ES2304388T3 - Uso de enzimas para reducir el tiempo de maceracion y la demanda de so2 en un proceso de molienda humeda del maiz. - Google Patents
Uso de enzimas para reducir el tiempo de maceracion y la demanda de so2 en un proceso de molienda humeda del maiz. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para la obtención de almidón a partir de maíz, que comprende la impregnación de las semillas de maíz en agua durante 1 a 6 horas para producir semillas de maíz impregnadas, la trituración de dichas semillas de maíz impregnadas para producir una pasta de maíz triturado y la incubación de dicha pasta de maíz triturado con proteasa, utilizando dicho método menos de 600 ppm de SO2.
Description
Uso de enzimas para reducir el tiempo de
maceración y la demanda de SO_{2} en un proceso de molienda húmeda
del maíz.
La presente invención se refiere a un método
para obtener almidón a partir de maíz (grano) utilizando la
impregnación de semillas de maíz en agua para producir semillas de
maíz impregnadas, la trituración de semillas de maíz impregnadas
para producir una pasta de maíz triturado y la incubación de la
pasta de maíz triturado con proteasa.
Para cubrir la creciente necesidad de etanol
para que resulte competitivo frente a otros aditivos oxigenados
basados en el petróleo se deben reducir los costes de producción del
etanol e incrementar el valor de los coproductos. Aproximadamente
el 60-70% del etanol de EEUU es producido mediante
el proceso convencional de molienda húmeda del maíz. El proceso de
molienda húmeda separa el grano (maíz) en un producto de almidón
puro y coproductos ricos en aceite, fibra y proteína. Inicialmente
el grano se hidrata (se macera) en una solución acuosa de dióxido
de azufre. El grano macerado se tritura en grueso para liberar el
germen intacto de la semilla. Como el germen contiene una elevada
concentración de aceite (\sim 45%), es más ligero que los otros
constituyentes de la pasta molida y puede ser separado (por
diferencia de densidad) mediante el uso de hidrociclones de germen.
La pasta restante se tritura finamente para romper la matriz del
endospermo y liberar las partículas de almidón. Las partículas de
fibra son eliminadas pasando la pasta a través de tamices finos
(aberturas de 75 \mum). El almidón se separa de la proteína en un
sistema de centrífugas e hidrociclones, teniendo como resultado una
fracción de almidón que contiene menos del 0,35% (d.s.) de proteína.
Entonces el almidón se sigue procesando en diferentes productos,
como etanol o jarabes de grano.
La primera y más importante operación en el
proceso de molienda húmeda del maíz es la maceración. Ésta implica
la impregnación de las semillas de maíz a contracorriente durante
24-48 horas en agua sulfurosa
(0,1-0,2%) caliente (48º-54ºC). La finalidad de la
maceración es ablandar la semilla de maíz y romper los enlaces
disulfuro que mantienen unida la matriz de la proteína. La
maceración es un proceso de difusión limitada. El agua y los
productos químicos de maceración (generalmente
2000-2500 ppm de SO_{2} y 0,5-2%
de ácido láctico (producido normalmente por las bacterias
lactobacillus durante la maceración)) difunden al interior de la
semilla del maíz a través del extremo de la base de la cáscara, se
mueven a través de las células cruzadas y tubulares del pericarpio
hacia la corona de la semilla y al interior del endospermo. El
SO_{2} reacciona en el endospermo con la matriz proteica que
encapsula los gránulos de almidón. El resultado es la dispersión de
las proteínas del endospermo y la mejora de la liberación del
almidón durante la molienda siguiente (Watson, S.A., et al.,
Cereal Chem., 38:22-23 (1961)). La penetración de
SO_{2} en el endospermo y su tiempo de reacción con la matriz
proteica hace que la maceración sea una operación que requiere mucho
tiempo (24 a 36 horas) en el proceso de molienda húmeda del
maíz.
Los tiempos de molienda inferiores a 24 horas
tienen como resultado rendimientos de almidón bajos y pérdida de
almidón en las fracciones de fibra y proteína. Se estima que el 21%
de la energía total y las inversiones de capital se usan en la
operación de maceración (Eckhoff, S.R., Wet milling short course,
Course Notes, American Association of Cereal Chemists, St. Paul,
MN, 1999). Reducir el tiempo de maceración disminuiría el gasto
energético, incrementaría la capacidad de la planta y reduciría la
inversión de capital involucrada en la construcción de nuevas
plantas de molienda húmeda del cereal.
Se han investigado varios enfoques para reducir
el tiempo de maceración manteniendo los rendimientos del producto.
Estos procesos, sin embargo, requirieron modificaciones costosas de
las instalaciones existentes de pretratamiento de semillas,
teniendo como resultado un incremento de la polución o del uso
energético (Patente U.S. 3,597,274; Roushdi, M., et al.,
Starch/Starke, 33: 7-9 (1981); Krochta, J. M., et
al., J. Food Process. Preserv., 5: 39 (1981); Meuser, F., et
al., 1985 The use of high pressure disintegration technique for
the extraction of starch from corn, páginas
161-180, IN: New Approaches to Research on Cereal
Carbohydrates, R.D. Hill and L. Munck, eds., Elsevier, Amsterdam;
Hassanean, A., y A. Abdel-Wahed, Starch/Starke, 38:
417 (1986); Grindel, R. S., Starch/Starke, 17: 298 (1965); Neryng,
A., and P. J. Reilly, Cereal Chem., 61: 8 (1984)).
El desarrollo de un procedimiento de procesado
que pueda reducir el tiempo de maceración y reducir o eliminar el
uso de productos químicos como el dióxido de azufre tendría un
impacto significativo en la industria de la molienda húmeda del
maíz. Dicho proceso reduciría apreciablemente los costes energéticos
operativos, incrementaría la capacidad de la planta y reduciría la
inversión de capital involucrada en la construcción de nuevas
plantas de molienda húmeda del maíz.
Un método para obtener almidón a partir de maíz
utilizando la impregnación de semillas de maíz en agua para
producir semillas de maíz impregnadas, la trituración de semillas de
maíz impregnadas para producir una pasta de maíz triturado y la
incubación de la pasta de maíz triturado con enzimas (p. ej.
proteasa).
La figura 1 muestra un diagrama de flujo general
que presenta el proceso completo de molienda húmeda del maíz con la
adición de la nueva etapa de incubación enzimática;
La Figura 2 muestra una comparación de los
rendimientos de almidón obtenidos de muestras de maíz macerado
usando el procedimiento de dos etapas con productos químicos de
maceración convencionales (SO_{2} y ácido láctico), en tampón
solo y enzimáticamente (tampón + enzima), las barras de error
representan \pm una desviación estándar de un promedio
duplicado;
La Figura 3 muestra una comparación de los
rendimientos de almidón obtenidos de muestras de maíz macerado
usando el procedimiento de dos etapas con productos químicos de
maceración convencionales (SO_{2} a 2000 ppm y ácido láctico),
SO_{2} reducido sin enzima (600 ppm sin ácido láctico), SO_{2}
reducido (200 y 600 ppm) con enzima y controles (sin SO_{2} con
enzima y sin SO_{2} ni enzima), las barras de error representan
\pm una desviación estándar a partir de un promedio duplicado, los
valores de porcentaje indican el contenido promedio en proteína de
la muestra; y
la Figura 4 muestra un diagrama general que
presenta el proceso completo de molienda húmeda del maíz y la
localización del nuevo tratamiento enzimático.
La Figura 5 muestra una comparación de los
rendimientos de las fracciones de muestras de maíz macerado usando
preparaciones individuales de hidrolasa, productos químicos normales
(control químico; SO_{2} a 2000 ppm y ácido láctico 0,55%) y
tampón solo (tampón control; tampón acetato 0,05 M, pH 4,0); las
barras de error representan \pm una desviación estándar a partir
de un promedio duplicado (cuadriplicado para los controles); la
escala para el gráfico insertado es diferente de la escala usada en
las figuras 6-9.
La figura 6 muestra una comparación de los
rendimientos de las fracciones de muestras de maíz macerado usando
proteasas, productos químicos normales (control químico; SO_{2} a
2000 ppm y ácido láctico 0,55%) y tampón solo (tampón control;
tampón acetato 0,05 M, pH 4,0); las barras de error representan
\pm una desviación estándar a partir de un promedio duplicado
(cuadriplicado para los controles).
La Figura 7 muestra una comparación de los
rendimientos de las fracciones de muestras de maíz macerado usando
tres concentraciones de bromelina, productos químicos normales
(control químico; SO_{2} a 2000 ppm y ácido láctico 0,55%) y
tampón solo (tampón control; tampón acetato 0,05 M, pH 4,0); las
barras de error representan \pm una desviación estándar a partir
de un promedio duplicado (cuadriplicado para los controles).
La Figura 8 muestra una comparación de los
rendimientos de las fracciones de muestras de maíz macerado usando
bromelina durante 1, 2, 3 y 4 horas de incubación, productos
químicos normales durante 3 horas (control químico; SO_{2} a 2000
ppm y ácido láctico 0,55%) y tampón solo durante 3 horas (tampón
control; tampón acetato 0,05 M, pH 4,0); las barras de error
representan \pm una desviación estándar a partir de un promedio
duplicado (cuadriplicado para los controles).
La Figura 9 muestra una comparación de los
rendimientos de las fracciones de muestras de maíz macerado usando
productos químicos normales (control químico; SO_{2} a 2000 ppm y
ácido láctico 0,55%), SO_{2} reducido sin enzima (600 ppm sin
ácido láctico), SO_{2} reducido (200 y 600 ppm sin ácido
láctico)bromelina (500 mg) sin SO_{2} o ácido láctico y
tampón solo (tampón control; tampón acetato 0,05 M, pH 4,0); las
barras de error representan \pm una desviación estándar a partir
de un promedio duplicado (cuadriplicado para los controles).
La Figura 10 muestra una comparación de los
rendimientos de las fracciones de muestras de maíz procesado usando
un proceso de molienda húmeda de un kg de maíz. Las muestras
procesadas convencionalmente se maceraron usando SO_{2} a 2000
ppm y ácido láctico 0,55%. Los tratamientos de bromelina se
realizaron con 3 horas de impregnación y 3 horas de incubación
usando 5 g de bromelina (500 mg/100 g de maíz) con tampón acetato
0,05 M, pH 5,0. Las barras de error representan \pm una
desviación estándar a partir de un promedio duplicado.
La presente invención implica generalmente la
hidratación de la semilla de maíz en agua durante
1-6 horas de forma que el germen se hidrata
completamente y se vuelve suficientemente flexible para no romperse
cuando se tritura en grueso; la trituración gruesa del maíz para
producir una pasta; y el tratamiento de la pasta de maíz triturado
en grueso con enzima exógeno o endógeno (p. ej. proteasa) durante
0,5-6 horas. Tras el tratamiento con enzima (p. ej.
proteasa) el maíz se muele usando los métodos normales de molienda
húmeda del maíz. El presente enfoque elimina las barreras de
difusión y permite a los enzimas penetrar en el interior del
endospermo del maíz y reaccionar con el sustrato proteico. El
tiempo global de maceración con el procedimiento modificado es
generalmente de 6 a 8 horas.
En la Figura 1 se presenta un diagrama de flujo
general que muestra el proceso global. Las semillas de maíz entran
a través de la línea 1A y se hidratan o maceran en agua en el tanque
de impregnación 1, generalmente durante 1-6 horas
(p. ej. 1-6 horas), preferiblemente
2-4 horas (p. ej. 2-4 horas), más
preferiblemente 3 horas (p. ej. 3 horas), y a una temperatura de
45ºC a 60ºC (p. ej. 45ºC-60ºC), preferiblemente 48ºC
a 52ºC (p. ej. 48ºC-52ºC), preferiblemente 45ºC a
50ºC (p. ej. 45ºC-50ºC), más preferiblemente
aproximadamente 48ºC (p. ej. 48ºC). Después, el agua de la
maceración ligera se elimina del tanque 1 vía descarga 2, y las
semillas de maíz hidratadas se transfieren a una trituradora 3 y se
trituran en grueso para formar una pasta de maíz triturado en
grueso. Más específicamente, tras la hidratación inicial el maíz se
tritura normalmente usando un molino de desgerminación (dispositivo
de reducción de partículas usado normalmente en la industria de la
molienda húmeda del maíz) o un equipo similar. Los molinos de
desgerminación están equipados normalmente con una placa "Devil's
tooth" fija y una rotatoria que se engranan estrechamente y se
han diseñado específicamente para el maíz Se puede fijar el hueco
entre las placas de molido. La fijación del hueco entre las placas y
de las rpm de molido controlan la fuerza de impacto y cizallamiento
en la semilla y, por consiguiente, afectan a la calidad del germen
recuperado. La hidratación inicial del grano se realiza para obtener
agua suficiente en la semilla del maíz, de forma que el germen no
se rompa cuando el maíz se triture usando un molino de
desgerminación. En la presente invención, generalmente se usa entre
las placas de molido un hueco un poco mayor (del que se usa
generalmente en la industria de la molienda húmeda del maíz) para
hacer la trituración gruesa (la trituración gruesa en la industria
de la molienda húmeda se conoce también como primera trituración);
aunque usar el ajuste normal del hueco (como se usa en la industria
de la molienda húmeda del maíz) no afectaría significativamente a
la recuperación del germen.
La pasta de maíz triturado se incuba en el
incubador 4 con el enzima 5 (p. ej. proteasa), generalmente durante
0,5-6 horas (p. ej. 0,5-6 horas),
preferiblemente 1-4 horas (p. ej.
1-4 horas), más preferiblemente unas 3 horas (p.
ej. 3 horas), y a una temperatura de 20ºC a 70ºC (p. ej.
20ºC-70ºC), preferiblemente 40ºC a 55ºC (p. ej.
40ºC-55ºC), más preferiblemente unos 48ºC (p. ej.
48ºC). La temperatura se puede cambiar dependiendo del enzima
específico usado pero no debe superar la temperatura de
gelatinización de aproximadamente 70ºC o la temperatura de
estabilidad térmica del enzima. Los enzimas usados en el primer
conjunto de ejemplos fueron proteasas (específicamente bromelina de
tallo de piña proporcionada por Sigma, la cantidad de enzima varió
pero fue de 250 mg a 1 g de enzima por 100 g de maíz; u otros
enzimas con actividad similar a la bromelina). Está dentro de los
conocimientos de un experto en la materia optimizar la cantidad de
enzima. El tiempo de incubación puede incrementarse de forma que se
puede usar menos enzima.
También está dentro de los conocimientos de un
experto en la materia determinar qué proteasas se pueden utilizar
con éxito en la presente invención; por ejemplo, hay una proteasa en
la semilla del maíz que puede ser útil en la liberación de los
gránulos de almidón. La selección de otros enzimas que puedan usarse
en este proceso requeriría considerar la actividad y la estabilidad
bajo las condiciones específicas usadas. Tales enzimas necesitarían
tener la capacidad de hidrolizar las proteínas que rodean los
gránulos de almidón. Como resultado, se seleccionarían los enzimas
que tienen especificidad hacia los enlaces peptídicos en las
proteínas del endospermo del maíz glutelinas y zeína (y otras
menores). Entonces los péptidos resultantes se separarían durante el
procesado. Las condiciones de reacción necesitarían tener en cuenta
la concentración enzimática, el pH, la temperatura, la tolerancia
al dióxido de azufre (si se usa), y otros factores específicos del
enzima, como la necesidad de mineral o cofactor.
Tras la incubación con el enzima (p. ej.
proteasa), el maíz es triturado en una trituradora 3A y desgerminado
en el separado 9 (se elimina el germen). El secador de germen 7
elimina el germen vía la línea 7A. La pasta restante se sigue
triturando (finamente) y después se criba a través del tamiz 8 y el
secador de fibras 12 para eliminar la fibra vía la línea 12A. El
resto del material (almidón y proteína) se separa usando un
hidrociclón (separación 9 basada en diferencia de densidad) u otro
equipamiento similar como una centrífuga 10, que separa el gluten y
el almidón. El gluten se conduce vía la línea 11A al secador de
gluten 11 vía la línea 23. El almidón se descarga de la centrífuga
10 vía la línea 24. Generalmente, las condiciones de molienda húmeda
tras maceración con o sin enzimas serán las mismas que las usadas
en la industria de la molienda húmeda del maíz.
La Figura 4 muestra un diagrama general de un
proceso convencional de molienda húmeda de maíz y la localización
del nuevo tratamiento enzimático, como se muestra en las etapas a,
b, c y d.
En un proceso convencional de molienda húmeda
del maíz, éste es hidratado en un tanque de maceración 1, escurrido
a través del tamiz 12, enviado después al molino primario 3 y el
primer tanque de trituración 4. Es aquí donde se introduce la
invención del tratamiento enzimático 5 en el tanque 4. El lavado del
germen en los tanques 13 se realiza con agua limpia 14 y la humedad
se expele en el secador 7. El germen se separa entonces con los
hidrociclones primarios 9 y se envía a otro molino 3A y al tanque 4A
para una segunda separación con los hidrociclones secundarios 9A y
se tamiza a través del tamiz 7A.
En el molino triturador 6 se lleva a cabo otra
trituración, después se tamiza alimentado a presión a través de los
tamices 8A y la fibra se lava en los tanques 15 con agua de proceso
16 y se elimina la fibra. El mezcla restante de almidón y gluten se
desempolva en el ciclón 17, se envía a un espesador 18 de la
corriente de molido y se elimina el agua de proceso 16A. Una
centrífuga primaria 10 elimina el almidón y envía el almidón
separado a un sistema de múltiples etapas en los tanques 19 usando
agua limpia 14A para obtener el almidón. Una parte de la mezcla se
envía a un clarificador 20 con el agua de proceso 16B eliminada.
El gluten separado se envía a la centrífuga
espesadora de gluten 21, se elimina el agua de proceso 16C, después
pasa a través de un aparato de filtración de gluten 22 para obtener
el gluten. Así se separan el almidón y el gluten.
Los ejemplos siguientes sólo pretenden seguir
ilustrando la invención y no pretenden limitar el alcance de la
invención tal y como se define en las reivindicaciones.
Primer grupo de
ejemplos
El maíz (100 g) se impregnó inicialmente en agua
(180 ml) durante 3 horas a 48ºC y se eliminó el agua de
impregnación (se puede realizar entre 1,0-6,0 horas
a 45-60ºC). El maíz se trituró después usando una
mezcladora tipo Waring en un volumen igual de agua para simular la
primera trituración normal (trituración gruesa) que se realiza
comúnmente en la industria de la molienda húmeda del maíz.
A la pasta se le añadieron los productos
químicos normales para la maceración (metabisulfito sódico a
600-2000 ppm con ácido láctico (0,5% p/p)) o tampón
acetato sódico, pH 4,0, a una concentración final 0,05 M. Entonces
se añadió el enzima a la pasta (se usaron 500 mg de bromelina de
tallo de piña para los resultados mostrados en la figura 2 y 3 pero
se ensayaron otros enzimas) y la pasta incubada durante
1-4 horas a 48ºC (se puede realizar entre
0,5-6,0 horas a 20-70ºC) con
agitación cada 30 min (se puede agitar continuamente).
Después del periodo de incubación, la pasta se
procesó según el procedimiento de Eckhoff y col. (Eckhoff, S.R.,
et al., "A 100-g laboratory corn
wet-milling procedure", Cereal Chem.
73:54-57 (1996)) para determinar los rendimientos
de las fracciones (fibra, almidón, germen y proteína).
El contenido de proteína del almidón se
determinó usando los métodos oficiales de análisis AOAC 991.201
(Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC). Los
valores mostrados son el promedio de mediciones por duplicado.
Los resultados en nuestro laboratorio han
mostrado que las proteasas (sin productos químicos de maceración
añadidos), si se usaban con el procedimiento modificado de
maceración en dos etapas, mostraban una mejora significativa en los
rendimientos de almidón respecto a las muestras maceradas en agua y
tenían rendimientos comparables a las muestras maceradas
convencionalmente (maceradas con SO_{2} y ácido láctico) (Figura
2). Esto contrasta marcadamente con el uso de los mismos enzimas en
un procedimiento de maceración en una sola etapa, donde no hay
mejora significativa respecto a los controles.
Estudios adicionales han mostrado que
manteniendo el mismo nivel de enzima e incrementando el tiempo de
incubación se obtienen rendimientos de almidón equivalentes a las
muestras maceradas convencionalmente. También hemos demostrado que
estos enzimas se pueden usar en presencia de SO_{2} y que los
rendimientos de almidón usando una concentración significativamente
reducida de SO_{2} (600 ppm) son indistinguibles de los controles
convencionales (2000 ppm) (Figura 3). Comercialmente se usan
normalmente 2000-2500 ppm de SO_{2}. Una finalidad
del uso de SO_{2} es controlar el contenido microbiano en las
diferentes corrientes del producto y los microbios pueden
controlarse usando tan poco SO_{2} como 600 ppm. El enzima no se
inactivó con 600 ppm de SO_{2}.
El contenido de proteína del almidón muestra que
las muestras tratadas con enzima (con o sin SO_{2}) tienen un
contenido de proteína similar a las muestras maceradas
convencionalmente. La muestra control sin SO_{2} y sin enzima
muestra un contenido de proteína significativamente mayor.
Segundo grupo de
ejemplos
Los enzimas proteasa (bromelina de tallo de
piña; pepsina de mucosa estomacal porcina; proteinasa ácida de
Aspergillus tipo XIII de Aspergillus saitoi) fueron
proporcionados por Sigma. Todos los demás enzimas (xilanasa,
celulasa, celobiasa, \beta-glucanasa) fueron
obsequiados por los fabricantes. Se usó para el estudio un híbrido
de maíz silvestre amarillo (Pioneer 3394 cultivado durante la
temporada de cosecha de 1999 en Agricultural Engineering Farm,
University of Illinois en Urbana Champaign). Las muestras de maíz
fueron lavadas para eliminar semillas rotas y materiales extraños.
Las muestras se envasaron y almacenaron a 4ºC hasta su uso. El
contenido total de humedad en la semilla de las muestras fue medido
usando el método del horno de convección a 103ºC AACC 2000a
(American Association of Cereal Chemists (AACC), 2000a, Approved
Methods of the AACC, 8th ed., Method 44-15A, The
Association: St Paul, MN).
Medición de la actividad enzimática: El
contenido proteico se determinó por el método Bradford (Bradford,
M.M., Anal. Biochem., 72: 248-254 (1976)) con
reactivos proporcionados por Sigma, usando albúmina sérica bovina
como patrón de proteína. Las actividades carbohidrasa se midieron
como un incremento en los equivalentes de grupos reductores en
tampón acetato, pH 4.5 a 40ºC (Johnston, D.B., et al., J Food
Biochem, 22: 301-319 (1998)); las unidades de
actividad fueron definidas como el cambio en los grupos reductores,
equivalente a un incremento de 1 \mug de azúcar por min. Los
ensayos de celulasa y \beta-glucanasa usaron
carboximetil celulosa y \beta-glucano de cebada
como sustratos, respectivamente, y glucosa como azúcar patrón. Los
ensayos de xilanasa y hemicelulasa usaron xilano y goma de fibra de
maíz (Doner, L.W., et al., Cereal Chem., 75:
408-411 (1998)) como sustratos, respectivamente, y
xilosa como azúcar patrón. Los ensayos de amilasa y almidón nativo
usaron almidón de maíz gelatinizado y no gelatinizado como sustrato
y maltosa como azúcar patrón. La actividad proteasa se realizó
según el método modificado de Anson (Abe, M., et al., Agric.
Biol. Chem., 41(5): 893-899 (1977)); una
unidad de proteasa se define como la \DeltaA_{280} de 0,001 por
minuto (paso de luz de 1 cm) a pH 4,5 y 40ºC, medida como productos
solubles TCA usando hemoglobina como sustrato en presencia de
cisterna 10 mM.
Procedimientos de molienda húmeda: La molienda
húmeda convencional del maíz se realizó usando el procedimiento de
laboratorio de molienda húmeda del maíz para 100 g (Eckhoff, S. R.,
et al., Cereal Chem., 73: 54-57 (1996)). El
procedimiento modificado de maceración en dos etapas se realizó como
sigue: las muestras de maíz (100 g) se introdujeron en matrazs
Erlenmeyer de 500 ml con 180 ml de agua o productos químicos de
maceración (SO_{2} 0,2% + ácido láctico 0,55%). El maíz se
impregnó durante 3 horas a 48ºC. El agua se escurrió en un cilindro
graduado de 250 ml, se midió este volumen de agua no absorbida y
después se secó para determinar los sólidos totales usando el
procedimiento de secado de dos etapas AACC 2000b (American
Association of Cereal Chemists (AACC), 2000b, Approved Methods of
the AACC, 8th ed., Method 44-18, The Association: St
Paul, MN). Después se molió el maíz en un volumen igual de agua
(v/v) usando una mezcladora tipo Waring. La pasta se transfirió a
un matraz Erlenmeyer y se añadieron los reactivos adicionales
(enzimas, tampón, metabisulfito sódico, ácido láctico). Después se
incubó el matraz a 48ºC (agua del baño) durante 1-4
h, mezclando a intervalos de 30 min. Tras la incubación, la pasta
se molió con el procedimiento convencional de laboratorio para
molienda húmeda (Eckhoff, S. R., et al., Cereal Chem., 73:
54-57 (1996)).
Condiciones de incubación: La maceración normal
se llevó a cabo usando el procedimiento de 100 g sin modificar
(Eckhoff, S. R., et al., Cereal Chem.,
73:54-57 (1996)) usando 2000 ppm de dióxido de
azufre y ácido láctico 0,55% y maceración durante 24 h a 52ºC antes
del molido. Los enzimas y productos químicos se añadieron
directamente a la solución de maceración. Los tratamientos
enzimáticos se realizaron añadiendo dióxido de azufre y ácido
láctico, sólo con ácido láctico, y sin productos químicos. También
se ensayaron tiempos de maceración distintos de 24 h.
La maceración normal en dos etapas se realizó
usando 2000 ppm de dióxido de azufre y ácido láctico 0,55% añadido
durante la etapa inicial de impregnación (3 h). No se añadieron
productos químicos adicionales durante el segundo procedimiento de
incubación.
Las muestras tratadas con enzima usando el
procedimiento de dos etapas se impregnaron con agua (sin productos
químicos de maceración, enzimas o tampón) para la primera etapa del
proceso. Después de la primera trituración se añadieron 10 ml de
tampón acetato sódico 1 M, pH 4,0 para controlar el pH (el pH final
fue 4-4,5). Se añadió metabisulfito sódico a las
muestras indicadas para dar una concentración equivalente de dióxido
de azufre de 200, 600 o 2000 ppm. Los enzimas se añadieron como
polvo seco (bromelina, 250, 500 o 1000 mg; pepsina, 250 mg;
proteinasa ácida de Aspergillus tipo XIII, 250 mg) o bien
como líquido (celulasas, xilanasas o
\beta-glucanasa, 5 ml). Las muestras control
(tampón) y las tratadas sólo con dióxido de azufre se hicieron de
forma idéntica pero sin adición de enzima.
Análisis de proteínas del almidón: el contenido
de proteína del almidón fue determinado por un laboratorio
analítico comercial (Silliker Laboratories Group, Chicago Heights,
IL) usando el método AOAC 991.20 (AOAC Official Methods of
Analysis, 1990, revised March 1996, Nitrogen (Total) in milk, method
991.20, AOAC 73, 849).
Resultados del procedimiento convencional (una
etapa) con tratamientos enzimáticos: los experimentos iniciales
pretendían reproducir los resultados publicados para los enzimas
añadidos durante la maceración convencional (Steinke, J. D., and L.
A. Johnson, Cereal Chem., 68: 7-12 (1991); Caransa,
A., et al., Starch/Starke, 40: 409-411
(1988); Hassanean, A., and A. Abdel-Wahed,
Starch/Starke, 38: 417 (1986); Moheno-Perez, J. A.,
et al., Starch, 51: 16-20 (1999)) usando el
altamente reproducible procedimiento de laboratorio para 100 g de
molienda húmeda del maíz. Los tratamientos experimentales
consistieron en la adición de enzimas con la siguiente: (a) adición
de dióxido de azufre y ácido láctico, (b) adición de ácido láctico
sin dióxido de azufre y (c) sin adición de dióxido de azufre ni
ácido láctico. Los experimentos de maceración de 24 h no mostraron
mejora en el rendimiento de almidón con la adición de cualquiera de
las combinaciones de enzimas ensayados. En varias muestras se
observó una pequeña pero estadísticamente significativa disminución
de los rendimientos de almidón comparados con los controles
tamponados.
Resultados del procedimiento de dos etapas con
glicosidasas: Cuando se usó el procedimiento modificado de dos
etapas (3 h de impregnación de semillas intactas seguido de
trituración gruesa y 3 h de incubación de la pasta triturada) con
preparaciones enzimáticas similares a las usadas en el procedimiento
convencional (una etapa), se observaron tanto incrementos
significativos como disminuciones de los rendimientos de almidón.
Las mezclas de preparaciones comerciales que mostraron disminución
de los rendimientos de almidón se siguieron ensayando para
identificar el componente específico responsable. La Figura 5
muestra los rendimientos de las fracciones para tres componentes
individuales (\beta-glucanasa, celulasas o
xilanasas). Aunque las tres mostraron una reducción significativa
en los rendimientos de almidón en comparación con el rendimiento de
almidón del tampón control, se identificó claramente la preparación
de \beta-glucanasa como el componente principal
responsable de la amplia reducción de los rendimientos de almidón.
Los rendimientos de gluten también fueron elevados para la
preparación de \beta-glucanasa, indicando
potencialmente una pérdida de almidón a través de la hidrólisis
enzimática hacia la fracción de gluten. Ninguna de las carbohidrasas
ensayadas fue útil para incrementar los rendimientos de
almidón.
Resultados del procedimiento de dos etapas con
proteasas: se ensayaron tres proteasas diferentes (pepsina,
proteasa ácida o bromelina) individualmente y en combinación con
otras hidrolasas (celulasas, xilanasas y
\beta-glucanasa) usando el procedimiento de dos
etapas. Los rendimientos de las fracciones para las proteasas sin
enzimas adicionales se muestran en la Figura 6. La pepsina y la
proteasa ácida mostraron una mejora significativa en los
rendimientos de almidón frente al tampón control; sin embargo, la
bromelina mostró la mejora más grande. También se produjo una
disminución significativa en el rendimiento total de fibra en las
tres proteasas ensayadas comparadas con el rendimiento total de
fibra del tampón control. No hubo ninguna diferencia significativa
en el rendimiento de fibra entre el control químico y la muestra
tratada con bromelina. Las mezclas de las proteasas con otras
hidrolasas no mostraron una mejora adicional en los rendimientos de
almidón frente al uso de la proteasa sola; sin embargo, se
observaron cambios en las fracciones de fibra y/o gluten.
\global\parskip0.860000\baselineskip
Resultados que muestran el efecto de la
concentración de bromelina: usando el procedimiento de dos etapas
se determinaron los efectos de la concentración de bromelina sobre
la recuperación de almidón. Se evaluaron tres niveles del enzima
(250, 500 y 1000 mg por 100 g de maíz). Los rendimientos de las
fracciones se muestran en la Figura 7. Todos los niveles ensayados
mostraron mejoras en los rendimientos de almidón por encima de los
controles tampón. Se observaron diferencias significativas entre los
tratamientos de 250 y 500 mg. Sólo hubo un replicado para la
muestra de 1000 mg.
Resultados del transcurso del tiempo del
tratamiento con bromelina: usando el procedimiento de dos etapas y
el nivel de aplicación de 500 mg de bromelina se realizó un perfil a
lo largo del tiempo para el tratamiento. Las muestras se
impregnaron durante 3 h en agua (1ª etapa del procedimiento
modificado), le siguió el triturado grueso y el tratamiento
enzimático durante 1, 2, 3 o 4 horas antes del molido (2ª etapa del
procedimiento modificado). Los rendimientos por fracción se
muestran en la Figura 8. Los resultados muestran claramente un
incremento progresivo en los rendimientos de almidón y un descenso
general de la fibra total al aumentar los tiempos de
incubación.
Resultados que muestran el efecto del dióxido de
azufre en los tratamientos enzimáticos: el dióxido de azufre
(SO_{2}) se usa en las plantas de molienda húmeda de maíz para
controlar el crecimiento microbiano. Para determinar si se pueden
añadir niveles de dióxido de azufre (200-600 ppm)
inferiores a los usados comercialmente (1000-2000
ppm) para inhibir el crecimiento microbiano sin afectar a la
actividad enzimática durante el proceso de molido modificado, se
procesaron muestras con y sin dióxido de azufre añadido durante la
etapa de incubación. Los resultados se muestran en la Figura 9. Las
muestras tratadas solamente con 600 ppm de dióxido de azufre
mostraron un pequeño incremento en los rendimientos de almidón
comparadas con los controles tampón; sin embargo, el rendimiento
total de fibra fue significativamente elevado y los rendimientos de
almidón fueron significativamente menores que para las muestras
tratadas con bromelina y para los controles químicos. Las muestras
que fueron tratadas sólo con bromelina mostraron rendimientos de
almidón mejorados en comparación con los rendimientos de almidón de
los controles tampón, igual que en los experimentos previos. La
adición de bromelina y dióxido de azufre mostró otra mejora en los
rendimientos de almidón
comparado con los controles al nivel de 600 ppm; sin embargo, al nivel de 200 ppm no hubo mejora adicional.
comparado con los controles al nivel de 600 ppm; sin embargo, al nivel de 200 ppm no hubo mejora adicional.
Resultados referentes a proteína en almidón: Se
determinaron los contenidos residuales de proteína en las muestras
de almidón obtenidas de los estudios de molido para muestras
tratadas con bromelina y con dióxido de azufre. La Figura 3 muestra
los resultados de los rendimientos de almidón así como el porcentaje
de proteína determinado para cada fracción de almidón. El contenido
de proteína de las muestras tratadas con dióxido de azufre y con
enzimas fue significativamente más bajo que en los controles tampón
(sin enzima ni SO_{2}). Las diferencias entre las muestras
individuales, sin embargo, no fueron suficientemente significativas
para sacar conclusiones adicionales acerca de la efectividad de la
eliminación de proteínas usando tratamientos de proteasa. El efecto
combinado del bajo nivel de dióxido de azufre más la aplicación del
enzima proteasa parece ser más eficaz para reducir el contenido de
proteína final del almidón producido que cualquiera de los
tratamiento solos.
Resultados del procedimiento a escala 10X: La
molienda húmeda convencional del maíz se llevó a cabo usando el
procedimiento de molienda húmeda del maíz a escala de laboratorio
para 1 kg (Eckhoff, S. R., et al., Cereal Chem.,
69:191-197 (1993)). El procedimiento de molienda
húmeda se llevó a cabo usando un procedimiento a escala 10x del
procedimiento de molienda húmedo modificado en dos etapas para 100
g. Las muestras de maíz (1000 g) se impregnaron en 2 L de agua a
55ºC durante 3 horas. El agua se escurrió y el maíz se mezcló usando
1,5 L de agua limpia. La pasta se transfirió a un cubo de acero
inoxidable y se añadió tampón (concentración final, tampón acetato
0,05 M, pH 5,0) y 5 g de bromelina. La pasta se incubó durante 3
horas a 48ºC en un baño de agua y se mezcló continuamente usando un
agitador mecánico. Las separaciones y el procesado posteriores se
realizaron según Eckhoff, S. R., et al., Cereal Chem.,
69:191-197 (1993).
Los rendimientos por fracción del procedimiento
de Kg usando bromelina mostraron un incremento significativo de la
recuperación de almidón y gluten comparados con los rendimientos de
las muestras de la molienda convencional. Los sólidos secos del
agua de impregnación de los tratamientos con bromelina se redujeron
enormemente en comparación con los rendimientos de la molienda
convencional.
Para superar el problema de la penetración
enzimática en el interior del endospermo intacto, nuestro enfoque
fue usar un sistema de maceración de dos etapas. La primera etapa es
hidratar la semilla de maíz en agua (sin añadir productos químicos
de maceración) durante varias horas (p. ej. 3 h) de forma que el
germen se hidrate completamente y se vuelva suficientemente
flexible para no romperse cuando el maíz se tritura en grueso. La
segunda parte de nuestro sistema de maceración implica tratar con
enzimas (p. ej. proteasa) la pasta de maíz triturado grueso. Tras
el tratamiento el maíz se molerá usando los métodos normales de
molienda húmeda del maíz. Este enfoque elimina las barreras de
difusión y permite que los enzimas penetren en el endospermo del
maíz y reaccionen con los sustratos proteicos.
Las preparaciones enzimáticas que dieron las
mejoras más significativas en los rendimientos de almidón usando el
procedimiento de dos etapas fueron las proteasas. Las proteasas
seleccionadas para el ensayo se escogieron basándose en su pH
óptimo, su estabilidad a la temperatura y el potencial del enzima
para retener la actividad en presencia de SO_{2} (cisteín
proteasas). La retención de la actividad en presencia de dióxido de
azufre se consideró muy importante ya que es muy probable que aún
sea deseable la adición de bajos niveles de SO_{2} para prevenir
la contaminación microbiana. Otras proteasas podrían ser útiles en
ausencia de dióxido de azufre o con el uso de otro compuesto
antimicrobiano.
Se observó que las proteasas solas eran tan o
más eficaces que usadas en mezclas con otras hidrolasas (Figura 6).
Esto fue algo sorprendente, ya que se creía que los enzimas
degradantes de la hemicelulosa ayudarían a liberar el almidón
adherido de la fibra. Los rendimientos de almidón de las muestras
tratadas con bromelina fueron significativamente superiores a los
rendimientos de las muestras tratadas con pepsina o proteasa ácida.
Probablemente esto se debió, al menos en parte, a las condiciones de
pH no óptimas usadas para la pepsina y la proteasa ácida. Fue
necesario usar un pH de compromiso (donde todos fueran activos pero
no necesariamente de forma óptima) para evitar tener un número
excesivo de muestras control.
La bromelina fue seleccionada para estudios
adicionales para determinar si los rendimientos se podrían mejorar
más y para determinar la cantidad mínima de enzima necesaria para
mantener el rendimiento de almidón. Se ensayaron tres niveles
diferentes de bromelina (250, 500 y 1000 mg usando 3 h de
impregnación y 3 h de incubación) y 4 tiempos de incubación (1, 2,
3 y 4 h usando 500 mg de bromelina y 3 h de impregnación) (Figuras 7
y 8). La adición de 250 mg de bromelina dio rendimientos de almidón
superiores a los rendimientos de almidón dados por la pepsina o la
proteasa ácida ensayadas previamente (Figura 6), pero fue varios
porcentajes inferior a los rendimientos de almidón de las muestras
de control químico. El rendimiento de almidón fue superior que el
de las muestras tratadas con 500 mg incubadas durante 2 h o menos,
pero no tras incubaciones más largas. Las incubaciones superiores a
3 h no se ensayaron usando el tratamiento de 250 mg; sin embargo, es
probable que los rendimientos hubieran alcanzado eventualmente a
los rendimientos del control químico suponiendo que el enzima no se
hubiera inactivado.
Se observó una diferencia entre los rendimientos
de almidón para las muestras tratadas con 500 y 1000 mg de
bromelina, pero no se pudo asignar significación estadística (sólo
un conjunto de datos para la muestra tratada con 1000 mg). No se
observó que los rendimientos de fibra total fueran
significativamente diferentes entre las muestras tratadas con 500 y
1000 mg de bromelina. Aunque no se ensayó, es improbable que se
puedan hacer más progresos añadiendo bromelina adicional.
El análisis a lo largo del tiempo (Figura 8)
mostró rendimientos de almidón mayores al incrementar el tiempo de
incubación; sin embargo, el cambio por unidad de tiempo disminuye
continuamente, indicando un valor máximo para los rendimientos de
almidón. Cuando se representaron los datos en un gráfico XY y se
calculó la ecuación del mejor ajuste de 2º orden, el máximo fue el
66,3 por ciento, que es aproximadamente igual a los rendimientos
del control químico.
La serie final de experimentos se realizó para
determinar los efectos de la adición de dióxido de azufre a bajo
nivel en el proceso durante la etapa de incubación. La contaminación
microbiana podría ser un problema potencial durante la etapa de
incubación del procesado. La adición de dióxido de azufre a niveles
de 200-600 ppm (dependiendo del pH) podría ser
eficaz para la inhibición del crecimiento microbiano (Block, R. L.,
Antimicrobials in Food Sanitation and Preservation, pages
814-815, IN: Disinfection, Sterilization, and
Preservation, 4^{th} ed., 1995, Lea & Febiger, Philadelphia;
Lewis, R.J., Food Additives Handbook, 1989, pages
412-413, Van Nostrand Reinhold, New York). Como se
esperaba, observamos que la adición de dióxido de azufre (sin enzima
o ácido láctico) aporta alguna mejora a los rendimientos de almidón
frente a los controles (sólo tampón) (Figura 9 y 10). Todas las
muestras tratadas enzimáticamente mostraron grandes mejoras en los
rendimientos de almidón frente a las muestras tratadas sólo con
dióxido de azufre. La combinación de dióxido de azufre (600 ppm) con
la adición de enzima mostró las mejoras mayores y en promedio fue
mejor que las muestras de control químico. Las determinaciones de
proteína se realizaron en las muestras de almidón obtenidas (Figura
10) para determinar si los tratamientos enzimáticos eliminaban
adecuadamente la proteína del almidón. La muestra control de almidón
(sin dióxido de azufre ni enzima) presentó un contenido promedio de
proteína del 0,54% y valores individuales tan elevados como 0,7%,
bastante por encima del nivel de aceptación del 0,3%. Las muestras
de almidón tratadas con enzima estuvieron todas por debajo del
0,28% y fueron tan bajas como 0,19% para el tratamiento combinado
de dióxido de azufre con bromelina. Resultaba claro a partir de los
datos que la adición de dióxido de azufre a la incubación
enzimática no tenía un efecto negativo en la actividad enzimática
pero aportaba una ligera mejora frente al uso del enzima solo.
Las proteasas adicionales que se podrían usar en
este proceso necesitarían tener actividad y estabilidad bajo las
condiciones específicas de uso. Estas proteasas también necesitarían
hidrolizar las proteínas que rodean los gránulos de almidón. Tales
enzimas tendrían especificidad frente a enlaces peptídicos en
glutelinas, zeína y otras proteínas menores del endospermo del
maíz. Después, los péptidos resultantes se separarían durante el
procesado. Las condiciones de reacción necesitarían tener en cuenta
la concentración enzimática, el pH, la temperatura, la tolerancia
al dióxido de azufre (si se usa) y otros factores específicos del
enzima, como la necesidad de mineral o cofactor. Se pueden hacer
más mejoras en la recuperación de almidón a través de la selección
de otros enzimas.
Nuestro proceso presenta un número de beneficios
potenciales a los que no se ha dirigido específicamente la presente
investigación, pero son consecuencias probables de su aplicación:
(1) Los tiempos de maceración más cortos podrían reducir el coste
energético y la inversión de capital en los tanques de maceración.
(2) Los tiempos de procesado más cortos podrían incrementar la
capacidad de la planta. (3) El proceso podría usar potencialmente
tanto granos rotos como enteros, triturándolos y añadiéndolos
directamente al tanque de incubación o mediante impregnación
durante un tiempo reducido (en relación a las semillas intactas)
antes de añadirlos a la corriente de molienda. Esto tendría como
resultado un incremento de la producción de producto primario
(almidón) para la misma entrada de maíz. (4) El agua de impregnación
del proceso modificado contiene relativamente pocos sólidos
disueltos en comparación con el agua de la maceración ligera
convencional (aproximadamente un 90% menos). Esta agua podría ser
potencialmente reciclada mediante el uso de membranas de filtración
que eliminaran la necesidad y el gasto en evaporadores.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Un método para la obtención de almidón a
partir de maíz, que comprende la impregnación de las semillas de
maíz en agua durante 1 a 6 horas para producir semillas de maíz
impregnadas, la trituración de dichas semillas de maíz impregnadas
para producir una pasta de maíz triturado y la incubación de dicha
pasta de maíz triturado con proteasa, utilizando dicho método menos
de 600 ppm de SO_{2}.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha impregnación dura de 2 a 4 horas.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha impregnación dura aproximadamente 3 horas.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha impregnación se realiza a 45ºC hasta 60ºC.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha impregnación se realiza a 45ºC hasta 50ºC.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha impregnación se realiza a aproximadamente 48ºC.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha incubación dura de 0,5 a 6 horas.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha incubación dura de 1 a 4 horas.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha incubación dura aproximadamente 3 horas.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha incubación se realiza a 20ºC hasta 70ºC.
11. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha incubación se realiza a 40ºC hasta 55ºC.
12. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha incubación se realiza a aproximadamente 48ºC.
13. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho método utiliza menos de 100 ppm de SO_{2}.
14. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho método utiliza aproximadamente 0 ppm de SO_{2}.
15. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha proteasa es bromelina.
16. Método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de dicha proteasa es aproximadamente 1000 mg por
100 g de maíz.
17. Método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de dicha proteasa es aproximadamente 500 mg por
100 g de maíz.
18. Método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de dicha proteasa es aproximadamente 250 mg por
100 g de maíz.
19. Método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de dicha proteasa es aproximadamente 100 mg por
100 g de maíz.
20. Método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de dicha proteasa es aproximadamente 50 mg por 100
g de maíz.
21. Método según la reivindicación 1 que
comprende además la trituración y desgerminación de dicha pasta de
maíz triturado tras la incubación mencionada con dicha proteasa.
22. Método según la reivindicación 1 que
consiste esencialmente en la impregnación de semillas de maíz en
agua durante 1 a 6 horas para producir semillas de maíz impregnadas,
la trituración de dichas semillas de maíz impregnadas para producir
una pasta de maíz triturado, y la incubación de dicha pasta de maíz
triturado con proteasa.
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