BRPI0111284B1 - método para obtenção de amido de milho - Google Patents

Abstract

"uso de enzimas para reduzir o tempo de maceração e exigências em so~ 2~ em um processo de moagem a úmido de milho". a presente invenção refere-se a um método para obtenção de amido de milho que envolve embebimento de grãos de milho em água para produzir grãos de milho embebidos, trituração dos grãos de milho embebidos para produzir uma pasta de milho triturado, e incubar a pasta de milho triturado com enzima (p. ex. protease).

Description

MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE AMIDO DE MILHO

Antecedentes da Invenção A presente invenção refere-se a ura método para obtenção de amido de milho que envolve embebintento com água de grãos de milho para produzir grãos de milho embebidos* trituração dos grãos de milho embebidos para produzir uma pasta de milho triturado, e incubar a pasta de milho triturado com enzima (p, ex. protease).

De forma a satisfazer as necessidades crescentes por etanol e ser competitivo com outros aditivos oxigenados baseados em. petróleo, os custos da produção de etanol devem ser diminuídos e o valor de co-produtos aumentado. Aproximadamente 60-701 do etanol nos EUA são produzidos pelo processo convencional de moagem a úmido de milho. O processo de moagem a úmido separa o cereal (milho) em um produto de amido puro e co-produtos ricos em óleo, fibra e proteína, O milho é inicialmente hidratado (macerado) em uma solução aquosa de dióxido de enxofre. O milho· macerado é triturado grosseíramente para soltar o gérmen intacto do grão. Uma vez que o gérmen contem uma alta concentração de óleo ("45%)* é mais leve que os outros constituintes da pasta triturada e pode ser separado (por diferença de densidade) utilízando-se hidrociclones para gérmen. A pasta remanescente é finamente trírurada para romper a matriz do endosperma e liberar as partículas de amido. As partículas de fibra são removidas por passagem da pasta por peneiras finas (abertura de 75 pm) . O amido é separado da proteína em um sistema de centrifugas e hidrociclones, resultando em uma fração de amido contendo menos de 0,35% (d.s.) de proteína. O amido é então posteriormente processado a diferentes produtos tais como etanol ou xaropes de milho. A primeira e mais importante operação no processo de moagem a úmido é a maceração. A maceração envolve o embebimento dos grãos de milho em contra-corrente por 24-48 horas em água sulfurosa (0,1-0,2%) morna (48°-54°C). 0 propósito da maceração é amaciar o grão de milho e quebrar as ligações dissulfeto que mantêm as matrizes de proteína juntas. A maceração é um processo de difusão limitado. A água e os produtos químicos de maceração (geralmente 2000-2500 ppm de S02 e 05-2% de ácido lático (usualmente produzido durante a maceração por bactérias lactobacillus)) se difundem no grão de milho através da extremidade do pedicelo, se movem através das células cruzadas e células tubulares do pericarpo até a coroa e no endosperma. O SO2 no endosperma reage com a matriz protéica que encapsula os grãos de amido. O resultado é a dispersão da proteína do endosperma e um aumento da liberação de amido durante a moagem subseqüente (Watson, S.A. et al., Cereal Chem.,38:22-23 (1961)). A penetração de SO2 no endosperma e seu tempo de reação com a matriz protéica torna a maceração uma operação que consome muito tempo (24 a 36 horas) no processo de moagem a úmido. Tempos de maceração menores que 24 horas, resultam em baixas produções de amido e perda de amido nas frações de fibra e protéicas. A maceração é também uma das partes mais intensivas em capital e energia do processo de moagem a úmido de milho. É estimado que 21% da energia total e do custo de investimento são utilizados para a operação de maceração (Eckhoff, S.R., Wet milling short course, Course Notes, American Association of Cereal Chemists, St. Paul, MN, 1999). A redução do tempo de maceração reduziría o custo em energia, aumentaria a capacidade da planta e reduziría o custo do investimento envolvido na construção de novas plantas de moagem a úmido de milho. Várias abordagens mecânicas e químicas têm sido investigadas para diminuir o tempo de maceração enquanto que mantendo o rendimento em produto. Estes processos, no entanto, requerem modificações dispendiosas das facilidades já existentes ou pré-tratamento dos grãos, resultando em aumento de poluição ou aumento do uso de energia (patente US 3.597.274; Roushdi, M. et al., Starch/Stárke, 33:7-9 (1981); Krochta, J.M. et al., J. Food Process. Preserv., 5: 39 (1981); Meuser, F. et al., 1985, The use of high-pressure disintegration technique for the extraction of starch from corn, páginas 161-180, em: New Approaches to Research on Cereal Carbohydrates, R.D. Hill e L. Munck, eds. Elsevier, Amsterdam; Hassanean, A., e A.Abdel-Wahed, Starch/Stãrke, 38:417 (1986); Grindel, R.S., Starch/Stãrke, 17:298 (1965); Neryng, A., e P.J. Reilly, Cereal Chem., 61:8 (1984)). O desenvolvimento de um processamento que pudesse reduzir o tempo de maceração e diminuir ou eliminar o uso de produtos químicos tais como dióxido de enxofre, causaria um impacto significativo na indústria da moagem a úmido de milho. Tal processo diminuiría consideravelmente os custos de energia operacional, aumentaria a capacidade da planta e reduziría os custos de investimentos envolvidos na construção de novas facilidades de moagem a úmido de milho.

Sumário da Invenção Trata-se de um método para obtenção de amido de milho que envolve embeber com água grãos de milho para produzir grãos de milho embebidos, trituração dos grãos de milho embebidos para produzir uma pasta de milho triturado, e incubar a pasta de milho triturado com enzima (p. ex. protease).

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra um fluxograma geral mostrando o processo total de moagem a úmido de milho com a adição de uma nova etapa de incubação com enzima; A Figura 2 mostra uma comparação dos rendimentos em amido de amostras de milho maceradas utilizando o procedimento em duas etapas com produtos químicos de maceração convencionais (SO2 e ácido lático), apenas em tampão, e com enzima (tampão + enzima) , as barras de erro representam ± um desvio padrão de uma duplicata média; A Figura 3 mostra uma comparação dos rendimentos em amido de amostras de milho maceradas utilizando o procedimento em duas etapas com produtos químicos de maceração convencionais (SO2 a 2000 ppm e ácido lático), SO2 em menos quantidade sem enzima {600 ppm sem ácido lático), SO2 em menos quantidade (200 e 600 ppm) com enzima e controles (sem SO2 com enzima e sem SO2 sem enzima) , as barras de erro representam ± um desvio padrão de uma duplicata média, os valores em percentagem indicam o teor médio em proteína da amostra; e A Figura 4 mostra um diagrama geral mostrando o processo convencional de moagem a úmido e a localização do novo tratamento enzimático. A Figura 5 mostra uma comparação do rendimento de cada fração a partir de amostras de milho maceradas utilizando preparações de hidrolase individual, produtos químicos normais (produto químico controle; SO2 a 2000 ppm e 0,55% de ácido lático) e apenas tampão (controle tampão; tampão acetato 0,05 M, pH 4,0); as barras de erro representam ± um desvio padrão de uma duplicata média (quadruplicata para os controles); a escala do gráfico anexado é diferente da escala utilizada nas figuras 6-9. A Figura 6 mostra uma comparação do rendimento de cada fração a partir de amostras de milho maceradas utilizando proteases, produtos químicos normais (produto químico controle; SO2 a 2000 ppm e 0,55% de ácido lático) e apenas tampão (controle tampão; tampão acetato 0,05 M, pH 4,0); as barras de erro representam ± um desvio padrão de uma duplicata média (quadruplicata para os controles). A Figura 7 mostra uma comparação do rendimento de cada fração a partir de amostras de milho maceradas utilizando três concentrações de bromelaína, produtos químicos normais (produto químico controle; SO2 a 2000 ppm e 0,55% de ácido lático) e apenas tampão (controle tampão; tampão acetato 0,05 M, pH 4,0); as barras de erro representam ± um desvio padrão de uma duplicata média (quadruplicata para os controles). A Figura 8 mostra uma comparação do rendimento de cada fração a partir de amostras de milho maceradas utilizando bromelaína por 1, 2, 3 e 4 horas de incubação, produtos químicos normais por 3 horas (produto químico controle; SO2 a 2000 ppm e 0,55% de ácido lático) e apenas tampão por 3 horas (controle tampão; tampão acetato 0,05 M, pH 4,0); as barras de erro representam ± um desvio padrão de uma duplicata média (quadruplicata para os controles). A Figura 9 mostra uma comparação do rendimento de cada fração a partir de amostras de milho maceradas utilizando produtos químicos normais (produto químico controle; S02 a 2000 ppm e 0,55% de ácido lático), S02 em menor quantidade sem enzima (600 ppm sem ácido lático), S02 em menor quantidade com 500 mg de bromelaína (200 e 600 ppm sem ácido lático), bromelaína (500 mg) sem SO2 ou ácido lático e apenas tampão (controle tampão; tampão acetato 0,05 M, pH 4,0); as barras de erro representam ± um desvio padrão de uma duplicata média (quadruplicata para os controles). A Figura 10 mostra uma comparação do rendimento de cada fração a partir de amostras de milho maceradas utilizando um procedimento de moagem a úmido Kg de milho. Amostras processadas convencionalmente foram maceradas utilizando S02 a 2000 ppm e 0,55% de ácido lático. Tratamentos com bromelaína foram realizados com 3 horas de embebimento e 3 horas de incubação utilizando 5 g de bromelaína (500 mg/100 g de milho) com tampão acetato 0,05 M, pH 5,0. As barras de erro representam ± um desvio padrão de uma duplicata média.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção, de uma maneira geral, envolve a hidratação de grãos de milho em água por 1-6 horas, de tal forma que o gérmen seja completamente hidratado e se torne suficientemente flexível para não quebrar quando o milho for triturado grosseiramente; trituração grosseira do milho para produzir uma pasta; e tratamento da pasta de milho triturado grosseiramente com enzima exógena ou endógena (p. ex. protease) por- 0,5-6 horas. Após o tratamento enzimático (p. ex. protease), o milho é moído utilizando-se os métodos normais de moagem a úmido. A presente abordagem remove as barreiras de difusão e permite que a enzima penetre no interior do endosperma do milho e reaja com o substrato protéico. 0 tempo total de maceração com o procedimento modificado fica em geral na faixa de 6 a 8 horas.

Um fluxograma geral do processo total é mostrado na Figura 1. Os grãos de milho entram através da linha IA e são hidratados ou macerados em água em um tanque de embebimento, geralmente por cerca de 1 a cerca de 6 horas (p. ex. 1-6 horas), preferivelmente cerca de 2 a cerca de 4 horas (p. ex. 2-4 horas), mais preferivelmente cerca de 3 horas (p. ex. 3 horas), e a uma temperatura de cerca de 45° a cerca de 60°C (p. ex. 45°-60°C), preferivelmente cerca de 48° a cerca de 52°C (p. ex. 48°-52°C) , preferivelmente cerca de 45° a cerca de 50°C (p. ex. 45°-50°C) , mais preferivelmente cerca de 48°C (p. ex. 48°C). Então, a água de maceração leve é removida do tanque (1) através da descarga (2), e os grãos de milho hidratados são transferidos para o tríturador (3) e triturados grosseiramente para formar uma pasta de milho triturado. Mais especificamente, após a hidratação inicial, o milho é triturado normalmente utilizando-se um moinho degerminador (dispositivo de redução de partícula comumente utilizado na indústria de moagem a úmido de milho) ou equipamento semelhante. Moinhos degerminadores são usualmente equipados com um prato "devil's tooth" fixo e outro rotativo que trabalham compactamente e são desenhados especificamente para milho. Os pratos do moinho podem ser ajustados para regulagens de distância. A distância entre os pratos e a rotação do moinho controlam o impacto e a força de cisalhamento sobre os grãos e, desta forma, afetam a qualidade do gérmen recuperado. A hidratação inicial do milho é feita de maneira a que se tenha água suficiente no grão de milho, de tal forma que o gérmen não quebre quando o milho é triturado utilizando-se um moinho degerminador. Na presente invenção, em geral é utilizada uma distância um pouco maior entre os pratos do moinho (do que a usualmente utilizada na indústria de moagem a úmido de milho) para a trituração grosseira (trituração grosseira na indústria de moagem a úmido é também conhecida como primeira moagem); embora a utilização de distâncias normais (como as utilizadas na indústria de moagem a úmido de milho) não afete significativamente na recuperação do gérmen. A pasta de milho triturado é incubada em uma incubadora (4) com a enzima (5) (p. ex. protease), em geral por cerca de 0,5 a cerca de 6 horas (p. ex. 0,5-6 horas), preferivelmente cerca de 1 a cerca de 4 horas (p. ex. 1-4 horas), mais preferivelmente cerca de 3 horas (p. ex. 3 horas), e a uma temperatura de cerca de 20° a cerca de 70°C (p. ex. 20°-70°C), preferivelmente cerca de 40° a cerca de 55°C (p. ex. 40°-55°C), mais preferivelmente cerca de 48°C. A temperatura pode ser alterada dependendo da enzima especifica utilizada, mas não deve ultrapassar a temperatura de gelatinização de cerca de 70°C ou ultrapassar a estabilidade térmica da enzima. As enzimas utilizadas no primeiro conjunto de exemplos foram proteases {especificamente bromelaína de talo de abacaxi adquirida da Sigma, a quantidade de enzima variou entre 250 mg e 1 g de enzima por 100 g de milho; ou outra enzima com atividade similar à bromelaína). Está dentro do conhecimento de um especialista na matéria otimizar a quantidade de enzima. 0 tempo de incubação pode ser aumentado de forma que menos enzima pode ser utilizada.

Também está dentro do conhecimento de um especialista na matéria determinar quais proteases podem ser utilizadas com sucesso na presente invenção; por exemplo, existe uma protease no grão de milho que pode ser útil na liberação dos grânulos de amido. A seleção de outras enzimas que poderiam ser utilizadas no processo deveria considerar sua atividade e estabilidade sob as condições específicas utilizadas. Tais enzimas devem apresentar a capacidade de hidrolisar as proteínas que envolvem os grânulos de amido. Como resultado, devem ser selecionadas enzimas que apresentam especificidade para ligações peptidicas em gluteínas e zeínas (e mais) outras proteínas menores do endosperma do milho. Os peptídeos resultantes devem então ser separados durante o processamento. As condições reacionais devem considerar a concentração de enzima, pH, temperatura, tolerância a dióxido de enxofre (se utilizado), e outros fatores enzimáticos específicos tais como exigências em minerais ou cofatores.

Após a incubação com enzima (p. ex. protease), o milho é triturado no triturador (3A) e degerminado no separador (9) (remoção do gérmen). A secadora de gérmen (7) remove o gérmen através da linha 7A. A pasta remanescente é triturado novamente (finamente) e então peneirada através da peneira (8) e a secadora de fibras (12) remove as fibras através da linha 12A. 0 material restante (amido e proteína) é separado pela utilização de um hidrociclone (separação (9) baseada na diferença de densidade) ou outro equipamento similar tal como uma centrífuga (10), separando o glúten e amido. O glúten é conduzido através da linha 11A para a secadora de glúten (11) através da linha 23. O amido é descarregado da centrífuga (10) através da linha 24. Em geral, as condições de moagem a úmido após a maceração com ou sem enzimas são as mesmas utilizadas na indústria de moagem a úmido de milho. A Figura 4 mostra um diagrama geral de um processo de moagem a úmido de milho convencional e a localização dos novos tratamentos enzimáticos como mostrado nos estágios a, b, c e d.

Em um processo de moagem a úmido de milho convencional, o milho é hidratado em um tanque de maceração (1), a água é retirada através da peneira (12), e o milho é então enviado para um moinho primário (3) e primeiro tanque de trituração (4). É neste ponto que o tratamento enzimático (5) da invenção é introduzido no tanque (4). A lavagem do gérmen nos tanques (13) é realizada com água fresca (14), e a umidade é retirada na secadora (7). O gérmen é então separado nos hidrociclones primários (9) e enviado para um outro moinho (3A) e tanque (4A) para uma segunda separação era hidrociclones secundários (9A) e separado através da peneira (7A) , Uma outra trituração é realizada em um moinho triturador (6) , então separado por alimentação sob pressão na peneira {8A} e a fibra é lavada em tanques (15) com água processual (16) e a fibra é removida. A mistura e amido e glúten remanescente é degranulada no ciclone (17), enviada para um espessador de corrente de moinho (18) e a água processual (16A) é removida. Uma centrifuga primária (10) remove o amido e envia o amido separado para um sistema de lavagem em múltiplos estágios em tanques (19) utilizando água fresca (14A) para obter o amido. Parte da mistura é enviada para um clarificador (20) com água processual (16B) sendo removida. O glúten separado é enviado para uma centrífuga espessadora de glúten (21), a água processual é removida, e então o glúten é passado através de um filtro tipo "belt filter" (22) para que o glúten seja obtido. Desta forma, o amido e o glúten são separados.

Os exemplos a seguir são destinados apenas a ilustrar adicionalmente a invenção e não são destinados a limitar o escopo da invenção como definido nas reivindicações.

Exemplos Primeiro conjunto de exemplos: Milho (100 g) foi inicialmente embebido em água (180 ml) por 3 horas a 48°C e a água de embebimento foi removida (pode ser feito de 1,0-6,0 horas a 45-60°C). O milho foi então triturado utilizando-se um homogeneizador do tipo Waring com um volume igual de água para simular a primeira trituração normal (trituração grosseira) como feito comumente na indústria de moagem a úmido.

Foram adicionados à pasta produtos químicos normais de maceraçâo {metabissulfito de sódio a 600-2000 ppm com e sem ácido lático (0,5% em peso)) ou tampão de acetato de sódio, pH 4,0, a uma concentração final de 0,05 M. Foi então adicionada enzima às pastas (500 mg de bromelaína de talo de abacaxi foi utilizada para os resultados mostrados nas figuras 2 e 3, mas outras enzimas foram testadas) e a pasta foi incubada por 1-4 horas a 48°C (pode ser feito de 0,5-6,0 horas a 20-70°C) com agitação a cada 30 minutos (a agitação pode ser contínua).

Seguindo ao período de incubação, a pasta foi processada de acordo com o procedimento de Eckhoff et al. (Eckhoff, S.R. et al, "A 100-g laboratory corn wet-milling procedure", Cereal Chem. 73:54-57 (1996)) para determinar o rendimento das frações (fibra, amido, gérmen e proteína). O teor de proteína do amido foi determinado utilizando-se AOAC 991.201 Métodos Oficiais de Análise (Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC) . Os valores mostrados são a média de determinações em duplicata.

Os resultados em nossos laboratórios mostraram que proteases (sem a adição de produtos químicos de maceraçâo), quando utilizadas com o procedimento de maceraçâo em duas etapas modificado, produziram um aumento significativo no rendimento em amido sobre amostras maceradas em água, e apresentaram rendimentos comparáveis a amostras maceradas de forma convencional (maceraçâo com SO2 e ácido lático) (Figura 2). Isto está em acentuado contraste com a utilização das mesmas enzimas em um procedimento de maceração de etapa única onde nâo há aumento significativo em relação aos controles.

Estudos adicionais mostraram que mantendo-se o mesmo nível de enzima e aumentando o tempo de incubação, são obtidos rendimentos em amido equivalentes às amostras maceradas de forma convencional. Foi também demonstrado que estas enzimas podem ser utilizadas na presença de S02 e que os rendimentos em amido, quando se utiliza uma concentração significativamente reduzida de S02 (600 ppm) , não são distinguíveis dos controles convencionais (2000 ppm) (Figura 3} . 2000-2500 ppm de S02 são normalmente utilizados comercíalmente. Uma razão para a utilização de S02 é controlar o conteúdo raicrobiano em diferentes correntes do produto, microorganismos podem ser controlados pela utilização de tão pouco quanto 600 ppm de S02. A enzima não foi desativada pelos 600 ppm de S02. O teor de proteína do amido mostra que as amostras tratadas com enzima (com e sem S02) , é semelhante ao teor de proteína das amostras maceradas de forma convencional. A amostra controle sem S02 e sem enzima mostra um teor de proteína significativamente maior.

Segundo conjunto de exemplos: Enzimas protease (bromelaína de talo de abacaxi; pepsína de mucosa estomacal suína; proteinase ácida de Aspergíllus, Tipo XIII de Aspergillus saitoi) foram adquiridas da Sigma. Todas as outras enzimas (xilanase, celulase, celobiase, β-glucanase) foram doadas pelos fabricantes. Um milho híbrido de grão amarelo (Pioneer 3394 crescido durante a estação de cultivo de 1999 na Agrícultural Engineering Farm, University of Illinois em Urbana-Champaing) foi utilizado para o estudo. As amostras de milho foram limpas a mão para remover os grãos quebrados e material estranho. As amostras foram então embaladas e armazenadas a 4°C até sua utilização. 0 teor de umidade total do grão das amostras foi determinado pela utilização de uma estufa de convecção a 103°C método AACC 2000a (American Association of Cereal Chemists (AACC), 2000a, Approved Methods of the AACC, 8a Ed,, Método 44-15A, The Association: St. Paul, MN).

Determinação da Atividade Enzimática: O teor de proteína foi determinado pelo método de Bradford (Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72:248-254 (1976)) com reagentes adquiridos da Sigma, utilizando como proteína padrão albumina de soro bovino. As atividades de carbohidrase foram medidas como um aumento na redução de grupos equivalentes em tampão acetato, pH 4,5 a 40°C (Johnston, D.B. et al., J. Food Biochem., 22:301-319 (1998)}; as unidades de atividade foram definidas pela alteração nos grupos redutores, equivalente a um aumento de 1 pg de açúcar por minuto. Os ensaios de celulase e β-glucanase utilizaram carboximetilcelulose e β-glucana de cevada como substrato, respectivamente, e glicose como açúcar padrão. Os ensaios de xilanase e hemicelulase utilizaram xilano e goma de fibra de milho (Doner, L.W. et al., Cereal Chem., 75:408-411 (1998)) como substrato, respectivamente, e xilose como açúcar padrão. Os ensaios de amilase e amido nativo utilizaram amido de milho gelatínízado e não gelatinizado como substrato e maltose como açúcar padrão. A atividade de protease foi dada de acordo com o método de Anson modificado (Abe, M. et al., Agric. Biol. Chem., 41(5):893-899 (1977)); uma unidade de protease é definida como ΔΑ280 de 0,001 por minuto (1 cm de trajetória luminosa) a pH 4,5 e 40°C, medida como produtos solúveis de TCA utilizando hemoglobina como substrato na presença de cisteína 10 mM.

Procedimentos de Moagem a Úmido: A moagem a úmido de milho convencional foi realizada utilizando-se o procedimento de moagem a úmido laboratorial de 100 g (Eckhoff, S.R. et al., Cereal Chem., 73:54-57 (1996)). O procedimento de maceração em dois estágios modificado foi conduzido como se segue: Amostras de milho (100 g) foram colocadas em frascos Erlenmeyer de 500 ml com 180 ml de água ou produtos químicos de maceração (0,2% de SO2 + 0,55% de ácido lático). 0 milho foi embebido por 3 horas a 48°C. A água foi drenada em um cilindro graduado de 250 ml e o volume de água não absorvida foi medido, e então secado para determinar os sólidos totais utilizando o procedimento de secagem em dois estágios AACC 2000b (American Association of Cereal Chemists (AACC), 2000b, Approved Methods of the AACC, 8a Ed., Método 44-18, The Association: St. Paul, MN) . O milho foi então moido em um volume igual de água (volume a volume) utilizando-se um homogeneizador do tipo Waring. A pasta foi então transferida para um frasco Erlenmeyer e os reagentes adicionais foram acrescentados (enzima, tampão, metabissulfito de sódio, ácido lático). O frasco foi então incubado a 48°C (banho-maria) por 1-4 horas, com agitação com intervalos de 30 minutos. Após a incubação, a pasta foi moída com um procedimento de moagem a úmido laboratorial convencional (Eckhoff, S.R. et al., Cereal Chem., 73:54-57 (1996)).

Condições de Incubação: Foi realizada uma maceração normal utilizando o procedimento de 100 g não modificado (Eckhoff, S.R. et al., Cereal Chem., 73:54-57 (1996)) utilizando 2000 ppm de dióxido de enxofre e 0,55% de ácido lático e maceração por 24 horas a 52°C antes da moagem. Foram adicionados a enzima e os produtos químicos diretamente à solução de maceração. Os tratamentos enzimáticos foram realizados com a adição de dióxido de enxofre e ácido lático, com apenas ácido lático, e sem produtos químicos. Tempos de maceração diferentes de 24 horas foram testados. A maceração em dois estágios normal foi realizada utilizando-se 2000 ppm de dióxido de enxofre com 0,55% de ácido lático adicionado durante a etapa inicial de embebimento (3 h). Nenhum produto químico adicional foi acrescentado durante o segundo procedimento de incubação.

As amostras tratadas com enzima utilizando o procedimento em dois estágios foram embebidas em água (sem produtos químicos de maceração, enzimas ou tampão) como primeira etapa do processo. Após a primeira trituração, foi adicionado 10 ml de tampão acetato de sódio 1 M, pH 4,0 para controlar o pH (o pH final foi 4-4,5). Foi adicionado metabissulfito de sódio às amostras indicadas para ter-se uma concentração equivalente de dióxido de enxofre de 200, 600 ou 2000 ppm. As ' enzimas foram adicionadas tanto em forma de pó (bromelaína, 250, 500 ou 1000 mg; pepsina, 250 mg; proteinase ácida de Aspergíllus Tipo XIII, 250 mg) quanto em forma líquida (celulases, xilanases, ou β-glucanase, 5 ml). As amostras controle (tampão) e tratadas apenas com dióxido de enxofre foram feitas de modo idêntico, mas sem a adição de qualquer enzima.

Ensaio de Proteína de Amido: O teor de proteína do amido foi determinado por um laboratório comercial de análise (Silliker Laboratories Group, Chicago Heighs, IL) utilizando o método AOAC 991.20 (AOAC Métodos Oficiais de Análise, 1990, revisão de março 1996, Nitrogênio (total) em leite, método 991.20, AOAC 73, 849).

Resultados do Procedimento (uma etapa) Convencional com Tratamento Enzimático: Os experimentos iniciais foram destinados a reproduzir os resultados publicados para adição de enzima durante maceração convencional (Steinke, J.D., e L.A. Johnson, Cereal Chem., 68:7-12 (1991);

Caransa, A. et al., Starch/Stárke, 40:409-411 (1988);

Hassanean, A., e A. Abdel-Wahed, Starch/Stárke, 38:417 (1986); Moheno-Perez, J.A. et al., Starch, 51:16-20 (1999)) utilizando o procedimento de moagem a úmido laboratorial de 100 g altamente reproduzível. Os tratamentos experimentais consistiram na adição de enzima com o que se segue: (a) adição de dióxido de enxofre e ácido lático, (b) adição de ácido lático sem dióxido de enxofre, e (c) sem adição de dióxido de enxofre ou ácido lático. Os experimentos de maceração por 24 h não mostraram aumento no rendimento de amido com a adição de qualquer das combinações de enzima testadas. Foi observado um pequeno decréscimo, estatisticamente insignificante, nos rendimentos de amido em comparação com os controles tamponados em várias amostras.

Resultados do Procedimento em Dois Estágios com Glicosidases: Quando foi utilizado o procedimento em dois sstágios modificado (3 h de embebimento de grãos intactos seguido de trituração grosseira e uma incubação de 3 h da Dasta moida) com preparações enzimáticas similares àquelas ntilizadas no procedimento (uma etapa) convencional, foram observados aumentos significativos bem como decréscimos no rendimento em amido. As misturas de preparações comerciais gue mostraram decréscimo foram posteriormente testadas para identificar o componente responsável. A Figura 5 mostra os rendimentos das frações para três componentes individuais (β-glucanase, celulases ou xilanases). Embora todas as :rês tenham mostrado um decréscimo significativo nos rendimentos em amido, quando comparados com o rendimento em unido do controle tampão, a preparação de β-glucanase foi rlaramente identificada como sendo o principal componente responsável para o decréscimo extensivo nos rendimentos em unido. Os rendimentos em glúten foram também levantados sara a preparação de β-glucanase, potencialmente indicando ima perda em amido por hidrólise enzimática na fração de jlúten. Nenhuma das carbohidrases testadas foram úteis no lumento dos rendimentos em amido.

Resultados do Procedimento em Dois Estágios com Proteases: Três diferentes proteases (pepsina, protease ícida ou bromelaina) foram testadas individualmente e em rombinação com outras hidrolases (celulases, xilanases e β-jlucanase) utilizando o procedimento em dois estágios. Os rendimentos das frações para proteases sem enzimas idicionais são mostrados na Figura 6. Pepsina e protease ícida mostraram um aumento significativo nos rendimentos em imido em relação ao controle tampão; no entanto, a bromelaina mostrou o maior aumento. Houve também um decréscimo significativo no rendimento em fibra total com as três proteases testadas quando se compara o rendimento am fibra total do controle tampão. Não houve diferença significativa no rendimento em fibra total entre o controle químico e a amostra tratada com bromelaína. As misturas de proteases sem outras hidrolases não mostraram aumentos adicionais nos rendimentos em amido em relação ao uso de apenas protease; no entanto, alterações nas frações de fibra e/ou glúten foram observadas.

Resultados Mostrando o Efeito da Concentração de Sromelaína: Utilizando-se o procedimento em dois estágios, foram determinados os efeitos da concentração de bromelaína ia recuperação do amido. Três níveis de enzima foram avaliados (250, 500 e 1000 mg por 100 g de milho) . Os rendimentos das frações são mostrados na Figura 7. Todos 3 s níveis testados mostraram aumento nos rendimentos em imido sobre os controles tampão. Diferenças significativas foram observadas entre os tratamentos com 250 e 500 mg. iouve apenas uma réplica para a amostra de 1000 mg.

Resultados do Desenvolvimento no Tempo do Tratamento :om Bromelaína: Utilizando-se o procedimento em dois sstágios e aplicando-se um nível de bromelaína de 500 mg, foi avaliado o tratamento ao longo do tempo. As amostras foram embebidas por 3 horas em água (Ia etapa do procedimento modificado) , após o que procedeu-se à :rituração grosseira e ao tratamento enzimátíco por 1, 2, 3 ϊ 4 horas antes da moagem (2a etapa do procedimento nodificado). Os rendimentos das frações são mostrados na figura 8. Os resultados mostram claramente um aumento progressivo nos rendimentos em amido e uma queda geral das fibras totais com o aumento do tempo de incubação.

Resultados Mostrando o Efeito do Dióxido de Enxofre no Tratamento Enzimático: Dióxido de enxofre (S02) é utilizado em plantas de moagem a úmido de milho para controlar o crescimento microbiano. Para determinar se níveis de dióxido de enxofre (200-600 ppm) mais baixos que aqueles utilizados comercialmente (1000-2000 ppm) poderíam ser usados para inibir o crescimento microbiano sem afetar a atividade enzimática durante o processo de moagem modificado, foram processadas amostras com e sem dióxido de enxofre adicionado durante o estágio de incubação. Os resultados são mostrados na Figura 9. As amostras tratadas som 600 ppm de dióxido de enxofre apenas mostraram um pequeno aumento nos rendimentos em amido quando comparadas som os controles tampão; no entanto, o rendimento total em fibras foi significativamente elevado e os rendimentos em amido foram significativamente mais baixos que para as amostras tratadas com bromelaína bem como controles químicos. As amostras que foram tratadas apenas com oromelaína mostraram rendimentos em amido aumentados quando em comparação com os rendimentos em amido dos controles tampão, como nos experimentos anteriores. A adição tanto de bromelaína quanto de dióxido de enxofre mostrou um aumento adicional nos rendimentos em amido em comparação som os controles no nível de 600 ppm; no entanto, no nível de 200 ppm não houve aumento adicional.

Resultados Relativos à Proteína no Amido; Os teores residuais de proteína nas amostras de amido obtidas a partir dos estudos de moagem foram determinados para amostras tratadas com bromelaína e amostras tratadas com dióxido de enxofre. A Figura 3 mostra os resultados dos rendimentos em amido bem como a percentagem de proteína determinada para cada fração de amido. 0 teor de proteína nas amostras tratadas com dióxido de enxofre e tratadas com enzima foram significativamente mais baixos que nos controles tampão (sem enzima, sem S02) . As diferenças entre as amostras individuais, no entanto, não foram suficientemente significativas para se chegar a conclusões adicionais sobre a eficácia da remoção de proteína pelo uso de tratamentos com protease. O efeito combinado do nível baixo de dióxido de enxofre mais a aplicação do processo enzimático não aparenta ser mais efetivo no que diz respeito à diminuição do teor de proteína final no amido produzido do que qualquer dos tratamentos acima.

Resultados do procedimento em escala 10X: Moagem a úmido de milho convencional foi realizada utilizando-se o procedimento de moagem a úmido de milho em escala laboratorial de 1 kg. (Eckhoff, S.R. et al., Cereal Chem., 73:54-57 (1996)). 0 procedimento de moagem enzimática foi realizado utilizando-se um procedimento de escala 10X do procedimento de moagem a úmido de 100 g em dois estágios modificado. Amostras de milho (1000 g) foram embebidas em 2 1 de água a 55°C por 3 horas. A água foi drenada e o milho homogeneizado utilizando-se 1,5 1 de água fresca. A pasta foi transferida para um recipiente de aço inoxidável e foram adicionados tampão (concentração final, tampão acetato 0,05 M, pH 5,0) e 5 g de bromelaína. A pasta foi incubada por 3 horas a 48°C em banho-maria e misturada continuamente utilizando-se um agitador mecânico.

Separações e processamentos adicionais foram realizados de acordo com Eckhoff, S.R. et al., Cereal Chem., 73:54-57 (1996). Os rendimentos das frações do procedimento Kg utilizando bromelaína mostraram um aumento significativo na recuperação de amido e glúten quando em comparação com os rendimentos obtidos a partir das amostras de moagem convencional. A quantidade em sólidos secos na água de embebimento dos tratamentos com bromelaína foi bastante reduzida quando em comparação com os rendimentos da moagem convencional.

De forma a superar o problema de penetração da enzima no endosperma intacto, nossa abordagem foi utilizar um sistema de maceração em dois estágios. 0 primeiro estágio é hidratar o grão de milho em água (sem a adição de produtos químicos de maceração) por várias horas (p. ex. 3 h), de tal forma que o gérmen seja completamente hidratado e se torne suficientemente flexível para não quebrar quando da trituração grosseira. A segunda parte do nosso sistema de maceração envolve o tratamento da pasta de milho triturado grosseiramente com enzima (e. ex. protease). Após o tratamento, o milho é moído utilizando-se métodos normais de moagem a úmido de milho. Esta abordagem remove as barreiras de difusão e permite às enzimas penetrar no endosperma do milho e reagir com os substratos protéicos.

As preparações de enzima que produziram os aumentos mais significativos nos rendimentos em amido utilizando o procedimento em dois estágios foram as de proteases. As proteases selecionadas foram escolhidas com base em seu pH ótimo, estabilidade térmica, e o potencial da enzima em manter a atividade na presença de S02 (proteases de císteína) . A manutenção da atividade na presença de dióxido de enxofre foi considerada de grande importância uma vez que provavelmente a adição de um nível baixo de S02 ainda será necessária para prevenir contaminação microbiana. Outras proteases podem ser úteis na ausência de dióxido de enxofre ou com o uso de um outro composto antimicrobiano.

Foi determinado que a utilização apenas de proteases é tanto ou mais efetiva que quando utilizadas em misturas com hidrolases (Figura 6). Isto é de alguma forma surpreendente, uma vez que acreditava-se que enzimas que degradam hemicelulose auxiliariam na liberação do amido das fibras. Os rendimentos em amido das amostras tratadas com bromelaína foram significativamente maiores que os rendimentos das amostras tratadas com pepsina ou protease ácida. Isto foi devido provavelmente em parte às condições não ótimas de pH utilizadas para a pepsina e protease: ácida. Foi necessária a utilização de um pH ajustado (no qual todas as enzimas são ativas, mas não necessariamente de forma ótima) para evitar um número excessivo de amostras de controle. A bromelaína foi selecionada para estudos adicionais para determinar se os rendimentos poderíam ser melhorados ainda mais e para determinar a quantidade mínima de enzima necessária para manter o rendimento em amido. Foram testados três diferentes níveis de bromelaína (250, 500 e 1000 mg com embebimento de 3 h e incubação de 3 h) (Figuras 7 e 8) . A adição de 250 mg de bromelaína produziu rendimentos em amido mais altos que os rendimentos em amido produzidos por pepsina ou protease ácida testadas previamente (Figura 6), mas foram vários pontos percentuais mais baixos que os rendimentos em amido das amostras de controle químico. 0 rendimento em amido foi mais alto que o das amostras tratadas com 500 mg e incubadas por 2 h ou menos, mas não para incubações mais longas. Incubações mais longas que 3 h não foram testadas utilizando o tratamento com 250 mg; no entanto é possível que os rendimentos eventualmente atingissem os rendimentos dos controles químicos, desde que a enzima não fosse desativada.

Uma diferença entre os rendimentos em amido das amostras tratadas com 500 e 1000 mg de bromelaína foi observada, mas um significado estatístico não pôde ser associado (apenas um conjunto de dados para a amostra tratada com 1000 mg) . Os rendimentos em fibra total não foram tidos como significativamente diferentes entre as amostras tratadas com 500 e 1000 mg de bromelaína. Embora não testado, é pouco provável que ganhos adicionais pudessem ser conseguidos pela adição de mais bromelaína. A análise do desenvolvimento no tempo (Figura 8) mostrou maiores rendimentos em amido com o aumento do tempo de incubação; no entanto, a modificação por unidade de tempo decaí uniformemente, indicando um valor máximo nos rendimentos em amido. Quando os dados foram plotados em um gráfico XY e a equação da 2a ordem que melhor se ajustava foi calculada, o máximo foi de 66,3%, o que é aproximadamente igual aos rendimentos do controle químico.

A série final de experimentos foi realizada para determinar os efeitos da adição de baixos níveis de dióxido de enxofre no processo durante a etapa de incubação. A contaminação microbiana pode ser um problema potencial iurante o estágio de incubação com enzima do processamento. V adição de dióxido de enxofre a níveis de 200-600 ppm [dependendo do pH) pode ser efetiva na inibição do crescimento microbiano (Block, R.L., Antimicrobials in Food 3anitation and Preservation, páginas 814-815, em: )isinfecion, Sterilization, and Preservation, 4a ed., 1995, ,ea & Febiger, Philadelphia; Lewis, R.J., Food Additives [andbook, 1989, páginas 412-413, Van Nostrand Reinhold, New 'ork) . Como esperado, encontrou-se que a adição de dióxido ie enxofre (sem enzima ou ácido látíco) produziu alguma lelhora nos rendimentos em amido sobre os controles (tampão penas) (Figuras 9 e 10). Todas as amostras tratadas com nzima mostraram aumentos maiores nos rendimentos em amido obre as amostras tratadas apenas com dióxido de enxofre. . combinação de dióxido de enxofre (600 ppm) com a adição .e enzima mostrou o maior aumento e foi na média melhor que .s amostras de controle químico. Determinações de proteína oram feitas nas amostras de amido produzidas (Figura 10) >ara determinar se os tratamentos enzimáticos adequadamente ■emoveram proteína do amido. A amostra controle de amido sem dióxido de enxofre e sem enzima) mostrou um teor médio le proteína de 0,54% e valores individuais tão altos quanto ,7%, bem abaixo do nível aceitável de 0,3%. As amostras b amido tratadas com enzima ficaram todas abaixo de 0,28% tão baixo quanto 0,19% para o tratamento combinando .ióxido de enxofre e bromelaína. Ficou claro a partir dos ,ados que a adição de dióxido de enxofre à incubação com nzima não apresentou efeito negativo na atividade enzimática, mas produziu um ligeiro aumento sobre a utilização apenas de enzima.

Proteases adicionais que poderíam ser utilizadas neste processo devem possuir atividade e estabilidade sob as condições específicas utilizadas. Estas proteases necessitam também hidrolisar as proteínas que envolvem os grânulos de amido. Tais enzimas devem apresentar especificidade para as ligações peptídicas nas gluteínas, zeína e outras proteínas menores do endosperma do milho. Os peptídeos resultantes são então separados durante o processamento. As condições reacionais devem levar em conta a concentração de enzima, pH, temperatura, tolerância ao dióxido de enxofre (se utilizado), e outros fatores da enzima tais como exigências minerais ou de cofatores. Aumentos adicionais na recuperação de amido podem ser conseguidos através da seleção de outras enzimas. 0 presente processo apresenta um número de benefícios potenciais que não foram especificamente objetivados pela presente pesquisa, mas que provavelmente surgem de suas aplicações: (1) Os tempos de maceração mais curtos podem causar um decréscimo no custo de energia e de investimento em tanques de maceração. (2) Os tempos mais curtos de processamento podem aumentar a capacidade da planta. (3) 0 processo pode potencialmente utilizar grãos tanto quebrados quanto inteiros na trituração e adiciona-los diretamente ao tanque de incubação ou no embebimento para uma diminuição do tempo (relativo a grãos intactos) antes da adição à corrente de moagem. Isto resulta em uma saída de produto primário (amido) aumentada para uma mesma alimentação de milho. (4) A água de embebimento do processo modificado contem uma quantidade relativamente baixa de sólidos dissolvidos quando em comparação com a água de maceração leve convencional (aproximadamente menos 90%) . Esta água pode potencialmente ser reciclada pela utilização de filtração em membrana, eliminando a necessidade e gasto com evaporadores.

Todas as referências citadas aqui são incorporadas integralmente como referência.

Desta forma, conforme visto acima, a presente invenção refere-se (em parte) ao seguinte: Um método para obtenção de amido de milho, que envolve o embebimento de grãos de milho em água para produzir grãos de milho embebidos, trituração dos grãos de milho embebidos para produzir uma pasta de milho triturado, e incubação da pasta de milho triturado com enzima. 0 método acima, em que o embebimento é por cerca de 1 a cerca de 6 horas ou por cerca de 2 a cerca de 4 horas ou por cerca de 3 horas. O método acima, em que o embebimento é a cerca de 45° a cerca de 60°C ou a cerca de 48° a cerca de 52°C ou a cerca de 45° a cerca de 50°C ou a cerca de 48°C. O método acima, em que a incubação é por cerca de 0,5 a cerca de 6 horas ou por cerca de 1 a cerca de 4 horas ou por cerca de 3 horas. O método acima, em que a incubação é a cerca de 20° a cerca de 70°C ou a cerca de 40° a cerca de 55°C ou a cerca de 48°C. O método acima, em que o método (embebimento, trituração, incubação com enzima) utiliza menos de cerca de 2500 ppm de S02 (p. ex. menos de 2500 ppm de S02) ou menos le cerca de 2000 ppm de S02 (p. ex. menos de 2000 ppm de >02) ou menos de cerca de 1900 ppm de S02 (p. ex. menos de .900 ppm de S02) ou menos de cerca de 1800 ppm de S02 (p. ;x. menos de 1800 ppm de S02) ou menos de cerca de 1700 >pm de S02 (p. ex. menos de 1700 ppm de S02) ou menos de :erca de 1600 ppm de S02 (p. ex. menos de 1600 ppm de S02) ju menos de cerca de 1500 ppm de S02 (p. ex. menos de 1500 >pm de S02) ou menos de cerca de 1400 ppm de S02 (p. ex. tenos de 1400 ppm de S02) ou menos de cerca de 1300 ppm de 02 (p. ex. menos de 1300 ppm de S02) ou menos de cerca de 200 ppm de S02 (p. ex. menos de 1200 ppm de S02) ou menos de erca de 1100 ppm de S02 (p. ex. menos de 1100 ppm de S02) ou .enos de cerca de 1000 ppm de S02 (p. ex. menos de 1000 pm de S02} ou menos de cerca de 900 ppm de S02 (p. ex. enos de 900 ppm de S02) ou menos de cerca de 800 ppm de S02 p. ex. menos de 800 ppm de S02) ou menos de cerca de 700 pm de S02 (p. ex. menos de 700 ppm de S02} ou menos de erca de 600 ppm de S02 (p. ex. menos de 600 ppm de S02) ou .enos de cerca de 500 ppm de S02 {p. ex. menos de 500 ppm .e S02) ou menos de cerca de 400 ppm de S02 (p. ex. menos de 00 ppm de S02) ou menos de cerca de 300 ppm de S02 (p. ex. tenos de 300 ppm de S02) ou menos de cerca de 200 ppm de S02 p. ex. menos de 200 ppm de S02) ou menos de cerca de 100 pm de S02 {p. ex. menos de 100 ppm de S02) ou menos de erca de 50 ppm de S02 (p. ex. menos de 50 ppm de S02) ou erca de 0 ppm de S02 (p. ex. 0 ppm de S02) . O método acima, em que a enzima é uma protease (p. x. bromelaina). O método acima, em que a concentração da enzima é de erca de 1000 mg (p. ex. 1000 mg) por 100 g de milho ou cerca de 500 mg (p. ex. 500 mg) por 100 g de milho ou cerca de 250 mg (p. ex. 250 mg) por 100 g de milho ou cerca de 100 mg (p. ex. 100 mg) por 100 g de milho ou cerca de 50 mg {p. ex. 50 mg) por 100 g de milho. O método acima envolvendo ainda trituração e degerminação da pasta de milho triturado após a incubação com a dita enzima.

Outras realizações da invenção serão claras àqueles especialistas na matéria a partir de uma consideração deste relatório ou prática da invenção aqui descrita. Pretende-se que o relatório e exemplos sejam considerados apenas exemplificativos, com o verdadeiro escopo e espírito da invenção sendo indicados pelas reivindicações a seguir. *§ ·η |Γ α x g g £ £ 1 s ^ s c ^ s s « ο a w ■Η •d Ό μ % <ο Φ .2 2 b> Ο ο ο LO ο Ό j ._} Η ^ Χ> ° co \γ> ο 'Cj^nJCio σι m r- 0 230^ 03 CMCMOO ■μ U 5 "" (β 2 +> * <ΰ 0 Φ ■* < ί . "8 ^ Η ? ο TJ Τ) -^00-^ T? Φ < ? c C σι t- r- Ο >0p cc -a< r- r- *cd 'Η -Η i | 5 i 1 | 8 _ m .¾ 3 Í* Q T3 Ό a 2 $ (X Η (0 Φ φ M W "Q g Λ φ w τί *§ I ^ ^ ^ 'â a § i! i* c c ps s § : ^ d Μ Ü -Η X) B 1¾ · μ φ -S g1 i) Π3 Ê Φ Tj Φ ^ u Q a m —. w to_ Ϊ .3 Φ Οι O c\! Ο ,,, ° η nj x Η 6 υ> τ3 xí ο Γ μ < tf c a » tf g £ ._| jj rH ÍD í-l rHM Õ* tf Jj 2 Φ w Η H Ü ■y ü o tf Ή "g * tf Φ Η X ^ a li s B . . 1 * i " 3 J | § § - gs°S« i 5 1 " 8 - " 3 S 13 ■s a °· « ΰ s T Ό CL) 5 (13 T3 a t « S ~ „ 3 o. "· Ό ,3 d i> o oo o i> x3 tf /11 ü 3 I m 'L U oo lo σι ^ 0 c ■8 0 | bi ” e c cí (VÍ m £ 2 3 Φ Φ 2 B o ^ ^ ^ ^ ^ $ ® ** Λ V (D -Η -Η O ;r1 ts +j a μ Ή ro μ a Μ 0 Φ φ m Φ φ 1*0 ιΰ ω 0) 2 4-1 Φ ο* Η a SxsatDxs (¾ +> >Η Φ Φ Φ Q ffl 3 τ3 Jj \{Η φ <TJ CO CQ CO <Ό *-j"< r-| tj 3 1 aJ-SStf^g^^aoo à‘3 £(0·ΡΌ:3(ϋΉβΦ,ΓβΦ S2 8cxo-HrH^H(j)ns;sEH w (S μ φ a υ φ -η i wW cQCM&j-ídUXoanja oo BBXVXMDICAÇâES

Claims (22)

1. Método para a obtenção de amido de milho caracterizado pelo fato de compreender: {a] embeber os grãos de milho em água por 1 a 6 horas para produzir grãos de milho embebidos; íb) triturar os ditos grãos de milho embebidos para produzir uma pasta de milho triturado; e (c) incubar a dita pasta de milho triturado com enzima, no qual dito método utiliza menos do que 600 ppm de S02.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito embebí mento ser por 2 a 4 horas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do dito embebimento ser por 3 horas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito embebimento· ser a 45° a 60°C.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do dito embebimento· ser a 4 5° a 50°C.

6. Método·, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do dito embebimento ser a 48°C.

7. Método·, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da dita incubação ser por 0,5 a 6 horas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato da dita incubação ser por 1 a 4 horas.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato da dita incubação ser por 3 horas,

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da dita incubação ser a 20° a 7Q°C,

11. Método, de acordo cora a reivindicação 10, caracterizado pelo fato da dita incubação ser a 40° a 55° t.

12. Método, de acordo cora a reivindicação 11, caracterizado pelo fato da dita incubação ser a 48°C.

13. Método, de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito método utilizar menos de 100 ppm de SO2 -

14. Método, de acordo cora a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do dito método utilizar menos de 0 ppm de S02,

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da dita enzima ser uma protease.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato da dita protease ser bromelaírta,

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da concentração da dita enzima ser 1000 mg por 100 g de milho.

18. Método, de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da concentração da dita enzima ser 500 mg por 100 g de milho,

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da concentração da dita enzima ser 250 mg por 100 g de milho.

20, Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da concentração da dita enzima ser 100 mg por 100 g de milho,

21, Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da concentração da dita enzima ser 50 mg por 100 g de milho.

22, Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda a trituração e degerminação da dita pasta de milho triturado· após a dita incubação com a dita enzima.