JPS58500947A - 末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフエラ−ゼ活性を抑制する組成物及び方法 - Google Patents

末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフエラ−ゼ活性を抑制する組成物及び方法

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JPS58500947A
JPS58500947A JP81502283A JP50228381A JPS58500947A JP S58500947 A JPS58500947 A JP S58500947A JP 81502283 A JP81502283 A JP 81502283A JP 50228381 A JP50228381 A JP 50228381A JP S58500947 A JPS58500947 A JP S58500947A
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uracil
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tdt
leukemia
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ライト・ジヨ−ジ
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/52Two oxygen atoms
    • C07D239/54Two oxygen atoms as doubly bound oxygen atoms or as unsubstituted hydroxy radicals
    • C07D239/545Two oxygen atoms as doubly bound oxygen atoms or as unsubstituted hydroxy radicals with other hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 末端デオキシリボヌクレオチ ゛ ジルトランスフェラーゼ活性 を抑制する組成物及び方決 本発明は末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフエラーゼ(TdT)の活性 を抑制する組成物及び方法に関するものである〇 現在、細胞中におけるDNAの生産を促進するよう機能する4種類の哺乳類DN Aポリメラーぞが存在する。
ぽ、β若しくはyDNAポリメラーゼとして知られる3種のDNAポリメラーゼ は、鋳型組によって支配されるワトソンークリック塩基対規則に従がってプライ マー鎖の3−プライム−OH末端にモノホスフェート残基な付加することにより プライマー鎖に対する基質の付加を行なうためには、DNAの鋳型鎖とDNAの プライマー鎖とを必要とする。これらのDNAffリメラーゼは複製DNAポリ メラーゼとして知られている。TdTポリメラーゼは、合成を開始するための単 −釦のDNA11!始分子のみを必要とする点において複製DNAポリメラーゼ とは異なっている。TdTは、鋳型の不存在下においてオリゴ若しくはポリデオ キシリボヌクレオチド開始剤の3−プライム−OH末端に対するデオキシリボヌ クレオチドの重合を触蝶する。
通常の条件下において、TdTは胸腺及び骨髄のみに存在し、最高濃度は胸腺m 胞に見られる。この観蒙から、TdTは少なくともT−細胞において免疫分化に 役割を演すると推定されている。さらに、マツフカ7り一等によって、TdTは リンパ芽白血病細胞に存在することが報告されている( Proc、 Nat、 Aead、 Sei、USA%第704.第2号、第521〜525頁、(19 75年2月)〕。さらに、TdTは骨髄芽白血病a胞又はリンパ肉腫細胞白血病 には存在しないことも見出されている。急性りンバ芽白血病を有する全ての患者 がTdTに対する試験に陽性であるとは限らないが、大多数、すなわちこの種の 患者の約95%がTdTに対する試験に陽性である。したがって、慣用の生化学 的技術、或いはTdT標識に対する蛍光性抗体標識技術を使用して、患者におけ る急性リンパ芽白血病io+aの存在又は不存在を決定するための少なくとも予 備試験を行なうことができる。
グラム陽性細菌のvI製を抑制するため、ilI製DNhiリメラーゼの選択的 抑制剤を使用することが提案されている。6−(アリールヒドラジノ)及び6− (アリールアミノ)ウラシルは、細菌性DNAポリメラーゼlを抑制することに よりDNA複製の選択的抑制剤になることが判明した。このメカニズムはウラシ ル部分の直換基と鋳型シトシンとの特定の対比及びポリメラーゼに対する6−ア リール基及びその置換基の結合を含み、それによりポリメラーゼを比較的安定な 蛋白質:薬剤コンプレックスに封鎖することを含むと信じられる。グラム陽性細 菌のl!!素−膳型ポリメラーゼの狭いスペタトルのみがこれらのウラシル抑制 剤に鋭敏であることが判明した。これは、ポリメラーゼ璽が活性部位の近くの臨 界的個所に独特のアリール部位を有し、この部位が強力に6−アリール部分を結 合するからである。化合物6−(P−!l−ブチルアニリノ)ウラシルはヒーラ 白面病細胞のDNA&9メラーゼCの特異的抑制剤であり、かつ生体内において ヒーラ細胞分裂及びDNA合成の選択的抑制剤となることが示されている。その 他の哺乳類細胞のDNAポリメラーゼは、この化合物により抑制されない。
生体内若しくは試験管内でリンパ芽白血病細胞の増殖を抑制し及び(又は)破壊 なもたらすため、TdTの抑制剤を提供することが望ましい。
発明の要約 本発明は式: 〔式中、Xは01〜C!−のアルコキシ又はアミノである〕を有する化合物はD NAを生産するTdTの選択的抑制に有効であるという知見に基づいている。本 発明のこの新規化合物は、6−バロウラシルを式: 〔式中、Yはたとえば塩化水素のような可溶化部分である〕 の化合物と反応させることにより製造される。
特定具体例の詳細な説明 本発明は式: 〔式中、XはC1−VCl、アルコキシ又はアミノであり、かつDNAを生産す るためのTdTの選択的抑制に有効である〕 を有する新規な化合物を提供する。
本発明の化合物は、6一ハpウラシル化合物を式:〔式中、Yはたとえば塩化水 素のような可溶化部分である〕 の化合−と反応させることにより製造される。この反応は、たとえばグライムな どのような不活性溶剤中において反応混合物を還流させる条件下で行なわれる。
通常、反応は約3〜約8時間、好ましくは約已5〜約4,5時間で行なわれる。
次いで、反応混合物を回収し、かっこの反応混合物から反応生成物が沈澱するよ うな温度まで冷却し、たとえば濾過によって回収する。次いで、固体反応生成物 をたとえば再結晶化によって精製することができる。
本発明の化合物は、急性リンパ芽白血病(jkLL)に罹患した患者の治療処置 に有用であり、かつ単独で又は医薬上許容しうるキャリヤと組合せて投与するこ とができる。キャリヤに対する活性成分の割合は、化合物の溶解度及び化学特性 、選択される投与経路及び線準的医薬慣行によって決定される。活性化合物は経 口的、非経口的又は静脈内で投与することができる。たとえば、活性化合物はた とえば乳糖、クエン酸ナトリウム、縦酸カルシウム又は燐酸二カルシウムのよう な補形薬と共に錠剤形態として投与することができる。たとえば澱粉、ア次ギン 酸又は成る種の錯体シリケートのような種々の崩壊剤な、たとえば−ステアリン 酸マダネシウム、アリール硫酸ナトリウム又はタルクのような滑剤と共に使用す ることもできる。カプセル型の経口投与については、適する材料は高分子量ポリ エチレングリコールにおける乳糖な包含する。水性懸濁物を使用する場合、活性 化合物は乳化剤及び(又は)懸濁剤と組合せる。たとえばエタノール、水、プロ ピレングリフール、グリセリン、グリシンなどの液体キャリヤを使用することが できる。非経口投与には、活性化合物の溶液をたとえばグルコース又は食塩のよ うな他の溶解質と組合せて使用することができる。
この種の水溶液は適当に緩機化して、等優性にすべきである。リンパ芽白血病細 胞の増殖を防止するようTdTの効果的抑制を達成するのに必要とされる投与量 は、主として処置される患者の状態に依存する。一般的方法は、先ず最初に少量 を投与し、次いで特定患者につき最適レベルが決定されるまで投与量を徐々に増 加させることからなっている。活性化合物を経口投与する場合は、非経口投与さ れる比較的少量でもたらされると同じレベルの白血病細胞増殖の抑制を与えるに は一般により多量の活性化合物が必要とされる。通常、単一の若しくは多重の投 与単位で投与される体重1JIg当り約104〜約500岬、好ましくは約10 19〜約25011Fの活性化合物は、白血病細胞の増殖を有効に防止し又は抑 制する。
本発明の好適化合物は、次式: によって示される6−(p−アミノアニロ)ウラシル及び6−(p−メトキシア ニロ)ウラシルである。
本発明を急性リンパ芽白血病の処置に関して上記したが、本発明の方法は通常T dTを発現しないが、個々の患者についてはTdTを発現する他の形態の白血病 にIIJIした患者を処置するにも使用することができる。たとえば、急性骨髄 芽白血病ミニ罹患した患者の約10%はTdT陽性細胞を有することが判明して いる。それより僅かに高い若しくは僅かに低い割合のTdT#、性細胞が、急性 の未分化白血病、慢性骨髄芽白血病、ポスト多血球ベラ白血病、ポスト骨髄芽異 形性白怖病又はぎスト化学療法/放射線療法白血病を有する患者に見ることがで き、これらを第1表に示す。
急性リンパ芽白血病 300 290 急性骨髄芽白血病 120 10 急性来分化白血病 60 16 慢性骨髄芽白血病 100 5B ポスト多血球症ベラ白血病 15 6 ボスト骨髄芽興形成白血届 16 10ポスト化学療法/放射線療法白血病 9 2安定相の慢性骨鮒芽白血病 50 0 B−細胞の慢性リンパ細胞白血病 15 0T−,1hlaの慢性リンパ細胞白 血病 30セザリ症候群 60 毛状細胞白皿病 90 多発性骨髄腫 70 本発明の活性化合物は、化合物そのものとして或いはたとえばナトリウム塩型若 しくはその他任意の塩型のような任意の医薬上許容しうる形態で投与することが できると理解すべきである。
以下の例により本発明を説明するが、これらのみに限定されない。
例I この伝は6−(p−アミノアニロ)ウラシルの製造方法を示している。t3tの モノアセチルアニリンHC1゜と(L5fの6−クロルウラシルとα9fの酢酸 ナトリウムとを15−のグリシン中で混合し、そして4時間還流サセタ。082 の固体生成@6−アセタミジルアニリノウラシルを回収した。この生成物α52 を2.5モルNaOHの50dと混合し、15分間室温で混合した。濾過により 0.4 t (90%収率)の6−(p−アミノアニロ)ウラシルが回収された 。
例■ この例は6−(p−メトキシアニtff)ウラシルの製造方法を示している。0 .5 Fの6−りpルウラシルとα9りのp−メトキシアニリンとを151のグ リシン中で4時間還流させた。生成物は濾過により94%収率で回収された。
例m コ(D fA)は、TdT活性に対する6−(p−アミノアニロ)ウラシルと6 −(p−メトキシアニロ)ウラシルとの抑制効果を示している。
TdTを均質化、イオン交換技術及びゲル濾過の順次の工程を用いる方法により 正常の牛胸腺から精製した[ボルム等、「The Enzymes J (アー ル・ディ・本−ザーM)、第145〜171頁、アカデミツク・プレス社、ニュ ーヨーク]。(105MのTrim −HCl (p HIIL 3 )と2m MのDDτとα6mMのMnC1意と10p2の牛血清アルブミン(BSA)と 1声tのオリゴ−dA14−11と10sMのHl−dGTP(d−)リホスフ エート)と蒸留水とからなる反応混合物の全量α1−中で、TdTを35℃にて 1時間分析した。用いる場合、6−アニリノウラシル誘導体は100ptの反応 混合物当り5μtのDMSOにおける種々の濃度で添加した。その他のDNA* リメラーゼ(”J β及びγ)はライト、バリル及びブラウンにより従前に記載 されたような標準的分析条件〔ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第8巻、第 1号、第99〜109頁(1980))を用いて分析した。
ヒーラ細胞、EL−4@胞、L1210細胞をRPMI培地において標準条件下 で懸濁細胞培養物として5%のCo、を含有する湿潤空気中にて37℃で増殖さ せた。これら細胞の特最終濃度のDMSOを用いて行なった。したがって、比較 細j!!は1%DMS Oの存在下に増殖させた。
1 細胞系統 供給源 TdT状態 ヒーラ ヒト 陰性 L1210 ねすみ 陰性 EL−4ねずみ 陽性 化合物cw1sc(6−(p−アミノアニレ)ウラシル〕を、予備加熱されたD MSO中の4(1mM保存溶液として調製した。この保存溶液を順次に希釈して 、1X10−’M〜lX10−5Mの範凹の操作抑制濃度を与えた。
抑制は、72時間後の比較培養物における生存細胞の個数を抑制剤に篇呈された 培養物中の個数と比較することにより測定した。化合物は次のように調製した: 下記の標準反応条件を用いて数種のウラシル同族体は200 pM濃度において TdT抑制を示さなかった(第■表)。使用した反応条件は上記した通りとした 。
第■表 名称 化合物 CMP 5H−dGMP inc。
GW−9E 6−74リノウラシk 10j50GW−7B −6−(ベンジル 7ミ/)つ5シk 12.780GW−7C6−(フェネチルアミノ)ウラシル  12.591GW−11D 6− (p−ブチルアニリノ)ウラシル 1(1 ,925GW−22E 6− (p−にニド四キシアニリノ)つry−7s、  21,760cw−16c 6−(p−アセタミドベンジルアミノ)ウラシル  14,1(50GW−1816−(シクロヘキシルアミノ)ウラシル 1444 2GW−20116−(シクロヘキシルメチルアミノ)ウラシル 1 %296 GW−18E 6−(s−ペンチルアミノ)ウラシル 11,674GW−17 B 6−(5’、4’−)リメチレンアニリノ)ウラシル 12.583GW− 22A 6−(イソーペンチy7ミノ)ウラシk 12.005GW−28A  6−(d−す7+#7ミ/)ウラシル 12.038GW−35E 6−(p− メトキシベンジル)−6−アミノウラシル j 198B比較として、2a1の 他の同族体はTdTの顕著な抑制を示した: aw−1sc 6− (p−アミノアニレ)ウラシル 5,198GW−17E  6−(p−1トキシアニロ)ウラシk 4980フエニル環のパラ位置におけ る置換は臨界的であると思われる。化合I#JGW−23A及6cw−2anは 抑制的でなかったが、構造的にはフェニル環上における置換基以外は構造的に同 様である: 6−(p−メトキシアニロ)ウラシル(GW−17E)及び6−(p−アミノア ニレ)ウラシル(cw−tic)に関する抑制曲線を第1図に示す。
GW−17K及びGW−18CのTdT活性の効果は特異的である。ヒーテ細胞 ボツメラーゼa、−及びγは40011M濃度では有効でなかった(第4表): DMSO比較 15,040 飄221 7,490 12.151GW−17 E 15.217 翫492 ス225 4,964GW−18CI&417  5.218 ス165 4102細胞増殖の抑制: ヒーラ細胞及びL102011飽の増殖は、40JltM11度においてさえG W−18Cによって抑制されない。これら系統の両者はTdT−陰性である。こ れに対し、400sM濃度において、GW−18CはTdT−陽性の系統EL− 4の増殖を抑制した。投与量反応曲線は、400pM濃度にて72時間で最大( 80%)の増殖抑制が見られた。
データは、成る種の置換6−アニリツウラシルがTdT活性を特異的に抑制し、 かつ培養物中のTdTQ性細胞の増殖を阻止しうろことを示している。丁dT活 性と74丁−陽性細胞の増殖との両者に対するこの薬剤誘発性の抑制は、この種 の置換6−アニリツウラシルの幾つかが〒dT−陽性のヒト及び動物の腫瘍病の 臨床治療に有用であることを示している。さらに、これらの抑制剤を使用して、 正常なリンパ細胞個体発生におけるTdTの機能を切除することができる。
かくして、本出願人は、アミノ若しくは0−メチル基のいずれかをフェニル環の バラ位置中へ導入すれば、TdT酵素の特異的かつ有力な抑制剤である化合−な 生゛成することを示した。この研究の一重要な結−は、上記したようにバラ−フ ェニル位亀に何らかの置換を行なえばTdT特異性を有する筈であるということ である。
本発明の一局面において、患者の骨髄細胞の試料を取出し、これを本発明の化合 物と共に培養してTdTを失活させることにより患者を処理することができる。
次いで、細胞を約−90℃で貯蔵し、そ゛して致死投与量の放射線に露呈させる 。次いで、細胞を思考の骨1中に再導入する。この一般的手順はオー)1−ガス 骨髄潅流として知られ、当業者で周知されている。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 一 細胞が末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを発現する成る種の 白血病に罹患したヒト患者を処置するに際し、患者に対し式: 〔式中、XはC1〜C1・アルコキシ若しくはアミノであり、TdTの選択的抑 制に対し有効である〕の化合物又はその医薬上許容しうる形を生体内における前 記細胞の増殖を阻止するのに有効な量で投与することを特徴とするヒト患者の処 置方法。 ! 活性化合物が6−(p−アミノアニa)ウラシルである請求の範囲第1項記 載の方法。 五 活性化合物が6−Cp−メトキシアニロ)ウラシルである請求の範囲第1項 記載の方決。 〔式中、XはC1〜C1・アルコキシ若しくはアミノであり、かつDNAを生産 するTdTの選択的抑制に対し有効である〕 の化合物。 4 化合物6−Cp−アミノアニ四)ウラシル。 4 化合物!−(p−メトキシア二a)ウラシル。 7、 細胞が末端デオキシヌタレオチジルトランクエラーゼを発現する成る種の 白血病に罹患したヒト患者を処置するに際し、骨髄細胞を患者から取出し、この 取出された細胞を請求の範囲第4項記載の化合物と共に培養して、末端デオキシ ヌタレオチジルトランス7エラーゼを失活させ、前記細胞を放射線に露呈させて 細胞を死滅させ、かつ前記照射されたsinを前記患者の骨髄中へ再導入するこ とを特徴とするヒト患者の処置方法。 龜 化合物が6−(P−アミノアニー)ウラシルである請求の範囲第7項記載の 方法。 9 化合物が6−(p−メトキシアニν)ウラシルであ
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