BRPI0017067B1

BRPI0017067B1 - inibidor de divisão de célula, desidrogenase, método para a produção de um inibidor de divisão de célula e composto

Info

Publication number: BRPI0017067B1
Application number: BRPI0017067A
Authority: BR
Inventors: Kazumi Akazawa; Kaneo Kanoh; Hiroshi Kanzaki; Teruhiko Nitoda; Satohiro Yanagisawa
Original assignee: Beyondspring Pharmaceuticals Inc; Dalian Wanchun Biotechnology Co Ltd; Nereus Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-01-18
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2019-08-27
Also published as: JP4810043B2; IL150430A; AU782917C; US6972289B1; AU7451100A; NZ519989A; CA2403790C; KR20020082484A; AU2005242133B2; IL150430A0; AU2005242133A1; WO2001053290A1; MXPA02006826A; BR0017067A; EP1264831A1; ZA200206576B; US20060079534A1; BRPI0017067B8; KR100831400B1; EP1264831A4

Abstract

"inibidor de divisão de célula, desidrogenase, método para a produção de um inibidor de divisão de célula e composto". a presente invenção se refere a um inibidor de divisão de célula o qual compreende diversas dehidrodiceto piperazinas tais como dehidrofenilaistina, ou análogos da mesma como o ingrediente ativo, e uma desidrogenase e a um método para a produção do mesmo inibidor.

Description

INIBIDOR DE DIVISÃO DE CÉLULA, DESIDROGENASE,

MÉTODO PARA A

PRODUÇÃO DE UM INIBIDOR DE DIVISÃO DE CÉLULA

E COMPOSTO

Campo da Técnica

A presente invenção refere-se a um inibidor de e um agente anti-tumor, e a um método de produção do mesmo.

Antecedentes da

Invenção crescimento e a diferenciação de células que constituem o corpo humano são estritamente controlados de modo a

manter a homeostase. As células se dividem ou proliferam ao repetir um ciclo celular que consiste em um determinado processo gue compreende o período Μ, o período

G1 o período S e o período

G2. Um defeito no mecanismo de controle do referido ciclo celular resulta no desenvolvimento de câncer e nas doenças imunes.

Ultimamente, os mecanismos de controle de ciclo celular estão se esclarecendo a nível molecular, e é conhecido como aquela substância que controla o ciclo celular que possivelmente pode ser usada como um agente anti-tumor ou um

agente imunosupressor. Recentemente, em se tratando de um agente anti-tumor ou de um composto principal do mesmo, a atenção está /9?

P o o centrada em uma substância, tal como pacritaxel, vincristina ou vimblastina, que inibem a função da tubulina que é uma das proteínas citoesqueléticas que desempenha um papel importante na precisa distribuição de um gene replicado em uma célula filha em um estágio de divisão de célula.

Fukushima et al., observou que a albonursina apresenta atividade anti-tumor e uma atividade anti-bacteriana, (Fukushima et al. ,

J.

Antibiotics , Vol. 26, enquanto Kobayashi et al., observou que a albonursina atua para

2/40 masculino (Kobayashi et al. , A Summary of the

Chemistry of Natural Products, P51, 1989) .

Symposium on the

Adicionalmente,

Kanzaki et al. , observou que tetradehidrociclo (Phe-Phe) exibe atividade inibitória de divisão de embriões de ouriços do mar (A

Summary of the Symposium of the Society for Actinomycetes

Japan,

Kanoh et al., observou que, bactérias filamentosas,

Aspergillus ustus NSC-F037 e Aspergillus ustus NSC-F038, que são

isoladas a partir do solo no município de Kanagawa, produz uma nova substância anti-tumor, fenilaistina, e determinou a estrutura da referida substância. As moléculas de fenilaistina são dotadas de um átomo de carbono quiral, e em resultado de exame completo, Kanoh et al., descobriu que a fenilaistina produzida pela bactéria acima é uma mistura fenilaistina e (+)-fenilaistina, e a atividade anti-tumor de (-)fenilaistina é aproximadamente de a 100.......,.v.e.ze-s..-ma.is.____forte __do (Pedido de Patente Japonesa mantido aberto (kokai) No. 10-130266, Kanoh et al., Bioorganic &

Medicinal Chemistry Letters, Vol. 7, NO.

22, pp. 2847

2852,

1997; Kanoh et al. , Bioscience Biotechnology Biochemistry, vol.

63, No. 6, pp. 1130 - 1133, 1999) . Adicionalmente, os mesmos observaram que a (-)- fenilaistina inibe a polimerização da tubulina (Kanoh et al. , The Journal of Antibiotics, Vol. 52, No.

pp. 134 - 141, 1999). Adicionalmente, Kanoh et al., examinou o efeito anti-tumor da (-)- fenilaistina, ao usar células cancerosas transplantadas em modelo animal, e mostrou que a (-)fenilaistina apresenta determinado grau de atividade anti-tumor (Kanoh et al., Bioscience Biotechnology Biochemistry, Vol. 63,

No. 6, pp. 1130 - 1133, 1999). A partir da posição clínica,

3/40 entretanto, forte do que um agente dotado de uma atividade anti-tumor mais a (-)-fenilaistina é desejável.

Descrição da

Invenção inibidor de

O objetivo da presente invenção é proporcionar um divisão de célula dotado de uma atividade inibitória de ciclo celular mais forte, em particular atividade anti-tumor, e um método de produção da enzimas que usam inibidores.

Em resultado da análise realizada pela presente invenção para se alcançar o objetivo acima, observou-se que

diversas dehidrodicetopiperazinas tais como dehidrofenilaistina ou afinidades da mesma apresentam atividade inibitória de ciclo presente invenção.

Quer dizer, a presente invenção compreende cada uma das seguintes invenções.

(1) um inibidor de divisão de célula que compreende, como um ingrediente ativo, um composto de fórmula (I) ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

na qual:

cada

um de Χχ (I) oxigênio ou enxofre;

Y₃ é oxigênio, enxofre, -NR₃- ou -CR₃iR₃₂-;

oxigênio, enxofre, -NR₄- ou -CR₄₁R4₂-;

Rio é halogênio,

| 4/40 ···

alcóxi, aralquila, hidroxila, substituinte(s) , e uma parte da cadeia de carbono de R₁₀ pode ser ramificada ou ciclizada, ou pode compreender um heteroátomo;

lquila,^C₂-25^ alquenila, ilcóxi, aralquila, hidroxila, podem ser substituídos por outro(s) substituinte(s) , e uma parte da cadeia de carbono de R₂q pode ser ramificada ou ciclizada, ou pode compreender um heteroátomo; cada

çjj-uzrn /χζο um de R₃ e R₄ é independentemente hidrogênio, halogênio, Οχ_₂5 alquila, C2-25 alquenila, C2-25 alquinila, Ci-₂₅ alcóxi, aralquila, hidroxila, amino, nitro ou arila, que podem ser substituídos por outro(s) substituinte(s), e uma parte da cadeia de carbono pode ser ramificada ou ciclizada, ou pode compreender um heteroátomo;

cada um de independentemente hidrogênio, halogênio,

Cx-23 alquila, C₂-₂5 alquenila, C2-25 alquinila, C1-25 alcóxi, aralquila, hidroxila, amino, nitro ou arila, que podem ser substituídos por outro(s) substituinte(s), e uma parte da cadeia de carbono pode ou pode compreender um heteroátomo;

Rio e qualquer um de ser ramificada ou

R₃, R₃₁ e R₃₂ pode ciclizada, formar um anel;

R20 θ qualquer um de

R₄, R₄i e R₄₂ pode formar um anel ;

cada (B2) representa independentemente uma ligação simples carbono-carbono ou uma ligação dupla carbonocarbono, onde pelo menos um representa uma ligação dupla carbonocarbono com configuração E ou Z;

pelo menos um dos grupos acima pode ser dotado de um grupo de proteção capaz de decompor-se in vivo, exceto no caso

5/40

onde cada X₃ e X₂ é oxigênio, cada de Y₃ e Y₄ é —NH-, R_xo é benzila, cada um de (Bl) e (B2) é uma ligação dupla de carbonocarbono, e R₂₀ é isobutila ou benzila, e no caso onde cada de X_x e

X₂ é oxigênio, cada um de Y₃ e Y₄ é -NH-, R₁₀ é benzila, (Bl) é uma ligação simples de carbono-carbono, (B2) is a uma ligação dupla Z de carbono-carbono, e R₂₀ é um grupo mostrado na seguinte fórmula

na qual * representa uma posição de ligação.

acordo com o cada um de (Bl) e (B2) é uma ligação dupla carbono-carbono.

(3) O inibidor celular de acordo com o item 1 ou 2 acima onde, na fórmula (I), cada um de

X₃ e X₂ oxigênio, Y₃ é

nr₃-, e Y₄ é —NR₄—.

(4) O inibidor de divisão de célula de acordo com o item acima onde, na fórmula (I), cada um de Y₃ e Y₄ é -NH-.

(5) Inibidor de divisão de célula que compreende, como ingrediente ativo, um composto de fórmula do mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável (II) ou a forma E do mesmo:

6/40 ·♦· • « ( · <·

na qual:

Ri é hidrogênio, halogênio, Οχ_25 alquila,

C2-25 alquenila,

C2-25 alquinila, Ci_₂5 alcóxi, aralquila, hidroxila, amino, nitro ou e uma parte da cadeia de carbono de R_x pode ser ramificada ou ciclizada, ou pode compreender um heteroátomo, e adicionalmente

RI pode compreender um átomo ou grupo, ou pelo menos 5 átomos ou grupos idênticos ou diferentes, e os átomos ou grupos podem mutuamente formar um anel;

R₂ é hidrogênio, halogênio, Ci-₂s alquila, C2-25 alquenila, C2-25 amino, nitro ou alquinila, C^s alcóxi, aralquila, hidroxila, arila, gue podem ser substituídos por outro(s) e uma parte da cadeia de carbono de R₂ pode ser ramificada ou ciclizada, ou pode compreender um heteroátomo;

cada um de alquila, C2-25 alquenila,

R3 e R₄ é hidrogênio, halogênio, C1-25

C2-25 alquinila, Cj-25 alcóxi, aralquila, hidroxila, amino, nitro ou arila, que podem ser outro(s) substituinte(s), e uma parte da cadeia ser ramificada ou ciclizada, ou pode compreender

Rs alquenila, C2-25 amino, nitro ou substituídos por de carbono pode um heteroátomo;

é hidrogênio, halogênio, C_v-₂₅ alquila, C2-25 alquinila, C!_₂₅ alcóxi, aralquila, hidroxila, arila, que podem ser substituídos por outro(s) e uma parte da ramificada ou ciclizada, ou pode

Re é hidrogênio, alquenila, C2-25 amino, nitro ou substituinte(s) , cadeia de carbono de R₅ pode ser compreender um heteroátomo;

halogênio, Ci~₂₅ alquila, C₂_₂5 alquinila, Ci_₂₅ alcóxi, aralquila, hidroxila, arila, que podem ser substituídos por outro(s) e uma parte da cadeia de carbono de R₆ pode ser cada um de R₇ e R_g é hidrogênio, halogênio, Ci-₂5 ramificada ou ciclizada, ou pode compreender um heteroátomo;

7/40

alquila, C₂.₂₅ alquenila, C2-25 alquinila, Ci_₂₅ alcóxi, aralquila,

hidroxila, amino, nitro ou arila, que podem ser substituídos por outro(s) substituinte(s) , e uma parte da cadeia de carbono pode ser ramificada ou ciclizada, ou pode compreender um heteroátomo;

R₂ e R₃ podem formar um anel;

R₄ e qualquer um de R₅, R₆, R₇ e R₈ pode formar um anel;

(B2) representa uma ligação simples carbono-carbono ou ligação dupla carbono-carbono; pelo menos um dos grupos acima pode ser dotado de um grupo de proteção capaz de se decompor in vivo.

(6) 0 inibidor de

	item 5 acima onde, na fórmula
15	carbono-carbono. (7) O	inibidor de

item 5 acima onde, na fórmula divisão de célula de acordo com o (II) , (B2) é uma ligação dupla de divisão de célula de acordo com o (II), pelo menos um de R₇ e R₈ é

1, l-dimetil-2-propenila.

O inibidor de divisão de célula de acordo com

qualquer um dos itens de 1 a 7 acima onde o mesmo é um agente anti-tumor.

(9)

Uma desidrogenase que é dotada de uma atividade para converter um composto representado pela fórmula onde pelo menos carbono-carbono, ligação simples um de (Bl) e (B2) é ou pela fórmula (II) carbono-carbono em ligação(ções) dupla(s) (10) Uma cujo peso molecular é (11) Uma uma ligação acima onde um composto carbono-carbono é(são) carbono-carbono.

desidrogenase de acordo

700 - 800 kDa.

desidrogenase de acordo simples de (B2) é onde substituída(s) uma por com o item 9 acima com o item 9 ou 10

8/40 acima que é produzida por Streptomyces albulus.

(12) Método para a produção de inibidor de divisão de célula de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 8 acima, que compreende usar, como um substrato, um composto representado pela seguinte fórmula (I) onde pelo menos um de (Bl) e (B2) é uma ligação simples carbono-carbono, ou um composto representado pela fórmula (II) onde (B2) é uma ligação simples carbono-carbono, e converter a referida ligação simples carbono-carbono em uma ligação dupla carbono-carbono pelo uso de uma célula, extrato livre de célula ou solução enzimática que contém a desidrogenase de acordo com qualquer um dos itens 9 a 11 acima.

(13) Método de acordo com o item 12 acima onde a desidrogenase do item 11 acima é usada.

(14) Composto de fórmula (II) ou a E forma do mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

na qual

Ri é hidrogênio, halogênio, Ci_₂₅ alquila, C₂_₂₅alquenila, C₂_₂₅ alquinila, C^s alcóxi, aralquila, hidroxila, amino, nitro ou arila, que podem ser substituídos por outros substituente (s) , e uma parte da cadeia de carbono de Rj. pode ser adicionalmente Ri pode compreender um átomo ou grupo, ou no máximo 5 átomos ou grupos idênticos ou diferentes, e os átomos ou ramificada ou ciclizada ou pode compreender um heteroátomo e

9/40

outros substituinte(s), grupos podem mutuamente formar um anel;

R₂ é hidrogênio, halogênio, C1-25 alquila, C2-25 alquenila, C2-25 amino, nitro ou substituinte(s) , alquinila, arila, que e uma parte ramificada ou ciclizada, cada um de alquila, C2-25 alquenila, hidroxila, amino, nitro ramificada ou ciclizada,

Rs alquenila, C2-25 amino, nitro ou substituinte(s),

Ci_25 alcóxi, aralquila, podem ser substituídos da cadeia de carbono de hidroxila, com outros

R₂ pode ser ou pode compreender um heteroátomo;

R₃ e R₄ é hidrogênio, halogênio, Ci_₂5

C2-25 alquinila, C1-25 alcóxi, aralquila, ou arila, que podem ser substituídos e uma parte da cadeia de carbono pode ou pode é hidrogênio, alquinila, arila, que e uma parte

C1-25 com ser compreender um heteroátomo;

halogênio, Ci-₂₅ alquila, alcóxi, aralquila, podem ser substituídos da cadeia de carbono de

C2-25 hidroxila, com outros

R_s pode ser ramificada ou ciclizada, ou pode compreender um heteroátomo;

Re é hidrogênio, halogênio, C1-25 alquila, C2-25 alquenila, C2-25 amino, nitro ou substituinte(s), alquinila, arila, que e uma parte

Cl-25 alcóxi, aralquila, podem ser substituídos da cadeia de carbono de hidroxila, com outros

R₆ pode ser ramificada ou ciclizada, ou pode compreender um heteroátomo;

cada um de R₇ e R₈ halogênio, Ci_₂s alquila, C2-25 alcóxi, aralquila, hidroxila, ser substituídos com outros cadeia de carbono pode ser anel;

R₂ r₄ é independentemente hidrogênio, alquenila, C₂_₂5 alquinila, Cj_₂5 amino, nitro ou substituinte(s), arila, que podem e uma parte da ramificada ou ciclizada, ou pode e R₃ podem formar um anel;

compreender um heteroátomo;

10/40 (Β2) representa uma ligação simples de carbonocarbono ou uma ligação dupla de carbono-carbono;

pelo menos um dos grupos acima pode ser dotado de um grupo de proteção capaz de decomposição in vivo.

Os detalhes da presente invenção será descritos abaixo.

Primeiramente, com relação à diversas definições que a presente invenção compreende, exemplos e explicações apropriadas são proporcionadas abaixo.

O termo halogênio que aparece nas fórmulas (I) e (II) significa flúor, cloro, bromo, iodo, a não ser que de outra forma especificado.

Ci_25 alquila representada por R_lz R₂, R₃, R₄, R5, Rg, &31Z R32z

R41 ou R42 z é um grupo alquila dotado de 1 a 25 átomos de carbono, que podem ser de cadeia normal ramificada ou ciclizada.

Exemplos de

Ci_25 alquila incluem metila, etila, propila, isopropila, ciclopropila, butila, isobutila, tercbutila, pentila, isopentila, ciclopentila, hexila, ciclohexil, heptila, nonila,

5-metilhexila,

7-metiloctila, preferida, Ci_i₀ alquila, cicloheptila, octila, 6-metilheptila, decila e 8-metilnonila, de foram mais preferida Ci_₆ de forma alquila.

C2-25 alquenila representada por Ri, R₂, R₃,

R4 z Rs z Re z

R7, Rg, Rioz R20Z R31Z R32Z R41 ou R42, é um grupo alquenila dotado de a 25 átomos de carbono, que podem ser dotados de cadeia normal,

5 ramificada ou ciclizada. Exemplos de C2-25 alquenila incluem vinila, propenila, 1,l-dimetil-2-propenila e 3-metil-3-butenila, de forma preferida C₂_io alquenila, e de forma mais preferida C₂-6 alquenila.

C2-25 alquinila representada por R_x, R₂, R3, R4, R5, Rg,

R₇, Rg, Rio, R20Z R31Z R32Z R41 ou R₄₂, é um grupo alquinila dotado de

11/40

a 25 átomos de carbono, que podem ser dotados de cadeia normal, ramificada ou ciclizada. Exemplos de C2-25 alquinila incluem etinila, propinila e butinila, de forma preferida C₂-₁₀ alquinila, e de forma mais preferida C₂-6 alquinila.

Ci-25 alcóxi representada por R_lz R₂, R3, R₄, R5, R₆,

R?, Rg, Rio, R20, R31₁ R32, R-u ou R₄₂, é um grupo alcóxi dotado de 2 a 25 átomos de carbono, que podem ser dotados de cadeia normal, ramificada ou ciclizada. Exemplos de Ci_₂₅ alcóxi incluem metóxi,

etóxi, propóxi, isopropóxi, butóxi, isobutóxi, terc-butóxi, pentilóxi, isopentilóxi, ciclopentilóxi, hexilóxi, ciclohexilóxi, heptilóxi, 5-metilhexilóxi, cicloheptilóxi, octila, 6-metil heptilóxi nonilóxi, 7-metiloctilóxi, decilóxi e 8-metilnonilóxi, de forma preferida Ci_₁₀ alcóxi, e de forma mais preferida Ci_6 alcóxi. Os referidos grupos alcóxi podem ser substituídos com outro(s) substituinte(s) e podem compreender um heteroátomo tal como halogênio, oxigênio, enxofre, nitrogênio ou semelhante.

Arila representada por Ri, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, Rg,

Rio, R20, R31, R32, R₄i ou R₄₂, é um grupo de hidrocarboneto

monocíclico ou policíclico aromático, e exemplos incluem fenila, naftila, e antranila, mas de forma preferida fenila. Os referidos grupos arila podem ser substituídos com outro(s) substituinte(s) tais como Ci_₆ alquila (de forma preferida metila, etila e propila) , Οχ_₆ alcóxi, halogênio, nitro, amino, carboxila, hidroxila-Ci-6 alquila, hidroxila ou hidroxila protegida e pode compreender um heteroátomo tal como oxigênio, enxofre, nitrogênio ou semelhante como um membro de formação de anel.

Aralquila representada por R_x, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R?,

R₈, Rio, R20, R31, R32, R41 ou R₄₂, é Ci_6 alquila substituída pela arila acima, e exemplos incluem benzila, fenetila, naftimetila e antranilmetila, mas de forma preferida benzila. Os referidos

12/40 grupos aralquila podem ser substituídos com outro(s) substituinte(s) tais como cq.6 alquila (de forma preferida, metila, etila e propila), Ci_₆ alcóxi, halogênio, nitro, amino, carboxila, hidroxila-Cj-6 alquila, hidroxila ou hidroxila protegida, e pode compreender um heteroátomo tal como oxigênio, enxofre, nitrogênio ou semelhante como um membro de formação de anel.

Os exemplos dos substituintes no amino substituído representados por R_lr R₂, R₃, R₄, R₅, R_s, R₇, Rg, Rio, R20, R31, R32,

R₄₁ ou R₄₂ incluem Ci_₆ alquila, Cx-6 alcóxi, halogênio, carboxila, hidróxi-Ci_₆ alquila, hidroxila ou hidroxila protegida.

Na fórmula (I) acima, Rio e qualquer de R₃, R₃₃ e R₃₂ pode formar um anel, e R₂o e qualquer de R₄, R₄₁ e R₄₂ pode formar um anel. Na fórmula (II) acima, R₂ e R₃ podem formar um anel, e R₄ e qualquer um de R₅ , R₆ , R₇ e R₈ pode formar um anel.

Como C₂_25 alquenila representada por

R₇ ou R_s, um grupo alquenila que corresponde a uma unidade isopreno que consiste em 5 átomos de carbono, ou seja, 1,l-dimetil-2-propenila

ou 3-metil-3-butenila, e um grupo alquenila que consiste em duas ou mais unidades de isopreno, de forma preferida no máximo 3 unidades isopreno (cerca de 15 átomos de carbono) são desejáveis.

Substituintes que aparecem nas fórmulas (I) e (II) acima podem ser dotados de um grupo de proteção capaz de decomposição in vivo. Dentre os referidos grupos de proteção, 25 como um grupo de proteção, por exemplo, para um grupo amino, pode ser usado um grupo de proteção dotado de uma forma de ligação tal como amida ácida, carbamato e semelhante que são descritos em Drug Development vol. 13, Drug Delivery Systems editado por

Hitoshi SEZAKI, Hirokawa Shoten (Julho 1989), Página 116, Tabela

2. 29 mas uma acila tal como acetila derivada de ácido graxo é

13/40 preferível.

ligação dupla de um composto é mostrada nas fórmulas acima ou estar em uma configuração Z ou na configuração

E, mas de forma preferida na configuração Z.

No caso onde (Bl) e/ou (B2) uma ligação dupla de carbono-carbono, substituinte acima que se liga à ligação dupla carbono-carbono se torna um grupo divalente correspondente. Por exemplo, metila se torna metileno, e benzila se torna fenilmetileno (benzilideno).

Dentre os compostos possíveis representados pela fórmula (I) acima um composto onde cada Xj. e

X₂ é oxigênio, cada um de I₃ e I₄ é -NH-, R₁₀ é benzila, cada um de (Bl) e (B2) é uma ligação dupla carbono-carbono, e R₂₀ é isobutila (o nome comum:

albonursina, o nome do composto:

diona) refere-se ao agente anti-tumor descrito em Fukushima et

J.

Antibiotics, Vol. 26, pp.

175, 1973) o agente inibidor de fusão pró the Chemistry agentes são nuclear descrito em of Natural Products, do inibidor de

A Summary

P51, 1989, divisão de of the Symposium on os referidos dois célula da presente invenção. Ademais, o composto cada um de X_t e X₂ é oxigênio, cada um de I₃ e I₄ é -NH-, cada um de Rio e R₂₀ é benzila, e cada (Bl) e (B2) é uma ligação dupla carbono-carbono e embriões de ouriço of the Society for refere-se ao agente do mar descrito em A

Actinomicetes Japan, inibidor de divisão de

Summary of the Symposium

P42, 1999, e este agente é excluído do inibidor de divisão de célula da presente invenção.

Adicionalmente, um composto (o nome comum fenilaistina, o nome do composto: 3-{[5-(1,l-dimetil-2-propenil)imidazola-4-il]metileno}30

14/40 cada um de I₃ e I₄ é -NH-, R₁₀ é benzila, (Bl) é uma ligação simples de carbono, (B2) é uma ligação dupla Z de carbonocarbono, e R₂₀ é um grupo mostrado na seguinte fórmula (a):

(onde * representa uma posição de ligação) é o inibidor de divisão de célula conhecido, descrito no Pedido de Patente

Japonesa mantida aberta (kokai) No. 10-130266, e assim por diante, e o referido agente é excluído do inibidor de divisão de célula da presente invenção. Em geral, um composto onde, na fórmula (I) acima, cada um de Xi e X₂ é independentemente oxigênio ou enxofre, Y₃ é -NR₃-, Y₄ é -NR₄- (aqui, R₃ e R₄ são definidos como determinado acima), R₁₀ é benzila substituída não substituída, (Bl) é uma ligação simples carbono-carbono, (B2) é

uma ligação dupla carbono-carbono, e R₂₀ é imidazola-4-ilmetileno substituído ou não substituído é excluído a partir daqueles usados para o inibidor de divisão de célula da presente invenção.

Ademais, na fórmula (I) acima, um composto onde (Bl) é uma ligação dupla de carbono-carbono e (B2) é uma ligação simples carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-carbono é preferível, e um composto onde cada um de (Bl) e (B2) é uma ligação dupla carbono-carbono é mais preferível.

Exemplos preferíveis dos compostos mostrados nas fórmulas (I) e (II) acima incluem: 3-(imidazola-4-ilmetileno)-6(fenilmetileno)piperazina-2,5-diona;

15/40 no)piperazina-2,5-diona;

3- [ (5-etilimidazola-4-il)metileno]-6-(fenilmetileno) piperazina-2,5-diona;

3-[(5-butilimidazola-4-il)metileno]-6-(fenilmetile no) piperazina-2,5-diona;

no)piperazina-2,5-diona;

3-{[(5-(1,l-dimetil-2-propenil)imidazola-4-il]metile

no}-6-(fenilmetileno)piperazina-2,5-diona.

Sal farmaceuticamente aceitável do composto mostrado acima é um sal atóxico simples orgânico ou inorgânico. No caso básica, os sais que hidrocloreto, onde são hidrobrometo, o composto de forma sulfato, acima é uma substância preferida usados são nitrato, acetato, metanosulfonato e toluenosulfonato, e em caso onde o composto é uma substância acidica, o sal que é usado de forma preferida é um sal com uma base inorgânica que inclui um sal de metal alcalino (por exemplo, sal sal de metal alcalino terroso (por exemplo, sal de cálcio, sal de magnésio, etc.). O termo farmaceuticamente aceitável na presente especificação significa que o sal não é aceitável agentes médicos, agentes veterinários, produtos agrícolas, agentes antimicrobianos, inseticidas, etc., apenas em quimicos mas também em um campo que compreende reagentes usados com o objetivo de estudos.

O inibidor de divisão de célula da presente invenção pode ser usado com o objetivo de inibição de divisão de célula, fusão pró nuclear e ciclo celular entre um núcleo fêmea e um núcleo macho de um procariota ou um eucariota.

16/40

Especificamente o inibidor de divisão de célula da presente invenção é útil como um agente antimicrobiano, produto químico agrícola, agente veterinário, inseticida, agente médico e reagente para fins de estudos. Ademais, dentre os agentes 5 médicos, o mesmo é em particular útil como um agente anti-tumor.

O inibidor de divisão de célula da presente invenção é eficaz em uma condição patológica onde as divisões celulares são repetidas de forma desordenada. O mesmo é em particular útil para canceres, e é também eficaz em uma condição patológica que aparece em

determinados tipos de doenças autoimunes, reumatismo articular crônico, etc., onde determinado tipo de célula continua a crescer de forma desordenada.

Ademais, o agente anti-tumor da presente invenção pode compreender outros ingredientes farmaceuticamente eficazes, isto é, outros agentes anti-tumor tão necessários quanto os ingredientes ativos acima de modo a tratar as várias doenças.

Quando o agente anti-tumor se apresenta na forma de grânulos, grânulos finos, pós, tabletes ou cápsulas é preferível que o

agente anti-tumor compreende de 5 a 80% em peso dos ingredientes ativos acima. Quando o agente anti-tumor se apresenta na forma líquida, é preferível que o aqente anti-tumor compreenda de 1 a

30% em peso dos ingredientes ativos acima. Ademais, quando o agente anti-tumor é usado como uma injeção entre agentes parenterais, é preferível que o inibidor compreenda de 1 a 10% em 25 peso dos ingredientes ativos acima.

Para uso em administração oral, a dose aplicada dos ingredientes ativos acima varia de forma preferida de 0,1 mg a 1 g por dia por adulto. Entretanto, dependendo da idade, do peso corporal, da sintomatologia etc., do paciente, a dose pode ser 30 alterada conforme apropriado. O agente anti-tumor da presente

17/40 invenção pode ser administrado uma vez ao dia, pode ser administrado de forma dividida duas intervalos de tempo regulares. Quando o mesmo

44 ··

44 %

mas ou for *4 também três usado

444 *4

4 mesmo vezes em como uma

4· injeção, a dose aplicada dos ingredientes ativos acima é de forma preferida de 1 a várias centenas de miligramas por administração por adulto. Ademais, é possível se administrar de 1 a 3 vezes por dia ou uma vez a cada 2 ou 3 dias por injeção, ou se administrar de forma sustentada por infusão de gotej amento ou semelhante.

Como um substrato, desidrogenase da presente

invenção compreende um composto onde, na fórmula (I) acima, pelo menos um de (Bl) e (B2) é uma ligação simples carbono-carbono, ou um composto onde, na simples carbono-carbono fórmula pode ser composto onde, na fórmula (I) oxigênio, Y₃ é -NR₃-, e (II) acima, (B2) é uma ligação usado, acima,

Y₄ é -NR₄— (aqui mas de cada

R₃ e R₄ determinado acima) , de fórmula (I) acima

X_L e

NH- é usado, e de forma preferida um um de Xi e X₂ é são definidos como forma mais preferida um composto onde, na

X₂ são oxigênio, e cada um de Y₃ e Y₄ é forma mais preferida um dipeptidio cíclico onde

dois amino ácidos de forma L se condensam para formar um anel dicetopiperazina ou compostos substituídos do mesmo são usados.

Exemplos dos amino ácidos de condensação acima preferíveis incluem amino ácidos (aromáticos) cíclicos tais como fenilalanina, histidina, triptofano e tirosina. Exemplos de substituintes nos compostos substituídos do dipeptidio cíclico acima incluem halogênio, Ο_χ_₂₅ alquila, C₂_₂₅ alquenila, C₂-₂s alquinila, C^s alcóxi, aralquila, hidroxila, amino, nitro e arila. Os referidos substituintes podem ser substituídos com outro(s) substituinte(s), e uma parte da cadeia de carbono pode ser ramificada ou ciclizada, pode compreender heteroátomo, pode mutuamente formar um anel, e pode ser dotada de um grupo de

18/40 proteção capaz de decomposição in vivo. Os substituintes incluem de forma preferida C₂-6 alquila ou C₂_₆ alquenila, de forma mais preferida 1,l-dimetil-2-propenila.

A maior parte dos compostos usados como o substrato determinado acima são os compostos conhecidos do pedido de patente japonesa mantida aberta (kokai) No. 10-130266; Kanoh et

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 7, No. 22, pp. 2847

2852, 1997; Kanoh et al. , Bioscience Biotechnology

Biochemistry, Vol. 63, No. 6, pp. 1130 - 1133, 1999; Kanoh et al. , Bioorganic & Medicinal Chemistry, Vol. 7, pp. 1451 - 1457,

1999), e os referidos compostos encontram-se disponíveis. Outros compostos que podem ser produzidos pelos mesmos métodos são aqueles descritos em Kopple et al., The Journal de Organic

Chemistry, Vol. 33, pp. 862 - 864, 1968 ou Nitecki et al. , The

Journal of Organic Chemistry, Vol. 33, pp. 864 - 866, 1968.

A desidrogenase da presente invenção inclui moléculas dotadas de uma variedade de pesos moleculares, mas uma

preferível.

presente invenção

usar, como

desidrogenase, compostos sintéticos tais como coenzima

ferricianeto, metosulfato tetrametilfenilenodiamina e quinonas, assim como os compostos naturais tais como nicotina adenina dinucleotídio (NAD), nicotina adenina dinucleotídio fosfato (NADP) , flavina adenina 25 dinucleotídio (FAD), flavina mononucleotídio (FMN), pirroloquinolina quinona (PQQ) e citocromos. Entretanto, dentre os mesmos, FMN, PQQ, citocromos, DCIP, PMS, ferricianeto, tetrametilfenilenodiamina e quinonas são preferíveis, e DCIP e/ou

PMS são os mais preferíveis.

19/40

A desidrogenase da presente invenção pode ser obtida a partir de qualquer organismo, mas os derivados de microrganismo tais como bactérias, actinomicetes e fungos filamentosos são preferíveis, aqueles derivados de actinomicetes são os mais preferíveis, e aqueles derivados de

Streptomyces albulus são os ainda mais preferíveis.

A desidrogenase derivada de Streptomyces albulus apresenta as seguintes propriedades fisico-quimicas:

(i) Função:

desidrogenase derivada de

Streptomyces albulus atua de modo a converter uma ligação simples de carbono-carbono na posição 3 ou na 6 em ligação dupla de carbono-carbono.

(ii) Especificidade do derivada de Streptomyces albulus dehidrofenilaistina, e converte substrato:

converte

A desidrogenase fenilaistina ciclofenilalanilistidila em em dehidrociclofenilalanilhistidila ou tetradehidrociclofenilalanilhistidila.

(iü) (iv)

Estabilidade de pH: estável a 7,0 - 9,0 (v)

Temperatura ideal: 60°C

Estabilidade de calor: estável a 20

70°C, desativado a 80C (vii)

Peso molecular: 700 kDa - 800 kDa

A desidrogenase não só como um tecido ou da presente invenção pode ser usada célula natural, mas também como um extrato livre de células ou solução enzimática obtida ao parcialmente ou completamente purificar o extrato livre de células. A desidrogenase pode ser purificada de método comum de purificação enzimática. Ainda, múltiplas etapas podem ser realizadas de uma vez acordo com as reações um de ao se misturar

20/40

A desidrogenase da presente invenção pode produzir outras enzimas.

(B2) é uma ligação dupla de na fórmula (II) acima, (B2) ao se usar um composto onde, de (Bl) e (B2) é uma de carbono-carbono.

inibidor de divisão

Alguns descrever a da presente pelo menos carbono, e

carbono-carbono ou um composto onde, é uma ligação dupla carbono-carbono, na fórmula (I) acima, pelo menos um ligação dupla de carbono-carbono, ou um

E os referidos compostos são úteis como um de célula exemplo presente invenção

O ingrediente invenção é uma um de (Bl) e ou como um agente anti-tumor.

são proporcionados abaixo mais especificamente.

ativo do inibidor de divisão de substância (B2) é uma exemplos representativos para célula onde na ligação incluem razinas substituídas ou não substituídas, piperazinas substituídas ou cíclico substituído ou não cíclico substituído ou fórmula (I) acima, dupla de carbonodehidrodicetopipe tetradehidrodiceto não substituídas, dipeptídio dehidrosubstituído, dipeptídio tetradehidronão substituído, em particular dehidrociclofenilalanilhistidila substituída ou não substituída ou tetradehidrociclofenilalanilhistidila representada pela fórmula (II) acima, e ainda, particularmente dehidrofenilahis tina.

Como um exemplo, o método de produção de dehidrofe nilahistina é proporcionado abaixo, mas é desnecessário dizer, que a presente invenção não está limitada ao mesmo.

O método de coleta do novo composto dehidrofenilahistina ao se cultivar um actinomicete, por exemplo,

Streptoiaices albulus KO23 (que foi depositado no National

21/40

Institute de Bioscience and Human-Technology, Agency de

Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3

Tsukuba-shi,

Ibaragi-ken, Japan) sob número de acesso FERM BP-6994 em 14 de Janeiro de 2000), que prepara a desidrogenase a partir de cultura, e permite que a mesma atue na fenilaistina é especificamente descrito mais tarde. Mas, a desidrogenase, seja uma enzima purificada ou um extrato de células naturais pode ser usada. Em geral, a desidrogenase pode ser preparada de acordo com o método de cultura de um actinomicete que pertence ao gênero

Streptomyces. Após a cultura, de modo a purificar a desidrogenase da presente invenção extrato celular que método comum microrganismo métodos tais a partir da solução de cultura contém atividade enzimática, ou preparar o em geral, um usado para purificar pode ser aplicada como a enzima apropriado.

como desintegração ultra-sônica, derivada do

Por exemplo, centrifugação, desalinização, diálise, diversos métodos de resina de troca de íon, método de cromatografia de alto desempenho, adsorção não filtragem de cristalização iônico, cromatografia incluindo gel, cromatografia de líquido de ou secagem a congelamento podem ser aplicados separadamente, em combinação como apropriado, ou repetidamente.

O método de realização de reação de desidrogenação ao usar acima é o fato uma solução enzimática ou extrato celular especificamente de que uma fenilaistina do mesmo, preparado como descrito posteriormente nos solução enzimática e um são misturados para reagir exemplos, substrato em tampão mas de tal como tampão fosfato. Se necessário, é possível se adicionar um solvente orgânico à solução de reação.

De modo a purificar e isolar a dehidrofenilaistina da solução de reação acima, em geral um método comum de compostos

22/40 orgânicos de purificação/isolamento

Por exemplo, métodos tais como os diversos métodos de resina de troca de ion e métodos de adsorção não iônicos; cromatografia de filtragem de gel, cromatografia com adsorventes incluindo carbono ativado, alumina, sílica gel, etc., e cromatografia de líquido de alto desempenho, cristalização, concentração à vácuo, ou secagem a congelamento podem ser aplicadas separadamente, em combinação como apropriado, ou repetidamente.

A dehidrofenilaistina produzida pelo método acima

apresenta atividade inibitória de de célula, como descrito a dose presente posteriormente nos exemplos.

O uso, a forma de dosagem e aplicada invenção ingrediente ativo (uso) que do inibidor compreende são determinados uso pretendido. Por exemplo, no presente invenção que compreende de divisão de célula dehidrofenilaistina como como apropriado dependendo caso do agente anti-tumor a dehidrofenilaistina como da do da ingrediente ativo, pode ser administrado ou por via oral ou por via parenteral. Exemplos de formas de dosagem orais tais com tabletes, cápsulas, grânulos, ou preparações parenterais tais como injeções incluem preparações extratos e xaropes, ou supositórios. As referidas formulações são produzidas ao se usar os aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como um excipiente ligação de acordo agente anti-tumor ingrediente ativo susceptibilidade, quantidade eficaz ou agente de com métodos que contém depende da conhecidos. A dose aplicada a dehidrofenilaistina como idade, do peso corporal, do da dos sintomas do em geral cerca de paciente.

0,1 mg a 1

Entretanto, g por dia por adulto, e é também possível se administrar apenas uma vez ao dia ou fracionado em diversas vezes ao dia. Ademais, doses aquém ou

23/40

além dos limites normais podem também ser administradas conforme necessário.

Quando o agente é usado como um reagente para o exame biomédico, o desenvolvimento do ciclo celular é inibido em 5 um período G2/M, se o agente é dissolvido em um solvente orgânico ou um solvente orgânico hídrico e administrado diretamente a vários sistemas de células cultivadas. Exemplos de solventes orgânicos aplicáveis incluem agentes sólidos incluem metanol, dimetilsulfóxido, etc. Exemplos de formas de dosagem incluem

agentes sólidos tais como pós ou grânulos, agentes líquidos dissolvidos em solvente orgânico ou solvente orgânico hídrico, ou semelhante. Em geral, o teor eficaz de um inibidor de divisão de célula que compreende a dehidrofenilaistina como um ingrediente ativo é de 0,01 - 100pg/mL, mas a quantidade apropriada depende 15 do tipo de sistema celular cultivado ou do uso pretendido.

Ademais, uma quantidade aquém e além dos limites normais pode também ser administrada, se necessário.

A presente especificação inclui parte ou todos os

conteúdos como descritos na especificação de pedido de patente japonesa de número 2000-9370 que é um documento de prioridade do presente pedido.

Melhor Modo de Realizar a Invenção

A presente invenção será adicionalmente descrita nos seguintes exemplos. Nos seguintes exemplos, o ciclo (A_x-A₂) , que é um ciclo de dipeptídio formado pela condensação de dois amino ácidos Ai e A₂ em um anel de dicetopiperazina, é designado CAiA₂ (Αχ e A₂ representam amino ácidos em uma notação de uma letra, respectivamente). Todos os ciclos de dipeptídios CAiA₂ são isômeros-LL a não ser que de outra forma especificado. Um D-amino 30 ácido é designado, por exemplo, DAI se necessário. Adicionalmente

24/40 • · • · «« emais dehidro-peptídios são designados Δ, de modo que

CAA]A₂ representa ciclo (ΔΆ1-ΔΑ2) , CA].AA₂ representa ciclo (Αχ-ΔΑ₂) , CAxAA₂ representa ciclo (ΔΑι~ΔΑ₂) , e ACA]A₂ representa uma mistura de

CAiÁA₂, CAiÁA₂ e CÁAiÁA₂. Ademais, PLH representa f enilaistina.

Exemplo 1 (1) a fenilaistina foi preparada como se segue.

Aspergillus

Células bacterianas ustus NSC-F038, que que foram produzem depositadas fenilaistina no National

Institute

Industrial of Bioscience and

Human-Technology,

Agency of

Science and Technology (Higashi 1-1-3,

Tsukuba-shi,

Ibaragi-ken, Japão) sob o número de acesso FERM P-15830 em 3 de

Setembro de 1996) foram inoculados em cinco pontos em um meio

0,5% de glucose, 2% de glicerol, 0,2% de extrato de levedura,

2% de

Pharmamedia cloreto de de agar (pH 6,5). As células foram então cultivadas a 26°C por 7 dias no escuro para se obter a suspensão dos esporos. A suspensão

de esporos resultante (0,1 ml) foi inoculada em 400 pratos que continham 20 ml do meio sólido acima, e então cultivados a 26°C

0 por 8 dias no escuro. A cultura resultante foi triturada ao se usar misturador, e após a adição de 8L de acetato de etila, foi permitido descansar por 2 dias e então extraído. A camada de acetato de etila coletada foi concentrada à vácuo para se obter 15 gramas de um xarope marrom. O referido xarope foi dissolvido 25 em 20 ml de acetato de etila e aplicado a uma coluna de sílica gel (8 cm de diâmetro, 20 cm de comprimento) preparada com uma proporção de 1:6 de acetona/acetato de etila, seguido por elução com 1:6 de acetona/acetato de etila. A solução eluída foi fracionada em frações de 500 ml em ordem de elução. A

25/40

fenilaistina foi contida nas quinta e décima frações, que foram então concentradas à vácuo para se obter 4,7 gramas de um pó marrom escuro no total. O referido pó marrom escuro foi dissolvido em 10 ml de clorofórmio e aplicado a uma coluna de sílica gel (4 cm de diâmetro, 30 cm de comprimento) preparada com clorofórmio, seguido de elução com 500 ml de clorofórmio e então 50:1 de clorofórmio/metanol. O composto de interesse foi eluído com 50:1 de clorofórmio/metanol para se obter 1,05 g de pó marrom

no total. Após a adição de 100 ml de acetato de etila, o referido pó marrom foi bem misturado e foi permitido descansar por dois dias para separar 628 mg de fenilaistina como um pó branco.

(2) Cultura de Streptomyces albulus KO23 e preparação de um extrato livre de células foi realizado como se segue.

Dez mililitros de água esterilizada que contém 50 15 200 μΐ de tensoativo (Triton X-100) foi adicionado e misturado com uma inclinação na qual esporos cinza se formaram bem, e desta forma se obteve a suspensão dos esporos. A referida suspensão foi diluída 100 vezes em um meio de cultura e cultivada sob as

seguintes condições. O meio de cultura apresentava a composição mostrada na Tabela 1.

	Tabela 1
	Composição de meio KP	(g/L)
	Glucose	15
	Glicerol	10
25	Polipepton	10
	Extrato de carne	10
	CaCO₃	4 PH 7,3

A Tabela 2 apresenta as condições de cultura

26/40

Tabela 2

Pré-cultura em

Meio KP

Período de

Velocidade

'·· ···„··.

J _r - ·· ;·· :: :

·· • ··«· frasco Erlenmeyer de 200

Cultura de rotação

Temperatura

Cultura principal em uma jarra de

Meio KP

Agente anti espumante

Período de Cultura

Velocidade de rotação

Volume de Ventilação

Temperatura ml ml horas

180 rpm

28° C fermentação de g por 3 L horas

300

28°

O extrato celular foi preparado meio de cultura (40 ml) foi centrifugado a rpm por 3 min como se segue. Um

20.000 x g por 15 minutos a suspensas a 20.000 referidas de sódio

4°C para em 4 0 ml x g por coletar as de solução células. As referidas células foram salina e então centrifugadas contra minutos a 4°C para lavar as células. As células foram suspensas em 7,3 ml de tampão de fosfato min, KUBOTA INSONATOR centrifugada sobrenadante (3) a reação seguido

201M).

a 20.000 por 15 como um extrato livre de conversão de e a purificação do produto segue.

Figura 3.

de ultrasonicação (150 W, 1,5 ,·

A solução resultante foi min a 4^o C para se obter o de células.

fenilaistina em dehidrofenilaistina de reação foram realizados como se

A mistura de reação apresenta a composição mostrada na

27/40

de reação em cada

Tabela 3

Composição da mistura

Fenilaistina

Sulfóxido dimetila de reação

0,5 mg/ml

10% (v/v)

Tampão de fosfato de sódio (pH 8,0)

Extrato livre de células

Temperatura mM

0, 145

50° C

A mistura de reação acima (100 ml) frascos de Erlenmeyer de 200 ml de modo a conter golpes/minuto por 24 por 15 min a 4 ^o C referido precipitado unidades/ml foi dividida em ml de mistura frasco. A reação foi realizada a 160 horas, seguido de centrifugação a 20.000 ^x g para se obter um precipitado amarelo. O foi centrifugado de novo a sobrenadante resultante dissolvido em 55 ml de metanol, e

20.000 ^x g por min a 4 ^o então

C. O foi concentrado à vácuo e seco para formar um sólido, seguido de recristalização a partir de metanol, e desta forma se obtém 5,58 mg de dehidrofenilaistina como um cristal de agulhas amarelas.

seguintes

A dehidrofenilaistina resultante apresenta os dados fisico-quimicos:

EIMS m/z:

UV (MeOH) max, nm (e): 205(16600), 363(35300).

δ

H-NMR	(500	MHz, CDC1₃) :
> 1,51,	6H,	s
> 5,16,	1H,	d(J = 17,4)
> 5,20,	1H,	d (J = 10,7)
> 6,03,	1H,	dd (J = 10,7
> 6,96,	1H,	s

, 17,4) δ 6,98, 1H, s

28/40

7,32,	1H,	d	(J = 7,0)
7,37,	2H,	d	(J = 7,3)
7,43,	2H,	dd	(J = 7,0
7,57,	1H,	s
8,04,	1H,	s
9,06,	1H,	Br	s
12,23,	1H	, s

O produto resultante foi identificado como (Z,Z)dehidrofenilaistina com base em NOE observada entre um próton de dicetopiperazina (δ 8,04, 1H, s) e prótons de grupo fenila (d

7,43, 2H, dd (J

7,0, 7,3)). O mesmo apresenta a seguinte fórmula estrutural (III):

Exemplo 2

Os produtos dehidro de ciclofenilalanilistidila (CFH) foram preparados a partir de CFH através de desidrogenação como se segue:

Tabela 4

Composição de mistura de reação

CFH 0,5 mg/ml

Sulfóxido dimetila 10% (v/v)

Tampão de fosfato de sódio (pH 8,0) 9 mM

29/40

Extrato de célula livre do Exemplo 1 0,435 un/ml foi preparada e fracionada em cinco frasco de Erlenmeyer de 20

50°

A reação

C por 24 foi realizada em

Reciprocai (160 golpes/minuto) a horas. Após horas, a mistura de reação foi centrifugado a 20.000 g por min. a 4^o C para se obter o sobrenadante. O referido sobrenadante foi extraído com acetato de etila, e então purificado por HPLC (Controlador Waters 600,

Detector de Absorção 486 Tunable,

Bomba 616,

Inertsil ODS-3

coluna Φ

X mm

250 mm, 60% de metanol como solvente, coeficiente de fluxo de 10 ml/min, detecção de

UV a 25 6 nm) , e desta forma se obtém três produtos dehidro em tempos de retenção de 3,9 minutos,

9,1 minutos e 11,6 minutos.

análise instrumental indica que o produto que eluiu a 9,1 minutos é o E-tetradehidrociclofenilalanilhistidila (CE-AFAH) de fórmula (IV), o produto eluído a 11,6 minutos foi o

Z-tetradehidrociclofenilalanilhistidila (CZ-AFAH) de fórmula (V), e o produto eluído a 30,1 minutos é o dehidrociclofe

nilalanilhistidila (CFAH) de fórmula (VI).

30/40

EIMS m/z:

composto (V) apresenta

seguintes dados fisico107(36), 279(29),

281(18)

UV (MeOH) 1 max, nm(e): 205(14800), 257(6500), 351(27100).

	¹H~NMR	(500 MHz,	CDC1₃) :
	δ 6,77,	1Η, s
10	δ 7,02,	1H
	δ 7,22,	1H, m
	δ 7,33,	1H, t (J	= 7,3)

δ 7,37, 2H, d (J = 7,3)

31/40

7,43,	2H,	dd	(J = 7,3, 7,3)
7,75,	1H,	s
8,09,	1H,	s
9,30,	1H,	br	s
11,91,	1H,	, s

Exemplo 3

Uma variedade de dehidrodicetopiperazinas foram preparadas a partir de diferentes dicetopiperazinas como substratos através de reações de desidrogenação ao se usar a enzima da presente invenção como se segue.

Tabela 5

Composição da Mistura de Reação

Sulfóxido dimetila (DMSO)		10%	(v/v)
Tampão de fosfato de sódio (ph 8.	.0)	5,2	mM
Diclorofenolindofenol (DCIP)		80 :	pm
Metosulfato de fenazina (PMS)		120	pm
Extrato livre de células Exemplo	1	g.s
Substrato		0,5	mM
Total		0, 5	ml

A mistura de reação mostrada na Tabela 5 foi usada _ipara a reação de desidrogenação a 37°C. O produto de reação foi analisado por HPLC e detectado por absorção de ultravioleta a 256 nm. 0 referido método proporciona os seguintes produtos dehidro:

ACAF,	ACFF,	ACFG, ACFH,	ACFL,	CAFL, CFAL, ACFS, ACFV,	ACFW, ACLW
ACLY,	ACVY,	ACWW, ACWY,	ACDWY	(Resíduo W é D-forma), e	APLH.
Exemplo 4
		Uma variedade de	dehidrodicetopiperazinas	foram

preparadas a partir de diferentes dicetopiperazinas como

32/40

substratos através de reações de desidrogenação ao se usar a enzima da presente invenção como se segue.

Tabela 6

Composição da mistura de reação

Sulfóxido dimetila (DMSO)

Tampão de fosfato de sódio (ph 8.0)

Extrato livre de células Exemplo

Substrato

q.s.

0,5 mg/ml

Total

mistura de reação mostrada na

Tabela 6 foi usada para a reação de desidrogenação a 37°C. O produto de reação foi analisado por

HPLC e detectado por um detector de estrutura de fotodiodo (múltiplos canais de UV, 220 nm a 400 nm) . O presente

método	proporcionou os seguintes	produtos dehidro: ACAH,	ACAW
15 ACAY,	ACD(OMe)D(OMe),	ACDF, ACFG,	ACFS,	ACFV, AVFW, ACGL,	ACGW
ACGY,	ACHH, ACHW, ACHY	, ACLP, ACLW,	, ACLY,	ACMM, ACSY, ACVW,	ACWW
ACWY,	ACDWY (resíduo	W é D-forma), e	ACD(OEt)G, onde	D (OMe

representa ácido aspártico dotado de um grupo carboxila metilado em sua cadeia lateral (posição γ), e D(Oet) representa um ácido aspártico dotado de um grupo carboxila etilado em sua cadeia .

lateral (posição γ) .

Exemplo 5

Os procedimentos de reação como descritos no Exemplo foram repetidos e um teor de desidrogenação enzimática foi determinado com base na mudança de absorção a 600 nm em virtude

33/40 ·

da coenzima. A Tabela 7 mostra o teor de hidrogenação enzimática expresso como um valor relativo (uma absorção para CFL foi ajustada a 100).

Tabela substrato por enzima

Teor de desidrogenação de cada

Substrato	Teor de
CFL	100
CFH	44
CMM	27
CEE	14
CLY	14
CDD	14

desidrogenação

A desidrogenase derivada de Streptomyces albulus

KO23, que requer dicetopiperazinas como substrato, foi purificada de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 1.

Streptomyces albulus KO23 foi cultivado em uma pequena jarra que contem 3 L de meio de cultura para se obter

167,12 g de células. O extrato livre de células foi preparado a partir das referidas células como se segue.

Atividade de	Proteína	Atividade	Volume	Atividade »
conversão	(Α₂8θ)	específica	líquido	total
(unidades/ml)	(mg/ml)	(unidades/mg)	(ml)	(unidades)
0, 684	14,2	0,0482	382	261,3

O extrato resultante foi submetido a cromatografia de coluna de troca de ânion DEAE-Sephacel.

Coluna:

Coeficiente de fluxo:

ml/min

Dimensão da fração:

ml

34/40

Amostra :

113 ml de extrato livre de células

Como tampão foi usado 10 mM de fosfato de sódio (pH 8,0) que contém 0,1 mM DTT. Após a amostra ter sido absorvida na coluna, a coluna foi lavada com 360 ml de tampão, e então eluida em etapas com 400 ml de tampão que contém 0,1 M NaCl, 410 ml de tampão que contém 0,3 M de NaCl e 600 ml de tampão que contém 0,5 M de NaCl, e desta forma se obtém as seguintes frações ativas.

Tabela 9

Fração	Atividade de	Proteína	Atividade	Volume	Atividade
	conversão	(Α₂8ο)	específica	líquido	total
	(unidades/ml)	(mg/ml)	(unidades/mg)	(ml)	(unidades)
50-56	0,179	1, 42	0,126	70	12,5
57-71	0,240	2,56	0,0781	152	30,4

As frações 50-56 que apresenta a atividade específica mais elevada foram submetidas a cromatografia de coluna Mono-Q subsequente como se segue.

Mono Q HR 5/5

Coeficiente ml/min

Dimensão da fração:

Amostra:

0, 6 ml

4^X1 ml DEAE-Sephacel frações

50-56 diluídas 2X com tampão

Como tampão, 10 mM de fosfato de sódio (pH 8,0) que contém 0,1 mM DTT

Após a amostra ter sido adsorvida na coluna, a coluna foi lavada com o tampão por 4 minutos, e então eluida com 1M de NaCl que contém tampão ao se usar um gradiente linear (25 minutos). Os procedimentos acima foram repetidos 4 vezes para se obter a seguinte fração ativa.

Tabela 10

Purificação por cromatografia de coluna de troca de ânion Mono Q

35/40 .» *· · • · ·· e ·· • 4♦ • «· r ·

Atividade de	Proteína	Atividade	Volume	Atividade
conversão	(A₂90 )	específica	líquido	total
(unidades/ml)	(mg/ml)	(unidades/mg)	(ml)	(unidades)
0,0201	0,0376	0,646	7,2	0, 145

A fração ativa acima foi submetida a cromatografia de filtragem de gel (Superose 12) como se segue.

Coluna:

Superose 12 HR 10/30

Coeficiente de fluxo:

0,5 ml/min

Dimensão da

Amostra:

fração:

0,25 ml

Fração

Mono Q ativa concentrada, 225 μΐ contém mostra ativas

0,1

Como tampão, mM de DTT e mM

0,3 M a atividade enzimática de de de fosfato de sódio

NaCl cada

13-16 foram combinadas entre foi usado.

fração. As si

A Tabela 11 frações mais e concentradas por ultrafiltragem.

Tabela 11

Purificação por cromatografia de coluna de filtragem de gel Superose

Fração	Atividade de conversão (unidades/ml)	Volume líquido (pL)	Atividade total (unidades)
11,	12	0,0737	100	7,37
13,	14	0,253	45	11,4
15,	16	0,184	45	8,28
17,	18	0,0526	80	4,21

A fração ativa acima foi submetida a cromatografia

de filtragem de gel (TSK G3000SWXL) com Waters LC Modulei como se segue.

Coluna:

TSK GEL G3000SWXL

36/40

Coeficiente de fluxo:

0,5 ml/min

Amostra:

·*· • * * ·· ·' ·· •9 • ·· • ··

Fração Superose ativa concentrada

Como tampão foi usado, 100 mM de fosfato de (pH 7,5) que contém 0,1 mM de DTT e 0,3M NaCl.

resultantes foram combinadas e concentradas por

···

μΐ sódio

As frações ativas ultrafiltragem. A

Tabela 12 mostra a atividade enzimática da fração cominada e concentrada.

Tabela 12

Purificação por cromatografia de filtragem de gel TSK G3000SWXL

Atividade	Proteína (A₂₈₀)	Atividade específica
(unidades)	(mg/ml)	(unidades/mg)
0,00224	0,00114	19, 6

A Tabela 13 mostra a atividade enzimática em cada etapa dos procedimentos de purificação e a atividade enzimática final.

Tabela 13

Purificação enzimática e atividade especifica

Etapa de	Atividade	Proteína	Atividade
purificação	enzimática	(mg)	específica
	(unidades)		(unidades/mg)
Extrato livre	0,734	15,2	0,0482
de células
DEAE-Sephacel	0,119	0, 946	0,126
Mono-Q	0,0644	0,120	0,537
Superose 12	0,00790	0,00799	0, 989
TSK G3000SW	0,00224	0,000114	19, 6

Exemplo 7

A mistura de reação mostrada na Tabela 14 foi usada para a reação enzimática ao se suar a enzima da presente

37/40 invenção.

Diversas dicetopiperazinas

substratos. A mistura de reação enzimática resultante foi testada quando a sua atividade inibitória contra a divisão embrionária de Temnopleurus toreumaticus sem qualquer purificação do produto de reação. O teste foi realizado como descrito no The Journal of Antibiotics, Vol. 52, p. 1017 (1999). Entretanto, estágios nos quais a primeira divisão de divagem ocorre varia dentre os ouriços do mar, de modo que a inibição de divisão de divagem foi observada após uma hora de fertilização no referido teste ao se usar Temnopleurus toreumaticus. A concentração di substrato adicionado ao sistema de reação enzimática foi usado como critério para o inibidor de concentração pelo fato de que o produto de reação foi usado para o teste como qualquer purificação. O teste de inibição para a divisão embrionária do

Temnopleurus toreumaticus se iniciou com a mais alta concentração de substrato de 25 pg/ml, seguido de concentrações de substrato diluídas em série. A Tabela 15 mostra o resultado dos testes.

Tabela 14

Composição de Mistura de Reação

Sulfóxido dimetila (DMSO)

Tampão de fosfato de sódio (pH 8.0)

Extrato livre de células do Exemplo 1

Substrato

Total

Tabela 15

10% (v/v)

q.s.

0,5 mg/ml

Teste de inibição para divisão de divagem ao se usar a mistura de reação enzimática

	MIC (pg/ml)
Produto de reação CDF	>25 (80% de inibição a 25 pg/ml)

38/40

Produto de reação CFF	>25 (90% de inibição a 25 pg/ml)
Produto de reação CFV	25
Produto de reação CGL	>13 (70% de inibição a 13 pg/ml)
Produto de reação CHW	13
Produto de reação CLY	>13 (60% de inibição a 13 pg/ml)
Produto de reação CWY	6, 3

Exemplo 8

A atividade fisiológica de cada

dehidrodicetopiperazina será descrita abaixo.

Cada dehidrodicetopiperazina foi testada quanto a sua atividade inibitória contra divisão de divagem de

Hemicentrotus pulcherrimus, Scaphechimus mirabilis e Temnopleurus toreumaticus como a atividade inibitória de divisão de célula. O teste foi realizado como descrito no The Journal of Antibiotics, Vol. 52, p. 1017 (1999). Entretanto, estágios nos quais a primeira divisão 10 de divagem ocorre varia entre os ouriços do mar, de modo que a inibição da divagem foi observada após 4 horas de fertilização

nos testes ao se usar Temnopleurus toreumaticus, respectivamente.

A Tabela 16 mostra o resultado dos testes.

Teste de inibição de divisão de célula ao se usar a dehidrofenilaistina e compostos relacionados

	MIC, pg/ml
	Composto	Scaphecin US mirabilis	Temnopleu rus toreumati cus	Hemicentr otus pulcherri mus
Exemplo 1	Dehidrofenilaistina	0,0061	0,0061	0,00038
Exemplo 2	(Z,Z)-tetradehidro- CFH	1,6	1,6	0,78

/1

39/40

Comparação 1	(-)-fenilaistina	1,6	0,2	0, 39
Comparação 2	(+)-fenilaistina	>13'	6, 3	13
Comparação 3	Albonursina	>13'	>25’	6.3
Comparação 4	CFH	>25’	>25’	>25’

* nenhuma atividade na concentração indicada

A dehidrofenilaistina apresenta MIC de 0,0061 pg/ml para divisão de célula de Scaphecinus mirabilis e Temnopleurus toreumaticus, e MIC de 0,00038 pg/ml para divisão de célula de

Hemicentrotus pulcherrimus, respectivamente. A dehidrofenilaistina exibe de 250 vezes a 1000 vezes atividade inibitória quando comparada à (-)-fenilaistina não-desidrogenada. (Z,Z)-tetradehidro-CFH obtido pela desidrogenação de CFH exibe 15 vezes ou mais atividade inibitória quando comparada à CFH. Em qualquer caso, a variedade de dehidrodicetopiperazinas que inclui dehidrofenilaistina e (Z,Z)-tetradehidro-CFH mostrou ser dotada de atividade inibitória de divisão de célula, o que indica que as dehidrodicetopiperazinas são úteis como inibidores de divisão de célula e como agentes anti-tumor.

Formulação do Exemplo 1: Formulação para injeção ou infusão de gotejamento.

Uma miligrama de dehidrofenilaistina e 5 g de ¹glucose em pó foram distribuídas de forma asséptica em cada frasco. Cada frasco foi selado sob um gás inerte tal como nitrogênio ou hélio, e então armazenado em um lugar escuro e fresco. Antes do uso, etanol foi adicionado a cada frasco para dissolver o seu conteúdo, seguido da adição de 100 ml de 0,85% de solução fisiológica para produzir uma formulação para injeção intravenosa. A formulação resultante é injetada por via intravenosa ou infundida em uma quantidade de 10 a 100 ml por dia dependendo dos sintomas.

40/40

Formulação do Exemplo 2: Formulação para injeção ou infusão de gotej amento

Os procedimentos como descritos na formulação do exemplo 1 foram repetidos para produzir a formulação de injeção 5 intravenosa que contém 0,2 mg de dehidrofenilaistina que pode ser usada para o tratamento de casos brandos. A formulação resultante é injetada por via intravenosa ou infundida em uma quantidade de 10 a 100 ml por dia dependendo dos sintomas.

Formulação do exemplo 3: Grânulos

Cem miligramas de dehidrofenilaistina, 98 gramas de lactose e grama de hidróxipropilcelulose foram bem misturados, granulados por técnicas padrão, bem secas e passadas através de uma malha, e desta forma se obtém grânulos adequados para acondicionamento em um frasco ou vedado a quente. Os grânulos

resultantes são administrados por via oral em uma quantidade de

100 a 1000 mg por dia dependendo dos sintomas.

Todas as publicações, pedidos de patentes aqui citados encontram-se aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Aplicabilidade Industrial e uma enzima

A presente invenção proporciona um inibidor de . divisão de célula dotado de atividade inibitória de ciclo celular mais forte, em particular atividade anti-tumor, capaz de ser utilizada para a produção do mesmo.

Claims

1. Composto de fórmula (II) ou uma forma E do mesmo, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

Ri é hidrogênio, halogênio, Ci_6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, hidroxila, amino ou nitro, cada um dos quais, ser substituído, e uma parte de qualquer cadeia carbônica em Rj poder ser ramificada ou ciclizada, e R, poder ser um átomo ou grupo, ou pelo menos 5 átomos ou grupos idênticos ou diferentes, e 10 os átomos ou grupos poderem mutuamente, formar um anel;

R2 é hidrogênio, halogênio, Cj.ê alquila, C2-6 alquenila, C2.6 alquinila, hidroxila, amino ou nitro, que é substituída, e uma parte de qualquer cadeia carbônica em R2 poder ser ramificada ou ciclizada;

cada um de R3 e R4 é hidrogênio;

15 R5 é hidrogênio, halogênio, C|_₆ alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, hidroxila, amino ou nitro;

Re é hidrogênio, halogênio, Ci_6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, hidroxila, amino ou nitro;

R₇ é hidrogênio, halogênio, Ci_6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, 20 hidroxila, amino ou nitro;

R₈ é halogênio, etila substituída, propila substituída, isopropila substituída, ciclopropila substituída, butila substituída, isobutila substituída, terc-butila substituída, pentila substituída, isopentila substituída, ciclopentila substituída, hexila substituída, ciclohexila substituída, C2-6 alquenila substituída, Ci_6 alcóxi 25 substituída, hidroxila, amina substituída, nitro, carboxila substituída, hidroxila-Ci.

6 alquila, e hidroxila protegida;

(B2) representa uma ligação dupla de carbono-carbono.

r

2/2

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na dita fórmula (II), pelo menos um de R7 e Rg é 1, l-dimetila-2-propenila.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um de R2, R3, R4, R5, Ró e R7 ser um hidrogênio, Rs ser 1, l-dimetila-2-propenila, e (B2) representar uma ligação dupla de carbono-carbono.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um de R2, R5, Ró e R7 ser um hidrogênio e Rg ser etila, propila, isopropila, ciclopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila, isopentila, ciclopentila, hexila, ciclohexila.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Ri é hidrogênio, halogênio, C]_6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, Ci_6 alcóxi, aralquila, hidroxila, amina, nitro ou arila, cada um dos quais é substituído, e ainda Rj pode ser um átomo ou grupo, ou pelo menos 5 átomos ou grupos idênticos ou diferentes.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo que consiste em:

3-[(5-etilimidazola-4-ila)metileno]-6-(fenilmetileno)piperazina-2- ,5-diona; 3-[(5-butilimidazola-4-ila)metileno]-6-(fenilmetileno)piperazina-2,5-diona;

3-[(5-pentilimidazola-4-ila)metileno]-6-(fenilmetileno)piperazina-2,5-diona; e 3-{[5-(l, l-dimetila-2-propenila)imidazola-4-ila]metileno}-6-(fenilmetileno) piperazina-2,5-diona.