JPS58500947A - 末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフエラ−ゼ活性を抑制する組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 末端デオキシリボヌクレオチ ゛　ジルトランスフェラーゼ活性 を抑制する組成物及び方決 本発明は末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＴｄＴ）の活性 を抑制する組成物及び方法に関するものである〇 現在、細胞中におけるＤＮＡの生産を促進するよう機能する４種類の哺乳類ＤＮ Ａポリメラーぞが存在する。

ぽ、β若しくはｙＤＮＡポリメラーゼとして知られる３種のＤＮＡポリメラーゼ は、鋳型組によって支配されるワトソンークリック塩基対規則に従がってプライ マー鎖の３−プライム−ＯＨ末端にモノホスフェート残基な付加することにより プライマー鎖に対する基質の付加を行なうためには、ＤＮＡの鋳型鎖とＤＮＡの プライマー鎖とを必要とする。これらのＤＮＡｆｆリメラーゼは複製ＤＮＡポリ メラーゼとして知られている。ＴｄＴポリメラーゼは、合成を開始するための単 −釦のＤＮＡ１１！始分子のみを必要とする点において複製ＤＮＡポリメラーゼ とは異なっている。ＴｄＴは、鋳型の不存在下においてオリゴ若しくはポリデオ キシリボヌクレオチド開始剤の３−プライム−ＯＨ末端に対するデオキシリボヌ クレオチドの重合を触蝶する。

通常の条件下において、ＴｄＴは胸腺及び骨髄のみに存在し、最高濃度は胸腺ｍ 胞に見られる。この観蒙から、ＴｄＴは少なくともＴ−細胞において免疫分化に 役割を演すると推定されている。さらに、マツフカ７り一等によって、ＴｄＴは リンパ芽白血病細胞に存在することが報告されている（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、 Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、ＵＳＡ％第７０４．第２号、第５２１〜５２５頁、（１９ ７５年２月）〕。さらに、ＴｄＴは骨髄芽白血病ａ胞又はリンパ肉腫細胞白血病 には存在しないことも見出されている。急性りンバ芽白血病を有する全ての患者 がＴｄＴに対する試験に陽性であるとは限らないが、大多数、すなわちこの種の 患者の約９５％がＴｄＴに対する試験に陽性である。したがって、慣用の生化学 的技術、或いはＴｄＴ標識に対する蛍光性抗体標識技術を使用して、患者におけ る急性リンパ芽白血病ｉｏ＋ａの存在又は不存在を決定するための少なくとも予 備試験を行なうことができる。

グラム陽性細菌のｖＩ製を抑制するため、ｉｌＩ製ＤＮｈｉリメラーゼの選択的 抑制剤を使用することが提案されている。６−（アリールヒドラジノ）及び６− （アリールアミノ）ウラシルは、細菌性ＤＮＡポリメラーゼｌを抑制することに よりＤＮＡ複製の選択的抑制剤になることが判明した。このメカニズムはウラシ ル部分の直換基と鋳型シトシンとの特定の対比及びポリメラーゼに対する６−ア リール基及びその置換基の結合を含み、それによりポリメラーゼを比較的安定な 蛋白質：薬剤コンプレックスに封鎖することを含むと信じられる。グラム陽性細 菌のｌ！！素−膳型ポリメラーゼの狭いスペタトルのみがこれらのウラシル抑制 剤に鋭敏であることが判明した。これは、ポリメラーゼ璽が活性部位の近くの臨 界的個所に独特のアリール部位を有し、この部位が強力に６−アリール部分を結 合するからである。化合物６−（Ｐ−！ｌ−ブチルアニリノ）ウラシルはヒーラ 白面病細胞のＤＮＡ＆９メラーゼＣの特異的抑制剤であり、かつ生体内において ヒーラ細胞分裂及びＤＮＡ合成の選択的抑制剤となることが示されている。その 他の哺乳類細胞のＤＮＡポリメラーゼは、この化合物により抑制されない。

生体内若しくは試験管内でリンパ芽白血病細胞の増殖を抑制し及び（又は）破壊 なもたらすため、ＴｄＴの抑制剤を提供することが望ましい。

発明の要約 本発明は式： 〔式中、Ｘは０１〜Ｃ！−のアルコキシ又はアミノである〕を有する化合物はＤ ＮＡを生産するＴｄＴの選択的抑制に有効であるという知見に基づいている。本 発明のこの新規化合物は、６−バロウラシルを式： 〔式中、Ｙはたとえば塩化水素のような可溶化部分である〕 の化合物と反応させることにより製造される。

特定具体例の詳細な説明 本発明は式： 〔式中、ＸはＣ１−ＶＣｌ、アルコキシ又はアミノであり、かつＤＮＡを生産す るためのＴｄＴの選択的抑制に有効である〕 を有する新規な化合物を提供する。

本発明の化合物は、６一ハｐウラシル化合物を式：〔式中、Ｙはたとえば塩化水 素のような可溶化部分である〕 の化合−と反応させることにより製造される。この反応は、たとえばグライムな どのような不活性溶剤中において反応混合物を還流させる条件下で行なわれる。

通常、反応は約３〜約８時間、好ましくは約已５〜約４，５時間で行なわれる。

次いで、反応混合物を回収し、かっこの反応混合物から反応生成物が沈澱するよ うな温度まで冷却し、たとえば濾過によって回収する。次いで、固体反応生成物 をたとえば再結晶化によって精製することができる。

本発明の化合物は、急性リンパ芽白血病（ｊｋＬＬ）に罹患した患者の治療処置 に有用であり、かつ単独で又は医薬上許容しうるキャリヤと組合せて投与するこ とができる。キャリヤに対する活性成分の割合は、化合物の溶解度及び化学特性 、選択される投与経路及び線準的医薬慣行によって決定される。活性化合物は経 口的、非経口的又は静脈内で投与することができる。たとえば、活性化合物はた とえば乳糖、クエン酸ナトリウム、縦酸カルシウム又は燐酸二カルシウムのよう な補形薬と共に錠剤形態として投与することができる。たとえば澱粉、ア次ギン 酸又は成る種の錯体シリケートのような種々の崩壊剤な、たとえば−ステアリン 酸マダネシウム、アリール硫酸ナトリウム又はタルクのような滑剤と共に使用す ることもできる。カプセル型の経口投与については、適する材料は高分子量ポリ エチレングリコールにおける乳糖な包含する。水性懸濁物を使用する場合、活性 化合物は乳化剤及び（又は）懸濁剤と組合せる。たとえばエタノール、水、プロ ピレングリフール、グリセリン、グリシンなどの液体キャリヤを使用することが できる。非経口投与には、活性化合物の溶液をたとえばグルコース又は食塩のよ うな他の溶解質と組合せて使用することができる。

この種の水溶液は適当に緩機化して、等優性にすべきである。リンパ芽白血病細 胞の増殖を防止するようＴｄＴの効果的抑制を達成するのに必要とされる投与量 は、主として処置される患者の状態に依存する。一般的方法は、先ず最初に少量 を投与し、次いで特定患者につき最適レベルが決定されるまで投与量を徐々に増 加させることからなっている。活性化合物を経口投与する場合は、非経口投与さ れる比較的少量でもたらされると同じレベルの白血病細胞増殖の抑制を与えるに は一般により多量の活性化合物が必要とされる。通常、単一の若しくは多重の投 与単位で投与される体重１ＪＩｇ当り約１０４〜約５００岬、好ましくは約１０ １９〜約２５０１１Ｆの活性化合物は、白血病細胞の増殖を有効に防止し又は抑 制する。

本発明の好適化合物は、次式： によって示される６−（ｐ−アミノアニロ）ウラシル及び６−（ｐ−メトキシア ニロ）ウラシルである。

本発明を急性リンパ芽白血病の処置に関して上記したが、本発明の方法は通常Ｔ ｄＴを発現しないが、個々の患者についてはＴｄＴを発現する他の形態の白血病 にＩＩＪＩした患者を処置するにも使用することができる。たとえば、急性骨髄 芽白血病ミニ罹患した患者の約１０％はＴｄＴ陽性細胞を有することが判明して いる。それより僅かに高い若しくは僅かに低い割合のＴｄＴ＃、性細胞が、急性 の未分化白血病、慢性骨髄芽白血病、ポスト多血球ベラ白血病、ポスト骨髄芽異 形性白怖病又はぎスト化学療法／放射線療法白血病を有する患者に見ることがで き、これらを第１表に示す。

急性リンパ芽白血病　３００　２９０ 急性骨髄芽白血病　１２０　１０ 急性来分化白血病　６０　１６ 慢性骨髄芽白血病　１００　５Ｂ ポスト多血球症ベラ白血病　１５　６ ボスト骨髄芽興形成白血届　１６　１０ポスト化学療法／放射線療法白血病　９ ２安定相の慢性骨鮒芽白血病　５０　０ Ｂ−細胞の慢性リンパ細胞白血病　１５　０Ｔ−，１ｈｌａの慢性リンパ細胞白 血病　３０セザリ症候群　６０ 毛状細胞白皿病　９０ 多発性骨髄腫　７０ 本発明の活性化合物は、化合物そのものとして或いはたとえばナトリウム塩型若 しくはその他任意の塩型のような任意の医薬上許容しうる形態で投与することが できると理解すべきである。

以下の例により本発明を説明するが、これらのみに限定されない。

例Ｉ この伝は６−（ｐ−アミノアニロ）ウラシルの製造方法を示している。ｔ３ｔの モノアセチルアニリンＨＣ１゜と（Ｌ５ｆの６−クロルウラシルとα９ｆの酢酸 ナトリウムとを１５−のグリシン中で混合し、そして４時間還流サセタ。０８２ の固体生成＠６−アセタミジルアニリノウラシルを回収した。この生成物α５２ を２．５モルＮａＯＨの５０ｄと混合し、１５分間室温で混合した。濾過により ０．４　ｔ　（９０％収率）の６−（ｐ−アミノアニロ）ウラシルが回収された 。

例■ この例は６−（ｐ−メトキシアニｔｆｆ）ウラシルの製造方法を示している。０ ．５　Ｆの６−りｐルウラシルとα９りのｐ−メトキシアニリンとを１５１のグ リシン中で４時間還流させた。生成物は濾過により９４％収率で回収された。

例ｍ コ（Ｄ　ｆＡ）は、ＴｄＴ活性に対する６−（ｐ−アミノアニロ）ウラシルと６ −（ｐ−メトキシアニロ）ウラシルとの抑制効果を示している。

ＴｄＴを均質化、イオン交換技術及びゲル濾過の順次の工程を用いる方法により 正常の牛胸腺から精製した［ボルム等、「Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　Ｊ　（アー ル・ディ・本−ザーＭ）、第１４５〜１７１頁、アカデミツク・プレス社、ニュ ーヨーク］。（１０５ＭのＴｒｉｍ　−ＨＣｌ　（ｐ　ＨＩＩＬ　３　）と２ｍ ＭのＤＤτとα６ｍＭのＭｎＣ１意と１０ｐ２の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と １声ｔのオリゴ−ｄＡ１４−１１と１０ｓＭのＨｌ−ｄＧＴＰ（ｄ−）リホスフ エート）と蒸留水とからなる反応混合物の全量α１−中で、ＴｄＴを３５℃にて １時間分析した。用いる場合、６−アニリノウラシル誘導体は１００ｐｔの反応 混合物当り５μｔのＤＭＳＯにおける種々の濃度で添加した。その他のＤＮＡ＊ リメラーゼ（”Ｊ　β及びγ）はライト、バリル及びブラウンにより従前に記載 されたような標準的分析条件〔ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第８巻、第 １号、第９９〜１０９頁（１９８０））を用いて分析した。

ヒーラ細胞、ＥＬ−４＠胞、Ｌ１２１０細胞をＲＰＭＩ培地において標準条件下 で懸濁細胞培養物として５％のＣｏ、を含有する湿潤空気中にて３７℃で増殖さ せた。これら細胞の特最終濃度のＤＭＳＯを用いて行なった。したがって、比較 細ｊ！！は１％ＤＭＳ　Ｏの存在下に増殖させた。

１ 細胞系統　供給源　ＴｄＴ状態 ヒーラ　ヒト　陰性 Ｌ１２１０　ねすみ　陰性 ＥＬ−４ねずみ　陽性 化合物ｃｗ１ｓｃ（６−（ｐ−アミノアニレ）ウラシル〕を、予備加熱されたＤ ＭＳＯ中の４（１ｍＭ保存溶液として調製した。この保存溶液を順次に希釈して 、１Ｘ１０−’Ｍ〜ｌＸ１０−５Ｍの範凹の操作抑制濃度を与えた。

抑制は、７２時間後の比較培養物における生存細胞の個数を抑制剤に篇呈された 培養物中の個数と比較することにより測定した。化合物は次のように調製した： 下記の標準反応条件を用いて数種のウラシル同族体は２００　ｐＭ濃度において ＴｄＴ抑制を示さなかった（第■表）。使用した反応条件は上記した通りとした 。

第■表 名称　化合物　ＣＭＰ　５Ｈ−ｄＧＭＰ　ｉｎｃ。

ＧＷ−９Ｅ　６−７４リノウラシｋ　１０ｊ５０ＧＷ−７Ｂ　−６−（ベンジル ７ミ／）つ５シｋ　１２．７８０ＧＷ−７Ｃ６−（フェネチルアミノ）ウラシル 　１２．５９１ＧＷ−１１Ｄ　６−　（ｐ−ブチルアニリノ）ウラシル　１（１ ，９２５ＧＷ−２２Ｅ　６−　（ｐ−にニド四キシアニリノ）つｒｙ−７ｓ、　 ２１，７６０ｃｗ−１６ｃ　６−（ｐ−アセタミドベンジルアミノ）ウラシル　 １４，１（５０ＧＷ−１８１６−（シクロヘキシルアミノ）ウラシル　１４４４ ２ＧＷ−２０１１６−（シクロヘキシルメチルアミノ）ウラシル　１　％２９６ ＧＷ−１８Ｅ　６−（ｓ−ペンチルアミノ）ウラシル　１１，６７４ＧＷ−１７ Ｂ　６−（５’、４’−）リメチレンアニリノ）ウラシル　１２．５８３ＧＷ− ２２Ａ　６−（イソーペンチｙ７ミノ）ウラシｋ　１２．００５ＧＷ−２８Ａ　 ６−（ｄ−す７＋＃７ミ／）ウラシル　１２．０３８ＧＷ−３５Ｅ　６−（ｐ− メトキシベンジル）−６−アミノウラシル　ｊ　１９８Ｂ比較として、２ａ１の 他の同族体はＴｄＴの顕著な抑制を示した： ａｗ−１ｓｃ　６−　（ｐ−アミノアニレ）ウラシル　５，１９８ＧＷ−１７Ｅ 　６−（ｐ−１トキシアニロ）ウラシｋ　４９８０フエニル環のパラ位置におけ る置換は臨界的であると思われる。化合Ｉ＃ＪＧＷ−２３Ａ及６ｃｗ−２ａｎは 抑制的でなかったが、構造的にはフェニル環上における置換基以外は構造的に同 様である： ６−（ｐ−メトキシアニロ）ウラシル（ＧＷ−１７Ｅ）及び６−（ｐ−アミノア ニレ）ウラシル（ｃｗ−ｔｉｃ）に関する抑制曲線を第１図に示す。

ＧＷ−１７Ｋ及びＧＷ−１８ＣのＴｄＴ活性の効果は特異的である。ヒーテ細胞 ボツメラーゼａ、−及びγは４００１１Ｍ濃度では有効でなかった（第４表）： ＤＭＳＯ比較　１５，０４０　飄２２１　７，４９０　１２．１５１ＧＷ−１７ Ｅ　１５．２１７　翫４９２　ス２２５　４，９６４ＧＷ−１８ＣＩ＆４１７　 ５．２１８　ス１６５　４１０２細胞増殖の抑制： ヒーラ細胞及びＬ１０２０１１飽の増殖は、４０ＪｌｔＭ１１度においてさえＧ Ｗ−１８Ｃによって抑制されない。これら系統の両者はＴｄＴ−陰性である。こ れに対し、４００ｓＭ濃度において、ＧＷ−１８ＣはＴｄＴ−陽性の系統ＥＬ− ４の増殖を抑制した。投与量反応曲線は、４００ｐＭ濃度にて７２時間で最大（ ８０％）の増殖抑制が見られた。

データは、成る種の置換６−アニリツウラシルがＴｄＴ活性を特異的に抑制し、 かつ培養物中のＴｄＴＱ性細胞の増殖を阻止しうろことを示している。丁ｄＴ活 性と７４丁−陽性細胞の増殖との両者に対するこの薬剤誘発性の抑制は、この種 の置換６−アニリツウラシルの幾つかが〒ｄＴ−陽性のヒト及び動物の腫瘍病の 臨床治療に有用であることを示している。さらに、これらの抑制剤を使用して、 正常なリンパ細胞個体発生におけるＴｄＴの機能を切除することができる。

かくして、本出願人は、アミノ若しくは０−メチル基のいずれかをフェニル環の バラ位置中へ導入すれば、ＴｄＴ酵素の特異的かつ有力な抑制剤である化合−な 生゛成することを示した。この研究の一重要な結−は、上記したようにバラ−フ ェニル位亀に何らかの置換を行なえばＴｄＴ特異性を有する筈であるということ である。

本発明の一局面において、患者の骨髄細胞の試料を取出し、これを本発明の化合 物と共に培養してＴｄＴを失活させることにより患者を処理することができる。

次いで、細胞を約−９０℃で貯蔵し、そ゛して致死投与量の放射線に露呈させる 。次いで、細胞を思考の骨１中に再導入する。この一般的手順はオー）１−ガス 骨髄潅流として知られ、当業者で周知されている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一　細胞が末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを発現する成る種の 白血病に罹患したヒト患者を処置するに際し、患者に対し式： 〔式中、ＸはＣ１〜Ｃ１・アルコキシ若しくはアミノであり、ＴｄＴの選択的抑 制に対し有効である〕の化合物又はその医薬上許容しうる形を生体内における前 記細胞の増殖を阻止するのに有効な量で投与することを特徴とするヒト患者の処 置方法。 ！　活性化合物が６−（ｐ−アミノアニａ）ウラシルである請求の範囲第１項記 載の方法。 五　活性化合物が６−Ｃｐ−メトキシアニロ）ウラシルである請求の範囲第１項 記載の方決。 〔式中、ＸはＣ１〜Ｃ１・アルコキシ若しくはアミノであり、かつＤＮＡを生産 するＴｄＴの選択的抑制に対し有効である〕 の化合物。 ４　化合物６−Ｃｐ−アミノアニ四）ウラシル。 ４　化合物！−（ｐ−メトキシア二ａ）ウラシル。 ７、　細胞が末端デオキシヌタレオチジルトランクエラーゼを発現する成る種の 白血病に罹患したヒト患者を処置するに際し、骨髄細胞を患者から取出し、この 取出された細胞を請求の範囲第４項記載の化合物と共に培養して、末端デオキシ ヌタレオチジルトランス７エラーゼを失活させ、前記細胞を放射線に露呈させて 細胞を死滅させ、かつ前記照射されたｓｉｎを前記患者の骨髄中へ再導入するこ とを特徴とするヒト患者の処置方法。 龜　化合物が６−（Ｐ−アミノアニー）ウラシルである請求の範囲第７項記載の 方法。 ９　化合物が６−（ｐ−メトキシアニν）ウラシルであ