JPH04506796A - ウィルス感染及び腫瘍の処理のためのＤ―アスパラギン酸β―ヒドロキサメート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス感染及び腫瘍の処理のためのＤ−アスパラギン酸β−ヒドロキサメート 本発明は、下記一般式： で表わされるＤ−アスパラギン酸β−ヒドロキサメート（ＤＡＨ）の医薬として の適用に関する。

ＤＡＨは、アスパラギン酸のＤ異性体又はその誘導体の１つの活性化されたアシ ル基とヒドロキシルアミンとの下記反応に従っての反応により形成され得る：（ ここでＣＯＸは酸、アミド、エステル又は無水物基である）。

ＤＡＨはまた、Ｄ−アスパラギン酸から酵素的に調製され得る。それは、既知の 商業的に入手できる製品、たとえば１９８７年のカタログ（Ｆｒｅｎｃｈ　ｖｅ ｒｓｉｏｎ）におけるＣｏｏ＋ｐａｎｙＳＩＧ？ｌＡの製品Ａ９００９である。

好都合で且つ好ましい方法によれば、ＤＡＨは、Ｄ−アスパラギン又はＤ−アス パラギン酸β−エチルエステルのヒドロキシアミン化により調製され、後者は、 下記反応配列に示されているようにＤ−アスパラギン酸のモノエステル化により 得られる： ＤＡＨの化学的特徴化は、まず初めに、次のようなその元素分析から誘導化され るニ 一般式：　Ｃ４Ｈａ　Ｎｚ　Ｏａ 分子量：１４８．１ Ｃ＝３２．５６％　Ｈ＝５．５％　Ｎ＝１８．６％　０＝４１．９８％ ＤＡＨは下記スペクトル分析によりさらに特徴づけられる：用いてＢｒｕｃｋｅ ｒ装置上で、それぞれ５０．４ＭＨｚ及び２００ＭＨｚでその１３Ｃ及びＩＨＮ ＭＲスペクトルにより分析された。異なったシグナルに対応する化学シフトは、 外部対照として取られるテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対してｐｐ■で表わさ れた。

１３ＣＮＭＲスペクトルは、それぞれ下記のものに対応する４種の特徴的なシグ ナルを含むニ ー酸官能基ＣＣ００Ｈ）　：　１７２．８ｐｐｔｓ−ヒドロキシメート官能基（ ＣＯＮＨＯＨ）　：　１６８．　４ｐｐｍ−ＮＨｔ官能基を担持する炭素　：　 ５１．　ｌｐｐｍＣＨを官能基を担持する炭素　：　３２．２＋）Ｉ）Ｉｌｌ。

’ＨＮＭＲスペクトルにおいては、ＤＡＨのα−及びβ−位置での３個のプロト ンがＡＢＸタイプのシステムを構成する。Ｈ３はＨａ　（Ｊ＝７．５Ｈｚ）と結 合し、そしてそれによって得られる２種のピークのそれぞれはＨβ’（Ｊ＝４． ５ｔｌｚ）により再び分割され、そしてクオドラブレフトが４．２ｐｐ１１１で 得られる。Ｈβ′はＨｓ　（Ｊ＝１６Ｈｚ）によりそのピークの分割を受け、そ して次にＨａ　（Ｊ　＝４　、　５　Ｈｚ　）によりそのピークの分割を受け、 ２．９ｐｐｍでクオドラプレットを形成する。

酸素及び窒素原子に結合されるプロトンは、０２０により交換され、そしてそれ らのシグナルは、そのピーク（ＨＯＤ）において５　ｐｐａ＋で生じる。

ｉｔ立捉抜： ＤＡＨの質量スペクトルは、ＤＯｅＶのイオン化エネルギーによりＶＡＲＩＡＮ 　ＭＡＴ　ＣＨＳ上で確立された。ＤＡＨの分子イオンはゼロの相対存在量を有 する。

ｍ／ｅ（％）　：　Ｍ”　１４８（０）　：　９７（１１）、　９７（３７）； 　５４（３５）；４４（１００）ｉ　４３（９１）；　４２（４３）；４Ｎ２９ ）；　２Ｂ（７５）；　２７（２９）；２６（８０）；　１Ｂ（４２）；　１７ （２３）。

立光叉左失上 ＤＡＨのヒドロキサメート官能基は、Ｂｅｃｌｖａｎ　ＣＵ　７０タイプの分光 光度計を用いて、５５０ｎｍでの比色法により定量化される、赤−紫の配色を与 えるＦｅ”−ヒドロキサメート錯により示される。

旦込」廊と組【汰： ｐＨ及び温度の関数としてのＤＡＨの安定法が、ヒドロキサメート官能基の特定 の比色アッセイにより１力月間にわたって決定された。下記表におけるその結果 は、水中において、ＤＡＨは５０°Ｃの温度まで安定することを示す。生成物の 有意な分解は、下記第１表に示されるように、ｐＨの極端な条件下でのみ観察さ れる。

１土ｌ ｐＨ及び温度に従っての３０日間にわたってのＤＡＨの分解率（％） ＋４　４％　０％　４２％ ＋２５　３６％　０％　７８％ ＋５０　１００％　０％　１００％ 本発明の目的は、特にウィルス感染及びより特定にはレトロウィルス、特にＡＩ ＤＳを引き起こすウィルスの処理のために、及び腫瘍の処理のために向けられる 、医薬として０ＤＡＨの適用である。

フランス特許第２．６００，２５６号においては、ＤＡＨがＬ−アスパラギナー ゼの抗腫瘍活性を可能にすることが示されている。Ｌ−アスパラギナーゼは抗腫 瘍剤であることは実際知られている。この活性は不十分であるので、Ｌ−アスパ ラギナーゼと他の生成物とを組合すことによって強化する努力が行なわれて来た 。ＤＡＨとの組合せは、実際、開発され得る結果を生まなかった。

驚くべきことには、ＤＡＨが、特にＡＩＤＳの原因であるウィルスに対して抗レ トロウイルス活性を単独で有することが見出された。特定の投与量で投与される ＤＡＨは腫瘍に対、して阻害作用を有することもまた見出された。

ウィルス感染を攻撃することに関して行なわれる進歩にもかかわらず、抗生物質 のような安全且つ効果的な抗ウィルス剤はまで入手できないことが良く知られて いる。

それらの作用Ｈ様に基づいて、抗ウィルス剤は、３種のシテゴリ−（その境界は 時々任意である）；すなわち化学的物質、免疫システム刺激剤及び抗ウイルス細 胞状態の活性剤に広く分類され得る。

化学物質は最っとも広範であるが、しかしそれらの作用範囲は一般的にひじょう に制限され、そしてそれらはしばしば、細菌により抗生物質を選択するのと同じ 態様で、結局、耐ウィルス変異体を選択する（ＤＥ　ＣＬＥＲＣＱ　Ｅ、、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　２０６゜１〜１３．１９８２　；　ＢＥＣＫＥＲＹ、　 ａｎｄ　）ＩＡＤＡＫ　Ｊ、、　Ｐｒｏｇ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、。

皿、１〜４４．１９８０）。

種々のタイプのワクチンとは異なって、免疫応答活性剤は身体の非特異的防御（ マクロファージ、天然の“キラー°゛細胞）又は、まれな特異的防御（“Ｂ”又 は“Ｔ”リンパ球）を活性化することができる物質である。大部分、これらの物 質はまた実験的な段階で存在する。化学物質と比較すれば、それらの作用１！様 の実質な特徴は、ひじょうに広範囲の作用であり、そしてそれらが耐変異体を選 択することができない事実である。しかしながら、それらは現在、数的に制限さ れ、そして比較的無効果であるが、但し、この方向への進歩は最近、進行してい る（ＫＯＦＦ　Ｗ、Ｃ，、ＳＩ’ｆＯＷＡＬＴＥＲＳ、Ｄ、、　ＩＩＡＭＰＡＲ Ｂ。

ａｎｄ　ＦＩＤＬＥＲ１，Ｊ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２８．４９５〜４９６ ．１９８５）。

、抗ウイルス細胞状態の誘発剤は、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ誘発剤 及びＩＦＮ置換体を含んで成る。それらは、ウィルス感染に対する耐性状態を細 胞に発生せしめる特徴的な特徴を有するまだひじょうに制限された物質グループ を含んで成る。これらの物質は、化学物質の細胞レベルでの作用及びひじょうに 広範囲の免疫システム活性剤の作用のための能力を同時に有する。それらはすべ ての細胞（感染されていても、されていなくても）に対して作用するので、それ らの効能における決定的な要因は、細胞に対する毒性のそれらの低い力である。

ウィルスの中で、レトロウィルスは、特に攻撃するのに重大且つ困難である条件 の原因であるグループを示す。

レトロウィルス及びそれらの発癌力は、新しい科学的な発見ではない。今世紀の 初期、何人かの研究者は、白血病及び固形腫瘍を引き起こすことができる伝染性 物質を動物において同定した（ＲＯＵＳ　Ｐ、、Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ 、、　’５６＋　１９８．１９１１）。続く１０年間、レトロウィルスは、多く の動物種に見出された。

研究者の不断の努力は、１９８０年、初めてのヒトレトロウ（ＨＴＬＶ−１）の 単離を導びいた（ＰＯＩＥＳＺ　Ｒ，Ｊ、など６、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７、７４１５．　１９８０）　、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１ は、まれで且つ極端な悪性癌、すなわち成人のＴリンパ球白血病（これは、日本 、アフリカ及びカリブのある地域において風土病である）を生ぜしめる。

レトロウィルスにより引き起こされるもう１つのひしよう記重大且つ重要な状態 は、ＡＩＤＳである。

ＡＩＤＳの最初の患者は、１９８１年に診断された（ＧＯＴＴＲＥＢ。

Ｍ、Ｓ、など０、Ｗｅｅｋｌｙ　Ｒｅｃｏｒｄ、　３０．２５０．１９８１）。

原因物質、すなわちヒト免疫欠損ウィルス（ＨＩＶ）（レトロウィルス）は、１ ９８３年に発見された（ＢＡＲＲＥ　５ＩＮＯＵＳＳＩ　Ｆ、など０．５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２２０．８６８．１９８３）、このレトロウィルスに対して活性的で ある物質が、現在捜しめられている。近い将来においてワクチンの開発に関与さ れる問題の点から、このレトロウィルスの複製を阻害することができる生成物の 研究が必要であるう 抗ウィルス活性に関する実験研究は、時々、フレンドウィルスにより誘発される 疾病を包含する。

ＦＬＹウィルスは、血球増生に対して急速な効果を生むタイＣネズミレトロウィ ルスであり、その赤芽球前駆体はこのウィルスの標的細胞である。フレンド複合 体は、ｌ’　Ｓ　Ｆ　Ｆ　Ｖ（肺臓病巣形成ウィルス）として知られる、複製を 欠失する形質転換性ウィルスを含んで成る。なぜならば、それは、感染された成 熟マウスの肺臓における形質転換された細胞及び複製のために作用する、Ｆ−Ｍ ｕＬＶ（フレンドネズミ白血病ウィルス）として知られるヘルパーウィルスの巨 大な病巣を誘発することができるからである。このウィルスの２種の変異体、す なわち貧血症を誘発するＦＶ−Ａ及び赤血球増加症を誘発するＦＶ−Ｐが存在す る。ＦＬ−Ｖにより誘発される赤白血病は２つの相、すなわち増殖のために制限 された能力を有する比較的成熟した赤芽球前駆体の数の急速な上昇により特徴づ けられる初期段階及び増殖のための高い能力を有する未分化前駆体の発生により 特徴づけられる後期段階を示す、４ｙ　互主において、この疾病の現れは、肝腫 脹により、肺臓及び骨髄における赤芽球増殖により、赤血球増加症によ本発明に よれば、ＤＡＨが、レトロウィルスの種類に属するウィルスの増殖、又は複製が それらに関係されるウィルス、たとえば“ヘパドナビリダニ（Ｈｅｐａｄｎａｖ ｉｒｉｄａｅ）　”として言及されるウィルスの増殖の実質的な阻害を生成する ことは知られている。これば、ＡＩＤＳウィルス（ＨＩＶ）により４７旦上旦で 及びタイプＣネズミレトロウィルスであるＦＲＩＥＮＤウィルス（ＦＬＶ−フレ ンド白血病ウィルス）によりイン　ビ±で示されて来た。

いづれか他のウィルスのようなレトロウィルスは、細胞の生合成装置をそれら自 体の利点に変えないで、複製することはできない。特別な特徴は、遺伝子情報の 正常な流れを逆にするためのそれらの能力に存在する。レトロウィルスにおいて は、遺伝子材料は、ＲＮＡから成り、ここで酵素、すなわち逆転写酵素がＤＮＡ を合成するために利用され；このウィルスＤＮＡは、宿主細胞のゲノムに組込ま れ得る。

本発明の目的：、ｉ′また、ウィルス感染、特にＡＩＤＳに関連する感染の処理 及び腫瘍の処理のために向けられる新規の医薬組成物にも関し、その組成物は医 薬的に許容できるビークルに活性成分としてＤ−アスパラギン酸β−モノヒドロ キサメート（ＤＡＨ）を含むことによって特徴づけられる。本発明の組成物はま た、不活性又は薬理学的に活性的な添加剤も含むことができる。

本発明の医薬組成物は、注射の目的のために生理学的溶液に使用するすぐ前で溶 解されるべき、活性物質の凍結乾燥粉末の形で取られ得る。次のその医薬は、非 経口的に、たとえば静脈内、腹腔内、を髄液内及び同様の態様で投与され得る。

注射のためには、活性成分は、投与のための所望する濃度が得られるまで、生理 学的溶液に溶解される。

本発明の医薬組成物はまた、経口投与のために適切な形を取ることができる。た とえば、適切な形は、錠剤、硬質ゼラチンカプセル、糖剤、粉末及び顆粒である 。

本発明の医薬の投与量に関しては、投与されるべき量は、処理期間、投与の頻度 、宿主及び疾病の性質及び重症度に従って異なることが示されるであろう。１ｇ 以上の量の投与及び制限された期間にわたっての間隔で活性物質数ｇまでの範囲 であり得る投与が、下記の詳細な説明から明らかになるであろうように、言及さ れ得る。

本発明はまた、ウィルス感染及び腫瘍の処理のために向けられる医薬組成物を製 造するためへのＤ−アスパラギン酸β−モノヒドロキサメート（ＤＡ）（）の使 用も包含する。

本発明のもう１つの目的は、Ｄ−アスパラギン酸β−モノヒドロキサメート（Ｄ ＡＨ）の調製方法に関し、ここでその調製方法は、Ｄ−アスパラギン酸β−エチ ルエステルを得る目的のためにＤ−アスパラギン酸のモジエステル化及びＤＡＨ を導びく、Ｄ−アスパラギン酸β−エチルエステルのヒドロキシアミン化（ｓｉ ｃ）を含んで成る。

最後に、本発明は医薬組成物を調製するための方法を包含し、ここで前記方法は 、Ｄ−アスパラギン酸β−モノヒドロキサメート（ＤＡＨ）が、注射の目的のた めに生理学的溶液に使用するすぐ前で、溶解に向けられる凍結乾燥粉末の形で調 製され、又は他方、活性物質が経口投与のために適切な形に調製される（ここで １又は複数の不活性又は薬理学的に活性的な添加剤と共に適切である）ことを特 徴とする。

ＨＩＶの　′Ｗに・　るＤＡＨのｔ 本発明によれば、ＤＡＨがＨＩＶのウィルス性増殖を完全に阻害することが示さ れた。この阻害は投与量依存性である。

その試験はまず、健康なドナーのリンパ球を包含する（第１及び２図）、この活 性は、ＨＩＶの複製の２種のモデル：（ａ）精製されたウィルスにより感染され た正常なリンパ球及び（ｂ）ＡＩＤＳ患者のリンパ球及び正常なリンパ球の同時 培養物に対して示され得る。逆転写酵素の活性は、ウィルス増殖の基準として細 胞培養上清液中で２２日間、測定された。ＤＡＨによる処理は、操作のＤｏから り、まで７２時間続いた（第３，４及び５図）。

リンパ球は生成物による処理の間、増殖し、そしてこの生成物はＨＩＶウィルス により感染されていないリンパ球に対して毒性でないことが見出された（第１及 び２図）。対照的に、ＤＡＨは、ＡＩＤＳウィルスにより感染されたリンパ球に 対してより毒性であることが示された（第６及び７図）。

里上園■五皿 健康なドナーのリンパ球の増殖速度に対するＤＡＨの効果。

（・）ＤＡＨの不在 （０）ＤＡＨ濃度−０，５ｓ＋Ｍ （ロ）ＤＡＨ濃度＝１−Ｍ （Δ）ＤＡＨ濃度＝１．５ａＭ （◇）ＤＡＨ濃度−２−阿 ・横座標：培養時間（日数） ・縦座標：増殖速度 策又口坐畿所 健康なリンパ球の細胞死亡率に対するＤＡＨの効果。

（・）ＤＡＨの不在 （０）ＤＡＨ濃度＝０．５ｄ （ロ）ＤＡＨ濃度＝１１ （Δ）ＤＡＨ濃度＝１．５ｍＭ （◇）ＤＡＨ濃度＝２ａ＋Ｍ ・横座標：培養時間（日数） ・縦座ｗＩ：死んだ細胞の割合（％） １主園旦説里 ＡＩＤＳ患者のリンパ球及び正常なリンパ球の同時培養物によるウィルス逆転写 酵素の生成に対する３日間のＤＡＨ処理の効果。

（・）ＤＡＨの不在（対照） （○）ＤＡＨ濃度＝１ｍＭ ・（ロ）ＤＡＨ濃度＝１．５ｍＭ ・横座標：　ＤＡＨの接種後の培養物の増殖時間（日数）・縦座標：逆転写酵素 活性（ＣＰＭ／ミリオン個の細胞）里互皿箆反皿 精製されたウィルスにより感染されたリンパ球の培養物によるウィルス逆転写酵 素の生成に対する３日間のＤＡＨ処理の効果。

（・）ＤＡＨの不在（対照） （０）　ＤＡＨさ１度−０，５ｓＭ （ロ）ＤＡＨ濃度冨１．ＯｍＭ （Δ）ＤＡＨ濃度−１，５ｓ＋Ｍ （◇）ＤＡ）Ｉ濃度−２，Ｏ＋＋ｅＭ ・横座標：　ＤＡＨの接種後の培養物の増殖時間（日数）・縦座標：逆転写酵素 活性（ＣＰＭ／ミリオン個の細胞）茅五辺ユ説１ ピークの逆転写酵素活性の最大に対する投与量効果。

（０）同時培養物 （ロ）精製されたウィルスにより感染された培養物・横座標：使用される投与量 （ＩＩＭ）・縦座標：逆転写酵素活性 玉旦皿■望ユ 感染されたリンパ球の増殖速度に対するＤＡＨの効果。

（・）ＤＡＨの不在 （０）ＤＡＨ濃度＝０．５ａ＋Ｍ （ロ）ＤＡＨ濃度＝１０１Ｍ 、（Δ）ＤＡＨ濃度＝ｌ、５ｍＭ （◇）ＤＡＨ濃度＝２ｍＭ ・横座標：培養時間（日数） ・縦座標：増殖速度 ■１区立脱五 感染されたリンパ球の細胞死亡率に対するＤＡＨの効果。

（・）ＤＡＨの不在 （○）ＤＡＨ濃度＝０．５−門 （ロ）ＤＡ’Ｈ濃度＝１ｄ （△）ＤＡＨ濃度＝１．５ｗ＋Ｍ （◇）ＤＡＨ濃度＝２１１１Ｍ ・横座標：培養時間（日数） ・縦座標：死んだ細胞の割合（％） フレンドウィルスによ　沃　れた　に・ｔ”６ＤＡＨΔ勉工 ＦＬＹウィルスは、血球増生に対して急速な効果を生成するタイプＣネズミレト ロウイルスであり、赤芽球前駆体はこのウィルスの標的細胞である。フレンド複 合体は５ＦＦＶ（膵臓病巣形成ウィルス）として知られる、複製を欠失する形質 転換性ウィルスを含んで成る。なぜならば、それは、感染された成熟マウスの肺 臓における形質転換された細胞及び複製のために作用する、Ｆ−ＭｕＬＶ（フレ ンドネズミ白血病つノルス）として知られるヘルパーウィルスの巨大な病巣を誘 発することができるからである。このウィルスの２種の変異体、すなわち貧血症 を誘発するＦＶ−Ａ及び赤血球増加症を誘発するＦＶ−Ｐが存在する。ＦＬ−Ｖ により誘発される赤白血病は２つの相、すなわち増殖のために制限された能力を 有する比較的成熟した赤芽球前駆体の数の急速な上昇により特徴づけられる初期 段階及び増殖のための高い能力を有する未分化前駆体の発生により特徴づけられ る後期段階を示す。４７ＹＭにおいて、この疾病の現れは、肝腫脹により、肺臓 及び骨髄における赤芽球増殖により、赤血球増加症によ細胞培養物におけるフレ ンドウィルスの複製に対するＤＡＨの効果が研究された。

ポリブレンにより処理されたＳＣＩ細胞の培養物がＦＬＹにより感染された（２ Ｘ１０’個の細胞当たり５Ｘ１０’個の感染性粒子）。次に、その細胞は、種々 の濃度のＤＡＨと共に培養され、そしてＦＬＹ複製の活性が、感染後、２，４及 び６日で培養培地上清液に出現する逆転写酵素活性をアッセイすることによって 測定された。

ＤＡＨによるＦＬＶ複製の有意な阻害が観察される。逆転写酵素活性は、０．２ ｍＭの濃度で０ＤＡＨにより約７０％、０　、　”　５ｍＭの濃度でのＤＡＨに ・ｊす８０％及び工ＩＩＭの濃度でのＤＡＨにより９０％、低められる。

他方、０．２及び０．５ｎ＋Ｍ％ＤＡＨの投与量は、ＳＣＩ細胞に対して細胞静 止効果を有さず、そしてｌｄ濃度のＤＡＨのみが、細胞分割を適度に阻害するこ とが観察される。従って、観察された抗−ＦＬＶ効果は、細胞代謝に対するＤＡ Ｈの毒性効果に間接的に起因しないが、しかしレトロウィルスの複製に対して直 接的な効果に起因する。

逆転写酵素は種々の抗レトロウイルス剤の標的であるので、ＦＬＹの逆転写酵素 （ＲＴ）活性に対するＤＡＨの効果を試験することが好都合である。、この試験 は１．ＲＴＯ源としてひじょうに精製されたＦＬＹの調製物及び基質としてポリ （Ａ）−オリゴ（ｄＴ）を用いて行なわれた。基質は次の順序で反応培地中に導 入された：所望する濃度でのＤＡＨ１精製されたウィルス、ポリ（Ａ）ニオリボ （ｄＴ）、、ｄＴＴＰ＋　（’Ｈ）−ｄＴＴＰ。

その結果は、ＤＡＨが、抗レトロウイルス効果が細胞培地に観察される濃度でＲ Ｔ活性に対する効果を有さないことを示す。従って、代謝されていない生来の形 でのＤＡＨはＲＴインヒビターでない。

他の試験において、ウィルスがＤＢＡ／２マウスにおける連続的な腹腔的継代培 養により維持された。この維持は、動物の＊臓から２１日ごとに行なわれた。Ｄ ＡＩ（の活性は、ＤＡＨと共に又はＤＡＨを伴わないで、ウィルスにより注入さ れた動物の生存時間を比較することによって評価された。

処理は、ウィルス感染の後、３日目で始まった。なぜならば、この時間の経過は 、感染されたウマスの赤芽球前駆体のゲノムにおけるウィルスの配列の存在のた めに必要があると思われるからである。毎日の注入の数及び与えられた投与量の ための処理期間を変えた後、最初の１０日間、Ｉｇ／ｋｇ投与量０）ＤＡＨの３ 回の注入及び次の２０日間、Ｉｇ／ｋｇ投与量のＤＡＨの２回の注入が２３９％ のＴ／Ｃを生成することが確立した。その結果は、次の表に記録される：１ｌ ＤＡＨＩＸ３／ｄ（１）　ＤＩ−３０２３９，８６５／１０（１）動物は、Ｄｉ −１０から１日当たり３度及びＤ　１１−３０から１日当たり２度処理される。

（２）Ｔ／Ｃ＝対照動物の生存時間（Ｃ）に対する処理された動物の生存時間（ Ｔ）の割合。

１２５％に等しいか又はそれ以上の活性Ｔ／Ｃの基準が有意であることが注目さ れる。

Ｄ　Ａ、　Ｈの　ゝ 本発明によれば、特定の用量で投与される場合、下記に定義されるように、腫瘍 に対する阻害作用を有することも示された。

フランス特許出願第２．６００，２５６号（上記）において、３匹のネズミ腫瘍 モデル（上記腫瘍細胞により接種されている）、すなわち１２１０白血病、ＲＢ ’Ｌ５リンパ腫及びＢＩ３黒色腫において５日間、６００■／ｋｇ１日に基づい てのＤＡＨの処理後、そのＤＡＨはインビボで活性を示さなかったことが報告さ れている。他方、インビトロで行なわれた同じタイプの試験において、腫瘍細胞 の増殖の阻害率（５０％ＩＣ）が、Ｉｆ！（ｓｉｃ）の細胞培地当たり０．８〜 １ｍＭの間で始まるＤＡＨの投与量により生じ、そして他方、治るのにひじよう に困難である１２１０白血病のネズミ腫瘍モデルにおいて、１日当たり４回の割 合での３日間のＩｇ／ｋｇ体重の投与が処理された動物の生存性のひじように有 意な拡張を導びくことか観察された。

これらの同じ投与量条件下で、Ｌ−アスパラギン酸β−ヒドロキサメートはひじ ように毒性である。従って、Ｌ−誘導体に対しての前記り一誘導体の投与量の上 昇は、同じ投与量でのし一誘導体により示される毒性を示さないＤ−誘導体の活 性を示す（ＤＡＨのための５０％ＬＤは１０　ｇ／）ｃｇであり、そしてＬＡＨ のための５０％ＬＤは２．５ｇ／ｋｇである）。

マウスの処理の間使用される投与量は、３日間の最少期間（この期間は１０日ま で延ばされ得る）　、０．５　ｇ／ｋｇから１．５ｇ／ｋｇに変化した。

しかしながら、５　ｇ／ｋｇまでの高い投与量を使用することが可能であり、そ して投与量が低い場合、より長い期間の処理が必要とされることが事実であるこ とが判明した。

ＤＡＨびＬＡＨのインビボでの　７ ＤＡＨ及びＬＡＨの抗腫瘍活性がＬ１２１０白血病モデルに対して研究された。

Ｌ１２１０白血病細胞は、雄のＢ６Ｄ２Ｆ１／Ｊマウスにおける腹腔的継代培養 により維持される。治療試験のために使用される細胞の数は、ＰＢ３０．５ｄに おいてマウス当たり１０５（ｓｉｃ）個の細胞である。観察期間は３０日である 。

結果は次の第３表に示される： 玉主表 ＤＡＨＩＸ３／ｄ　１−１０　３４７　３１５　＋１．３００ＤＡＨ１，５ｘ４ ／ｄ（１）　１．２．３．４　３４７　３１５　＋１．０００ＤＡＨ１，５Ｘ４ ／ｄ　１．２．３　２７６　０１５　＋１．２００Ｄ／ｌ）Ｉ　１ｘ４／ｄ　１ ．２．３　１７１　０１５　＋１．１００ＤＡＨＯ，５ｘ４／ｄ　１．２．３　 １１３　０１５　＋１．４００ｔ、ＡＨ１，５ｘ４／ｄ　１　５０　０１５　− ＬＡＨＩＸ４／ｄ　１，２　６５　０１５　−（１）動物は１日４回処理される 。

（２）Ｔ／Ｃ＝対照動物の生存時間（Ｃ）に対する処理された動物の生存時間の 割合。

（３）３０日日日。

（４）ＤＩからＤ５への重量の変化（ｇ）。

ＤＡＨはＩｇ／ｋｇ以上の又はそれに等しい用量での１日３又は４回の投与量に よりこのモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示すことが見出された。対照的に、 ＬＡＨに関しては、同じ手段は毒性のために適用できず、そして低い投与量での 手段を用いてさえ、抗腫瘍活性は観察されないが、しかし常にひじょうに実質的 に毒性である（対照グループの前、ＬＡＨにより処理された動物の死）。

ＤＡＨの抗腫瘍活性がまた、他の２種のネズミモデル：、Ｌ　５１７８　Ｙリン パ腫及びＰ３８８白血病に対して研究された。

ネズミリンパ腫細胞（Ｌ５１７８Ｙ）は、ＤＢＡ／２マウスにおける連続的な腹 腔的継代培養により維持され、そしてマウス当たり１０４個の細胞の用量で試験 のために注入される。

Ｐ３８８白血病細胞は、ＤＢＡ／２マウスにおける腹腔的継代培養により維持さ れ、そしてマウス当たり１０５（ｓｉｃ）個の細胞の用量で、試験のために８６ Ｄ２Ｆ１マウスに注入される。

結果は次の表に示される： Ｌ５１７８Ｙ　リンパ腫 活　性　投与量　処理の　Ｔ／ＣＸ　１００　生存動物物　質　（ｇ／ｋｇ体重 ）　日数　（％）　の数８ＤＡＨＩ　Ｘ　４／ｄ　１，２．３，４．５　５７６ 　５１５ＤＡＨ１ｘ３／ｄ　１．２，３，４．５　５７６　５１５Ｐ３８８　白 血病 活　性　投与量　処ばの　Ｔ／ＣＸ　１００　生該動物物質（ｇ／ｋｇ体）　日 　（％）の１ ＤＡＨ１，５Ｘ４／ｄ　１．２．３．４．５　１９０　０１５ＤＡＨ１，５Ｘ４ ／ｄ　１，２．３　１５５　０１５＊　３０日間で。

次の説明においては、より完全な情報が医薬としてＤＡＨの使用を与える。

前置床７負■理ヱ ＤＡ）（が、３ｇ／ｋｇのＤＡＨの腹腔的注入を受けた生後８週目の８６Ｄ２Ｆ １マウスの血清及び尿においてアッセイされた。ＤＡＨは、分光光度計により、 すなわち５５０ｎ−でＦｅ”−ヒドロキサメート錯体を検出することによってア ッセイされた。

ＤＡＨの腹腔内注入後、６■／ｄの平均血漿ピークが２０分で観察された。この 濃度における低下は、３５分の半分で生じる。尿のピークは、２２０■／ｄの値 による注入後、２５０分で観察された。尿の排除は２４時間にわたって維持され る。尿に排除されたＤＡＨはいづれの構造学的変性も受けなかった。従って、Ｄ ＮＡは、代謝を受けていないその生来の形で作用する。

皇生主並皿究 マウスにおける毒性： 非経口投与されたＤＡＨの毒性が、２０〜２２ｇの重量の生後６週目の８６Ｄ２ Ｆ１マウスで評価された。個々の投与れ、そして観察期間は１４日であった。致 死量（ＬＤ）が、ＤＡＨの注入後２４時間目で及び次に１４日目で評価された。

これらの条件下で、ＬＤＩＯ（１０％の死亡率）が８．５〜９ｇ／ｋｇの用量で 観察され；ＬＤ、。は１１〜１２ｇ／ｋｇに相当し、そしてＬＤ？。は１４〜１ ５ｇ／ｋｇに対応した。死亡率における有意な差異は、与えられた投与量レベル に関して１．２４時間及び１４日で観察されなかった。

ＤＡＨの維持された投与の耐性が、２ｇ／ｋｇの毎日の注入により３０日間処理 された１０匹のグループ及び同じ期間、１日当たりＩｇ／ｋｇの２回の注入を受 ける１０匹のマウスのグループに対して評価された。その耐性は、毒性の臨床学 的症状を伴わないで、死亡率を伴わないで、卓越しており、そして体重は、同じ 年齢及び同じ初期体重の対照グループに対して＋／−１０％の範囲で存続した。

犬における毒性： Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（ＭＣＩ）の推薦に従 って、次の決定を行なった：ａ）最大の非毒性投与量、ｂ）最低の毒性投与量、 Ｃ）最大の非致死毒性投与量、ｄ）致死投与量。

これらの研究は、６．５〜７．５ｋｇの体重の生後６〜７力月目のピーグル大に 対して行なわれた。ＤＡＨの毒性効果を示すために、臨床学的、形態学的、生化 学的及び血液学的パラメーターが測定された。

心拍、心電図、動脈血圧（動脈内カーチーチル法により測定される）及び呼吸速 度の評価が、α−クロラロースにより麻酔をかけられた犬において測定された。

１〜５ｇ／ｋｇのＤＡＨの静脈内投与を受けた動物においては、これらのパラメ ーターの変化は観察されなかった。

即座の毒性効果の徴候：１〜Ｌｏｇ／ｋｇ（１０％溶液において）の投与量での ＤＡＨの静脈内注入は、生成物の投与のの間維持され得る食欲不振を伴う。非耐 性に関する他の症状は、ＤＡＨの投与間、観察されなかった。

初期毒性効果の徴候：血液学的毒性。血小板系に対する毒性が、ＤＡＨの注入後 、３日目で最低３９Ｘ１０９　（ｓ　ｉ　ｃ）個の血小板／ｌ及び７日〜１０日 後、前処理レベルへの戻りを伴って、５ｇ／ｋｇの投与量で及びそれ以上で示さ れた。９ｇ／ｋｇの投与量で、血小板減少症が、注入後２２日目で、最低１７ｘ ｌ　０９　（ｓ　ｉｃ）個の血小板／ｌ及び２力月後、一部の回復率（５６Ｘ１ ０”＃りを伴って、より進行した。

顆粒／単球又は赤血球系に対する毒性は、高い投与量（９ｇ／ｋｇ）でさえ、示 されなかった。

肝機能に対する毒性は、上記投与量で示されなかった。

１０ｇ／）ｃｇ以上の投与量を受けた１匹の犬は、胃管におけるＤＡＨ結晶の沈 殿を示し、この合併症は、生理学的溶液による予備水和化により回避することが 可能であった。

１ｇ／）ｃｇの週５回の注入による、２週間にわたってのＤＡＨのくり返しての 静脈内投与は、生成物の投与の期間、嘔吐以外の非耐性の徴候を引き起こさなか った。生物学的試験は、代謝的又は血液学的障害又は止血の障害を示さなかった 。

これらの結果は、最大の非毒性投与量が２．５〜３ｇ／ｋｇの間にあり、低い毒 性投与量が５ｇ／ｋｇであり、そして最大の非致死的毒性投与量が、９ｇ／ｋｇ の程度であることの結論を集合的に可能にする。これは、ＤＡＨの低い毒性を示 す。

ＤＡＨが、ＡＩＤＳの患者に連続的に静脈内投与され得る。

このために、ＤＡＨ粉末が、たとえば１０％の濃度で生理学的溶液に溶解される 。個々のバイアルは一回の投与量のためにＤＡＨ１０ｇを含む。次にＤＡＨが末 梢静脈路を通しての連続的な潅流で２４時間にわたって投与される。

上記の前臨床学的研究は、８．５ｇ／ｋｇのＬＤ、。の値を提供する。マウス／ ヒトの相関要因を考慮すれば、ヒトにおける初期投与量の、体表イ当たり１．２ ｇであろう。

動物で行なわれた活性研究の点から、連続的な静脈潅流での投与は、患者が、連 続的な潅流による処理の前、３０分間の潅流での毎日の投与量のｌ／２４に等し い１回の投与量を受けた後、１５日間にわたって行なわれ得る。この手段は、ア ジドチミジンの場合において使用された手段に類似する（Ｙａｒｃｈｏａｎなと ８、Ｌａｎｃｅｔ、　１９８６．５７５〜５８０）。投与量の上昇は、医学的管 理下において適用され得る。

前述の説明は、ＡＩＤＳの処理においてＤＡＨの実質的な価値を示す。さらに、 ＤＡＨの使用は、ＨＩＶウィルスに特異的に対する説明に例示され、そしてこの 使用は、ＡＩＤＳに関連するすべての状態の処理に関連する。

日　数 悶驚橿喜報牛 一一一−１−−−−１紙　■π／Ｆｉｔ　Ｏｎ／Ｉ’Ｉｎ’ｌ１１７国際調査報 告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｄ−アスパラギン酸β−モノヒドロキサメート（ＤＡＨ）から成ることを特 徴とする医薬。
2. ２．ウィルス感染、及びより特定にはレトロウイルスによる感染、特にＡＩＤＳ を引き起こす感染の処理に向けられることを特徴とする請求の範囲第１項記載の 医薬。
3. ３．腫瘍の処理のために向けられることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の 医薬。
4. ４．医薬的に許容できるビークルに、活性成分としてＤ−フスパラギン酸β−モ ノヒドロキサメート（ＤＡＨ）を含むことを特徴とする医薬組成物。
5. ５．ウィルス感染、及びより特定にはレトロウイルスによる感染、特にＡＩＤＳ を引き起こす感染の処理に向けられることを特徴とする請求の範囲第４項記載の 医薬組成物。
6. ６．腫瘍の処理のために向けられることを特徴とする請求の範囲第４項記載の医 薬組成物。
7. ７．注射の目的のための生理学的溶液に使用するすぐ前で溶解されるべき、前記 活性物質の凍結乾燥粉末の形を取ることを特徴とする請求の範囲第４〜６のいづ れか１項記載の医薬組成物。
8. ８．経口投与のために適切である形を取ることを特徴とする請求の範囲第４〜６ のいづれか１項記載の医薬組成物。
9. ９．ウィルス感染、特にＡＩＤＳの感染の処理のために向けられる医薬を製造す るためへのＤ−アスパラギン酸β−モノヒドロキサメート（ＤＡＨ）の使用。
10. １０．腫瘍の処理のために向けられる医薬を製造するためへのＤ−アスパラギン 酸β−モノヒドロキサメート（ＤＡＨ）の使用。
11. １１．Ｄ−アスパラギン酸β−モノヒドロキサメート（ＤＡＨ）の製造方法であ って、Ｄ−アスパラギン酸β−エチルエステルを得る目的のためにＤ−アスパラ ギン酸のモノエステル化及びＤＡＨを導びく、Ｄ−アスパラギン酸β−エチルエ ステルのヒドロキシアミン化を含んで成る方法。
12. １２．Ｄ−アスパラギンのヒドロキシアミン化によりＤ−アスパラギン酸β−モ ノヒドロキサメート（ＤＡＨ）の製造方法。
13. １３．腫瘍の処理のために向けられる医薬組成物を製造するための方法であって 、Ｄ−アスパラギン酸β−モノヒドロキサメート（ＤＡＨ）が、注射の目的のた めに生理学的溶液に使用するすぐ前で、溶解に向けられる凍結乾燥粉末の形で調 製され、又は活性物質が経口投与のために適切な形に調製される（ここで、１又 は複数の不活性又は薬理学的に活性な添加剤と共に適切である）ことを特徴とす る方法。