BR122019027405B1

BR122019027405B1 - dispositivo e método para preparação de amostras

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Publication number: BR122019027405B1
Application number: BR122019027405-3A
Authority: BR
Inventors: Christopher A. Scott; Kurt Greenizen; Sara D. Gutierrez; David Briggs; Ralph T. Scaduto; Timothy K. Nadler; Louis Bonhomme; Masaharu Mabuchi; Phillip Clark
Original assignee: Emd Millipore Corporation
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2020-10-13
Also published as: JP2013019904A; CN102967492B; BR102012017457A2; US9103756B2; US20140017151A1; EP2546346A2; BR122019027420B1; EP2546346A3; CN105319093A; TWI520772B; EP3628733A1; SG187322A1; ES2784549T3; TW201311340A; US20160103045A1; JP5544399B2; BR102012017457B1; US20130017620A1; CN102967492A; EP2546346B1

Abstract

Trata-se de um dispositivo para preparação de amostras que permite um processo completo de ligação, lavagem, eluição, troca e concentração de tampão a ser realizado sem uma transferência de amostras entre os múltiplos dispositivos. O dispositivo inclui um reservatório, uma coluna que serve para reter o meio de cromatografia, uma região retentora que serve para manter um dispositivo de filtração, e uma saída. O dispositivo de filtração se conecta à região retentora do dispositivo centrífugo, e a montagem pode ser colocada em um retentor opcional. A montagem, com ou sem um retentor opcional, pode ser colocada em um tubo de centrifugação convencional para centrifugação. Todas as etapas de ligação, lavagem, eluição, troca e concentração de tampão podem ser realizadas com o aparelho sem quaisquer transferências de pipetagem (e as perdas de amostras associadas). O dispositivo para preparação de amostras também pode ser usado para etapas de ligação e lavagem, no caso onde o dispositivo de filtração não é necessário, e para etapas de troca e concentração de tampão, no caso onde o meio não é necessário.

Description

[001] O presente pedido reivindica a prioridade ao Pedido Provisório U.S. com Número de Série 61/507.240 depositado em 13 de julho de 2011 e ao Pedido Provisório U.S. com Número de Série 61/648.631 depositado em 18 de maio de 2012, estando as descrições destes aqui incorporadas a título de referência. Antecedentes

[002] Podem-se utilizar filtros centrífugos para separar substâncias biológicas como uma enzima de anticorpo, ácido nucléico e proteína para o propósito de concentração, dessalinização, purificação, e fracionamento. Estes dispositivos são mais comumente usados em instrumentos separadores por centrífuga, que podem consistir em uma configuração de rotor de ângulo fixo ou em uma configuração de rotor de ângulo oscilável ou variável. A velocidade do processo de filtração e a recuperação da amostra de retentado são altamente avaliadas pelos consumidores. Os valores de recuperação de amostra maiores que 85% são geralmente obtidos removendo-se a cápsula de membrana (retentor de amostra) e a girando ao contrário em um tubo receptor.

[003] Esses dispositivos são tipicamente usados para concentrar urina, soro, plasma e fluido cérebro-espinal. Por exemplo, a medição de proteínas específicas na urina pode ser importante para o diagnostico e gerenciamento de vários estados de doença, ainda o conteúdo dessas proteínas na urina é geralmente muito pequeno para que seja detectado sem concentrar primeiramente as proteínas. Em geral, os dispositivos convencionais incluem um compartimento tendo um reservatório de amostras, um filtro vedado no compartimento de tal modo que a amostra deva passar através do filtro quando submetida a uma força de acionamento (tal como centrifugação), e uma câmara de coleta que serve para coletar a amostra concentrada.

[004] Existe uma classe de protocolos de purificação de proteína que usa afinidade a antígeno-proteína para separar as proteínas de interesse de uma amostra misturada, tal como um lisato celular ou soro. Geralmente, estes protocolos usam pequenas microesferas que são conjugadas com anticorpos de tal modo que se liguem às proteínas especificas a partir da amostra. Uma vez que as proteínas forem efetivamente ligadas às microesferas, existe uma necessidade de extrair e coletar as proteínas (eluição) a partir das microesferas para análise a jusante, desenvolvimento de ensaio, etc. As técnicas de análise a jusante exemplificadoras incluem eletroforese bidimensional em gel e espectrometria de massa.

[005] Existe uma série de etapas de processamento que são necessárias no fluxo de trabalho. Estas podem incluir equilibrar as microesferas com um tampão neutro antes da ligação, lavar as microesferas após a ligação para remover os contaminates não-ligados, eluir as proteínas de interesse, trocar o tampão das proteínas eluídas, concentrar a amostra diluída final, e finalmente recuperar a amostra de proteínas purificadas. Para protocolos de purificação por afinidade e imunoprecipitação, as proteínas ligadas às microesferas são as proteínas de interesse. Para protocolos de depleção, a fração não-ligada (proteínas não ligadas às microesferas) é a amostra de interesse.

[006] As microesferas usadas nestes métodos de purificação são magnéticas ou não-magnéticas. Uma das microesferas não-magnéticas mais comuns é a agarose. As microesferas magnéticas, como a proteína PureProteome A & G, albumina PureProteome e albumina PureProteome e IgG para albúmen e depleção de IgG de soro, microesferas de proteína A Magna ChIP para imunoprecipitação cromática, e microesferas magnéticas de níquel PureProteome para uma purificação recombinante com tag His, encontram-se comercialmente disponíveis junto à EMD Millipore.

[007] Ao se trabalhar com microesferas magnéticas, os métodos manuais atuais dependem do uso de pipetas para mover os líquidos no tubo de amostras (tampões, etc.) e mover a amostra de um dispositivo para outro. Utilizam-se ímãs par manter as microesferas ao lado do tubo de amostras de tal modo que o usuário possa pipetar os tampões sem atrapalhar as microesferas. Existem cerca de 8 etapas de pipeta por amostra em um fluxo de trabalho típico de ligação/lavagem/eluição.

[008] Para uma ligação de proteína ótima com as microesferas, requer-se incubação com esses métodos. O dispositivo contendo as microesferas e a amostra são geralmente girados em um misturador extremo a extremo (do inglês, “end-over- end”), ou colocado em um agitador (por exemplo, vortexor) durante 10 a 30 minutos. Quando novos tampões forem adicionados, tais como tampões e lavagem e eluição, o usuário criará um vórtice no dispositivo durante aproximadamente um minuto para misturar e lavar.

[009] As etapas de lavagem e eluição precisam ser repetidas várias vezes para que sejam efetivas. Por exemplo, o protocolo padrão consiste em adicionar tampão de lavagem ao frasco de amostra, criar um vórtice (misturar) durante aproximadamente um minuto, remover o tampão e repetir duas ou mais vezes. Com as microesferas magnéticas, o procedimento de ligação/lavagem/eluição dura cerca de 45 minutos.

[010] Uma alternativa às microesferas magnéticas são as microesferas de agarose. Um dispositivo comercialmente disponível que usa microesferas de agarose inclui um tubo com um fundo aberto e uma frita porosa posicionada sobre o fundo aberto. Ao invés de usar pipetas para remover os fluidos do tubo de amostras, uma centrífuga de topo de bancada é usada para conduzir os fluidos através da frita e em um tubo de coleta- tipicamente um tubo de 4 mL ou 15 mL. O tamanho de poro da frita é escolhido por reter as microesferas enquanto permite que tampões e proteínas passem através.

[011] Dependendo do tamanho da coluna de centrifugação usada, o fluxo de trabalho pode ser inconveniente e demorado comparado aos métodos que usam microesferas magnéticas. Uma centrífuga de topo de bancada é tipicamente uma peça compartilhada de equipamento localizada em um local comum; diferentemente de microcentrífugas que cada usuário pode ter configurado em sua área de trabalho.

[012] Este processo requer 16 etapas de pipetagem por amostra e dura cerca de 1 hora para completar.

[013] Para fluxos de trabalho magnéticos e de agarose, as etapas a jusante podem incluir trocar o tampão carreador e concentrar uma amostra diluída. Em casos onde a troca de tampão da amostra é desejada, talvez para remover o eluente tipo imidazola, a amostra é tipicamente transferida para um tubo de membrana de diálise com grampos ou algo do gênero, que é, então, colocada dentro de um tanque de troca de tampão durante até 24 horas à medida que o tampão é gradualmente trocado por meio de difusão.

[014] Quando a troca e concentração de tampão forem desejadas, pode-se utilizar um dispositivo de diafiltração/concentração de proteínas, tal como um dispositivo centrífugo com uma membrana UF porosa dimensionada para reter as proteínas, porém, permitir que o tampão passe através. Controlando-se o tempo de centrifugação e selecionando-se um design de dispositivo apropriado, a concentração final pode ser controlada. Para que a troca de tampão seja efetiva, a etapa de troca de tampão precisa ser repetida duas ou três vezes (como foi realizado com as etapas de lavagem e eluição). Estes dispositivos levam 30 a 45 minutos e requerem múltiplas rotações em uma centrífuga. No dispositivo Amicon Ultra comercialmente disponível junto à EMD Millipore, existem 5 etapas de pipetagem para troca e concentração de tampão.

[015] À medida que os volumes de amostras de proteína se tomam menores, as perdas potenciais indesejadas de amostras devido ao volume de retenção dentro de um dispositivo se tornaram mais importantes do que nunca. Os dados atuais sugerem que uma perda de 10 pL em uma amostra concentrada de 50 pL representa 80% de recuperação de proteínas. Se a perda de proteínas for reduzida em uma ordem de magnitude de 10 pL para 1 pm, as recuperações de amostra de proteínas podem ser aumentadas de 80% para 98%. Um aperfeiçoamento de 18% na recuperação de amostra de proteínas pode ser bastante valioso.

[016] Deseja-se proporcionar um dispositivo e um método que realizem de modo eficiente e eficaz uma ligação e lavagem, uma troca e concentração de tampão, e/ou um processo completo de ligação, lavagem, eluição, troca e concentração de tampão em um único dispositivo sem a necessidade de transferência por pipeta da amostra preciosa entre os dispositivos, particularmente para tamanhos de amostra de até cerca de 11 mL.

Sumário

[017] Os problemas da técnica anterior foram superados pelas modalidades aqui descritas, que, em determinadas modalidades, inclui um dispositivo para preparação de amostras que permite uma ligação e lavagem, uma troca e concentração de tampão, e/ou um processo completo de ligação, lavagem, eluição, troca e concentração de tampão a ser realizado sem uma transferência de amostras entre os múltiplos dispositivos. De acordo com determinadas modalidades, proporciona-se um dispositivo centrífugo que inclui um reservatório tendo uma entrada, uma coluna para manter o meio, tal como um leito de microesferas embaladas, uma região retentora que serve para receber em uma relação vedante um dispositivo de filtração, e uma saída. De acordo com determinadas modalidades, o dispositivo de filtração inclui um compartimento tendo um reservatório de amostras, uma ou mais, de preferência duas, membranas orientadas de modo substancialmente vertical (espaçadas quando mais de uma estiver presente) dispostas n compartimento, um canal de drenagem inferior associado a cada membrana de tal modo que o fluido que passa através de cada membrana flua através de um respectivo canal de drenagem inferior em uma câmara de coleta de filtrado. O dispositivo de filtração se une à região retentora do dispositivo centrífugo, e a montagem pode ser colocada em um retentor opcional. A montagem, com ou sem o retentor opcional, pode ser colocada em um tubo de centrífuga convencional para centrifugação. Todas as etapas de ligação, lavagem, eluição, troca e concentração de tampão podem ser realizadas com o aparelho sem quaisquer transferências de pipetagem (e as perdas de amostra associadas), resultando em uma recuperação superior da amostra de interesse. O dispositivo para preparação de amostras também pode ser usado para etapas de ligação e lavagem, no caso onde o dispositivo de filtração não é necessário, e para etapas de troca e concentração de tampão, no caso onde o meio não é necessário. Podem-se realizar várias trocas de tampão no mesmo dispositivo.

[018] De acordo com determinadas modalidades, o dispositivo pode incluir um tubo de alimentação retrátil, tal como para ajudar a reduzir a perda de soluções de amostra que se acumulam no furo úmido interno e na superfície externa do tubo de alimentação.

[019] De acordo com determinadas modalidades, uma amostra é incubada com o meio em posição no dispositivo de tal modo que o alvo selecionado se ligue ao meio media. Então, a amostra livre restante pode ser lavada. A amostra é purificada eluindo-se a amostra alvo de interesse a partir do meio adicionando-se um tampão que faz com que o meio libere o alvo capturado de volta na solução. Uma vez que uma amostra for purificada, a mesma pode ser concentrada e uma concentração útil para análise e armazenamento (a maioria das proteínas é mais estável quando armazenada em uma concentração próxima a 1 mg/ml).

[020] De acordo com determinadas modalidades, o dispositivo para preparação de amostras pode incluir um membro de orientação ou diafragma que pode ser acionado para evacuar pequenas porções (por exemplo, volumes de retenção) de amostra a partir do dispositivo.

[021] O dispositivo para preparação de amostras resulta em economias de tempo para protocolos de ligação, lavagem, troca de tampão, e/ou ligação, lavagem, eluição e concentração. Não é necessário pipetar a amostra, resultando em uma recuperação de amostra maior. A troca de tampão pode ser realizada substancialmente em menos tempo do que previamente possível, com uma única etapa de centrifugação para cada uma das etapas de troca de tampão e lavagem, ao invés de múltiplas etapas de centrifugação previamente necessárias. Nenhum período de incubação de ligação é necessário.

[022] De acordo com determinadas modalidades, a interface de montagem entre o dispositivo de filtração e a câmara de troca pode permitir o movimento relativo ou separação, tal como por meios mecânicos como uma parada física ou uma geometria de auto-ativação submetida a um gradiente de pressão centrífuga para remover o engate de ponta com alvo capturado de modo a otimizar a recuperação de amostras.

[023] As vantagens obtidas pelos dispositivos e métodos descritos incluem, mas não se limitam a, tempos de incubação encurtados para processos de separação de afinidade; concentração de amostra aperfeiçoada em uma plataforma de dispositivo; recuperação de amostra aperfeiçoada utilizando-se dispositivos de centrifugação inversa; e diluições de troca de centrifugação única.

Breve descrição dos desenhos

[024] A Figura 1 é uma vista em perspectiva, em corte transversal, de um membro de reservatório/troca de acordo com determinadas modalidades;

[025] A Figura 1B é uma vista em perspectiva, em corte transversal, de um membro de reservatório/troca contendo uma coluna de microesferas pré-embalada de acordo com determinadas modalidades;

[026] A Figura 2 é uma vista explodida de um membro de reservatório/troca e do dispositivo de filtração de acordo com determinadas modalidades;

[027] A Figura 3 é uma vista lateral em corte transversal verticalmente orientada de um dispositivo de filtração de acordo com determinadas modalidades;

[028] A Figura 4 é uma vista em perspectiva, em corte transversal, de um membro de reservatório/troca e de um dispositivo de filtração posicionado no mesmo de acordo com determinadas modalidades;

[029] A Figura 5 é uma vista explodida de um membro de reservatório/troca, um dispositivo de filtração, um retentor de montagem opcional, um tubo e uma tampa de centrífuga de acordo com determinadas modalidades;

[030] A Figura 6 é uma vista em corte transversal de uma montagem incluindo um membro de reservatório/troca, um dispositivo de filtração, um retentor de montagem, um tubo e uma tampa de centrífuga de acordo com determinadas modalidades;

[031] A Figura 7 é uma vista em corte transversal de uma montagem incluindo um membro de reservatório/troca, um dispositivo de filtração, um retentor de montagem, um tubo e uma tampa de centrífuga, mostrando a ponta do membro de reservatório/troca posicionada na região de volume de batente fixo do dispositivo de filtração, de acordo com determinadas modalidades;

[032] A Figura 8 é uma vista em corte transversal de uma montagem incluindo um membro de reservatório/troca, um dispositivo de filtração, um retentor de montagem, um tubo e uma tampa de centrífuga, mostrando a ponta do membro de reservatório/troca erguida a partir da região de volume de batente fixo do dispositivo de filtração, de acordo com determinadas modalidades;

[033] A Figura 9 é uma vista em perspectiva explodida de um dispositivo de ligação, lavagem, eluição e concentração de acordo com determinadas modalidades;

[034] A Figura 10 é uma vista em corte transversal que mostra o volume ocupado pelo membro de troca no dispositivo de filtração de acordo com determinadas modalidades;

[035] A Figura 11 é uma vista em corte transversal de um membro de reservatório/troca tendo uma porção com convoluções para permitir um movimento axial durante a centrifugação, de acordo com determinadas modalidades;

[036] A Figura 12 é uma vista em corte transversal de um membro de reservatório/troca tendo uma porção de parede delgada para permitir um movimento axial durante a centrifugação, de acordo com determinadas modalidades;

[037] A Figura 13 é uma vista em corte transversal de um membro de reservatório/troca tendo uma porção de parede delgada sobremoldada para permitir um movimento axial durante a centrifugação, de acordo com determinadas modalidades;

[038] A Figura 14 é uma vista diagramática de um membro de reservatório/troca que mostra o local de asperezas moldadas na superfície externa da coluna, e o detalhe explodido mostra uma seção transversal da superfície molhada e da camada limite de gás;

[039] A Figura 15 é uma vista de fundo em perspectiva de uma tampa de diafragma de acordo com determinadas modalidades;

[040] A Figura 16 é uma vista de topo em perspectiva da tampa de diafragma da Figura 15 de acordo com determinadas modalidades;

[041] A Figura 17 é uma vista em corte transversal de um membro de reservatório/troca incluindo a tampa de diafragma da Figura 15 de acordo com determinadas modalidades;

[042] A Figura 18 é uma vista de topo em perspectiva de um membro de reservatório/troca tendo um flange modificado para acomodar a tampa de diafragma da Figura 15 de acordo com determinadas modalidades;

[043] A Figura 19 é uma vista em corte transversal de uma montagem incluindo uma tampa de diafragma de acordo com determinadas modalidades;

[044] A Figura 20 é uma vista de topo em perspectiva de um dispositivo de reservatório/troca que mostra uma tampa de diafragma afixada em uma posição aberta;

[045] A Figura 21 é uma vista lateral de um dispositivo de reservatório/troca que mostra uma tampa de diafragma afixada em uma posição aberta;

[046] A Figura 22 é uma vista explodida de um dispositivo de reservatório/troca incluindo um diafragma e um filtro de 15 ml de acordo com determinadas modalidades;

[047] A Figura 23 é uma vista em perspectiva de um dispositivo de reservatório-troca de acordo com uma primeira modalidade alternativa;

[048] A Figura 24 é uma vista em perspectiva de um dispositivo de reservatório-troca de acordo com uma segunda modalidade alternativa;

[049] A Figura 25 é uma vista em perspectiva de um dispositivo de reservatório-troca de acordo com uma terceira modalidade alternativa;

[050] A Figura 26 é um gráfico que mostra volumes de retenção de dispositivos com e sem diafragmas de acordo com determinadas modalidades; e

[051] A Figura 27 é um gráfico que compara um procedimento de 3 giros a um procedimento de ligação-lavagem-eluição de acordo com determinadas modalidades.

Descrição detalhada da invenção

[052] Primeiramente, voltando-se à Figura 1, apresenta-se um membro de reservatório/troca 12 de acordo com determinadas modalidades. O membro 12 é, de preferência, constituído por um material transparente de baixa ligação capaz de suportar as forças tipicamente encontradas durante a centrifugação. Os materiais adequados incluem polipropileno ou policarbonato clarificados. Em determinadas modalidades, o membro 12 inclui um reservatório de amostras genericamente cilíndrico 14 tendo um topo aberto (entrada), embora outros formatos sejam adequados e estejam dentro do escopo das modalidades aqui descritas. Pode-se proporcionar um flange anular de topo 16 tendo um diâmetro externo maior que o diâmetro externo do reservatório 14 que possa assentar uma tampa de tubo de centrífuga (não mostrada na Figura 1). O volume ou capacidade do reservatório 14 não é particularmente limitado, e pode ser escolhido com base no tamanho da amostra e/ou no tamanho do dispositivo de filtração ao qual o reservatório deve ser conectado. Os volumes exemplificadores incluem 3 ml e 11 ml. Em determinadas modalidades, o fundo do reservatório 14 tem um formato frustro-cônico, afunilando- se para baixo (na direção da vazão de fluidos a partir do topo aberto) e radialmente para dentro, convergindo para uma abertura central que leva a uma coluna 18 de diâmetro menor que aquele do reservatório 14. A porção superior da coluna 18 tem um diâmetro e um comprimento escolhidos para manterem uma quantidade suficiente de meio 30 para realizar uma etapa de ligação, e, portanto, é posicionada a jusante, na direção do fluxo amostrai durante uma operação de ligação, do reservatório de amostras 14. Em modalidades onde não se desejam ligações (por exemplo, um protocolo de troca e concentração de tampão), o meio pode ser omitido da coluna 18. De preferência, o diâmetro e o comprimento da coluna são suficientes para manter pelo menos 200 microlitro de microesferas, criando um leito embalado. Um diâmetro exemplificador é igual a cerca de 0,635 centímetro (% polegada), com um comprimento de 1,27 centímetro (1Z polegada) ou mais. Quando um meio for usado, pode-se colocar uma estrutura de retenção de meio, tal como uma frita porosa 31 abaixo do meio 20 para manter o meio em posição, no caso de uma coluna pré-embalada, existiria a necessidade por uma estrutura de retenção adicional 31a posicionada acima do meio para conter o meio dentro do diâmetro da coluna (Figura 1B). A coluna 18 pode incluir um flange anular 19, que proporciona um ombro ou batente contra o qual o dispositivo de filtração 50 é posicionado durante o suo use (por exemplo, com uma vedação interposta 40 (Figura 2), proporcionando uma interface de vedação de líquidos entre o dispositivo de filtração 50 e o membro 12). Abaixo do flange anular 19, a coluna tem uma região retentora 20 de diâmetro intermediário, que é recebida na porção superior do reservatório de amostras do dispositivo de filtração quando posicionado na coluna durante o uso. A região 20 tem um diâmetro externo menor que o diâmetro externo do flange anular 19. Uma porção de diâmetro a jusante adicionalmente descendente 21, tendo um diâmetro externo menor que o diâmetro externo da região 20, se assenta em uma região inferior da porção do reservatório de amostras do dispositivo de filtração, acima das membranas, quando posicionadas na coluna durante o uso.

[053] A região 22 da coluna 18 tem uma geometria dotada de aletas, afunilando-se radialmente a partir de uma porção superior relativamente grossa 22a até uma porção inferior relativamente delgada 22b, e define uma câmara de ligação/eluição. Na porção mais delgada 22b, a coluna se afunila radialmente para dentro em 22c, convergindo em uma haste 23, de preferência centralmente localizada, que tem uma extremidade de fundo aberta 24, sendo que a haste se estende axialmente a partir da coluna com formato dotado de aletas. O recurso dotado de aletas é conformado para se encaixar dentro do dispositivo de filtração 50 correspondente com a parte interna oca para manter uma espessura de parede uniforme. De acordo com determinadas modalidades, o recurso dotado de aletas permite que a região 22 da coluna 18 ocupe substancialmente todo o volume entre as membranas 12A e 12B do dispositivo de filtração 50, mantendo, assim, o volume amostrai desejado próximo à extremidade de fundo aberto 24. De preferência, a haste é cilíndrica e se afunila radialmente para dentro em direção à extremidade de fundo aberto 24. A extremidade de fundo aberto 24 permite uma comunicação fluídica entre o reservatório 14 (através de qualquer meio e frita presentes, e através da região 22 (câmara de ligação/eluição)) e um dispositivo a jusante, como um tubo ou um dispositivo de filtração.

[054] De acordo com determinadas modalidades, o meio pode ser um meio de cromatografia, tal como o meio usado para capturar analitos selecionados em uma amostra e liberá-los quando as condições de tampão forem apropriadamente alteradas. O meio adequado inclui microesferas que ligam quelato metálico, proteína A, glutationa, albumina, etc. O meio pode ser magnético, não-magnético, agarose, etc., e pode ser modificado com determinadas químicas, como IMAC, proteína A, glutationa, estreptavidina, etc. Consequentemente, o meio pode incluir químicas apropriadas para executar a ligação desejada.

[055] De acordo com determinadas modalidades, a porção inferior dotada de aletas e a coluna podem formar um único recurso separável que pode ser fixado ao reservatório 14, tal como através de um encaixe por pressão, encaixe luer, rosca, etc. O recurso separável reduz a quantidade de desperdício de plástico e os custos do disponível, visto que a porção de reservatório pode ser lavável e reutilizável. Um dispositivo exemplificador onde a coluna 18 é removível é mostrado na Figura 23. Embora qualquer mecanismo de conexão adequado possa ser usado para conectar a coluna 18 ao reservatório 14, a Figura 23 mostra uma modalidade onde a coluna 18 inclui uma porção rosqueada 118 que é recebida, de modo rosqueável, na porção inferior 144 do reservatório 14 que contém as ranhuras internas 145 compatíveis às roscas na porção rosqueada 118. A porção rosqueada 114 é preferencialmente cilíndrica e circunscreve o bocal 146 que se encontra em comunicação fluídica com o reservatório 14. A capacidade de remoção da coluna 18 permite flexibilidade na utilização de diferentes colunas 18 com o mesmo reservatório 14. As Figuras 24 e 25 mostram modalidades similares onde múltiplas colunas podem ser fixadas ao reservatório. Por exemplo, o reservatório 14’ na modalidade da Figura 24 tem duas saídas, e duas colunas removíveis 18A e 18B podem ser fixadas, cada uma a uma respectiva saída. De modo similar, o reservatório 14” na modalidade da Figura 25 tem quatro saídas, e quatro colunas removíveis 18A, 18B, 18C, e 18D podem ser fixadas, cada uma a uma respectiva saída.

[056] A Figura 2 é uma vista explodida do membro 12 e do dispositivo de filtração 50, com o dispositivo de filtração 50 mostrado orientado para que seja recebido pela coluna 18 do membro 12. Devido à configuração achatada e afunilada da região 22 da coluna 18, e devido à simetria do dispositivo de filtração 50, o dispositivo de filtração 50 pode apenas se encaixar na coluna 18 em uma de duas formas; aquela mostrada na Figura 2, e aquela girada 180° a partir da mesma. Na modalidade mostrada, uma vedação 40 é usada para proporcionar um lacre hermético a líquidos entre o dispositivo de filtração 50 e o membro 12. Outro mecanismo de vedação pode ser usado, tais como anéis em O ou lacres sobremoldados com formato adaptado incluindo lacres de face, lacres tipo lingüeta flexível, etc. Esses lacres sobremoldados podem ser integralmente moldados.

[057] Voltando-se, agora, à Figura 3, mostra-se um dispositivo de filtração 50 adequado para uso de acordo com determinadas modalidades. O dispositivo de filtração 50 é aquele descrito na Publicação U.S. No. 2009/0078638, estando a descrição deste aqui incorporada a título de referência. O dispositivo 50 inclui um reservatório de amostras 11 para receber uma amostra não-filtrada, e primeiras e segundas membranas 12A e 12B dispostas em uma parede lateral do dispositivo 50 conforme mostrado. Uma câmara de retenção 14 que define um volume de batente fixo é proporcionada abaixo das membranas 12A e 12B. Uma ponta de coleta 30 que tem genericamente um formato de arco e se projeta para fora a partir do período inferior do dispositivo pode ser proporcionada para localizar o volume de batente fixo na linha central do dispositivo, e, subsequentemente, reduzir a variabilidade do volume de batente fixo à medida que o ângulo de orientação em uma centrífuga se altera. De preferência, o dispositivo 50 é constituído por um material sólido que seja impermeável a líquidos, tenha baixas características de ligação à proteína, e seja suficientemente forte para suportar as forças gravitacionais (Gs) aplicadas durante a centrifugação. Os materiais adequados incluem acrílico, resina CYROLITE G20 HiFlo, resina ESTAR HN631 e polímeros KRATON. Em particular, os painéis laterais podem ser constituídos por um material plástico transparente que permita um operador ou usuário olhar pela cavidade interna do dispositivo com a finalidade de determinar os níveis de fluido antes, e após o processo de filtração. Os painéis laterais incluem um suporte de canal de drenagem inferior que suporta a membrana e proporciona uma comunicação fluídica à câmara de retenção 14. Por exemplo, o suporte de canal de drenagem inferior pode incluir uma série de ranhuras longitudinal espaçadas, canais, ou texturas superficiais que fiquem localizados abaixo da membrana para capturar o filtrado à medida que ele passa através da membrana e o direciona em direção aos orifícios de drenagem e em um frasco receptor. Cada membrana é vedada a um respectivo painel lateral de tal modo que apenas o fluido que passa através da membrana possa sair pelos orifícios de drenagem do dispositivo localizados nos painéis laterais. Em determinadas modalidades, cada membrana 12A, 12B é co-extensiva a um respectivo suporte de canal de drenagem inferior e vedado ao mesmo. A geometria do canal de drenagem inferior é destinada a suportar a membrana e mantê-la o mais achatada possível, enquanto permite um espaço aberto suficiente abaixo da membrana para permitir que o fluido flua e passe através dos orifícios de drenagem 18 do dispositivo. Prefere-se que a resistência de fluido hidráulico seja mantida a mais baixa possível.

[058] As membranas adequadas incluem membranas microporosas e ultraporosoas, sendo que as últimas são úteis para ultrafiltração. As membranas de ultrafiltração de celulose regenerada (por exemplo, as membranas “Ultracel Amicon YM” e “Ultracel PL” disponíveis junto à Millipore Corporation de Bedford, Mass., EUA) são bem adequadas para dispositivos almejados para concentrar ou dessalinizar líquidos de amostra extremamente diluídos ou hidrofóbicos. O uso de uma membrana hidrofilica tendo uma microestrutura “hermética” promove uma boa retenção com baixa absorção de proteína, DNA, e outras macromoléculas. As membranas de ultrafiltração de polietersulfona (por exemplo, “Amicon PM” e “Biomax PB” também disponíveis junto à Millipore Corporation), ou outras membranas similares tendo uma microestrutura “aberta” adequada para rápida separação, são mais bem adequadas para dispositivos almejados para concentrar e dessalinizar líquidos de amostra mais concentrados, tal como soro, plasma, e cultura tecidual condicionada.

[059] De preferência, cada membrana 12A, 12B é orientada em um ângulo pequeno em relação à linha central longitudinal do dispositivo 10, de tal modo que o topo de cada membrana seja espaçado a partir da linha central longitudinal a uma distância maior que o fundo da membrana. Forma-se uma configuração com formato de funil. Logo, o posicionamento de cada membrana leva vantagem dos efeitos de fluxo tangencial durante a centrifugação. Um ângulo maior que cerca de 0o e menor que cerca de 5o, de preferência, cerca de 3o, foi encontrado como sendo adequado.

[060] Os painéis laterais incluem um ou mais orifícios de drenagem 18 (Figura 2) que estão em comunicação fluídica com a câmara de retenção 14 e permitem que o filtrado passe através do compartimento do dispositivo para coleta em outro compartimento. De preferência, cada orifício de drenagem 18 fica localizado no fundo de uma respectiva ranhura ou canal de canal de drenagem inferior e é, de preferência, substancialmente circular em corte transversal. Os orifícios de drenagem devem estar localizados em uma distância suficiente a partir das bordas laterais dos painéis de tal modo que os orifícios não sejam constritos ou, de outro modo, alterados de modo prejudicial durante uma operação de vedação térmica que pode ser usada durante a fabricação do dispositivo. De preferência, os orifícios de drenagem 18 são igualmente espaçados entre si e são co-lineares.

[061] A Figura 4 mostra o membro 12 com um dispositivo de filtração 50 posicionado em posição na coluna 18 do membro 12 de acordo com determinadas modalidades. A vedação 40 pode ser observada proporcionando uma interface de vedação entre o dispositivo de filtração 50 e o flange 19 da coluna 18. De preferência, a haste 23 do membro 12 é posicionado de modo que fique dentro do volume de batente fixo do dispositivo de filtração 50, conforme discutido em maiores detalhes abaixo.

[062] Conforme observado na Figura 5, de acordo com determinadas modalidades, um retentor de montagem 60 opcional pode ser proporcionado onde manter o membro 12 fixado ao dispositivo de filtração 50 é uma preocupação sob as forças centrífugas tipicamente aplicadas à montagem. Em determinadas modalidades, o retentor 60 pode ser constituído pelo mesmo material do membro 12, e inclui uma manga de retenção superior cilíndrica 62 configurada para receber o reservatório 14 do membro 12. Um flange anular superior 6 estendendo-se radialmente para fora proporciona um assento para o flange anular 16 do membro 12. De acordo com determinadas modalidades, o fundo 63 da manga de retenção 62 tem um formato frustro-cônico para receber o fundo com formato similar do reservatório 14. Uma abertura centralmente localizada no fundo 63 leva a uma coluna cilíndrica estendendo-se axialmente 64 tendo um orifício. O orifício é conformado para receber o dispositivo de filtração 50, de tal modo que uma porção inferior do dispositivo de filtração 50 se projete axialmente para fora do orifício (Figura 6).

[063] Para montar os componentes tais como para centrifugação, o dispositivo de filtração 50 pode ser inserido sobre coluna 18 do membro 12, e, então, pode ser inserido no retentor 60. A combinação é, então, colocada em um tubo de centrífuga convencional 70 (por exemplo, 15 ou 50 ml), tendo um diâmetro externo de tal modo que o flange 61 se assente na superfície de topo do tubo 70 (Figura 6). Então, a tampa 72 pode ser rosqueada no tubo ou, de outro modo, conectada para prender a montagem no tubo. Quando o retentor opcional 60 for omitido, o flange 16 do membro 12 se assenta na superfície de tipo do tubo 70.

[064] Para a maioria dos protocolos de purificação e IP, as etapas de ligação e lavagem podem ser realizadas com dispositivo de filtração separado da coluna 22. O dispositivo de filtração pode, então, ser fixado à coluna 22 e as proteínas eluídas diretamente a partir do dispositivo através da centrifugação. Para depleção na qual a fração não-ligada é a amostra de interesse, o dispositivo de filtração pode ser deixado fixado à coluna 22 a partir do início do processo.

[065] Em determinadas modalidades, a coluna de meio 30 se concentra no meio, de preferência, microesferas, em uma coluna, assim com uma coluna de cromatografia. Isto cria um leito embalado no qual o fluido é conduzido através do leito de modo que aumente a probabilidade de interação entre as fases móvel (fluxo atravessante) e estacionária (meio). Isto leva a uma ligação, lavagem e eluição mais eficientes. De fato, o número de etapas de lavagem e eluição pode ser reduzido de três para uma, com um tempo de ligação (incubação) mínimo ou nenhum. A proteína recuperada mostra uma atividade aumentada quando apenas uma única etapa de concentração for usada. Quando uma ligação (incubação) for desejável, a frita 31 é, de preferência, uma frita hidrofóbica, que inibe o fluxo de amostra através da frita, permitindo, assim, tempos de incubação prolongados até que seja centrifugado para iniciar o fluxo. Por exemplo, as fritas que compreendem material hidrofóbico permitem a incubação de agarose em soluções de microesferas magnéticas sem gotejar, e quando submetidas a forças G centrífugas entre cerca de 100 e cerca de 700 G, permitem a passagem do filtrado no tubo receptor. Os materiais adequados incluem polipropileno sinterizado em camisa produzido por Porex Corporation, e um polipropileno extrudado em filamentos produzido por Filtronna Corporation que foram tratados com um revestimento superficial, tal como um tratamento de plasma fluorado. Quando nenhuma ligação for desejada, tal como para troca de tampão e concentração, o meio pode ser omitido da montagem. A frita (estrutura de retenção de meio) também pode ser omitida, porém, visto que não interfere na troca de tampão, pode ser deixada no dispositivo, caso seja desejado.

[066] A porção inferior dotada de aletas da coluna 22 permite que uma solução de tampão nova seja trocada de modo mais eficiente do que os métodos convencionais. Muito embora os presentes inventores não se atenham à teoria, acredita-se que funcione com base em um princípio de diafiltração. A geometria compatível entre a coluna de troca e o dispositivo de filtração otimiza o fluxo de tampão novo através do sistema. De acordo com determinadas modalidades, de preferência, a geometria de aleta preenche a maioria do espaço de cavidade não- utilizado dentro do dispositivo de filtração e mantém o volume de amostrai próximo ao orifício de saída 24. Visto que o tampão novo dentro da coluna 22 e a amostra dentro do dispositivo de filtração se encontram em equilíbrio estático durante a centrifugação, à medida que a altura de cabeça do tampão novo diminui, o volume de amostra que deixa o sistema em qualquer momento determinado é pequeno enquanto existe uma grande quantidade de tampão novo fluindo através. Isto leva a uma alta eficiência. Conforme se pode observar na Figura 10, o deslocamento “A” entre a superfície da membrana voltada para aleta 12A (e entre a superfície da membrana voltada para aleta 12B) é maior que o deslocamento “B” entre a superfície da aleta voltada para a superfície do dispositivo de filtração onde nenhuma membrana está presente (por exemplo, em 81A e 81B), de tal modo que a aleta não oclua as porções da membrana que possam bloquear o fluxo através da membrana. Em uma modalidade, o deslocamento “A” entre a superfície da aleta voltada para cada membrana é de cerca de 0,0127 cm (0,005 polegada) a cerca de 0,0508 cm (0,02 polegada), de preferência, 0,0508 cm (0,02 polegada). O deslocamento “B” entre a superfície de cada aleta voltada para a superfície do dispositivo de filtração onde nenhuma membrana está presente está entre cerca de 0,0508 cm (0,02 polegada) e cerca de 0,0127 cm (0,005 polegada), de preferência, cerca de 0,0127 cm (0,005 polegada). Otimamente, a quantidade de volume de amostra é minimizada (para otimizar a taxa de troca) enquanto otimiza as características de fluxo da membrana. A geometria da aleta ajuda a localizar o fluído entre a área ativa das membranas e a aleta, e minimiza a quantidade de fluído entre as regiões de membrana inativas e a aleta.

[067] Ademais, posicionando-se a haste 23 no batente fixo do dispositivo de filtração, a mistura é aprimorada, evita-se a agregação induzida por desnaturação, e evita-se a secagem da proteína uma vez que um tampão novo está sempre disponível através da coluna de troca de tampão. Uma mistura mais eficiente de soluções de tampão é obtida porque um volume de controle é formado no espaço fluídico do volume de batente fixo. Dentro deste volume de controle, existe um sistema de fluxo estável. A solução de tampão proveniente do reservatório 14 entra, e a solução misturada sai através dos orifícios de drenagem 18. Dentro do volume de controle, o fluxo de solução de tampão que sai pela ponta 23 cria e mantém um fluxo de mistura de vórtice. É este fluxo de vórtice que cria uma mistura mais eficiente de soluções de tampão e fluidos de amostra. Conforme se pode observar na Figura 7, obtém-se uma troca de tampão ótima e eficiente quando a ponta 23 do dispositivo de troca for submersa quase próximo ao fundo (sem entrar em contato com a superfície de fundo que pode ocluir o orifício de saída e obstruir o fluxo) do compartimento de volume de amostra do dispositivo de filtração 50 durante a centrifugação.

[068] De acordo com determinadas modalidades, existe um benefício adicional em ser capaz de proporcionar um movimento relativo entre a ponta 23 e o dispositivo de filtração 50, tal como erguendo-se a ponta 23 do dispositivo de troca a partir da amostra durante a centrifugação uma vez que a troca de tampão tiver sido realizada, conforme mostrado na Figura 8. Isto reduz a perda potencial de amostra devido à adesão de amostra às superfícies externas e internas da ponta devido à tensão superficial dos materiais. O movimento relativo entre a ponta e o dispositivo de filtração pode ser obtido por meios mecânicos como um batente físico ou pela geometria de auto-ativação submetida a um gradiente de pressão centrífuga para remover o engate de ponta com o alvo capturado para otimizar a recuperação amostrai.

[069] A inclusão de um design de ponta retrátil tal como aquele mostrado na Figura 11 ajuda a reduzir a perda de soluções amostrais que se acumulam no orifício molhado interno e a superfície externa da ponta. Inicialmente, uma solução amostrai de proteína concentrada já está localizada no fundo do dispositivo de filtração 50. As soluções de troca de tampão são adicionadas ao reservatório 14 e deixadas passarem através de um material de frita e no dispositivo de filtração. Durante as operações de centrífugas, a solução de troca de tampão agora se encontra no dispositivo de filtração 50 onde ocorre a mistura. Esta mistura permite que a amostra de proteínas de concentração salina seja diluída pela solução de troca de tampão. Quando a centrifugação tiver sido completa, a extremidade da ponta 23 ainda pode se estender no volume da amostra concentrada. A pequena quantidade de amostra que diminui no orifício interno da extremidade distal da ponta e também reveste a superfície da parede externa da ponta pode ser tão grande quanto 5 ou 6 pL. O comportamento de mistura mais bem sucedido ocorre porque a extremidade distal da ponta é submersa no volume amostrai concentrado.

[070] Uma opção consiste em realizar uma operação de centrifugação secundária para mover esta perda de 5 a 6 pL de solução. Isto pode envolver parar a centrífuga e utilizar uma manutenção mecânica para suspender todo o reservatório para fora do volume amostrai em uma distância de 0,254 cm (0,100 polegada). No entanto, a utilização de uma centrifugação secundária é indesejável.

[071] Em contrapartida, um design de ponta retrátil tal como aquele mostrado nas Figuras 11 a 13 permite que as pontas sejam atraídas no volume amostrai devido às forças G quando a centrífuga aumentar a velocidade de centrifugação, e elasticamente retiradas do volume amostrai quando a centrífuga girar até uma velocidade igual a zero, As forças G levam a ponta 23 para o fundo do volume amostrai do dispositivo de filtração 50, e promovem o comportamento de mistura mais eficaz que é necessário para obter a diluição mais eficaz da solução de tampão em uma única operação de centrifugação. Após toda a solução de troca de tampão tiver passado através do dispositivo, a pressão hidrostática reduzida e a força G reduzida durante a centrifugação fazem com que a ponta 23 seja retirada do volume amostrai. A ponta retirada permite que qualquer fluido residual no orifício interno da ponta e na superfície externa da ponta seja removido.

[072] A Figura 11 exemplifica como um reservatório de peça única 14 e a ponta 23 podem ser configurados de modo que tenham um comprimento encurtado antes da centrifugação, e um aumento no comprimento durante a centrifugação, de acordo com determinadas modalidades. O alongamento pode ser obtido por moldagem ou, de outro modo, formação de uma ou mais, por exemplo, uma a cinco (três mostradas), convoluções 90 em uma porção de parede delgada de um material elastomérico que define a coluna 22, com a finalidade de alcançar uma configuração tipo acordeão. Um material adequado é o silicone moldado por injeção, que pode se alongar até 50% a 200% sem ruptura. Outros materiais adequados podem incluir poliuretanos e outros elastômeros termoplásticos, e devem ter um baixo desempenho de ligação de proteína não-específico adequado.

[073] Se uma rigidez maior for necessária na porção de reservatório do dispositivo, as convoluções elastoméricas 90 podem ser sobremoldadas em uma extremidade de um reservatório pré-moldado a partir de polipropileno ou de um material equivalente.

[074] A Figura 12 mostra um exemplo de um design mais simples onde a coluna 22 inclui uma porção de parede reta e delgada 91. As múltiplas convoluções foram eliminadas desta modalidade. As paredes mais delgadas permitem que as forças G estendam o comprimento axial da coluna 22 durante a centrifugação. As espessuras de parede delgada adequadas incluem entre cerca de 0,0381 a cerca de 0,1016 cm (0,015 a cerca de 0,040 polegada).

[075] A Figura 13 mostra um exemplo de um design sobremoldado. O reservatório hachurado é pré-moldado. A coluna 22 é sobremoldada no reservatório utilizando-se um material elastomérico transparente ou virtualmente claro, tal como silicone líquido moldado por injeção (LIM), elastômero termoplástico, ou material equivalente. Os materiais adequados devem ter um desempenho de ligação de proteína não-específico que não comprometa a recuperação das proteínas de amostra de interesse.

[076] De acordo com determinadas modalidades, a redução do volume de retenção amostrai pode ser adicionalmente aperfeiçoada reduzindo-se a área superficial molhada disponível da superfície externa da coluna do tubo de alimentação 22 e/ou da ponta 23, tal como incluindo uma superfície áspera e mais texturizada na superfície externa da coluna e/ou da ponta. Esta superfície texturizada pode consistir em asperezas superficiais (pequenas saliências) que tenham pelo menos aproximadamente 10 p de diâmetro e cerca de 10 p de altura. Essas asperezas de superfície podem ser moldadas em um dispositivo utilizando-se um material de baixa energia superficial, tal como polipropileno, polietileno, PTFE ou equivalentes. Estas asperezas criam uma topografia superficial que reduz significativamente a molhagem da superfície do dispositivo. Apenas os pontos mais altos das asperezas são molhados pelo fluxo de fluido e entram em contato com o fluido amostrai. Os vales ou canais permanecem não-molhados e revestidos por uma camada limite delgada de gás, que neste caso seria tipicamente ar. Isto reduz significativamente as perdas amostrais devido a um comportamento de molhagem (comportamento hidrofóbico). Isto também reduz significativamente a oportunidade para perdas que podem ocorrer devido a uma ligação de proteína não-específica de fluídos amostrais. A combinação de um material de baixa energia superficial e uma geometria superficial áspera cria o que chamamos de efeito lótus, que ajuda a reduzir as perdas amostrais associadas à retenção superficial de fluidos, e ligação indesejável de frações abundantes de proteína de alto interesse.

[077] Em casos onde as asperezas superficiais de moldagem em um dispositivo podem ser muito difíceis ou impraticáveis, as mesmas superfícies 22 e 23 podem ser revestidas com uma emulsão de solvente de silício para minimizar a energia de superfície do dispositivo, ou podem ser tratadas com plasma.

[078] Quando uma maximização adicional de recuperação de amostra (particularmente com soluções amostrais de alto valor) for desejada, a minimização das perdas amostrais devido aos volumes de retenção e à ligação de proteína não- específica é imperativa. À medida que os volumes das amostras de proteína se tomam menores, as perdas indesejáveis de amostras devido à retenção dentro de um dispositivo aumentaram em importância. De acordo com determinadas modalidades, uma tampa de diafragma tendo um membro de orientação ou diafragma pode estar incluída no dispositivo para resgatar a perda das soluções de amostra que se acumulam, tal como no orifício molhado do tubo de alimentação. Por exemplo, mediante o término da centrifugação, pequenas quantidades de amostra podem diminuir no orifício interno da extremidade distal do tubo de alimentação. Esta pequena quantidade de amostra ou volume de retenção pode ser tão grande quanto 5 ou 10pl. Parte ou todo este volume de retenção pode ser evacuado a partir do orifício interno do dispositivo ativando-se o membro de orientação para criar pressão no dispositivo e forçar parte ou todo este volume de retenção para fora do dispositivo.

[079] As Figuras 15 e 16 mostram uma tampa de diafragma 300 que em determinadas modalidades pode ser afixada, de preferência, de modo articulado, ao membro de reservatório/troca 12. De preferência, a tampa de diafragma 300 não interfere na tampa do dispositivo 72. Em determinadas modalidades, a tampa de diafragma 300 inclui um perímetro 301 e uma região de orientação 302 localizada de modo radialmente interno a partir do perímetro 301. A região de orientação 302 é descendente a partir do perímetro 301 através do ombro 303, e inclui uma abertura 320 para permitir que o ar escape. Em determinadas modalidades, a tampa de diafragma 300 é genericamente circular, com o perímetro 301 sendo um anel anular, e a região de orientação também sem circular e tendo um diâmetro correspondente ao diâmetro interno da entrada (por exemplo, no local do flange 16) do reservatório de amostras 14 do membro 12. Logo, o dimensionamento da região de orientação 302 permite que a borda de perímetro externo da região de orientação 302 se engate de modo vedante à parede interna do membro 12 conforme observado na Figura 17.

[080] Em determinadas modalidades, a superfície de topo do flange 16 do membro de reservatório/troca 12 inclui uma porção de recepção de tampa 305, conforme mostrado na Figura 18. A porção de recepção de tampa é axialmente rebaixada ligeiramente a partir do restante da superfície de topo do flange 16, e inclui um botão 306 que se estende para cima além do restante da superfície de tipo do flange 16. O botão 306 corresponde em formato a uma abertura 307 no perímetro 301 da tampa 300, sendo que a abertura 307 é formada em uma porção de perímetro 308 que é axialmente rebaixada ligeiramente (pela altura dos ombros 311, 312) a partir do restante do perímetro 301 (Figura 16). Uma segunda abertura 313 é definida radialmente para dentro a partir da porção de perímetro 308 conforme mostrado nas Figuras 16 e 17. Em determinadas modalidades, a superfície de topo 316 do botão 306 é mais larga do que a largura da abertura 307 (mais bem mostrada nas Figuras 19 e 21), inibindo, assim, que a tampa 300 de desaloje de modo não-intencional a partir do membro de reservatório/troca 12.

[081] O flange 16 também inclui uma região radialmente rebaixada 307 que é conformada e posicionada para cooperar com uma aba estendendo-se axialmente 309 sobre a tampa de diafragma 300, para permitir que a tampa 300 seja encaixada no membro 12. Portanto, quando a tampa de diafragma 300 estiver na posição fechada conforme mostrado na Figura 17, a aba estendendo-se axialmente 309 é posicionada na região rebaixada 307 do flange 16. Em determinadas modalidades, a região radialmente rebaixada 307 é posicionada oposta à porção de recepção de tampa 305, e a aba estendendo-se axialmente 309 é similarmente posicionada oposta à porção de perímetro 308. A aba 309 e a região rebaixada 307 cooperam para permitir uma simples manipulação manual da tampa de diafragma. Por exemplo, o usuário pode mover a tampa de diafragma a partir de sua posição fechada até sua posição aberta enquanto mantém o dispositivo simplesmente colocando-se o topo de seu dedo polegar debaixo da extremidade livre de fundo da torneira e erguendo-a para cima até que seja liberada da região rebaixada 307.

[082] As Figuras 20 e 21 ilustram a tampa de diafragma 20 na posição aberta. Na posição aberta, a tampa de diafragma 300 permanece acoplada ao flange 16 através do botão 306. A abertura 313 define um eixo geométrico radial ao redor do qual a tampa 300 pode se articular entre a posição aberta e a posição fechada, definindo, assim, uma dobradiça incorporada. A Figura 22 mostra uma vista explodida de uma modalidade incluindo um filtro maior, tal como um filtro de 15 ml 50’. Na modalidade mostrada, um retentor de montagem não é usado, embora um possa estar presente.

[083] O membro de orientação ou diafragma 302 é constituído por um material flexível deformado, e, portanto, pode ser facilmente desviado axialmente, tal como pelo dedo indicador do usuário, quando a tampa de diafragma estiver em posição em sua posição fechada. A ativação do membro 302 desta forma cria uma força dentro do dispositivo que evacua o fluido de retenção na cavidade interna do tubo de alimentação e do tubo distai e, portanto, reduz ou elimina o volume de retenção.

[084] A tampa de diafragma 300 permite a centrifugação da montagem do dispositivo com ou sem a tampa rosqueada 70 em posição.

[085] O diafragma ou membro de orientação pode ser elastomérico ou termoformado.

Exemplo 1 - Depleção por Afinidade

[086] Neste protocolo, os contaminantes principais da amostra são seletivamente ligados ao meio enquanto os componentes de interesse permanecem em solução. Mediante o térmico da etapa de ligação, a solução é colhida para análise adicional.

[087] As microesferas que se ligam tanto a albumina como ao IgG sã adicionadas ao dispositivo de ligação, lavagem, eluição e concentração (BWEC) completamente montado (por exemplo, Figura 9. Uma amostra de soro é adicionada e deixada interagir com as microesferas que removem seletivamente a albumina e o IgG da amostra absorvendo-os sobre a superfície das microesferas através da interação com um anticorpo anti-albumina imobilizado e proteína A imobilizada. Após a etapa de incubação, as microesferas são separadas dos componentes não-ligados no líquido por centrifugação. As microesferas são contidas pela frita no dispositivo BWEC enquanto a solução contendo os analitos e os biomarcadores de interesse passa para a câmara abaixo. Esta câmara pode simplesmente ser o tubo de teste ou pode ser um dispositivo de filtração como uma unidade de filtração centrífuga Amicon Ultra-O.5, que proporciona o benéfico que os biomarcadores de proteína na amostra podem ser concentrados na mesma etapa de centrifugação como a remoção de microesferas. Isto é especificamente significativo para depleção por afinidade visto que amostras de soro tipicamente requerem uma diluição de 10 vezes antes da incubação de microesfera porque a albumina e o IgG a serem removidos são em uma concentração muito alta e precisam entrar em contato com um grande volume de microesferas para realizar a remoção completa. Uma vez que as proteínas abundantes forem removidas das amostras diluídas, os alvos restantes de interesse tipicamente precisam ser concentrados. Portanto, o acoplamento da remoção/separação de microesferas e as etapas de concentração reduz o manuseio necessário no fluxo de trabalho.

Exemplo 2 - Purificação por Afinidade

[088] Apresenta-se no presente documento um exemplo típico de como as microesferas de afinidade são usadas para purificar um analito de interesse. Neste caso, as microesferas são usadas para ligar seletivamente o alvo, os contaminantes são lavados e, então, o analito de interesse é eluído a partir das microesferas alterando-se o sistema de tampão.

[089] As microesferas de cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC) que são carregadas com cobre são colocadas no dispositivo BWEC junto a uma amostra que contém uma proteína de fusão unida ao tag de purificação por afinidade 6X His. É o tag 6X His que é conhecido por se ligar às microesferas IMAC carregadas como cobre (conhecidas como microesferas de tag his). Uma vez que a ligação estiver completa, o dispositivo é centrifugado para remover os contaminantes que permanecem na solução enquanto as microesferas são retidas pela frita no dispositivo. As microesferas podem ser lavadas com tampão de carregamento adicional para obter uma purificação mais clara. No entanto, a separação inicial e as lavagens são realizadas sem o dispositivo de filtração (por exemplo, sem um dispositivo Amicon Ultra-O.5 ml) e a solução não-ligada e as lavagens são coletadas como refugo no fundo do tubo da centrífuga. Uma vez que as lavagens estiverem completas, o dispositivo de filtração (por exemplo, um dispositivo Amicon Ultra-O.5) é fixado à sadia do dispositivo BWEC e um tampão de eluição que desassocia o alvo das microesferas é adicionado. O alvo purificado é, então, coletado e concentrado no dispositivo de filtração em uma única volta sem a necessidade de etapas de transferência adicionais.

Exemplo 3 - Troca de Tampão

[090] Os exemplos 1 e 2 levam vantagem apenas da funcionalidade de manuseio de microesferas do dispositivo BWEC. Descreve-se, agora, uma capacidade de troca de buffer. Dispositivos de ultrafiltração vem sendo utilizados há muito tempo para troca de tampão. Isto é realizado simplesmente concentrando-se a amostra (por exemplo, 10 vezes a partir de 500 pl até 50 pl) e, então, diluindo-se o novo tampão de volta ao volume original. Em uma única etapa, isto produziria aproximadamente uma troca de tampão de 10 vezes ou 90%. Tipicamente, isto é insuficiente com um máximo na ordem de uma troca de tampão de 99,9%, que requer três giros separados com um dispositivo de ultrafiltração típico, como o dispositivo Amicon Ultra-O.5. Adicionalmente, se tiver simplesmente diluído a amostra com o volume completo, 1,5 ml neste exemplo, em um único giro, não seria tão eficaz (96,7%) quanto três giros em 0,5 ml cada (99,9%). Embora 96,7% possam parecer próximos a 99,9%, de fato, existem 33 vezes mais tampão restante que foi trocado para 96,7%. A chave para um único giro bem sucedido consiste em medir a amostra lentamente com mistura ao invés de uma única diluição grande.

[091] Uma amostra de proteína/DNA contendo azida ou algum outro tampão ou sal indesejável é primeiramente adicionada ao dispositivo completamente montado (BWEC mais o dispositivo de filtração, por exemplo, um Amicon Ultra-O.5). Então, a mesma é centrifugada e concentrada até 50 ul. A seguir, 1,5 ml do novo tampão é adicionado ao dispositivo e novamente centrifugado. O dispositivo mede lentamente o novo tampão na amostra e remove o tampão antigo indesejado, deixando a amostra concentrada no novo tampão.

Exemplo 4 - Combinação de Purificação por Afinidade com Troca de Tampão

[092] Quando uma amostra purificada por afinidade ou depletada também requerer uma troca de tampão além da concentração, isto pode ser realizado simplesmente combinando-se as etapas de purificação com a troca de tampão.

[093] As microesferas IMAC são carregadas no dispositivo BWEC junto a uma amostra que contém uma proteína de fusão ligada ao 6X His. Uma vez que a ligação estiver completa, o dispositivo é centrifugado para remover os contaminantes que permanecem em solução enquanto as microesferas são retidas pela frita no dispositivo. As microesferas podem ser lavadas com tampão de carregamento adicional para obter uma purificação mais clara. Uma vez que as lavagens estiverem completas, o dispositivo de filtração (por exemplo, um dispositivo Amicon Ultra-O.5) é fixado à saída do dispositivo BWEC e um tampão de eluição que desassocia o alvo das microesferas e adicionado. O alvo purificado é, então, coletado e concentrado no dispositivo de filtração em um único giro sem a necessidade de etapas de transferência adicionais. Para remover a imidazola, que é tipicamente usada no tampão de eluição, pode-se adicionar 1,5 ml de PBS ao dispositivo e girar novamente. O PBS não terá impacto sobre as microesferas e vice-versa. O PBS será lentamente medido na amostra previamente eluída, removendo a imidazola, substituindo-a por PBS.

Exemplo 5 -Volumes de Retenção

[094] Os volumes de retenção foram avaliados com dispositivos de ligação- lavagem-eluição-concentração (BWEC) e tampas de diafragma. Os dispositivos foram pré-lavados com 1,5 ml BSA (1 mg/ml PBS) a 4000 xg durante 2 minutos, e, então, 0,5 ml BSA (1 mg/ml PBS) foi adicionado a cada um dos dispositivos após a montagem com um dispositivo de filtro de 0,5 pm (AMICON ULTRA 0.5 ml 10K, disponível junto à EMD Millipore Corporation), seguido por centrifugação durante 15 minutos a 4000 xg. Os volumes de retenção foram calculados por diferença de peso dos dispositivos antes e após ativar o diafragma. Os resultados são mostrados na Figura 26, e demonstram que a ativação do diafragma resulta na recuperação de mais de 1,5 pl de amostra comparado a nenhum diafragma.

Exemplo 6

[095] Os dispositivos de ligação-lavagem-eluição (BWE) foram avaliados em troca de tampão. 50 pl de 10 mM Tris, pH 7,5, 1 M de NaCI foram distribuídos a um dispositivo de filtro (AMICON ULTRA 0,5 ml 10K, disponível junto à EMD Millipore Corporation) e montado em tubos de troca e centrifugados a 4000 xg durante 15 minutos após a adição de 1,5 ml de 10 mM Tris, pH 7,5 ao tubo de troca. Os retentados foram coletados por centrifugação inversa durante 2 minutos a 1000 xg e o volume final foi ajustado para 100 pl com 10 mM Tris. As condutividades foram medidas após adicionar 4,9 ml Milli-Q de água. Para o controle de 3 giros, a troca de tampão foi realizada por três lavagens consecutivas com 0,5 ml. A Figura 27 mostra que a etapa de ligação-lavagem-eluição é realizada de modo equivalente ao método de 3 giros apesar de apenas um único giro.

Claims

1. Dispositivo para preparação de amostras, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um membro de reservatório/troca tendo um reservatório de amostras, uma coluna estendendo-se axialmente a partir do dito reservatório, a dita coluna tendo uma região retentora e uma região tendo uma geometria dotada de aletas afunilando radialmente de uma porção superior relativamente grossa para uma porção inferior relativamente fina que converge em uma haste que se estende axialmente com um fundo aberto, e uma saída espaçada e em comunicação fluídica com o dito reservatório de amostras, e um dispositivo de filtração fixado ao dito membro de reservatório/troca, sendo que o dito dispositivo de filtração compreende uma câmara de filtrado, uma ou mais membranas espaçadas posicionadas de modo vedante entre o dito reservatório de amostras e a dita câmara de filtrado, sendo que uma câmara de retenção define um volume de batente fixo abaixo das ditas membranas, sendo que a dita saída do dito membro de reservatório/troca é posicionada no dito volume de batente fixo.

2. Dispositivo de preparação de amostras, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita região dotada de aletas tem uma espessura de parede uniforme.

3. Dispositivo de preparação de amostras, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita coluna abriga meios de cromatografia.

4. Dispositivo de preparação de amostras, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito meio de cromatografia compreende microesferas.

5. Dispositivo de preparação de amostras, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito meio de cromatografia compreende meios que se ligam a um membro selecionado do grupo que consiste em quelato metálico, proteína A, glutationa e albumina.

6. Dispositivo de preparação de amostras, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita coluna abriga uma frita.

7. Dispositivo de preparação de amostras, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas membranas espaçadas definem entre elas um volume e em que a referida região com uma geometria dotada de aletas ocupa o dito volume e é deslocada de cada referida membrana.

8. Método de preparação de amostras, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: proporcionar um dispositivo para preparação de amostras que compreende um membro de reservatório/troca tendo um reservatório de amostras, uma coluna estendendo-se axialmente a partir do dito reservatório, sendo que a dita coluna contém um meio e tendo uma região retentora e uma região tendo uma geometria dotada de aletas afunilando radialmente de uma porção superior relativamente grossa para uma porção inferior relativamente fina que converge em uma haste que se estende axialmente com um fundo aberto, e uma saída espaçada e em comunicação fluídica com o dito reservatório de amostras, e um dispositivo de filtração fixado ao dito membro de reservatório/troca, sendo que o dito dispositivo de filtração compreende uma câmara de filtrado, uma ou mais membranas espaçadas posicionadas de modo vedante entre o dito reservatório de amostras e a dita câmara de filtrado, e uma câmara de retenção definindo um volume de batente fixo abaixo das ditas membranas; ligar seletivamente um alvo ao dito meio, lava a dita amostra ligada ao dito meio para remover os contaminantes, e eluir o dito alvo a partir do dito meio no dito dispositivo de filtração aplicando-se uma força centrífuga em uma única etapa.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita região dotada de aletas tem uma espessura de parede uniforme.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita coluna abriga meios de cromatografia.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito meio de cromatografia compreende microesferas.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito meio de cromatografia compreende meios que se ligam a um membro selecionado do grupo que consiste em quelato metálico, proteína A, glutationa e albumina.

13. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas membranas espaçadas definem entre elas um volume e em que a referida região com uma geometria dotada de aletas ocupa o dito volume e é deslocada de cada referida membrana.