jak to opisano w tabeli 4, i produkty zbadano na aktywność trombiny.

T a b e l a 4

Kolumna 1	Kolumna 2	Kolumna 3
Obciążenie protrombiną	Obciążenie Czynnikiem X	Obciążenie Czynnikiem X
Stabilizacja	Stabilizacja	Stabilizacja
Bufor przemywający	Bufor przemywający	Bufor przemywający
Inkubacja z buforem zawierającym wapń	Inkubacja z buforem zawierającym wapń	Inkubacja z buforem zawierającym wapń
Stabilizacja	Stabilizacja	Stabilizacja
Bufor elucyjny	Bufor przemywający	Bufor przemywający
	Obciążenie protrombiną	Obciążenie antytrombiną
	Stabilizacja	Stabilizacja
	Bufor elucyjny	Bufor przemywający
		Obciążenie protrombiną
		Stabilizacja
		Bufor elucyjny

Wyniki przedstawiono w tabeli 5.

T a b e l a 5

	Kolumna 1	Kolumna 2	Kolumna 3
Wprowadzona protrombina ogółem, iu	2039	2044	2061
Wprowadzony czynnik X ogółem, u	0	1222	1196
Wprowadzona antytrombina, u	0	0	850
Powstała trombina, iu na iu protrombiny	< 0,07	113	< 0,07

PL 208 219 B1

Wyniki wskazują, że trombina nie może powstać z protrombiny po inaktywacji wirusów wyłącznie w wyniku zastosowania wapnia (Kolumna 1). Trombina może powstać z protrombiny po inaktywacji wirusów po inkubacji z czynnikiem X po inaktywacji wirusów, który uprzednio inkubowano z wapniem i następnie wapń usunięto przed kontaktem z protrombiną (Kolumna 2). Trombina nie może powstać z protrombiny po inaktywacji wirusów na drodze inkubacji z czynnikiem X po inaktywacji wirusów, który uprzednio inkubowano z wapniem, jeśli czynnik X/czynnik Xa następnie inaktywowano antytrombinę i zarówno wapń, jak i antytrombinę usunięto przed kontaktem z protrombiną (Kolumna 3).

Mechanizm powstawania trombiny w sposobie według wynalazku wymaga aktywacji czynnika X przez wapń i następnie aktywacji protrombiny w trombinę w wyniku działania aktywowanego czynnika X (tj. czynnika Xa), a nie bezpośrednio wapnia. Wyizolowana protrombina nie jest zatem odpowiednim materiałem wyjściowym do zastosowania w sposobie według wynalazku.

P r z y k ł a d 8

Brak powstawania trombiny przy zastosowaniu tylko oczyszczonej protrombiny i wapnia

Protrombinę (czynnik II) oddzielono od innych białkowych czynników krzepnięcia kompleksu protrombiny po wirusobójczej obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent w kolumnie Chelating Sepharose obciążonej miedzią.

Ten roztwór białek zastosowano albo łącznie z odczynnikami stosowanymi w metodzie rozpuszczalnik-detergent (SD), lub po oddzieleniu od odczynników stosowanych w metodzie rozpuszczalnik-detergent metodą chromatografii na żelu anionowymiennym DEAE Sepharose.

Protrombinę w roztworze inkubowano przy wartości pH 6,5 z buforem na bazie 40 mM chlorku wapnia w temperaturze 25°C przez 3 godziny. Następnie zmierzono aktywność trombiny. Wyniki przedstawiono w tabeli 6.

T a b e l a 6

Próbki	Aktywność trombiny po 3 godzinach, iu/ml
Protrombina z SD	poniżej 0,05
Protrombina po usunięciu SD	poniżej 0,05

Wyniki potwierdzają, że wyizolowana ludzka protrombina nie została przekształcona w trombinę pod wpływem działania samych jonów wapnia po inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik-detergent, bez względu na to czy przed dodaniem jonów wapnia odczynniki SD usunięto, czy nie. Wyizolowana protrombina nie jest zatem odpowiednim materiałem wyjściowym do zastosowania w sposobie według wynalazku.

P r z y k ł a d 9

Brak powstawania trombiny w wyniku działania wapnia na kompleks protrombiny podczas lub po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent

Próbki trzech różnych koncentratów kompleksu protrombiny (zawierających czynniki II, IX i X) inkubowano z 20 mM chlorku wapnia w roztworze i następnie oceniono aktywność trombiny po inkubacji przez 3 i 5 godzin.

Próbki kompleksu protrombiny (PCC) pochodzące z ludzkiego osocza:

A: Eluat PCC po chromatografii anionowymiennej CPS.

B: Eluat PCC zawierający 1% detergentu polisorbatu 80 i 0,3% rozpuszczalnika fosforanu tri-n-butylu (TNBP).

C: PCC po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent, z którego usunięto odczynniki stosowane w metodzie rozpuszczalnik-detergent.

Żaden spośród zastosowanych w tych doświadczeniach kompleksów protrombiny nie został aktywowany podczas powstawania, czy to celowo, czy przypadkowo, co określono z zastosowaniem testów NAPTT i FCT dla aktywowanych czynników krzepnięcia. Wyniki przedstawiono w tabeli 7.

T a b e l a 7

Próbka	Trombina po 3 godzinach, iu/ml	Trombina po 5 godzinach, iu/ml
A	619	1168
B	poniżej 1	3,48
C	poniżej 1	2,02

PL 208 219 B1

Wyniki wskazują, że trombina z (nieaktywowanego) kompleksu protrombiny w roztworze powstała w zaniedbywalnie małej ilości po potraktowaniu metodą rozpuszczalnik-detergent bez względu na to, czy odczynniki stosowane w metodzie rozpuszczalnik-detergent były obecne, czy też nie w czasie inkubacji z wapniem (porównaj wyniki dla próbki A z wynikami dla próbek B i C). Jest to zgodne ze stanem techniki, że wapń sam nie wystarcza do aktywacji kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent. Główną cechą sposobu według wynalazku jest fakt, że w celu otrzymania trombiny materiał zawierający protrombinę po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent wprowadza się do złoża anionowymiennego.

P r z y k ł a d 10

Aktywacja z zastosowaniem jonów wapnia lub magnezu 249 ml kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent rozcieńczono 150 ml wody dejonizowanej w celu zmniejszenia wartości przewodności właściwej do 16 mS/cm. Roztwór następnie zmiareczkowano do wartości pH 8,0 z zastosowaniem 1M wodorotlenku sodu. 82 do 87 g tego roztworu wprowadzono do każdej z trzech kolumn o ś rednicy 1 cm, wypeł nionych 10 ml DEAE Sepharose CL6B, po stabilizacji roztworem zawierającym 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 137 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0. Po obciążeniu złoże przemyto 10 objętościami kolumny roztworu zawierającego 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 137 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu usunięcia odczynników stosowanych w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent i luźno związanego białka. Złoże następnie przemyto 1 objętością kolumny buforu aktywującego, czyli albo roztworem zawierającym 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 129 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0 (kolumna 1), lub roztworem zawierającym 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 129 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku magnezu, o wartości pH 8,0 (kolumna 2) lub roztworem zawierającym 8 mM cytrynianu, 10 mM fosforanu, 129 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, 2 mM chlorku magnezu, o wartości pH 8,0 (kolumna 3). Wyloty kolumny zamknięto. Kolumny pozostawiono w temperaturze pokojowej.

Po około 64 godzinach złoże przemyto roztworem zawierającym bufor aktywujący w celu odzyskania trombiny powstałej podczas inkubacji. Wyniki przedstawiono w tabeli 8.

T a b e l a 8

Kolumna	Aktywność chromogeniczna oddzielonej trombiny ogółem	Jon metalu w buforze aktywującym
1	178000 iu	wapń
2	66500 iu	magnez
3	256000 iu	wapń/magnez

P r z y k ł a d 11

Preparat

Roztwór trombiny po oddzieleniu wirusów przez filtrację otrzymany według przykładu 1 skomponowano z 10 mM trometamolu, 200 mM NaCl, 40 mM CaCl2, 2% sacharozy, o wartości pH 7,0 i jego moc uregulowano do okoł o 500 iu aktywnoś ci krzepnię cia trombiny/ml.

Roztwór ten rozdozowano po 5 ml do fiolek szklanych i liofilizowano. Liofilizowany materiał poddano obróbce cieplnej w temperaturze 80°C przez 72 godziny. Dla 3 serii średni odzysk aktywności krzepnięcia trombiny wyniósł 98% po liofilizacji i 98% po obróbce cieplnej.

P r z y k ł a d 12

Preparat

Skomponowano roztwór trombiny o mocy przybliżeniu 1250 iu aktywności krzepnięcia/ml. Wszystkie preparaty zawierały 10 mM trometamolu i 200 mM chlorku sodu, przy wartości pH 7,0. Ponadto zawierały one dodatkowe składniki wymienione poniżej. Roztwory rozdozowano do fiolek, po 2 ml na fiolkę. Zawartość fiolek poddano liofilizacji i obróbce cieplnej na sucho w temperaturze 80°C przez 72 godziny. Następnie zawartość fiolek odtworzono wodą i określono aktywność trombiny, którą porównano z aktywnością trombiny w próbkach pobranych przed liofilizacją. Wyniki przedstawiono w tabeli 9.

PL 208 219 B1

T a b e l a 9

Chlorek wapnia, mM	Dodatkowe składniki	Odzysk aktywności krzepnięcia po liofilizacji i obróbce cieplnej
2	-	59%
10	-	69%
40	-	88%
2	1% sacharozy	88%
2	2% sacharozy	93%
2	1% trehalozy	98%
2	1% rafinozy	88%
2	1% albuminy ludzkiej	60%
2	1% PEG 4000	78%

Wyniki wskazują, że typowy stabilizator albumina nie zapewnia trwałości w trakcie liofilizacji i obróbki cieplnej. Inne kombinacje wapnia i węglowodanów dają lepszą trwałość w trakcie liofilizacji i obróbki cieplnej.

P r z y k ł a d 13

Przygotowanie preparatu trombiny, liofilizacja i obróbka cieplna

Skomponowano roztwór trombiny o mocy 500 iu/ml (rozdozowano po 5 ml). Wszystkie preparaty zawierały także 10 mM trometamolu i 200 mM sodu, przy wartości pH 7,0, i ponadto zawierały składniki wskazane poniżej. Roztwory rozdozowano do fiolek, po 5 ml na fiolkę. Zawartość fiolek liofilizowano i poddano obróbce cieplnej na sucho w temperaturze 80°C przez 72 godziny lub 100°C przez 24 godziny. Następnie zawartość fiolek odtworzono wodą i określono aktywność trombiny, którą porównano z aktywnością trombiny w próbkach pobranych przed liofilizacją. Wyniki przedstawiono w tabeli 10.

T a b e l a 10

Chlorek wapnia, mM	Dodatkowe składniki	Objętość dozowana, ml	Odzysk aktywności krzepnięcia po liofilizacji i obróbce cieplnej
80°C 72 godziny	100°C 24 godziny
2	2% sacharozy	5	79%	-
40	2% sacharozy	5	97%	89%
2	1% trehalozy	5	92%	73%

Wyniki wskazują, że optymalny preparat zawiera 10 mM trometamolu i 200 mM sodu przy wartości pH 7,0 oraz 40 mM chlorku wapnia i 2% sacharozy.

P r z y k ł a d 14

Otrzymywanie trombiny

1,17 kg kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent rozcieńczono 2,58 kg wody w celu zmniejszenia wartości przewodności właściwej z 27,5 mS/cm do 9,12 mS/cm. Roztwór następnie zmiareczkowano do wartości pH 8,0 z zastosowaniem 0,5 M wodorotlenku sodu. Ten roztwór wprowadzono do termostatowanej kolumny o średnicy 5 cm, wypełnionej do wysokości 13 cm złożem DEAE Sepharose CL6B, po stabilizacji z zastosowaniem roztworu 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0. Po obciążeniu złoże przemyto 15 objętościami kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu usunięcia odczynników stosowanych w obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent i luźno związanego białka. Złoże następnie przemyto 1 objętością kolumny roztworu zawierającego 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0. Wyloty kolumny zamknięto. Poprzez płaszcz kolumny cyrkulowano wodę o temperaturze 20°C.

Po 64 godzinach, obieg wody zatrzymano. Złoże przemyto roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0 w celu odzyskania trombiny powstałej podczas

PL 208 219 B1 inkubacji. Pierwsze 4 objętości kolumny eluatu zawierały trombinę o wartości aktywności krzepnięcia 4,3 miliona jednostek międzynarodowych (iu) o specyficznej aktywności krzepnięcia poniżej 2000 iu/mg całkowitego białka. Następne 9 objętości kolumny eluatu, który zawierał trombinę o wartości aktywności krzepnięcia 2,2 miliona iu o specyficznej aktywności 2100 iu/mg zamrożono w temperaturze -40°C przechowywano do dalszej obróbki.

900 g zamrożonego eluatu rozmrożono i przesączono przez filtr antywirusowy Planova 15N, który poddano stabilizacji z zastosowaniem roztworu 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, o wartości pH 8,0. Zmierzony odzysk aktywności krzepnięcia trombiny wyniósł 95% po zamrażaniu/rozmrażaniu i 102% po filtracji antywirusowej.

Przesącz następnie skomponowano z roztworem 10 mM trometamolu, 200 mM chlorku sodu, 40 mM chlorku wapnia, 2% sacharozy, poprzez dodanie odpowiedniego buforu. Roztwór rozcieńczono tak, aby uzyskać koncentrat o wartości aktywności krzepnięcia trombiny 550 iu/ml, stosując roztwór 10 mM trometamolu, 200 mM chlorku sodu, 40 mM chlorku wapnia, 2% sacharozy, o wartości pH 7,0, i następnie zmiareczkowano z zastosowaniem 0,5 M kwasu chlorowodorowego do wartości pH 7,0.

Ten roztwór następnie przesączono przez filtr jałowiący 0,2 μm i rozdozowano do fiolek, po 5 g roztworu na fiolkę. Zawartość fiolek liofilizowano i następnie poddano obróbce cieplnej na sucho w temperaturze 80°C przez 72 godziny. Zmierzony odzysk aktywności krzepnięcia trombiny wyniósł 97% po filtracji jałowiącej, 102% po liofilizacji i 100% po obróbce cieplnej na sucho.

P r z y k ł a d 15

Czasy inkubacji

150 ml kompleksu protrombiny po obróbce metodą rozpuszczalnik-detergent rozcieńczono wodą w celu zmniejszenia przewodności właściwej do w przybliżeniu 9,3 mS/cm. Roztwór następnie zmiareczkowano do wartości pH 8,0. Ten roztwór wprowadzono do każdej z czterech kolumn wypełnionych 12,5-12,9 ml DEAE Sepharose CL6B, po stabilizacji z zastosowaniem roztworu 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu pH 8,0. Kolumny następnie przemyto takim samym buforem w celu usunięcia odczynników stosowanych w metodzie rozpuszczalnik-detergent i luźno związanego białka. Kolumny następnie przemyto roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM chlorku sodu, mM chlorku wapnia, o wartości pH 8,0, wyloty kolumny zamknięto i kolumny pozostawiono w temperaturze pokojowej (w przybliżeniu 20°C) na okres czasu pomiędzy 35 i 85 godzin. Pod koniec każdego przedziału czasu, jedną spośród kolumn przemyto roztworem zawierającym 10 mM trometamolu, 110 mM NaCl, o wartości pH 8,0 w celu odzyskania powstałej trombiny. Wyniki przedstawiono w tabeli 11:

T a b e l a 11

Kolumna	Inkubacja (godziny)	Aktywność krzepnięcia trombiny
Odzysk ogółem (iu)	Ogółem >2000 iu/mg (iu)
1	35	229344	144751
2	45	267860	144463
3	65	289359	128578
4	85	266844	101687

Ogólny trend obejmował wzrost wydajności (jednostki ogółem), ale pogorszenie czystości (jednostki >2000 iu/mg) wraz z wydłużaniem czasu inkubacji. Można jednakże tak dobrać czas inkubacji, aby uzyskać najkorzystniejszą równowagę pomiędzy całkowitą wydajnością, a czystością w każdym indywidualnym przypadku.

Claims (13)

1. Sposób otrzymywania trombiny po inaktywacji wirusów, znamienny tym, że obejmuje etapy:

(a) inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent w roztworze zawierającym protrombin ę i czynnik X, (b) wprowadzenia produktu z etapu (a) do złoża anionowymiennego, (c) przemywania złoża i usunięcia odczynników zastosowanych do inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent według etapu (a) i

PL 208 219 B1 (d) aktywacji protrombiny w złożu z wytworzeniem trombiny poprzez dodanie jonów metalu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór zawierający protrombinę i czynnik X stanowi kompleks protrombiny.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jony metalu są jonami metalu dwuwartościowego.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako jony metalu dwuwartościowego stosuje się jony magnezu i/lub wapnia.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap:

(e) selektywnej elucji trombiny ze złoża anionowymiennego.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etapy:

(f) przepuszczenia produktu z etapu (e) poprzez filtr zatrzymujący patogeny, (g) dodania jonu metalu dwuwartościowego i węglowodanu do produktu z etapu (f), i (h) liofilizacji i obróbki cieplnej produktu z etapu (g) i inaktywacji wirusów.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etapy (a) i (b) zastępuje się etapami (a') i (b'): (a') wprowadzenie roztworu zawierającego protrombinę i czynnik X do złoża anionowymiennego i (b') inaktywacja wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent protrombiny i czynnika X w złożu.

8. Sposób otrzymywania trombiny po inaktywacji wirusów, znamienny tym, że obejmuje etapy:

(a) inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent w roztworze zawierającym czynnik X, (b) wprowadzenia produktu z etapu (a) do złoża anionowymiennego, (c) przemywania złoża w celu usunięcia odczynników zastosowanych do inaktywacji wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent według etapu (a), (d) aktywacji czynnika X w złożu z wytworzeniem czynnika Xa poprzez dodanie jonów metalu i (e) wprowadzenia protrombiny po inaktywacji wirusów do złoża anionowymiennego i otrzymanie trombiny.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jony metalu są jonami metalu dwuwartościowego.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako jony metalu dwuwartościowego stosuje się jony magnezu i/lub wapnia.

11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap:

(e) selektywnej elucji trombiny ze złoża anionowymiennego.

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etapy:

(f) przepuszczenia produktu z etapu (e) poprzez filtr zatrzymujący patogeny, (g) dodania jonu metalu dwuwartościowego i węglowodanu do produktu z etapu (f) i (h) liofilizacji i obróbki cieplnej produktu z etapu (g) i inaktywacji wirusów.

13. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że etapy (a) i (b) zastępuje się etapami (a') i (b'): (a') wprowadzenie roztworu zawierającego protrombinę i czynnik X do złoża anionowymiennego i (b') inaktywacja wirusów metodą rozpuszczalnik/detergent protrombiny i czynnika X w złożu.