MXPA03011844A - Sistemas de recombinacion y procedimiento para eliminar secuencias de acido nucleico del genoma de organismos eucariotas. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a sistemas de recombinacion y procedimientos para eliminar secuencias de acido nucleico a partir del genoma de organismos eucariotas, asi como a organismos transgeneticos, preferentemente, plantas, que contienen estos sistemas o bien que se obtuvieron mediante este procedimiento.

Description

SISTEMAS DE RECOMBINACIÓN Y PROCEDIMIENTO PARA ELIMINAR SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO DEL GENOMA DE ORGANISMOS EUCARIOTAS DESCRIPCIÓN La invención se refiere a sistemas de recombinación y procedimientos para eliminar secuencias de ácido nucleico del genoma de organismos eucariotas, asi como a organismos transgenéticos - preferentemente, plantas - que contienen estos sistemas. El objetivo de trabajos biotecnológicos en organismos es, entre otras cosas, la obtención de informaciones . comercialmente útiles sobre la función de determinados genes y productos genéticos, asi como la aclaración de las vías de biosintesis o mecanismos de enfermedades. Las informaciones asi obtenidas tienen múltiples aplicaciones. Sirven, por ejemplo, para la fabricación de medicamentos, el desarrollo de procedimiento de producción biotecnológicos alternativos o la generación de plantas modificadas. El objetivo de trabajos biotecnológicos en plantas es la obtención de plantas con nuevas propiedades ventajosas, por ejemplo, para incrementar la productividad agrícola, para mejorar la calidad de alimentos o la producción de químicos o fármacos (Dunwell JM, J Exp Bot . 2000; 51 Spec No:487-96). En la obtención de organismos transgenéticos es necesario, debido a la reducida eficiencia de los métodos usados (como por ejemplo la transformación estable o, especialmente, la recombinación homogénea) , efectuar una selección de los organismos modificados en la forma deseada. Plantas transgenéticas se pueden generar mediante una serie de técnicas (cuadro sinóptico: Potrykus I. and Spangenberg G. ed. (1995) Gene transfer to plants. Springer, Berlín) . Aquí juega un papel muy importante la transferencia genética inducida por Agrobacterium tumefaciens y el bombardeo de las células vegetales con el "Particle Gun". Un problema esencial es el hecho, que el ADN transgenético, una vez insertado en forma estable en un organismo, sólo es difícil de eliminar. Los genes de resistencia a antibióticos o herbicidas usados para la selección en la transformación se dejan en las plantas transgenéticas, fenómeno que contribuye considerablemente a la poca aceptación de estos "alimentos genéticos" por parte del consumidor. Por tanto, desde hace bastante tiempo se trata de desarrollar técnicas, que permitan integrar ADN ajeno en determinados sitios en el genoma de la planta o bien cortar el ADN ajeno nuevamente de este sitio (Ow DW and Medberry SL (1995) Crit Rev in Plant Sci 14:239-261) . El perito conoce diferentes sistemas para eliminar específicamente secuencias de ácido nucleico insertadas transgenéticamente . Estas se basan en el uso de recombinasas para secuencias especificas y dos secuencias de reconocimiento de dichas recombinasas , que flanquean a la secuencia a eliminar. La acción de la recombinasa sobre la estructura resulta en que se corta la secuencia flanqueada, permaneciendo una de las secuencias de reconocimiento en el genoma del organismo. Se conocen diferentes sistemas de recombinación para secuencias especificas, como p.ej. el sistema de Cre/lox del bacteriófago Pl (Dale EC y Ow DW (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:10558-10562; Russell SH et al. (1992) Mol Gen Genet 234: 49-59; Osborne BI et al. (1995) Plant J. 7, 687-701), el sistema de FLP/FRT de la levadura (Kilby NJ et al. (1995) Plant J 8:637-652; Lyznik LA et al. (1996) Nuciere Acids Res 24:3784-3789), la recombinasa de gin de fago de Mu, la recombinasa de Pin a partir de E. coli o el sistema de R/RS del plásmido de pSRl (Onouchi H et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 247:653-660.; Sugita Ket al. (2000) Plant J. 22:461-469) . Aqui interacciona la recombinasa (por ejemplo, Cre o FLP) específicamente con sus secuencias de recombinación correspondientes (secuencia de 34 bp lox o secuencia de 47 bp FRT) , para deletar o invertir las secuencia situadas en medio. Sólo hay limitados informes sobre aplicaciones exitosas de estos sistemas en plantas. Por ejemplo, el grupo de David Ow pudo demostrar, que un marcador de selección usado para la transformación de plantas, que estaba rodeado de dos secuencias lox, se puede cortar nuevamente del genoma de la planta mediante expresión de Cre (Dale EC y Ow DW (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:10558-10562) . Una desventaja del sistema de recombinación de secuencias especificas es la reversibilidad de la reacción, es decir, rige un equilibrio entre la excisión y la integración del gen marcador correspondiente. Esto resulta, frecuentemente, en que se seleccionan mutaciones, a saber, una vez que una mutación bloquee la interacción ulterior de las secuencias de reconocimiento lox con la enzima, se saca el producto (no deseado) del equilibrio y se fija. Esto vale además del sistema de Cre-lox también para otras recombinasas de secuencias especificas (ver arriba). Otra desventaja es que una de las secuencias de reconocimiento de la recombinasa permanece en el genoma, es decir, este es modificado. Esto puede afectar las propiedades del organismo, por ejemplo, cuando la secuencia de- reconocimiento cambia o destruye marcos de lectura o elementos de control, tales como promotores o enhanceres. Además, la secuencia de reconocimiento que permanece en el genoma excluye un uso posterior del sistema de recombinación, por ejemplo, para una segunda modificación genética, ya que no se pueden excluir interacciones con las secuencias de reconocimiento insertadas posteriormente. Esto puede resultar en mayores transposiciones cromosomales o en deleciones. Zubko et al. describen un sistema para la deleción de secuencias de ácido nucleico del genoma de tabaco, en donde la secuencia a deletar está flanqueada por dos secuencias de reconocimiento de attP con una longitud de 352 bp del bacteriófago de Lambda . La deleción de la región flanqueada se efectúa independientemente de la expresión de proteínas de levadura en dos de once lineas de tabaco transgenéticas por recombinación intracromosomal espontánea entre las regiones de reconocimiento attP. El procedimiento tiene la desventaja, que las recombinaciones o bien la deleción no puede inducirse específicamente en un momento determinado, sino que tiene lugar espontáneamente. Que el procedimiento sólo funcione con una pequeña parte de las líneas, indica, que en los casos correspondientes el locus de integración respectivo tendía a una inestabilidad (Puchta H (2000) Trends in Plant Sci 5:273-274) . La WO 96/14408 describe en la página 12 en la leyenda de la Figura 32 un procedimiento para la eliminación selectiva de un locus genético, en el que se inserta cada vez una secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción de Homing, I-Scel, en el término correspondiente de la secuencia a deletar. El tratamiento con la endonucleasa produce aquí roturas en las cadenas dobles en ambos términos de la secuencia a deletar. Los términos libres se unen, entonces por "recombinación". La "recombinación" aquí citada puede ser - a como se desprende de la Figura - tan sólo una recombinación ilegitima (por ejemplo, un "non-homologous end-joining" (NHEJ) ) , puesto que en los dos términos restantes del ADN genómico ya no existen secuencias homologas. Una recombinación ilegitima resulta en incidentes de recombinación no predecibles. Esto puede influir en las propiedades del organismo, por ejemplo, cuando se ha modificado o destruido tramas de lectura o elementos de control genéticos, tales como promotores o enhanceres. El sistema requiere dos secuencias de reconocimiento, que flanquean al fragmento a deletar. La generación de fraccionamientos de dobles cadenas de secuencias especificas con la ayuda de enzimas de restricción en genomas eucariotas, como p.ej. levadura, se describe en (Haber JE (1995) Bioassays 17:609-620), en células de mamíferos en (Jasin M (1996) Trends Genet . 12:224-228) o en plantas en (Puchta H (1999a) Methods Mol Biol 113 : 447-451) . Se describe la inducción de una recombinación intramolecular en un ADN de plásmido en oocitos de Xenopus por fraccionamiento específico de secuencia con la endonucleasa: I-Scel (Segal DJ y Caroll D (1995) Proc Nati Acad Sci USA 92:806-810) o por nucleasas sintéticas, quiméricas (Bibikova M et al. (2001) Mol Cell Biol 21(1) :289-297). El objetivo es una recombinación específica entre dos secuencia homologas, entre las que está localizado un correspondiente sitio de corte de nucleasa. En ambos casos se trata de incidentes de recombinación extracromosomales , en los que únicamente una parte del ADN de plásmido extracromosomal es recombinada homólogamente . Posfai et al. describen un procedimiento para el intercambio de genes en procariotas de E.coli (Posfai G et al. (1999) Nucleic Acids Res 27 (22) : 4409-4415) . Aquí tiene lugar en el genoma de E.coli una recombinación entre el gen endogenético y el gen imitado, que es inducida por un corte con la enzima de restricción de I-Scel. El objetivo y la tarea era un intercambio de un gen endogenético por un transgen mutado. Recombinaciones en E.coli transcurren más fácilmente y con mayor eficiencia que en eucariotas superiores (a como se describe, por ejemplo, en Kuzminov A (1999) Microbiol Mol Biol Rev. 63 ( 4 ) : 751-813 ) . Dürrenberger et al. describen la inducción de una recombinación en cloroplastos del alga verde, Chl mydomonas reinhardtii, usando la endonucleasa de Homing, I-Scel, (Dürrenberger F et al. (1996) Nucleic Acid Res 24(17) :3323-3331) . La recombinación tiene lugar entre el gen endógeno, 23S, y un 23S-cADN insertado, que contienen un sitio de corte de I-Scel. Se inducen roturas de dooles cadenas mediante "mating" del organismo transgenético correspondiente con un organismo que exprime a I-Scel. Recombinaciones en cloroplastos transcurren más fácilmente y con mayor eficiencia que en ADN cromosomal de eucariotas superiores. Por lo visto, la recombinación homologa es normalmente el método preferido de la integración de ADN en plástidos (cloroplastos) (descrito en: Heifetz PB y Tuttle AM (2001) Curr Opinión Plant Biol 4:157-161) . Los plástidos tienen, por lo visto, un sistema especial, que les permite una recombinación homogénea, contrario al núcleo de célula, y que facilita la integración especifica de ADN ajeno (Heifetz PB (2000) Biochimie 82:655-666) . La técnica de "gene targeting", en que se desea logar una integración especifica en el ADN cromosomal del organismo huésped por recombinación homologa, sólo funciona con eficiencia aceptable en procariotas y levaduras. La generación de correspondientes organismos transgenéticos sólo se alcanza en unas pocas especies (como por ejemplo, el ratón) y allí únicamente con mayor esfuerzo (ver también Kanaar R Hoeijmakers JH (1997) Genes Funct 1 (3) : 165-174) . La reducida eficiencia existente de la recombinación homologa (aprox. 1:1x10°) está compensada aqui por el uso de técnicas de selección complicadas y refinadas, limitadas a la especie correspondiente (por ejemplo: tecnología celular "ES") . En otras especies - sobre todo en plantas superiores - hasta la fecha, no están establecidas tales técnicas (Mengiste T y Paszkowski J (1999) Biol Chem. 380:749-758; Vergunst AC y Hooykaas PJJ (1999) Crit Rev Plant Sci 18:1-31; Puchta H (1999) Methods Mol Biol 113:447-451; Hohn B y Puchta H (1999) Proc Nati Acad Sci USA 96:8321-8323). Intentos de alcanzar una recombinación homologa en plantas, resultan en la mayoría de los casos en incidentes de inserción casuales, no homólogos ("ilegítimos") . Aquí se integra el ADN insertado en uno o varios sitios, que no pueden determinarse previamente, en el genoma de la planta. La integración tiene lugar mediante recombínación ilegítima (Roth DB y ilson JH (1988) illegitimate recombination in mammalian cells, en "Genetic recombination", R. Kucherlapati and G.R. Smith Edts., American Society of Micorbiology, Washington, USA; S.621-635.) y no en regiones de secuencia homologas al ADN transferido (Puchta H y Hohn B (1996) Trends Plant Sci. 1:340-348). El problema de la reducida eficiencia de la recombinación homologa, sobre todc, en plantas, es generalmente conocido al perito. Las causas son objeto de la investigación actual (artículo sinóptico: Mengiste T y Paszkowski J (1999) Biological Chemistry 380 ( 7-8 ) : 749-58 ) . El incremento de la eficiencia de la recombinación homologa es una meta que ya existe desde hace mucho tiempo y que todavía no se ha alcanzado. Otro objeto que ya existe desde hace mucho tiempo en la investigación biotecnológica, y que todavía no se ha alcanzado mediante los sistemas establecidos hasta la fecha, es proveer sistemas y procedimientos que permitan una eliminación especifica de secuencias de ácido nucleico del ADN cromosomal de un organismo eucariota y que permitan una aplicación múltiple en el mismo organismo. Por ejemplo, un objetivo de la biotecnología vegetal consiste en mejorar aún más especies de alto rendimiento ya cultivados. Aquí es especialmente importante eliminar secuencias transgenéticas excesivas, tales como los marcadores de selección, después de la transformación. Además, procedimientos para la eliminación previsible de secuencias, por ejemplo, del ADN cromosomal, de un organismo, ofrecerían aplicaciones adicionales, sumamente interesantes desde el punto de vista económico, en el sector del "genetíc engeneering" . Por tanto, el objeto era desarrollar sistemas y procedimientos que permitan una eliminación previsible de secuencias de ácido nucleico definidas del ADN cromosomal de un organismo eucariota, y que permitan una aplicación múltiple, sucesiva en el mismo organismo. Este objeto se alcanza, sorprendentemente, mediante los sistemas de recombinación de la invención. Un primer objeto de la invención es un sistema de recombinación para eliminar una secuencia de ADN del ADN cromosomal de una célula eucariota o un organismo, cuyo sistema está caracterizado porque en una célula eucariota o un organismo eucariota están presentes conjuntamente I) una estructura de recombinación transgenética insertada en el ADN cromosomal de un organismo eucariota, que contiene una secuencia que se compone en dirección 5'/3' de: al) una primera secuencia de homología A, y bl) por lo menos una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario, y a2) una segunda secuencia de homología B, presentando las secuencias de homología A y B una longitud suficientemente larga y una homología suficientemente alta, para asegurar una recombinación homologa, y II) una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento (bl) para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario o una secuencia de ácido nucleico codificante para una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento (bl) . Otro objeto de la invención es un procedimiento para eliminar una secuencia de ADN del ADN cromosomal de una célula eucariota o un organismo, caracterizado porque I) una estructura de recombinación transgenética insertada en el ADN cromosomal de un organismo eucariota, que contiene una secuencia que se compone en dirección 5'/3' de: al) una primera secuencia de homología A, y bl) por lo menos una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenarío, y a2) una segunda secuencia de homología B, presentando las secuencias de homología A y B una longitud suficientemente larga y una homología suficientemente alta, para asegurar una recombinación homologa, y II) una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento (bl) para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario o una secuencia de ácido nucleico codificante para una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento (bl) , reúnen en una célula eucariota o un organismo eucariota, y inducción de las roturas de ADN bicatenario se realiza en secuencia de reconocimiento para la inducción específica de f accionamientos de dobles cadenas de ADN, asi como la recombinación homologa se realiza entre las secuencias de homología A y B. La invención permite deletar del ADN cromosomal de un organismo secuencias (por ejemplo, marcadores de selección, tales como genes de resistencia a antibióticos o herbicidas) de una manera exactamente previsible. Para tal fin, se flanquea la secuencia a eliminar con secuencias de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario (por ejemplo, secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de corte poco frecuente) y se combina con secuencias homologas en la región de los sitios de corte. La inducción de la fracción de doble cadena se realiza mediante una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario (por ejemplo, una nucleasa de secuencia específica), lo que induce la recombinación homologa de secuencias homologas situadas en la fracción y con ello la deleción de posibles secuencias de ácido nucleico localizadas entre las secuencias. La secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario también es deletada, de modo que el procedimiento puede ser repetido para otras modificaciones genéticas controladas. Sorprendentemente, esta recombinación homologa tiene lugar - contrario a las experiencias hechas hasta la fecha en el campo de la recombinación homologa -también en plantas con alta eficiencia y precisión. La frecuencia es comparable con los incidentes paralelos no homogéneos (por ejemplo, "non-homologous end-j oining" ) (véase el Ejemplo 5) . Esto es un hallazgo sorprendente, que es contrario a las observaciones hechas hasta la fecha, según las cuales la recombinación homologa, sobre todo en plantas, tiene una frecuencia inferior casi negligible, en comparación con los incidentes "ilegítimos". Son deletadas las secuencias localizadas entre las secuencias de homología A y B. Contrario a sistemas, tales como el sistema cre/lox o FRT/FLP, no se está limitado para la recombinación a secuencias determinadas. El perito sabe, que cada secuencia puede ser recombinada homólogamente con otra secuencia, cuando presente una longitud y homología suficiente. Por inducción específica de secuencias de las roturas de dobles cadenas se aumenta considerablemente la eficiencia de la recombinación homologa entre las secuencias de homología A y B, o aún se hace posible por primera vez. "Transgen" significa con respecto a la estructura de recombinación todas aquellas estructuras generadas por tales métodos de tecnología genética, en las cuales a) por lo menos una de las secuencias de homología A o B, o b) por lo menos una secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario, o c) (a) y (b) no se encuentran en su entorno genético natural (por ejemplo, en su locus cromosomal natural) , o que han sido modificadas por métodos de tecnología genética, cuya modificación puede comprender, por ejemplo, sustituciones, adiciones, deleciones o inserciones de uno o más radicales nucleótidos. "Célula u organismo eucariota" significa, generalmente, cada célula u organismo eucariota, así como las células, tejidos, partes o bienes de reproducción derivados de los mismos (tales como semillas o frutos), en los que está presente la estructura de recombinación y la enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario en un espacio de reacción (por ejemplo, una célula o un compartimento de la misma) y se pueda realizar, simultáneamente, una inducción de roturas de dobles cadenas en la secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario, así como la recombinación homologa entre las secuencias de homología A y 3. En una modalidad especialmente preferida, este término abarca compartimentos en una célula eucariota, como por ejemplo, el núcleo de la célula.

Muy preferentemente, están comprendidas aquellas células u organismos, que representan un organismo eucariota multicelular o que se derivan de éste, así como células, tejidos, partes o bienes de multiplicación del mismo. Muy especialmente, están comprendidas aquellas células u organismos, que representan un organismo vegetal o que se derivan del mismo, así como células, tejidos, partes o bienes de multiplicación del mismo. Géneros y especies preferidas se indican en lo sucesivo. "Longitud suficiente" significa con respecto a las secuencias de homología A y B, preferentemente, secuencias con una longitud de por lo menos 20 pares de bases, preferentemente, por lo menos 50 pares de bases, muy preferentemente, de por lo menos 100 pares de bases, especialmente, de por lo menos 250 pares de bases, muy especialmente de por lo menos 500 pares de bases. "Homología suficiente" significa con respecto a las secuencias de homología A y B, preferentemente, secuencias que presenten una homología dentro de estas secuencias de homología de por lo menos un 70%, preferentemente, un 80%, preferentemente, por lo menos un 90%, muy preferentemente, por lo menos un 95%, especialmente, por lo menos un 99%, muy especialmente, 100% por una longitud de por lo menos 20 pares de bases, preferentemente, por lo menos 50 pares de bases, muy pre erentemente, de por lo menos 100 pares de bases, especialmente, de por lo menos 250 pares de bases, muy especialmente de por lo menos 500 pares de bases. Por homología entre dos secuencias de ácido nucleico se entiende la identidad de la secuencia de ácido nucleico por toda la longitud de la secuencia, que se calcula por comparación, valiéndose del algoritmo programado GAP (Wisconsin Package Versión 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA), ajustándose los parámetros siguientes: Gap Weight: 12 Length Weight: 4 Average Match: 2,912 Average Mismatch : -2 , 003 En una modalidad preferida, entre las secuencias de homología A y B sólo está situada una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario, de manera que la estructura de recombinación utilizada en los sistemas de recombinación o bien procedimientos de la invención está compuesta en dirección 5'/3' en la forma siguiente: una primera secuencia de homología A y una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y una segunda secuencia de homología B, cuyas secuencias de homología A y B presentan una longitud suficiente y una homología suficiente, para asegurar una recombinación homologa. En una modalidad preferida, está localizada entre las secuencias de homología A y B otra secuencia de ácido nucleico, de manera que la estructura de recombinación usada en el sistema de recombinación o bien procedimiento según la invención está compuesta en dirección 5' /3' en la forma siguiente : al) una primera secuencia de homología A y bl) una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y c) otra secuencia de ácido nucleico y a2) una segunda secuencia de homología B, cuyas secuencias de homología A y B tienen una longitud suficiente y una homología suficiente, para aseguar una recombinación homologa. La secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario también puede estar localizada detrás o en la secuencia de ácido nucleico. En otra modalidad preferida, detrás de la otra secuencia de ácido nucleico existe una segunda secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de dobles cadenas. Sobre todo, en secuencias de homología A y B muy distantes entre si o bien secuencias de ácido nucleico más largas, esta modalidad es ventajosa, puesto que así se aumenta la eficiencia de la recombinación. La estructura de recombinación usada en el sistema de recombinación o bien el procedimiento de la invención está compuesta, según esta modalidad, en dirección 5f/3'de: al) una primera secuencia de homología A y bl) una primera secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y c) otra secuencia de ácido nucleico y b2) una segunda secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y a2) una segunda secuencia de homología B, cuyas secuencias de homología A y B tienen una longitud suficiente y una homología suficiente, para asegurar una recombínación homologa. Además, junto a la segunda secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario pueden estar presentes otras secuencias de reconocimiento entre las secuencias de homología A y B. Las secuencias de reconocimiento individuales (por ejemplo, bl ó b2) para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario pueden ser idénticas o diferentes, es decir, pueden tener la función de secuencia de reconocimiento para una enzima individual para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario o para diferentes de estas enzimas. Aquí se prefiere la modalidad, en la que las secuencias de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario actúa como secuencia de reconocimiento para una enzima individual o para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario. El perito conoce muchos métodos para obtener una de las estructuras de recombinación de la invención. Pueden ser obtenidas por técnicas de recombinación y clonado, tal y como se describen, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), así como en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987). Preferentemente, se prepara la estructura de recombinación de la invención por disociación de los componentes esenciales arriba indicados de la estructura de recombinación en el orden mencionado, usando la técnicas de recombinación y clonados conocidos al perito, y luego se inserta en el ADN cromosomal de un organismo huésped. Sin embargo, el perito sabe que la estructura de recombinación de la invención también se puede preparar de otro modo. Por ejemplo, el organismo huésped ya puede contener uno o varios de los componentes esenciales de la estructura de recombinación. La estructura de recombinación de la invención es generada por incorporación de otro componente esencial o más componentes esenciales de la estructura de recombinación en el orden correcto a los componentes ya existentes en el organismo respectivo. Por ejemplo, el organismo de partida puede contener ya una de las secuencias de homología A o B. Cuando el organismo ya contiene una secuencia de homología A, entonces se forma por inserción de una estructura compuesta de una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y una segunda secuencia de homología B detrás de la secuencia de homología A, una de las estructuras de recombinación de la invención. Además, el perito conoce diferentes métodos para la inserción de la estructura de recombinación de la invención en el ADN cromosomal de una célula o un organismo eucariota. La inserción puede ser dirigida (es decir, a un lugar de inserción definido) o no dirigida (es decir, casual) . Las técnicas correspondientes son conocidos al perito y se describen en lo sucesivo con base en algunos ejemplos. "Enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario" (en lo sucesivo, "enzima de DSBI" para "double strand-break _inducing enzyme") significa, generalmente, todas aquellas enzimas, que son capaces de inducir en secuencias específicas roturas de dobles cadenas en ADN de dobles cadenas. Por ejemplo, sean mencionadas, pero no en forma limitativa: 1. Endonucleasas de restricción (tipo II) preferentemente, endonucleasas de Homing, a como se describen más abajo en más detalle. 2. Recom inasas (como por ejemplo, Cre/lox; R-RS; FLP/FTR, arriba descritas) . 3. Transposasas , por ejemplo, las transposasas de elemento P (Kaufman PD y Rio DC (1992) Cell 69(l) :27-39) o AcDs (Xiao YL y Peterson T (2000) Mol Gen Genet 263 (1 ) : 22-29) . En principio, están apropiadas todas las transposasas o integrasas, siempre que tengan una especificidad de secuencia (Har n L et al. (1999) Annu Rev Microbiol. 1999;53:245-281; Beall EL, Rio DC (1997) Genes Dev. 11(16) :2137- 2151) . 4. Nucleasas quiméricas, a como se describen más abajo en detalle. 5. Enzimas que inducen roturas de dobles cadenas en el sistema inmune, como p.ej. el sistema de RAG1/RAG2 (Agrawal A et al . (1998) Nature 394 (6695) : 744-451) . Endonucleasas de intrones del grupo II. Por modificación de la secuencia de intron se pueden dirigir intrones del grupo II a una secuencia arbitraria en un ADB de doble cadena. En estos se pueden insertar los intrones del grupo II mediante un mecanisamo de splicing reversible (Mohr et al. (2000) Genes & Development 14:559-573; Guo et al. (2000) Science 289:452- 457) . Durante este mecanismo de splicing reversible se inserta en el ADN destino una fracción de doble cadena, por lo que el ARN del intron cortado fracciona la cadena de sentido, mientras que la proporción proteica de la endonucleasa del intron de grupo II hidroliza la cadena de antisentido (Guo et al. (1997) EMBO J 16: 6835- 6848) . Si en la presente invención se desea únicamente inducir la fracción de doble cadena y no un splicing completo reversible, entonces se pueden usar endonucleasas de intrones del grupo II, que carecen de la actividad de transcriptasa reversible. De esta forma no se impide la generación de una fracción de doble cadena, pero el mecanismo de splicing reversible no puede transcurrir completamente. Son apropiadas tanto las enzimas naturales como las enzimas generadas artificialmente. Se prefieren todas las enzimas de DSBI, cuyas secuencias de reconocimiento son conocidas y que pueden ser generadas en forma de sus proteínas (por ejemplo, durch purificación) o que pueden ser exprimidas usando su secuencia de ácido nucleico. Son especialmente preferidas, las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) , que no contienen ningunas o unas pocas secuencias de reconocimiento - junto a las secuencias de reconocimiento presentes en la estructura de recombinación transgenética - en la secuencia de ADN cromosomal de un determinado organismo eucariota. De esta forma se impiden roturas de doble cadena en locus indeseados en el genoma. Por tanto, son muy especialmente preferidas las endonucleasas de Homing (cuadro sinóptico: (Belfort M y Roberts RJ (1997) Nucleic Acids Res 25: 3379-3388; Jasin M (1996) Trends Genet. 12:224-228; Internet: http://rebase.neb.com/rebase/rebase.homing.html) . Estas tienen, debido a sus largas secuencias de reconocimiento, generalmente, sólo pocas secuencias de reconocimiento adicionales en el ADN cromosomal de organismos eucariotas. Las secuencias que codifican para tales endonucleasas de Homing se pueden aislar, por ejemplo, del genoma de cloroplastos de Chlamydomonas (Turmel M et al. (1993) J Mol Biol 232: 446-467) . Son pequeñas (18 a 26 kD) , presentan en su marco de lectura abierto (ORF) un "coding usage", que es directamente apropiado para la expresión nuclear en eucariotas (Monnat RJ Jr et al. (1999) Biochem Biophys Res Com 255:88-93) . Son especialmente preferidas, las endonucleasas de Homing: I-Scel (WO96/14408 ) , I-SceII (Sarguiel B et al. (1990) Nuciere Acids Res 18:5659-5665), I-SceIII (Sarguiel B et al. (1991) Mol Gen Genet. 255:340-341), I-Ceul (Marshall (1991) Gene 104:241-245), I-Crel (Wang J et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 3767-3776), I-ChuI (Cote V et al. (1993) Gene 129:69-76), I-TevI (Chu et al. (1990) Proc Nati Acad Ser USA 87:3574-3578; Bell-Pedersen et al. (1990) Nucleic Acids Resl8 : 3763-3770) , I-TevII (Bell-Pedersen et al. (1990) Nucleic Acids Resl8 : 3763-3770) , I-TevIII (Eddy et al. (1991) Genes Dev. 5:1032-1041), Endo Scel (Kawasaki et al. (1991) J Biol Chem 266:5342-5347), I-Cpal (Turmel M et al. (1995a) Nucleic Acids Res 23:2519-2525) y I-Cpall (Turmel M et al. (1995b) Mol. Biol. Evol . 12, 533-545) . Otras endonucleasas se mencionan en la dirección de internet indicada. Sean mencionadas, por ejemplo, las endonucleasas de Homing: F-Scel, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-Amal, I-Anil, I-Ceul, I-CeuAIIP, I-ChuI, I-Cmoel, I-Cpal, I-CpaII, I-Creí, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-Csml, I-Cvul, I-CvuAIP, I-Ddil, I-DdiII, I-Dirl, I-Dmol, I-Hmul, I-HmuII, I-HspNIP, I-Llal, I-Msol, I-Naal, I-Nanl, I-NclIP, I-NgrIP, I-Nitl, I-Njal, I-Nsp236IP, I-Pakl, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, 1-PobIP, I-Porl, 1-PorIIP, I-PpbIP, I-Ppol, I-SPBetaIP, I-Scal, I-Scel, ?-SceII, I-SceIII , I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhi JP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiS3bP, I-TdeIP, I-Tevl, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAlP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP, PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-PspI, PI-Rma43812IP, PI-SPBetalP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-Thyl, PI-Tlil, PI-Tlill. Son preferidas las endonucleasas de Homing, cuyas secuencias genéticas ya son conocidas, como por ejemplo: F-Scel, I-Ceul, I-Chul, I-Dmol, I-Cpal, I-Cpall, I-Creí, I-Csml, F-TevI, F-TevII, I-TevI, I-TevII, I-Anil, I-Cvul, I-Ddil, I-Hmul, I-HmuII, I-Llal, I-NanI, I-Msol, I-Nitl, I-Njal, I-Pakl, I-PorI, I-Ppol, I-Scal, I-Ssp6803I, PI-PkoI, Pl-PkoII, PI-PspI, PI-TfuI, PI-Tlil. Son especialmente preferidas las endonucleasas de Homing que se obtienen en el comercio, tales como: I-Ceul, I-Scel, I-Dmol, I-Ppol, PI-PspI o PI-SceI. Las enzimas se pueden purificar en la forma conocida por el perito a partir de sus organismos de origen y/o se puede clonar la secuencia de ácido nucleico que codifica para estas enzimas. Las secuencias de diferentes enzimas están depositadas en el banco genético. Son especialmente preferidas las endonucleasas de Homing: I-Scel, I-Cpal, I-CpaII, I-Creí y I-ChuI, muy especialmente, las endonucleasas de Honing según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 o 10. Como enzimas de DSBI artificiales sean mencionadas como ejemplos las nucleasas quiméricas, que se componen de un dominio de nucleasa no especifico y un dominio de unión de ADN de secuencia especifica que consta de dedos de cinc (Bibikova M et al. (2001) Mol Cell Biol. 21:289-297). Estos dominios de dedos de cinc ligantes de AON se pueden adaptar a cualquier secuencia de ADN. Procedimientos para la obtención de dominios de dedos de cinc correspondientes están descritos y conocidos al perito (Beerli RR et al., Proc Nati Acad Sci U S A. 2000; 97 ( 4 ): 1495-1500 ; Beerli RR, et al., J Biol Chem 20C0; 275 (42) : 32617-32627; Segal DJ and Barbas CF 3rd. , Curr Opin Chem Biol 2000; 4(l):34-39; Kang JS and im JS, J Biol Chem 2000; 275 (12 ): 8742-8748 ; Beerli RR et al., Proc Nati Acad Sci USA 1998; 95 ( 25 ): 14628 -14633 ; Kim JS et al., Proc Nati Acad Sci USA 1997; 94 ( 8 ): 3616-3620 ; Klug A, J Mol Biol 1999; 293 (2) :215-218; Tsai SY et al., Adv Drug Deliv Rev 1998; 30 (1-3) :23-31; Mapp AK et al., Proc Nati Acad Sci USA 2000; 97 ( 8 ): 3930-3935 ; Sharrocks AD et al., Int J Biochem Cell Biol 1997; 29 (12) : 1371-1387; Zhang L et al., J Biol Chem 2000; 275 (43) : 33850-33860) . Se prefiere la enzima de DSBI como proteína de fusión exprimida con una secuencia de localización nuclear (NLS) . Esta secuencia de NLS permite un transporte más fácil en el núcleo y aumenta la eficiencia del sistema de recombinación. El perito conoce diferentes secuencias de NLS. Estas están descritas, por ejemplo, en Jicks GR y Raikhel NV (1995) Annu. Rev. Cell Biol. 11:155-188. Para organismos vegetales se prefiere, por ejemplo, la secuencia de NLS del SV40 "large antigen". Son especialmente preferidas las siguientes secuencias de NLS: NLS1: N-Pro-Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Val-C (SEQ ID NO: 29) NLS2 :N-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-C (SEQ ID NO: 30) Las endonucleasas de Homing según SEQ ID NO: 4, 6, 8 ó 10 usadas en los ejemplos de realización son proteínas de fusión a partir de nucleasas nativas y la secuencia de localización nuclear, NLS2. Sin embargo, debido al reducida tamaño de numerosas enzimas de DSBI (como por ejemplo, las endonucleasas de Homing) , no es absolutamente necesario usar una secuencia de NLS. Estas enzimas pueden pasar los poros nucleares también sin asistencia. Esto es comprobado por la eficiencia de las endonucleasas de Homing según SEQ ID NO: 2, usadas que no comprenden ninguna secuencia de localización nuclear.

En otra modalidad preferida, se puede inducir la afinidad de la enzima de DSBI . Procedimientos correspondientes están descritas para recombinasas especificas de secuencias (Angrand PO et al. (1998) Nucí. Acids Res. 26 ( 13 ) : 3263-3269 ; Logie C y Stewart AF (1995) Proc Nati Acad Sci USA 92 ( 1 ) : 5940-5944 ; Imai T et al. (2001) Proc Nati Acad Sci USA 98 (1) : 224-228 ) . En estos procedimientos se usan proteínas de fusión a partir de la enzima de DSBI y del dominio de ligando de unión de un receptor de hormona esferoide (p.ej. del receptor andrógeno humano, o variantes mutados del receptor de estrógeno humano, tal y como están allí descritas) . La inducción se puede realizar con ligandos, como por ejemplo, estradiol, dexametasona, 4-hidroxitamoxifeno o raloxifeno. Algunas enzimas de DBSI son activas como dimeros (homo- o heterodírneros ) (I-Creí forma un homodimero; I-SecIV forma un heterodimero (Wernette CM (1998) Biochemical & Biophysical Research Communications 248 (1) : 127-333) ) . Una dimerización se puede configurar en forma inducib.le, por ejemplo, intercambiando los dominios de dimerización naturales por los dominios de enlace de un ligando de bajo peso molecular. La adición de un ligando dímero resulta, entonces, en la dimerización de la proteina de fusión. Procedimientos de dimerización inducibles correspondientes ya están descritas (Amara JF et al. (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94(20): 10618-1623; Muthuswamy S et al. (1999) Mol Cell Biol 19 (10) : 6845-685; Schultz LW y Clardy J (1998) Bioorg Med Chem Lett. 8(1): 1-6; Keenan T et al. (1998) Bioorg Med Chem. 6(8) : 1309-1335) . "Secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario" significa, generalmente, aquellas secuencias, que bajo las condiciones que rigen en la correspondiente célula o el correspondiente organismo eucariota, permiten el reconocimiento y el splicing por medio de la enzima de DSBI . Como ejemplos no limitativos sean mencionadas en la Tabla 1 las secuencias de reconocimiento para las correspondientes enzimas de DSBI. Tabla 1: Secuencias de reconocimiento y organismo de origen de las enzimas de DSBI ("?" indica dentro de una secuencia de reconocimiento el sitio de corte de la enzima de DSBI . ) Enzima de Organismo de Secuencia de DSBI origen Reconocimiento CRE bacteriófago de 5' - Pl AACTCTCATCGCTTCGGATAACTTCCTGTT ATCCGAAACATATCACTCACTTTGGTGATT TCACCGTAACTGTCTATGATTAATG-3' FLP Saccharomyces 5' - cerevisiae GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCT AGAAAGTATAGGAACTTC-3' R plásmido de pSRl 5' - CGAGATCATATCACTGTGGACGTTGATGAA AGAATACGTTATTCTTTCATCAAATCGT P-Elemento Drosophila 5' -CTAGATGAAATAACATAAGGTGG Transposase I-Anil Aspergillus 5' - nidulans TTGAGGAGGTT^TCTCTGTAAATAANNNN NNNNNNNNNN 3' - AACTCCTCCAAAGAGACA T ATTNNNNNN ?????????? I-Ddil Dictyostelium discoideuraAX3 3' -AAAAAACCAG^AGGTCTTCATATA I-Cvul Chlorella 5'- vulgaris CTGGGTTCAAAACGTCGTGAAGACAGTTTG G 3' - GACCCAAGTTTTGCAGACACTCTGTCAAAC C I-Csml Chlamydomonas 5' - smithii GTACTAGCATGGGGTCAAATGTCTTTCTGG I-Cmoel Chlamydomonasmoew 5' -TCGTAGCAGCTACACGGTT usii 3' -AGCATCGATCGAGTGCCAA I-Crel Chl mydomonas 5' - reinhardtii CTGGGTTCAAAACGTCGTGAAGACAGTTTG G 3'- GACCCAAGTTTTGCAGACACTCTGTCAAAC C I-Chul Chlamydomonas 5' - humicola GAAGGTTTGGCACCTCCATGTCGGCTCAT C 3'- CTTCCAAACCGTGAGAGCTACAGCCGAGTA G I-Cpal Chlamydomonas 5' -CGATCCTAAGGTAGCGAA ATTCA pallidostigmatica 3' -GCTAGGATTCCATCAGCTTTAAGT I-CpaII Chlamydomonas 5' -CCCGGCTAACTCATGTGCCAG pallidostigmatica 3' -GGGCCGATATGAGACACGGTC I-Ceul Ch1amydomonas 5' - eugametos CGTAACTATAACGGTCCTAA GGTAGCGAA 3' - GCATTGATATTGCCAGAGATTCCATCGCTT I-Dmol Desulfurococcus 5' - mobilis ATGCCTTGCCGGGTAAAGTTCCGGCGCGCA T 3' - TACGGAACGGCCACATTCAAGGCCGCGCGT A I-Scel S . cerevisiae 5' - AGTTACGCTAGGGATAA'CAGGGTAATATA G 3'- TCAATGCGATCCC TATTGTCCCATTATAT C 5' -TAGGGATAAACAGGGTAAT 3' -ATCCCATATTGTCCCATTA ( "Core"-Sequenz ) I-SceII S . cerevisiae 5' - TTTTGATTCTTTGGTCACCCATGAAGTATA 3' - AAAACT AGAAACCAGATGGGACTTCATAT I-SceIII S . cerevisiae 5' - ATTGGAGGTTTTGGTAAC TATTTATTACC 3' - TAACCTCCAAAACCAATTGATAAATAATGG I-SceIV S . cerevisiae 5'- TCTTTTCTCTTGATTAAGCCCTAATCTACG 3' - AGAAAAGAGAACAT ATCGGGAT AGATGC I-SceV S . cerevisiae 5' -AATAATTTTCTATCTTAGTAATGCC 3' -TTATTAAAAGAAGAATCATTAACGG I-SceVI S . cerevisiae 5' -GTTATTTAATGATTTTAGTAGTTGG 3' -CAATAAATTACAAAATCATCAAACC I-SceVII S . cerevisiae 5'- TGTCACATTGAGGTGCACTAGTTATTAC PI-SceI S . cerevisiae 5' - ATCTATGTCGGGTGCAGGAGAAAGAGGTAA T 3' - TAGATACAGCCACACGCCTCTTTCTCCATT A F-Scel S . cerevisiae 5' -GATGCTGTAGGCAATAGGCTTGGTT 3' -CTACGACA TCCGTATCCGAACCAA F-SceII S . cerevisiae 5' -CTTTCCGCAACA GTAAAATT 3' -GAAAGGCGATTGTCATTTTAA I-Hmul Bacillus subtilis 5' -AGTAATGAGCCTAACGCTCAGCAA bacteriophage 3' -TCATTACTCGGATTGCAGAGTCGTT SP01 I-HmuII Bacillus subtilis 5'- bacteriophage AGTAATGAGCCTAACGCTCAACAANNNNNN SP82 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNN I-Llal Lactococcus 5' -CACATCCATAACACATATCATTTTT lactis 3' -GTGTAGGTATTGGTATAGTAA AAA I-Msol Monomastix 5' - species CTGGGTTCAAAACGTCGTGAAGACAGTTTG G3' - GACCCAAGTTTTGCAGACACTCTGTCAAAC C I-Nanl Naegleria 5' -AAGTCTGGTGCCA GCACCCGC andersoni 3' -TTCAGACCAACGGTCGTGGGCG I-Nitl Naegleria itálica 5' -AAGTCTGGTGCCA-GCACCCGC 3' -TTCAGACCAACGGTCGTGGGCG I-Njal Naegleria 5' -AAGTCTGGTGCCAAGCACCCGC j amiesoni 3' -TTCAGACCAACGGTCGTGGGCG I-Pakl Pseudendoclonium 5' - akinetuin CTGGGTTCAAAACGTCGTGA GACAGTTTG G 3' - GACCCAAGTTTTGCAGACACTCTGTCAAAC C I-Porl Pyrobaculum 5' -GCGAGCCCGTAAGGGTAGTGTACGGG organotrophum 3' -CGCTCGGGCATTACCCACACATGCCC I-Ppol Physa um 5' - polycephalum TAACTATGACTCTCTTAA GGTAGCCAAAT 3' - ATTGATACTGAGAGAAATTCCATCGGTTTA I-Scal S ccharomyces 5' - capensis TGTCACATTGAGGTGCACT?AGTTATTAC 3' - ACAGTGTAACTCCAC?G GATCAATAATG I-Ssp6803I Synechocystis 5' -GTCGGGCTACATAACCCGAA species 3' -CAGCCCGAGTAATTGGGCTT PI-PfuI Pyrococcus 5' - furiosus Vcl GAAGATGGGAGGAGGG ACCGGACTCAACT T 3' - CTTCTACCCTCC TCCCTGGCCTGAGTTGA A PI-PfuII Pyrococcus 5'- furiosus Vcl ACGAATCCATGTGGAGAAAGAGCCTCTATA 3' - TGCTTAGGTACACACTCTTCTCGGAGATAT PI-PloI Pyrococcus 5' -GATTTTAGATACCCTGTACC kodakaraensis 3' -CTAAAA TCTAGGGACATGG KOD1 PI-PkoII Pyrococcus ¦5' -CAGTACTACGAGTTAC kodakaraensis 3' -GTCATGAATGCCAATG KOD1 PI-PspI Pyrococcus sp. 5' - AAAATCCTGGCAAACAGCTATTATAGGGTA T 3' - TTTTAGGACCGTTTGTCGA AAATACCCAT A PI-TfuI Thermococcus 5' -TAGATTTTAGGTACGCTATATCCTTCC fumicolans 3' -ATCTAAAAATCCAGCGATATAGGAAGG ST557 PI-TfuII Thermococcus 5' -TAYGCNGAYACNAGACGGYTTYT fumicolans ST557 3' -ATRCGNCTARTGNCTGCCRAARA Pi-Thyl Thermococcus 5' -TAYGCNGAYACN GACGGYTTYT hydrothermalis 3' -ATRCGNCT~RTGNCTGCCRAARA PI-Tlil Thermococcus 5' -TAYGCNGAYACNGACGGAYTTYT litoralis 3' -ATRCGNCTRTGNCTGCCRAARA PI-Tlill Thermococcus 5' - litoralis AAATTGCTTGCAAACAGCTATTACGGCTAT I-Tevl bacetriófago de 5' -AGTGGTATCAACAGCTCAGTAGATG T4 3' -TCACCATAGT'^TGCGAGTCATCTAC I-TevII bacteriófago de 5 ' - T4 GCTTATGAGTA GAAGTGAACACGT? ATT C 3'- CGAATACTCATACTTCACTTGTGACAATAA G F-Tevl bacteriófago de 5' - T4 G A CACAAGAAAATGTTTAGTAAANNNNN NNNNNNNN 3' - CTTTGTGTTCTTTACAAATCATTTNNNNNN ????????? F-TevII bacteriófago de 5f - T4 TTTAATCCTCGCTTC^AGATATGGCAACTG 3' - AAATTAGGAGCGAAAGTCTATACCGTTGAC Aquí están comprendidas también pequeñas divergencias (degeneraciones) de la secuencia reconocimiento, las que sin embargo permiten un reconocimiento y un splicing por la enzima de DSBI correspondiente. Tales divergencias - también en combinación diferentes condiciones básicas, tales concentraciones de calcio o magnesio - están descritas (Argast GM et al. (1998) J Mol Biol 280: 345-353) . Además, están comprendidas secuencias núcleo (secuencias "Core") de estas secuencias de reconocimiento. Es generalmente conocido, que también las proporciones interiores de las secuencias de reconocimiento son suficientes para una fracción de doble cadena inducida y que las exteriores no son absolutamente necesarios, pero si pueden influir en la eficiencia del slicing. Por ejemplo, para I-Scel se puede definir una secuencia "Core" 18bp. La unión de la estructura de recombinación y la enzima de DSBI dando un sistema de recombinación o bien un procedimiento de la invención se puede realizar mediante diferentes métodos conocidos al perito. Por ejemplo, se puede unir la estructura de recombinación y la enzima de DSBI, de la siguiente forma en un organismo, una célula o un tejido: 1.) Se preparan organismos en la forma acostumbrada, que llevan insertada la cassette de recombinación en el ADN cromosomal. Por ejemplo, se pueden preparar plantas correspondientes por transformación inducida por Agrobacterium. Los transformandos primarios que contienen las cassette de recombinación se usan para la transformación de una cassette de expresión que asegura la expresión de la enzima de DSBI, o se llevan en forma apropiada hasta la homocigosis y sirven, entonces, como organismo huésped (por ejemplo, planta huésped) para la transformación con una cassette de expresión, que asegura la expresión de la enzima de DSBI. Partiendo de estas plantas huésped, se pueden preparar, por ejemplo, cultivos in vitro, como plej . cultivo de callo o embrionales, se pueden establecerlas y usarlas para la transformación. La transformación con la cassette de expresión para la enzima de DSBI puede realizarse en forma estable o transiente. Se preparan unos llamados organismos máster en la forma acostumbrada, que llevan y exprimen el correspondiente gen para la enzima de DSBI (o bien una cassette de expresión, que asegura la expresión de la enzima de DSBI). Por ejemplo, se pueden prearar las correspondientes plantas máster, preferentemente, por transformación inducida por Agrobacterium. Los transformandos primarios que exprimen a la enzima de DSBI se usan para la transformación con la estructura de recombinación o se llevan en forma apropiada a la homocigosis y sirven, entonces, como organismo máster o bien organismo huésped (por ejemplo, planta máster) , en la que se insertan las estructuras de recombinación. Partiendo de estas plantas máster se pueden preparar, por ejemplo, cultivos in vitro, como p.ej. cultivos de callo o embrionales, se pueden establecerlas y usarlas para la transformación. El gen codificante para la enzima de DSBI (o bien una cassette de expresión, que asegura la expresión de la enzima de DSBI) se puede integrar en un vector que ya lleva la cassette de recombinación, y se puede insertar simultáneamente con el gen destino en las células vegetales. Preferentemente, se inserta el gen codificante para la enzima de DSBI entre las secuencias de homología y con ello se deleta, una vez cumplida su función, del ADN cromosomal. Muy preferentemente, se realiza en este caso la expresión de la enzima de DSBI en forma inducible (por ejemplo, bajo el control de los promotores inducibles abajo descritos), en función del desarrollo, usando un promotor en función del desarrollo, o se usa una enzima de DSBI, cuya actividad es inducible, para evitar el corte de la estructura de recombinaciónes inmediatamente después de la transformación y antes de la inserción en el genom .

La cassette de expresión, que asegura la expresión de la enzima de DSBI, se puede transformar con la ayuda de la co-transformación ¦ simultáneamente con la estructura de recombinación, pero en un vector separado en las células. La co-transformación puede realizarse en cada caso en forma estable o transiente. Preferentemente, se realiza en este caso la expresión de la enzima de DSBI en forma inducible (por ejemplo, bajo el control de un promotor inducible abajo descrito) , en función del desarrollo, usando un promotor en función del desarrollo, o se usa una enzima de DSBIe, cuya actividad es inducible, para evitar el corte de la estructura de recombinación inmediatamente después de la transformación y antes de la inserción en el genoma. Organismos, por ejemplo, plantas o también animales, que exprimen a la enzima de DSBI, también pueden servir de socios de hibridación. En las progenies de estas hibridaciones entre organismos, que exprimen a la enzima de DSBI, por una parte, y organismos, que llevan a la estructura de recombinación, por la otra, tienen lugar las roturas de dobles cadenas deseadas y la recombinación entre las secuencias de homología, deletándose, en caso dado, las secuencias localizadas entre las secuencias de homología. 6.) La expresión de la enzima de DSBI también es concebible en una preparación de transformación transiente, en que se valen de las posiblidadades 2 hasta 4 . 7. ) La enzima de DSBI también se puede insertar directamente, por ejemplo, por microinyección, bombardeo de partículas (procedimientos biolísticos) , transfección de polietilenglícol o transfección inducida por liposomas en las células, que representan o bien llevan la estructura de recombinación transgenética. Esta modalidad es ventajosa, ya que no pueden permanecer ningunas secuencias codificantes de la enzima de DSBI en el genoma. Un procedimiento correspondiente está descrito, por ejemplo, en Segal DJ et al. (1995) Proc Nati Acad Sci USA 92:806-810. 8. ) La enzima de DSBI también puede ser generada por inserción del mARN codificante para la enzima de DSBI, generada in vitro, en células (por ejemplo, por microinyección, bombardeo de partículas (procedimientos biolísticos) o por transfección inducida por liposomas). Esta modalidad es ventajosa, ya que no pueden permanecer ningunas secuencias codificantes de la enzima de DSBI en el genoma . 9.) La enzima de DSBI puede ser introducida como proteína de fusión junto con la proteína de VirE2 o VirF de una agrobacteria en células vegetales. Procedimientos correspondientes están descritos, por ejemplo, para la recombinasa de Cre (Vergunst AC et al. (2000) Science. 290: 979-982) . Cuando la cassette de expresión para la proteína de fusión se encuentra aparte de las secuencias "border", entonces no es insertada en el genoma de la planta. Esta modalidad es ventajosa, ya que no pueden permanecer ningunas secuencias codificantes de la enzima de DSBI en el genoma. El sistema o bien procedimiento de recombinación de la invención se puede realizar tanto en organismos intactos como también en partes, células o bienes de multiplicación derivados de los mismos, muy preferentemente, se realizará en plantas intactas y en tejidos vegetales o bien cultivos vegetales in vitro, incluyendo cultivos de callo. Pero también es concebible una aplicación in vitro usando, por ejemplo, extracto se germen de trigo o extracto de recticulocitos . La enzima de DSBI se puede generar, en la forma arriba descrita, usando una cassette de expresión, que contiene el ADN codificante para una enzima de DSBI, y que es insertada en una célula o un organismo eucariota. La cassette de expresión para la enzima de DSBI contiene aquí, preferentemente, una secuencia de ácido nucleico codificante para una enzima de DSBI según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10 o un equivalente funcional de la misma, que es capaz de generar en ADN bicatenario, valiéndose de la secuencia de reconocimiento substancialmente idéntica, roturas de ADN bicatenario. Como secuencias de reconocimiento substancialmente idénticas se definen aquellas secuencias de reconocimiento, que si bien presentan divergencias, con respecto a la secuencia de reconocimiento considerada óptima para la enzima correspondiente, pero que aún permiten un fraccionamiento por medio de esta enzima. Muy preferentemente, la cassette de expresión para la enzima de DSBI contiene una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 o 9. Como cassette de expresión se define - por ejemplo con respecto a la cassette de expresión para la enzima de DSBI - aquellas construcciones, en las que el ADN a exprimir está en enlace funcional con por lo menos un elemento de control genético, que permite o bien regula su expresión (a saber, transcripción y/O translación) . La expresión se puede realizar en forma estable o transiente, constitutiva o inducible. Para la inserción, el perito dispone de diferentes procedimientos directos abajo indicados (p.ej. transfección, bombardeo de partículas, microinyección) o procedimientos indirectos (p.ej. infección con Agrobacterium, infección por virus), que se describen más abajo. Por enlace funcional se entiende, generalmente, una disposición, en la que la secuencia de control genético puede ejecutar su función con respecto a una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico codificante para una enzima de DSBI . La función puede ser, por ejemplo, el control de la expresión, a saber, transcripción y/o translación de la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico codificante para una enzima de DSBI. El control abarca, por ejemplo, la iniciación, incrementación o supresión de la expresión, a saber, la transcripción y, eventualmente , la translación. El control puede realizarse nuevamente, por ejemplo, en forma específica para el tejido o especifico del tiempo. También puede ser inducible, por ejemplo, por químicos especiales, estrés, patógenos, etc. Por enlace funcional se entiende, por ejemplo, la disposición secuencial de un promotor, la secuencia de ácido nucleico a exprimir - por ejemplo, codificante para una enzima de DSBI - y, en caso dado, otros elementos -de regulación, tal como un terminador, de tal forma, que cada elemento de regulación pueda ejecutar su función en la expresión de la secuencia de ácido nucleico - por ejemplo, codificante para una enzima de DSBI. Para ello es no es absolutamente necesario un enlace directo en el sentido químico. Secuencias de control genéticas, tales como secuencias de enhanceres, pueden desempeñar su función también desde posiciones más lejanas o aún desde otras moléculas de ADN sobre la secuencia destino. Son preferibles las disposiciones, en las que la secuencia de ácido nucleico a exprimir - por ejemplo, codificante para una enzima de DSBI - está posicionada detrás de una secuencia que actúa de promotor, de modo que ambas secuencias estén unidas entre si en forma covalente. Preferentemente, la distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico - por ejemplo, codificante para una enzima de DSBI - es por debajo de 200 pares de bases, muy preferentemente, por debajo de 100 pares de bases, especialmente, por debajo de 50 pares de bases. El perito conoce diferentes métodos para obtener una cassette de expresión de este tipo. Se prepara, por ejemplo, preferentemente, por fusión directa de una secuencia de ácido nucleico que actúa de promotor con una secuencia de nucleótido a exprimir - por ejemplo, codificante para una enzima de DSBI. La obtención de un enlace funcional se puede alcanzar mediante técnicas de recombinación y clonado convencionales, tal y como se describen, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), asi como en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) . Una cassette de expresión también puede estar construida de manera, que la secuencia de ácido nucleico a exprimir (p.ej. codificante para una enzima de DSBI), por ejemplo, se somete bajo el control -de un elemento de control genético endógeno, mediante recombinac^ón homologa o también por inserción casual, por ejemplo, el control de un promotor. Tales construcciones también se entienden como cassettes de expresión en el marco de la presente invención. El perito sabe, además, que moléculas de ácido nucleico pueden inducirse a la expresión, usando factores de transcripción artificiales de tipo proteínas de cinc digitiforme (Beerli RR et al. (2000) Proc Nati Acad Sci USA 97 (4) : 1495-500) . Estos factores pueden adaptarse a cualquier región de secuencia arbitraria y permiten una expresión independiente de determinadas secuencias de promotores.

El término "secuencias de control genéticas" debe entenderse en un sentido amplio, y se refiere a todas las secuencias, que influyen en la formación o la función de la cassette de expresión de la invención. Secuencias de control genéticas aseguran, por ejemplo, la transcripción y, en caso dado, la translación en organismos procariotas o eucariotas. Preferentemente, las cassette de expresión de la invención abarcan en dirección 5' corriente arriba de la correspondiente secuencia de ácido nucleico a exprimir, un promotor, y en dirección 3 corriente abajo, una secuencia de terminador, como secuencia de control genética adicional, asi como, en caso dado, otros elementos de regulación habituales, a saber, elementos ligados funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico a exprimir. Secuencias de control genéticas se describen, por ejemplo, en "Goeddel; Gene expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)" o "Gruber and Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Ratón, Florida, eds.:Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108", asi como la literatura allí citada . Ejemplos de secuencias de control de este tipo son las secuencias que se ligan con inductores o represores, regulando asi la expresión del ácido nucleico. Adicionalmente a estas nuevas secuencias de control o en lugar de estas secuencias, puede estar aún existente la regulación de estas secuencias antes de los genes estructuras propios y, en caso esta puede haber sido modificado genéticamente, de manera que la regulación natural esté apagada y la expresión de los genes esté incrementada. Pero la cassette de expresión también puede tener una composición más sencilla, es decir, no se insertan ningunos señales de regulación adicionales antes de los genes antes mencionados y no se elimina el promotor natural con su regulación. En lugar de ello, se muta la secuencia de control natural de tal manera, que ya no tenga lugar ninguna regulación y que la expresión genética sea incrementada. También es posible insertar únicamente estos promotores modificados por si solos antes de los genes naturales para aumentar la actividad. Dependiendo del organismo huésped u organismo de partida abajo descrito en más detalle, que es transformado por inserción de la cassette de expresión o de vectores en un organismo genéticamente modificado o transgenético, son apropiadas diferentes secuencias de control. Secuencias de control ventajosas para las cassette de expresión o los vectores de la invención están contenidos, por ejemplo, en promotores, tales como eos-, tac-, trp-, tet-, phoA-, tat-, lpp-, lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, tre-, ara-, SP6-, ?-PR- o en el promotor de ?-PL, que se aplican, venta osamente, en bacterias gram-negativas .

Otras secuencias de control ventajosas están contenidas, por ejemplo, en los promotores gram-positivos : amy y SP02, en los promotores de levadura o de hongos: ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en promotores de plantas: CaMV/35S (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294), PRP1 (Martini N et al. (1993) Mol Gen Genet . 236 (2-3) : 179-186), SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1, B33, NOS; FBPaseP (WO 98/18940) o en el promotor de ubiquitina o faseolina. Para la expresión en vertebrados, preferentemente, en mamíferos, son apropiados los vectores, tales com el promotor de TK, el promotor de RSV 3' LTR, el promotor de CMV, el promotor de SV40 "early" o late". Otros promotores son conocidos al perito. Promotores inducibles que son apropiados para ser usados en vertebrados, preferentemente, en mamíferos, son, por ejemplo: el promotor/represor de Tet que es inducibles o reprimible por tetraciclina o derivados, el promotor de MMTV-LTR inducible por dexametasona, el promotor Drosophila minimal heat shock, inducible por Eccysone o la ponasterona análoga A (por ejemplo, dentro de sistema de expresión de pVgRXR; Invitrogen, Inc.). Se prefiere, básicamente, cualquier promotor, que es capaz de controlar la expresión de los genes, especialmente de genes ajenos, en plantas. Se prefieren los promotores, que permiten una expresión constitutiva en plantas (Benfey et al. (1989) EMBO J. 8:2195-2202).

Preferentemente, se usa un promotor, especialmente, vegetal o un promotor que procede de un virus vegetal. Se prefiere, especialmente, el promotor del transcripto de 35S del virus en mosaico del coliflor (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. 1986, Plant Mol. Biol. 6, 221-228) o el promotor de 19S CaMV (US 5, 352, 605 y WO 84/02913) . Este promotor contiene, como se sabe, diferentes secuencias de reconocimiento para efectores transcipcionales , que en su totalidad llevan y una expresión permanente y constitutiva del gen insertado (Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202) . Otro promotor constitutivo apropiado es el promotor de "Rubisco small subunit (SSU)" (US 4,962,028) . Un ejemplo de un promotor apropiado es el promotor de leguminaB (GenBank Acc.-No. : X03677) . Otros promotores constitutivos preferidos son, por ejemplo, el promotor de la nopalinsintasa a partir de Agrobacterium, el promotor doble TR, el promotor de OCS ( octopinsintasa) a partir de Agrobacterium, el promotor de ubiquitina (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), los promotores de las subunidades de ATPasa vacuolar o el promotor de la proteina rica en prolina a partir de trigo (WO 91/13991) . Las cassettes de expresión pueden contener también un promotor inducible, preferentemente, un promotor inducible químicamente (Aoyama T y Chua NH (1997) Plant J 11:605-612; Caddick MX et al . (1998) Nat . Biotechnol 16:177-180; Rewiew: Gatz, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1997, 48:89-108), mediante se puede dirigir la expresión del gen exógeno en la planta en un momento determinado. Tales promotores, como p.ej. el promotor de PRP1 (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) , 361-366) , un promotor inducible por ácido slicilico (WO 95/19443), un promotor inducible por bencenosulfonamida (EP-A-0388186) , un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), un promotor inducible por ácido abcisinico (EP-A 335528), un promotor inducible por ácido salicílico (WO 95/19443) o bien un promotor inducible por etanol (Salter MG et al. (1998) Plant J. 16:127-132) o por ciclohexanona (WO 93/21334), también pueden ser usados. En una modalidad muy preferida, se exprime sobre todo el ácido nucleico codificante para la enzima de DSBI ba o el control de un promotor inducible. De este modo se alcanza una expresión y deleción controladas, regulables, por ejemplo, en plantas, y se evita posibles problemas a raíz de la expresión constitutiva de una enzima de DSBI. Además, son preferidos los promotores, que pueden ser inducidos por estrés biótico o abiótico, como por ejemplo, el promotor inducible por patógenos del gen de PRP1 (Ward et al., Plant Mol Biol 1993, 22: 361-366), el promotor de hsp80 inducible por calor del tomate (US 5,187,267), el promotor de alfa-amilasa inducible por frió a partir de la papa (WO 96/12814) o el promotor de pinll inducible por heridas (EP375091) . Además, son preferidos los promotores con especificidades para anteras, ovarios, polen, meristema, flores, hojas, tallos, raices y semillas. Un promotor regulado en función del desarrollo está descrito, por ejemplo, en Baerson et al. (Baerson SR, Lamppa GK (1993) Plant Mol Biol 22 (2 ) : 255-67 ) . Son especialmente apropiados aquellos promotores, que aseguran la expresión in tejidos y partes vegetales, en las que tiene lugar la biosintesis de almidón y/o aceites o bien sus productos intermedios o donde los productos son acumulados vent josamente. El lugar de biosintesis del almidón son los cloroplastos de las hojas o bien los amiloplastos de los órganos de almacenamiento, tales como semillas, frutos o bulbos. En estos órganos son, especialmente, las células del endospermo o las cotiledóneas del embrión, donde tiene lugar la síntesis. Promotores preferidos son, por tanto, además de los promotores constitutivos arriba mencionados, especialmente los promotores específicos de la semillas, por ejemplo, el promotor de la faseolina (US 5, 504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989 ; 1 ( 9) : 839-53 ) , del gen 2S de albúmina (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), den la legúmina (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet . 215 (2) : 326-331) , de USP (unknown seed protein; Báumlein H et al. (1991) Molecular & General Genetics 225 (3) : 459-67) des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K, et al. (1996) L. Planta 199: 515-519), del proteína de sacarosa (WO 00/26388) o el promotor B4 de la legúmina (LeB4; Báumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225:121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2 (2 ) : 233-239; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13 ( 10) : 1090-1093) , el promotor de Ins oleosina a partir de Arabidopsis (W09845461) , el promotor Bce4 a partir de Brassica (WO 91/13980) . Otros promotores específicos de semillas son aquellos de los genes codificantes para la glutenina de alto peso molecular: "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG) , gliadina, enzima de ramificación, pirofosf tasa de ADP glucosa (AGPase) o la sintasa de almidón. Otros promotores preferidos son los promotores que permiten una expresión específica de semillas en monocotiledóneas , tales como maíz, cebada, centeno, arroz, etc. Venta osamente, se puede usar el promotor del gen de lpt2 o lptl (WO 95/15389, WO 95/23230) o los promotores descritos en la WO 99/16890 (promotores del gen de hordeína, del gen de glutelina del gen de orizina, del gen de prolamina, del gen de gliadina, del gen de glutelina, del gen de zeína, del gen de kasirina o del gen de secalina) . Como elementos de control genéticos son preferidos, además, los promotores específicos de polen, como por ejemplo, el promotor del gen de bgpl de B. campestris (GenBank Acc.-No: X68210; Xu H et al. (1993) Mol Gen Genet 239 (1-2) : 58-65; WO 94/13809), del gen ory s 1 de Oryza sativa (GenBank Acc.-No.: AJ012760; Xu H et al. (1995) Gene 164 (2) :255-259) , del gen ZM13 específico de maíz (Hamilton DA et al. (1998) Plant Mol Biol 38 ( 4 ): 663-669 ; US 5, 086, 169), del gen de BplOs de B.napus (GenBank Acc.-No.: X64257; Albani D (1992) Plant J 2 (3) : 331-342 ; US 6,013,859) . Además, se prefiere el promotor de Lcgl para una expresión específica de la célula en gametos machos (WO 99/05281; XU H et al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 96:2554-2558) y el promotor del gen de AtDMCl (Klimyuk VI et al. (1997) Plant J. 11(1) :1-14). Otros promotores apropiados son, por ejemplo, los promotores específicos para bulbos, raíces almacenantes o raíces, como por ejemplo, de la clase de los promotores de patatina clase I (B33) , del promotor del inhibidor de catepsina D a partir de la papa, el promotor de la sintasa del almidón (GBSS1) o el promotor de esporamina, así como los promotores específicos de frutos, tal como el promotor específico de frutos del tomate (EP-A 409625) . Otros promotores apropiados son aquellos, que aseguran una expresión específica de la hoja. Sean mencionados el promotor de la FBPasa cistólica de la papa (WO 98/18940) , .el promotor de SSU (small subunit) del rubiscc (ribulosa-1, 5-bisfosf tcarboxilasa ) o el promotor de ST-LSI a partir de la papa (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8(9):2445-2451) . Promotores preferidos son, adicionalmente , los promotores que regulan la expresión en semillas y en embriones vegetales. Otros promotores, por ejemplo, promotores específicos de f uctificación, como por ejemplo, el promotor específico de fructificación del tomate (WO 94/21794), los promotores específicos de flores, como por ejemplo, el promotor de fitoen-sintasa (WO 92/16635) o el promotor del gen de P-rr (WO 98/22593) un otro promotor específico de nodios, tal y como se describe en la EP-A 249676, se pueden usar ventajosamente. Principalmente, se pueden usar todos los promotores naturales con sus secuencias de regulación, como las arriba mencionadas, para el procedimiento de la invención. Adicionalmente, se pueden usar vent josamente también promotores sintéticos. Secuencias de control genéticas abarcan también otros promotores, elementos de promotor o promotores minimales, que pueden modificar las propiedades reguladoras de la expresión. Así se puede efectuar mediante secuencias de control genéticas, por ejemplo, adicionalmente la expresión específica de tejido en función de determinados factores de estrés. Elementos correspondientes se describen, por ejemplo, para el estrés de agua, ácido abscisínico (Lam E y Chua NH (1991) J Biol Chem 266 (26) : 17131 -17135) y estrés de calor (Schoffl F et al. (1989) Molecular & General Genetics 217(2- 3) :246-53) . Además, otros promotores pueden estar ligados funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico a exprimir, que permiten una expresión en otros tejidos vegetales, como p.ej. bacterias de E.coli. como promotores vegetales son apropiados, en principio, todos los promotores arriba descritos. Secuencias de control genéticas abarcan también la región de 5' no translatada, intrones o la región de 3' no codificante de genes. Se ha demostrado, que esta estas pueden desempeñar una función significante en la regulación de la expresión de genes. Asi se ha observado, que las secuencias de 5' no translatadas pueden reforzar la expresión transiente de genes heterológicos . Además, pueden favorecer la especificidad de tejido (Rouster J et al., Plant J. 1998, 15: 435-440.) . Por el contrario, la región de 5' no translatada del gen de opaque-2 suprime la expresión. Una deleción de la región correspondiente produce un aumento de la actividad genética (Lohmer S et al., Plant Cell 1993, 5:65-73). Secuencias de control genéticas también pueden comprender las secuencias de enlace de ribosoma para la iniciación de la translación. Esto es preferido, sobre todo cuando la secuencia de ácido nucleico a exprimir no facilita secuencias correspondientes o estas no son compatibles con el sistema de expresión. La cassette de expresión puede contener, ventajosamente, una o varias llamadas "secuencias enhancer" ligadas funcionalmente con el promotor, que permiten una expresión transgenética de la secuencia de ácido nucleico. También en el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico a exprimir transgenéticamente se pueden insertar otras secuencias ventajosas, tales como elementos reguladores o terminadores . Las secuencias de ácido nucleico a exprimir transgenéticamente pueden estar contenidas en una o varias copias en la estructura de gen. Secuencias de control genéticas son además, aquellas secuencias que codifican para proteínas de fusión compuestas de una secuencias de señal peptídica. Señales de poliadenilación apropiados como secuencias de control genéticas son las señales de poliadenilación vegetales, preferentemente, aquellas, que corresponden, substancialmente, a señales de poliadenilación de T-ADN a partir de Agrobacterium tumefaciens , especialmente, del gen 3 del T-ADN (octopin-sintasa) del plásmido de Ti, pTiACHS (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 y sig.) o equivalentes funcionales del mismo. Ejemplos de secuencias de terminador especialmente apropiadas son el terminador de OCS (octopin-sintasa) y de NOS (nopalin-sintasa) . Como se ha indicado arriba, las estructuras de recombinación de la invención pueden comprender otras secuencias de ácido nucleico. Tales secuencias de ácido nucleico pueden representar, preferentemente, cassettes de expresión. Como ejemplos no limitativos de las secuencias de ADN a exprimir en las estructuras de expresión sean mencionados : i) Marcadores de selección positivos: Marcadores de selección son necesarios, generalmente, para seleccionar exitosamente células recombinadas homólogamente o transformadas. El marcador incorporado con la estructura de expresión proporciona a las células recombinadas exitosamente o transformadas una resistencia contra un biocida (por ejemplo, un herbicida, tal como fosfinotricina, Glyphosat o bromoxinilo) , un inhibidor de metabolismo, como p.ej. 6-fosfato de 2-desoxiglucosa (WO 98/45456) o un antibiótico, como p.ej. tet aciclina , ampicilina, canamicina, G 418, neomicina o higromicina. El marcador de selección permite seleccionar las células no transformadas (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84) . Marcadores de selección muy preferidos son aquellos que proporcionan una resistencia contra herbicidas. Como ejemplos de marcadores de selección sean mencionados: Secuencias de ADN, que codifican para fosfinotricinacetiltransferasas (PAT), que acetiliza la base libre del inhibidor de glutaminsintasa, fosfinotricina (PPT) , alcanzando de este modo una detoxificación de la PPT (de Block et al. 1987, EMBO J. 6, 2513-2518) (también denominado gen de resistencias contra Bialophosr (bar) ) - genes de 5-enolpiruvilshikimato-3- fosfatsintasa (genes de EPSP sintasa) , que proporcionan una resistencia contra Glyphosatr (N- (fosfonometil) glicina) , - el gen de gox degradante para Glyphosatr codificante para enzimas (Glyphosat oxidoreductasa) , el gen de deh (codificante para una dehalogenasa, que inactiva a Dalaponr) , acetolactatosintasas que inactivan a sulfonilurea e imidazolinona - genes de bxn Gene codificantes para enzimas de nitrilasa que degradan a Bromoxynilr el gen de resistencia contra canamicinada o bien gen de resistencia a G418 (NPTII) . El gen de NPTII codifica para una neomicinfosfotransferasa , que mediante una reacción de fosforilación reduce la acción inhibidora de canamicina, neomicina, G418 y paromomicina - el gen de D0GR1. El gen de D0GR1 fue aislado a partir de la levadura, Saccharomyces cerevisiae (EP 0 807 836) . Codifica para una 2-desoxiglucosa-6-fosfato fosfatasa, que proporciona resistencia contra 2-DOG (Randez- Gil et al. 1995, Yeast 11, 1233-1240) . Marcadores de selección negativos permiten por ejemplo, seleccionar organismos con secuencias exitosamente deletadas, que comprenden el gen marcador (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal 19 (6) : 719-726) . TK thymidine kinase (TK) and diphtheria toxin A fragment (DT-A) , el gen de codA codificante para una citosindeaminasa (Gleve AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40 (2) : 223-35; Pereat RI et al. (1993) Plant Mol. Biol 23(4): 793-799; Stougaard J; (1993) Plant J 3:755-761), das Cytochrom P450 Gen (Koprek et al. (1999) Plant J. 16:719-726), genes codificantes para una haloalcano dehalogenasa (Naested H (1999) Plant J. 18:571- 576), el gen de iaaH (Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9:1797-1810) o el gen de tms2 (Fedoroff NV & Smith DL 1993, Plant J 3 : 273- 289) . ) genes repórter, que codifican para proteínas fácilmente cuantificables y que por medio del color propio o la actividad enzimática aseguran una evaluación de la eficiencia de transformación, del sitio o momento de expresión. Aquí son especialmente preferidos los genes codificantes para proteínas repórter (véase también Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(l):29-44) wie - "green fluorescence protein" (GFP) (Chui L et al., Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al., Biotechniques . 23(5): 912-8, 1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5) : 777-784 ; Haseloff et al. (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94 (6) :2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Nati Acad Sci USA 93 (12) : 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228) . cloroamfenicoltransferasa , luciferasa (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414; Ow et al. (1986) Science, 234:856-859); permite detección de bioluminiscencia . ß-Galactosidasa codificante para una enzima para la que se dispone de diferentes sustratos cromógenos . ß-Glucuronidasa (GUS) (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) o el gen de uidA, que codifica para una enzima para diferentes sustratos cromógenos. Producto genético de R-locus: proteina que regula la producción de pigmentos de antocianina (coloración roja) en tejido vegetal, permitiendo de este modo una análisis directa de la actividad de promotor sin adición de auxiliares adicionales o sustratos cromógenos (Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988). ß-Lactamasa (Sutcliffe (1978) Proc Nati Acad Sci USA 75:3737-3741), enzima para diferentes sustratos cromógenos (p.ej. PADAC, una cefalosporina cromógena) . El producto genético xylE (Zukowsky et al. (1983) Proc Nati Acad Sci USA 80:1101-1105), catecoldioxigenasa , que es capaz de transformar catecoles cromógenos . - Alfa-amila (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8 :241-242) . - Tirosinasa (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129:2703-2714), enzima que oxida la tirosina en DOPA y dopaquinona, que como resultado forman la melanina fácilmente detectable. Aequorin ( Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) : 1259-1268 ) , se puede usar en la detección de bioluminiscencia sensitiva a calcio. La estructura de recombínación de la invención y, en caso dado, los vectores derivados de la misma pueden contener otros elementos de función. El término: "otros elementos de función", debe entenderse en sentido amplio. Preferentemente, se refiere a aquellos elementos, que influyen en la obtención, multiplicación, función, utilidad o valor del sistema de recombinación, la estructura de recombinación de la invención o las células u organismos que los contienen. Como ejemplos no limitativos sean mencionados los siguientes elementos de función: ív) Orígenes de replicación que aseguran una multiplicación de las cassettes de expresión o vectores de la invención, por enemplo, en E. coli. Como ejemplos sean mencionados: ORI (origin of ADN replication) , el pBR322 ori o el P15A ori (Sambrook et al. : Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . v) Regiones de clonado múltiple (MCS) permiten y facilitan la inserción de una o varias secuencias de ácido nucleico. vi) Secuencias, que permiten la recombinación homologa o bien inserción en el genoma de un organismo huésped. vii) Elementos, tales como "secuencias border", que permiten una transferencia inducida por Agrobacterium en células vegetales para la transmisión e integración en el genoma de la planta, como por ejemplo, la delimitación derecha o izquierda de T-ADN o de la región de vir . Todas las cassettes de expresión o elementos de función adicionales pueden estar localizados, como se ha mencionado, entre las secuencias de homología A y B. También pueden hallarse afuera de las mismas. Esto es especialmente ventajoso en las "secuencias border". La inserción de una cassette de recombinación de la invención en una estructura de expresión para una enzima de DSBI en células se puede realizar, venaj osamente, usando vectores, en los que se inserta estas estructuras o bien cassettes. Vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, bacteriófagos, virus, retrovirus o también Agrobacterium. Como vectores para la expresión en E.coli son, preferentemente, pQE70, pQE60 y pQE-9 (QIAGEN, Inc.) ; vectores de pBluescript, vectores de Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech, Inc . ) . Vectores preferidos para la expresión en eucariotas comprenden: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG (Stratagene Inc.); pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia Biotech, Inc.) . Como vectores inducibles sean mencionados; pTet-Thia, Potter-Splice, pcADN4/T0, pcADN4/TO ,/LacZ, pcADN6/TR, pcADN4/T0/Myc-His /LacZ, pcADN4/TO/Myc-His A, pcADN4 /TO/Myc-His B, pcADN4 /TG7Myc~His C, pVgRXR (Invitrogen, Inc.) o la serie pMAM (Clontech, Inc.; GenBank Accession No.: U02443) . Estos ya proporcionan el elemento de ccntrol de regulación inducible, por ejemplo, para una expresión químicamente inducible de una enzima de DSBI . En estos vectores se puede insertar directamente la secuencia de ácido nucleico codificante para una enzima de DSBI. Vectores para la expresión en levadura comprenden, por ejemplo: pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ,pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, PHIL-D2, PHIL-S1, pPIC3SK, pPIC9K, y PA0815 (Invitrogen, Inc.). En una modalidad ventajosa se integra la cassette de expresión mediante vectores de plásmido. Preferentemente, se usan aquellos vectores, que permiten una integración estable de la cassette de expresión en el genoma huésped. Otro objeto de la presente invención se refiere a organismos eucariotas, transgenéticos , que contienen el sistema de recombinación de la invención, asi como células, cultivos de células, tejidos o bienes de multiplicación, como por ejemplo en orgnismos vegetales: hojas, raices, semillas, frutos, polen, etc., derivados de tales organismos. Organismo eucariota, organismo de partida u organismo huésped son organismos inferiores y superiores monocelulares y policelulares. También están comprendidos los microorganismos eucariotas, tales como las levaduras, algas u hongos . Levaduras preferidas son: Candida, Saccharomyces , Hansenula o Pichia, muy preferentemente, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (ATCC Accession No . 201178). Hongos preferidos son: Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria u otros hongos descritos en Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) en la página 15, Tabla 6. Se prefiere especialmente el Hemiascomycet Ashbya gossypii filamentoso. Organismos huésped o de partida preferidos según la invención son, además, los organismos animales y las células o tejidos derivados de los mismos. Organismos animales comprenden, preferentemente, vertebrados e invertebrados. Son especialmente preferidos como vertebrados los mamíferos, tales como perros, gatos, ovejas, cabras, pollos, ratones, ratas o caballos. Células animales preferidas abarcan las células de CHO, COS, HEK293. Invertebrados preferidos comprenden las células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9 o Sf21. Organismos huésped o de partida preferidos como organismos transgenéticos son, sobre todo, las plantas, en el marco de la invención están comprendidos todos los géneros y especies de plantas superiores e inferiores del reino vegetal. Además, están incluidas las plantas maduras, semillas, gérmenes y plántulas, así como partes, bienes de multiplicación derivados de los mismos (por ejemplo, semillas o frutos) y cultivos, como p . e . cultivos celulares. Plantas maduras son plantas en cualguier estadio de desarrollo más allá de las plántulas. Plántulas son plantas jóvenes, no maduras en un temprano estadio de desarrollo. El sistema de recombinación de la invención se puede usar, preferentemente, para las siguientes familias de plantas: Amaranthaceae , Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae-Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Tetragoniacea . Plantas anuales, perennes, monocotiledóneas y dicotiledóneas son organismos huésped preferidos para la obtención de plantas transgenéticas, El uso del sistema de recombinación o bien procedimiento de la invención es ventajoso, además, para todas las plantas de adorno, plantas útiles o árboles de adrno, flores, flores cortados, arbustos o césped. Como ejemplos no limitativos sean mencionados: angiospermos, briofitos, tales como Hepaticae (hepática) y Musci (musgos); pteridofitos , tales como heléchos, eguiseto y licopodios; gimnospermos , tales como coniferos, cicadas, ginco y gnetales; algas, tales como Chlorophyceae , Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae , Bacillariophyceae (diatomeas ) y Euglenophyceae . Plantas en el marco de la ivención comprenden, por ejemplo, pero no en forma limitativa; las familias de las rosáceas, tal como la rosa, ericaceáceas , p,ej. rododendro y azaleas, euforbiáceas, tales como poinsetias y crotón, cariofiláceas, tales como claveles, solanáceas, tales como petunias, gesneriáceas , tal como violeta africana, balsamináceas, p.ej. balsamina, orquidáceas, p.ej. orquídeas, iridáceas, tales como gladiolas, iris, fresias y crócus, compósitas, tales como caléndulas, geraniáceas, tales como generanios, liliáceas, p.ej. drago, moráceas, p.ej. ficus, aráceas, p.j. filodendro y muchos otros. Ejemplos no limitativos de plantas de flores son: la familia de las leguminosas, tales como arverjas, alfalfa y soya; gramíneas, tales como arroz, maíz, trigo; solanáceas, tales como tabaco, y muchas otras; la familia de las umbelíferas, especialmente la especie Daucus , (muy especialmente Daucus carota (zanahoria)) y Apium (muy especialmente, graveolens dulce (apio)) y otras más; la familia de las solanáceas, especialmente el género Lycopersicon, muy especialmente la especie esculentum (tomate) y el género Solanum, muy especialmente la especie tuberosum (papa) y melongena (berenjena) y otras más; y el género Capsicum, muy especialmente la especie annum (pimiento) y otras más; la familia de las leguminosas, especialmente el género Glycine, muy especialmente la especie max (soya) y otras más; y la familia de las cruciferas, especialmente el género Brassica, muy especialmente la especie napus (colza) , campestris (remolacha) , oleráceas cv Tastie (col) , oleráceas cv Snowball Y (coliflor) y oleráceas cv Emperor (bróculi) ; y del género Arabidopsis, muy especialmente la especie thaliana y otras más; la familia de las compósitas, especialmente el género Lactuca, muy especialmente la especie sativa (lechuga) y otras más. Las plantas transgenéticas de la invención son seleccionadas, especialmente, de entre las plantas de cultivo monocotiledóneas , como por ejemplo, las especies de cereales, tales como trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, maíz, arroz o avena, asi como caña de azúcar. Además, las plantas transgenéticas de la invención son seleccionadas de las plantas dicotiledóneas, tales como: Brassicacae, tales como colza (B.napus), berro, Arabidopsis, especies de col o cánola, leguminosas, tales como soya, alfalfa, arverjas, frijoles o maní solanáceas, tales como papas, tabaco, tomates, berenjenas o pimientos, asteráceas, tales como girasoles, tagetes, lechuga o caléndula, cucurbitáceas, tales como melones, calabazas, o calabacita, asi como lino, almidón, cáñamo, pimiento rojo, zanahoria, remolacha de azúcar y las diversas especies de árboles, nueces y vinos. Son muy preferidos: Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum y colua, asi como sus géneros y especies que son usados como alimentos humanos y animales, como las especies de cereales arriba descritos, o que son apropiadas paa la obtención de aceites, tales como semillas oleaginosas (por ejemplo, colza), especies de nueces, soya, girasoles, calabazas y maní. Organismos vegetales en el sentido de la invención son, además, los organismos con actividad fotosintética, tales como las algas o cianobacterias , asi como los musgos. Algas preferidas son las algas verdes, como por ejemplo, las algas de los géneros Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox o Dunaliella. La obtención de un organismo transformado o una célula transformada la inserción del ADN correspondiente en la célula huésped correspondiente. Para este proceso, que se denomina transformación, se dispone de múltiples métodos (véase también Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185:527-537) . Por ejemplo, se puede insertar el ADN directamente por micoinyección o por bombardeo con microparticulas recubiertas con ADN. Pero también es posible per eabili zar la célula químicamente, por ejemplo, con polietilenglicol , de modo que el ADN pueda entrar en la célula por difución. El ADN tqambién puede ser insertado por fusión de protoplastos con otras unidades que contienen ADN, tales como minicélulas, células lisosomas o liposomas. Otro método apropiado para la integración de ADN es la electroporación, en donde las células son permeabilisadas reversiblemente con un impulso eléctrico. Como métodos generales preferidos, sean mencionados: la transfección inducida por fosfato de calcio, la transfección inducida por DEAE-dextrano, la transfección catiónica inducida por lipidos, la electroporacion, transducción, infección. Tales procedimientos son conocidos al perito y se encuentran descriutos, por ejemplo, por Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) . En las plantas se utilizan los métodos conocidos al perito de la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales para la transformación transiente o estable. Métodos apropiados son, sobre todo, la transformación de protoplastos por integración de ADN inducida por polietilenglicol , procedimientos bioliticos, tales como el cañón genético (método de "particle bo bardment") , la electroporacion, la incubación de embrios secos, asi como la transformación de células o tejidos intactos por micro o macroinyeccion en tejidos o embriones en solución conteniendo ADN, o la filtración a vacio de semillas. En caso de una inyección o electroporacion de ADN en células vegetales, el plásmido no tiene que cumplir requisitos especiales. Se pueden usar plásmidos simples, como los de la serie pUC. Cuando se desea regenerar plantas enteras a partir de las células transformadas, entonces es útil, que en el plásmido se encuentre un gen marcador adicional seleccionable . Cada tejido vegetal puede servir de material celular. Igualmente, se puede realizar la expresión en callo, tejido embrional o bien en embriones somáticos. Además de estas técnicas de transformación "directas" se puede realizar la transformación también por infección bacteriana mediante Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Estas cepas contienen un plásmido (plásmido Ti o bien Ri) . Una parte de este plásmido, denominada T-ADN (transferred ADN) , es transferida sobre la planta después de la infección con la agrobacteria e intregrada en el genoma de la célula vegetal. La estructura de recombinación o la cassette de expresión para la enzima de DSBI son integradas, preferentemente, en plásmidos especiales, o bien en un vector intermedio (denominado en inglés: shuttle o intermedíate vector) o en un vector binario. Cuando para la transformación se desar usar, por ejemplo, un plásmido de Ti o Ri, por lo menos la deliminación derecha, pero en la mayoría de los casos la delimitación derecha e izquierda del T-ADN del plásmido de Ti o Ri están ligados como regiones flanqueantes con la cassette de expresión a integrar. Preferentemente, se usan vectores binarios. Los vectores binarios pueden replicar tanto en E. coli como también en Agrobacterium. Contienen, generalmente, un gen de marcador de selección y un linker o polilinker flanqueado por la secuencia de delimitación derecha e izquierda de T-ADN. Pueden ser transformados directamente en Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187) . El gen de marcador de selección permite seleccionar Agrobacterium transformadas, y es, por ejemplo, el gen de nptll, que proporciona una resistncia contra canamicina. La agrobacteria que en este caso sirve de organismo huésped, deberla contener ya un plásmido con una región de vir. Esta es necesaria para la transmisión del T-ADN sobre la célula vegetal. Una agrobacteria asi transformada puede usarse para la transformación de células vegetales . El uso de Agrobakterium tumefaciens para la transformación de plantas, usando explantes de cultivos de tejidos está descrito en Horsch et al. (Horsch RB (1986) Proc Nati Acad Sci USA 83 ( 8 ) : 2571-2575 ) , Fraley et al. (Fraley et al. 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80, 4803-4807) y Bevans et al. (Bevans et al. 1983, Nature 304, 184-187) . Numerosas cepas de Agrobakterium tumefaciens son capaces de tranferir material genético - por ejemplo, las estructuras de recombinación de la invención -, como por ejemplo, las cepas: EHA101 [???????] , EHA105 [pEHA105] , LBA4404 [pAL4404 ] , C58Cl[pMP90] y C58C1 [pGV2260 ] . La cepa EHA101 [pEHAlOl] se encuentra descrtita por Hood et al. (Hood EE et al. (1996) J Bacteriol 168 (3) : 1291-1301) , la cepa EHA105 [pEHA105] , por Hood et al. (Hood et al. 1993, Transgenic Research 2, 208-218), la cepa LBA4404 [pAL4404] , por Hoekema et al. (Hoekema et al. 1983, Nature 303, 179-181), la cepa C58C1 [pMP90 ] , por Koncz y Schell (Koncz and Schell 1986, Mol. Gen. Genet . 204, 383-396) y la cepa C58C1 [pGV2260 ] , por Deblaere et al. (Deblaere et al. 1985, Nucí. Acids Res. 13, 4777-4788) . La cepa de agrobacteria usada para la transformación contiene adicionalmente a su plásmido de Ti desarmante, un plásmido binario con el T-ADN a tranferir, que por regla general, contiene un gen para la selección de las células transformadas y el gen a transferir. Ambos genes deben estar dotados de señales de iniciación y terminación transcripcionales y translacionales . El plásmido binario se puede transferir, por ejemplo, por electroporación u otros métodos de transformación en las cepas de Agrobacterium (Mozo & Hooykaas 1991, Plant Mol. Biol. 16, 917-918) . El co-cultivo de los explantes con la cepa de agrobacteria tiene lugar, generalmente, por dos a tres días. Diferentes vectors fueron o son útiles . Básicamente, se puede distinguir entre vectores, que pueden usarse para la transformación inducida por Agrobacterium o bien por agroinfección, a saber, que contienen las estructuras de recombinación o bien la cassette de expresión para la expresión de la enzima de DSBI, dentro de un T-ADN, lo que permite aún una integración estable del T-ADN en el genoma de la planta. Además, se pueden usar vectores exentos de secuencias border, que pueden ser transformados, por ejemplo, por bombardeo de partículas, en células vegetales y pueen llevar en estas aún a una expresión transciente pero también a una expresión estable. El uso de T-ADN para la transformación de células vegetales se ha estudiado y descrito en detalle (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit . Rev. Plant. Sci., 4:1-46 and An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287) . Se conocen diferentes veccores binarios y se obtienen, en parte, en el comercio, como por ejemplo, pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA) . Para la transferencia del ADN sobre la célula vegetal se co-cultivan explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Partiendo de material celular vegetal infectado (p.ej. partes de hojas, raíces o tallos, pero también protoplastos o suspensiones de células vegetales) se pueden regenerar plantas enteras usando un meció apropiado, que puede contener, por ejemplo, antibióticos o biocidas para la selección de células transformadas. La plantas obtendidas pueden ser revisadas, con respecto a la presencia del ADN insertado, aquí la estructura de recombinación o la cassette de expresión de la invención para la enzima de DSBI . Una vez que el ADN esté integrado en el genoma huésped, el genotipo correspondiente es, generalmente, estable, y la inserción correspondiente se encuentra nuevamente en las generaciones posteriores. Por regla general, la cassette de expresión integrada contiene un marcador de selección, que confiere a la planta transformada una resistencia contra un biocida (por ejemplo, un herbicida) o un antibiótico, tal como canamícína, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina, etc. El marcador de selección permite seleccionar las células transformadas de las no transformadas (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84) . Las plantas obtenidas pueden ser cultivadas y cruzadas en la forma acostumbrada. Se deberían cultivar dos o más generaciones para estar seguro, que la integración en el genoma es estable y hereditable. Los procedimientos mencionados están descritos, por ejemplo, en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol . 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128 -143, así como en: Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) . Preferentemente, la estructura a exprimir es clonado en un vector apropiado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, pBinl9 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12 (1984) , 8711) . La transformación inducida por Agrobacterium es más apropiada para céluals de platnas dicotiledónesas , mientras que las ténciaas de transformación directa son apropiadas para cualquier tipo de célula. Células transformadas, a saber, aquellas, que contienen el ADN insetado integrado en la célula huésped, puedense pueden seleccionar de las no transformadas, cuando un marcador seleccionable es parte integrante de un ADN insertado. Como marcador puede actuar, por ejemplo, cualquier gen que es capaz de proporcionar una resistencia contra antibióticos o herbicidas. Células transformadas, que exprimen a un gen marcador de este tipo, son capaces de sobrevivir en presencia de concentraciones del antibiótico o herbicida correspondiente, que destruyen a un tipo salvaje no transformado. Diferentes marcadores de selección positivos y negativos se describen más arriba. Un ejemplo es el gen de bar que confiere resistencia contra el herbicida, fosfinotricina (Rathore KS et al.,Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21 (5) : 871-884) , el gen de nptll, que confiere resistencia contra canamicina, el gen de hpt, que proporciona resistencia contra higromicina, o el gen de EPSP, que confiere resistencia contra el herbicida, Glyphosat. Una vez tranformada una célual vegetal, se puede obterer una platnas entera, aplicando los procedimientos conodicos al perito. Aquí se parte, por ejemplo, de cultivos de callo. A partir de estas masas aún no diferenciadas se puede inducir de manera en si conocida la formación del germen y de la raíz. Los gérmenes obtenidos pueden ser plantados y cultivados. La invención abarca, además, las células, cultivos de células, partes, como en el caso de organismos vegetales transgenéticos, los raices, hojas, etc., derivados de los organismos transgenéticos arriba descritos, y los bienes de multiplicación transgenéticos (tales como semillas o frutos) . Plantas según la invención, genéticamente modificadas, que pueden ser comidad por el hombre o animales, también se pueden usar, por ejemplo, directamente so después de una elaboración ulterior conocida, como alimentos humanos o animales. Aquí es sensato efectuar una deleción de, por ejemplo, resistencia contra antibióticos y/o herbicidas, que son f ecuenemente insertados en la generación de plantas transgenéticas, por razones de la aceptación por parte del cliente pero también por razones de la seguridad de producto. Otro objeto de la invención es el uso de los organismos transgénicos de la invención arriba descritos y de las células, cultivos de células, partes, como por ejemplo en el eso de organismos vegetales transgénicos, raíces, hojas, etc., y bienes de multiplicación, tales como semillas o frutos, para la obtención de alimentos humanos o animales, fármacos o químicos finos. También en este caso es ventajosa una deleción de, por ejemplo, resistencias a antibióticos y/o herbicidas por razones' de la aceptación por parte del cliente y la seguridad de producto. Químicos finos son enzimas, vitaminas, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos, sabores y aromas naturales y sintéticos y colorantes en un sentido amplio. Es especialmente preferida la producción de tocoferoles y tocotrienoles , así como carotinoides . El cultivo .de los organismos huésped transformados, así como el aislamiento a partir de los organismos huésped o bien el medio de cultivo se realiza según procedimientos conocidos al perito. La producción de fármacos, tales como anticuerpos o vacunas está descrita (Hood EE, Jilka JM. (1999) Curr Opin Biotechnol. 10 ( ) : 382-386; Ma JK y Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol.236:275-92) . Además, el sistema de recombinación o bien procedimiento de la invención ofrece diferentes posibilidades de aplicación ventajosas, que no se pueden alcanzar con los procedimientos de deleción del estado de la técnica descritos. Diferentes ejemplos de aplicación no limitativas se describen a continuación: 1. Deleción simple de una secuencia de ácido nucleico del ADN cromosomal de un organismo: Usando secuencias de homología A y B arbitrarios se puede deletar las secuencias de ácido nucleico localizadas entre estas secuencias. La secuencia recombinada a partir de las secuencias de homología A y B permanece en el genoma. El procedimiento es apropiado, por ejemplo, para eliminar nuevamente marcadores de selección después de la obtención de un organismo transgenético, por ejemplo, una planta transgenética, del ADN cromosomal. El procedimiento está representado esquemáticamente en la Fig. 2 y 3, esando representada en la Fig. 2 la variante con una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario, y en la Fig. 3, la variante con dos secuencias de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario. Deleción completa de secuencias de ácido nucleico heterológicas integradas transgenéticamente del ADN cromosomal de un organismo : Usando secuencias de homología A y B, que son homologas con determinadas secuencias del organismo, se puede integrar la estructura de expresión por recombinación homologa en el organismo. Usando el sistema de recombinación o bien el procedimiento de la invención, se deletarían las secuencias de ácido nucleico localizadas entre las secuencias de homología. La recombinación homologa inducida entre las secuencias de homología A y B restaura la secuencia original. La estructura es eliminada sin residuos del ADN cromosomal. El procedimiento es apropiado, por ejemplo, para eliminar marcadores de selección después de la obtención de una planta transgenética nuevamente del ADN cromosomal. Además, el sistema o bien procedimiento de la invención es apropiado para exprimir transitoriamente determinadas proteínas para alcanzar un efecto ventajoso, y apagarlo nuevamente, valiéndose de una expresión o actividad inducida por una enzima de DSBI, eliminado nuevamente el gen correspondiente irreversiblemente del genoma . El procedimiento está representado esquemáticamente en la Fig. 4, en la que se representa la variante con dos secuencias de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario. El sistema se puede realizar igualmente con una secuencia de reconocimiento; sin embargo en caso de inserciones más grandes entre las secuencias de homología A y B, son ventajosos dos sitios de corte, ya que así se puede incrementar aún más la eficiencia de la deleción y recombinación homologa. (Dentro de la región de la secuencia a deletar pueden estar localizadas otras secuencias de reconocimiento.) Activación genética inducida por deleción específica de secuencias de ácido nucleico: Usando secuencias de homología A y B, cuya recombinación homologa restaura, por ejemplo, un marco de lectura completamente abierto de una proteína o bien un promotor aapaz de funcionar, s puede realizar, independientemente de la presencia de la enzima de DSBI, la expresión inducida de proteínas destino. Usando el sistema o bien el procedimiento de recombinación de la invención, se deletarían las secuencias de ácido nucleico localizadas entre las secuencias de homología. El procedimiento está representado esquemáticamente en la Fig. 5 y 6, estando representada en la Fig. 6 una variante especial del procedimiento general representado en la Fig. 5, en la que la estructura de recombinación se inseirta previamente por recombinación homologa en un gen endógeno, por lo que este puede ser activado induciblemente, independientemente de la presencia de la enzima de DSBI. La Fig. 7a ilustra este sistema de la activación genética en un ejemplo de aplicación concreto, en el que se reconstituye el gen de la ß-glucuronidasa (GUS) , usando el sistema o bien procedimiento de la invención, lo que facilita una reacción cromática (véase la descripción en la Fig. 7a y los ejemplos). Sistema fácilmente seleccionable para la deleción de una secuencia de ácido nucleico del ADN cromosomal de un organismo: En una modalidad preferida, la estructura de recombinación contiene un marcador de selección ppsitivo y un marcador de selección negativo (y, en caso dado, otras secuencias de ácido nucleico a deletar) de tal manera, que en la inducción de las roturas de dobles cadenas se deletan ambos marcadores. Un sistema correspondiente está representado en la Fig. 8 y 9 (A) . Además, también la cassette de expresión para la enzima de DSBI puede estar contenida entre las secuencias de homología (Fig. 10 (B) ) , efectuándose la expresión, preferentemente, bajo el control de un promotor inducible (Pi) (p.ej.: Aoyama T y Chua NH (1997) Plant J 11:605-612; Caddick MX et al. (1998) Nat. Biotechnol 16:177-180). A como ya se ha descrito, pueden estar contenidas otras secuencias de ácido nucleico adicionales (Fig. 9 (C) ) . La expresión de la enzima de DSBI resulta en todos los casos en que las secuencia de ADN, que están situada ssntre las dos secuencias de reconocimiento, son eliminadas, y que las secuencias homologas se recombinen . Ya que la células perden simultáneamente un marcador de selección negativo, las céluals con una deleción exitosa pueden ser identificadas por selección (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40:223-235) . A partir de las células asi obtenidas se pueden regenar y multiplicar, por ejemplo, en caso de células vegetales, las plantas completas correspondientes, que ahora ya no contienen ningunos genes de marcación. Manipulación genética del genoma huésped: El sistema o bien procedimiento de recombinación de la invención se puede usar para modificaciones in situ del genoma huésped.

Asi ya puede estar presente, por ejemplo, una secuencias de homología en forma endógena en el genoma . Después de la inserción de la segunda secuencia de homología ligada con una secuencia de reconocimiento de la enzima de DSBI se eliminan posibles secuencias de regulación o codificantes situadas entre las secuencias de homología A y B del genoma. Al mismo tiempo es concebible, que la estructura de recombinación comprenda secuencias reguladoras o codificantes, que después de la deleción son eliminadas nuevamente del organismo. Por ejemplo, se puede regular transitoriamente un gen endógeno en forma específica. En una modalidad preferida, se incrementa la eficiencia del sistema de recombinación por combinación con sistemas, que fomentan la recombinación homologa. Tales sistemas están descritos y comprende, por ejemplo, la expresión de proteínas, tales como RecA o el tratamiento con inhibidores de PARP . Se ha podido mostar, que la recorrúoinación homologa intracromosomal en plantas de tabaco puede ser incrementada por el uso de los inhibidores de PARP (Puchta H et al. (1995) Plant J. 7:203-210). Caundo se usan estos inhibidores, se puede aumentar aún más el nivel de la recombinación homologa en las estructuras de recombinación tras inducción de la fracción de doble cadena de ADN especifica de secuencia y con ello la eficiencia de la deleción de las secuencias trangenéticas .. Aquí se pueden usar diferentes inhibidores de PARP. Están comprendidos, preferentemente, los inhibidores, tales como 3-aminobenzamida, 8-hidroxi-2-metilquinazolin-4-ona (NU1025), 1, llb-dihidro- [2H] benzopirano [4, 3, 2 -de] isoquinoli -3-ona (GPI 6150), 5-aminoisoquinolinona, 3 , 4-dihidro-5- [ 4- ( 1-piperidinil) butoxi] -1 (2H) -isoquinolinona o los compuestos descritos en la O 00/26192, O 00/29384, WO 00/32579, WO 00/64878, WO 00/68206, WO 00/67734, WO 01/23386 y la WO 01/23390. Adicionalmente, se pueden aumenar diversas reacciones de recombinación homologa en plantas por la expresión del gen de RecA de E. coli en su frecuencia (Reiss B et al. (1996) Proc Nati Acad Sci USA 93 (7 ) : 3094-3098 ) . En presencia de la proteina se desplaua la relación entre la reparación homologa y la reparación ilegitima de DSB a favor de la reparación homologa (Reiss B et al. (2000) Proc Nati Acad Sci USA 97 ( 7 ) : 3358-3363 ) . También sea remitido a los proceidmientos descritos en la WO 97/08331 para el incremetno de la recombinación en plantas. Un aumento adicional de la eficiencia del sistema de recombinación se podia alcanzar con la expresión simultánea del gen de RecA o de otros genes que aumentan la eficiencia de recombianción (Shalev G et al. (1999) Proc Nati Acad Sci USA 96 ( 13 ) : 7398 -402 ) . Los sistemas arriba mencionados para el fomento de la recombinación homologa también se pueden usar ventajosamente, en todos los casos, en los que se desea insertar la estructura de recombinación específicamente por recombinación homologa en el genoma de un organismo eucariota. Secuencias 1. SEQ ID NO: 1 secuencia de ácido nucleico para la endonucleasa de I-Scel Homing. 2. SEQ ID NO: 2 secuencia de proteína para la la endonucleasa de I-Scel Homing. 3. SEQ ID NO: 3 secuencia de ácido nucleico para la proteína de fusión a partir de la endonuclease de I-ChuI Homing y secuencia de localización nuclear N-terminal . 4. SEQ ID NO: 4 secuencia de proteína para la proteína de fusión a partir de endonucleasa de I-ChuI Homing y secuencia de localización nuclear N-terminal. 5. SEQ ID NO: 5 secuencia de ácido nucleico para la proteína de fusión a partir de endonucleasa de I- Crel Homing y secuencia de localización nuclear N- terminal . 6. SEQ ID NO: 6 secuencia de proteina para la proteína de fusión a partir de endonucleasa de I-Creí Homing y secuencia de localización nuclear N-terminal. . SEQ ID NO: 7 secuencia de ácido nucleico para la proteina de fusión a partir de endonucleasa de I- Cpal Homing y secuencia de localización nuclear N- terminal. 8. SEQ ID NO: 8 secuencia de proteina para la proteina de fusión a partir de endonucleasa de I-Cpal Homing y secuencia de localización nuclear N-terminal. 9. SEQ ID NO: 9 secuencia de ácido nucleico para la proteina de fusión a partir de la endonucleasa de I-CpaII Homing y secuencia de localización nuclear N-terminal . 10. SEQ ID NO: 10 secuencia de proteina para la proteina de fusión a partir de la endonucleasa de I-CpaII Homing y secuencia de localización nuclear N-terminal . 11. SEQ ID NO: 11: Primer de oligonucleótido, OPNl 5'-CGG CTC GAG CTA CGG GGA CGA TTT CTT TTT TTC AC- 3' 12. SEQ ID NO: 12: Primer de oligonucleótido, 0PN2 5 ' -CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC AT GAA TAC AAA ATA TAA TAA AGA GTT CTT ACT C-3' 13. SEQ ID NO: 13: Primer de oligonucleótido, OPN3 5'-CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG GAC ATT AAT CCT CAA TGG ATT ACA GG- 3' 14. SEQ ID NO: 14: Primer de oligonucleótido, OPN4 5' -CGG CTC GAG TTA CTC GCC AGT TTC TTC AAA ACG-3' 15. SEQ ID NO: 15: Primer de oligonucleótido, OPN5 5 ' -CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG ACC GAT TCT AAA TCT AGA AAC AAC-3' 16. SEQ ID NO: 16: Primer de oligonucleótido, OPN6 5' -CGG CTC GAG CTA AAG GTG GCC TTT ATT GCC ATC AG- 3' 17. SEQ ID NO: 17: Primer de oligonucleótido, OPN7 5 ' -CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG TCA TTA ACA CAA CAA CAA AAA GAC-3' 18. SEQ ID NO: 18: Primer de oligonucleótido, 0PN8 5' -CGG CTC GAG CTA AAG GTG GCC TTT ATT GCC ATC AG- 3' 19. SEQ ID NO: 19: Primer de oligonucleótido, 0PN9 5 ' -CGG CTC TAG AGC GGC CGC CTA GGG ATA ACA GGG TAA TAG AAT CCC ACA AAA ATC TGA GCT TAA CAG 3' 20. SEQ ID NO: 20: Primer de oligonucleótido , OPN10 5' -CGG CTC TAG ACT ATT ACC CTG TTA TCC CTA GGC CCG ATC TAG TAA CAT AGA TGA CAC CGC GCG CG 3' 21. SEQ ID NO: 21: Primer de oligonucleótido, OPN11 5?- CGG AAG CTT CGT CAC CAA TCC CAA TTC GAT CTA C - 3 22. SEQ ID NO: 22: Primer de oligonucleótido, OPN12 5 - CGG AAG CTT CCA CTT GCA AAG TCC CGC TAG TGC C - 3 ? 23. SEQ ID NO: 23: Primer de oligonucleótido, OPN13 5^- CGG AAG CTT CGT CAC CAA TCC CAA TTC GAT CTA C - 3 24. SEQ ID NO: 24: Primer de oligonucleótido, OPN14 5?- CGG AAG CTT CCA CTT GCA AAG TCC CGC TAG TGC C - 3 25. SEQ ID NO: 25: Primer de oligonucleótido, OPN15 5'- CTA GTA CAA AAC GTC GTG AGA CAT TTT AAT CTG AAG GTT TGG CAC CTC GAT GTC GGC TCA TC-3' 26. SEQ ID NO: 26: Primer de oligonucleótido, OPN16 5' -CTA GGA TGA GCC GTC ATC GAG GTG CCA AAC CTT CAG ATT AAA ATG TCT CAC GAC GTT TTG TA-3' 27. SEQ ID NO: 27: Primer de oligonucleótido, OPN17 5' -CTA GTC CGA AAA CGC CGT GAG ACA TAT TGG TTA CGA TCC TAA GGT AGC GAA ATT CAC CCG GTA ACT CTG TGC CAG-3' 28. SEQ ID NO: 28: Primer de oligonucleótido, 0PN18 5'-CTA GCT GGC ACA GAG TTA CCG GGT GAA TTT CGC TAC CTT AGG ATC GTA ACC AAT ATG TCT CAC GGC GTT TTC GGA-3 ' 29. SEQ ID NO: 29: secuencia de localización nuclear, NLSl N-Pro-lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Val-C 30. SEQ ID NO: 30: secuencia de localización nuclear, NLS2 N-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-C (SEQ ID NO: 30) Gráficas Para las gráficas valen las siguientes abreviaturas : secuencia de homología A secuencia de homología B secuencia como resultado de la recombinación homologa a partir de Hl y H2 primera secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario segunda secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario enzima de DSBI promotor u otro elemento de control genético otra secuencia de ácido nucleico marcador de selección negativo marcador de selección positivo parte delantera de, por ejemplo, un gen o un marco de lectura abierto parte trasera de, por ejemplo, un gen o un marco de lectura abierto interrupción del gen o del marco de lectura abierto, ejemplo, por un codon de stop o el desplazamiento del marco de lectura. 1: Descripción del principio de la invención Secuencias en el genoma se pueden eliminar eficientemente, cuando están flanqueadas por las secuencias de homología Hl y H2 y se encuentra entre las secuencias de homología un sitio de corte (SI) para una enzima de DSBI . Por la acción de la enzima de DSBI (E) sobre esta cassette de recombinación (H1-S1-H2) se genera la formación de roturas de dobles cadenas en el sitio de corte SI y se eliminan las secuencias que se encuentran entre las secuencias Hl y H2. 2: Modalidad preferida Secuencias - aquí por ejemplo, una cassette de expresión compuesta de un promotor (P) y otra secuencia de ácido nucleico a exprimir (N) (por ejemplo, un marcador de selección) - pueden ser eliminados eficientemente del ADN cromosomal, cuando están flanqueadas por las secuencias de homología Hl y H2 y cuando entre las secuencias de homología se halla un sitio de corte (SI) para una enzima de DSBI. Por la acción de la enzima de DSBI (E) sobre esta cassette de recombinación (H1-S1-P-N-H2) generan roturas de dobles cadenas en el sitio de corte SI y se eliminan las secuencias situadas entre las secuencias Hl y H2.

Este sitio de corte SI también puede estar localizado detrás o en la cassette de expresión. Fig. 3: Modalidad preferida Secuencias - aquí por ejemplo, una cassette de expresión compuesta de un promotor (P) y otra secuencia de ácido nucleico a exprimir (N) (por ejemplo, un marcador de selección) - pueden ser eliminadas en forma especialmente eficiente del ADN cromosomal, cuando están flanqueadas por las secuencias de homología Hl y H2 y cuando antes o después de la secuencia de ácido nucleico a deletar se encuanra un sitio de corte (SI y S2) para una enzima de DSBI. Por la acción de la enzima de DSBI (E) sobre esta cassette de recombinación (Hl-Sl- P-N-S2-H2) se generan roturas de dobles cadenas en los sitios de corte SI y S2 y se eliminan las secuencias situadas entre las secuencias Hl y H2. 4 : Modalidad preferida Secuencias - aquí por ejemplo, una cassette de expresión compuesta de un promotor (P) y otra secuencia de ácido nucleico a exprimir (N) (por ejemplo, un marcador de selección) - pueden eliminarse casi sin trazas del ADN cromosomal, cuando la estructura de recombinación que los comprende ha sido insertada previamente, por ejemplo, por una recombinación homologa, en el genoma huésped. En este proceso se interrumpe el gen compuesto de las secciones de secuencia, TI, Hl/2 y T2. La estructura de recombinación está flanqueada por dos partes del gen interrumpido (Tl-Hl o bien H2-T2), habiéndose duplicado la parte media (Hl o H2) , para permitir la recombinación homologa. Por la acción de la enzima de DSBI (E) en los sitios de corte (SI y S2) se generan roturas de dobles cadenas y se induce la recombinación homologa entre las secuencias de homología Hl y H2, deletándose, por un lado, las secuencias situadas entre las secuencias Hl y H2, y restaurándose, por el otro, el gen de partida. 5: Modalidad preferida Secuencias de ácido nucleico (aquí un gen con la secuencia T1-H1/2-T2 bajo el control de un promotor P) pueden ser exprimidas induciblemente, reconstuyendo el gen intacto, primero, por aplicación del sistema de recombinación. El gen, compuesto de las secciones de secuencia, TI, Hl/2 y T2 , es inactivado, por ejemplo, por inserción de un codon de stop u otras interrupciones de 1 marco de lectura dentro de la des estructura de recombinación. La estructura de recombinación está flanqueada por dos partes del gen interrumpido (Tl-Hl o bien H2- T2 ) , habiéndose duplicado la parte media (Hl o H2), para permitir la recombinación homologa. Por la acción de la enzima de DSBI (E) en los sitios de corte (SI y S2) se genera la inducción de roturas de dobles cadenas y la inducción de la recombinación homologa entre las secuencias de homología Hl y H2 , deletándose, por un lado, las secuencias situadas entre Hl y H2, y restaurándose, por el otro, el gen intacto. 6: Modalidad preferida La Figura representa un procedimiento que es parecido al procedimiento representado en la Fig, 5, sólo que aquí se activa específicamente un gen por integración de una estructura de recombinación, por ejemplo, mediante una recombinación homologa. Fig. 7a: Ejemplo de aplicación La Figura ilustra una modalidad concreta del procedimiento descrito en la Fig. 6. Se inserta una estructura de recombinación por transfección inducida por agrobacteria. La estructua contiene, flanqueada por la "secuencia border" derecha e izquierda (RB o bien LB) el marco de lectura interrumpido del gen de GUS (ß-glucuronidasa) bajo el control del promotor de 35S promotores (P) y del terminador de nopalinsintasa (nos) . La región media del gen de GUS (U) fue duplicada y representa las secuencias de homología A y B. Entre estas secuencias se encuentra como marcador de selección negativo el gen de codA bajo el control del promotor 35? del virus en mosaico del coliflor (CaMV) y del terminador de nopalinsintasa (nos) , flanqueado por dos secuencias de reconocimiento de la enzima de DSBI (SI y S2) . Además, estructura de recombinación contiene todavía como marcador de selección positivo el gen de BAR bajo el control del promotor 35S (P) y el terminador 35S. La Fig.7a ilustra la generación de fracciones de dobles cadenas producidas por la acción de la enzima de DSBI y la recombinación homologa entre las secuencias de homología U, por lo cual, por un lado, son deletadas las secuencias situadas entre las secuencias de homología U, y, por el otro lado, es resataurado nuevamente el gen de GUS . La longitud del fragmento de Acc65I es acortada, por tanto de 7,3 kb a 3,7 kb . b: Representa el mismo sistema descrito en la Fig.7a. La Fig.7a ilustra la generación de roturas de dobles cadenas por la acción de la enzima de DSBI. Contrario a la Fig.7a, aguí no se realiza una recombinación homologa, sino que un "non-homologous end-joining" ilegítimo. Debido a los dos sitios de corte es deletada la región situada entre SI y S2, pero no es restaurado el gen de GUS. Por tanto, se acorta la longitud del fragmento de Acc65I de 7,3 kb a 4,4 kb . 7c: La Figura representa nuevamente los dos productos finales de los procesos representados en la Fig.7a y Fig.7b. A: Resultado de la recombinación homologa: el fragmento de Acc65I tiene una longitud de 3,7 kb; el fragmento amplificado con los primers 0PN13 y 0PN14 (ilustrado por las flechas) tiene un tamaño de 0,7 kb . B: Resultado de la recombinación ilegítima ("non- homologous end-j oining" ) : el fragmento Acc65I tiene una longitud de 4,4 kb; el fragmento amplificado por los primers OPN13 y OPN14 (ilustrado por las flechas) tiene un tamaño de 1,4 kb. 8 : Modalidad preferida Ventajosamente, la cassette de recombinación comprende tanto un marcador de selección positivo como uno negativo (PS o bien NS) , cada uno bajo el control de un promotor. El marcador de selección positivo es útil para facilitar la integración de la estructura en el genoma y para la detección de la misma. El marcador de selección negativo es útil para detectar la deleción de la estructura del genoma. Ambos marcadores son eliminados efeicientemente del ADN crornosoma1, cuando están flanqueados por las secuencias de homología Hl y H2 y cuando antes y/o después de la secuencia de ácido nucleico a deletar se encuentra cada vez un sitio de corte (SI y S2) para una enzima de DSBI. Por la acción de la enzima de DSBI (E) sobre esta cassette de recombinación se generan roturas de dobles cadenas en los sitios de corte SI y/o S2 y se eliminan las secuencas situadas entre Hl y H2. La acción de una de las enzimas de DSBI mencionadas genera específicamente roturas de dobles cadenas e induce la recombinación homologa entre las secuencias de homología U, deletándose, por un lado, las secuencias situadas entre Hl y H2 , y restaurándose, por el otro, el gen intacto.

Sistemas fácilmente seleccionables para la deleción de una secuencia de ácido nucleico del ADN cromosomal de un organismo. Las estructura confinen un marcador de selección positivo (PS) y un marcador de selección negativo (NS) , cada uno bajo el control de un promotor (P) . (B) contiene adicionalmente una cassette de expresión para la enzima de DSBI, realizándose la expresión, preferentemente, bajo el control de un promotor inducible (Pi). (C) Otras secuencias de ácido nucleico pueden estar contenidas . La expresión de la enzima de DSBI resulta en todos los caso en que las secuencias de ADN situadas entre las dos secuencias de reconocimiento son eliminadas y las secuencias de homología se recombinan. Ya que las células pierden simultáneamente un marcador de selección negativo, se pueden identificar las células con una deleción exitosa por selección (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40:223-235). 10: La Figura ilustra las dos estructuras (estructura de SI (A) y estructura de SD (B) ) , que se usaron para comprobar, que se puede inducir la recombinación homologa con diferenctes enzimas de restricción mediante fraciones de dobles enlaces. Las estructuras son insertadas por transfección inducida por Agrobacterium. Las estructuras contiene, flanqueadas por la "secuencia border" derecha e izquierda (RB o bien LB) el marco de lectura interrumpido del gen de GUS (ß-glucuronidasa) bajo el control del promotor de 35S promotores (P) y del terminador de nopalinsintasa (nos) . La región media del gen de GUS (U) fue duplicada y representa las secuencias de homología A y B. Entre estas secuencias se encuentran, en caso de la estructura SI (A) , las secuencias de reconocimiento de la enzima de DSBIe, I-Scel, I-Cpal, I-CpaII y I-Creí, en caso de la estructura SD-Konstruktes (B) , la secuencia de reconocimiento de la enzima de I-Chul. Además, las estructuras de recombinación contienen " todavía como marcador de selección positivo el gen de BAR bajo el control de un promotor (P) . 11: Análisis histoquímica representativa de callos de tabaco obtenidos tras inducción de roturas de dobles cadenas. La coloración azul (aquí la coloración oscura) respresenta la expresión del gen de ß-glucuronida y con ello la eliminación del marcador de selección por recombinacíón homologa. Coloraciones azules (coloraciones oscuras) se observan en los callos en las depresiones A2, A5, A6, B2, Cl, C6 y D2. 12: Análisis de PCR para la comprobación de la recombinación homologa. PCR con los primers OPN13 y 0PN14 con ADN a partir de callo del tabaco. En las trazas 1, 2 y 3 se observa el producto de PCR (tamaño: 0,7 kb) , que indica la recombinación homologa. Los callos correspondientes fueron azules después de la coloración histoquímica, las bandas de PCR correspondiente fueron secuenciadas para demostrar, que el marco de lectura abierto (ORF) de la ß-glucuronidase efectivamente fue restablecido por recombinación homologa. Trazas 4 y 5: productos de PCR (1,4 kb) de callo que no puede colorarse de azul, en los que el transgen fue eliminado por "non-homologous end-j oning" . 13: Southern Blots, que indican la eliminación completa de la secuencia transgenética correspondiente . Las trazas de los Blots A hasta D contienen, respectivamente : Traza Línea Descripción 1 GU.C.USB 1 línea de partida 2 GU.C.USB 1-61 "non-homologous end- j oning" 3 GU.C.USB 1-83 recombinación homologa 4 GU.C.USB 3 línea de partida 5 GU.C.USB 3-1 "non-homologous end- j oning" 6 GU.C.USB 3-3 recombinación homologa 7 GU.C.USB 7 línea de partida 8 GU.C.USB 7-14 "non-homologous end- j oning" 9 GU.C.USB 7-34 recombinación homologa A: ADN digerido con HindIII, gue fue hibridizada con una muestra específica de ß-glucuronidasa .

B: ADN digerido con HindIII, que fue hibridizado con una muestra especifica de codA. C: ADN digerido con Acc65I, que fue hibridizada con una muesta especifica de ß-glucuronidasa . D: ADN digerido con Acc65I, que fue hibridizado con una muestra especifica de codA. El análisis muestra, que tras inducción de roturas de ADN bicatenario mediante expresión de la enzima de restricción pueden tener lugar tanto recombinaciones homologas (trazas 3, 6 y 9) como también recombinaciones ilegitimas (trazas 2, 5 y 8) , eliminándose en cada caso la secuencia transgenética (codA) situada entre las los sitios de corte de restricción del genoma de la planta.

Ejemplos Métodos generales : La síntesis química de los oligonucleótidos se puede realizar, por ejemplo, se manera en si conocida, según el método der fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edición, Wiley Press New York, páginas 896-897) . Las etapas de clonado realizadas en la presente invención, como p.ej. fraccionamientos de restricción, electroforesis de gel de agarosa, purificación de fragmentos de ADN, transferencia de ácidos nucleínico con nitrocelulosa y membranas de nilón, enlace de fragmentos de ADN, transformación células de E. coli, cultivo de bacterias, multiplicación de fagen y análisis secuencial de ADN recombinante, se realizan en la forma indicada por Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6. La secuenciación de moléculas de ADN recombinante se realiza con un secuenciador de ADN de fluorescencia de láser, ALF-Express (Pharmacia, Upsala, Suecia) , según el método de Sanger (Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). Ejemplo 1: Clonado de las endonucleasas de Homing Los marcos de lectura abiertos (ORFs) de las endonucleasas de Homing I-Creí (Wang J et al. (1997) Nuciere Acids Res 25: 3767-3776), I-ChuI (Cote V et al. (1993) Gene 129:69-76), I-Cpal (Turmel M et al. (1995a) Nucleic Acids Res 23:2519-2525) y I-CpaII (Turmel M et al. (1995b) Mol. Biol. Evol . 12, 533-545) fueron clonado a partir de las cepas de Chlamydomonas correspondientes. Para garantizar una translación óptima del gen, se unen los ORFs de las endonucleasas con la secuencia "líder" de un virus vegetal (gen CaMV V, tal y como ya se ha acreditado en I-Scel; Puchta H (1993) Nucí Acids Res 21:5034-5040) . Igualmente, se antepuso a los ORFs una secuencia de localización nuclear (NLS2; SEQ ID NO: 30), para llevar la proteína eficientemente al sitio de acción deseado. Ambos elementos (secuencia líder y secuencia de localización nuclear) fueron integrados por medio de PCR por los primeros de oligonucleótido usados. Para el aislamiento de los marcos de lectura abiertos (ORFs) de las enducleasas a partir de Chlamydomonas se adquirieron de la collección de cultivos de algas de Gottingen (Universidad de Gottingen. Ficología experimental y Colección de cultivos de algas, Albrecht-von-Haller-Institut für Pflanzenwissenschaften, Untere Karspüle 2, D-37073 Gottingen) los cultivos de algas: Chlamydomonas reinhardtii/Smith (cepa No. ll-32b) , Chlamydomonas applanata/Lucksch (cepa No.: 11-9) y Chlamydomonas segris/King (cepa No.: 9.83) . Los cultivos se cultivaron con la ayuda de un cultivo por agitación en medio de MS y el ADN se generó con la ayuda del DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Hilden) . A partir de una muestra del cultivo de alga, ll-32b Chlamydomonas reinhardtii/Smith, se amplificó con la ayuda de los oligonucleótidos : OPN1 y 0PN2 (SEQ ID NO: 11 y 12), el ORF de I-Creí (GenBank Acc.-No.: X01977) . OPN1 (SEQ ID NO: 11) : 5' -CGG CTC GAG CTA CGG GGA CGA TTT CTT TTT TTC AC- 3' OPN2 (SEQ ID NO: 12) : 5'- CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC AT GAA TAC AAA ATA TAA TAA AGA GTT CTT ACT C 3 r Para la reacción de PCR se usaron 2 ocl (equivalentes a aprox. 100 ng de ADN) de la preparación de ADN. En un volumen total de 50 ocl se reunieron según las indicaciones del fabricante (Life Technologies) : 5 ocl de 10X tampón de PCR [200 mM de Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM de KCl ] 1,5 ocl de 50 mM de MgCl2 1 ocl de 10 mM de mezcla de dNTP (cada vez 10 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) 1 ocl de primer 0PN1 (10 ocM ) 1 81 de primer OPN2 (10 ocM) 0,4 ocl de Taq ADN polimerasa (5 U / ocl ) 2 xl de preparación de ADN 38, 1 c l de agua destilada, tratada en autoclave La mezcla de reacción se recubrió con aprox. 50 c l de aceite de silicona y se sometió al siguiente programa de temperatura (Thermocycler : M G Biotech Primus HT; MWG Biotech, Alemania) : 1 ciclo con 180 sec a 95_C 30 ciclos con 92_C por 60 sec, 54_C por 60 sec y 72_C por 3 min. 1 ciclo con 72_C por 5 min. El fragmento de PCR se purificó mediante electroforesis de gel de agarosa usando el QIAquickR Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y se clonó en el vector de pGEM-T Easy (Promega, Madison, USA) . A continuación, se realizó un análisis secuencial con el apararo de secuenciación de ADN, ALF-Express (Pharmacia, Upsala, Suecia) . La secuencia está representada en SEQ ID NO: 5. Análogamente a I-Creí, se realizó el clonado del ORF de I-Cpal del cultivo de algas: 9.83 Chlamydomonas segris/King (Genbank Acc.-No. : L36830) . Para la PCR se usaron los oligonucleótidos OPN3 y OPN . La secuencia está representada en SEQ ID NO: 7. OPN3 ( SEQ ID NO: 13) : 5'-CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG GAC ATT AAT CCT CAA TGG ATT ACA GG- 3' 0PN4 (SEQ ID NO: 14) : 5'-CGG CTC GAG TTA CTC GCC AGT TTC TTC AAA ACG-3' Análogamente a I-Creí, se realizó igualmente el clonado del ORF de I-CpaII (Genbank Acc.-No: L39865) . Para tal fin, se usó una muestra del cultivo de algas: 9.83 Chlamydomonas segris/King. Para la PCR se usaron los oligonucleótidos: OPN5 y 0PN6. La secuencia está representada en SEQ ID NO: 9.

OPN5 (SEQ ID NO: 15) : 5' -CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG ACC GAT TCT AAA TCT AGA AAC AAC- 3' OPN6 (SEQ ID NO: 16) : 5' -CGG CTC GAG CTA AAG GTG GCC TTT ATT GCC ATC AG-3' Análogamente a I-Creí, se realizó el clonado del ORF de I-ChuI del cultivo de algas: No. 11-9 Chlamydomonas applanata/Lucksch (Genbank Acc.-No.: L06107) . Para la PCR se usaron los oligonucleótido : 0PN7 y OPN8. La secuencia está representada en SEQ ID NO: 3. OPN7 (SEQ ID NO: 17) : 5' -CGG CTC GAG TAC CTA GAA TAC AAA GAA GAG' GAA GAA GAA ACC TCT ACA GAA GAA GCC ATG GGT CCA AAG AAA AAG AGA AAG GTT ATC ATG TCA TTA ACA CAA CAA CAA AAA GAC- 3' OPN8 (SEQ ID NO: 18) : 5 '-CGG CTC GAG CTA AAG GTG GCC TTT ATT GCC ATC AG-3') El ORF de las diferentes endonucleasas de Homing (con la señal de localización nuclear) se cortó cada vez del vector de pGEM-T Easy correspondiente por digestión de restricción de Salí, se purificón por electroforesis de gel y se clonó cada veu en el sitio corte de restricción Salí del vector binario, pBinAR (Hófgen y Willmitzer (1990) Plant Science 66:221-230). La expresión de las diferentes enzimas se realiza bajo el control del promotor de 35S promotor y el terminador de la cctopin-sintas . El vector binario de expresión de I-Scel, pCIScel (Puchta H et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:5055-5060) contiene un ORF sintético de I-Scel bajo el control del promotor de CaMV 35S (Puchta H et al. (1993) Nucí Acids Res 21: 5034-5040) entre las secuencias "border" de T-ADN . Todos los cinco plásmidos fueron multiplicados en E. coli, purificados con el QIAfilter Plasmid Midi Kit (Qiagen, Hilden) y transferidos mediante electroporación en la cepa de agrobacteria C58. Ejemplo 2: Obtención de la estructura de pGU.I.USB Para la construcción de los sustratos de recombinación, se usó el plásmido de pGU.US (Tinland B et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:8000-8004). El plásmido contiene en la región del T-ADN dos mitades solapantes del gen de la ß-glucuronidasa (GUS), que presentan un solape de 557 bp. Entre las secuencias de GUS está integrado un gel de higromicina en un sitio de corte unical Xbal. En un primer paso, se cortó el gen de BAR con el promotor y las secuencias de terminador como fragmento de HindIII aislado del vector de pRC (Puchta H et al. (1996) Proc Nati Acad Sci USA 93:5055-5060), se separó por electroforesis de gel de agarosa de la secuencia del vector, se cortó del gel, se aisló con la ayuda del QIAquickR Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y luego se insertó en el sitio de corte unical HindIII de pGU.US. Para tal fin, se cortó, primero el vector de pGU.US con HindIII y se desfosforiló con fosfatasa alcalina (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) , New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) para impedir la recircularización . El vector formado lleva el nombre: pGU.US-BAR. En el vector de pNE3 (Stougaard J (1993) Plant J 3:755-761) se eliminó, primero, el sitio de corte Xbal mediante una reacción de "Kleno -filling-in" . Del vector resultante pNE3-XBA se amplificó mediante PCR, usando los primers de oligonucleótido ONP9 (SEQ ID NO: 16) y ONP10 (SEQ ID NO: 17), el marco de lectura abierto (ORF) del gen de marcador de selección negativo, citosindeaminasa {codA) , bajo el control del promotor de 35S del Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) y del terminador de nopalinsintasa (nos) . Gracias a los primers de oligonucleótido, OPN9 y OPN10, usados, se agregó en ambos extremos amplificado un sitio de corte de I-Scel respectivamente (que se hace resaltar en las secuencias indicados mediente letras en negrilla) y eun sitio de corte de Notl o bien Xbal. OPN9 (SEQ ID NO: 19) : 5'-CGG CTC TAG AGC GGC CGC CTA GGG ATA ACA GGG TAA TAG AAT CCC ACA AAA ATC TGA GCT TAA CAG 3' OPNIO (SEQ ID NO: 20) : 5'-CGG CTC TAG ACT ATT ACC CTG TTA TCC CTA GGC CCG ATC TAG TAA CAT AGA TGA CAC CGC GCG CG 3' Para la reacción de PCR se usaron 2 ocl (equivalentes a aprox. 100 ng) de una preparación de plásmido de pNE3-XBA. En un volumen total de 50 ocl se reunieron según las indicaciones del fabricante (Life Technologies): 5 ccl delOX de tampón de PCR [200 mM de Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM de KC1] 1,5 c l de 50 mM de MgCl2 1 ocl de 10 mM de mezcal de dNTP (cada vez 10 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) 1 ocl de primer de OPN1 (10 ocM) 1 ocl de primer de OPN2 (10 ocM) 0,4 ocl de Taq ADN polimerasa (5 U/ocl) 2 ocl de preparación de plásmido de pNE3-XBA 38,1 ccl de agua destilada, tratada en autoclave La mezcla de reacción de recubrió con aprx. 50 ccl de aceite de silicona y se sometió al siguiente programa de temperaturaThermocycler : M G Biotech Primus HT; MWG Biotech, Alemania) : 1 ciclo con 180 sec a 95_C 25 ciclos con 92_C po 60 sec, 54_C po 60 sec y 72 C por 3 min. 1 ciclo con 72_C por 5 min. El producto de PCR fue digerido con Xbal y Notl. El vector de pGU-US-BAR también fue digerido con Xbal y Notl (lo que desembocó en la deleción del gen marcador de higromicina) , el fragmento de vecror fue purificado por electroforesis de gel de agarosa y usando el QIAquickR Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) . La ligación del fragmento de PCR digerido y del vector proporciona el vector binario, pGU.C.USB (ver la Fig. 7a) . El vector contiene en un T-ADN entre dos sitios de corte de I-Scel, un gen marcador (la citosindeminasa (codA) ) . Los sitios de corte de I-Scel son flanqueados hacia afuera por regiones de secuencia homologa de 557 bp del gen de ß-glucuronidasa (GUS) . El cen de GUS sirve de marcador de la restauración homologa (Swoboda P et al. (1994) EMBO J 13:481- 489) . Cuando el gen es restaurado por recombinación homologa, se puede comprobar la expresión histoquimicamente . La eliminación del gen marcador resulta en células de tabaco resistentes a 5-FC ( fluorocitosina) que pueden ser generadas, entonces, en callos (Salomón S y Puchta H (1998) EMBO J 17:6086-6095) . Ejemplo 3: Trans ormación de plantas con pGU.I.USB Plántulas de Nicotiana tabacum L. cv. Petite Havana Lir.e SR1 fueron transformados con la cepa C58 de agrobacteria, que contenia el vector binario, pGU.C.USB.

Al respecto, se colocaron en la forma descrita por Puchta H. (1999) Methods Mol Biol 113: 447-451, semillas bajo condiciones estériles sobre papel de filtro húmedo y se cosecharon las plántulas después de 2 semanas (25°C, ritmo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad) . Para la inoculación se cultivó la cepa de agrobacteria que contenia el plásmido binario para la transformación, primero, durante la noche en un cultivo de agitación a 28°C en medio de YEB. La suspensión de Agrobacterium se centrifugó por 10 minutos a 15.000 g y las células fueron absorbidas en 10 mM de MgS04, de manera, que la densidad óptica final de la suspensión correspondió a un valor de aproximadamente 0,5. En un recipiente de reacción se colocaron, luego, las plántulas bajo condiciones estériles en la suspensión de bacterias y se aplicó un desecador estéril a un vacio de 0,15 at . Después de 10 minutos se colocan las plántulas, luego, sobre placas de MS, que contenían BAP (bencilaminopurina, 5 ocg/ml) y NAA (ácido 1-naftalenacético, 0,5 ocg/ml), y se dejaron 3 días en una cámara de crecimiento (25°C, ritmo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad). A continuación, se colocaron las plántulas en un medio de MS, que contenia además de NAA y BAP todavía fosfinotricina (100 ocg/ml), vancomícina (1 ocg/ml) y cefotaxina (0,5 c g/ml) . Cada 10 días se transferieron las plántulas sobre placas recién preparadas. A partir de los callos formados, se desarrollaron con el tiempo vastagos. Estos vastagos se cortaron del material de callo, cuando habían alcanzado un tamaño determinado (1 a 2 cm) , y se colocaron en cajas de magenta que contenían medio de MS con fosfinotricina, vancomicina y cefotaxina (concentraciones como arriba) . Los vástagos formaron dentro de corto tiempo raíces y fueron plantados después de 2 a 4 semanas en la tierra. En el invernadero, las plantas fueron llevadas a la floración, aclareadas y se esperó hasta que las semillas formadas en las cápsulas estaban maduras. A continuación, se colocaron las semillas para los análisis de segregación sobre medio de MS, que contenía 300 cg de fosfinotricina (para la selección positiva) o bien 500 <xg de 5-FC ( fluorocitosina para la selección negativa) por mi. Por determinación de la relación de las plántulas resistentes a las plántulas sensitivas (3:1 en caso de la selección positiva, o bien 1:3 en caso de la selección negativa) se pudo demostrar, que en las tres líneas seleccionadas estaban insertadas la estructuras de recombinación en un locus. Ejemplo 4 : Inducción de la deleción de gen por introducción de la enzima de DSBI I-Scel En los experimentos se inocularon plántulas de Fl de las líneas transgenéticas: GU.C.USB 1, 3 y 7, que contenían cada vez una copia de T-ADN GU.C.USB representado en la Fig. 2, con una cepa de agrobacteria que exprime transientemente a I-Scel, y que contenía el plásmido pCIScel (Puchta H et al. (1996) Proc Nati Acad Sci USA 93, 5055-5060), en la forma arriba descrita (véase también Puchta, 1999b) . Después de 3 días sobre medio de MS se incubaron las plántulas con medio de BAP y NAA (concentraciones como arriba) sobre el mismo medio adicionalmente en presencia de 100 =>cg de 5-FC y 100 8q de fosfinotricina por mi, para detectar células de plantas, en las que el gen marcador a eliminar (en este caso, el gen de codA) se había deletado. Los callos que crecieron en el medio, se dividieron después de 6 semanas en dos partes: una parte se usó para la regeneración de ejes de vástago, la otra parte se usó para aislar el ADN y para el ensayo de ß-glucuronidasa . Los callos trangénicos, resistentes a 5-FC obtenidos, se examinaron con respecto a incidentes de recombinación homologa mediante coloración histoquímica . Una coloración azul indica una restauración del callo (véase la Fig. 11) . La coloración histoquímica de los callos se realizó en la forma descrita por Swoboda et al-, 1994. Para tal fin, se colocaron los callos en la solución de tintura (0,3 mg de X-Gluc [Duchefa, Harlem, NI] por mi de tampón de fosfato sódico 100 m , pH 7,0; 0,1% de tritona; 0,05% de NaN3) . Se aplica en el un desecador un vacío por 15 minutos y luego se incubaron los callos en la solución por 48 horas a 37°C. Después de verter la solución de coloración, se eliminó el clorofilo residucal del material vegetal, agitando varias veces en 80% de etanol. La coloración azul obtenida indica la actividad de la ß-glucuronidasa . En aproximadamente un cuerto de los casos se había eliminado exitosamente el gen marcador por recombinación homologa (Fig. 11, Tabla 2) . Tabla 2. Número de callos de tabaco resistentes a 5-FC tras inducción transiente de DSB Los análisis moleculares confirman los hechos: Ya que la línea de GU.C.USB 1 contenía una sola copia del trangen, se examinaron los callos directamente mediante PC con respecto a recombinaciones. Una parte seleccionada estadísticamente de los callos fue examinasa mediante PCR a nivel molecular. Por el análisis molecular con los pares de primers : OPN11 (SEQ ID NO: 21) 5X- CGG AAG CTT CGT CAC C7AA TCC CAA TTC GAT CTA C - 3 y 0PN12 (SEQ ID NO: 22) 5X- CGG AAG CTT CCA CTT GCA AAG TCC CGC TAG TGC C - 3 x se pudieron aislar lugares de enlase recién formados del genoma del tabaco (Fig. 12; Tabla 3) . Tabla 3. Análisis molecular de recombinaciones mediante PCR Linea Callos Fragmento (s) de PCR transgenética 0,7 kb 1,4 kb ninguno/diferente GU.C.USB 1 30 10 12 ¦ 7 Se seleccionadro tres fragmentos de PCR de 0,7 kb y se secuenciaron . La secuenciación dió en todos los tres casos la secuencia funcional del gen de ß-glucuronidasa, a saber, la restauración del gen efectivamente tuvo lugar sin faltas por recombinación homologa. En la secuenciación de cinco bandas de PCR de 1,4 kb se encontró, que estas bandas se habían formado después de haber cortado el gen de codA, por reparación en los dos sitios de corte de I-Scel (por "non-homologous end-joining" NHEJ) , sin que haya tenido lugar una recombinación homologa. Aquí se presentaron, en la mayoría de los casos, pequñas deleciones en el sitio de corte de I-Scel. Por Southern Blot se demostró, que en los productos recombinados con las bandas 1,4 kb está eliminada completamente, a como se esperaba, la secuencia situada entre los sitios de corte de I-Scel. Ya no se pudo detectar ningún ADN especifico de codA en el genoma de la planta regenerada (Figs. 13 B y D, trazas 2 y 3). El ADN fue aislado con la ayuda del DNeasy Plant Mini Kit (Quiagen, Hilden) , Para la detección de los productos de recombinación se analizó ADN genómico mediante PCR, usando los oligonucleótidos de 0PN13 y 0PN14. 0PN13 (SEQ ID NO: 23) : 5?- CGG AAG CTT CGT CAC CAA TCC CAA TTC GAT CTA C - 3 0PN14 (SEQ ID NO: 24) : 5 - CGG AAG CTT CCA CTT GCA AAG TCC CGC TAG TGC C - 3 5 ocl 10X PCR Buffer [200 mM de Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM de KC1] 1,5 ocl de 50 mM MgCl2 1 ocl de mezcla de 10 mM de dNTP (cada vez 10 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) 1 xl de primer de OPN1 (10 ocM) 1 ocl de primer de OPN2 (10 ocM) 0,4 ocl de Taq ADN polimerasa (5 U/o l) 2 ocl de preparación de ADN 38,1 ocl de agua destilada, tratada en autoclave La mezcla de reacción se recubrió con aprox. 50 QCI de aceite de silicona y se sometió al siguiente programa de temperatura (Thermocycler : MWG Biotech Primus HT; MWG Biotech, Alemania) : 1 ciclo con 180 sec a 95_C 30 ciclos con 92_C por 60 sec, 54_C por 60 sec y 72_C por 3 min. 1 ciclo con 72__C por 5 min. La secuenciación de los productos de PCR se realizó con el "ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit" (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . Para el Southern Blotting se cortó el ADN con HindIII o Acc65I y se sometió a una electroforesis con un gel de agarosa al 0,8%. El ADN que se encuetra en el gel se transfirió mediante blotting capilar, según las intrucciones del fabricante, sobre la membrana de hibridización Hybond N' (Amersham, Little Chalfont, UK) . Para la hibridización molecular se aislan fragmentos de gen específicos de codA o bien GUS a partir de los plásmidos de partida (fragmento de Xbal/Xhol como PNE3; Stougaard, 1993 y fragmento de Kpnl/SacI como pGUS23, Puchta and Hohn, 1991, aislados mediante del QIAquick Gel Extraction Kit [Qiagen, Hilden] ) y se marcó con la ayuda de un "Random Priming Labeling Kit" (Megaprime ADN labeling system RPN1607, Amersham, Little Chalfont, UK) y [a-32P]ciATP (Amersham, Little Chalfont, UK) . Las híbridizaciones se realizaron a 65° C. Ya que en la lineas GU.C.USB 3 y GU.C.USB 7 estaban integradas cada veu dos copias transgenéticas ligadas genéticamente, se regeneraron a partir de estas líneas un número representativo de plantas del callo, se generó ADN y luego se examinó por Southern Blot (Tabla 4). En Acc65I indica la presencia de una banda de 3,7 específica de GUS que existe una recombinación homologa, la presencia de una banda de 4,4 kb que hay un incidente de NHEJ ( "non-homologous end-j oining" ; NHEJ) (Fig. 7b y c; Fig. 13 C) . Tabla 4. Análisis molecular de recombinaciones mediante Southern Blots Es interesante, que en ambos casos se encontró el mismo tipo de enlace en ambas copias transgenéticas. En otras palabras, se presentaban únicamente recombinaciones homologas o únicamente incidentes de NHEJ. En ningún caso estaban presentes ambas posibilidades, a saber, por ejemplo, una recombinación homologa en uno de los trangenes y un incidente de NHEJ en el otro. También se realizaron análisis de PCR con ambas líneas y se seleccionaron cada vez tres fragmetnos de PCR de un tamaño de 0,7 kb y estos fueron secuenciados . La secuenciación dió en todos los tres casos la secuencia funcional del gen de ß-glucuronidasa, a saber, la restauración del gen tuvo lugar efectivamente por recombinación homologa. En la secuenciación de, en total, nueve bandas de PCR 1,4 kb de largas, se encontró además, que estas bandas efectivamente se formaron tras haber cortado el gen de codA por reparación de los dos sitios de corte de I-Scel (mediante "non-homologous end- oining" NHEJ) . Aquí se presentaron, en la mayoría de los casos pequeñas deleciones en el sitio de corte de I-Scel. Por Southern Blot se demostró, que en los productos recombinados, tuvo lugar, a como se esperaba, una eliminación completa de la secuecncia situada entre los sitios de corte de I-Scel. Ya no se pudo comprobar ningua ADN específica de codA en el genoma de la pltanta regenerada (Fig. 13 B y D trazas 5, 6 y 8, 9) . Ejemplo 5: Se prepararon diferentes líneas de plantas de tabaco transgénicas , que presentaron entre las dos mitades del gen de ß-glucuronidasa (disposición como se describe arriba) junto a un sitio de corte de I-Scel mediante clonado de oligonucleótidos también sitios de corte para las enzimas de restricción arriba indicadas (Fig. 10) . Plántulas de esta linea de tabaco fueron inoculadas cada vez en comparación directa con Agrobacterium capaces de exprimir I-Scel o la enzima correspondiente en células vegetales. Los callos que se van formando se colorearon, entonces después de dos semanas histoquímicamente . Los resultados están resumidos en la Tabla 4. El plásmido de pGU.C.US.B fue cortado con I-Scel, de manera que el gen de codA es cortado del plásmido. El ADN digerido se separó mediante electroforesis de gel de agarosa, se cortó la banda más grande y se purificó mediante el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) , y luego se ligó y se transformó en E. coli. El plásmido obtenido se cortó, entonces con Xbal. Los oligonucleótidos monocatenarios complementarios, OPN25 y OPN26, se convirtieron por calentamiento breve a 92°C seguido de un enfriamiento, en una forma bicatenaria, y luego se ligaron el plásmido cortado con Xbal. La estructura de SI obtenida (pSI) contiene los sitios de corte para I-Scel, I-Cpal, I-CpaII y I-Creí ( (ver Fig. 10 (A) ) . OPN15 (SEQ ID NO: 25) : 5'- CTA GTA CAA AAC GTC GTG AGA CAT TTT AAT CTG AAG GTT TGG CAC CTC GAT GTC GGC TCA TC-3' 0PN16 (SEQ ID NO : 26) : 5'-CTA GGA TGA GCC GTC ATC GAG GTG CCA AAC CTT CAG ATT AAA ATG TCT CAC GAC GTT TTG TA-3' Los oligonucleótidos monocatenarios complementarios, OPN27 y OPN28, se convirtieron por calentamiento breve a 92°C seguido de un enfriamiento, en una forma bicatenaria, y luego se ligaron el plásmido cortado con Xbal . La estructura de SD obtenida (pSD) contiene los sitios de corte para I-Scel y I-ChuI (ver Fig. 10 (B) ) . OPN17 (SEQ ID NO: 27) :5'-CTA GTC CGA AAA CGC CGT GAG ACA TAT TGG TTA CGA TCC TAA GGT AGC GAA ATT CAC CCG GTA ACT CTG TGC CAG-3' OPN18 (SEQ ID NO: 28) : 5'-CTA GCT GGC ACA GAG TTA CCG GGT GAA TTT CGC TAC CTT AGG ATC GTA ACC AAT ATG TCT CAC GGC GTT TTC GGA-3 ' En la forma arriba descrita se prepararon plantas de tabaco trangenéticas con ambas estructuras por transformación medidante Agrobacterium. Para los ensayos ulteriores se usaron lineas que contenían secuencias trangenéticas solamente en un locus . Estas líneas se separaron por la segregación de 3:1 en plantas resistentes a fosfinotricina y plantas no resistentes a fosforicina. La plántulas aclareadas se inocularon, entonces, con cepas de Agrobacterium que contenían una de las cuatro estructuras para la expresión de las endonucleasas de restricción o bien como control vectorial el plásmido de BinAR o como control positivo una mezcla de 1:1 a partir de BinAR y CISce-I. La inoculación se realizó en la forma arriba descrita (Puchta H (1999) Methods Mol.. Biol. 113:447-451) y para la selección se cultivaron las plántulas en medio de MS con 100 Og de canamicina por mi, que también contenía BAP y NAA, vancomicina y cefotaxina (concentraciones como arriba) , durante varias semanas. Luego se sometieron los callos formados, en la forma arriba descrita, a una coloración histoquímica con ß-glucuronidasa . Con todas las cuatro enzimas de restricción ensayadas, se alcanzó inducir una recombinación homologa en el mismo orden de magnitud, que con I-Scel (que se usó aquí en una co-inoculación con el vector de selección, pBinAR [AR] ) (Tabla 5) . Con eso se ha comprobado, que con el uso de cualquier endonucleasa de restricción se puede inducir recombínaciones homologas. Tabla 5. Inducción de la recombinación homologa en plantas mediante diferentes endonucleasas: I-Creí, I-Cpal, I-CpaII y I-Chul. [sectores/callo] se refiere al número de areales coloreados de azul en los callos resistentes .

Linea Enzima Sectores/callo Relación transgenétíca SI5 I-Scel/AR 42/31 1.35 I-Creí 77/50 0.54 I-CpaII 51/50 1.02 SI2 I-Scel/AR 8/9 0.89 I-Creí 40/18 2.22 I-CpaII 9/20 0.45 512 I-Cpal 144/106 1.36 SD2 I-Chul 166/100 1.66 LISTADO DE SECUENCIAS <110> SunGene GmbH & Co . KGaA <120> Sistemas y procedimientos para eliminar secuencias de ácido nucleínico del ADN cromosomal de organismos eucariotas <130> NAE502_2001 <14C> <141> <16C> 3C <17C> Patentln Ver. 2.1 <21C> 1 <211> 788 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (62) .. (766) <223> marco de lectura abierto que codifica para I-Scel <400> 1 ggatccagta ctgtacctag aatacaaaga agaggaagaa gaaacctcta cagaagaagt 60 g atg aaa aac ate aaa aaa aac cag gta atg aac ctg ggt ccg aac tct 109 Met Lys Asn lie Lys Lys Asn Gln Val Met Asn Leu Gly Pro Asn Ser 1 5 10 15 aaa ctg ctg aaa gaa tac aaa tec cag ctg ate gaa ctg aac ate gaa 157 Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Lys Ser Gln Leu lie Glu Leu Asn lie Glu 20 25 30 cag ttc gaa gca ggt ate ggt ctg ate ctg ggt gat gct tac ate cgt 205 Gln Phe Glu Ala Gly lie Gly Leu lie Leu Gly Asp Ala Tyr lie Arg 35 40 45 tct cgt gat gaa ggt aaa acc tac tgt atg cag ttc gag tgg aaa aac 253 Ser Arg Asp Glu Gly Lys Thr Tyr Cys Met Gln Phe Glu Trp Lys Asn 50 55 60 aaa gca tac atg gac cac gta tgt ctg ctg tac gat cag tgg gta ctg 301 Lys Ala Tyr V.et Asp His Val Cys Leu Leu Tyr Asp Gln Trp Val Leu 65 70 75 80 tcc ccg ccg cae aaa aaa gaa cgt gtt aac cae ctg ggt aac ctg gta 349 Ser Pro Pro His Lys Lys Glu Arg Val Asn His Leu Gly Asn Leu Val 85 90 95 atc acc tgg ggc gee cag act ttc aaa cae caá gct ttc aac aaa ctg 397 lie Thr Trp Gly Ala Gln Thr Phe Lys His Gln Ala Phe Asn Lys Leu 100 105 110 gct age ctg ttc atc gtt aac aac aaa aaa acc atc ccg aac aac ctg 445 Ala Ser Leu Phe lie Val Asn Asn Lys Lys Thr lie Pro Asn Asn Leu 115 120 125 gtt gaa aac tac ctg acc ccg atg tct ctg gca tac tgg ttc atg gat 493 Val Glu Asn Tyr Leu Thr Pro Met Ser Leu Ala Tyr Trp Phe Met Asp 130 135 140 gat ggt ggt aaa tgg gat tac aac aaa aac tct acc aac aaa tcg atc 541 Asp Gly Gly Lys Trp Asp Tyr Asn Lys Asn Ser Thr Asn Lys Ser lie 145 150 155 160 gta ctg aac acc cag tct ttc act ttc gaa gaa gta gaa tac ctg gtt 589 Val Leu Asn Thr Gln Ser Phe Thr Phe Glu Glu Val Glu Tyr Leu Val 165 170 175 aag ggt ctg cgt aac aaa ttc caá ctg aac tgt tac cta aaa atc aac 637 Lys Gly Leu Arg Asn Lys Phe Gln Leu Asn Cys Tyr Leu Lys lie Asn 180 185 190 aaa aac aaa ccg atc atc tac atc gat tct atg tct tac ctg atc ttc 685 Lys Asn Lys Pro lie lie Tyr lie Asp Ser Met Ser Tyr Leu lie Phe 195 200 205 tac aac ctg atc aaa ccg tac ctg atc ccg cag atg atg tac aaa ctg 733 Tyr Asn Leu lie Lys Pro Tyr Leu lie Pro Gln Met Met Tyr Lys Leu 210 215 220 ccg aac act atc tcc tcc gaa act ttc ctg aaa taataagtcg agtactggat 786 Pro Asn Thr lie Ser Ser Glu Thr Phe Leu Lys 225 230 235 ce 788 <210> 2 <211> 235 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Lys Asn lie Lys Lys Asn Gln Val Met Asn Leu Gly Pro Asn Ser 1 5 10 15 Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Lys Ser Gln Leu lie Glu Leu Asn lie Glu 20 25 30 Gln Phe Glu Ala Gly lie Gly Leu lie Leu Gly Asp Ala Tyr lie Arg 35 40 45 Ser Arg Asp Glu Gly Lys Thr Tyr Cys Met Gln Phe Glu Trp Lys Asn 50 55 60 Lys Ala Tyr Met Asp His Val Cys Leu Leu Tyr Asp Gln Trp Val Leu 65 70 75 80 Ser Pro Pro His Lys Lys Glu Arg Val Asn His Leu Gly Asn Leu Val 85 90 95 lie Thr Trp Gly Ala Gln Thr Phe Lys His Gln Ala Phe Asn Lys Leu 100 , 105 110 Ala Ser Leu Phe lie Val Asn Asn Lys Lys Thr lie Pro Asn Asn Leu 115 120 125 Val Glu Asn Tyr Leu Thr Pro Met Ser Leu Ala Tyr Trp Phe Met Asp 130 135 140 Asp Gly Gly Lys Trp Asp Tyr Asn Lys Asn Ser Thr Asn Lys Ser lie 145 150 155 160 Val Leu Asn Thr Gln Ser Phe Thr Phe Glu Glu Val Glu Tyr Leu Val 165 170 175 Lys Gly Leu Arg Asn Lys Phe Gln Leu Asn Cys Tyr Leu Lys lie Asn 180 185 190 Lys Asn Lys Pro lie lie Tyr lie Asp Ser Met Ser Tyr Leu lie Phe 195 200 205 Tyr Asn Leu lie Lys Pro Tyr Leu lie Pro Gln Met Met Tyr Lys Leu 210 215 220 Pro Asn Thr lie Ser Ser Glu Thr Phe Leu Lys 225 230 235 <210> 3 <211> 746 <212> ADN <213> Chlamydomonas applanata <220> <221> CDS <222> (54) .. (737) <223> marco de lectura abierto de I-ChuI con señal de ubicación nuclear <220> <221> misc_feature <222> (54) .. (83) <223> codificación para la señal de ubicación nuclear <400> 3 ctcgagtacc tagaatacaa agaagaggaa gaagaaactc tatagaagaa gcc atg 56 Met 1 ggt cea aag aaa aag aga aag gtt ate atg tea tta acá caá caá caá 104 Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val lie Met Ser Leu Thr Gln Gln Gln 5 10 15 aaa gac tta att ttc gga tet cta ctg ggt gat gga aat tta caá act 152 Lys Asp Leu lie Phe Gly Ser Leu Leu Gly Asp Gly Asn Leu Gln Thr 20 25 30 ggt tea gta ggt agg act tgg cgc tat cga gcg etc cat aaa agt gag 200 Gly Ser Val Gly Arg. Thr Trp Arg Tyr Arg Ala Leu His Lys Ser Glu 35 40 45 cat cag acá tac tta ttt cat aag tat gaa ate tta aag ceg ctt tgt 248 His Gln Thr Tyr Leu Phe His Lys Tyr Glu lie Leu Lys Pro Leu Cys 50 55 60 65 ggc gaa aat act etc cea acá gaa agt ata gtg ttc gac gaa aga acá 296 Gly Glu Asn Thr Leu Pro Thr Glu Ser lie Val Phe Asp Glu Arg Thr 70 75 80 aac aag gag gtt aaa cgt tgg ttt ttc aac acá tta acc aat ect tec 344 Asn Lys Glu Val Lys Arg Trp Phe Phe Asn Thr Leu Thr Asn Pro Ser 85 90 95 tta aaa ttc ttc gca gac atg ttc tac acá tat gac caá aac acá caá 392 Leu Lys Phe Phe Ala Asp Met Phe Tyr Thr Tyr Asp Gln Asn Thr Gln 100 105 110 aaa tgg gtt aaa gat gta ect gta aag gtr caá ac ttc tta act ect 440 Lys Trp Val Lys Asp Val Pro Val Lys Val Gln Thr Phe Leu Thr Pro 115 120 125 caá gct tta gca tac ttt tat ata gac gat gga gcg tta aaa tgg ctt 488 Gln Ala Leu Ala Tyr Phe Tyr lie Asp Asp Gly Ala Leu Lys Trp Leu 130 135 140 145 aat aag tet aac gct atg caá att tgt act gaa agt ttc agt caá ggg 536 Asn Lys Ser Asn Ala Met Gln lie Cys Thr Glu Ser Phe Ser Gln Gly 150 155 160 ggc acg att cgg ate caá aaa gca cta aaa acg etc tat aat att gat 584 Gly Thr lie Arg lie Gln Lys Ala Leu Lys Thr Leu Tyr Asn lie Asp 165 170 175 acá acg ttg acá aaa aaa act cta caá gac ggc aga at ggc tat cgt 632 Thr Thr Leu Thr Lys Lys Thr Leu Gln Asp Gly Arg lie Gly Tyr Arg 180 185 190 ata gct att cct gaa gcc agt age ggt gct ttt cgt gaa gtc att aaa 680 lie Ala lie Pro Glu Ala Ser Ser Gly Ala Phe Arg Glu Val lie Lys 195 200 205 cct ttt cta gtt gat tgt atg aga tac aaa gtt tet gat ggc aat aaa 728 Pro Phe Leu Val Asp Cys Met Arg Tyr Lys Val Ser Asp Gly Asn Lys 210 215 220 225 ggc cae ctt tagetegag 746 Gly His Leu <210> 4 <211> 228 <212> PRT <213> Chlamydomonas applanata <400> 4 Met Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val lie Met Ser Leu Thr Gln Gln 1 5 10 15 Gln Lys Asp Leu lie Phe Gly Ser Leu Leu Gly Asp Gly Asn Leu Gln 20 25 30 Thr Gly Ser Val Gly Arg Thr Trp Arg Tyr Arg Ala Leu His Lys Ser 35 40 45 Glu His Gln Thr Tyr Leu Phe His Lys Tyr Glu lie Leu Lys Pro Leu 50 55 60 Cys Gly Glu Asn Thr Leu Pro Thr Glu Ser lie Val Phe Asp Glu Arg 65 70 75 80 Thr Asn Lys Glu Val Lys Arg Trp Phe Phe Asn Thr Leu Thr Asn Pro 85 90 95 Ser Leu Lys Phe Phe Ala Asp Met Phe Tyr Thr Tyr Asp Gln Asn Thr 100 105 110 Gln Lys Trp Val Lys Asp Val Pro Val Lys Val Gln Thr Phe Leu Thr 115 120 125 Pro Gln Ala Leu Ala Tyr Phe Tyr lie Asp Asp Gly Ala Leu Lys Trp 130 135 140 Leu Asn Lys Ser Asn Ala Met Gln lie Cys Thr Glu Ser Phe Ser Gln 145 150 155 160 Gly Gly Thr lie Arg lie Gln Lys Ala Leu Lys Thr Leu Tyr Asn lie 165 170 175 Asp Thr Thr Leu Thr Lys Lys Thr Leu Gln Asp Gly Arg lie Gly Tyr 180 185 190 Arg lie Ala lie Pro Glu Ala Ser Ser Gly Ala Phe Arg Glu Val lie 195 200 205 Lys Pro Phe Leu Val Asp Cys Met Arg Tyr Lys Val Ser Asp Gly Asn 210 215 220 Lys Gly His Leu 225 <210> 5 <211> 582 <212> ADN <213> Chlamydomonas reinhardtii <220> <221> CDS <222> (55) .. (573) <223> marco de lectura abierto que codifica para I-Creí con señal ubicación nuclear <220> <221> mise feature <222> (55) .. (84) <223> codificación para la señal de ubicación nuclear <400> 5 ctcgagtacc tagaatacaa agaagaggaa gagaaacctc taccagaaga agcc atg 57 Met 1 ggt cea aag aaa aag aga aag gtt ate atg aat ac aaa tat aat aaa 105 Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val lie Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys 5 10 15 gag ttc tta ctc tac tta gca ggg ttt gta gac ggt gac ggt age ata 153 Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser lie 20 25 30 ate gct ca att aag ect aat cag tet tat aaa ttt aag cat cag cta 201 lie Ala Gln lie Lys Pro Asn Gln Ser Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu 35 40 45 tea ctc gcg ttc caá gtc acg caá aag acá cag aga cgt tgg ttt tta 249 Ser Leu Ala Phe Gln Val Thr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu 50 55 60 65 gac aaa tta gtg gat gaa att ggg gtt ggt tat gta aga gat agg ggt 297 Asp Lys Leu Val Asp Glu lie Gly Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly 70 75 80 agc gtt tcg gat tat att cta age gaa ate aag cct ttg cat aat ttt 345 Ser Val Ser Asp Tyr lie Leu Ser Glu lie Lys Pro Leu His Asn Phe 85 90 95 tta aca caá cta caá cct ttt cta aaa cta aaa caá aaa caá gca aat 393 Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn 100 105 110 tta gtt tta aaa att att gaa caá ctt ceg tea gca aaa gaa tec ceg 441 Leu Val Leu Lys lie lie Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro 115 120 125 gac aaa ttc tta gaa gtt tgt aca tgg gtg gat caá att gca gct ctg 489 Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln lie Ala Ala Leu 130 135 140 145 aat gat tcg aag acg cgt aaa aca act tet gaa acc gtt cgt gct gtg 537 Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val 150 155 160 cta gac agt tta agt gaa aaa aag aaa tcg tec ceg tagetegag 582 Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser Ser Pro 165 170 <210> 6 <211> 173 <212> PRT <213> Chlamydomonas reir.hardtii <40C> 6 Met Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val lie Met Asn Thr Lys Tyr Asn 1 5 10 15 Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val -Asp Gly Asp Gly Ser 20 25 30 lie lie Ala Gln lie Lys Pro Asn Gln Ser Tyr Lys Phe Lys His Gln 35 40 45 Leu Ser Leu Ala Phe Gln Val Thr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe 50 55 60 Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu lie Gly Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg 65 70 75 80 Gly Ser Val Ser Asp Tyr lie Leu Ser Glu lie Lys Pro Leu His Asn 85 90 95 Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala 100 105 110 Asn Leu Val Leu Lys lie lie Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser 115 120 125 Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln lie Ala Ala 130 135 140 Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala 145 150 155 160 Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser Ser Pro 165 170 <210> 7 <211> 546 <212> ADN <213> Chlamydomonas segnis <220> <221> CDS <222> (52) .. (537) <223> marco de lectura abierto que codifica para I-Cpal con señal de ubicación nuclear <220> <221> misc_feature <222> (52) .. (81) <223> codificación para la señal de ubicación nuclear <400> 7 ctcgagtacc tagaatacaa gaagagaaga agaacctcta cagaagaagc c atg ggt 57 Met Gly 1 cea aag aaa aag aga aag gtt ate atg gac att aat cct caá tgg att 105 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val lie Met Asp lie Asn Pro Gln Trp lie 5 10 15 acá ggt ttc gta gat ggg gaa ggt tgt ttt agt gta agt att ctt aga 153 Thr Gly Phe Val Asp Gly Glu Gly Cys Fhe Ser Val Ser lie Leu Arg 20 25 30 aat aat teg ttg cgc tat ggc cat cag ctt caá cea gaa ttc gta gtg 201 Asn Asn Ser Leu Arg Tyr Gly His Gln Leu Gln Pro Glu Phe Val Val 35 40 45 50 acc caá cat aaa tta gat gca aat gtt tta tat gca tta aaa gac tac 249 Thr Gln His Lys Leu Asp Ala Asn Val Leu Tyr Ala Leu Lys Asp Tyr 55 60 65 ttt aaa gtt gga tea gtc gtt gtg aat cat ggg gaa cgg ctt tgc tat Phe Lys Val Gly Ser Val Val Val Asn His Gly Glu Arg Leu Cys Tyr 70 75 80 aaa gtc aaa aat att gat cae ttt ata acc gtc att ata cea ttt ttc Lys Val Lys Asn lie Asp His Phe lie Thr Val lie lie Pro Phe Phe 85 90 95 gaa aaa cat gag cta aaa ac aaa aga aga att gaa ttt ctt cga ttt Glu Lys His Glu Leu Lys Thr Lys Arg Arg lie Glu Phe Leu Arg Phe 100 105 110 cga aaa ate tgc ttg ctg tta aaa gca ggt aga cat tta gaa teg cag Arg Lys lie Cys Leu Leu Leu Lys Ala Gly Arg His Leu Glu Ser Gln 115 120 125 130 gaa gga ttc gag aaa gtg ttg gat tta gca aaa aaa etc cgt ate aat Glu Gly Phe Glu Lys Val Leu Asp Leu Ala Lys Lys Leu Arg lie Asn 135 140 145 gag aaa aac tac cag gaa tet ate aaa cgt ttt gaa gaa act ggc gag Glu Lys Asn Tyr Gln Glu Ser lie Lys Arg Phe Glu Glu Thr Gly Glu 150 155 160 taactcgag <210> 8 <211> 162 <212> PRT <213> Chlamydomonas segnis <400> 8 Met Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val He Met Asp He Asn Pro Gln 1 5 10 15 Trp He Thr Gly Phe Val Asp Gly Glu Gly Cys Phe Ser Val Ser He 20 25 30 Leu Arg Asn Asn Ser Leu Arg Tyr Gly His Gln Leu Gln Pro Glu Pne 35 40 45 Val Val Thr Gln His Lys Leu Asp Ala Asn Val Leu Tyr Ala Leu Lys 50 55 60 Asp Tyr Phe Lys Val Gly Ser Val Val Val Asn His Gly Glu Arg Leu 65 70 75 80 Cys Tyr Lys Val Lys Asn He Asp His Phe He Thr Val He He Pro 85 90 95 Phe Phe Glu Lys His Glu Leu Lys Thr Lys Arg Arg He Glu Phe Leu 100 105 110 Arg Phe Arg Lys lie Cys Leu Leu Leu Lys Ala Gly Arg His Leu Glu 115 120 125 Ser Gln Glu Gly Phe Glu Lys Val Leu Asp Leu Ala Lys Lys Leu Arg 130 135 140 lie Asn Glu Lys Asn Tyr Gln Glu Ser lie Lys Arg Phe Glu Glu Thr 145 150 155 160 Gly Glu <210> 9 <211> 793 <212> ADN <213> Chlamydomonas segnis <220> <221> CDS <222> (53) .. (784) <223> marco de lectura abierto que codifica para ?-CpaII con señal de ubicación nuclear <220> <221> misc_feature <222> (53) .. (82) <223> codificación para la señal de ubicación nuclear <40C> 9 ctcgagtacc tagaaacaaa gaagaggaag aagaaactct acagaagaag ce atg ggt 58 Met Gly 1 cea aag aaa aag aga aag gtt ate atg acc gat tet aaa tet aga aac 106 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val lie Met Thr Asp Ser Lys Ser Arg Asn 5 10 15 aac aat aat ttt tta age aat aar ctt tta ect ttg acc gat gac gag 154 Asn Asn Asn Phe Leu Ser Asn Asn Leu Leu Pro Leu Thr Asp Asp Glu 20 25 30 aag gct tta att gcg ggg ac ctt tta ggg gat gct cat att caá aag 202 Lys Ala Leu lie Ala Gly Thr Leu Leu Gly Asp Ala His lie Gln Lys 35 40 45 50 cgt ggt gat age tat agg cta aaa ata gct cat ggc ttg gat cat gaa 250 Arg Gly Asp Ser Tyr Arg Leu Lys lie Ala His Gly Leu Asp His Glu 55 60 65 gag ctt gtc gtc tgg aag tat aac cgt tta ate agg ttg tgt caá acá 298 Glu Leu Val Val Trp Lys Tyr Asn Arg Leu lie Arg Leu Cys Gln Thr 70 75 80 acá caá ccc cea agg gtg gaa acc tac tea acá aag tta aag tet ggc Thr Gln Pro Pro Arg Val Glu Thr Tyr Ser Thr Lys Leu Lys Ser Gly 85 90 95 gta ttg ect ca ggg gtt gtt ttc tat acc teg tec gga aag tat tta Val Leu Pro Gln Gly Val Val Phe Tyr Thr Ser Ser Gly Lys Tyr Leu 100 105 110 aaa gag act tat gac ctt ttt tat aaa caá act gca gac ggt cgg agg Lys Glu Thr Tyr Asp Leu Phe Tyr Lys Gln Thr Ala Asp Gly Arg Arg 115 120 125 130 gta aaa ac ata acá cag gag ttg ate gac agt tta ccc aag cat cea Val Lys Thr lie Thr Gln Glu Leu lie Asp Ser Leu Pro Lys His Pro 135 140 145 ttg gtc tta gca gee ttt ttt atg gac gat ggt agt gtt cgg tec gac Leu Val Leu Ala Ala Phe Phe Met Asp Asp Gly Ser Val Arg Ser Asp 150 155 160 tgt tat tea gga aag att gca acg cea ggg ttt gct ggt aaa gaa gaa Cys Tyr Ser Gly Lys lie Ala Thr Pro Gly Phe Ala Gly Lys Glu Glu 165 170 175 age cag ttg ttg tgt aac tat cta cae agt tgg gat gtt caá gca aac Ser Gln Leu Leu Cys Asn Tyr Leu His Ser Trp Asp Val Gln Ala Asn 180 185 190 gta gtt gct cat aaa aaa gca aac aat cag tat tac att ggg etc cea Val Val Ala His Lys Lys Ala Asn Asn Gln Tyr Tyr lie Gly Leu Pro 195 200 205 210 gca aaa acá ttt ggt cgc ttt att aac att att gaa ccc tac gtt aga Ala Lys Thr Phe Gly Arg Phe lie Asn lie lie Glu Pro Tyr Val Arg 215 220 225 gaa gtt ect gct tta tgt tat aaa tta aac gaa tea aga aaa ccc cgt Glu Val Pro Ala Leu Cys Tyr Lys Leu Asn Glu Ser Arg Lys Pro Arg 230 235 240 aac gac tgactcgag Asn Asp <210> 10 <211> 244 <212> PRT <213> Chlamydomonas segnis <400> 10 Met Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val lie Met Thr Asp Ser Lys Ser 1 5 10 15 Arg Asn Asn Asn Asn Phe Leu Ser Asn Asn Leu Leu Pro Leu Thr Asp 20 25 30 Asp Glu Lys Ala Leu lie Ala Gly Thr Leu Leu Gly Asp Ala His He ¦35 40 45 Gln Lys Arg Gly Asp Ser Tyr Arg Leu Lys He Ala His Gly Leu Asp 50 55 60 His Glu Glu Leu Val Val Trp Lys Tyr Asn Arg Leu He Arg Leu Cys 65 70 75 80 Gln Thr Thr Gln Pro Pro Arg Val Glu Thr Tyr Ser Thr Lys Leu Lys 85 90 95 Ser Gly Val Leu Pro Gln Gly Val Val Phe Tyr Thr Ser Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Leu Lys Glu Thr Tyr Asp Leu Phe Tyr Lys Gln Thr Ala Asp Gly 115 120 125 Arg Arg Val Lys Thr He Thr Gln Glu Leu He Asp Ser Leu Pro Lys 130 135 140 His Pro Leu Val Leu Ala Ala Phe Phe Met Asp Asp Gly Ser Val Arg 145 150 155 160 Ser Asp Cys Tyr Ser Gly Lys He Ala Thr Pro Gly Phe Ala Gly Lys 165 170 175 Glu Glu Ser Gln Leu Leu Cys Asn Tyr Leu His Ser Trp Asp Val Gln 180 , 185 190 Ala Asn Val Val Ala His Lys Lys Ala Asn Asn Gln Tyr Tyr He Gly 195 200 ¦ 205 Leu Pro Ala Lys Thr Phe Gly Arg Phe He Asn He He Glu Pro Tyr 210 215 220 Val Arg Glu Val Pro Ala Leu Cys Tyr Lys Leu Asn Glu Ser Arg Lys 225 230 235 240 Pro Arg Asn Asp <210> 11 <2H> 35 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artificial oligonucleótido primer <400> 11 cggctcgagc tacggggacg atttcttttt ttcac 35 <210> 12 <211> 120 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 12 cggctcgagt acctagaata caaagaagag gaagaagaaa cctctacaga agaagccatg 60 ggtccaaaga aaaagagaaa ggttatcatg aatacaaaat ataataaaga gttcttactc 120 <210> 13 <211> 116 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 13 cggctcgagt acctagaata caaagaagag gaagaagaaa cctctacaga agaagccatg 60 ggtccaaaga aaaagagaaa ggttatcatg gacattaatc ctcaatggat tacagg 116 <210> 14 <211> 33 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 14 cggctcgagt tactcgccag tttcttcaaa acg 33 <21Q> 15 <211> 113 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer :<400> 15 cggctcgagt acctagaata caaagaagag gaagaagaaa cctctacaga agaagccatg 60 ggtccaaaga aaaagagaaa ggttatcatg accgattcta aatctagaaa caá 113 <210> 16 <211> 35 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 16 cggctcgagc taaaggtggc ctttattgcc atcag 35 <210> 17 <211> 114 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 17 cggctcgagt acctagaata caaagaagag gaagaagaaa cctctacaga agaagccatg 60 ggtccaaaga aaaagagaaa ggttatcatg tcattaacac aacaacaaaa agac 114 <210> 18 <211> 3b <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 18 cggctcgagc taaaggtggc ctttattgcc atcag 35 <210> 19 <211> 66 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 19 cggctctaga gcggccgcct agggataaca gggtaataga atcccacaaa aatctgagct 60 taacag 66 <210> 20 <211> 65 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 20 cggctctaga ctattaccct gttatcccta ggcccgatct agtaacatag atgacaccgc gcgcg <210> 21 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artifical <223> descripción de la secuencia artifical oligonucleótido primer <40C> 21 cggaagcttc gtcaccaatc ccaattcgat ctac <210> 22 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical oligonucleótido primer <400> 22 cggaagcttc cacttgcaaa gtcccgctag tgcc <210> 23 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical oligonucleótido primer <400> 23 cggaagcttc gtcaccaatc ccaattcgat ctac <210> 24 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical oligonucleótido primer <400> 24 cggaagcttc cacttgcaaa gtcccgctag tgcc <210> 25 <211> 62 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 25 ctagtacaaa acgtcgtgag acattttaat ctgaaggttt ggcacctcga tgtcggctca 60 te 62 <210> 26 <211> 62 <212> ADN <213> secuenc artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 26 ctaggatgag ccgtcatcga ggtgccaaac cttcagatta aaacgtctca cgacgttttg 60 ta 62 <210> 27 <211> 75 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 27 ctagtccgaa aacgccgtga gacatattgg ttacgatcct aaggtagcga aattcacccg gtaactctgt geeag <210> 28 <211> 75 <212> ADN <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: oligonucleótido primer <400> 28 ctagctggca cagagttacc gggtgaattt cgctacctta ggatcgtaac caatatgtct 60 cacggcgttt tcgga /5 <210> 29 <211> 7 , <212> PRT <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: secuencia de ubicación nuclear <403> 29 Pro Lys Thr Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> secuencia artifical <220> <223> descripción de la secuencia artifical: secuencia de ubicación nuclear <400> 30 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5

Claims (24)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Sistema de recombinación, caracterizado porque I) una estructura de recombinación transgenética insertada en el ADN cromosomal de un organismo eucariota, que contiene una secuencia que se compone en dirección 5'/3' de: al) una primera secuencia de homología A, y bl) por lo menos una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario, y a2) una segunda secuencia de homología B, presentando las secuencias de homología A y B una longitud suficientemente larga y una homología suficientemente alta, para asegurar una recombinación homologa, y II) una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento (b) para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario o una secuencia de ácido nucleico codificante para una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento (b) . Fig. Secuencias están presentes con untamente en una célula eucariota o un organismo eucariota.
2. 2. Sistema de recombinación según la reivindicación 1, caracterizado porque la estructura de recombinación está compuesta como sigue: al) una primera secuencia de homología A y bl) una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y c) otra secuencia de ácido nucleico y a2) una segunda secuencia de homología Bf presentando las secuencias de homología A y B una longitud suficiente y una homología suficiente, para asegurar una recombinación homologa.
3. 3. Sistema de recombinación según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la estructura de recombinacíón está compuesta como sigue: al) una primera secuencia de homología A y bl) una primera secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y c) otra secuencia de ácido nucleico y b2 ) una segunda secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y al) una segunda secuencia de homología B, presentando las secuencias de homología A y B una longitud suficiente y una homología suficiente, para asegurar una recombinación homologa.
4. 4. Sistema de recombinación según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la estructura de recombinación o la otra secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos uno de los elementos seleccionados del grupo que abarca : i) marcadores de selección positivos ii) marcadores de selección negativos iii) genes repórter iv) orígenes de replicación v) regiones de clonado múltiples vi) secuencias ,border" para la transíección con Agrobacterium vii) secuencias, que permiten una recombinación homologa o bien una inserción en el genoma de un organismo huésped viii) cassette de expresión para una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario.
5. 5. Sistema de recombinación según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario está seleccionada del grupo que comprende: endonucleasas de restricción, endonucleasas de Homing, endonucleasas de intron del grupo II, recombinasas , transposasas , nucleasas quiméricas.
6. 6. Sistema de recombinación según una, de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario está seleccionada del grupo de las endonucleasas de Homing que comprende: F-Scel, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-Amal, I-Anil, I-Ceul, I-CeuAIIP, I-ChuI, I-Cmoel, I-Cpal, I-CpaII, I-Creí, I-CrepsbIP, I-CrepsblIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-Csml, I-Cvul, I-CvuAIP, I-Ddil, I-DdiII, I-DirI, I-Dmol, I-Hmul, I-HmuII, I-HspNIP, I-Llal, I-Msol, I-Naal, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-Nitl, I-Njal, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-EcuVI, I-PgrIP, ?-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PpbIP, I-Ppol, ?-SPBetaIP, I-Scal, I-Scel, I-SceII, I-SceIII , I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomCP, I-SpomlP, ?-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhÍST3P, I-SthPhiS3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAlP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-Mtul, PI-MtuHIP, PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, ??-PkoI, PI-PkoII, PI-PspI, PI-Rma43812IP, PI-SPBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-Thyl, PI-Tlil y PI-TlilI.
7. 7. Sistema de recombinación según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario está seleccionada del grupo de las endonucleasas de Homing que comprende emzimas según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10.
8. 8. Sistema de recombinación según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario se realiza, usando una cassette de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico codificante para dicha enzima.
9. 9. Sistema de recombinación según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario se realiza, usando una cassette de expresión, que comprende una seecuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ó 9 codificante para dicha enzim .
10. 10. Procedimiento para eliminar una secuencia de ADN a partir del ADN cromosomal de una céula o un organismo eucariota, caracterizado porque se reúnen I) una estructura de recombinación transgenética insertada en el ADN cromosomal de un organismo eucariota, que contiene una secuencia que se compone en dirección 5'/3' de: al) una primera secuencia de homología A, y bl) por lo menos una secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario, y a2) una segunda secuencia de homología B, presentando las secuencias de homología A y B una longitud suficientemente larga y una homología suficientemente alta, para asegurar una recombinación homologa, y II) una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenarío en la secuencia de reconocimiento (b) para la inducción específica de roturas de ADN bicatenarío en una célula eucariota o un organismo eucariota, y se realiza la inducción de roturas de ADN bicatenarío en la secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de doble cadena de ADN, así como la recombinación homologa entre las secuencias de homología A y B.
11. 11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la estructura de recombinación está compuesta como sigue al) una primera secuencia de homología A y bl) una secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenarío y c) otra secuencia de ácido nucleico y a2) una segunda secuencia de homología B, presentando las secuencias de homología A y B una longitud suficiente y una homología suficiente, para asegurar una recombinación homologa.
12. 12. Procedimiento según la reivindicación 10 ó 11, caracterizado porque la estructura de recombinación está compuesta como sigue: al) una primera secuencia de homología A y bl) una primera secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y c) otra secuencia de ácido nucleico y b2) una segunda secuencia de reconocimiento para la inducción específica de roturas de ADN bicatenario y a2) una segunda secuencia de homología B, presentando las secuencias de homología A y B una longitud suficiente y una homología suficiente, para asegurar una recombinación homologa.
13. 13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque la estructura de recombinación o la otra secuencia de ácido nucleico se compone de por lo menos uno de los elementos seleccionados del grupo que abarca: i) marcadores de selección positivos ii) marcadores de selección negativos iíi) genes repórter iv) orígenes de replicación v) regiones de clonado múltiples vi) secuencias "border" para la transfección con Agrobacterium vii) secuencias, que permiten una recombinación homologa o bien inserción en el genoma de un organismo huésped viii) cassette de expresión para una enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario.
14. 14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque la enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario está seleccionada del grupo que comprende: endonucleasas de restricción, endonucleasas de Homing, recombinasas , transposasas, nucleasas quiméricas.
15. 15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque la enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario está seleccionada del grupo de las endonucleasas de Homing que comprende: F-Scel, F-Scell, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-Amal, I-Anil, I-Ceul, I-CeuAIIP, I-ChuI, I-Cmoel, I-Cpal, I-CpaII, I-Creí, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-Csml, I-Cvul, I-CvuAIP, I-Ddil, I-DdiII, I-Dirl, I-Dmol, I-Hmul, I-HmuII, I-HspNIP, I-Llal, I-Msol, I-Naal, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-Nitl, I-Njal, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-Porl, I-PorIIP, ?-PpbIP, I-Ppol, I-SPBetaIP, I-Scal, I- Scel, I-SceII, I-SceIII , ?-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I- Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiS3bP , I-TdeIP, I- Tevl, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, 1-UarHGPAlP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP, PI-MtuHIIP, PI-PfuI, ??-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-PspI, PI-Rma43812IP, PI- SPBetalP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-Thyl, PI-Tlil y PI- TÜII .
16. 16. Procedimiento según una de las . reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque la enzima apropiada para la inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario está seleccionada del grupo de las endonucleasas de Homing compuesta de enzimas según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10.
17. 17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 16, caracterizado porque la enzima apropiada para la inducción de roturas de doble cadena de ADN en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario se realiza, usando una cassette de expresión, que comprende una secuencia de ácido nucleico codificante para dicha enzima.
18. 18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 17, caracterizado porque la enzima apropiada para la ' inducción de roturas de ADN bicatenario en la secuencia de reconocimiento para la inducción especifica de roturas de ADN bicatenario se realiza usando una cassette de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ó 9 codificante para dicha enzima.
19. 19. Organismo que contiene un sistema de recombinación según una de las reivindicaciones 1 a 9.
20. 20. Organismo según la reivindicación 19 seleccionado del grupo que abarca: levaduras, algas, hongos, organismos animales o vegetales.
21. 21. Organismo según la reivindicación 19 ó 20 seleccionado del grupo de los organismos vegetales.
22. 22. Organismo según una de las reivindicaciones 19 ó 22, estando el organismo seleccionado del grupo que comprende: Arabidopsis thaliana, tabaco, trigo, centeno, cebada, avena, colza, maíz, papas, remolacha de azúcar, soya, girasol, calabaza o maní.
23. 23. Cultivos celulares, órganos, partes o bienes de multiplicación trangenéticos derivados de un organismo según las reivindicaciones 19 a 22.
24. 24. Uso de un organismo según una .de las reivindicaciones 19 a 22 o de cultivos celulares, órganos, partes o bienes de multiplicación trangenéticos derivados de los mismos según la reivindicación 23 como alimento humano o animal, simientes o para la obtención de fármacos o químicos finos .