JPH05504940A - ３’―アジド―２’，３’―ジデオキシ―５―メチルシチジン抗ウィルス性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３°−アジド−２’　、　３’−ジデオキシ−５−メチルシチジンウィルス性 及豆旦！１ 本発明は薬学的な輸送（ｄｅｌ　１ｖｅｒｙ）系におけるものであり、特に、ヒ ト免疫不全ウィルスの感染の阻害のために、３−アジド−２°、３−ジブオキ／ −５−メチルシチジンおよびその組成物を用いることに関する。

米国政府は、Ｖｅｔｅｒａｎｓ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｒｉｔ　 Ｒｅｖｉｅｗ　Ａｖａｒｄから生じる本発明における権利を有する。

これは、Ｃｈｕｎｇに、ＣｈｕおよびＲａｙ＋＊ｏｎｄ　Ｆ、５ｃｈｉｎａｚｉ によって１９８９年６月７日に提出された−３−Ａｚｉｄｏ−２°、　３−Ｄｅ ｏｘｙ−５−ＭｅｔｈｌＣｙｔｉｄｉｎｅ”というタイトルの米国特許出願第０ ７７３６２．７５６号の一部継続出願であり、それは１９８８年２月２３日に提 出された°２’、３−Ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉ −Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｃｏ＋＊ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄＴｈｅｉｒ　Ｍ ｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ−というタイトルの米国特許出願第 ０７７１５９．２４６号の一部継続出願であり、それは（１）米国特許出願第０ ７１０１６．１３６号および（２）米国特許出願第０７／１０４．４３８号の一 部継続出願である。この（１）の米国特許出願第０７７０１６．１３６号は、Ｃ ｈｕｎｇ　Ｋ、ＣｈｕおよびＲａｙｍｏｎｄ　Ｆ、５ｃｈｉｎａｚｉによって１ ９８７年２月１８日に提出された”　２’　、　３’　−Ｄｉｄｅｏｘｙ−５− Ｓｕｂｓｔｉ　ｔｕｔｅｄ　ｔｌｒｉｄｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｃ ｏｍｐｏｕｎｄｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ａｇｅｎｔｓ−というタイトル の出願であり、それはＣｈｕｎｇに、ＣｈｕおよびＲａｙｍｏｎｄ　Ｆ、５ｃｈ ｉｎａｚｉによって１９８６年５月１日に提出された米国特許出願第０６７８５ ７．９４７号、現在の米国特許第４，６８１．９３３号である。上記（２）の米 国特許出願第０７７１０４．４３８号は、Ｃｈｕｎｇ　Ｋ、ＣｈｕおよびＲａ！ ｍｏｎｄＦ、　５ｃｈｊｎａｚｉによって１９８７年１０月２日に提出された− ３−Ａｚｉｄｏ−２゛、３°−Ｄｉｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ　Ａｎｔｉｖｉｒ ａｌ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ−というタイトルの出願であり、それは”３−Ａ ｚｉｄｏ−２°、　３−Ｄｉｄｅｏｘｙｐｙｒｉｕ＋１ｄｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｒ ｅ１ａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ａｇｅｎｔｓ ＋というタイトルの１９８７年１月２８日に提出された米国特許出願第０７１０ ０７．４７３号、現在の米国特許第４．９１６．１２２号である。

エイズは１９７９年という早期に認められた。Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓ ｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）に報告された事例の数は、その時以来、年 々劇的に増加し、１９８２年には、ＣＤＣはエイズを新しい伝染病であると言明 した。この時点では、エイズは一般的にレトロウィルス、すなわち、ヒト免疫不 全ウィルス（旧ｖ−１）による感染の結果生じると容認されている。これらのウ ィルスに対する抗体は、エイズまたは前エイズ症候群を有すると診断された患者 の８０％を越えて存在し、そしてそれは、同定されたリスクグループにおいて高 頻度で見られた。

患者は、一般に障害されたＴ細胞免疫を引き起こすとき、エイズを有すると診断 され、通常、１８か月から３年にわたって見られる。この傷害された免疫の結果 として、この患者は日和見感染症、種々のタイプの癌（例えば、カボージ肉履） 、および免疫系の機能が減退したことに関連する他の疾患に、感染しやすくなる 。

旧Ｖはレトロウィルスである。レトロウィルスの遺伝物質は、たいていの生物に おいて、ＤＮＡではなく、一本鎖ＲＮＡであり、そしてそれは、ひとまとめにし て逆転写と呼ばれる２つの酵素（ポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼ）による 、コードされているタンパク質の発現によって２本＠　ＤＮＡに変換される。

次いで、このＤＮＡは、細胞の遺伝子に組み込まれ、そこに永久に組み込まれた ままとなるか、または、ウィルスの複製によってタンパク質が発現する。このウ ィルスは優先的にＴ４リンパ球、すなわち、免疫系のあるサプセ７トに感染する 。しがし、それはまた、神経系および腸およびある種の骨髄細胞中で細胞に感染 する。このウィルスは数年間潜伏したままでいるか、あるいは宿主細胞を破壊し て速やかにｗＬ製される。

このウィルスに対して個体にワクチンを接種する努力、お・よび感染プロセスを 妨げるための努力がなされているが、現在使用されているほとんどの化合物は、 ウィルスの核酸の複製を標的するのに用いられている。以下を含む多くの化合物 が、このウィルスに対して抗ウィルス活性を有することが見いだされた：　ＨＰ Ａ−２３、インターフェロン、リバビリン、糸スホノフォルメート、アンサマイ シン（ａｎｓａｍｙ＋ｊｎ）　、スラミン、イムチオール（ｉｍｕｔｈｉｏｌ） 　、ペニシラミン、リファブチン（ｒｉｆａｂｕｔｊｎ）、ＡＩ、−７２１，３ −アジド−３−デオキシチミジ７　（ＡＺＴ）、および他の２°、３°−ジデオ キシヌクレオシド〈例えば、２゛、３゛−ジデオキシシチジン（ＤＤＣ）　、２ ′、ｒ−ジデオキシアデノシン（ＤＤＡ）、３−アジド−２°、３゛−ジデオキ シウリジン（ＡｚｄｄＵ）、２’、３’−ジデヒドロシチジン、３゛−デオ牛シ ー２°、３−ジデヒドロチミジンおよび′３−アジドー５−エチルー２゛、３° −ジデオキシウリジン（ＡｚｄｄＵ）　）。

一般に、このような薬剤以外のウィルスの複製阻害剤は、通常、宿主に対しても かなり毒性がある。たいていのこれまでに発見された抗ウイルス性薬剤は、毒性 があるので、長期間は処方され得ない。インビボで毒性、特に長期間の毒性を防 ぐことは困難である。

例えば、ＡＺＴは、初めに、インビトロで試験したときは毒性はないと考えられ たが、その後、数か月間投与した場合、骨髄毒性を有することが確認された。Ａ ＺＴ関連の血液学上の異常のために、ＡＺＴ療法を行なわれている患者の２１％ は、６か月の治療の間、多数回の輸血が要求されることをＲｉｃｈｍａｎらは示 している。骨髄の減少は、細胞内のホスホリル化されたＡＺＴの蓄積によって起 こり得、そして、これはチミジン５°−トソホスフェートプールの実質的な減少 によって起こり得る。ＡＺＴの他の欠点はヒトにおいて半減期が短い（約１．１ 時間）こと、そして３°−アジド−３−デオキシ−５°−グルクロニルチミジン （実質的に抗ウィルス活性を有さない代謝産物）として尿中に排泄されることで ある。

この試験システムに依存してデータの有効性に関する意見が異なるが、インビト ロで抗ウィルス活性を宵するものとして、多くの化合物が報告されてきた。これ らの化合物が、インベスティゲイシ１ナル　ニニー　ドラッグ　ライセンス（Ｉ ｒ＋ｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ　Ｎｅｗ　Ｄｒｕｇ　Ｌｉｃｅｎｓｅ）の適用 を検討される前に、食品医薬８局は、インビボでの毒性試験を行うことおよび薬 物動慇の研究データを要求する。このデータに基づいて、ある化合物はエイズの 治療に有用であるという予想、あるいは、これらの研究が行われるとすぐにただ 処分されるべきであるということの予想が何度もなされている。例えば、Ｃｈｕ らにより、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　３２．６１２−６１７（１９８９年２ 月）において、ＡＺＴに関する多くのピリミジンヌクレオチドが、インビトロで 旧Ｖに対して活性を有し、そしてヒトの末梢血単核細胞においてインビトロで毒 性を制限するということが報告された。彼らは、いくつかの物質が特に有望であ り、それらは下のものを包含することを示している：３°−アジドー２°、３゛ −ジデオ牛シウリジ７　（ＡＺｄｄＵ）、３′−アジド−５−エチｔｋ−２’、 ’３°−ジデオ牛シウリジン、および３−アジド−２°５３−ジデオキシシチジ ン（ＡｚｄｄＣ）およびその５−メチル類似物（ＡｚｄｄＭｅＣ）。残念なこと に、その後の試験により、最後の化合物以外には、ヒトの顆粒球マクロファージ 前駆細胞のコロニー形成を測定するアッセイを用いることにより、インビトロで 、毒性がある七いうことが、証明された。特に、ＡｚｄｄｌＪは、実質的にＡＺ Ｔより強い毒性があるということが決定された。例えば、ＡＺＴは、１ｍＭのＡ ＺＴで細胞の５０％の減少を引き起こし、Ａ　ｚｄｄＣは、８０％の減少を引き 起こし；両者ともｌｏｍＭで細胞の１００％を殺した。

不可能でないなら、インビトロのデータに基づいて、化合物の生物学的利用能、 半減期、安定性、および代謝を予期することもまた困難である。毒性がなく、イ ンビボで抗ウィルス活性を示す化合物の多くは、不活性な化合物に速やかに代謝 されるか、または有用でないような短い半減期を有する。

結果として、インビボのデータだけで、エイズの治療において、その化合物が有 用でないことを予期し得る。さらに、生物学的利用能および代謝の情報だけで、 その化合物の投与の用量および時間および手段を正確に決定し得る。

エイズの治療に関する莫大な量の調査にもかかわらず、エイズはまだ不治の病で ある。ＨＩＶで感染された患者は、まだ治癒の希望はない。あるいは、長期間、 安全でかつ効果があると証明されたいかなる薬もまだない。

それゆえ、本発明の目的は、感染していない細胞に対して低い毒性を有する、新 しい抗ウイルス性組成物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、）ＩＩＶ−１および他の関連のレトロウィルスの複製 を阻害するための組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ＨＩＶ−１および他のレトロウィルスによる感染の 予防および治療の方法を提供することである。

（以下余白） 旦コヱど」！ 次の一般式の活性化合物の旧Ｖ阻害量を輸送する（ｄｅｌｉｖｅｒ）、薬学的に 受容され得る担体中の抗ウィルス性組成物：ここで、ＲはＯＨ，モノホスフェー ト、ジホスフェート、マたはトリホスフェート、または薬学的に受容され得るそ れらの塩である。この組成物は、ＡＺＴの２倍から３倍の半減期を有すること、 細胞内でＡＺＴに変換すること、および優先的に末梢血単核細胞によって取り込 まれることが発見されたので、この組成物は少ない頻度で、そしてＡＺＴより高 い用量で投与され得、毒性を与えることなく、より大きな効果を達成する。この 組成物の他の利点は、低い細胞毒性とともに、非常に選択的な抗レトロウイルス 活性を有することである。この化合物は、１ｆｆｌ純ヘルペスウイルスまたはフ クサフキーウィルスＢ４に対しては活性がなく、そして、ただ、フレンド白血病 ウィルス（フレンドネズミレトロウイルス；　Ｆｒ１ｅｎｄ　ｍｕｒｉｎｅ　ｒ ｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）に対して、弱い活性がある。もっとも重要なことは、１０ ０μＭまでで試験した場合、赤血球の前駆細胞に対して毒性ｌｉ旦見皿至旦里 図１は、ヒトの顆粒球マクロファージ前駆細胞のコロニー形成に基づく、３−ア ジド−３−デオ牛ンチミジン（ＡＺＴ）　、３゜−アジド−２゛、３−ジデオキ シウリジン（Ａｚｄｄｔｌ）、３゛−アジド−５−エチル−２”、３−ジデオキ シウリジン（ＡｚｄｄＥＵ）および３−アジド−２°、３−ジテオキシ−５−メ チルシチジン（ＡｚｄｄＭｅＣ）の関連効果を示すグラフである。

図２は、ラットにおいて時間の経ｉ５（時間）にょるＡｚｄｄＭｅＣの血漿濃度 （ｍｇ／ｍｌ）を比較するグラフである。（０）は１０ｍｇ／ｋｇ；　（ロ）は ５０ａ＋ｇ／ｋｇ；および（△）はＩＧＧｍｇ／ｋｇノ用量の静脈内投与である 。

Ｅ　図３Ａ、図３Ｂ、および図３ｃは、ＡｚｄｄＭｅｅの用量の関数（ｍｇ／ｋ ｇ）としての、総クリアランス（Ａ）、腎クリアランス（Ｂ）、および非腎クリ アランス（Ｃ）のグラフである。横線は平均値を示す。（０）はｌｏｍｇ／ｋｇ ；　（ロ）はＳｏＩＩｇ／ｋｇ；および（△）は！（ｌＱａ＋ｇ／ｋｇの用量の 静脈内投与である。

図４は、ＡｚｄｄＭｅＣのＡｚＴへの細胞内変換、次いで、ＡＺＴ−ＭＰへの細 胞内変換を図で示しており、これはヒト血液単核細胞を用い、放射線標識された ＡＺＴおよびＡｚｄＭｅＣ（４μＭ、６時間）の取り込み量を比較したものであ る。

図５Ａおよび５Ｂは、ＰＢＭ細胞にょるＡｚｄｄＭｅＣ（図５Ａンの優先的な取 り込みを、ＡＺＴ（図５Ｂ）と比較して（１０μＭで３７℃で６時間インキュベ ートした）、説明している。

図６は、インビトロでＰＢＭ細胞および骨髄細胞におけるＡｚｄｄＭｅｃの生体 内変換（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の想定されるメカニズムを図で示してい る。

１にユ皿工且皿 薬学的に受容され得る担体中の、次の一般式を宵する３−アジド−２°、３−ジ デオ牛シー５−メチルノチジンを、活性成分が約０．２〜４０μＭの血中１度に 到達するように、１日につき２〜３回患者に投与する： ここで、Ｒは、ＯＨ，モノホスフェート、ジホスフェート、マたはトリホスフェ ート、および薬学的に受容され得るそれらの塩である。好ましい４度の範囲は、 ０．２〜２０（、ｔＭであり、そして最も好ましくは、約１〜１０μＭである。

これは１日当り体重１ｋｇに付き１〜６０ミリグラムの化合物を投与することと 等しい。

本発明は、３−アジド−２°、３−ジデオ牛ノー５−メチルシチジン（Ａｚｄｄ ＭｅＣ）およびホス十すル化されたそれらの誘導体が旧■に対して非常に選択的 な活性を有するが、同時に、正常の、感染していない細胞に対して非常に低い毒 性を示すという発見に加えて、延長された半減期、単核血液細胞による優先的な 取り込み、およびＩ（Ｉｖに対してインビボで効果があることが知られているＡ ＺＴへの細胞内変換という事柄に基づいている。

３−アンド−２゛、３−ジテオキシ−５−メチルンチジンは、既知の化合物であ る。例えば、ＬｊｎらのＪ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、２６．１５９１−１５９５（１ ９８３）を参照せよ。Ｌｉｎらは、インビトロでＬ１２１０および肉腫１８０細 胞に対するＡｚｄｄＭｅＣの活性を試験し、そして、この化合物および３−アジ ド−２’、３’−ジデオキシシチジン（ＡｚｄｄＣ）が、両細胞系に対して不活 性で坐ることを発見した。Ｌｉｎらにより、３゛−アンド−２°、３−ジデオキ ／ンチンンは、Ｌ１２１０細胞から単離された２種の特定の酵素に対して単にほ んのわずかな阻害活性のみを示し、そして、ＡｚｄｄＭｅＣは、同様の酵素に対 してわずかな活性のみを示すことが報告された。その後の報告では、ＨＩＶに対 して活性のある可能性のある化合物が示されているが、インビボでの毒性および 半減期については述べられていない。

ＡｚｄｄＭｅＣは、薬学的に受容され得る塩（例えば、カリウム塩、ナトリウム 塩、またはアミン塩）の形で投与され得る。５−メチル−３°−アジド−２°、 ３−ジデオキシシチジンの合成の適切な方法は、文献中に見られ、そして当業者 に知られている。例えば、ＬｉｎらのＪ、　Ｍｅｄ、　ＣｈｅＩｌｌ、　２６． １６９１−１６９６　（１９Ｂ３）　；　Ｈｏｒｏｖｉ　ｔｚ、Ｊ、　Ｐ、らの Ｊ、Ｏｒ　、Ｃｈｅｍ、３１．２０５（＋９６６）　；　Ｈｏｒｏｖｉｔｚ、　 Ｊ、Ｐ　らのム以ｌ」ｈｅｍ、　３２．８１７（１９６７）　：　Ｍｏｆｆａｔ Ｌ、　Ｊ、Ｇ　らのム立１」匝↓−３９、３０（１９７４）：およびＲｏｂｂｉ ｎｓ、　Ｍ、らのＴｅｔ、Ｌｅｔｔｅｒｓ　２５，３６７（１９８４）を参照せ よ。

Ｌｉｎらの方法によるＡｚｄｄＭｅＣの合成の特定の方法は、実施例１において 提供される。

［実施例１：３°−アジド−２’、３’−ジブオキ／−５−メチルシチジン（Ａ ｚｄｄＭｅＣ）の合成］ ５−０−アセチル−３−アット−３−デオｊ−７チミジン　２）氷−水浴中で、 ３−アジド−３−デオキシチミジン（５，０ｇ、　１８゜７ｍ１ｌＩｏｌｅ）　 １のピリジン（５０ｍｌ）溶液に無水酢酸を滴下して加えた。この混合物を冷却 装置中に一晩放置した。次いで、この溶液をＣ）ｌｃ１３　（２０１１１１）中 に注ぎ、Ｈ２０２００ｍ１で２回、重炭酸ナト１／ウムの飽和溶液、次いでＨ２ ０２００ｍ１で２回で洗浄した。次いで、この有機層を乾燥した（ＭｇＳＯ４） 。この溶媒を除去した後、シｏ７ブ（５，５ｇ）を得た。

５−０−アセチル−３−アジド−２゛３°−ジデオキシ−５−メチル−４−トリ ゾリル−１−−〇−リボフラノシル）ピリミジン　３化合物２　（６，５ｇ、２ １．０４ｍｍｏｌｅ）のピリミジン（Ｓｏｉｌ）溶液に、Ｃｌ−Ｃ６Ｈ４０ＰＯ Ｃ１２（７，８ｇ、　３１．５６ｍｍ）を滴下して加え、次いで、トリアゾール （４，３５ｇ、　６３．１２ｍｍ）を加えた。この混合物を室温で７日間攪拌し た。攪拌後、塩化メチレン（２００ｍｌ）をこの反応混合物に加えた。得られた 溶液をＨ２０２００＋ｍｌで２回、重炭酸ナトリウムの飽和溶液、次いでＨ２０ で再び洗浄した。次いで、この有機層を乾燥した（ＭｇＳＯａ）。溶媒を蒸発さ せることにより、黄色の固形物（５，０４ｇ）を得た。

３−アット−２゛、３°−ジデオキシづ一メチルンチジン（±、ＡｚｄｄＭｅＣ ） 化合物３　（５，０４ｇ、１３．９６ｍｍ）を３０ｍ１の水酸化アンモニウム− ジオキサン（１・３）中に溶解した。この反応混合物を室温で１時間攪拌し、次 いで、この溶媒を蒸発させてシロップを形成した。得られたシロップを、室温で 一晩、アンモニアの飽和メタノール溶液中に貯蔵した。次いで、この反応混合物 を蒸発させて乾燥状態とし、その残留物を溶離剤としてＣＨＣｌ５およびメタノ ールを初めにＩＯ：１の割合で、次いで５：１の割合で月いて、シリカゲルカラ ムで精製した。この画分を合わせて、そして蒸発させてＡｚｄｄＭｅＣを固形物 として得たくｉ、２．９グラム）。

［実施例・２　：　ＡｚｄｄＭｅＣの抗ウィルス活性コツイトヘマグルチニン（ ＰＨＡ）で刺激された、ＨＩ’Ｖ−１（ＬＡＹ菌株）に感染したヒトの末梢血単 核（ＰＢＭ）細胞におけるウィルスの複製の阻害によって、ＡｚｄｄＭｅＣの旧 ■を阻害する能力を測定する。ウィルスにコードされた逆転写酵素の量を測定す ることによって阻害を決定する。生じた酵素の電を旧Ｖコントロールと比較する 。この方法を下記に詳細に記載する。

（ヒトの末梢血単核細胞ＰＢＭにおける抗ウイルス７ノセイ）Ａ、Ｂ型肝炎およ び旧ｖ−１１１１１１陰性の健康な提供者由来で３日齢の、フィトヘマグルチニ ンで刺激されたＰＢＭ細胞（１０６細胞／ｍ１）に、旧Ｖ−１（ＬＡＹ菌株）を 、５０％組織培養感染用ｊｌ　（ＴＩＣＤ５０）の約１００倍の濃度で感染させ 、そして、種・々の濃度の抗ウィルス化合物の存在下でおよび不存在下で培養し た。

Ｂ、感染約４５分後、試験すべき化合物を培地中に最終濃度の２倍のｒｓ度で宵 する培地５ｍｌ、または化合物を有さない培地５ｍｌをフラスコに加え、最終容 量を１０ｍ１とした。ＡＺ丁を陽性コントロールとして用いた。

Ｃ１この細胞をウィルス（約２　ｘ　１０５ｄｍｐ／ｍｌ、逆転写酵素ア２セイ によって決定された）にさらし、次いで、Ｃ０２インキニベーター中に静置した 。ＨＩＶ−１（ＬＡＹ！１株）をジョーシア州、アトランタのセンター　フォー 　ディシーズ　コントロール（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎ ｔｒｏｌ）から得た。ＰＢＭ細胞を培養するために用いられる方法、ウィルスを 回収する方法、そして逆転写酵素活性を決定する方法は、ファンジゾンが培地中 に含有されていないこと以外は、ＭｃＤｏｕｇａｌら（Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎ、 　Ｍｅｔｈ、’　７６、１７１−１８３．１９８５）および５ｐｉｒａら（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｔｈ、　２５ｙ９７−９９．１９８７）に記載されている方法で ある（　５ｃｈｉｎａｚｉらのＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂユ江吐り飢肌匹立二３２． １７８４−１７８７（１９８ｇ）を参照）。

ウィルス感染したコントロールにおける逆転写酵素活性は、約２　Ｘ　１０５ｄ ｐ＋ｉ／ｍｌであった。ブランクおよび感染していない細胞のコントロールの値 は、それぞれ、約３００および１．ｏｏｏｄｐｍであった。工程Ｂの前に工程Ｃ を実施した場合にも同様の結果が得られる。

Ｄ、６日目において、この細胞および上澄みを１５＋ａｌのチューブに移し、そ して約９ＱＯｇで１０分間遠心分離を行った。５ｍｌの上澄みを除去し、そして 、このウィルスを３０分間、約４０．００Ｏｒｐｍで遠心分離することによって Ｊ！した（Ｂｅｃｋｔｎａｎ　７０．Ｉ　Ｔｉ。

−ター）。可溶化されたウィルスのペレットを逆転写酵素のレベルの測定をする ために処理した。結果をサンプルの上澄みのｄｐｍ／ｍｌで表す。

（インビトロでのマクロファージｏ＋ｖ−１ｇ染アッセイ）Ｃｒｏｖｅ　Ｓ、、 Ｍｉｌｌｓ　Ｊ、、およびＭｃＧｒａｔｈ、　Ｍ、　Ｓ、のＡＩＤＳ　ＲＥＳ、 １（ｕｎａｎ　Ｒｅｔｒｏ、　３．１３５−１４５（１９８？）　ｒ　ＤＣ４表 面抗原発現の定量的免疫細胞蛍光光度性分析、および末梢血単球／マクロファー ジのＨＩＶ感染」に記載されているように、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏ ｓｓ、Ａｔｒａｎｔａ、Ｇａ、から得られた血液の白血球層から、単核細胞およ びマクロファージを単離した。この細胞を５Ｘ　１０’細胞／ｍｌの密度で、Ｔ ｅｆ　１１ｏｎ”培養容器（Ｓａｖｉｌｌｅｘ、Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ、ＭＮ） 中の、１０％のＡＢプラス（血液型）のヒト血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０ 培地中に入れた。

培養７−２０日後、リンパ球汚染が最小である間に、マクロファージを室温で１ 時間、はぼｌ　ＴＣＩＤｓｅ単位／細胞の感染多重度でＨＩＶ−，１（）ＩＩＶ −ＤＶＩ！ｉ株）にさらす。結合していないウィルスを希釈していない仔ウシの 胎児の血清で洗浄することによって除去する。次いで、細胞を再懸濁し、そして １０６細胞／ウエルを、薬物の不存在下または種々の希釈濃度の薬物の存在下で ２検体ずつ、９６ウエルの微量希釈プレート（ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｆｏｎ　ｐ ｌａｔｅ、）に加える。急性感染の９日後、上澄みを回収し、そして、Ａｂｂｏ ｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ＨＴＬＶＩＩＩ−ＥＩＡ試験を用いて旧Ｖ− １ｐ２４抗体の定量を行う。処理されていない、感染したコントロール細胞と比 較した、薬物処理された細胞におけるｐ２４の阻害の割合（％）を全テストにつ いて算出する。

Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂへｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、３０．４９１−４９８ （１９８６）に記載された５０％有効量法（ＩＩｌｅｄｉａｎ　ｅｆｆｅｃｔ　 ｍｅｔｈｏｄ）によって決定された種々の２°、３−ジブオキ７−および２’、 ３’−ジデオキシジデヒドロヌクレオシドの５０％有効濃度（ＥＣｓａ）は、微 量モル濃度の化合物に対してプロットされた逆転写酵素の測定により決定される 、ウィルスの阻害割合（％〉に基づく。ＥＣｓ、は、ウィルスの増殖の５０％阻 害における化合物の濃度である。

）１１Ｖに感染したＰＢＭ細胞において試験した場合、ＡｚｄｄＭｅＣは、ｏ、 ｏｇｌ　〜０．２２μＭのＥＣ５ｓを有する。ＡｚｄｄＣは、旧Ｖ−１に感染し たヒトのマクロファージにおいて非常に活性があり、ＥＣ６＠＝０゜００６ｇＭ を有している。ここで使用される、抗ウィルス活性とは、ＡｚｄｄＭｅＣを含有 する組成物が旧Ｖの複製を阻害する能力をさして言う。

ＡｚｄｄＭｅＣは、ＡＺＴと比較するために、数種の細胞のタイプの）１１Ｖに 対して、および他のウィルスに対して試験された。この結果を表１に示す。

表１．　ＡｚｄｄＭｅＣおよびＡＺＴの抗ウイルス活性ウィルスＥＣ５ｆ１また はＩＣ５ｓ（μＭ）ＡｚｄｄＭｅＣＡＺＴ ＰＢＭ細胞中の旧Ｖ−１（ＬＡＶ）　０．０９　Ｑ、００２？９０７ｒ−ノ’中 （７））ＩＩＶ−１（ＤＶ）　０．００６　Ｇ、０００８ＰＢＭ細胞中ノ）ＩＩ Ｖ−２（ＲＯＤ２）　０．０１６　０．００５Ｖｅｒｏ細胞中のＨＳＶ−１（Ｆ ）　＞１００　＞１００Ｖｅｒｏ細胞中の）ＩｓＶ−２（Ｇ）　＞１００　＞１ ００Ｖｅｒｏ細胞中のコクチアキーウィルス（Ｂ４）　＞１００　＞１００ＳＣ 細胞中のフレンドレトロウィルス（ＥＹ−ＩＱ）　２．８　０．００４ＭＤＣＫ 細胞中のインフルエンザ″Ａ （Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ　１１５７（８２Ｎ２＞およびＷｌ　３３３４−１（Ｈ３ Ｎ２））　＞１００　検出されない（以下余白） ｃ寅施例３　：　ＡｚｄｄＭｅＣの細胞毒性〕感染していないヒト細胞の増殖に 対する化合物の効果は、２つのア、セイ（１つは感染していない末梢血の単核細 胞（ＰＢＭ）を用い、他の１つは顆粒球のコロニー形成の抑制を用いた７ノセイ を用いる）によって決定する。

ＰＢＭ　びｖｅｒｏ、における　神 マイトジｘ７刺激されたＰＢＭ細胞（３，８ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、 薬剤を使用した場合と使用しない場合とにおいて、上記の抗ウィルス性ア、セイ に使用される場合と同様の条件下で培養した。細胞は、血球計数器及びトリパン ブルー排除法を使用し、５ｃｈｉｎａｚｉらのＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａ 　ｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ　５２２（３）、４９９（１９Ｈ） によって、６日後に測定した。　ＩＣ５ａは、正常の細胞の増殖の５０％を抑制 する化合物の濃度である。

ＡｚｄｄＭｅＣは、ＰＢＭ細胞に対してわずか２００マイクａモルを越える濃度 において毒性を持つ。

Ｖｅｒｏ　アフリカミドリザルＡｆｒｉｃａｎ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｏｎｋｅ　に乱 史ｌ皇並 増殖培地（２，５ｍ１）中のＶｅｒｏ細胞を、２５ｃｍ２フラスコ（Ｆａｌｃｏ ｎ）２個ずつに、試験される各化合物について、細胞集密性（Ｃｅｌｌ　Ｃｏｎ ｆｌｕｅｎｃｙ）の１０分の１に等しい濃度で入れた。５％ＣＯ２，９５％空気 中の雰囲気中３７°Ｃで２４時間培養した後、試験化合物を（増殖培地の２５ｍ ｌに溶解させた最終濃度の２倍の濃度で）加えた。２個のマウス＝について、培 地をデカンテーシ１ンによって除去し、３１のＰＢＳで一度洗浄し、そして３７ ℃で５分間３ｍｌのトリプシン／　ＥＤＴＡ　（０，１２５％／　０．０２％＞ で培養することにより、収穫した。フラスコから剥された細胞は、一般的に凝渠 しており、この懸濁液をフラスコの表面に繰り返し強くピペッティングして分散 する。よく分散された細胞懸濁液１ｍｌに、トリパンブルー溶液を２ｍｌ加え、 細胞の数を血球計数器を使用して数える。これは続く３日間にわたり繰り返され る。

この方法は、先に５ｃｈｉｎａｚｉらによって◎１旧」暉■立Ｌ−ｎ旦Ｕ。

ｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　２２．４９９−５０７（１９ｇ２）に「細胞培養物 及びマウスにおけるアシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）及びバイダラビン（Ｖ ｉｄａｒａｂｉｎｅ）あるいはこの５−モノホスフェートの組み合せの単純ヘル ペスウィルスに対する影響」として記載されている。

ＡｚｄｄＭｅＣは、Ｖｅ　ｒｏ細胞に対してわずか４００マイクロモルを越える 濃度で毒性を持つ。

粒球における　性　ｉ ヒトの骨髄前駆細胞において化合物の濃度を変化させることによる効果を決定す るために使用される方法は、Ｓｏｔｍｍａｄｏｓｓｉ、　Ｃａｒｌｉｓｌｅ、　 ５ｃｈｉｎａｚｉ、及びＺｈｏｕによってｉｎ　Ａｎｔｆｍｉｃｒｏｂｉａｌ　 Ａ　ｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ　、３２（７）、　９９７（１９ ８ｇ）、にＳ２載されている。簡潔に述べると、正常ヒトの骨髄細胞を、３７℃ で２時間、種々の濃度の薬剤とともに培養し、細胞をブレーティングの前に２回 洗浄する。細胞の生存は、軟寒天クロニーング及びその後のコロニー形成測定に より決定される。

ＡｚｄｄＣは、このシステムで試験をしたうちの最も低い毒性を宵するヌクレオ シド類似体の試験レベルである、１００μＭまで試験を行ったが、ｅｒｙｔｈｒ ｏｉｄ前駆細胞に対して毒性を示さない。

図１は、３°−アジ）’　−３’−テオキシチミジ７　（ＡＺＴ）、３゛−アジ ド−２’　、　３−’ジデオ牛ンウリノ７　（ＡｚｄｄＵ）、３′−アジド−２ °、３−ジデオ牛／−５−エチル−ウリジン（ＡｚｄｄＥＵ）及び３−アジド− ２°、３°−ジデオキシ−５゛−メチルンチジン（ＡｚｄｄＭｅｃ）のヒトの顆 粒球大食前駆細胞のコロニー形成に対する相対的効果を示すグラフである。

図１に示されている結果は、ヒトの顆粒球大食前駆細胞のコロニー形成に対する ＡｚｄｄＭｅＣの効果をＡＺＴと比較した際の有意な違いを明確に示している。

１０マイクロモルの濃度で、ＡｚｄｄＭｅＣは、ＡｚｄｄＵよりもこれらの細胞 に対して毒性が低く、ＡＺＴよりも約２０倍これらの細胞に対して毒性が小さい 。インビトロでヒトの骨髄により、これらのヌクレオチドを投与したときにヒト において起こり得る潜在的問題を予知することができるｏ　（Ｓｏｍｍａｄｏｓ ｓｉ、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、Ａ　ｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍ。

皿、　３１．４５２−４５４　（１９８７）参照）。

これらのデータは、ＡｚｄｄＭｅＣが１．０００を越える治療指数（ｔｈｅｒａ ｐｅｕｔｉｃ　１ｎｄｅｘ）を有することを示す。化合物の治療指数は、１ｃｓ ９　／ＥＣ５ａで算出され、化合物の効果的な用量の投与における毒物安全性の 限界の目安である。この化合物の毒性の低さは、化学構造、または抗ウィルスの 研究分野における従来の知識によっては予測され得なかった。

ＡｚｄｄＭｅＣ及びＡＺＴの細胞毒性を比較した。

アッセイで使用された　（８Ｍ　ＡＺｄｄＭｅＣ＞　＜ｔｔ　Ｍ　ＡＺＴ）細胞 型のＥＣ５ａまたはＩＣ５ｓ　： ヒトＰＢＭ　＞　２００　１００ Ｖｅｒｏ　）　４００　２９ ＭＤＣＫ　＞　１００　検出されない ヒト骨髄： ＧＭ−ＣＦＵ　３６　Ｑ、　９ ＢＦＵ−Ｅ　≧１００　’　１．に の発見、即ちＡｚｄｄＭｅＣが旧■に対して低濃度で活性であり、同時に正常の 感染していない宿主細胞に対して毒性が非常に低いということは、驚くべきこと である。なぜなら非常に構造が類似した化合物であるＡＺＴを、種々の実験で測 定、したときに強い毒性を示すからである。さらに、３°−アジド−２°、３゛ −ジデオ牛ンー５−メチル／チジンは、ヒトのｔ髄始原細胞の複製を十分に抑制 しない。

［実施例４：［ｌＩＶ逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼαの阻害コ組換え６５ ，０００　Ｄ旧Ｖ−１逆転写酵素は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ、　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、　ＭＤの国立ガン研 究所でＳ、　Ｈｕｇｈｅｓ博士から入手した。この酵素は異なる抗ウィルス剤の 効果が比較されるときに、ピリオン誘導酵素と識別不可能な阻害のプロフィール を・持つことが報告されている。

ＨＩＭ−１ア、セイの標準反応混合液（１００μｌ）は、１００　ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、Ｓｏ　ｍＭ　ＫＣＩ、　２　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、 ５　ｍＭジチオトレイトール、４００　ａ　ｇ／ｍ＋　８ＳＡ、１ｍｌあたり０ ．０５Ｕの（ｒｌＬ（ｄＣ）＋２−１８　（３，１μｇ／ｍｌに等しい）及び１ μＭ［３Ｈ］ｄＣＴＰ　（比活性２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含んでいる。ＤＮＡポ リメラーゼαをＰＨＡにより刺激されたＰＢＭ細胞から単離した。ＰＢＭ　ＤＮ Ａポリメラーゼαを、１００８Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、６　ｍ Ｍ　ＭｇＣｌ２．５　ｍＭジチオトレイトール、４００μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１ ８Ｍ［３Ｈ］ｄＣＴＰ　（比活性２５Ｃ４／＋ｎｍｏｌ）、各１００μＭｄＡＴ Ｐ、　ｄ丁ＴＰ、及びｄＧＴＰ、及び１ｍｌあたり活性化ウシ胸腺ＤＮＡ２００ μｇを含む反応混合液１００　ｍｌ中でアッセイした。反応は１０μｍの酵素を 加えることにより開始した。反応混合ｌ夜を、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、、Ａ　ｅ ｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、３３．１１５−１１７（１９８９）に記載の方法 によりインキュベートし、反応させた。

（ｒｌＬ（ｄＣ）＋２−＋ｓを鋳型とする合成におけるＡｚｄｄＭｅＣの５−ト リホスフェートと旧１／−１逆転写酵素との相互作用により、ｄＣＴＰに関して は競合阻害パターンが示され、且つｄｄｅＴＦ’の親和性よりも約３０倍大きな 親和性が示された。阻害定数に１ｓの値は、抑制濃度に対する勾配のりプロット から決定され、ＡｚｄｄＭｅＣ−ＴＰ及びｄｄＣＴＰに対してそれぞれ０．００ ９３　ＩＩＭ及び（１，２９ａ＋Ｍであった。

ｄＣＴＰの算出された平均Ｋｍ値は、約７．２μＭ　（５，３−９，１μＭの範 囲）であった。細胞のＤＮＡポリメラーゼαの活性に関するＡｚｄｄＭｅｃ及び ｄｄＣＴＰについての動力学的研究により、両化合物は種々の濃度のｄｃＴＰに 関して競合するインヒビターであることが明らかにされた。しかしながら、ＤＮ Ａポリメラーゼαの活性を５０％減少させるためには、有意に濃度の高い化合物 が必要とされた。ＡｚｄｄＭｅＣ−ＴＰは、同様のＤＮＡポリメラーゼαの抑制 に必要な濃度のａ、　ｏｏｏ倍低い濃度で旧Ｖ−Ｉ　ＲＴを５０％抑制した。

［実施例５　：　ＡｚｄｄＭｅＣの細胞内代謝物コＡｚｄｄＭｅＣは脱アミノさ れ、ＡＺＴになる。ＡｚｄｄＭｅＣはインビトロでヒト骨髄細胞に毒性がないの で、インビボで骨髄に毒性を持つＡ２Ｔの代謝物とは違った代謝物を持つに違い ない。　ＡｚｄｄＭｅＣは、ＨＥｐ−２細胞由来のンチジンジアミナーゼの基質 ではないと決定されていた。

この結果を表Ｉ＋に示す。

表Ｉ＋　ヒト細胞における２４時間さらしたネ後のｌＯμＭ［３Ｈ］−Ａｚｄｄ ＭｅＣの代謝 嵐且二星五亙旧 化合物：　ＡｚｄｄＭｅＣＡＺＴ　ＡＺＴ−ＭＰ　ＡＺＴ−ＤＤＰ　ＡＺＴ−Ｔ Ｐ５．０５　１．３５ （総量１１．４）　１９．４　０．３２　（１，３０旦Σｉ藍皿盗 化合物：　ＡｚｄｄＭｅＣＡＺＴ　ＡＺＴ−ＭＰ　ＡＺＴ−ＤＤＰ　ＡＺＴ−Ｔ Ｐ（総ｔＬ、８Ｂ＞　４．８Ｉ　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

２、ＯＯ，７１（総量８．１６） ＊ｐｍｏｌｅｓ／　１０’細胞 Ｎ、　Ｄ、検出されない ＰＢＭ細胞における代謝の研究によりＡｚｄｄＭｅＣの主要代謝物は、ＡＺＴ− モノホスフェート（ＡＺＴ−ＭＰ）であり、ＡｚｄｄＭｅＣ−ＭＰは形成されな いことが示される。一方ＡＺＴジホスフェート（ＡＺＴ−ＤＰ）とＡＺＴ−トリ ホスフェート（ＡＺＴ−ＴＰ）はＰＢＭ細胞中に形成されるが、ＡＺＴ−ＭＰだ けが骨髄細胞中に形成される。逆に、ＡＺＴ−ＭＰ及びＡｚｄｄＭｅＣはどちら もＣＥＭ細胞中で検出されない。

このデータはＡｚｄｄＭｅＣの一部が一次細胞内で脱アミノ化してＡＺＴになる こと、及びＡＺＴ−ＭＰがＡｚｄｄＭｅＣ−ＭＰの脱アミン化ではなく　ＡＺＴ のリン酸化により生しることを示唆している。ＡＺＴの主要代謝物がＡＺＴ−Ｍ Ｐであるのに対し、ＡｚｄｄＭｅＣで処理される一次細胞内ではＡＺＴ　：Ａ　 ＺＴ−ＭＰの比率は約２：　１である。そのため、ＡｚｄｄＭｅＣがリン酸化に 関してＡＺＴと競合することは明らかである。

［実施例６：マウスの生体内毒性］ ＢＡＬＢ／ｃマウスに任意に（自由に）　ＡＺＴまたはＡｚｄｄＭｅＣ（０，１ 菖ｇ／ｌｌ１ｌ、−日当り１７．５　ｍｇ／ｋｇに相当）を経口で投与した。Ａ ｚｄｄＭｅＣの１４５日間の連続経口投与では、明らかに毒性は表れなかった。

ＡＺＴ投与の３４ＥＩという早い時期に赤血球の平均血球容量を増加させた（水 で処理（投与）された動物；　ｎｗ５のときＭＣＶ：ｉ：　ＳＤ＝　５１．７± ０．３ｆＬ対４６．９±０．４ｆＬ）。ＡｚｄｄＭｅＣ（ＭＣＶ＝　４６゜９± ０．３ｆＬ）では、動物について投与開始から１４５日後後側された場合にも、 同様の効果は見られなかった。ＡｚｄｄＭｅＣまたはＡＺＴで処理後、投与され ていないマウスと比較して、体重が減逼し、または増加しない動物はなかった。

［実施例７：ラット及びアカゲザルにおけるＡｚｄｄＭｅＣの薬物動態コ ＡｚｄｄＭｅＣの前臨床の薬物動態がラットに静脈投与した後、及びサルに静脈 及び経口投与した後に特徴づけられた。ＡｚｄｄＭｅＣを１０．５０．１００　 ｍｇ／ｋＨの投与量で静脈に投与した。ＡｚｄｄＭｅＣの血漿及び尿濃度を、Ｈ ＰＬＣより、そして面積／時間（Ａｒｅａ／＋ｏｍｅｎｔ）分析によって生じる 薬物動態学的パラメーターにより決定した。

標準法で、２５０−３００ｇの成体オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｙラットを 使用した。薬剤を外部頚静脈力ニニーレを通して外科的に投与した。１．ｏｍｌ 標準生理食塩水中のＡｚｄｄＭｅＣを３０秒にわたって投与した。６匹のラット を各用量で試験した。０．３ｍｌの血液サンプルを薬剤投与の前に、そして薬剤 投与に続いて０．０ｇ、　０゜２５、０．５．０．７５．　ｌ、　１．５，２． 　３．　４．　５．　６．　７．　８．　１０゜及び１２時間にカニニーレから ヘパリン化されたポリプロピレンミクロ遠心機チューブへ集めた。血液容量を標 準生理食塩水で置き換えた。血液サンプルを遠心分離し、血漿を分析まで凍結し て保存した。尿も、薬剤投与後選択された時間（２４時間）後に集めた。尿容量 を測定し、サンプルを分析まで凍結して保存した。

血漿及び東向の薬剤濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬＣ）により 決定した。１００マイクロリツターの血漿、５０マイクロリ、ターのコントロー ル、及びタンパク質沈澱剤として１００マイクロリツターの２Ｍ過塩素酸をポリ プロピレンマイクロ遠心分離用チューブ（４００μｌ）に加え、充分に攪拌し、 ５．０００ｇｒＳ分間遠心分離した。上清（１５−２００μｌ）をＨＰＬＣ（Ｗ ａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ）に注入した。Ａ １１ｔｅｃｈ　Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ＯＤＳカラム（０，４６χ１５ｃｍ、ミクロ ン粒子サイズ）を用い、４０＋ｎＭの酢酸ナトリウムｐ）１７．０中に、１２％ のアセトニトリルを含む可動桁を使用し、流速２　ｍｌ／ｗｉｎ、でから成るク ロマトグラフィーにかけた。化合物を０．００５ＡＵＦＳの検出範囲設定で２８ ３　ｒｖのＵｖ彼長で定量した。ＡｚｄｄＭｅＣの保持時間は、２．６分だった 。ＡＴＺの保持時間は４．１分だった。

尿サンプルは、脱イオン化された蒸留水で１：１００に希釈され、内部標準を加 え、２０−１００μｌのサンプルをＥＩＰＬＣに注入した。薬剤濃度は、排出さ れた未変化のＡｚｄｄＭｅＣの量を決定するために集められた尿の量に応じて高 くなる。

尿中のＡｚｄｄＭｅＣグルクロニドの形成可能性をβ−グルクロニダーゼによる 加水分解によって確認した。尿（１００μｌ）、０．１２Ｎ酢酸１５μｌ、β− グルクロニダーゼ１００μｌ（水中でｌａｌ当り５００ユニツト）、及びｐＨ５ ，８ホスフエート緩衝液３５μｌをガラス培養チューブに加え、混合し、３７” Ｃの水浴中で緩やかに振盪させながら１２時間イン牛１ベートした。β−グルク ロダーゼで処理された尿を、尿サンプルにおいて記載したのと同様に、Ａｚｄｄ ＭｅＣについてア、ノセイを行なった。グルクロニド濃度を、β−グルクロニダ ーゼで加水分解する前後のヌクレオシド濃度の差異として計算した。

ＡｚｄｄＭｅＣスタンダードを、０．１から１００μｍ　ｇ／＋ｉｌの範囲で、 ブランクのラット血漿及び尿中に調製した。Ｉ／Ｙで重み付された最小２乗法に より標準曲線勾配及び切片を得たが、これは直線回帰にはならなかった。アッセ イでは、０．１から１００μｍ　ｇ／ｍｌの範囲で直線的であった。そして、定 量の下限は０．１ｇｇ／ｒａ１（１０ｎｇ＞であった。２５１度がｌｏｏμ７　 ／ｍｌを越えるＡｚｄｄＭｅＣ濃度を膏する血漿す７ブルを、アッセイする前に ブランクのう、ト血漿て希釈した。ＡｚｄｄＭｅＣの抽出と回収率及び内部標準 は、８５％であった。アッセイにおいて全ての薬剤濃度の日内または日間の変動 係数は、１０％よりも小さかった。

面積／時間分析を、ＡｚｄｄＭｅＣの薬物動態的パラメーターを計算するために 使用した。血漿Ｓ度一時間曲線の下側の面積（ＡＵＧ）及び第一の正規化されて いないモーメント（ＡＵＭＣ）は、ラクランジュ（Ｌａｇｒａｎｇｅ）の多変量 の、ゼロ時間から最終サンプル採取まで積分した内挿と非線形の最小２乗末端勾 配を使用した無限の時間に対する外挿により決定した。総クリアランス（ＣＬＴ ）ハ、投与量／’ＡＵＧ、　ＡＵＭＣ／ＡＵＣから得られた平均滞留時間（ＭＲ Ｔ）、及びＣＬＴ　ｘ　ＭＲＴから得られた分布（Ｖｓｓ）の定常状態量から計 算された。ｆｅで表現される尿中へ未変化のまま排泄された薬剤の画分は、Ａｕ ／投与量から計算された。ただしＡｕは、無限の時間が経過したときに排泄され ると予想されるＡｚｄｄＭｅＣの量である。腎臓のクリアランス（ＣＬＲ）はｆ ｅ　ｘ　ＣＬＴで計算され、非腎臓クリアランスは、（ＣＬＮＲ）は、ＣＵＴ− ＣＬＲで計算された。

半減期（Ｔ　Ｉ／２）は、λ２が非直線の最小２乗末端勾配のとき０、６９３／ λ２で計算された。

統計分析を、投与量の効果を比較する分散の一方向分析を使用して行った。０． ０５より少ない可能性のレベルは統計的に有意であると考えた。

図２は、ＡｚｄｄＭｅＣの８時間にわたる血漿濃度を示す。ＡｚｄｄＭｅＣのラ ットに対する静脈投与の後で、総クリアランス１．９±０５７Ｌ／ｈ／ｋｇ　（ １８ラツトの平均±ＳＤ）であり、そして存在している定常状態体積は、１．４ ±０．６４Ｌ／ｋｇであった。半減期は平均２．５±５ｈだった。統計的に有意 な差異は、３つの投与量の間の薬物動態的パラメーターにおいては示されなかっ た。総クリアランスは、図３Ａに示すように、体重１ｋｇ当り１０，５０．１０ ０ｍｇのＡｚｄｄＭｅＣに対して、それぞれ２．３３±０．７３（平均±ＳＤ） 、１５７±０，３３、及び１，７６±０．３２Ｌ／ｈ／ｋｇであった。腎臓排出 は、図３Ｂに示すように、総クリアランスの約半分であり、尿中の未変換Ａｚｄ ｄＭｅＣとして回収された量の５５ｔ１１％である。腎臓以外のクリアランスは 、図３０で示す。グルクロニド代謝物は、尿中に見られなかった。さらに、Ａｚ ｄｄＭｅＣは、う・７トではＡＺＴへの脱アミノ化によって代謝されなかった。

ＡｚｄｄＭｅＣの分布の定常状態量は、体重１　ｋｇ当り１０．５０．及び１０ ０　ｍｇのＡｚｄｄＭｅＣの投与により、それぞれ平均０．９２±０．２７．１ ．７３±０．７８、及び１．４６±０．４４　Ｌ／ｋｇであった。この結果は、 ラットにおけるＡｚｄｄＭｅＣの運命がｔｏ−１００ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる 投与量に依存していないことを示した。ＡｚｄｄＭｅＣのクリアランスはＡＺＴ よりも４０％少ないが、ＡｚｄｄＭｅＣのうｌトにおける薬物動態は、２’、３ −ジデオ牛シンチジ／の薬物動態と類似している。

ＡｚｄｄＭｅＣの運命は、うｌトに関して記載したのと同様に、６０　ｍｇ／ｋ ｇ　ＡｚｄｄＭｅＣをアカゲザルに静脈及び経口投与した後に評価した。生物学 的利用率（Ｆ）は、経口または皮下の薬剤を投与した後、ＡＵＣＰｏ、ｓｓＱ　 ｘ　Ｄｏｓｅ＋ｖ／ＡＵＣ＋ｖ　ｘ　ＤＯ５ｅＰｏ、ｓＱにより計算した。生物 学的利用性に関しては、ＣＩＴは投与量に依存しないと推定した。

ＡｚｄｄＭｅＣの平均半減期は、静脈及び経口投与の後、それぞれ１．５２±０ ．７３（３匹のサルの平均±ＳＤ）、及び１７４±１．Ｏｈであった。静脈投与 後のＡｚｄｄＭｅＣの総クリアランスは、２，２±０．１２Ｌ／ｈ／ｋｇ、及び 分布の定常状態量は、１．２±０．５３Ｌ／ｋｇであった。

経口の生物学的利用率は、２１ｔ８％であった。ＡＺＴは、ＡｚｄｄＭｅＣの主 要な代謝物のようであり、そのことはサルにおいてこのヌクレオシドがかなりの 割合で脱アミノされたことを示唆している。ＡｚｄｄＭｅＣのグルクロニド代謝 物は尿中で検出されなかったが、ＡＺＴグルクロニドの有意の量が尿中に検出さ れた。

ＡｚｄｄＭｅＣは大脳を椎液（ＣＳＦ）中では検出されなかったが、ＡＺＴは検 出され得た。これらの結果を表■にまとめる。

（以下余白） 表ＩＩ１．　ＡＺＴと比較した、゛体重１ｋｇ当り６０ＩＩ１ｇのＡｚｄｄＭｅ Ｃを静脈及び経口投与した後のアカゲザルにおける薬物動態パラメータプル ハ”−）、）　−９ＲＨＤ−Ｉ　ＲｌＪＪ−Ｉ　ＲＺＯ−１□　Ｌｌｉ’１）α 囮　成田 ＡｚｄｄＭｅＣ： 助１．ｍｇ／ｋｇ　６０６０　６０６０　６０６０ＡＵＣ，ｍｇ、ｈ／Ｌ　２７ ．６３．３９　２８．７７．６９　２５．９６．３９Ｃ１７，Ｌ／ｈ／ｋｇ　２ ，１７　２，０９　２．３２Ｖ、、、Ｌ／ｋｇ　Ｏ，６２１，６５１，３３ｔ、 、２．ｈ　Ｏ，６８０，６８１，９８２，６６１，８９１，８７Ｆ　Ｏ，１２０ ，２７０２５ ＡＺＴ： ＡＵＧ、ｍｇ、ｈ／Ｌ　１３．４　１．３９　１３．５　２，０９　９．９９　 １．６１ｔ、、２．　ｈ　Ｏ，６１０，６１０，７４１，５７０，５２０，９１ Ａす；ユＷ ＡＵＣ（ＡｚｄｄＭｅＣ）　０．４９０，４１　０，４７０，２７　０，３９０ ．２５［実施例８：　ヒトのＰＢＭにおけるＡＺＴとＡｚｄｄＭｅＣの吸収、及 びＡｚｄｄＭｅＣからＡＺＴへの転換］ ヒトの末梢血単核細胞による１４（て標識されたＡＺＴ及び３Ｈで標識されたＡ ｚｄｄＭｅＣ（４μＭ）の、６時間にわたる取り組みを、図４で比較する。

図４に示される結果は、ＡｚｄｄＭｅＣが細胞内でＡＺＴに変換しく６．６％） 、その後ＡＺＴ−ＭＰ　（４１１％）に変換することを示す。細胞を含まないア ッセイでは、ＡｚｄｄＭｅＣの０．３５％が脱アミノ化されてＡＺＴとなる。Ａ ｚｄｄＭｅＣのＡＺＴへの変換は律速段階である。４００μＭで、細胞を含まな い／ステムでは、ＡＺＴからＡＺＴ−ＭＰへのリン酸化を１２％抑制した。ＡＺ Ｔは、培地（６，９％）において、ＡｚｄｄＭｅＣから殆ど変換されない。図５ は、ＰＢＭによるＡｚｄｄＭｅＣの優先的な取り組みを、ＡＺＴと比較して示す 。図６は、ＰＢＭ及び骨髄細胞におけるＡｚｄｄＭｅＣの生物学的変換のための 推定されるメカニズムを図示する。

Ｃ実施例９　：　Ｈｒｖｑ染処置のための活性剤としての、ＡｚｄｄＭｅＣを含 む薬学的組成物の調製］ ）１１Ｖ感染は、患者に３″−アジド−２°、３°−ジデオ牛シー５−メチルシ チジンまたはその塩の効果的な量を薬学的に受容され得る担体または希釈液の存 在下で患者に投与することにより処置され得る。

活性物質を適当なルート（例えば経口、非経口、静脈、皮肉、皮下、または局所 的に）で液体中または個体の状態で投与する。この組成物は経口投与することが 好ましい。

活性化合物は、薬学的に受容され得る担体な中に、または顕著な毒性効果を与え ずインビボで旧Ｖの複製を抑制する量が含有される。ｒＨＩＶ抑制量」とは、例 えばここに記載されているアッセイによって測定される旧■抑制効果を発揮する のに、十分な活性成分の量を示す。

これらの：Ａ４物は、０２から４０ＨＭの活性成分の血清濃度を生じるべきであ る。好ましい濃度範囲は０．２から２０ＨＭであり、最も好ましくは１からｔｏ ｕｙである。薬学的組成物は１日当り体重ｋｇ当り１から６０ミリグラムの化合 物の投与を与えるべき上記の実施例で示されたように、１日当たり投与されるＡ ｚｄｄＭｅＣの量は、細胞培養データに基づき予測される量よりはるかに少ない 。なぜなら半減期がＡＺＴに比べて２倍から３倍大きいからである。しかしなが ら、化合物は細胞内でＡＺＴに変換するので効力は問題なく、これは食品医薬品 局エイズ対策委員会（Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａ【ｉ ｏｎ　ｆｏｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＡＩＤＳ）で承認されている。さら にＡｚｄｄＭｅＣ投与は、骨髄前駆細胞及び赤血球前駆細胞に加えてＰＢＭ及び その他の血液細胞へ、細胞内でＡＺＴを好ましく運ｊζ方法である。

投与量は患者及び緩和されるべき疾病の発病度に幾らか依存する。患者により、 特定の投与処方が、投与される人の個々の必要性及び専門的な判断により、継続 的に調整されるべ作用を損なわない他の活性物質または所望の作用を補う物質（ 例えば、抗性物質、抗真菌剤、抗炎症剤、またはその他ヌクレオチド抗旧Ｖ化合 物を含むその他の抗ウィルス剤）と混合され得る。ＡｚｄｄＭｅＣがＣＮＳに浸 透せず、ＡＺＴは浸透するので、ＡＺＴとＡｚｄｄＭｅＣの混合物は特に好まし いと考えられる。

活性化合物の好ましい投与法は経口投与である。経口の組成物は一般的に不活性 な希釈剤または食用可能な担体を含む。

これらは、ゼラチンカプセルに封入され得、または錠剤に圧縮され得る。治療の ための経口投与のために、活性化合物を賦形剤に入れ、錠剤、トローチ、または カプセルの形で使用され得る。薬学的に適合性のある結合剤、及び／または補助 剤を組成物の一部として含み得る。

錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分または同様の性質の化合物の いずれかを含み得る：結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、滑剤（ｇＪｉｄａｎｔ ）、甘味剤、または芳香剤。

投与ユニットの形がカプセルであるとき、上記のタイプの物質に加えて、脂肪油 のような液体担体を含み得る。さらに、投与ユニットの形は、投与ユニットの物 理的形状を変える種々の他の物質（例えば、しよ糖コーティング、セラック、ま たはその他の腸溶剤）を含み得る。薬学的に受容され得る、静脈または皮下に投 与するための賦形剤もまた知られている。

静脈に投与されるときは、生理食塩水またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ ）が好ましい。

好適な実施態様では、例えば化合物が移植組織及びマイクロカプセル化輸送／ス テムを含む除放性製剤のような、体内から活性化合物が迅速に排出することを防 ぐ担体と共に調製される。生分解性、生体適合性のポリマー、例えばエチレンビ ニルアセテート、ポリアンハイドライド、ポリグリ；−ル酸、コラーゲン、ポリ オルトエステル、及びポリ乳酸等が使用され得る。このような製剤の調製方法は 、当業者には明らかなことである。物質はＡｌｚａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　 ａｎｄ　Ｎｏｖａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ！ｓ、Ｉｎｃから市販されてい る。シボ゛ノーム懸濁液（ウィルス１に対するモノクローナル系の抗体を含む、 感染細胞に標的されたリポソーム）もまた、薬学的に受容可能な担体として好適 である。これらは、当業者に既知の方法により、例えばＵ、Ｓ、Ｐ、Ｎｏ、４． ５２２．１１１１に記載の方法で調製される。例えば、リポソーム製剤は、適当 な脂質（例えばステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルオ スファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、及びコレステロール ）を無機の溶媒に溶解させ、溶媒を蒸発させると、容器の表面に乾燥した脂質の 薄膜が残留する。３°−アジド−２゜、３−ジデオキシ−５−メチルシチジンの 水溶液またはそのモノホスフェート、ジホスフェート、及び／またはトリホスフ ェート誘導体を容器に入れる。次に容器を、手作業により攪拌すると容器の側面 から詣１を物質が剥がれ、脂質凝集物が分散し、このことにより、リポソーム製 剤液が形成される。

［実施５ＡＩ　９　：　ＡｚｄｄＭｅＣのホスフェート誘導体の調製］ＡＺｄｄ ＭｅＣのホスフェート誘導体を３°−アジド−２°、３°−ジデオキシ−５−メ チル−シチジンのリン酸化により下記のように調製すモノホスフェートは、１ｍ ａ　ｉらのＪ、　Ｏｒ　、　Ｃｈｅｍ、　３４（６）、　１５４７−１５５０　 （１９６９年６月）の方法によって調製され得る。例えば、約１００ｍｇのＡｚ ｄｄＭｅＣ及び約２８０１の示スホリルクロライドを攪拌しながら約８ｍｌの乾 燥酢酸エチル中で約０　’Ｃで約４時間反応させる。反応物を氷で急冷する。水 相を、活性化された炭素カラムで精製し、エタノールと水との１＝１混合液中の ５％水酸化アンモニウムで抽出する。溶離液を蒸発させることにより、１００　 ｍｇのアンモニウム−（３−アジド−２゛、３−ジデオキシ−５−メチルシチジ ン）−５′−モノホスフェートが生じる。

ジホスフェートはＤａｖｉｓｓｏｎらのＪ、　Ｏｒ　、　Ｃｈｅｌｌ、５２（９ ）、　１７９４−１１１０１　（１９１１７）の方法によって調製され得る。３ ・−アジド−２・。

３゛−ジデオキシ−５−メチルシチジン−５゛−ジホスフェートは、ＡｚｄｄＭ ｅＣのトシレートから調整され得る。このＡｚｄｄＭｅＣのトシレー１−　例Ｌ 　ハ、ＡｚｄｄＭｅＣをトシルクロライドと共にピリジン中で室温で２４時間反 応させ、通常の方法で（例えば洗浄、乾燥、及びその結晶化により）生成物を処 理することにより調製され得る。

トリホスフェートはＨｏａｒｄらのＪ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８７（８ ）。

１７１１５−１７Ｈ（１９５５＞の方法により調製される。例えば、３−アジド −２°、３゛−ジデオキシ−メチルシチジン−５°モノホスフエートを、（当業 者に既知の方法によりイミダゾールを作成することにより）活性化し、ＤＭＦ中 のトリプチルアンモニウムホスフＬ−トで処理する。反応により、まず３−アジ ド−２°、３−ジデオキシ−５−メチルシチジン−５゛−トリホスフェートが、 いくらかの未反応のモノホスフェート及びジホスフェートと共に生じる。

ＤＥＡＥカラムの陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製に続き、トリホス フェートとして、ＡｚｄｄＭｅＣが例えば４ナトリウム塩として、単離される。

ＡｚｄｄＭｅＣのリン酸及びアシル酸の誘導体のような構造的類似物、及びその Ｃ−ヌクレトシドの誘導体は、インビボで通常同様の濃度の範囲で、同様の活性 を持つ。

活性抗ウィルス剤としての３゛−アジド−２°、３°−ジデオキシ−５−メチル シチジンを含む■１ｖ処理のための組成物に関する本発明の修正と変更、及びこ れらの使用方法は、前述の進んだ本発明の詳細な記述から当業者には自明のこと であり、添付の請求の範囲内に包合される。

？ｉ！・１−＃２ 北砦ｒｅ　〕 Ｌ′ｌ鎮８−γに 一／Ｇ；／だ５−ｚ ／−、、−ｒ 、−’、Ｊ−電’ｉｆして；：−ビ 補正書の写しく翻訳文）提出書く特許法第１８４条の８）平成３年１２月５日圃

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の一般式の活性化合物のＨＩＶ阻害量を輸送するための薬学的に受容さ れ得る手段を含む組成物：▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ＲはＯＨ、モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェート 、または薬学的に受容され得るそれらの塩である。
2. ２．前記輸送手段が、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、滑剤および補助剤でな る群から選択される物質をさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記輸送手段が、油、水、生理食塩水、リン酸塩、緩衝液、ポリエチレング リコール、グリセリン、プロピレングリコールおよびこれらの組み合せでなる群 から選択される、請求項１に記載の組成物。
4. ４．前記薬学的に受容され得る輸送手段が、前記化合物が生体から速やかに除去 されることを防ぐ、請求項１に記載の組成物。
5. ５．前記薬学的に受容され得る輸送手段が、リポソームの懸濁液を含む、請求項 ４に記載の組成物。
6. ６．前記薬学的に受容され得る輸送手段が、生分解性の移植組織を含む、請求項 ４に記載の組成物。
7. ７．約０．２μＭと４０μＭとの間の血清濃度の化合物を生じる、請求項１に記 載の組成物。
8. ８．約０．２μＭと２０μＭとの間の血清濃度の化合物を生じる、請求項７に記 載の組成物。
9. ９．抗菌性物質、抗真菌剤、化学療法剤、抗ウィルス剤、およびそれらの組み合 せでなる群から選択される化合物をさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
10. １０．前記抗ウィルス剤がＡＺＴである、請求項９に記載の組成物。
11. １１．次式を有する化合物のＨＩＶ阻害量を輸送する組成物を提供することを包 含する、細胞におけるＨＩＶの複製を阻害する方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ここで、ＲはＯＨ、モノホスフェート、ジホ スフェートまたはトリホスフェート、または薬学的に受容され得る担体と組み合 わされた薬学的に受容され得るそれらの塩である。
12. １２．結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、滑剤および補助剤でなる群から選択さ れる物質を提供することをさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
13. １３．油、水、生理食塩水、緩衝液、ポリエチレングリコール、グリセリンおよ びプロピレングリコールでなる群から前記担体を選択することをさらに包含する 、請求項１１に記載の方法。
14. １４．前記化合物が生体から速やかに除去されることを防ぐことをさらに包含す る、請求項１１に記載の方法。
15. １５．前記薬学的に受容され得る担体が、リボソームの懸濁液を含む、請求項１ ３に記載の方法。
16. １６．前記薬学的に受容され得る担体が、生分解性の移植組織である、請求項１ ３に記載の方法。
17. １７．前記組成物が、約０．２μＭと４０μＭとの間の血清濃度の化合物を生じ る、請求項１１に記載の方法。
18. １８．前記組成物が、約０．２μＭと２０μＭとの間の血清濃度の化合物を生じ る、請求項１１に記載の方法。
19. １９．抗菌性物質、抗真菌剤、化学療法剤、抗ウィルス剤、およびそれらの組み 合せでなる群から選択される化合物を提供することをさらに包含する、請求項１ １に記載の方法。
20. ２０．前記組成物がさらにＡＺＴを含有する、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記化合物を、腸溶性のコーティング（ｅｎｔｅｒｉｃ　ｃｏａｔｉｎｇ ）において薬学的に受容され得る担体とともにカプセル化することをさらに包含 する、請求項１１に記載の方法。
22. ２２．細胞の混合物中の非赤血球細胞にＡＺＴを優先的に投与する方法であって 、３′−アジド′２′，３′−ジデオキシ−５−メチルシチジンを投与すること を包含する、方法。