BRPI0210839B1 - Sistema para recombinações múltiplas e sucessivas no mesmo organismo ou dna genômico, e, método para remover uma seqüência de dna do dna cromossômico de uma célula vegetal ou organismo vegetal - Google Patents

Abstract

"sistema de recombinação, método para remover uma seqüência de dna do dna cromossômico de uma célula ou organismo eucarióticos, organismo, cultura de célula, órgão, tecido, parte ou material de propagação transgênico, e, uso de um organismo ou de uma cultura de célula, órgão, tecido, parte ou material de propagação transgênico". a invenção diz respeito a sistemas de recombinação e a um método para remover seqüências do dna cromossômico de organismos eucarióticos. a invenção também diz respeito a organismos transgênicos (preferivelmente plantas), contendo os ditos sistemas ou produzido pelo dito método.

Description

“SISTEMA PARA RECOMBINAÇÕES MÚLTIPLAS E SUCESSIVAS NO MESMO ORGANISMO OU DNA GENÔMICO, E, MÉTODO PARA REMOVER UMA SEQÜÊNCIA DE DNA DO DNA CROMOSSÔMICO DE UMA CÉLULA VEGETAL OU ORGANISMO VEGETAL”

A invenção diz respeito a sistemas de recombinação e métodos para eliminar seqüências de ácido nucléico do genoma de organismos eucarióticos e a organismos transgênicos - preferivelmente plantas - que compreendam estes sistemas.

O propósito da pesquisa biotecnológica em organismos consiste, inter alia, na obtenção de informação comercialmente utilizável na função de certos genes e produtos de gene e na elucidação de caminhos biossintéticos ou mecanismos de doença. A informação obtida desta maneira pode ser utilizada em uma multiplicidade de modos. Eles servem por exemplo para a produção de novos medicamentos, o desenvolvimento de métodos de produção alternativos, biotecnológicos ou a geração de plantas modificadas. Um objetivo da pesquisa biotecnológica em plantas é a geração de plantas com novas características vantajosas, por exemplo para aumentar a produtividade agrícola, melhorar a qualidade em produtos alimentícios ou para a produção de certos produtos químicos ou farmacêuticos (Dunwell J M, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No: 487 a 496).

Na geração de organismos transgênicos, a seleção dos organismos que foram modificados na maneira desejada é requerida devido à eficácia deficiente dos métodos usados (tais como, por exemplo, a transformação estável ou, em particular, a recombinação homóloga). Plantas transgênicas podem ser geradas por uma série de técnicas (Revisão: Potrykus

I. e Spangenberg G. ed. (1995) Gene transfer to plants. Springer, Berlim). Em

Petição 870180046314, de 30/05/2018, pág. 11/19

particular a transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens e o bombardeamento de células vegetais com a pistola de partícula desempenham um papel importante neste contexto. Um problema importante é o fato de que • * o DNA transgênico, uma vez estavelmente introduzido em um organismo, . 5 pode ser apenas removido com dificuldade. Os genes para a resistência aos antibióticos ou herbicidas, que são usados durante o procedimento de transformação com propósitos de seleção, permanece nas plantas transgênicas, o que contribui substancialmente para a falta de aceitação destes produtos de “alimento de gene” entre os consumidores.

φ 10 Portanto tem sido tentado durante algum tempo desenvolver

- técnicas por meio das quais o DNA estranho pode ser integrado no genoma vegetal em sítios específicos ou reexcisado deste (Ow DW e Medberry SL (1995) Crit Rev in Plant Sei 14: 239 a 261).

O trabalhador habilitado está familiarizado com uma variedade de sistemas para a remoção direcionada a sítio de seqüências de ácido nucléico recombinantemente introduzidas. Eles estão fundamentados no uso de recombinases específicas de seqüência e duas seqüências de reconhecimento das ditas recombinases que flanqueiam a seqüência a ser removida. O efeito da recombinase nesta construção efetua a excisão da seqüência flanqueada, uma das seqüências de reconhecimento permanece no genoma do organismo. Vários sistemas de recombinação específicos de seqüência são descritos, tais como o sistema Cre/lox do bacteriófago PI (Dale EC e Ow DW (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88: 10558 a 10562; Russell SH et al. (1992) Mol Gene Genet 234: 49 a 59; Osbome BI et al. (1995) Plant

J. 7, 687 a 701), o sistema de FLP/FRT de levedura (Kilby NJ et al. (1995) Plant J 8: 637 a 652; Lyznik LA et al. (1996) Nucleic Acids Res 24: 3784 a 3789), a recombinase Gin do fago Mu, a recombinase Pin da E. coli ou o sistema R/RS do plasmídeo pSRl (Onouchi H et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 247: 653 a 660.; Sugita K et al. (2000) Plant J. 22: 461 a 469). Aqui, a

recombinase (por exemplo Cre ou FLP) interage especificamente com as suas seqüências de recombinação correspondentes (seqüência lox de 34 pares de base e seqüência FRT de 47 pares de base, respectivamente) de modo a suprimir ou inverter as seqüências interpostas. Relatos sobre aplicações bem . 5 sucedidas destes sistemas em plantas são limitados. Assim, o grupo de David

Ow demonstrou que um marcador de seleção usado para a transformação de plantas que foi flanqueado por duas seqüências lox pode ser re-excisado do genoma vegetal pela expressão de Cre (Dale EC e Ow DW (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88: 10558 a 10562). Uma desvantagem dos sistemas de φ 10 recombinação específicos de seqüência é a reversibilidade da reação, em outras palavras um equilíbrio existe entre excisão e integração do gene marcador em questão. Isto freqüentemente realiza a seleção de mutações, isto é, tão logo uma mutação bloqueia a outra interação das seqüências de reconhecimento lox com a enzima, o produto (indesejado) é removido do equilíbrio e fixado, isto não apenas se aplica ao sistema Cre-lox, mas também às outras recombinases específicas de seqüência (ver acima). Uma outra desvantagem é o fato de que uma das seqüências de reconhecimento da recombinase permanece no genoma, que é assim modificado. Isto pode ter

efeitos nas características dos organismos quando, por exemplo, a seqüência de reconhecimento modifica ou destrói as fases de leitura ou os elementos de controle genético tais como promotores ou intensificadores. Além disso, a seqüência de reconhecimento que permanece no genoma exclui um uso adicional do sistema de recombinação, por exemplo para uma segunda modificação genética, visto que as interações com as seqüências de 25 reconhecimento subseqüentemente introduzidas não podem ser impedido.

Rearranjos ou supressões cromossômicas substanciais podem resultar.

Zubko et al. descrevem um sistema para a supressão de seqüências de ácido nucléico do genoma do tabaco, onde a seqüência a ser suprimida é flanqueada por duas seqüências de reconhecimento attP de 352

pares de base do bacteriófago Lambda. A supressão da região flanqueada ocorre independentemente da expressão de proteínas auxiliares em duas de onze linhas de tabaco transgênico pela recombinação intracromossômica

- ’ espontânea entre as regiões de reconhecimento de attP. As desvantagens deste . 5 método são que a recombinação ou supressão, não podem ser induzidas especificamente em um ponto no tempo particular, mas ocorre espontaneamente. O fato de que o método tenha funcionado apenas em um número pequeno de linhas sugere que o local de integração nos casos em questão tende a ser instável (Puchta H (2000) Trends in Plant Sei 5: 273 a φ 10 274).

Na página 12 na explicação da Figura 32, a WO 96/14408 descreve um método para eliminar um local genético em que em cada caso uma seqüência de reconhecimento da endonuclease de restrição residente IScel é inserida na extremidade respectiva da seqüência a ser suprimida. O 15 tratamento com a endonuclease leva à ruptura da fita dupla em ambas as extremidades da seqüência a ser suprimida. As extremidades livres depois se unem por meio da “recombinação”. A “recombinação” aqui citada pode ser apenas uma recombinação ilegítima - como também pode ser observado da Figura - (por exemplo um evento de junção de extremidade não homóloga 20 (NHEJ)), visto que nenhuma das seqüências homólogas existem nas duas extremidades remanescentes do DNA genômico. A recombinação ilegítima, entretanto, leva aos eventos de recombinação não prognosticáveis. Isto pode ter efeitos sobre as características dos organismos se por exemplo fases de leitura ou elementos de controle genético tais como promotores ou 25 intensificadores são modificados ou destruídos por meio disso. O sistema requer que duas seqüências de reconhecimento flanqueiem o fragmento a ser suprimido.

A geração de rupturas de fita dupla específico de seqüência com o auxílio de enzimas de restrição em genomas eucarióticos tais como

levedura (Haber JE (1995) Bioassays 17: 609 a 620), células de mamífero (Jasin M (1996) Trends Genet. 12: 224 a 228) ou plantas (Puchta H (1999a) Methods Mol Biol 113: 447 a 451) é descrita.

O que é descrito é a indução de uma recombinação intramolecular em um DNA plasmídico em ovócitos de Xenopus pela divagem específica de seqüência com a endonuclease I-Scel (Segai DJ e Caroll D (1995) Proc Natl Acad Sei USA 92: 806 a 810) ou pelas nucleases sintéticas, quiméricas (Bibikova M et al. (2001) Mol Cell Biol 21(1): 289 a 297). O objetivo é a recombinação direcionada a sítio entre duas seqüências 10 homólogas entre as quais um sítio de divagem de nuclease adequado está localizado. Ambos os casos são eventos de recombinação extracromossômica em que em cada caso apenas parte do DNA plasmídico cromossômico extra sofre a recombinação homóloga.

Posfai et al. descrevem um método para trocar genes na E. coli procariótica (Posfai G et al. (1999) Nucleic Acids Res 27(22): 4409 a 4415). Aqui, a recombinação entre o gene endógeno e o mutado resulta no genoma da E. coli, induzido pela divagem com a enzima de restrição I-Scel. O alvo e o objetivo foi a troca de um gene endógeno por um transgene mutado. As recombinações na E. coli se processam em um modo notadamente mais simples e com maior eficácia do que nos eucariotas superiores (por exemplo descrito por Kuzminov A (1999) Microbiol Mol Biol Rev. 63(4): 751 a 813).

Dürrenberger et al. descrevem a indução de recombinação em cloroplastos da alga verde de célula única Chlamydomonas reinhardtii usando a endonuclease residente I-Scel (Dürrenberger F et al. (1996) Nucleic Acid 25 Res 24(17): 3323 a 3331). A recombinação ocorre entre o gene 23S endógeno e um cDNA 23S inserido que contém um sítio de divagem I-Scel. As rupturas de fita dupla são induzidas igualando-se o organismo transgênico em questão com um organismo que expressa I-Scel. As recombinações em cloroplastos se processam em um modo notadamente mais simples e com

maior eficácia do que no DNA cromossômico de eucariotas superiores. Assim, de fato, a recombinação homóloga parece ser o modo preferido, normal de integração de DNA em plastídeos (cloroplastos) (descrito em: Heifetz PB e Tuttle AM (2001) Curr Opinion Plant Biol 4: 157 a 161). Parece 5 que os plastídeos têm um sistema específico que permite que eles soffam a recombinação homóloga, como oposto ao núcleo e facilita a introdução direcionada a sítio do DNA estranho (Heifetz PB (2000) Biochimie 82: 655 a 666).

A técnica de alvejamento de gene, em que uma integração direcionada a sítio no DNA cromossômico do organismo hospedeiro deva ser obtida por meio da recombinação homóloga funciona aceitavelmente bem apenas no caso de procariotas e levedura. A geração de organismos transgênicos correspondentes é possível apenas em umas poucas espécies (tais como, por exemplo, camundongos) e até então altamente complicada (ver também Kanaar R Hoeijmakers JH (1997) Genes Funct 1(3): 165 a 174). A eficácia da recombinação homóloga existente, deficiente (aprox. 1:1x10⁶) é compensada neste caso pelo uso de técnicas de seleção complicadas, sofisticadas que são limitadas à espécie em questão (tais como, por exemplo, tecnologia de célula “ES”). Em outras espécies - mas acima de tudo em

Plantas Superiores - tais tecnologias não foram até agora estabelecidas (Mengiste T e Paszkowski J (1999) Biol Chem. 380: 749 a 758; Vergunst AC e Hooykaas PJJ (1999) Crit Rev Plant Sei 18: 1 a 31; Puchta H (1999) Methods Mol Biol 113: 447 a 451; Hohn B e Puchta H (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96: 8321 a 8323). Tentativas para se obter a recombinação homóloga em plantas resultaram em eventos de inserção “ilegítima” aleatória, não homóloga na maioria dos casos. Aqui, o DNA introduzido é integrado em um ou mais sítios não prognosticáveis no genoma de planta. A integração ocorre por meio da recombinação ilegítima (Roth DB e Wilson JH (1988) Illegitimates recombination in mammalian cells. Em ”Genetic

recombination”, R. Kucherlapati e G. R. Smith Edts., American Society of Micorbiology, Washington, USA; pp. 621 a 635) e não em regiões de seqüência que sejam homólogas ao DNA transferido (Puchta H e Hohn B (1996) Trends Plant Sei. 1: 340 a 348). O problema de falta de eficácia na recombinação homóloga, o que é predominantemente sério em plantas, é no geral conhecido para o trabalhador habilitado. As causas são tratadas pela pesquisa corrente (Artigo de revisão: Mengiste T e Paszkowski J (1999)

Biological Chemistry 380 (7-8): 749 a 758). Aumentar a eficácia da ·¹⁰ recombinação homóloga tem sido a muito uma necessidade na biotecnologia de planta que é até agora não solucionado.

Uma outra necessidade que tem existido a muito na pesquisa biotecnológica e que não é tratado por nenhum dos sistemas estabelecidos é o fornecimento de sistemas e métodos que permitam a eliminação direcionada a sítio de seqüências de ácido nucléico a partir do DNA cromossômico de um organismo eucariótico e permitam a aplicação repetida no mesmo organismo. Por exemplo, é um objetivo da biotecnologia de planta melhorar ainda mais por meio de métodos recombinantes variedades de alto rendimento existentes. Neste contexto, é particularmente importante eliminar, depois que a transformação tenha ocorrido, seqüências de transgene supérfluas tais como marcadores de seleção. Além disso, métodos para a eliminação prognosticável de seqüências, por exemplo a parti do DNA cromossômico de um organismo, pode oferecer mais aplicações no campo da engenharia genética que sejam de maior interesse científica e economicamente.

r

E um objetivo da presente invenção desenvolver sistemas e métodos que permitam a eliminação prognosticável de seqüências de ácido nucléico definidas a partir do DNA cromossômico de um organismo eucariótico e permitam a aplicação repetida, sucessiva ao mesmo organismo.

Verificou-se que este objetivo foi obtido de uma maneira surpreendente fomecendo-se o sistema de recombinação de acordo com a

invenção.

Um primeiro assunto objeto da invenção diz respeito a um sistema de recombinação para eliminar uma seqüência de DNA do DNA cromossômico de uma célula ou organismo eucarióticos, que compreende, em 5 uma célula ou organismo eucarióticos, •¹⁰

I) uma construção de recombinação transgênica inserida no DNA cromossômico de um organismo eucariótico que compreenda uma seqüência que consiste, na direção 573’, de al) uma primeira seqüência de homologia A e bl) pelo menos uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a2) uma segunda seqüência de homologia B, as seqüências de homologia A e B tendo um comprimento suficiente e homologia suficiente de modo a garantir a recombinação homóloga, junto com

II) uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento (bl) para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA ou uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento (bl).

Um outro assunto objeto da invenção diz respeito a um método para eliminar uma seqüência de DNA do DNA cromossômico de uma célula ou organismo eucarióticos, que compreende combinar, em uma célula ou organismo eucarióticos,

I) uma construção de recombinação transgênica inserida no DNA cromossômico de um organismo eucariótico que compreenda uma seqüência que consiste, na direção 573’, de al) uma primeira seqüência de homologia A e • 10

bl) pelo menos uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a2) uma segunda seqüência de homologia B, as seqüências de homologia A e B tendo um comprimento suficiente e homologia suficiente de modo a garantir a recombinação homóloga, junto com

II) uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento (bl) para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA, e a indução de rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a recombinação homóloga ocorrendo entre as seqüências de homologia A e B.

A invenção permite que seqüências (por exemplo marcadores de seleção tais como genes para resistência a antibióticos ou herbicidas) sejam suprimidas do DNA cromossômico de um organismo em uma maneira acuradamente prognosticável. Em assim fazendo, a seqüência a ser eliminada é flanqueada por seqüências de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA (por exemplo seqüências de reconhecimento de enzimas de restrição de divagem rara) e combinadas com seqüências homólogas na região dos sítios de divagem. Uma ruptura de fita dupla é induzida por uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA, (por exemplo uma nuclease específica de seqüência), que, em conseqüência, deflagra a recombinação homóloga de seqüências homólogas localizadas na ruptura e assim a supressão de quaisquer seqüências de ácido nucléico localizadas entre as seqüências. A seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de

DNA é do mesmo modo suprimida e o método pode ser assim usado repetidamente para outras modificações genéticas controladas.

Surpreendentemente, esta recombinação homóloga induzida ocorre com alta eficácia e precisão, que está em contraste com a experiência . 5 anterior no campo da recombinação homóloga, incluindo em plantas. A freqüência pode ser comparada com os eventos paralelos, não homólogos (por exemplo eventos de junção de extremidade não homóloga) (conforme o Exemplo 5). Esta é uma verificação extraordinária que está em contraste com as observações mais antigas, de acordo com as quais a freqüência de φ 10 recombinação homóloga - acima de tudo no caso de plantas - é secundária, ’ quase negligenciável, em comparação com os eventos “ilegítimos”.

As seqüências que são suprimidas são aquelas localizadas entre as seqüências de homologia A e B. Ao contrário dos sistemas tais como, por exemplo, o sistema cre/lox ou o FRT/FLP, não se está ligado às 15 seqüências específicas quando da realização da recombinação. O trabalhador habilitado sabe que qualquer seqüência pode sofrer recombinação homóloga com uma outra seqüência contanto que comprimento e homologia suficientes existam. Devido à indução específica de seqüência das rupturas de fita dupla,

a eficácia de recombinação homóloga entre as seqüências de homologia A e B é consideravelmente aumentada, de fato permitido em primeiro lugar em alguns casos.

Com respeito à construção de recombinação, “transgene” refere-se a todas estas construções que são o resultado de métodos recombinantes em que:

a) pelo menos uma das seqüências de homologia A ou B, ou

b) pelo menos uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA, ou

c) (a) e (b) não estão localizados em seu ambiente genético natural (por

•· · · •· · •· · • ·· • · · · · · · • · · · • · • · · • · • · ·· ·· exemplo no seu local cromossômico natural) ou foram modificados pelos métodos recombinantes, sendo possível para a modificação abranger, por exemplo, substituições, adições, supressões, inversão ou inserções de um ou mais resíduos de nucleotídeo.

. 5 “Célula ou organismo eucarióticos” no geral refere-se a qualquer célula ou organismo eucarióticos e às células, tecidos, partes ou material de propagação (tais como sementes ou frutos) derivados destes em que uma indução das rupturas de fita dupla pode ocorrer na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de φ 10 DNA e a recombinação homóloga entre as seqüências de homologia A e B pode ocorrer enquanto a construção de recombinação e a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA estão simultaneamente presentes em um espaço de reação (por exemplo em uma 15 célula ou compartimento celular). Uma forma de realização particularmente preferida abrange compartimentos de uma célula eucariótica tais como, por exemplo, o núcleo.

As células ou organismos que são especial e preferivelmente

abrangidos são aqueles que constituem um organismo eucariótico de célula múltipla ou são derivados do último e células, tecidos, partes ou material de propagação (tais como sementes ou frutos) do mesmo. Muito especial e preferivelmente abrangidos as células ou organismos são aqueles que constituem um organismo animal ou vegetal ou são derivados dos últimos e células, tecidos, partes ou material de propagação dos mesmos. Mais preferivelmente abrangidos as células ou organismos são aqueles que constituem um organismo vegetal ou são derivados do último e células, tecidos, partes ou material de propagação do mesmo. Os gêneros e espécies preferidos são mais detalhados abaixo.

Referindo-se às seqüências de homologia A e B, • ·

“comprimento suficiente” preferivelmente refere-se às seqüências com um comprimento de pelo menos 20 pares de base, preferivelmente de pelo menos 50 pares de base, especial e preferivelmente de pelo menos 100 pares de base, - ' muito especial e preferivelmente de pelo menos 250 pares de base, o mais . 5 preferivelmente de pelo menos 500 pares de base.

Referindo-se às seqüências de homologia A e B, “homologia suficiente” preferivelmente refere-se às seqüências com pelo menos 70 %, preferivelmente 80 %, por preferência pelo menos 90 %, especial e preferivelmente pelo menos 95 %, muito especial e preferivelmente pelo φ 10 menos 99 %, o mais preferivelmente 100 %, de homologia dentro destas seqüências de homologia em um comprimento de pelo menos 20 pares de base, preferivelmente de pelo menos 50 pares de base, especial e preferivelmente de pelo menos 100 pares de base, muito especial e preferivelmente de pelo menos 250 pares de base, o mais preferivelmente de 15 pelo menos 500 pares de base.

Homologia entre duas seqüências de ácido nucléico é entendido como significando a identidade da seqüência de ácido nucléico em cada caso no comprimento de seqüência inteiro que é calculado pelo alinhamento com o auxílio do algoritmo do programa GAP (Wisconsin

-φ

Package Versão 10.0, Universidade de Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA), ajustando-se os seguintes parâmetros:

Valor de Intervalo: 12 Valor de comprimento: 4

Emparelhamento médio: 2.912 Desemparelhamento médio: -2,003

Em uma forma de realização preferida, apenas uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA está localizada entre as seqüências de homologia A e B, de modo que 25 a construção de recombinação utilizada no sistema ou método de recombinação de acordo com a invenção são construídos na direção 573’ como segue:

al) uma primeira seqüência de homologia A e bl) uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e

- ’ a2) uma segunda seqüência de homologia B, as seqüências de . 5 homologia A e B tendo um comprimento suficiente e homologia suficiente de modo a garantir a recombinação homóloga.

Em uma forma de realização preferida, uma outra seqüência de ácido nucléico está localizada entre as seqüências de homologia A e B, de φ 10 modo que a construção de recombinação utilizada no sistema ou método de recombinação de acordo com a invenção seja construída como segue na direção 5 73 ’ de

al) uma primeira seqüência de homologia A e bl) uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e

c) uma outra seqüência de ácido nucléico e a2) uma segunda seqüência de homologia B, as seqüências de homologia A e B tendo um comprimento suficiente e homologia suficiente de modo a garantir a recombinação homóloga.

A seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA também pode estar localizada depois ou dentro da outra seqüência de ácido nucléico.

Em uma outra forma de realização preferida, uma segunda seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla está presente depois da outra seqüência de ácido nucléico. Esta forma de realização é vantajosa em particular no caso de seqüências de homologia A e B que são ainda separadas ou no caso de seqüências de ácido nucléico ainda mais longas, visto que a eficácia da recombinação é • ·

·· ·· • ·· •· • ·· • · · · ·· ·· ·· ··· aumentada. Nesta forma de realização, a construção de recombinação utilizada no sistema ou método de recombinação de acordo com a invenção é construída como segue na direção 573’ de • 10 al) uma primeira seqüência de homologia A e bl) uma primeira seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e

c) uma outra seqüência de ácido nucléico e b2) uma segunda seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a2) uma segunda seqüência de homologia B, as seqüências de homologia A e B tendo um comprimento suficiente e homologia suficiente de modo a garantir a recombinação homóloga.

Além disso, outras seqüências de reconhecimento também podem estar presentes entre as seqüências de homologia A e B, além da segunda seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA. As seqüências de reconhecimento individuais (por exemplo bl ou b2) para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita

dupla de DNA podem ser idênticas ou diferentes, isto é, elas podem atuar como seqüência de reconhecimento para uma enzima individual para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA ou ainda para uma variedade de enzimas. Aqui, a forma de realização em que as seqüências de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA atuam como seqüência de reconhecimento para uma enzima 25 individual para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é preferida neste contexto.

O trabalhador habilitado está familiarizado com uma variedade de modos para se obter uma das construções de recombinação de acordo com a invenção. Elas podem ser preparadas por meio das técnicas de

• · recombinação e clonagem habituais como são descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, and Wiley Interscience (1987).

Preferivelmente, a construção de recombinação de acordo com a invenção é gerada pela junção dos constituintes essenciais mencionados acima da construção de recombinação juntos na seqüência mencionada acima usando as técnicas de recombinação e clonagem com as quais o trabalhador habilitado está familiarizado e o resultado é depois introduzido no DNA cromossômico de um organismo hospedeiro.

Entretanto, o trabalhador habilitado está ciente de que ele também pode obter a construção de recombinação de acordo com a invenção de outros modos. Assim, o organismo hospedeiro pode já compreender um ou mais dos componentes essenciais da construção de recombinação. A construção de recombinação de acordo com a invenção é depois gerada pela introdução de um outro ou mais, componentes essenciais da construção de recombinação na posição correta em relação aos componentes existentes no dito organismo. Assim, por exemplo, o organismo de partida já pode compreender uma das seqüências de homologia A ou B. Se o organismo já compreende uma seqüência de homologia A, a introdução de uma construção que consiste de uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e uma segunda seqüência de homologia B depois da seqüência de homologia A dá origem a uma das construções de recombinação de acordo com a invenção.

Além disso, o trabalhador habilitado está familiarizado com vários modos em que a construção de recombinação de acordo com a

invenção pode ser introduzida no DNA cromossômico de uma célula ou organismo eucarióticos. Neste contexto, a inserção pode ser direcionada (isto é, ocorrendo em um sítio de inserção definido) ou não direcionada (isto é, • ’ ocorrendo aleatoriamente). Técnicas adequadas são conhecidas pelo . 5 trabalhador habilitado e descritas por via de exemplo abaixo.

“Enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA” (abaixo “enzima DSBI”, que significa “double strandbreak inducing enzyme”} no geral refere-se a todas estas enzimas que são • 10 capazes de gerar rupturas de fita dupla em DNA de fita dupla em uma maneira específica de seqüência. As seguintes podem ser mencionadas por via

de exemplo, mas não por limitação:

1. endonucleases de restrição (tipo II), preferivelmente endonucleases residentes como descrito em detalhes abaixo.

2. Recombinases (tais como, por exemplo, Cre/lox; R-RS; FLP/FTR como descrito acima)

3. Transposases, por exemplo a transposase do elemento P (Kaufman PD e Rio DC (1992) Cell 69(1): 27 a 39) ou AcDs (Xiao YL e Peterson T (2000) Mol Gen Genet 263(1): 22 a 29). Em princípio, todas as transposases ou integrases são adequadas contanto que elas tenham especificidade de seqüência (Haren L et al. (1999) Annu Rev Microbiol. 1999; 53: 245 a 281; Beall EL, Rio DC (1997) Genes Dev. 11(16): 2137 a 2151).

4. Nucleases quiméricas como descritas em detalhes abaixo.

5. Enzimas que induzem as rupturas de fita dupla no sistema imune, tais como o sistema RAG1/RAG2 (Agrawal A et al. (1998) Nature 394(6695): 744 a 451).

6. Endonucleases de íntron do Grupo II. Modificações da seqüência de íntron permite que íntrons do grupo II sejam direcionados a

virtualmente qualquer seqüência em um DNA de fita dupla, onde íntrons do grupo II podem ser subseqüentemente inseridos por meio de ym mecanismo de junção reversa (Mohr et al. (2000) Genes & - ' Development 14: 559 a 573; Guo et al. (2000) Science 289: 452 a . 5 457). Durante este mecanismo de junção reversa, uma ruptura de fita dupla é introduzida no DNA alvo, o RNA do íntron excisado que cliva a fita senso enquanto a porção de proteína da endonuclease do íntron do grupo II hidrolisa a fita anti-senso (Guo et al. (1997) EMBO J 16: 6835 a 6848). Se é desejado apenas φ 10 induzir a ruptura da fita dupla sem obter a junção reversa completa, como é o caso na presente invenção, é possível recorrer, por exemplo, às endonucleases de íntron do grupo II que careçam da atividade de transcriptase reversa. Embora isto não impeça a geração da ruptura da fita dupla, o mecanismo de junção reversa 15 não pode se processar até a conclusão.

As enzimas adequadas não são apenas as enzimas naturais, mas também as enzimas sintéticas.

As enzimas preferidas são todas aquelas enzimas DSBI cuja seqüência de reconhecimento é conhecida e que pode ser obtida na forma de 20 suas proteínas (por exemplo pela purificação) ou expressada usando sua seqüência de ácido nucléico.

Especialmente preferidas são as endonucleases de restrição (enzimas de restrição) que não têm nenhuma ou apenas umas poucas seqüências de reconhecimento - além das seqüências de reconhecimento 25 presentes na construção de recombinação transgênica - na seqüência de DNA cromossômico de um organismo eucariótico particular. Isto evita outras rupturas de fita dupla em locais indesejados no genoma.

Isto é o porque das endonucleases residentes serem muito especialmente preferidas (Revisão: (Belfort M e Roberts RJ (1997) Nucleic

Acids Res 25: 3379 a 3388; Jasin M (1996) Trends Genet. 12: 224 a 228; Internet: http://rebase.neb.com/rebase/rebase.residentes.html). Devido às suas sequências de reconhecimento longas, elas não têm nenhuma ou apenas umas ' poucas, outras seqüências de reconhecimento no DNA cromossômico de . 5 organismos eucarióticos na maioria dos casos.

As seqüências que codificam tais endonucleases residentes podem ser isoladas por exemplo a partir do genoma de cloroplasto de Chlamydomonas (Turmel M et al. (1993) J Mol Biol 232: 446 a 467). Elas são pequenas (18 a 26 kD) e a sua fase de leitura aberta (ORF) tem um “uso φ 10 de código” que é adequado diretamente para a expressão nuclear em eucariotas (Monnat RJ Jr et al. (1999) Biochem Biophys Res Com 255: 88 a 93). As endonucleases residentes que são muito especiais e preferivelmente isoladas são as endonucleases residentes I-Scel (WO 96/14408), I-SceII (Sarguiel B et al. (1990) Nucleic Acids Res 18: 5659 a 5665), I-SceIII 15 (Sarguiel B et al. (1991) Mol Gen Genet. 255: 340 a 341), I-Ceul (Marshall (1991) Gene 104: 241 a 245), I-Crel (Wang J et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 3767 a 3776), I-ChuI (Cote V et al. (1993) Gene 129: 69 a 76), I-TevI (Chu et al. (1990) Proc Natl Acad Sei USA 87: 3574 a 3578; Bell-Pedersen et al. (1990) Nucleic Acids Res 18: 3763 a 3770), I-TevII (Bell-Pedersen et al.

(1990) Nucleic Acids Res 18: 3763 a 3770), I-TevIII (Eddy et al. (1991)

Genes Dev. 5: 1032 a 1041), Endo Scel (Kawasaki et al. (1991) J Biol Chem 266: 5342 a 5347), I-Cpal (Turmel M et al. (1995a) Nucleic Acids Res 23: 2519 a 2525) e I-CpaII (Turmel M et al. (1995b) Mol. Biol. Evol. 12, 533 a 545).

Outras endonucleases residentes são detalhadas no website da

Internet mencionado acima e os exemplos que podem ser mencionados são endonucleases residentes tais como F-Scel, F-ScelI, F-SuvI, F-TevI, F-TevII,

I-Amal, I-Anil, I-Ceul, I-CeuAIIP, I-ChuI, I-Cmoel, I-Cpal, I-CpaII, I-Crel, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-Csml, I-Cvul, I• · ··«· ··

CvuAIP, I-Ddil, 1-DdiII, I-DirI, I-Dmol, I-HmuI, I-HmuII, I-HspNIP, I-Llal, I-Msol, I-Naal, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-NitI, I-Njal, I-Nsp236IP, I-Pakl, IPboIP, !-PçuIP. T-PcuAL I-PcuVI. I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PpbIP, I-Ppol, I-SPBetaIP, I-Scal, I-Scel, I-SceII, I-SceIII , I-SceIV, I-SceV, I. 5 SceVI, I-SceVII, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP,

I-Ssp68O3I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiS3bP, I-TdeIP, I-TevI, ITevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAlP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP, PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PIPspI, PI-Rma43812IP, PI-SPBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-Thyl, PIφ 10 Tlil, PI-TlilI.

Preferidas neste contexto são as endonucleases residentes cujas seqüências de gene já são conhecidas, tais como, por exemplo, F-Scel, I-Ceul, I-ChuI, I-Dmol, I-Cpal, I-CpaII, I-Crel, I-Csml, F-TevI, F-TevII, I-TevI, ITevII, I-Anil, I-Cvul, I-Ddil, I-HmuI, I-HmuII, I-Llal, I-NanI, I-Msol, I-NitI, 15 I-Njal, I-Pakl, I-PorI, I-Ppol, I-Scal, I-Ssp6803I, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-PspI, PI-TfuI, PI-Tlil.

Muito especialmente preferidas são as endonucleases residentes comercialmente disponíveis tais como I-Ceul, I-Scel, I-Dmol, IPpol, PI-PspI ou PI-SceI.

As enzimas podem ser isoladas a partir de seus organismos de origem na maneira com a qual o trabalhador habilitado está familiarizado, e/ou a sua seqüência de ácido nucléico codificadora pode ser clonada. As seqüências de várias enzimas estão depositadas no banco de genes.

Muito especialmente preferidas são as endonucleases 25 residentes I-Scel, I-Cpal, I-CpaII, I-Crel e I-Chul. As mais preferidas são as endonucleases residentes como mostradas nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10.

As enzimas DSBI sintéticas que podem ser mencionadas por via de exemplo são as nucleases quiméricas que são compostas de um domínio de nuclease não específico e um domínio de ligação específico de ···

seqüência DNA que consiste de dedos de zinco (Bibikova M et al. (2001) Mol Cell Biol. 21: 289 a 297). Estes domínios de dedo de zinco de ligação de DNA podem ser adaptados para adequar qualquer seqüência de DNA. « ‘ Métodos adequados para preparar domínios de dedo de zinco adequados são . 5 descritos e conhecidos pelo trabalhador habilitado (Beerli RR et al., Proc Natl

Acad Sei USA. 2000; 97 (4): 1495 a 1500; Beerli RR, et al., J Biol Chem 2000; 275(42): 32617 a 32627; Segai DJ e Barbas CF 3^a, Curr Opin Chem

Biol 2000; 4(1): 34 a 39; Kang JS e Kim JS, J Biol Chem 2000; 275(12): 8742 a 8748; Beerli RR et al., Proc Natl Acad Sei USA 1998; 95(25): 14628 a φ 10 14633; Kim JS et al., Proc Natl Acad Sei USA 1997; 94(8): 3616 a 3620;

Klug A, J Mol Biol 1999; 293(2): 215 a 218; Tsai SY et al., Adv Drug Deliv Rev 1998; 30 (1 a 3): 23 a 31; Mapp AK et al., Proc Natl Acad Sei USA 2000; 97(8): 3930 a 3935; Sharrocks AD et al., Int J Biochem Cell Biol 1997;

29(12): 1371 a 1387; Zhang L et al., J Biol Chem 2000; 275(43): 33850 a 15 33860).

A enzima DSBI é preferivelmente expressada como uma proteína de fusão com uma seqüência de localização nuclear (NLS). Esta seqüência NLS permite o transporte facilitado no núcleo e aumenta a eficácia do sistema de recombinação. Uma variedade de seqüências NLS são 20 conhecidas pelo trabalhador habilitado e descritas, inter alia, por Jicks GR e Raikhel NV (1995) Annu. Rev. Cell Biol. 11: 155 a 188. Preferida para organismos vegetais é, por exemplo, a seqüência NLS do antígeno grande do SV40. Muito especialmente preferidas são as seguintes seqüências NLS:

NLS1: N-Pro-Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Val-C (SEQ ID NO: 29) NLS2: N-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-C (SEQ ID NO: 30)

As endonucleases residentes como mostradas nas SEQ ID 25 NOs: 4, 6, 8 ou 10 usadas nos exemplos de uso são proteínas de fusão das nucleases nativas e a seqüência de localização nuclear NLS2.

Devido ao tamanho pequeno de muitas enzimas DSBI (tais

como, por exemplo, as endonucleases residentes), uma seqüência NLS não é necessariamente requerida. Estas enzimas são capazes de passar através dos poros nucleares mesmo sem qualquer ajuda. Isto é confirmado pela eficácia

- ' das endonuclease residente como mostrada na SEQ ID NO: 2 que foi usada e que não abrange nenhuma seqüência de localização nuclear.

Em uma outra forma de realização preferida, a atividade da enzima DSBI pode ser induzida. Métodos adequados foram descritos para as recombinases específicas de seqüência (Angrand PO et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26(13): 3263 a 3269; Logie C e Stewart AF (1995) Proc Natl Acad Sei φ 10 USA 92(13): 5940 a 5944; Imai T et al. (2001) Proc Natl Acad Sei USA . 98(1): 224 a 228). Estes métodos utilizam proteínas de fusão da enzima DSBI e o domínio de ligação de ligando para o receptor de hormônio esteróide (por « exemplo o receptor de androgênio humano ou variantes mutadas do receptor de estrogênio humano como lá descritos), a indução pode ser efetuada com 15 ligandos tais como, por exemplo, estradiol, dexametasona, 4hidroxitamoxifen ou raloxifen.

Algumas enzimas DBSI são ativas como dímeros (homo ou heterodímeros; I-Crel forma um homodímero; I-SecIV forma um heterodímero) (Wemette CM (1998) Biochemical & Biophysical Research 20 Communications 248(1): 127 a 333)). A dimerização pode ser planejada como uma característica indutível, por exemplo trocando-se os domínios de dimerização natural pelos domínios de ligação de um ligando de peso molecular baixo. A adição de um ligando dimérico realiza então a dimerização da proteína de fusão. Os métodos de dimerização indutível e a 25 preparação dos ligandos diméricos correspondentes, foram descritos (Amara JF et al. (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94(20): 10618 a 1623; Muassimwamy SK et al. (1999) Mol Cell Biol 19(10): 6845 a 685; Schultz LW e Clardy J (1998) Bioorg Med Chem Lett. 8(1): 1 a 6; Keenan T et al. (1998) Bioorg Med Chem. 6(8): 1309 a 1335).

“Seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA” no geral refere-se àquelas seqüências que, sob os condições na célula ou organismo eucarióticos usados em cada caso, permitem o reconhecimento e a divagem pela enzima DSBI. As 5 seqüências de reconhecimento para as respectivas enzimas DSBI detalhadas são mencionadas na Tabela 1 abaixo por via de exemplo, mas não por limitação.

Tabela 1: Seqüências de reconhecimento e organismos de origem de enzimas DSBI (“^Λ” indica o sítio de divagem da enzima DSBI dentro de uma

Enzima DSBI	Organismo de origem	Seqüência de reconhecimento
CRE	Bacteriófago PI	5’-AACTCTCATCGCTTCGGATAACTTCCTGTTATCCGAAA CATATCACTCACTTTGGTGATTTCACCGTAACTGTCTATG ATTAATG-3’
FLP	Saccharomyces cerevisiae	5’-GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTA TAGGAACTTC-3’
R	pSRl Plasmídeos	5’-CGAGATCATATCACTGTGGACGTTGATGAAAGAATAC GTTATTCTTTCATCAAATCGT
Transposase do elemento P	Drosophila	5’-CTAGATGAAATAACATAAGGTGG
I-Anil	Aspergillus nidulans	5 ’-TTGAGGAGGTTATCTCTGTAAAT AANNNNNNNNNNNN NNN 3 '-AACTCCTCCAAAGAGACATTTATTNNNNNNNNNNNNN NNA
I-Ddil	Dictyostelium discoideumAX3	5 ’-TTTTTTGGTCATCCAGAAGTATAT 3 ’-AAAAAACCAGATAGGTCTTCATATA
I-Cvul	Chlorella vulgaris	5 ’-CTGGGTTCAAAACGTCGTGAAGACAGTTTGG 3’-GACCCAAGTTTTGCAGACACTCTGTCAAACC
I-Csml	Chlamydomonas smithii	5’-GTACTAGCATGGGGTCAAATGTCTTTCTGG
I-Cmoel	Chlamydomonasm oewusii	5 ’-TCGTAGCAGCTACACGGTT 3 ’-AGCATCGATCGAGTGCCAA
I-Crel	Chlamydomonas reinhardtii	5 ’-CTGGGTTCAAAACGTCGTGAAGACAGTTTGG 3 ’-GACCCAAGTTTTGCAGACACTCTGTCAAACC
I-ChuI	Chlamydomonas humicola	5 ’-GAAGGTTTGGCACCTCGAATGTCGGCTCATC 3’-CTTCCAAACCGTGAGAGCTACAGCCGAGTAG
I-Cpal	Chlamydomonas pallidostigmatica	5 ’-CGATCCTAAGGTAGCGAAAATTCA 3 ’-GCTAGGATTCCATCAGCTTTAAGT
I-CpaII	Chlamydomonas pallidostigmatica	5 ’-CCCGGCTAACTCATGTGCCAG 3 ’-GGGCCGATATGAGACACGGTC
I-Ceul	Chlamydomonas eugametos	5’-CGTAACTATAACGGTCCTAAAGGTAGCGAA 3’-GCATTGATATTGCCAGAGATTCCATCGCTT
I-Dmol	Desulfurococcus mobilis	5’-ATGCCTTGCCGGGTAAAGTTCCGGCGCGCAT 3’-TACGGAACGGCCACATTCAAGGCCGCGCGTA
I-Scel	S.cerevisiae	5 ’-AGTTACGCTAGGGATAAACAGGGTAATATAG 3’-TCAATGCGATCCCATATTGTCCCATTATATC 5 ’-TAGGGATAAACAGGGTAAT 3’-ATCCCATATTGTCCCATTA (Seqüência de “Núcleo”)
1-SceII	S.cerevisiae	5 ’-TTTTGATTCTTTGGTCACCCATGAAGTATA 3 ’-AAAACTAAGAAACCAGATGGGACTTCATAT
I-SceIII	S.cerevisiae	5 ATTGG AGGTTTTGGTAACATATTTATTACC 3 ’-TAACCTCCAAAACCAATTGATAAATAATGG
I-SceIV	S.cerevisiae	5 ’-TCTTTTCTCTTGATTAAGCCCTAATCTACG 3 ’-AGAAAAGAGAACATAATCGGGATTAGATGC
I-SceV	S.cerevisiae	5 ’-AATAATTTTCTATCTTAGTAATGCC 3 ’-TTATTAAAAGAAGAATCATTAACGG
I-SceVI	S.cerevisiae	5 ’-GTTATTTAATGATTTTAGTAGTTGG 3 ’-CAATAAATTACAAAATCATCAAACC
I-SceVII	S.cerevisiae	5 ’-TGTCACATTGAGGTGCACTAGTTATTAC

Enzima DSBI	Organismo de origem	Seqüência de reconhecimento
PI-SceI	S.cerevisiae	5 ’-ATCTATGTCGGGTGCAGGAGAAAGAGGTAAT 3 ’-TAGATACAGCCACACGCCTCTTTCTCCATTA
F-Scel	S.cerevisiae	5 ’-GATGCTGTAGGCAATAGGCTTGGTT 3' -CTaCGaCA”TCCüTaTCCGaaCCaa
F-ScelI	S.cerevisiae	5 ’-CTTTCCGCAACAAGTAAAATT 3 ’-GAAAGGCGATTGTCATTTTAA
I-HmuI	Bacillus subtilis bacteriófago SPO1	5 ’-AGTAATGAGCCTAACGCTCAGCAA 3 ’-TCATTACTCGGATTGCAGAGTCGTT
I-HmuII	Bacillus subtilis bacteriófago SP82	5’-AGTAATGAGCCTAACGCTCAACAANNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
I-Llal	Lactococcus lactis	5 ’-CACATCCATAACACATATCATTTTT 3 ’-GTGTAGGTATTGGTATAGTAAAAAA
I-Msol	Espécies Monomastix	5’-CTGGGTTCAAAACGTCGTGAAGACAGTTTGG 3 ’-GACCCAAGTTTTGCAGACACTCTGTCAAACC
I-NanI	Naegleria andersoni	5 ’-AAGTCTGGTGCCAAGCACCCGC 3 ’-TTCAGACCAACGGTCGTGGGCG
I-NitI	Naegleria italica	5 ’-AAGTCTGGTGCCAAGCACCCGC 3 ’-TTCAGACCAACGGTCGTGGGCG
I-Njal	Naegleria jamiesoni	5’-AAGTCTGGTGCCAAGCACCCGC 3 ’-TTCAGACCAACGGTCGTGGGCG
I-Pakl	Pseudendoclonium akinetum	5 ’-CTGGGTTCAAAACGTCGTGAAGACAGTTTGG 3 ’-GACCCAAGTTTTGCAGACACTCTGTCAAACC
I-PorI	Pyrobaculum organotrophum	5 ’-GCGAGCCCGTAAGGGTAGTGTACGGG 3’-CGCTCGGGCATTACCCACACATGCCC
I-Ppol	Physarum polycephalum	5 ’-TAACTATGACTCTCTTAAAGGTAGCCAAAT 3’-ATTGATACTGAGAGAAATTCCATCGGTTTA
I-Scal	Saccharomyces capensis	5 ’-TGTCACATTGAGGTGCACTAAGTTATTAC 3’-ACAGTGTAACTCCACAGTGATCAATAATG
I-Ssp68O3I	Espécies Synechocystis	5 ’-GTCGGGCTACATAACCCGAA 3 ’-CAGCCCGAGTAATTGGGCTT
Pl-PfuI	Pyrococcus furiosus Vcl	5’-GAAGATGGGAGGAGGGAACCGGACTCAACTT 3 ’ -CTTCT ACCCTCCATCCCTGGCCTGAGTTGAA
PI-PfuII	Pyrococcus furiosus Vcl	5’-ACGAATCCATGTGGAGAAAGAGCCTCTATA 3’-TGCTTAGGTACACACTCTTCTCGGAGATAT
PI-PkoI	Pyrococcus kodakaraensis K0D1	5 ’-GATTTTAGATACCCTGTACC 3 ’ -CTAAAAATCTAGGG AC ATGG
PI-PkoII	Pyrococcus kodakaraensis KOD1	5 ’-CAGTACTACGAGTTAC 3 ’-GTCATGAATGCCAATG
PI-PspI	Pyrococcus sp.	5 ’-AAAATCCTGGCAAACAGCTATTATAGGGTAT 3 ’-TTTTAGGACCGTTTGTCGATAAATACCCATA
PI-TfuI	Thermococcus fumicolans ST557	5 ’-TAGATTTTAGGTACGCTATATCCTTCC 3 ATCTAAAAATCCAGCG ATATAGGAAGG
PI-TfuII	Thermococcus fumicolans ST557	5 ’-TAYGCNGAYACNAGACGGYTTYT 3 ATRCGNCTARTGNCTGCCRAARA
PI-Thyl	Thermococcus hydrothermalis	5 ’-TAYGCNGAYACNAGACGGYTTYT 3 ATRCGNCTARTGNCTGCCRAARA
PI-Tlil	Thermococcus litoralis	5 ’-TAYGCNGAYACNGACGGAYTTYT 3 ’-ATRCGNCTRTGNCATGCCRAARA
PI-TlilI	Thermococcus litoralis	5 ’-AAATTGCTTGCAAACAGCTATTACGGCTAT

Enzima DSBI	Organismo de origem	Seqüência de reconhecimento
I-TevI	Bacteriófago T4	5 ’-AGTGGTATCAACAGCTCAGTAGATG 3 ’-TCACCATAGTATGCGAGTCATCTAC
I-TevII	Bacteriófago T4	5 ’-GCTTATGAGTATGAAGTGAACACGTATATTC ί λ a τ' a ata Λ Γ'Τ'τητηΑΓ* δ δ Τ δ δ G
F-TevI	Bacteriófago T4	5 ’-GAAACACAAGAAAATGTTTAGTAAANNNNNNNNNNN ΝΝΝ 3’-CTTrGTGTTCTTTACAAATCATTTNNbnWNNNNNNNN ΝΑ
F-TevII	Bacteriófago T4	5 ’ -TTTAATCCTCGCTTCA AGATATGGC AACTG 3 ’-AAATTAGGAGCGAAAGTCTATACCGTTGAC

Também abrangidos são desvios menores (degenerações) da

seqüência de reconhecimento que ainda permite o reconhecimento e a clivagem pela enzima DSBI em questão. Tais desvios - também em conexão com diferentes condições de esqueleto tais como, por exemplo, concentração de cálcio ou magnésio - foram descritos (Argast GM et al. (1998) J Mol Biol 280: 345 a 353). Também são abrangidas as seqüências de núcleo destas seqüências de reconhecimento. É conhecido que as porções internas das seqüências de reconhecimento são suficientes para uma ruptura induzida da fita dupla e que as externas não são absolutamente relevantes, mas podem codeterminar a eficácia da clivagem. Assim, por exemplo, uma seqüência de núcleo de 18 pares de base pode ser definida para I-SceL

A construção de recombinação e a enzima DSBI podem ser combinadas para dar um dos sistemas de recombinação ou métodos de acordo com a invenção de vários modos com que o trabalhador habilitado está familiarizado. Assim, as construções de recombinação e a enzima DSBI podem ser combinadas em um organismo, uma célula, um compartimento celular ou um tecido por exemplo como segue:

1.) Organismos que têm o cassete de recombinação inserido no DNA cromossômico são gerados da maneira habitual. Por exemplo, tais plantas podem ser geradas preferivelmente pela transformação mediada pelas agrobactérias. Os transformantes primários que contêm o cassete de recombinação são utilizados para a transformação com um cassete de expressão que garante a

expressão da enzima DSBI ou o desenvolvimento em uma maneira adequada até homozigotos, quando eles atuam como o organismo hospedeiro (por exemplo planta hospedeira) para a transformação com um cassete de expressão que garanta a expressão da enzima DSBI. Partindo destas plantas hospedeiras, é possível, por exemplo, iniciar, estabelecer e usar com propósitos de transformação culturas in vitro tais como, por exemplo, culturas de calo ou culturas embriogênicas. A transformação com o cassete de expressão para a enzima DSBI pode ser em cada caso estável ou transitória.

2.) Organismos conhecidos como organismos mestres, que carregam e expressam o gene correspondente para a enzima DSBI (ou um cassete de expressão que garante a expressão da enzima DSBI) são gerados da maneira habitual. Por exemplo, tais plantas mestras podem ser geradas preferivelmente pela transformação mediada por agrobactéria. Os transformantes primários que expressam a enzima DSBI são utilizadas para a transformação com a construção de recombinação ou cultivo em uma maneira adequada até homozigoto, que é quando eles atuam como organismo mestre ou organismo hospedeiro (por exemplo planta mestre) em que as construções de recombinação são introduzidas. Partindo-se destas plantas mestras, é possível, por exemplo, iniciar, estabelecer e usar com propósitos de transformação culturas in vitro tais como, por exemplo, culturas de calo ou culturas embriogênicas.

3.) O gene que codifica a enzima DSBI (ou um cassete de expressão que garanta a expressão da enzima DSBI) pode ser integrado em um vetor que já carregue o cassete de recombinação e assim introduzido nas células vegetais simultaneamente com o gene alvo. É preferido inserir o gene que codifica a enzima DSBI entre as seqüências de homologia e assim suprimi-lo do DNA

cromossômico depois que ele tenha cumprido a sua função. Muito especial e preferivelmente, a expressão da enzima DSBI é indutível em tal caso (por exemplo sob o controle do um dos promotores indutíveis descritos abaixo), em uma maneira dependente do desenvolvimento usando um promotor dependente de desenvolvimento ou ainda as enzimas DSBI são utilizadas cuja atividade é indutível de modo a evitar a divagem da construção de recombinação imediatamente depois da transformação e antes da sua inserção no genoma.

4. ) Contando com a técnica de co-transformação, o cassete de expressão que garante a expressão da enzima DSBI pode ser transformado nas células simultaneamente com a construção de recombinação, mas em um vetor separado. A co-transformação pode ser em cada caso estável ou transitória. Em tal caso, a expressão da enzima DSBI é preferivelmente indutível (por exemplo sob o controle de um dos promotores indutíveis descritos abaixo), em uma maneira dependente do desenvolvimento usando um promotor dependente de desenvolvimento ou ainda enzimas DSBI são utilizadas cuja atividade é indutível de modo a evitar a divagem da construção de recombinação imediatamente depois da transformação e antes da sua inserção no genoma.

5. ) Organismos, por exemplo plantas ou mesmo animais, que expressam a enzima DSBI também podem atuar como indivíduos precursores. Na progênie da hibridização entre organismos que expressam a enzima DSBI por um lado e organismos que carregam a construção de recombinação por outro lado, as rupturas de fita dupla desejadas e a recombinação entre as seqüências de homologia são observadas, com a possível supressão das seqüências localizadas entre as seqüências de homologia.

_φ10

6. ) A expressão da enzima DSBI também é concebível em um método de transformação transitória em que as possibilidades de 2 a 4 podem ser exploradas.

7. ) A enzima DSBI também pode ser introduzida em células que compreendem ou que carregam a construção de recombinação transgênica diretamente, por exemplo via microinjeção, bombardeamento de partícula (método biolístico), transfecção com polietileno glicol ou transfecção mediada com lipossoma. Esta forma de realização é vantajosa visto que nenhuma das seqüências que codificam a enzima DSBI pode permanecer no genoma. Um tal método foi descrito por exemplo por Segai DJ et al. (1995) Proc Natl Acad Sei USA 92: 806 a 810.

8. ) A enzima DSBI também pode ser gerada pela introdução do mRNA que codifica a enzima DSBI, gerado in vitro em células (por exemplo via microinjeção, bombardeamento de partícula (método biolístico) ou transfecção mediada com lipossoma). Esta forma de realização é vantajosa visto que nenhuma das seqüências que codificam a enzima DSBI podem permanecer no genoma.

9. ) A enzima DSBI pode ser introduzida em células vegetais como uma proteína de fusão com a proteína VirE2 ou VirF de uma agrobactéria. Tais métodos foram descritos por exemplo para a recombinase Cre (Vergunst AC et al. (2000) Science. 290: 979 a 982). Se o cassete de expressão para a proteína de fusão está localizado fora das seqüências da borda, ela não é inserida no genoma vegetal. Esta forma de realização é vantajosa visto que nenhuma das seqüências que codificam a enzima DSBI podem permanecer no genoma.

O sistema ou método de recombinação de acordo com a invenção podem ser compreendidos em organismos inteiros ou ainda em

···

partes, células ou material de propagação derivado destas, especial e preferivelmente em plantas inteiras ou ainda em qualquer tecido vegetal ou culturas vegetais in vitro incluindo calo. Uma aplicação in viiro usando, por exemplo, extrato de germe de trigo ou extrato de reticulócito também pode ser 5 considerada.

Como descrito acima, a enzima DSBI pode ser gerada usando um cassete de expressão que compreenda o DNA que codifica uma enzima DSBI e é introduzida em uma célula ou organismo eucarióticos. Neste contexto, o cassete de expressão para a enzima DSBI preferivelmente φ 10 compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima DSBI > como mostrado nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10 ou um equivalente funcional do mesmo que é capaz de gerar rupturas de fita dupla de DNA no >«

DNA de fita dupla usando seqüência de reconhecimento essencialmente idêntica. As seqüências de reconhecimento essencialmente idênticas referem15 se àquelas seqüências de reconhecimento que, embora se desviem da seqüência de reconhecimento identificada como ótima para a enzima em questão, ainda permitem a divagem por esta enzima. Muito especial e preferivelmente, os cassetes de expressão para a enzima DSBI compreendem

uma seqüência de ácido nucléico como mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 ou 9.

Cassete de expressão - por exemplo quando se referindo ao cassete de expressão para a enzima DSBI - significa aquelas construções em que o DNA a ser expressado está operavelmente ligado a pelo menos um elemento de controle genético que permite ou regula a sua expressão (isto é, 25 transcrição e/ou tradução). Aqui, a expressão pode ser por exemplo estável ou transitória, constitutiva ou indutível. Para introduzi-la, o trabalhador habilitado pode recorrer a vários métodos diretos (por exemplo transfecção, bombardeamento de partícula, microinjeção) ou métodos indiretos (por exemplo infecção com agrobactérias, infecção com vírus), todos os quais são

* · · • · ··· • · · · ·« ·· detalhados mais abaixo.

A ligação operável é no geral entendida como significando um arranjo em que uma seqüência de controle genético c capaz de exercer a sua * ' função com respeito a uma seqüência de ácido nucléico, por exemplo . 5 enquanto codifica uma enzima DSBI. A função, neste contexto, pode significar por exemplo o controle da expressão, isto é, transcrição e/ou tradução, da seqüência de ácido nucléico, por exemplo uma que codifica uma enzima DSBI. Controle, neste contexto, abrange por exemplo iniciar, aumentar, influenciar ou suprimir a expressão, isto é, a transcrição e, se • 10 apropriado, a tradução. O controle, por sua vez, pode ser, por exemplo, específico de tecido e/ou tempo. Ele também pode ser indutível, por exemplo por certos produtos químicos, estresse, patógenos e outros.

A ligação operável é entendida como significando por exemplo o arranjo seqüencial de um promotor, da seqüência de ácido nucléico 15 a ser expressada - por exemplo uma que codifica uma enzima DSBI - e, se apropriado, outros elementos reguladores tais como, por exemplo, um terminador, de tal modo que cada um dos elementos reguladores possam cumprir a sua função quando a seqüência de ácido nucléico - por exemplo uma que codifica uma enzima DSBI - é expressada.

Isto não requer necessariamente uma ligação direta no sentido químico. As seqüências de controle genético tais como, por exemplo, as seqüências intensificadoras também são capazes de exercer a sua função na seqüência alvo de posições localizadas em uma distância ou de fato outras moléculas de DNA. Os arranjos preferidos são aqueles em que a seqüência de ácido nucléico a ser expressada - por exemplo uma que codifica uma enzima DSBI - é posicionada depois de uma seqüência que atua como promotor de modo que as duas seqüências sejam covalentemente ligadas entre si. A distância entre a seqüência promotora e a seqüência de ácido nucléico - por exemplo uma que codifica uma enzima DSBI - é preferivelmente menor do

que 200 pares de base, especial e preferivelmente menor do que 100 pares de base, muito especial e preferivelmente menor do que 50 pares de base.

O trabalhador habilitado está familiarizado com uma variedade de modos a fim de obter um tal cassete de expressão. Por exemplo, ele é preferivelmente preparado fundindo-se diretamente uma seqüência de ácido nucléico que atue como promotor com uma seqüência de nucleotídeo a ser expressada - por exemplo uma que codifica uma enzima DSBI. A ligação operável pode ser obtida por meio de técnicas de recombinação e clonagem habituais como são descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J.

Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, e Wiley 15 Interscience (1987).

Entretanto, um cassete de expressão também pode ser construído de tal modo que a seqüência de ácido nucléico a ser expressada (por exemplo uma que codifica uma enzima DSBI) seja levada sob o controle de um elemento de controle genético endógeno, por exemplo um promotor, 20 por exemplo por meio de recombinação homóloga ou ainda pela inserção aleatória. Tais construções são do mesmo modo entendidas como sendo cassetes de expressão para os propósitos da invenção.

O trabalhador habilitado além disso sabe que as moléculas de ácido nucléico também pode ser expressadas usando fatores de transcrição 25 artificiais do tipo da proteína de dedo de zinco (Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97(4): 1495 a 1500). Estes fatores podem ser adaptados para adequar qualquer região de seqüência e permitir a expressão independentemente de certas seqüências promotoras.

O termo “seqüências de controle genético” deve ser entendido

·· ·· ···· ·· • · · · ·· • ·· · · · • · · ···· • · · · ·· ·· ·· ·· ·· • 10 no sentido amplo e refere-se a todas aquelas seqüências que afetam a origem ou a função, do cassete de expressão de acordo com a invenção. Por exemplo, as seqüências de controle genético garantem a transcrição c, se apropriado, a tradução em organismos procarióticos ou eucarióticos. Preferivelmente, os cassetes de expressão de acordo com a invenção abrangem a montante de 5’ da respectiva seqüência de ácido nucléico a ser expressada um promotor e a jusante de 3 ’ uma seqüência terminadora como seqüência de controle genético adicional, e, se apropriado, outros elementos reguladores habituais, em cada caso em ligação operável com a seqüência de ácido nucléico a ser expressada.

As seqüências de controle genético são descritas, por exemplo, em “Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)” ou “Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, eds.: Glick e Thompson, Capítulo 7, 89 a 108” e as referências citadas nestes.

Os exemplos de tais seqüências de controle são seqüências às quais indutores ou repressores se ligam e assim regulam a expressão do ácido nucléico. A regulagem natural das seqüências perante os genes estruturais reais pode ainda estar presente além destas novas seqüências de controle ou ao invés destas seqüências e, se apropriado, podem ter sido geneticamente modificadas de tal modo que a regulagem natural tenha sido desligada e a expressão de gene aumentada. Entretanto, o cassete de expressão também pode ser mais simples em construção, em outras palavras nenhum sinal regulador adicional é inserido antes dos genes mencionados acima e o promotor natural junto com a sua regulagem não é removido. Ao invés, a seqüência de controle natural é mutada de tal modo que a regulagem não mais ocorra e a expressão de gene é aumentada. Estes promotores modificados também podem ser colocados por sua própria conta antes dos genes naturais para aumentar a atividade.

Uma variedade de seqüências de controle é adequada, dependendo do organismo hospedeiro ou organismo de partida descritos em maiores detalhes abaixo, que. devido à introdução dos cassetes de expressão • ' ou vetores, se tomam um organismo geneticamente modificado ou . 5 transgênico.

As seqüências de controle vantajosas para os cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção estão presentes por exemplo em promotores tais como cos, tac, trp, tet, phoA, tat, lpp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR ou no promotor λ-PL, que são vantajosamente φ 10 usados em bactérias Gram-negativas.

As seqüências de controle mais vantajosas estão presentes por exemplo nos promotores Gram-positivos amy e SPO2, nos promotores de A levedura ou fungicos ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH ou nos promotores vegetais CaMV/35S (Franck et al. (1980) Cell 21:

285 a 294), PRP1 (Martini N et al. (1993) Mol Gen Genet. 236(2-3): 179 a

186), SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1, B33, NOS; FBPaseP (WO 98/18940) ou nos promotores de ubiquitina ou faseolina.

Os vetores que são adequados para a expressão em vertebrados, preferivelmente em mamíferos, são vetores como o promotor 20 TK, o promotor RSV 3’ LTR, o promotor CMV ou o promotor precoce ou tardio de SV40. O trabalhador habilitado está familiarizado com outros promotores. Os promotores indutíveis adequados para o uso em vertebrados, preferivelmente em mamíferos, abrangem por exemplo o promotor/repressor Tet, que é indutível ou repressível pela tetraciclina ou derivados, o promotor 25 MMTV-LTR indutível pela dexametasona, o promotor de choque térmico mínimo de Drosófila, que é indutível pela ecdisona ou o análogo ponasterona A (por exemplo dentro do sistema de expressão pVgRXR; Invitrogen, Inc.).

Um promotor preferido é, em princípio, qualquer promotor que seja capaz de controlar a expressão de genes, em particular genes

estranhos, em plantas. Os promotores preferidos são aqueles que permitem a expressão constitutiva em plantas (Benfey et al. (1989) EMBO J. 8: 2195 a 2202). Um promotor que é preferivelmente usado é, em pariicuiar, um • ' promotor vegetal ou um promotor derivado de um vírus vegetal.

. 5 Especialmente preferido é o promotor do transcrito 35S do vírus mosaico da couve-flor (Franck et al. (1980) Cell 21: 285 a 294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810 a 812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140: 281 a 288; Gardner et al. 1986, Plant Mol. Biol. 6, 221 a 228) ou o promotor 19S CaMV (US 5.352.605 e WO 84/02913). É conhecido que este promotor compreende uma φ 10 variedade de seqüências de reconhecimento para efetores transcricionais que, na sua totalidade, realizam a expressão permanente e constitutiva do gene introduzido (Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195 a 2202). Um outro

A promotor constitutivo adequado é o promotor da subunidade pequena de Rubisco (SSU) (US 4.962.028). Um outro exemplo de um promotor adequado é o promotor da legumina B (Banco de genes Acesso N^s: X03677). Ostros promotores constitutivos preferidos são, por exemplo, o promotor da nopalina sintase de Agrobactéria, o promotor duplo TR, o promotor OCS da agrobactéria (octopina sintase), o promotor de ubiquitina (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637 a 649), os promotores das subunidades ATPase vacuolares ou o promotor de uma proteína rica em prolina do trigo (WO 91/13991).

Os cassetes de expressão também podem compreender um promotor indutível, de modo preferível quimicamente indutível, (Aoyama T e Chua NH (1997) Plant J 11: 605 a 612; Caddick MX et al. (1998) Nat.

Biotechnol 16: 177 a 180; Rewiew: Gatz, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1997, 48: 89 a 108), por meio dos quais a expressão do gene exógeno na planta pode ser controlada em um ponto no tempo específico, tais promotores, tais como, por exemplo, o promotor PRP1 (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361 a 366), um promotor indutível pelo ácido salicílico (WO

• ··

95/19443), um promotor indutível por benzenossulfonamida (EP-A-0388186), um promotor indutível por tetraciclina (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397 a 404), um promotor indutível pelo ácido abscísico (EP-A 335528), um , promotor indutível pelo ácido salicílico (WO 95/19443) ou um promotor . 5 indutível por etanol (Salter pg et al. (1998) Plant J. 16: 127 a 132) ou por cicloexanona (WO 93/21334) podem ser do mesmo modo usados.

Em uma forma de realização especialmente preferida, o ácido nucléico que codifica a enzima DSBI, em particular, é expressada sob o controle de um promotor indutível. Isto leva a uma expressão e supressão φ 10 controlada, dirigível - por exemplo em plantas - e quaisquer problemas » causados por uma expressão constitutiva de uma enzima DSBI são evitados.

Outros promotores preferidos são promotores induzidos por A estresses bióticos ou abióticos, tais como, por exemplo, o promotor indutível por patógeno do gene PRP1 (Ward et al., Plant Mol Biol 1993, 22: 361 a 15 366), o promotor hsp80 indutível pelo calor de tomate (US 5.187.267), o promotor da alfa-amilase indutível por congelamento da batata (WO 96/12814) ou o promotor pinll induzido por ferimento (EP375091).

Outros promotores preferidos são promotores com especificidades para as anteras, ovários, pólen, o meristema, flores, folhas, 20 caules, raízes e sementes.

* Um promotor regulado por desenvolvimento é, inter alia, descrito por Baerson et al. (Baerson SR, Lamppa GK (1993) Plant Mol Biol 22(2): 255 a 267).

Os promotores especialmente preferidos são aqueles que garantem a expressão em tecidos ou partes vegetais em que a biossíntese do amido e/ou óleos ou seus precursores ocorre ou em que os produtos são vantajosamente acumulados. O sítio de biossíntese de amido são os cloroplastos das folhas ou os amiloplastos dos órgãos de armazenagem tais como sementes, frutos ou tubérculos. Dentro destes órgãos, estão

• ·

predominantemente as células do endosperma ou os cotilédones do embrião em que a síntese ocorre. Os promotores preferidos são assim além dos promotores constitutivos mencionados acima cm particular os promotores - * específicos de semente tais como, por exemplo, o promotor de faseolina (US . 5 5.504.200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1(9): 839 a 853), o promotor do gene da albumina 2S (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196 a 12201), o promotor de legumina (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet. 215(2): 326 a 331), o promotor USP (proteína de semente desconhecida) (Bãumlein H et al. (1991) Molecular & General Genetics 225(3): 459 a 467), • 10 o promotor do gene napin (US 5.608.152; Stalberg K, et al. (1996) L. Planta . 199: 515 a 519), o promotor da proteína de ligação da sacarose (WO

00/26388) ou o promotor B4 da legumina (LeB4; Bãumlein H et al. (1991)

Mol Gen Genet 225: 121 a 128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2): 233 a 239; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090 a 1093), o promotor da oleosina de Arabidopsis Ins (WO 9845461), o promotor Bce4 de Brássica (WO 91/13980). Outros promotores específicos de semente adequados são aqueles dos genes que codificam a “glutenina de peso molecular alto” (HMWG), gliadina, enzima de ramificação, ADP-glicose pirofosfatase (AGPase) ou amido sintase. Além disso os promotores preferidos são aqueles que permitem a expressão específica de semente em monocotiledôneas tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz e outros. Os promotores que podem ser vantajosamente utilizados são o promotor dos genes lpt2 ou lptl (WO 95/15389, WO 95/23230) ou os promotores descritos na WO 99/16890 (promotores do gene da hordeína, do gene da glutelina, do gene da orizina, do gene da prolamina, do gene da gliadina, do gene da glutelina, do gene da zeína, do gene da casirina ou o gene da secalina).

Os promotores que são preferidos como elementos de controle genético são, além disso, os promotores específicos de pólen tais como, por exemplo, o promotor do gene bgpl da B. campestris (Banco de genes Acesso

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3Í • ·· · • · · ·· • ·· ·· •· · ··· • · · ·· ·· ···· ··

I» • ¹⁰

N- : X68210; Xu H et al. (1993) Mol Gen Genet 239(1-2): 58 a 65; WO 94/13809), do gene ory s 1 da Oryza sativa (Banco de genes Acesso N°: AJO 12760: Xu H et al. 0995} Gene 164 (2): 255 a 259), do gene ZMÍ3 do milho específico de pólen (Hamilton DA et al. (1998) Plant Mol Biol 38(4): 663 a 669; US 5.086.169) e do gene BplO de B. napus (Banco de genes Acesso N²: X64257; Albani D (1992) Plant J 2(3): 331 a 342; US 6.013.859).

Outros promotores preferidos são o promotor Lcgl para a expressão específica de célula nos gametas masculinos (WO 99/05281; XU H et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA Vol. 96: 2554 a 2558) e o promotor do gene AtDMCl (Klimyuk VI et al. (1997) Plant J. 11(1): 1 a 14).

Outros promotores adequados são, por exemplo, promotores específicos para tubérculos, raízes de armazenagem ou raízes tais como, por exemplo, o promotor da patatina de classe I (B33), o promotor inibidor da catepsina D da batata, o promotor da amido sintase (GBSS1) ou o promotor de esporamina e promotores específicos de fruto tais como, por exemplo, o promotor específico do fruto do tomate (EP-A 409625).

Os promotores que são além disso adequados são aqueles que garantem a expressão específica de folha. Os promotores que podem ser mencionados são o promotor FBPase citossólico da batata (WO 98/18940), o promotor da SSU (subunidade pequena) de Rubisco (ribulose-l,5-bisfosfato carboxilase) ou o promotor ST-LSI da batata (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8(9): 2445 a 2451). Outros promotores preferidos são aqueles que controlam a expressão em sementes e embriões vegetais.

Outros promotores adequados são, por exemplo, os promotores específicos da maturação de fruto tais como, por exemplo, o promotor específico da maturação do fruto do tomate (WO 94/21794), promotores específicos de flores tais como, por exemplo, o promotor da fitoeno sintase (WO 92/16635) ou o promotor do gene P-rr (WO 98/22593) ou um outro promotor específico de nó como descrito na EP-A 249676 podem ser

vantajosamente usados.

Em princípio, todos os promotores naturais junto com suas seqüências reguladoras, tais como aqueles mencionados acima, podem ser - * usados para o método de acordo com a invenção. Além disso, promotores . 5 sintéticos também podem ser vantajosamente usados.

As seqüências de controle genético também abrangem outros promotores, elementos promotores ou promotores mínimos capazes de modificar as características específicas de expressão. Assim, por exemplo, a expressão específica de tecido pode ocorrer além disso como uma função de φ 10 certos fatores de estresse, devido às seqüências de controle genético. Tais * elementos são, por exemplo, descritos para estresse á água, ácido abscísico (Lam E e Chua NH (1991) J Biol Chem 266(26): 17131 a 17135) e estresse ♦

ao calor (Schoffl F et al. (1989) Molecular & General Genetics 217(2-3): 246 a 253).

Além disso, outros promotores que permitem a expressão em outros tecidos vegetais ou outros organismos, tais como, por exemplo, as bactérias E. coli, podem ser operavelmente ligados com a seqüência de ácido nucléico a ser expressada. Os promotores vegetais que são adequados são, em princípio, todos os promotores descritos acima.

As seqüências de controle genético além disso também abrangem a região não traduzida 5’, íntrons ou a região 3’ não codificadora dos genes. Foi demonstrado que elas podem desempenhar um papel significante na regulagem da expressão de gene. Assim, foi demonstrado que as seqüências não traduzidas 5’ são capazes de realçar a expressão transitória de genes heterólogos. Além disso, elas podem promover especificidades de tecido (Rouster J et al., Plant J. 1998, 15: 435 a 440). Ao contrário, a região não traduzida 5’ do gene opaque-2 suprime a expressão. A supressão da região em questão leva a uma atividade de gene aumentada (Lohmer S et al., Plant Cell 1993, 5: 65 a 73).

• · ·· ···· ··

As seqüências de controle genético também podem abranger seqüências de ligação de ribossoma para iniciar a tradução. Isto é preferido em particular quando a seqüência de ácido nüvléico a ser expressada não . * fornece seqüências adequadas ou quando elas não são compatíveis com o . 5 sistema de expressão.

O cassete de expressão pode vantajosamente compreender um ou mais doa que são conhecidos como seqüências intensificadoras na ligação operável com o promotor, que permite a expressão transgênica aumentada da seqüência de ácido nucléico. As seqüências vantajosas adicionais, tais como φ 10 outros elementos reguladores ou terminadores, também podem estar inseridas na extremidade 3’ das seqüências de ácido nucléico a serem recombinantemente expressadas. Uma ou mais cópias das seqüências de ácido nucléico a serem recombinantemente expressadas podem estar presentes na construção de gene.

As seqüências de controle genético são além disso entendidas como significando seqüências que codificam proteínas de fusão que consistem de uma seqüência peptídica de sinal.

Os sinais de poliadenilação que são adequados como seqüências de controle genético são os sinais de poliadenilação vegetais, φ preferivelmente aqueles que correspondem essencialmente aos sinais de poliadenilação de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, em particular do gene 3 do T-DNA (octopina sintase) dos plasmídeos Ti, pTiACHS (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 et sec.) ou equivalentes funcionais destes. Os exemplos de seqüências terminadoras particularmente adequadas são o terminador da OCS (octopina sintase) e o terminador da NOS (nopalina sintase).

Como mencionado acima, as construções de recombinação de acordo com a invenção podem abranger outras seqüências de ácido nucléico. Tais seqüências de ácido nucléico podem constituir preferivelmente cassetes

• · de expressão. O seguinte pode ser mencionado por via de exemplo das seqüências de DNA a serem expressadas nas construções de expressão, mas não por via de limitação:

i) Marcadores de seleção positivos:

Como uma regra, marcadores de seleção são requeridos para selecionar células que têm sofrido com sucesso a recombinação ou transformação homólogas. O marcador selecionável que foi introduzido junto com a construção de expressão confere resistência a um biocida (por exemplo um herbicida tal como fosfinotricina, glifosato ou bromoxinil), um inibidor de φ 10 metabolismo tal como 2-desoxiglicose-6-fosfato (WO 98/45456) ou um > antibiótico tal como, por exemplo, tetraciclinas, ampicilina, canamicina, G

418, neomicina, bleomicina ou higromicina às células que sofreram com sucesso a recombinação ou transformação. O marcador de seleção permite que a seleção das células transformadas das células não transformadas (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81 a 84). Os marcadores de seleção especialmente preferidos são aqueles que conferem resistência a herbicidas. Os exemplos de marcadores de seleção que podem ser mencionados são:

seqüências de DNA que codificam fosfinotricina acetiltransferases (PAT), que acetila o grupo amino livre do inibidor da glutamina sintase da fosfinotricina (PPT) e assim realiza a destoxificação da PPT (de Block et al. 1987, EMBO J. 6, 2513 a 2518) (também aludido como gene de resistência a Bialophos® (bar)), genes da 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (genes da EPSP sintase), que conferem resistência à Glifosato® (N(fosfonometil)glicina), o gene gox, que codifica a enzima que degrada Glyphosate® (Glifosato oxidorreductase), o gene deh (que codifica uma desalogenase que inativa Dalapon®),

acetolactato sintases que inativam a sulfoniluréia e imidazolinona, genes bxn que codificam as enzimas de nitrilase que degradam Bromoxynil®.

• ' - o gene de resistência à canamicina ou G418 (NPTII). O gene NPTII . 5 codifica uma neomicina fosfotransferase que reduz o efeito inibidor da canamicina, neomicina, G418 e paromomicina devido a uma reação de fosforilação, o gene DOG^R1. O gene DOG^R1 foi isolado da levedura Saccharomyces cerevisiae (EP 0 807 836). Ele codifica uma 2- • 10 desoxi-glicose-6-fosfato fosfatase que confere resistência a 2-DOG < (Randez-Gil et al. 1995, Yeast 11, 1233 a 1240).

ii) Os marcadores de seleção negativos permitem por exemplo a seleção de organismos com seqüências suprimida com sucesso que abrangem o gene marcador (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal 19(6):

719 a 726). Fragmento da TK timidina cinase (TK) e da toxina a da difteria (DT-A), gene codA que codifica uma citosina desaminase (Gleve AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40(2): 223 a 235; Pereat RI et al. (1993) Plant Mol. Biol 23(4): 793 a 799; Stougaard J; (1993) Plant J 3: 755 a 761), o gene de citocromo P450 (Koprek et al. (1999) Plant J. 16: 719 a 726), genes que 20 codificam uma haloalcano desalogenase (Naested H (1999) Plant J. 18: 571 a • 576), o gene iaaH (Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9: 1797 a 1810) ou o gene tms2 (Fedoroff NV & Smith DL 1993, Plant J 3: 273 a 289).

iii) Genes repórter que codificam proteínas facilmente quantificáveis e que, por intermédio de atividade de cor ou enzimática intrínsecas, garantem a avaliação da eficácia de transformação ou da localização ou regulagem do tempo de expressão. Muito especialmente preferidos aqui são os genes que codificam proteínas repórteres (ver também Schenbom E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29 a 44) tais como:

• · · • ¹⁰

a “proteína de fluorescência verde” (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325 a 330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912 a 918_: 1997; Sheen et al. (1995) Plant Joumal 8(5): 777 a 784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94(6): 2122 a 2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93(12): 5888 a 5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267 a 271; WO 97/41228). Cloranfenicol transferase, luciferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324 a 414; Ow et al. (1986) Science, 234: 856 a 859); permite a detecção de bioluminescência, β-galactosidase, codifica uma enzima para a qual uma variedade de substratos cromogênicos são disponíveis, β-glicuronidase (GUS) (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901 a 3907) ou o gene uidA, que codifica uma enzima para uma variedade de substratos cromogênicos, o produto de gene do local R: proteína que regula a produção de pigmentos de antocianina (coloração vermelha) em tecido vegetal e assim toma possível a análise direta da atividade promotora sem a adição de adjuvantes ou substratos cromogênicos adicionais (Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263 a 282, 1988), β-lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sei USA 75: 3737 a 3741), enzima para uma variedade de substratos cromogênicos (por exemplo PADAC, uma cefalosporina cromogênica), produto de gene xylE (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80: 1101 a 1105), catecol dioxigenase capaz de converter catecóis cromogênicos, alfa-amilase (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8: 241 a 242),

tirosinase (Katz et a/.(1983) J Gene Microbiol 129: 2703 a 2714), enzima que oxida a tirosina para dar DOPA e dopaquinona que subsequcntvmvmv ±viniãíii a niciaiiiíiâ, que c laciuiicuíe ueíectavei, . ‘ - aequorina (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun

- 5 126(3): 1259 a 1268), pode ser usada na detecção da bioluminescência sensível ao cálcio.

A construção de recombinação de acordo com a invenção e quaisquer vetores derivados dela podem compreender outros elementos funcionais. O termo outros elementos funcionais deve ser entendido no φ 10 sentido amplo. Ele preferivelmente se refere a todos aqueles elementos que > afetam a geração, multiplicação, função, uso ou valor do sistema de recombinação de acordo com a invenção, da construção de recombinação de acordo com a invenção ou células ou organismos que as compreendam. O seguinte pode ser mencionado por via de exemplo, mas não por limitação, dos 15 outros elementos funcionais:

iv) As origens de replicação que garantem a replicação dos cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, por exemplo, na E. coli. Os exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem de replicação de DNA), o pBR322 ori ou the P15A ori (Sambrook et al.:

Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2^a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

v) As regiões de clonagem múltipla (MCS) permitem e facilitam a inserção de uma ou mais seqüências de ácido nucléico.

vi) As seqüências que tomam possível a recombinação 25 homóloga ou a inserção no genoma de um organismo hospedeiro.

vii) Elementos, por exemplo seqüências de borda, que tomam possível a transferência mediada por agrobactéria em células vegetais para a transferência e integração no genoma vegetal, tais como, por exemplo, as bordas direita ou esquerda do T-DNA ou a região vir.

Todos os cassetes de expressão mencionados acima ou outros

elementos funcionais podem ser localizados, como mencionado, entre as sequências de homologia A e B. Entretanto clõa vaiilbeiii pOucm CSÍar localizados fora delas. Isto é vantajoso em particular no caso de seqüências de borda.

Um cassete de recombinação ou construção de expressão de acordo com a invenção para uma enzima DSBI podem ser vantajosamente introduzidos em células usando vetores nos quais estas construções ou cassetes são inseridos. Os exemplos de vetores podem ser plasmídeos, φ 10 cosmídeos, fagos, vírus, retrovírus ou ainda agrobactérias.

, Os vetores para a expressão na E. coli são preferivelmente pQE70, pQE60 e pQE-9 (QIAGEN, Inc.); vetores pBluescript, vetores Fagoscript, pNH8A, pNHlóa, pNH18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia 15 Biotech, Inc.).

Os vetores preferidos para a expressão eucariótica abrangem pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG (Stratagene Inc.); pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL (Pharmacia Biotech, Inc.). Os vetores indutíveis que podem ser mencionados são pTet-Thia, Potter-Splice, pcDNA4/TO, pcDNA4/TO ^W 20 /LacZ, pcDNA6/TR, pcDNA4/TO/Myc-His /LacZ, pcDNA4/TO/Myc-His A, pcDNA4/TO/Myc-His B, pcDNA4/TO/Myc-His C, pVgRXR (Invitrogen, Inc.) ou a série pMAM (Clontech, Inc.; Banco de genes Acesso N²: U02443). Estes já fornecem o elemento de controle regulador indutível por exemplo para uma expressão indutível química de uma enzima DSBI. A seqüência de 25 ácido nucléico que codifica uma enzima DSBI pode ser inserida diretamente nestes vetores.

Os vetores para a expressão em levedura abrangem por via de exemplo pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, PHIL-D2, PHIL-S1, pPIC3SK, pPIC9K e • 10 >

• · • · • · ·· ···· ···· ·· • · ·· • · · • ···· • · ·· ·· ·♦

ΡΑ0815 (Invitrogen, Inc.).

Em uma forma de realização vantajosa, o cassete de expressão é introduzido por meio de vetores plasmídicos. Os vetores preferidos são aqueles que permitem a integração estável do cassete de expressão no genoma hospedeiro.

Um outro assunto objeto da invenção diz respeito a organismos transgênicos eucarióticos que compreendem o sistema de recombinação de acordo com a invenção e às células, culturas de célula, tecidos, partes ou material de propagação - tais como, por exemplo, no caso de organismos vegetais folhas, raízes, sementes, fruto, pólen e outros derivados de tais organismos.

Organismo eucariótico, organismo de partida ou organismo hospedeiro referem-se a organismos eucarióticos superiores e inferiores, de célula única e múltipla. Também abrangidos são os microorganismos eucarióticos tais como, por exemplo, leveduras, algas ou fungos.

As leveduras preferidas são Candida, Saccharomyces, Hansenula ou Pichia, com Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris (ATCC Acesso N² 201178) sendo particularmente preferidas.

Os fungos preferidos são Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria ou outros fungos descritos no Indian Chem Engr. Seção B. Vol 37, N² 1,2 (1995) na página 15, Tabela 6. Hemiascomycete Ashbya gossypii filamentoso é particularmente preferido.

Organismos hospedeiros ou de partida que são preferidos acordo com a invenção são, além disso, organismos de animal e células tecido derivados destes. Os organismos de animal abrangem preferivelmente vertebrados e invertebrados. Os vertebrados especialmente preferidos são mamíferos tais como cães, gatos, ovelha, cabras, galinhas, camundongos, ratos, bovinos ou cavalos. As células de animal preferidas abrangem células CHO, COS e HEK293. Os invertebrados preferidos abrangem células de de ou • ·

insetos tais como células S2 de Drosophila e Sf9 ou Sf21 de Spodoptera.

Os organismos hospedeiros ou organismos de partida que são preferidos çnrno organismos transgênicos são especialmente plantas. Incluídas dentro do escopo da invenção estão todos os gêneros e espécies de plantas . 5 superiores e inferiores do reino vegetal. Incluídas são além disso as plantas maduras, semente, brotos e mudas e partes, material de propagação (por exemplo sementes e fruto) e culturas, por exemplo culturas de célula, derivados destas. As plantas maduras devem ser entendidas como significando plantas em qualquer estágio de desenvolvimento além da muda, φ 10 A muda deve ser entendida como significando uma planta jovem, imatura em , um estágio de desenvolvimento inicial.

O sistema de recombinação de acordo com a invenção pode b ser preferivelmente usado para as seguintes famílias de planta: Amaranthaceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, 15 Compositae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae-Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Tetragoniacea.

As plantas anuais, perenes, monocotiledôneas e dicotiledôneas

são organismos hospedeiros preferidos para a geração de plantas transgênicas. O uso do sistema ou método de recombinação de acordo com a invenção é além disso vantajoso em todas as plantas ornamentais, árvores úteis ou ornamentais, flores, flores cortadas, arbustos ou gramado. As plantas que podem ser mencionadas por via de exemplo mas não por limitação são angiospermas, briófitos tais como, por exemplo, Hepaticae (hepáticas) e

Musci (musgos); pteridófitos tais como samambaias, cavalinha e clubmosses', gimnospermas tais como coníferas, cicadáceas, ginkgo e Gnetaeae’, algas tais como Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (diátomos) e Euglenophyceae.

As plantas para os propósitos da invenção compreendem por

t» •· · •· •· · •· ♦ ·· ··· ·· ·· ···· ·· • · · *· · • ·· · · · ·· · ···· • · · · ·· ·· ·· ♦· ·♦ via de exemplo e não por via de limitação as famílias das Rosaceae tais como rosa, Ericaceae tais como rododendros e azaléias, Euphorbiaceae tais como poinsetias e cróton, Caryophyllaceae tais como cravos. Solanaceae tais como petúnias, Gesneriaceae tais como Violeta africana, Balsaminaceae tais como não me toques, Orchidaceae tais como orquídeas, Iridaceae tais como gladíolos, íris, ffésia e crocos, Compositae tais como tagetes, Geraniaceae tais como gerânios, Liliaceae tais como dracena, Moraceae tais como ficus, Araceae tais como fílodendro e muitas outras.

Plantas que dão flor que podem ser mencionadas por via de exemplo mas não por limitação são as famílias das Leguminosae tais como ervilha, alfafa e soja; Gramineae tais como arroz, milho, trigo; Solanaceae tais como tabaco e muitas outras; a família das Umbelliferae, particularmente o gênero Daucus (muito particularmente a espécie carota (cenoura)) e Apium (muito particularmente a espécie graveolens dulce (aipo)) e muitas outras; a família das Solanacea, particularmente o gênero Lycopersicon, muito particularmente a espécie esculentum (tomate) e o gênero Solanum, muito particularmente a espécie tuberosum (batata) e melongena (aubergine') e muitas outras; e o gênero Capsicum, muito particularmente a espécie annum (pimentas) e muitas outras; a família das Leguminosae, particularmente o gênero Glycine, muito particularmente a espécie max (soja) e muitas outras; e a família das Cruciferae, particularmente o gênero Brassica, muito particularmente a espécie napus (semente oleaginosa de colza), campestris (beterraba), oleracea cv Tastie (repolho), oleracea cv Snowball Y (couve-flor) e oleracea cv Emperor (brócolis); e o gênero Arabidopsis, muito particularmente a espécie thaliana e muitas outras; a família das Compositae, particularmente o gênero Lactuca, muito particularmente a espécie sativa (alface) e muitas outras.

As plantas transgênicas de acordo com a invenção são selecionadas em particular entre plantas de safra monocotiledôneas, tais

•· · · •· · •♦ ♦ • ·· • ·· ···· ·· ·· ·♦·· ·· • · · · ♦· · • · ·· · · · • ·· · ···· • · · · · ·· ·· ·· ·· ·· como, por exemplo, os cereais tais como trigo, cevada, sorgo e milho miúdo, centeio, triticale, milho, arroz ou aveias e cana de açúcar. As plantas transgênicas de acordo com a invenção são além disso selecionadas em particular dentre plantas de safra dicotiledôneas tais como, por exemplo,

Brassicaceae tal como semente oleaginosa de colza, agrião,

Arabidopsis, repolhos ou canola, Leguminosae tais como soja, alfalfa, ervilhas, feijões ou amendoim

Solanaceae tais como batata, tabaco, tomate, aubergine ou pimentas, Asteraceae tais como girassol, Tagetes, alface ou Calêndula, φ 10 Cucurbitaceae tais como melão, abóbora ou abobrinha, • Bem como linhaça, algodão, cânhamo, linho, pimenta malagueta, cenoura, beterraba e as várias espécies arbóreas, noz e vinícolas.

Especialmente preferidas são a Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum e semente oleaginosa de colza e todos os gêneros e 15 espécies que são usadas como alimento ou gêneros alimentícios, tais como as espécies de cereais descritas acima ou que são adequadas para a produção de óleos, tais como safras oleaginosas (tais como, por exemplo, semente oleaginosa de colza), espécies nogais, soja, girassol, abóbora e amendoim.

Os organismos vegetais são além disso, para os propósitos da invenção, outros organismos que são capazes de atividade fotossintética, tais como, por exemplo, algas ou cianobactérias e também musgos.

As algas preferidas são as algas verdes, tais como, por exemplo, as algas do gênero Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox ou Dunaliella.

A geração de um organismo transformado ou uma célula transformada requer introduzir o DNA em questão na célula hospedeira em questão. Uma multiplicidade de métodos está disponível para este procedimento, que é denominado transformação (ver também Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527 a 537). Por exemplo, o DNA pode ser

introduzido diretamente pela microinjeção ou pelo bombardeamento com micropartícuias revestidas com DNA. Também, a célula pode ser quimicamente permeabilizada, por exemplo usando polietileno glicol, de modo que o DNA possa entrar na célula pela difusão. O DNA também pode . 5 ser introduzido pela fusão de protoplasto com outras unidades que contenham

DNA tais como minicélulas, células, lisossomos ou lipossomos. Um outro método adequado de introduzir DNA é a eletroporação, onde as células são permeabilizadas reversivelmente por um pulso elétrico. Os métodos gerais preferidos que podem ser mencionados são a transfecção mediada por fosfato • 10 de cálcio, a transfecção mediada por DEAE-dextrano, a transfecção mediada , por lipídeo catiônico, eletroporação, transdução e infecção. Tais métodos são conhecidos pelo trabalhador habilitado e descrito, por exemplo, em Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

Em plantas, métodos para transformar e regenerar plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais com as quais o trabalhador habilitado está familiarizado são explorados para a transformação transitória ou estável. Os métodos adequados são especialmente a transformação de protoplasto por meio da captação de DNA induzida pelo polietileno glicol, métodos biolísticos tais como a pistola de gene (método do “bombardeamento de partícula”), eletroporação, a incubação de embriões secos em solução contendo DNA, sonificação e microinjeção e a transformação de células ou tecidos intactos pela micro ou macroinjeção em tecidos ou embriões, eletroporação de tecido, incubação de embriões secos em solução contendo DNA ou infiltração a vácuo de sementes. No caso da injeção ou eletroporação de DNA em células vegetais, o plasmídeo usado não necessita atingir nenhuma exigência particular. Plasmídeos simples tais como aqueles das séries pUC podem ser usados. Se plantas intactas devam ser regeneradas a partir de células transformadas, a presença de um gene marcador selecionável adicional no plasmídeo é útil.

Qualquer tecido vegetal pode atuar como material alvo.

Igualmente, a expressão pode ocorrer em calo, tecido embriogênico ou embriões somáticos.

Além destas técnicas de transformação “diretas”, a transformação também pode ser realizada pela infecção bacteriana por meio de Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Estas cepas contêm um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri). Parte deste plasmídeo, denominada T-DNA (DNA transferido), é transferida para a planta a seguir da infecção agrobacteriana e integrada no genoma da célula vegetal.

A construção do cassete de recombinação ou de expressão para a enzima DSBI é preferivelmente integrada em plasmídeos específicos, em um vetor transportador ou intermediário ou em um vetor binário). Se, por exemplo, um plasmídeo Ti ou Ri devam ser usados para a transformação, pelo menos a borda direita, mas na maioria dos casos as bordas direita e esquerda, 15 do plasmídeo Ti ou Ri o T-DNA é ligado com o cassete de expressão a ser introduzido como uma região flanqueadora. Os vetores binários são preferivelmente usados. Os vetores binários são capazes de replicação tanto na E. coli quanto na Agrobacterium. Como uma regra, eles contêm um gene marcador de seleção e um ligador ou poliligador flanqueado pelas seqüências 20 flanqueadoras de T-DNA direita ou esquerda. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181a 187). O gene marcador de seleção permite a seleção de agrobactérias transformadas e é, por exemplo, o gene nptll, que comunica resistência à canamicina. A agrobactéria, que atua como organismo hospedeiro neste caso, 25 já deve conter um plasmídeo com a região vir. O último é requerido para transferir o T-DNA para a célula vegetal. Uma agrobactéria assim transformada pode ser usada para transformar células vegetais.

O uso de Agrobacterium tumefaciens para a transformação de plantas usando explantes de cultura de tecido foi descrito por Horsch et al.

• · ·

(Horsch RB (1986) Proc Natl Acad Sei USA 83(8): 2571 a 2575), Fraley et al. (Fraley et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 4803 a 4807) e Bevans et al. (Bevans et al. 1983. Nature 3Q4_? 184 a 187). Muitas cepas de . * Agrobacterium tumefaciens são capazes de transferir material genético - por exemplo as construções de recombinação de acordo com a invenção - tais como, por exemplo, as cepas EHA101[pEHA101], EHA105[pEHA105], LBA4404[pAL4404], C58Cl[pMP90] e C58Cl[pGV2260J. A cepa EHA101[pEHA101] foi descrita por Hood et al. (Hood EE et al. (1996) J Bacteriol 168(3): 1291 a 1301), a cepa EHA105[pEHA105] por Hood et al.

• 10 (Hood et al. 1993, Transgenic Research 2, 208 a 218), a cepa , LBA4404[pAL4404] por Hoekema et al. (Hoekema et al. 1983, Nature 303,

179 a 181), a cepa C58Cl[pMP90] por Koncz e Schell (Koncz e Schell 1986, Mol. Gen. Genet. 204, 383 a 396) e a cepa C58Cl[pGV2260] por Deblaere et al. (Deblaere et al. 1985, Nucl. Acids Res. 13, 4777 a 4788).

A cepa agrobacteriana utilizada para a transformação compreende, além do.seu plasmídeo Ti abrandado, um plasmídeo binário com o T-DNA a ser transferido, que, como uma regra, compreende um gene para a seleção das células transformadas e o gene a ser transferido. Ambos os genes devem ser equipados com sinais de início e término transcricional e translacional. O plasmídeo binário pode ser transferido na cepa agrobacteriana por exemplo pela eletroporação ou outros métodos de transformação (Mozo &

Hooykaas 1991, Plant Mol. Biol. 16, 917 a 918). A co-cultura dos explantes vegetais com a cepa agrobacteriana é usualmente realizada durante dois ou três dias.

Uma variedade de vetores poderíam ou podem, ser usados. Em princípio, diferencia-se entre estes vetores que possam ser utilizados para a transformação mediada por agrobactéria ou agroinfecção, isto é, que compreendam as construções de recombinação ou o cassete de expressão, para a expressão da enzima DSBI dentro de um T-DNA, o que de fato permite

• · a integração estável do T-DNA no genoma vegetal. Além disso, vetores isentos de seqüência de borda podem ser utilizados, que podem ser transformados nas células vegetais por exemplo pelo bombardeamento de partícula, onde eles podem levar tanto à expressão transitória quanto á estável.

O uso de T-DNA para a transformação de células vegetais foi estudado e descrito intensivamente (EP 120516; Hoekema, Em: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Capítulo V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4: 1 a 46 e An et al., EMBO J. 4 (1985), 277 a 287). Vários vetores binários são conhecidos, alguns dos quais φ 10 são comercialmente disponíveis tais como, por exemplo, pBIN19 (Clontech , Laboratories, Inc. USA).

Para a transferir o DNA para a célula vegetal, explantes vegetais são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Partindo-se de material vegetal infectado (por exemplo seções de 15 folha, raiz ou haste, mas também protoplastos ou suspensões de células vegetais), plantas inteiras podem ser regeneradas usando um meio adequado que pode conter, por exemplo, antibióticos ou biocidas para selecionar células transformadas. As plantas obtidas podem ser depois tríadas na presença do DNA introduzido, neste caso a construção de recombinação ou o cassete de 20 expressão para a enzima DSBI de acordo com a invenção. Tão logo o DNA tenha integrado no genoma hospedeiro, o genótipo em questão é, como uma regra, estável e a inserção em questão também é encontrada nas gerações subsequentes. Como uma regra, o cassete de expressão integrado contém um marcador de seleção que confere uma resistência a um biocida (por exemplo 25 um herbicida) ou um antibiótico tal como canamicina, G 418, bleomicina, higromicina ou fosfinotricina e outros à planta transformada. O marcador de seleção permite a seleção de células transformadas (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81 a 84). As plantas obtidas podem ser cultivadas e hibridizadas na maneira habitual. Duas ou mais gerações devem ser cultivadas

• ίο

de modo a garantir que a integração genômica seja estável e hereditária.

Os métodos mencionados acima são descritos, por exemplo, em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, em: Transgenics Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993), 128 a 143 e em Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205 a 225). A construção a ser expressada é preferivelmente clonada em um vetor que seja adequado para a transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo pBinl9 (Bevan et al., Nucl. AcidsRes. 12(1984), 8711).

A transformação mediada por agrobactéria é melhor adaptada para células vegetais dicotiledôneas, ao passo que as técnicas de transformação direta são adequadas para qualquer tipo de célula.

As células transformadas, isto é, aquelas que compreendem o DNA integrado no DNA da célula hospedeira, pode ser selecionadas de células não transformadas se um marcador selecionável for parte do DNA introduzido. Um marcador pode ser, por exemplo, qualquer gene que seja capaz de conferir uma resistência a antibióticos ou herbicidas. As células transformadas que expressam um tal gene marcador são capazes de sobreviver na presença de concentrações de um antibiótico ou herbicida adequados que matam um tipo selvagem não transformado. Vários marcadores de seleção positivos e negativos são descritos acima. Os exemplos são o gene bar, que confere resistência ao herbicida fosfinotricina (Rathore KS et al., Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21(5): 871 a 884), o gene nptll, que confere resistência à canamicina, o gene hpt, que confere resistência à higromicina ou o gene EPSP, que confere resistência ao herbicida Glifosato.

Tão logo uma célula vegetal transformada foi gerada, uma planta inteira pode ser obtida usando métodos conhecidos pelo trabalhador habilitado. Por exemplo, culturas de calo são usadas como material de partida. A formação de broto e raiz pode ser induzida nesta biomassa celular ainda • ·

• ·

não diferenciada na maneira conhecida. Os brotos obtidos podem ser plantados e cultivados.

Também de acordo com a invenção estão as células, culturas de célula, partes - tais como, por exemplo, no caso de organismos vegetais . 5 transgênicos, raízes, folhas e outros - derivadas dos organismos transgênicos descritos acima e material de propagação transgênico (tais como sementes ou frutos).

As plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção que podem ser consumidas pelos seres humanos ou animais também φ 10 podem ser usadas como alimento ou gêneros alimentícios, por exemplo diretamente ou a seguir de processamento conhecido por si. Aqui, a supressão, por exemplo, de resistências a antibióticos e/ou herbicidas, como são freqüentemente introduzidas quando da geração das plantas transgênicas, faz sentido por razões de aceitação do consumidor, mas também de segurança 15 do produto.

Um outro assunto objeto da invenção diz respeito ao uso dos organismos transgênicos descritos acima de acordo com a invenção e as células, culturas celulares, partes - tais como, por exemplo, no caso de organismos vegetais transgênicos, raízes, folhas e outros - derivados deles e 20 material de propagação transgênico tais como sementes ou frutos, para a produção de alimentos ou gêneros alimentícios, produtos farmacêuticos ou produtos químicos finos. Aqui mais uma vez, a supressão, por exemplo, de resistências a antibióticos e/ou herbicidas é vantajosa por razões de aceitação do consumidor, mas também de segurança do produto.

Produtos químicos finos são entendidos como significando enzimas, vitaminas, aminoácidos, açúcares, ácidos graxos, sabores, aromas e corantes naturais e sintéticos amplamente usáveis. Especialmente preferida é a produção de tocoferóis e tocotrienóis e de carotenóides. O cultivo dos organismos hospedeiros transformados e a isolação dos organismos

hospedeiros ou do meio de cultura são realizados por métodos conhecidos pelo trabalhador habilitado. A produção de produtos farmacêuticos tais como, por exemplo, anticorpos ou vacinas, está descrita por Hood EE, Jilka JM. (1999) Curr Opin Biotechnol. 10(4): 382 a 386; Ma JK e Vine ND (1999) . 5 Curr Top Microbiol Immunol. 236: 275 a 292).

O sistema ou método de recombinação de acordo com a invenção além disso oferece vários usos vantajosos que não podem ser obtidos com os métodos de supressão descritos na técnica anterior. Vários exemplos de uso são descritos abaixo por via de exemplo, mas não por • 10 limitação:

1. A supressão simples de uma seqüência de ácido nucléico do

DNA cromossômico de um organismo:

Usando qualquer uma das seqüências de homologia A e B, as seqüências de ácido nucléico localizadas entre elas podem ser suprimidas. A 15 seqüência que é o resultado da recombinação das seqüências de homologia A e B permanece no genoma. O método é adequado por exemplo para remover, do DNA cromossômico, marcadores de seleção depois que um organismo transgênico, por exemplo uma planta transgênica, foi gerada. O método é mostrado esquematicamente nas Figs. 2 e 3, a Fig. 2 mostrando a variante 20 com uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a Fig. 3 mostrando a variante com duas seqüências de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA.

2. A supressão completa de seqüências de ácido nucléico heterólogas recombinantemente introduzidas do DNA cromossômico de um organismo:

Usando seqüências de homologia A e B, que são homólogas a certas seqüências do organismo, a construção de expressão pode ser introduzida no organismo pela recombinação homóloga. Usando o sistema ou • ·

método de recombinação de acordo com a invenção, as seqüências de ácido nucléico localizadas entre as seqüências de homologia podem ser suprimidas. A recombinação homóloga induzida entre as seqüências de homologia A e B restaura a seqüência original. Toda a construção é removida do DNA

- 5 cromossômico. O método é adequado por exemplo para remover marcadores de seleção do DNA cromossômico depois que uma planta transgênica foi gerada. Além disso, o sistema ou método de acordo com a invenção são adequados para expressar certas proteínas transitoriamente de modo a obter um efeito vantajoso e depois desligá-las usando uma expressão ou atividade φ 10 de enzima DSBI induzidas removendo-se irreversivelmente o gene em , questão do genoma. O método é mostrado esquematicamente na Fig. 4, a variante com duas seqüências de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA sendo mostrada. O sistema também pode ser realizado usando uma seqüência de reconhecimento; entretanto, dois 15 sítios de clivagem são vantajosos no caso de inserções maiores entre as seqüências de homologia A e B visto que isto permite que a eficácia da supressão e a eficácia da recombinação homóloga sejam aumentadas ainda mais (outras seqüências de reconhecimento podem ser localizadas dentro da região de seqüência a ser suprimida).

3. A ativação de gene induzida pela supressão direcionada a sítio de seqüências de ácido nucléico:

Usando seqüências de homologia A e B, cuja recombinação homóloga restaura por exemplo uma fase de leitura aberta completa de uma proteína ou de um promotor funcional, a expressão indutível de proteínas alvo 25 pode ser realizada como uma função da presença da enzima DSBI. Usando o sistema ou método de recombinação de acordo com a invenção, as seqüências de ácido nucléico localizadas entre as seqüências de homologia podem ser suprimidas. O método é mostrado esquematicamente nas Figs. 5 e 6, a Fig. 6 mostrando uma forma de realização específica do método geral mostrado na

Fig. 5 em que a construção de recombinação é inserida em um gene endógeno em um ponto no tempo mais no princípio por meio da recombinação homóloga, permitindo assim que este gene seja indutivelmente ativado como uma função da presença da enzima DSBI. A Fig. 7a ilustra o sistema de 5 ativação de gene com referência a um exemplo de uso específico onde o gene da β-glicuronidase (GUS) é reconstituído usando o sistema ou método de acordo com a invenção, permitindo que uma reação de cor ocorra (ver a descrição para a Fig. 7a e Exemplos).

4. Sistema facilmente selecionável para a supressão de uma φ 10 seqüência de ácido nucléico do DNA cromossômico de um organismo:

Em uma forma de realização preferida, a construção de recombinação compreende um marcador de seleção positivo e um negativo (e, se apropriado, outras seqüências de ácido nucléico a serem suprimidas) de tal modo que ambos os marcadores sejam suprimidos quando as rupturas de fita 15 dupla são induzidas. Um tal sistema é mostrado nas Figs. 8 e 9 (A). Além disso, o cassete de expressão para a enzima DSBI também pode estar presente entre as seqüências de homologia (Fig. 10 (B)), a expressão preferivelmente sendo efetuada sob o controle de um promotor indutivel (Pi) (por exemplo: Aoyama T e Chua NH (1997) Plant J 11: 605 a 612; Caddick MX et al.

(1998) Nat. Biotechnol 16: 177 a 180). Como já descrito, outras seqüências de < ácido nucléico podem estar presentes (Fig. 9 (C)).

A expressão da enzima DSBI leva em ambos os casos à eliminação das seqüências de DNA localizadas entre as duas seqüências de reconhecimento e à recombinação das seqüências homólogas. Visto que as 25 células simultaneamente perdem um marcador de seleção negativo, as células com uma supressão bem sucedida pode ser identificada por meio da seleção (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40: 223 a 235).

No caso de células vegetais, por exemplo, as células resultantes podem ser usadas para regenerar e propagar as plantas inteiras

correspondentes, que agora não mais contém qualquer dos genes marcadores.

5. Manipulação genética do genoma hospedeiro:

O sistema ou método de recombinação de acordo com a invenção podem ser usados para modificações in situ do genoma hospedeiro.

- 5 Assim, por exemplo, uma seqüência de homologia pode já existir endogenamente no genoma. Depois da inserção da segunda seqüência de homologia, que está ligada com uma seqüência de reconhecimento da enzima DSBI, qualquer uma das seqüências reguladoras ou codificadoras localizadas entre as seqüências de homologia A e B são eliminadas do genoma.

φ 10 Ao mesmo tempo, é concebível que a construção de recombinação abrange as seqüências reguladoras ou codificadoras que são eliminadas do organismo uma vez que a supressão tenha ocorrido. Assim, é possível por exemplo regular transitoriamente um gene endógeno em uma maneira direcionada a sítio.

Em uma outra forma de realização preferida, a eficácia do sistema de recombinação é aumentada pela combinação com sistemas que promovam a recombinação homóloga. Tais sistemas são descritos e abrangem, por exemplo, a expressão de proteínas tais como RecA ou o tratamento com inibidores de PARP. Foi demonstrado que a recombinação homóloga intracromossômica em plantas de tabaco pode ser aumentada usando-se inibidores de PARP (Puchta H et al. (1995) Plant J. 7: 203 a 210). Usando estes inibidores, a taxa de recombinação homóloga nas construções de recombinação depois da indução da ruptura da fita dupla do DNA específica de seqüência e assim a eficácia da supressão das seqüências de transgene pode ser aumentada ainda mais. Vários inibidores de PARP podem ser utilizados para este propósito. Preferivelmente abrangidos são os inibidores tais como 3-amino-benzamida, 8-hidróxi-2-metilquinazolin-4-ona (NU1025), 1,1 lb-diidro-[2H]benzopirano[4,3,2-de]isoquinolin-3-ona (GPI 6150), 5-amino-isoquinolinona, 3,4-diidro-5-[4-(I -piperidinil)butóxi]-1 (2H) isoquinolinona ou os compostos descritos na WO 00/26192, WO 00/29384, WO 00/32579, WO 00/64878, WO 00/68206, WO 00/67734, WO 01/23386 e WO 01/23390.

. * Além disso, foi possível aumentar a freqüência de várias

- 5 reações de recombinação homóloga em plantas expressando-se o gene RecA da E. coli (Reiss B et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93(7): 3094 a 3098). Também, a presença da proteína muda a relação entre o reparo de DSB homólogo e ilegítimo em favor do reparo homólogo (Reiss B et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97(7): 3358 a 3363). Referência também pode ser φ 10 feita aos métodos descritos na WO 97/08331 para aumentar a recombinação . homóloga em plantas. Um aumento adicional na eficácia do sistema de recombinação podería ser obtido pela expressão simultânea do gene RecA ou outros genes que aumentam a eficácia da recombinação homóloga (Shalev G et al. (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96(13): 7398 a 7402). Os sistemas estabelecidos acima para promover a recombinação homóloga também podem ser vantajosamente utilizados em casos onde a construção de recombinação deva ser introduzida em uma maneira direcionada a sítio no genoma de um organismo eucariótico por meio da recombinação homóloga.

Seqüências ^20 l.SEQIDNO:l

- Seqüência de ácido nucléico para a endonuclease residente IScel.

2. SEQ ID NO: 2

Seqüência de proteína para a endonuclease residente I-Scel.

3. SEQ ID NO: 3

Seqüência de ácido nucléico para a proteína de fusão da endonuclease residente I-ChuI e a seqüência de localização nuclear do terminal N.

4. SEQ ID NO: 4 ···

Seqüência de proteína para a proteína de fusão da endonuclease residente I-ChuI e a seqüência de localização nuclear de terminal N.

5. SEQ ID NO: 5

Seqüência de ácido nucléico para a proteína de fusão da endonuclease residente I-Crel e a seqüência de localização nuclear de terminal N.

6. SEQ ID NO: 6

Seqüência de proteína para a proteína de fusão da φ 10 endonuclease residente I-Crel e a seqüência de localização nuclear de terminal N.

7. SEQ ID NO: 7

Seqüência de ácido nucléico para a proteína de fusão da endonuclease residente I-Cpal e a seqüência de localização nuclear de 15 terminal N.

8. SEQ ID NO: 8

Seqüência de proteína para a proteína de fusão da endonuclease residente I-Cpal e a seqüência de localização nuclear de terminal N.

• 20 9. SEQ ID NO: 9

- Seqüência de ácido nucléico para a proteína de fusão da endonuclease residente I-CpaII e a seqüência de localização nuclear de terminal N.

10. SEQIDNO: 10

Seqüência de proteína para a proteína de fusão da endonuclease residente I-CpaII e a seqüência de localização nuclear de terminal N.

11. SEQ ID NO: 11: iniciador de oligonucleotídeo OPN1

5’-CGG CTC GAG CTA CGG GGA CGA TTT CTT TTT

12. SEQ ID NO: 12: iniciador de oligonucleotídeo OPN2 ····

TTC AC-3’

5’-CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG

GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG

AAA AAG AGA AAG GTT ATC AT GAA TAC AAA ATA TAA TAA

AGA GTT CTT ACT C-3’

13. SEQ ID NO: 13: iniciador de oligonucleotídeo OPN3

5’-CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG

GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG • 10

AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG GAC ATT AAT CCT CAA TGG

ATT ACA GG-3’

14. SEQ ID NO: 14: iniciador de oligonucleotídeo OPN4

5’-CGG CTC GAG TTA CTC GCC AGT TTC TTC AAA

ACG-3’

15. SEQ ID NO: 15: iniciador de oligonucleotídeo OPN5

5’-CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG

GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG

AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG ACC GAT TCT AAA TCT AGA «20

AAC AAC-3’

16. SEQ ID NO: 16: iniciador de oligonucleotídeo OPN6

5’-CGG CTC GAG CTA AAG GTG GCC TTT ATT GCC

ATC AG-3’

17. SEQ ID NO: 17: iniciador de oligonucleotídeo OPN7

5’-CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG

GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG

AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG TCA TTA ACA CAA CAA CAA

AAAGAC-3’

18. SEQ ID NO: 18: iniciador de oligonucleotídeo OPN8

5’-CGG CTC GAG CTA AAG GTG GCC TTT ATT GCC

CTAC-3’

ATC AG-3’

19. SEQ ID NO: 19: iniciador de oligonucleotídeo OPN9 5’-CGG CTC TAG AGC GGC CGC CTA GGG ATA ACA

GGG TAA TAG AAT CCC ACA AAA ATC TGA GCT TAA CAG 3’

20. SEQ ID NO: 20: iniciador de oligonucleotídeo ΟΡΝΙΟ

5’-CGG CTC TAG ACT ATT ACC CTG TTA TCC CTA

GGC CCG ATC TAG TAA CAT AGA TGA CAC CGC GCG CG 3’

21. SEQ ID NO: 21: iniciador de oligonucleotídeo OPN11

5’- CGG AAG CTT CGT CAC CAA TCC CAA TTC GAT

22. SEQ ID NO: 22: iniciador de oligonucleotídeo OPN12

5’- CGG AAG CTT CCA CTT GCA AAG TCC CGC TAG

23. SEQ ID NO: 23: iniciador de oligonucleotídeo OPN13

5’- CGG AAG CTT CGT CAC CAA TCC CAA TTC GAT

24. SEQ ID NO: 24: iniciador de oligonucleotídeo OPN14

5’- CGG AAG CTT CCA CTT GCA AAG TCC CGC TAG

25. SEQ ID NO: 25: iniciador de oligonucleotídeo OPN15

5’- CTA GTA CAA AAC GTC GTG AGA CAT TTT AAT

CTG AAG GTT TGG CAC CTC GAT GTC GGC TCA TC-3’

26. SEQ ID NO: 26: iniciador de oligonucleotídeo OPN16 5’-CTA GGA TGA GCC GTC ATC GAG GTG CCA AAC

CTT CAG ATT AAA ATG TCT CAC GAC GTT TTG TA-3 ’

27. SEQ ID NO: 27: iniciador de oligonucleotídeo OPN17 5’-CTA GTC CGA AAA CGC CGT GAG ACA TAT TGG

TTA CGA TCC TAA GGT AGC GAA ATT CAC CCG GTA ACT CTG

TGC CAG-3’

TGC

CTA C-3’

TGC

28. SEQ ID NO: 28: iniciador de oligonucleotídeo OPN18

5’-CTA GCT GGC ACA GAG TTA CCG GGT GAA TTT • ·· ·· •· · · •· · •· · • ·· • ·· ····

CGC TAC CTT AGG ATC GTA ACC AAT ATG TCT CAC GGC GTT

TTC GGA-3’

29. SEQ ID NO: 29: seqüência de localização nuclear NLS1 N-Pro-Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Val-C

30. SEQ ID NO: 30: seqüência de localização nuclear NLS2 N-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-C (SEQ ID NO: 30) Figuras

As seguintes abreviações se aplicam às Figuras no geral:

Hl: Seqüência de homologia A

H2: Seqüência de homologia B

Hl/2: Seqüência como o resultado da recombinação homóloga de Hl e H2

Sl: Primeira seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA

S2: Segunda seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA

E: enzima DSBI

P: Promotor ou outro elemento de controle genético

N: Outra seqüência de ácido nucléico

NS: Marcador de seleção negativo

PS: marcador de seleção positivo

Tl: Parte frontal, por exemplo de um gene ou fase de leitura aberta

T2: parte traseira, por exemplo de um gene ou fase de leitura aberta

STOP: Interrupção de um gene ou fase de leitura aberta, por exemplo, pelos códons de parada ou mudanças de fase de leitura.

• · · •· •· •· •· • · ·

Fig. 1: Diagrama do princípio da invenção

V	As seqüências no genoma podem ser eficientemente eliminadas quando elas são flanqueadas pelas seqüências de homologia H1 e
	H2 e quando um sítio de divagem (Sl) para uma enzima DSBI está
5	localizado entre as seqüências de homologia. Devido à ação da enzima DSBI (E) neste cassete de recombinação (H1-S1-H2), as rupturas de fita dupla são formadas no sítio de divagem Sl e as seqüências localizadas entre H1 e H2 são eliminadas. Fig. 2: Forma de realização preferida
• 10 * *	Seqüências - no presente caso por exemplo um cassete de expressão que consiste de um promotor (P) e uma outra seqüência de ácido nucléico (N) a ser expressada (por exemplo um marcador de seleção) - podem ser eficientemente eliminadas do DNA cromossômico quando elas são flanqueadas pelas seqüências de homologia H1 e H2 e quando um sítio de
15	divagem (Sl) para uma enzima DSBI está localizado entre as seqüências de homologia. Devido à ação da enzima DSBI (E) neste cassete de recombinação (H1-S1-P-N-H2), rupturas de fita dupla são formadas no sítio de divagem Sl e as seqüências localizadas entre H1 e H2 são eliminadas. O sítio de divagem S1 também pode estar localizado atrás ou dentro do cassete de expressão.
W20	Fig. 3: Forma de realização preferida Seqüências - no presente caso por exemplo um cassete de expressão que consiste de um promotor (P) e uma outra seqüência de ácido nucléico (N) a ser expressada (por exemplo um marcador de seleção) - podem ser particular e eficientemente eliminadas do DNA cromossômico quando
25	elas são flanqueadas pelas seqüências de homologia H1 e H2 e quando em cada caso um sítio de divagem (Sl e S2) para uma enzima DSBI está localizado antes e depois da seqüência de ácido nucléico a ser suprimida. Devido à ação da enzima DSBI (E) neste cassete de recombinação (Hl-Sl-PN-S2-H2), rupturas de fita dupla são formadas nos sítios de divagem S1 e S2

e as seqüências localizadas entre H1 e H2 são eliminadas.

Fig. 4: Forma de realização preferida

Seqüências - no presente caso por exemplo um cassete de expressão que consiste de um promotor (P) e uma outra seqüência de ácido nucléico (N) a ser expressada (por exemplo um marcador de seleção) podem ser eliminadas virtualmente sem traço do DNA cromossômico quando a construção de recombinação que as compreendem foi previamente inserida no genoma hospedeiro, por exemplo pela recombinação homóloga. Em assim o fazendo, o gene que consiste dos segmentos de seqüência Tl, Hl/2 e T2 é 10 interrompido. A construção de recombinação é flanqueada por duas partes do gene interrompido (Tl-Hl ou H2-T2), a parte intermediária (H1 ou H2) tendo sido duplicada de modo a permitir que a recombinação homóloga ocorra. A ação da enzima DSBI (E) nos sítios de divagem (S1 e S2) induz rupturas de fita dupla e induz a recombinação homóloga entre as seqüências de 15 homologia H1 e H2, por meio da qual primeiramente as seqüências localizadas entre H1 e H2 são suprimidas e em segundo lugar o gene original é restaurado.

Fig. 5: Forma de realização preferida

Seqüências de ácido nucléico (no presente caso um gene com a 20 seqüência T1-H1/2-T2 sob o controle de um promotor P) pode ser expresso indutivelmente reconstituindo-se o gene inteiro apenas pela aplicação do sistema de recombinação. O gene, que consiste dos segmentos de seqüência Tl, Hl/2 e T2 é inativado, por exemplo pela inserção de códons de parada ou outras interrupções da fase de leitura dentro da construção de recombinação.

A construção de recombinação é flanqueada por duas partes do gene interrompido (Tl-Hl ou H2-T2), a parte do meio (H1 ou H2) tendo sido duplicada de modo a permitir que a recombinação homóloga ocorra. A ação da enzima DSBI (E) nos sítios de divagem (SI e S2) induz rupturas de fita dupla e induz a recombinação homóloga entre as seqüências de homologia H1

e H2, por meio da qual primeiramente as seqüências localizadas entre H1 e H2 são suprimidas e em segundo lugar o gene inteiro é restaurado.

Fig. 6: Forma de realização preferida

A Figura mostra um método que é idêntico àquele descrito na

- 5 Fig. 5, apenas que no presente caso um gene endógeno deve ser ativado em uma maneira direcionada a sítio pela introdução da construção de recombinação por exemplo por meio da recombinação homóloga.

Fig. 7a: Forma de realização exemplar

A Figura ilustra uma forma de realização específica do método φ 10 descrito na Fig. 6. Uma construção de recombinação é introduzida por intermédio da transfecção mediada pela agrobactéria. Flanqueada pelas seqüências da borda direita e esquerda (RB e LB, respectivamente), a construção compreende a fase de leitura interrompida do gene GUS (βglicuronidase) sob o controle do promotor 35S (P) e o terminador da nopalina 15 sintase (nos). A região intermediária do gene GUS (U) foi duplicada e constitui as seqüências de homologia A e B. Localizado entre estas seqüências está o gene codA como marcador de seleção negativo sob o controle do promotor 35S do Vírus Mosaico da Couve-flor (CaMV) e o terminador da nopalina sintase (nos), flanqueado por duas seqüências de reconhecimento da 20 enzima DSBI (SI e S2). A construção de recombinação além disso adicionalmente compreende o gene BAR sob o controle do promotor 35S (P) e do terminador 35S, como marcador de seleção positivo.

A Fig. 7a ilustra o aparecimento de rupturas de fita dupla e a recombinação homóloga entre as seqüências U homólogas, realizada pela 25 ação da enzima DSBI, por meio da qual primeiramente as seqüências localizadas entre as seqüências U homólogas são suprimidas e em segundo lugar o gene GUS é restaurado. O comprimento do fragmento Acc65I é assim reduzido de 7,3 kb para 3,7 kb.

Fig. 7b: Mostra o mesmo sistema como descrito na Fig. 7a. A

Fig. 7a ilustra o aparecimento de rupturas de fita dupla como o resultado da ação da enzima DSBI. Ao contrário da Fig. 7a, nenhuma recombinação »* homóloga ocorre no presente caso, mas a recombinação ilegítima pela junção de extremidade não homóloga. Enquanto a região entre SI e S2 é suprimida devido aos dois sítios de divagem, o gene GUS não é restaurado. O comprimento do fragmento Acc65I é assim reduzido de 7,3 kb para 4,4 kb.

Fig. 7c: A Figura é uma outra representação dos dois produtos finais dos processos descritos na Fig. 7a e Fig. 7b.

A: Resultado da recombinação homóloga; o fragmento Acc65I

tem um comprimento de 3,7 kb; o tamanho do fragmento amplificado com o auxílio dos iniciadores OPN13 e OPN14 (mostrados pelas setas) é de 0,7 kb.

B: Resultado da recombinação ilegítima (junção de extremidade não homóloga); o fragmento Acc65I tem um comprimento de 4,4 kb; o tamanho do fragmento amplificado com o auxílio dos iniciadores 15 OPN13 e OPN14 (mostrados pelas setas) é de 1,4 kb.

Fig. 8: Forma de realização preferida

Os cassetes de recombinação vantajosamente abrangem tanto um marcador de seleção positivo quanto um negativo (PS e NS,

respectivamente), em cada caso sob o controle de um promotor. O marcador de seleção positivo é útil para facilitar e detectar a introdução da construção no genoma. O marcador de seleção negativo é útil para detectar a supressão da construção do genoma. Ambos os marcadores são eliminados eficientemente do DNA cromossômico quando eles são flanqueados pelas seqüências de homologia H1 e H2 e quando em cada caso um sítio de divagem (SI e S2, respectivamente) para uma enzima DSBI está localizado antes e/ou depois da seqüência de ácido nucléico a ser suprimida. Devido ao efeito da enzima DSBI (E) neste cassete de recombinação, rupturas de fita dupla aparecem nos sítios de divagem SI e/ou S2 e as seqüências localizadas entre H1 e H2 são depois eliminadas.

O efeito de uma das enzimas DSBI mencionadas acima realiza rupturas de fita dupla direcionadas a sítio e induz a recombinação homóloga entre as seqüências U homólogas, por meio da qual primeiramente as seqüências localizadas entre as seqüências U homólogas são suprimidas e em 5 segundo lugar o gene GUS é restaurado.

Fig. 9: Sistemas facilmente selecionáveis para a supressão de uma seqüência de ácido nucléico do DNA cromossômico de um organismo. As construções compreendem um marcador de seleção positivo (PS) e marcador de seleção negativo (NS), em cada caso sob o controle de um 10 promotor (P).

(B) adicionalmente compreende um cassete de expressão para a enzima DSBI, a expressão preferivelmente ocorrendo sob o controle de um promotor indutível (Pi).

(C) Outras seqüências de ácido nucléico podem estar 15 presentes.

A expressão da enzima DSBI leva em todos os casos à eliminação das seqüências de DNA localizadas entre as duas seqüências de reconhecimento e para a recombinação das seqüências homólogas. Visto que as células simultaneamente perdem um marcador de seleção negativo, as 20 células onde a supressão bem sucedida tenha ocorrido podem ser identificadas por meio da seleção (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40: 223 a 235).

Fig. 10: A Figura ilustra as duas construções (construção SI (A) e construção SD (B)) que foram usadas para provar que a recombinação homóloga pelas rupturas de fita dupla pode ser induzida com diferentes 25 enzimas de restrição. As construções são introduzidas por intermédio da transfecção mediada pela agrobactéria. As construções, que são flanqueadas pelas seqüências das bordas direita e esquerda (RB e LB, respectivamente) contêm a fase de leitura interrompida do gene GUS gene (β-glicuronidase) sob o controle do promotor 35S (P) e do terminador da nopalina sintase (nos).

A região intermediária do gene GUS (U) foi duplicada e constitui as seqüências de homologia A e B. Localizados entre estas seqüências estão, no caso da construção SI (A), as seqüências de reconhecimento das enzimas DSBI I-Scel, I-Cpal, I-CpaII e I-Crel, e, no caso da construção SD (B), a - 5 seqüência de reconhecimento da enzima I-Chul. As construções de recombinação além disso adicionalmente contêm o gene BAR sob o controle de um promotor (P) como marcador de seleção positivo.

Fig. 11: Análise histoquímica representativa de calos de tabaco obtida depois da indução de rupturas de fita dupla. Uma coloração azul (aqui φ 10 mostrada como coloração escura) indica a expressão do gene da βglicuronidase e assim a eliminação do marcador de seleção pela recombinação homóloga. O azul (colorações escuras) pode ser observado no caso dos calos nos reservatórios A2, A5, A6, B2, Cl, C6 e D2.

Fig. 12: Análise de PCR para a detecção da recombinação 15 homóloga. A PCR no DNA de calos de tabaco usando os iniciadores OPN13 e OPN14.

O produto da PCR (tamanho de 0,7 kb) que indica a recombinação homóloga pode ser observado nas traços 1, 2 e 3. Os calos correspondentes foram azul a seguir do tingimento histoquímico e as faixas de 20 PCR correspondentes foram seqüenciadas de modo a demonstrar que a fase • de leitura aberta (ORF) da β-glicuronidase foi de fato restaurada pela recombinação homóloga.

Traços 4 e 5: produtos de PCR (1,4 kb) de calos que não viraram para azul no tingimento, onde o transgene foi eliminado pela junção 25 de extremidade não homóloga.

Fig. 13: Southem blots que indicam a eliminação completa da seqüência de transgene em questão.

Os traços de manchas de A a D compreendem em cada caso:

Traço Linha Descrição

·· ·· • 4 »

A • · · · ♦

1	GU.C.USB 1	Linha original
	2	GU.C.USB 1-61	Junção de extremidade não homóloga
	3	GU.C.USB 1-83	Recombinação homóloga
	4	GU.C.USB 3	Linha original
5	5	GU.C.USB 3-1	Junção de extremidade não homóloga
	6	GU.C.USB 3-3	Recombinação homóloga
	7	GU.C.USB 7	Linha original
	8	GU.C.USB 7-14	Junção de extremidade não homóloga
	9	GU.C.USB 7-34	Recombinação homóloga
10		A: DNA digerido	com HindIII hibridizado com uma sonda
	específica de β-glicuronidase.
		B: DNA digerido	com HindIII hibridizado com uma sonda
	específica de codA.
		C: DNA digerido	com Acc65I hibridizado com uma sonda
15	específica de β-glicuronidase.

hibridizado sonda

Acc65I com com uma

D: DNA digerido específica de codA.

A análise demonstra que, a seguir da indução de rupturas de fita dupla de DNA por meio de expressão da enzima de restrição, não apenas a recombinação homóloga (traços 3, 6 e 9), mas também a recombinação ilegítima (traços 2, 5 e 8) podem ocorrer, a seqüência de transgene (codA) localizada entre os sítios de restrição de divagem sempre foi eliminada do genoma vegetal.

Exemplos

Métodos gerais:

A síntese química de oligonucleotídeos pode ser efetuada por exemplo na maneira conhecida usando o método da fosfoamidita (Voet, Voet, 2^a edição, Wiley Press Nova Iorque, páginas 896 e 897). As etapas de clonagem realizada para os propósitos da presente invenção, tais como, por

·¹⁰ exemplo, clivagens de restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, a transferência de ácidos nucléicos para membranas de nitrocelulose e náilon, a ligação de fragmentos de DNA, a transformação de células de E. coli, culturas bacterianas, a propagação de fagos e a análise de seqüência de DNA recombinante são realizadas como descrito por Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969309-6. Moléculas de DNA recombinante foram seqüenciadas usando um seqüenciador de DNA de fluorescência a laser ALF Express (Pharmacia, Upsala, Suécia) seguindo o método de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463 a 5467).

Exemplo 1: Clonagem das endonucleases residentes

As fases de leitura aberta (ORFs) das endonucleases residentes I-Crel (Wang J et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 3767 a 3776), I-ChuI (Cote V et al. (1993) Gene 129: 69 a 76), I-Cpal (Turmel M et al. (1995a) Nucleic Acids Res 23: 2519 a 2525) e I-CpaII (Turmel M et al. (1995b) Mol. Biol. Evol. 12, 533 a 545) foram clonadas a partir das cepas de Chlamydomonas correspondentes.

Para garantir ótima tradução do gene, as ORFs das endonucleases foram ligadas à seqüência líder de um vírus vegetal (gene V de CaMV, como tem mostrado ser útil no caso de I-Scel; Puchta H (1993) Nucl Acids Res 21: 5034 a 5040). Também, uma seqüência de localização nuclear (NLS2; SEQ ID NO: 30) foi colocada em frente das ORFs de modo a transportar eficientemente a proteína para o local pretendido de ação. Os dois elementos (seqüência líder e seqüência de localização nuclear) foram introduzidos por intermédio da PCR por meio dos iniciadores de oligonucleotídeo usados.

Para isolar as fases de leitura aberta (ORFs) das endonucleases de Chlamydomonas, as culturas de algas Chlamydomonas reinhardtii/Smith (cepa n^s 11-32b), Chlamydomonas applanata/Lucksch (cepa n°: 11-9) e

Chlamydomonas segris/YAng (cepa n^a: 9.83) foram obtida da coleção de cultura de alga em Gõttingen (Universidade de Gõttingen, ficologia experimental e coleção de cultura de algas, Albrecht-von-Haller Institute for Plant Sciences, Untere Karspüle 2, D-37073 Gõttingen). As culturas foram

- 5 cultivadas com o auxílio de uma cultura agitada em meio MS e o DNA foi obtido usando o Conjunto DNeasy Plant Maxi (Qiagen, Hilden).

A ORF de I-Crel (Banco de genes Acesso N²: XO 1977) foi amplificada a partir de uma amostra da cultura de alga 11-32b de Chlamydomonas reinhardtii/Srmth com o auxílio dos oligonucleotídeos φ 10 OPN1 e OPN2 (SEQ ID NOs: 11 e 12).

OPN1 (SEQIDNO: 11):

5’-CGG CTC GAG CTA CGG GGA CGA TTT CTT TTT TTC AC-3’

OPN2 (SEQIDNO: 12):

5’- CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG

GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC AT GAA TAC AAA ATA TAA TAA AGA GTT CTT ACTC3’ μΐ (correspondentes a aproximadamente 100 ng de DNA) da preparação de DNA foram utilizados na reação de PCR. Os seguintes foram

- combinados em um volume total de 50 μΐ de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies):

μΐ 10X tampão de PCR [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mMKCl]

1,5 μΐ pgCl₂50 mM μΐ de mistura de dNTP 10 mM (10 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) μΐ de iniciador OPN1 (10 mM) μΐ de iniciador OPN2 (10 mM) ·¹⁰ * 20

0,4 μΐ de Taq DNA polimerase (5 U/ml) μΐ de preparação de DNA

38,1 μΐ de água destilada autoclavada

A mistura de reação é coberta com aproximadamente 50 μΐ de óleo de silicona e submetida ao seguinte programa de temperatura (Thermocycler: MWG Biotech Primus HT; MWG Biotech, Alemanha):

ciclo de 180 segundos a 95°C ciclos de 60 segundos a 92°C, 60 segundos a 54°C e 3 minutos a 72°C ciclo de 5 minutos a 72°C.

O fragmento de PCR foi purificado por intermédio da eletroforese em gel de agarose usando o Conjunto de Extração em Gel QIAquick® (Qiagen, Hilden, Alemanha) e clonado no vetor pGEM-T Easy (Promega, Madison, USA). Em seguida, uma análise de seqüência é realizada usando o Seqüenciador de DNA ALF-Express (Pharmacia, Upsala, Suécia). A seqüência é mostrada na SEQ ID NO: 5.

A clonagem da ORF de I-Cpal a partir da cultura de alga 9.83 de Chlamydomonas segrislYÃng (Banco de genes Acesso N°: L36830) foi realizada de modo análogo à descrição dada para I-Crel. Os oligonucleotídeos OPN3 e OPN4 foram usados para a PCR. A seqüência é mostrada na SEQ ID NO: 7.

OPN3 (SEQIDNO: 13):

5’-CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG GAC ATT AAT CCT CAA TGG ATT ACA GG-3’

OPN4 (SEQ ID NO: 14):

5’-CGG CTC GAG TTA CTC GCC AGT TTC TTC AAA

ACG-3’ • · ···· ··

A clonagem da ORF de I-CpaII também foi realizada de modo análogo como descrito para I-Crel (Banco de genes Acesso N^s: L39865). Uma amostra da cultura de alga 9.83 de Chlamydomonas segris/YAng foi usada para este propósito. Os oligonucleotídeos OPN5 e OPN6 foram usados 5 para a PCR. A seqüência é mostrada na SEQ ID NO: 9.

OPN5 (SEQIDNO: 15):

5’-CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG

GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG

AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG ACC GAT TCT AAA TCT AGA φ 10 AACAAC-3’

OPN6 (SEQ ID NO: 16):

5’-CGG CTC GAG CTA AAG GTG GCC TTT ATT GCC

ATC AG-3’

A clonagem da ORF de I-ChuI a partir da cultura de alga 11-9 15 de Chlamydomonas applanata/Lucksch (Banco de genes Acesso N°: L06107) foi realizada de modo análogo à descrição dada para I-Crel. Os oligonucleotídeos OPN7 e OPN8 foram usados para a PCR. A seqüência é mostrada na SEQ ID NO: 3.

OPN7 (SEQIDNO: 17):

5’-CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG

GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG

AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG TCA TTA ACA CAA CAA CAA

AAAGAC-3’

OPN8 (SEQIDNO: 18):

5’-CGG CTC GAG CTA AAG GTG GCC TTT ATT GCC

ATC AG-3’)

A ORF das endonucleases residentes individuais (com o sinal de localização nuclear) foi em cada caso excisada do vetor pGEM-T Easy por meio da digestão de restrição com Sall, purificada pela eletroforese em gel e

• ·

»	em cada caso clonada no sítio de clivagem de restrição Sall d vetor binário pBinAR (Hõfgen e Willmitzer (1990) Plant Science 66: 221 a 230). A expressão das enzimas individuais ocorre sob o controle do promotor 35S e
» 5	do terminador da octopina sintase. O vetor de expressão de I-Scel binário pCIScel (Puchta H et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 5055 a 5060) contém uma ORF IScel sintética sob o controle do promotor 35S de CaMV (Puchta H et al. (1993) Nucl Acids Res 21: 5034 a 5040) entre as bordas de T-DNA. Todos os cinco plasmídeos foram multiplicados na E. coli,
• 10	purificados por meio do conjunto QIAfilter Plasmid Midi (Qiagen, Hilden) e transferidos na cepa agrobacteriana C58 por meio da eletroporação. Exemplo 2: Geração da construção pGU.I.USB O plasmídeo pGU.US (Tinland B et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 8000 a 8004) foi usado para construir os substratos de
15	recombinação. Dentro da região de T-DNA, o plasmídeo contém duas metades que se sobrepõe do gene da β-glicuronidase (GUS) com uma sobreposição de 557 pares de base. Um gene da higromicina é integrado em um sítio de clivagem Xbal único entre as seqüências GUS.
φ 20	Em uma primeira etapa, o gene BAR junto com as seqüências promotora e terminadora foi excisado do vetor pRC (Puchta H et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: 5055 a 5060) na forma de um fragmento HindIII isolado, separado da seqüência de vetor por intermédio da eletroforese em gel de agarose, excisado do gel, isolado com o auxílio do Conjunto de Extração em Gel QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemanha) e em seguida inserido no
25	sítio de clivagem HindIII único de pGU.US. Para esta finalidade, o vetor pGU.US foi previamente cortado com HindIII e desfosforilado com alcalino fosfatase (alcalino fosfatase intestinal de bezerro (CIP), New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha) de modo a impedir a recircularização. O vetor resultante é denominado pGU.US-BAR.

• ·

	No vetor ρΝΕ3 (Stougaard J (1993) Plant J 3: 755 a 761), ο sítio de divagem Xbal foi primeiro removido por uma reação de
•	preenchimento com Klenow. A fase de leitura aberta (ORF) da citosina desaminase do gene marcador de seleção negativo (codA) sob o controle do
- 5	promotor 35S do Vírus Mosaico da Couve-flor (CaMV) e o terminador da nopalina sintase (nos) foi amplificado a partir do vetor pNE3-XBA resultante por meio da PCR usando o iniciador de oligonucleotídeos ONP9 (SEQ ID NO: 16) e ONPIO (SEQ ID NO: 17). Devido aos iniciadores de oligonucleotídeo OPN9 e ΟΡΝΙΟ usados, em cada caso um sítio de divagem
·10	I-Scel (enfatizado em negrito nas seqüências estabelecidas abaixo) e um sítio de divagem Notl ou Xbal foram adicionados às duas extremidades do amplificado. OPN9 (SEQIDNO: 19): 5’-CGG CTC TAG AGC GGC CGC CTA GGG ATA ACA
15	GGG TAA TAG AAT CCC ACA AAA ATC TGA GCT TAA CAG 3 ’ ΟΡΝΙΟ (SEQID NO: 20): 5’-CGG CTC TAG ACT ATT ACC CTG TTA TCC CTA GGC CCG ATC TAG TAA CAT AGA TGA CAC CGC GCG CG 3’
20 4»	2 μΐ (correspondentes a aproximadamente 100 ng) de uma preparação plasmídica de pNE3-XBA foram utilizados para a reação de PCR. Os seguintes foram combinados em um volume total de 50 μΐ de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies): 5 μΐ de 10X tampão de PCR [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mMKCl]
25	1,5 μΐ de pgCh a 50 mM 1 μΐ de mistura de dNTP 10 mM (10 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) 1 μΐ de iniciador OPN1 (10 mM) 1 μΐ de iniciador OPN2 (10 mM)

0,4 μΐ de Taq DNA polimerase (5 U/ml) μΐ de preparação plasmídica de pNE3-XBA

38,1 μΐ de água destilada autoclavada

A mistura de reação é coberta com aproximadamente 50 μΐ de óleo de silicona e submetida ao seguinte programa de temperatura (Thermociclor: MWG Biotech Primus HT; MWG Biotech, Alemanha):

ciclo de 180 segundos a 95°C ciclos de 60 segundos a 92°C, 60 segundos a 54°C e 3 minutos a 72°C

1 ciclo de 5 minutos a 72°C.

O produto de PCR foi digerido com Xbal e Notl. O vetor pGU-US-BAR foi do mesmo modo digerido com Xbal e Notl (que resultou na supressão do gene marcador de higromicina) e o fragmento de vetor foi purificado pela eletroforese em gel de agarose usando o Conjunto de Extração 15 em Gel QIAquick® (Qiagen, Hilden, Alemanha). A ligação do fragmento de PCR digerido e o vetor deu origem ao vetor binário pGU.C.USB (ver a Fig. 7a). O vetor contém um gene marcador (citosina desaminase (codA)) em um T-DNA entre dois sítios de divagem I-Scel. Os sítios de divagem I-Scel são extemamente franqueados por regiões de seqüência homóloga de 557 pares de 20 base no tamanho do gene da β-glicuronidase (GUS). O gene GUS atua como marcador de restauração homóloga (Swoboda P et al. (1994) EMBO J 13: 481 a 489). Se o gene é restaurado pela recombinação homóloga, a expressão pode ser histoquimicamente detectada. A eliminação do gene marcador dá origem às células de tabaco resistentes a 5-FC (fluorocitosina), que podem depois 25 regenerar-se para dar calos (Salomon S e Puchta H (1998) EMBO J 17: 6086 a 6095).

Exemplo 3: Transformação de planta com pGU.I.USB

Mudas de Nicotiana tabacum L. cv. Petite Havana Linha SR1 foram transformadas com a cepa agrobacteriana C58, que conteve o vetor

binário pGU.C.USB.

Para esta finalidade, as sementes foram colocadas sobre papel de filtro umedecido sob condições estéreis e as mudas foram colhidas depois de 2 semanas, tudo como descrito por Puchta H. (1999) Methods Mol Biol *

- 5 113: 447 a 451 (25°C, ritmo de 16 horas de luz/8 horas de escuro).

Para a inoculação, a cepa agrobacteriana contendo o plasmídeo de transformação binária foi primeiro cultivado durante a noite em uma cultura agitada a 28°C em meio YEB. Depois, a suspensão agrobacteriana foi centrifugada durante 10 minutos a 15.000 g e as células foram coletadas em | 10 10 mM de pgSO₄ de modo que a densidade ótica final da suspensão teve um valor de aproximadamente 0,5. Em um vaso de reação, as mudas foram depois colocadas na solução bacteriana sob condições estéreis e um vácuo de 0,15 atmosferas foi aplicado em um dessecador estéril. Depois de 10 minutos, as mudas foram depois colocadas em placas MS suplementadas com BAP (615 benzilaminopurina 5 pg/ml) e NAA (ácido 1-naftalenoacético 0,5 pg/ml) e deixadas durante 3 dias em um armário de cultivo (25°C, ritmo de 16 horas de luz/8 horas de escuro). As mudas foram depois colocadas em meio MS suplementado adicionalmente com fosfinotricina (100 pg/ml), vancomicina (1 pg/ml) e cefotaxim (0,5 pg/ml) além de NAA e BAP. A cada 10 dias, as 20 mudas foram transferidas para placas recém fabricadas. Eventualmente, os calos resultantes formaram raízes. Tão logo os brotos atingiram um certo tamanho (1 a 2 cm), eles foram excisados do material de calo e plantados em caixas de magenta que compreenderam meio MS suplementado com fosfinotricina, vancomicina e cefotaxin (concentrações como acima). Depois 25 de um tempo curto, os brotos desenvolveram raízes; eles foram transferidos para o solo depois de 2 a 4 semanas. As plantas foram feitas florescer na estufa e foram depois fertilizados de modo cruzado e as sementes formadas foram deixadas amadurecer nas cápsulas. As sementes foram depois colocadas em meio MS suplementado com 300 pg de fosfinotricina (para a

seleção positiva) ou 500 pg de 5-FC (fluorocitosina; para a seleção negativa) por ml de modo a realizar as análises de segregação. Determinando-se a relação de mudas resistentes para sensíveis (3:1 no caso da seleção positiva e 1:3 no caso da seleção negativa), foi possível demonstrar que as construções *

- 5 de recombinação foram inseridas em um local nas três linhas selecionadas.

Exemplo 5: Indução da supressão de gene pela introdução da enzima DSBI I-Scel

Nos experimentos, mudas F1 das linhas transgênicas GU.C.USB 1,3 e 7, cada uma das quais compreende uma cópia do T-DNA • 10 GU.C.USB mostrado na Fig. 2, foram inoculados com uma cepa agrobacteriana que transitoriamente expressou I-Scel e que compreendeu o plasmídeo pCIScel (Puchta H et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93, 5055 a 5060) na maneira descrita acima (ver também Puchta, 1999b). Depois de 3 dias, as mudas foram colocadas em placa em meio MS suplementado com 15 BAP e meio NAA (concentrações como acima) para o mesmo meio adicionalmente na presença de 100 pg de 5-FC e 100 pg de fosfínotricina por ml incubados de modo a detectar células vegetais em que o gene marcador a ser eliminado (neste caso o gene codA) foi suprimido. Depois de 6 semanas, os calos cultivados no meio foram divididos em dois e uma parte foi usada 20 para a regeneração de eixos de broto enquanto a outra foi usada para isolar DNA e para o ensaio de β-glicuronidase. Os calos transgênicos resistentes a 5-FC resultantes foram analisados quanto aos eventos de recombinação homóloga por meio do tingimento histoquímico. Uma mancha azul indicou a restauração do calo (ver a Fig. 11).

O tingimento histoquímico dos calos foi realizado como descrito por Swoboda et al., 1994. Para esta finalidade, os calos foram introduzidos na solução de tingimento (0,3 pg de X-Gluc [Duchefa, Harlem, Nl] por ml de tampão de fosfato de sódio a 100 mM pH 7,0; 0,1 % de Triton; 0,05 % de NaN₃). Um vácuo foi aplicado durante 15 minutos ao dessecador e ·· ···· ··

os calos foram subsequentemente incubados na solução durante 48 horas a 37°C. Depois que a solução de fingimento foi vertida fora, a clorofila remanescente foi removida do material vegetal pela agitação repetida em 80 % etanol. A mancha azul obtida indicou a atividade de β-glicuronidase.

Em aproximadamente um quarto dos casos, o gene marcador foi eliminado com sucesso pela recombinação homóloga (Fig. 11, Tabela 2).

Tabela 2. Número de calos de tabaco resistente a 5-FC a seguir da indução de

DSB transitória

Linha transgênica	Mudas	Calos resistentes	GUS-positivo	GUS-positivo(% de calos resistentes)
GU.C.USB 1	290	56	22	39
GU.C.USB 3	490	90	24	27
GU.C.USB 7	370	59	11	19

As análises moleculares confirmam os fatos: visto que a linha

GU.C.USB 1 conteve uma cópia única do transgene, os calos foram analisados diretamente quanto aos resultados de recombinação por meio da PCR.

Uma fração aleatória de calos foi depois analisada ao nível molecular por meio da PCR. A análise molecular com os pares de iniciador

OPN11 (SEQ IDNO:21)

5’- CGG AAG CTT CGT CAC CAA TCC CAA TTC GAT

CTA C-3’e

OPN12 (SEQ ID NO: 22)

5’- CGG AAG CTT CCA CTT GCA AAG TCC CGC TAG

TGC C-3’ permitiu a isolação dos sítios de ligação recém formados do genoma do tabaco (Fig. 12; Tabela 3).

Tabela 3. A análise molecular de eventos de recombinação por meio da PCR

Linha transgênica	Calos	Fragmento(s) de PC	R.
		0,7 kb	1,4 kb	nenhum/outro
GU.C.USB 1	30	10	12	7

Três fragmentos de PCR de 0,7 kb foram selecionados e

seqüenciados. Em todos os três casos, o seqüenciamento confirmou a seqüência funcional do gene da β-glicuronidase, isto é, a restauração do gene de fato ocorreu com precisão pela recombinação homóloga.

Quando cinco faixas de PCR de 1,4 kb foram seqüenciadas, foi descoberto que estas faixas foram formadas depois da excisão do gene codA pela reparação dos dois sítios de divagem I-Scel (pela junção de extremidade não homóloga, NHEJ) sem que a recombinação homóloga ocorresse. Na maioria dos casos, supressões menores no sítio de divagem I-Scel resultaram.

Os Southem blot demonstraram que, como esperado, a eliminação completa da seqüência localizada entre os sítios de divagem IScel ocorreu nos recombinantes com as faixas de 0,7 e 1,4 kb, respectivamente. Nenhum DNA específico de codA foi detectável no genoma das plantas regeneradas (Fig. 13 B e D, traços 2 e 3).

O DNA foi isolado com o auxílio do conjunto DNeasy Plant 15 Mini (Quiagen, Hilden). Para detectar os produtos de recombinação, o DNA genômico foi analisado por meio da PCR usando os oligonucleotídeos OPN13 e OPN14.

OPN13 (SEQ ID NO: 23):

5’- CGG AAG CTT CGT CAC CAA TCC CAA TTC GAT ®20 CTAC-3’

OPN14 (SEQ ID NO: 24):

5’- CGG AAG CTT CCA CTT GCA AAG TCC CGC TAG

TGC C-3’ μΐ de 10X tampão de PCR [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KC1]

1,5 μΐ de μgC12 50 mM μΐ de mistura de dNTP 10 mM (10 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) μΐ de iniciador OPN1 (10 mM)

μΐ de iniciador OPN2 (10 mM)

0,4 μΐ de Taq DNA polimerase (5 U/μΙ) μΐ de preparação de DNA

38,1 μΐ de água destilada autoclavada

- 5 A mistura de reação é coberta com aproximadamente 50 μΐ de óleo de silicona e submetida ao seguinte programa de temperatura (Thermociclor: MWG Biotech Primus HT; MWG Biotech, Alemanha):

ciclo de 180 segundos a 95 °C ciclos de 60 segundos a 92°C, 60 segundos a 54°C e 3 10 minutos a 72°C ciclo de 5 minutos a 72°C.

Os produtos de PCR foram seqüenciados usando o “Conjunto de Reação de Seqüenciamento de Ciclo ABI Prism Dye Terminator” (PE Applied Biosystems, Weiterstadt).

Para o Southem blotting, o DNA foi cortado com HindIII ou

Acc65I e submetido à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 %. O DNA no gel foi depois transferido para a membrana de hibridização ‘Hybond N’ (Amersham, Little Chalfont, UK) por meio do manchamento capilar como descritos nas instruções do fabricante. Para a hibridização molecular, os fragmentos de gene específicos de codA ou GUS foram isolados dos plasmídeos de partida (fragmento Xbal/Xhol como PNE3; Stougaard, 1993 e fragmento Kpnl/SacI de pGUS23, Puchta e Hohn, 1991, isolados usando o Conjunto de Extração em Gel QIAquick [Qiagen, Hilden]) e rotulados com o auxílio de um “Conjunto de Rotulação de Imprimação Aleatória” (sistema de rotulação de DNA Megaprime RPN1607, Amersham, Little Chalfont, UK) e [oc-³²P]dATP (Amersham, Little Chalfont, UK). As reações de hibridização foram realizadas a 65 °C.

Visto que em cada caso 2 cópias de transgene geneticamente ligados foram integradas no caso das linhas GU.C.USB 3 e GU.C.USB 7, um

* número representativo de plantas foi regenerado a partir de calo no caso destas linhas, o DNA foi obtido e depois analisado pela mancha de Southem (Tabela 4).

No caso de Acc65I, a presença de uma faixa de 3,7 kb específica de GUS sugere uma recombinação homóloga, enquanto uma faixa de 4,4 kb sugere um evento de NHEJ (“junção de extremidade não homóloga”; NHEJ) (Fig. 7b e c; Fig. 13 C).

Tabela 4. Análise molecular de eventos de recombinação por meio de Southem blot

transgênica	Linha	Calos	Acc65I 3,7 4,4	Fragmento
supressão	(kb)
B3	GU.C.US	39	•	6 18	15
B7	GU.C.US	14		2 5	7

De maneira interessante, o mesmo tipo de ligação nas duas cópias de transgene foi encontrado em todos os casos. Em outras palavras, apenas recombinações homólogas ou apenas eventos NHEJ ocorreram. Em nenhum caso ambas as possibilidades existiram em paralelo, isto é, por exemplo uma recombinação homóloga em um transgene e um evento NHEJ no outro.

Em ambas as linhas, as análises de PCR também foram realizadas e em cada caso três fragmentos de PCR de 0,7 kb foram selecionados e seqüenciados. Em todos os três casos, o seqüenciamento revelou a seqüência funcional do gene da β-glicuronidase, isto é, a restauração do gene de fato ocorreu por meio da recombinação homóloga.

Quando um total de nove faixas de PCR de 1,4 kb das duas linhas foram seqüenciadas, foi além disso verificado que estas faixas de fato ·· ·♦· originaram depois da excisão do gene codA pelo reparo dos dois sítios de clivagem I-Scel (pela “junção de extremidade não homóloga” NHEJ). Mais uma vez, supressões menores resultaram no sítio de clivagem I-Scel na maioria dos casos.

• 5 O Southem blot demonstrou que, como esperado, a seqüência entre os sítios de clivagem I-Scel foram eliminados completamente no recombinante. Nenhum DNA específico de codA não foi mais detectado no genoma das plantas regeneradas (Fig. 13 B e D, traços 5, 6 e 8, 9).

Exemplo 5:

) 10 Várias linhas de plantas do tabaco transgênicas foram geradas que, entre as metades do gene da β-glicuronidase (arranjo como descrito acima) também contiveram sítios de clivagem para as enzimas de restrição mencionadas acima além de um sítio de clivagem I-Scel por meio da clonagem de oligonucleotídeos sintéticos (Fig. 10). As mudas desta linha de 15 tabaco foram inoculadas em cada caso em comparação direta com agrobactérias capazes de expressar I-Scel ou a enzima correspondente em células vegetais. Os calos resultantes foram depois histoquimicamente tingidos depois de 2 semanas. Os resultados estão mostrados na Tabela 4.

O plasmídeo pGU.C.US.B foi cortado com I-Scel de modo que o gene codA fosse excisado do plasmídeo. O DNA digerido foi separado por meio da eletroforese em gel de agarose, a faixa maior foi excisada e purificada por meio do Conjunto de Extração em Gel QIAquick (Qiagen, Hilden) e subsequentemente ligado e transformado na E. coli. O plasmídeo resultante foi depois cortado com Xbal.

Os oligonucleotídeos de fita simples complementares OPN25 e

OPN26 foram feitos de fita dupla pelo aquecimento breve a 92°C e esfriamento subsequente e depois subsequentemente ligado com o plasmídeo cortado com Xbal. A construção SI resultante (pSI) contém os sítios de clivagem para I-Scel, I-Cpal, I-CpaII e I-Crel ((ver a Fig. 10 (A)).

•· •· •· •· • · • · • ·· * · • · « · · · ···· • · • ♦ • ♦

OPN15 (SEQ ID NO: 25):

5’- CTA GTA CAA AAC GTC GTG AGA CAT TTT AAT

CTG AAG GTT TGG CAC CTC GAT GTC GGC TCA TC-3’

OPN16 (SEQIDNO; 26);

5’-CTA GGA TGA GCC GTC ATC GAG GTG CCA AAC

CTT C AG ATT AAA ATG TCT CAC GAC GTT TTG TA-3’ • ¹⁰

Os oligonucleotídeos de fita simples complementar OPN27 e OPN28 foram feitos de fita dupla pelo aquecimento breve a 92°C e esfriamento subsequente e depois subsequentemente ligados com o plasmídeo cortado por Xbal. A construção SD resultante (pSD) contém os sítios de divagem para I-Scel e I-ChuI (ver a Fig. 10 (B)).

OPN17 (SEQ ID NO: 27):

5’-CTA GTC CGA AAA CGC CGT GAG ACA TAT TGG

TTA CGA TCC TAA GGT AGC GAA ATT CAC CCG GTA ACT CTG

TGC CAG-3’

OPN18(SEQ ID NO: 28):

5’-CTA GCT GGC ACA GAG TTA CCG GGT GAA TTT

CGC TAC CTT AGG ATC GTA ACC AAT ATG TCT CAC GGC GTT

TTC GGA-3’

As plantas de tabaco transgênicas com as duas construções foram geradas como descrito mais acima por meio da transformação com agrobactéria. As linhas que apenas contiveram seqüências transgênicas em um local foram usadas para outros experimentos. Estas linhas foram determinadas pela segregação 3:1 em plantas resistentes e não resistentes à fosfinotricina. As mudas fertilizadas de modo cruzado foram depois inoculadas com cepas agrobacterianas que compreenderam uma das quatro construções para expressar as endonucleases de restrição ou, como o controle de vetor, o plasmídeo BinAR ou, como o controle positivo, uma mistura 1:1 de BinAR e CISce-I. As inoculações foram realizadas como descrito acima (Puchta H

(1999) Methods Mol. Biol. 113: 447 a 451) e com propósitos de seleção as mudas foram cultivadas durante diversas semanas em meio MS suplementado com 100 pg de canamicina por ml, que também conteve BAP e NAA, vancomicina e cefotaxin (concentrações como acima). Os calos resultantes - 5 foram depois submetidos ao tingimento histoquímico com β-glicuronidase como descrito acima.

Todas as quatro das enzimas de restrição testadas foram capazes de induzir a recombinação homóloga na mesma ordem de magnitude como I-Scel (que foi utilizada aqui em uma co-inoculação com o vetor de ) 10 seleção pBinAR [AR]) (Tabela 5). Isto demonstra que a recombinação homóloga pode ser induzida efícientemente quando do uso de qualquer uma das endonucleases de restrição.

Tabela 5. Indução de recombinação homóloga em plantas por meio de várias endonucleases I-Crel, I-Cpal, I-CpaII e I-Chul. [Setores/calos] refere-se ao 15 número de áreas tingidas de azul nos calos resistentes.

Linha transgênica	Enzima	Setores/calos	Relação
SI5	I-Scel/AR	42/31	1,35
	I-Crel	77/50	0,54
	I-CpaII	51/50	1,02
SI2	I-Scel/AR	8/9	0,89
	I-Crel	40/18	2,22
	I-CpaII	9/20	0,45
SI2	I-Cpal	144/106	1,36
SD2	I-ChuI	166/100	1,66

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Sistema para recombinações múltiplas e sucessivas no mesmo organismo ou DNA genômico, caracterizado pelo fato de que compreende, em uma célula vegetal ou organismo vegetal,

   I) uma construção de recombinação transgênica inserida no DNA cromossômico de uma célula vegetal ou organismo vegetal que compreenda uma seqüência que consiste, na direção 573’, de al) uma primeira seqüência A e bl) pelo menos uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a2) uma segunda seqüência B, as seqüências A e B tendo pelo menos 50 pares de base e pelo menos 70% de identidade uma com a outra, junto com

   II) uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento (b) para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA ou uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento (b).
2. 2. Sistema para recombinações de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a construção de recombinação é construída como segue:

   al) uma primeira seqüência A e bl) uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e

   c) uma outra seqüência de ácido nucléico e a2) uma segunda seqüência B, as seqüências A e B tendo pelo menos 50 pares de base e pelo menos 70% de identidade uma com a outra.

   Petição 870180046314, de 30/05/2018, pág. 12/19
3. 3. Sistema para recombinações de acordo com a reivindicação 1 ou

   2, caracterizado pelo fato de que a construção de recombinação é construída como segue:

   al) uma primeira seqüência A e bl) uma primeira seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e

   c) uma outra seqüência de ácido nucléico e b2) uma segunda seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a2) uma segunda seqüência B, as seqüências A e B tendo pelo menos 50 pares de base e pelo menos 70% de identidade uma com a outra.
4. 4. Sistema para recombinações de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a construção de recombinação ou a outra seqüência de ácido nucléico abrange pelo menos um dos elementos selecionados do grupo que consiste de:

   i) marcadores de seleção positivos ii) marcadores de seleção negativos iii) genes repórter iv) origens de replicação

   v) regiões de clonagem múltiplas vi) seqüências de borda para a transfecção por Agrobacterium vii) seqüências que permitam a recombinação ou inserção homólogas no genoma de um organismo hospedeiro viii) cassete de expressão para uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA.
5. 5. Sistema para recombinações de acordo com qualquer uma

   Petição 870180046314, de 30/05/2018, pág. 13/19 das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende que uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é selecionada do grupo que consiste de endonucleases de 5 restrição, endonucleases residentes, endonucleases de íntron do grupo II, recombinases, transposases e nucleases quiméricas.
6. 6. Sistema para recombinações de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento

   10 para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é selecionada do grupo das endonucleases residentes que consistem de F-Scel, F-ScelI, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-Amal, I-Anil, I-Ceul, I-CeuAIIP, I-ChuI, I-Cmoel, I-Cpal, I-CpaII, I-Crel, 1-CrepsbIP, Ι-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, ICrepsblVP, I-Csml, I-Cvul, I-CvuAIP, I-Ddil, I-DdiII, I-DirI, I-Dmol, I15 HmuI, I-HmuII, I-HspNIP, I-Llal, I-Msol, I-Naal, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, INitl, I-Njal, I-Nsp236IP, I-Pakl, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PpbIP, I-Ppol, I-SPBetaIP, I-Scal, I-Scel, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomCP, ISpomlP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I20 SthPhiS3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAlP, IUarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP, PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-PspI, PI-Rma43812IP, PI-SPBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-Thyl, PI-Tlil e PI-TlilI.
7. 7. Sistema para recombinações de acordo com qualquer uma 25 das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é selecionada do grupo das endonucleases residentes que consistem das enzimas como mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 e 10.

   Petição 870180046314, de 30/05/2018, pág. 14/19
8. 8. Sistema para recombinações de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é concebida usando um cassete de expressão que abrange uma seqüência de ácido nucléico que codifica a dita enzima.
9. 9. Sistema para recombinações de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é concebida usando um cassete de expressão que abrange uma seqüência de ácido nucléico que codifica a dita enzima como mostrado nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 ou 9.
10. 10. Método para remover uma seqüência de DNA do DNA cromossômico de uma célula vegetal ou organismo vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende combinar, em uma célula vegetal ou organismo vegetal,

    I) uma construção de recombinação transgênica inserida no DNA cromossômico de um organismo vegetal que compreenda uma seqüência que consiste, na direção 573’, de al) uma primeira seqüência A e bl) pelo menos uma seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a2) uma segunda seqüência B, as seqüências A e B tendo um comprimento suficiente e identidade suficiente de modo a garantir a recombinação homóloga, junto com

    II) uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento (b) para a indução direcionada a

    Petição 870180046314, de 30/05/2018, pág. 15/19 sítio de rupturas de fita dupla de DNA, e a indução de rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a recombinação homóloga ocorrendo entre as seqüências com identidade A e B.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a construção de recombinação é construída como segue:

    al) uma primeira seqüência A e bl) uma primeira seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e

    c) uma outra seqüência de ácido nucléico e a2) uma segunda seqüência B, as seqüências A e B tendo um comprimento suficiente e identidade suficiente de modo a garantir a recombinação homóloga.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a construção de recombinação é construída como segue:

    al) uma primeira seqüência A e bl) uma primeira seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e

    c) uma outra seqüência de ácido nucléico e b2) uma segunda seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA e a2) uma segunda seqüência B, as seqüências A e B tendo um comprimento suficiente e identidade suficiente de modo a garantir a recombinação homóloga.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a construção de recombinação ou a outra seqüência de ácido nucléico abrange pelo menos um dos elementos

    Petição 870180046314, de 30/05/2018, pág. 16/19 selecionados do grupo que consiste de

    i) marcadores de seleção positivos ii) marcadores de seleção negativos iii) genes repórter iv) origens de replicação

    v) regiões de clonagem múltiplas vi) seqüências de borda para a transfecção com Agrobacterium vii) seqüências que permitam a recombinação ou inserção homólogas no genoma do organismo hospedeiro viii) cassete de expressão para uma enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende que a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é selecionada do grupo que consiste de endonucleases de restrição, endonucleases residentes, recombinases, transposases e nucleases quiméricas.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 14, caracterizado pelo fato de que a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é selecionada do grupo das endonucleases residentes que consistem de F-Scel, F-ScelI, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-Amal, I-Anil, I-Ceul, I-CeuAIIP, I-ChuI, I-Cmoel, I-Cpal, I-CpaII, I-Crel, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-Csml, I-Cvul, I-CvuAIP, I-Ddil, I-DdiII, I-DirI, I-Dmol, I-HmuI, I-HmuII, IHspNIP, I-Llal, I-Msol, I-Naal, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-NitI, I-Njal, INsp236IP, I-Pakl, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, IPorl, Ι-PorIIP, I-PpbIP, I-Ppol, I-SPBetaIP, I-Scal, I-Scel, I-SceII, I-SceIII, I

    Petição 870180046314, de 30/05/2018, pág. 17/19

    ScelV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomCP, I-SpomIP, ISpomlIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiS3bP, ITdelP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAlP, I-UarHGPA13P, IVinlP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP, PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-PspI, PI-Rma43812IP, PI-SPBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-Thyl, PI-Tlil e PI-TlilI.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 15, caracterizado pelo fato de que a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é selecionada do grupo das endonucleases residentes que consistem das enzimas como mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 e 10.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 16, caracterizado pelo fato de que a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é concebida usando um cassete de expressão que abrange a seqüência de ácido nucléico que codifica a dita enzima.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 17, caracterizado pelo fato de que a enzima adequada para induzir rupturas de fita dupla de DNA na seqüência de reconhecimento para a indução direcionada a sítio de rupturas de fita dupla de DNA é concebida usando um cassete de expressão que abrange a seqüência de ácido nucléico que codifica a dita enzima como mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 ou 9.