CN208586304U - 一种用于稀有细胞的分离富集与转移系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种用于稀有细胞的分离富集与转移系统，将微滤与微流控技术相结合，采用栅形孔设计替代微滤中常用的圆孔，通过仿真设计的3‑D栅形微纳芯片，并根据常见肿瘤细胞的物理特性，优化栅形结构参数、富集分离条件，提高分离能力；通过优化芯片夹具结构保证芯片在运行中无可见变形；通过芯片表面涂层减少芯片与细胞粘附；通过加入抗粘附生物试剂，降低细胞间粘附；最后通过引入间歇波动性流体，将富集分离得细胞从芯片上转移出来，供下游检测需要。

Description

一种用于稀有细胞的分离富集与转移系统

技术领域

本发明涉及细胞分离技术领域，具体涉及一种用于稀有细胞的分离富集与转移系统。

背景技术

CTC（循环肿瘤细胞，CirculatingTumorCell）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称,其数量非常稀少，却具有重要临床意义的稀有细胞。CTC检测通过捕捉检测外周血中痕量存在的CTC，监测CTC类型和数量变化的趋势，以便实时监测肿瘤动态、评估治疗效果，实现实时个体治疗。通常CTCs检测利用细胞的生物特性或物理性质等对CTCs加以分离富集。基于细胞物理性质的分离是利用CTCs与血细胞在细胞密度、体积大小、变形性和电性能等方面的差异，用密度梯度离心、微滤、微流体和双向电泳等方法从外周血分离CTCs。

目前用于CTC方面的技术通常是单独采用微滤或微流控技术，微滤技术完全基于大小的CTCs检测技术容易受到血中体积较大白细胞的影响；微流控技术芯片，有螺旋形、梯度柱状等形式，能部分实现富集分离和转移目的；基于细胞变形特点微孔膜计数可将白细胞和CTCs分开；但是这类方法面临最大问题是滤膜上细胞堆积和吸附，从而限制其使用效果。

总之，基于物理原理进行CTCs检测存在的主要问题有：细胞富集率和细胞富集纯度，二者互为矛盾，难有两全；流速慢，每分钟仅几微升，实验时间长，多达十几到二十多小时；实际操作容易堵塞，细胞活性受损，甚至破裂等现象；进而导致芯片滤孔变形降低捕获率；捕获的细胞转移出来难，捕获的细胞由于粘附等原因难以被有效转移出来。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中血液中稀有细胞（尤其是循环肿瘤细胞）的分离富集与转移技术问题，提供一种用于稀有细胞的分离富集与转移系统。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于稀有细胞的分离富集与转移系统。所述系统包括：主机、液体控制系统、样品管、微流控芯片夹具、废液瓶和管线、多种缓冲液管，

其中，主机上控制所有液体控制系统的运行与切换，

液体控制系统通过管线分别与缓冲液管、样品管和废液瓶相连接，

所述的样品管与微流控芯片夹具连接并且相互连通，

所述的微流控芯片夹具通过管线与废液瓶连接；所述的微流控芯片夹具包括上夹片、下夹片、密封圈和芯片，上下夹片内包埋有相关管道。

其中上下夹片内同侧分别为进样、废液管道，上夹片进样边相邻两侧分别有侧冲洗管道。

其中，缓冲液管包括：上样缓冲液管、侧冲缓冲液管、转移缓冲液管。

其中，芯片夹具整体结构采用三明治结构堆叠方式进行组装设计，芯片微过滤膜处于结构中间层，上下两层夹板分别为微流道及腔室层。

其中，芯片夹具通过具有栅形微纳芯片实现微滤。

其中，所述系统通过引入间歇波动性流体，将富集分离得细胞从芯片上转移出来。

其中，夹具上下板采用双O形圈设计将芯片悬空不与夹板直接接触。

本发明的有益效果是，本发明涉及的系统将微滤与微流控技术相结合，采用栅形孔设计替代微滤中常用的圆孔，通过仿真设计的3-D栅形微纳芯片，并根据常见肿瘤细胞的物理特性，优化栅形结构参数、富集分离条件，提高分离能力；通过优化芯片夹具结构保证芯片在运行中无可见变形；通过芯片表面涂层减少芯片与细胞粘附；通过加入抗粘附生物试剂，降低细胞间粘附；最后通过引入间歇波动性流体，将富集分离得细胞从芯片上转移出来，供下游检测需要。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明的优选实施例的系统示意图。

图2是本发明的优选实施例的微过滤膜的光学显微镜图及扫描电镜图。

图3是本发明的优选实施例的芯片及夹具空间位置与结构示意图。

图4是本发明的优选实施例的芯片夹具组装示意图。

图5是本发明的优选实施例的芯片夹具上板仰视图。

图6是本发明的优选实施例的液体流转结构示意图。

图7是本发明优选实施例的血液稀有细胞富集分离与转移方案流程图。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。

本发明的涉及的系统包括主机、液体控制系统、样品管、微流控芯片夹具、废液瓶和管线，其中，主机上控制所有液体控制系统运行与切换，液体控制系统通过管线分别与上样缓冲液管、侧冲缓冲液管、转移缓冲液管、样品管和废液瓶相连接，所述的样品管与微流控芯片夹具连接并且相互连通，所述的微流芯片通过管线与废液瓶连接；所述的微流控芯片夹具包括上夹片、下夹片、密封圈和芯片，上下夹片内包埋有相关管道，其中上下夹片内同侧分别为进样、废液管道，上夹片进样边相邻两侧分别有侧冲洗管道。在主机及液体控制装置的控制下，实现样品、缓冲液的管理控制，以及废液的处理，其中，各种液体的流转通过对微流控制芯片夹具的管理实现。

其中，芯片夹具的设计过程如下：根据细胞形态大小等特点初步选取的微过滤单元结构特征尺寸（宽度）为5-10微米来分别设计并加工。其优化尺寸根据筛选过程机理研究的结果决定；首先LPCVD分别在硅基上下分别沉积一定厚度的氮化硅，其中所述一定厚度优选为均一厚度150-500nm。再分别采用涂胶-光刻-显影-RIE刻蚀的步骤流程，分别图形化上下层的氮化硅层。其中，上层氮化硅层为过滤膜结构层，背部保护层为充液池，最后通过KOH湿法刻蚀方法整体释放出微过滤膜结构，其中，微过滤膜如图2所示。

上述芯片所使用的参数如下：硅基衬底N<100>，400+/-15um；低应力氮化硅薄膜双面厚度（h）各为150<h<500nm；单个栅形孔尺寸长宽比10-20:1，宽度为5-10微米。相邻栅形孔氮化硅宽度5-15微米；每个单元滤膜结构总尺寸规格1.5-6毫米。

根据上述芯片参数，获得所述芯片后，加入一定浓度的特殊涂层剂溶液中，在50℃条件下包被反应5-15小时，最终在氮化硅表面形成涂层；为进一步提高转移效果，使用一定浓度的牛血清白蛋白进行包埋处理，由此可以改变芯片表面电荷属性，减少细胞与芯片间粘附。该涂层能降低氮化硅表面的静电作用，减少细胞与氮化硅间的粘附，有利于后面高效率转移。本技术同类芯片中未见使用。

上述芯片夹具设计过程包含芯片栅形设计参数、芯片氮化硅层厚度；其中，栅形设计减少降低同类芯片细胞富集过程堵塞现象，也为提高流速和缩短分离时间提供基础；芯片氮化硅层厚度影响获得细胞的活性，芯片中氮化硅厚度范围能保证获得的细胞活性不受影响；同时该参数芯片制备成品率高，达90%以上，其他类似材料制备芯片成品率远低于该芯片所采用参数。

优选的，芯片夹具整体结构采用三明治结构堆叠方式进行组装设计，芯片微过滤膜处于结构中间层，上下两层夹板分别为微流道及腔室层。芯片上下层夹板采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），厚度各6毫米，上板相邻三侧面包埋有测冲洗管路端口1和端口2，端口2在两个端口1中间；上夹板内另有一环形流路；下板仅有端口3，上下板以中央点（对角线交叉点）为原点，直径16-14.5毫米区域间各开一半弧形圆圈，用于装置O形圈，O型圈外径16毫米，线径1.5毫米，采用熟橡胶材质。组装时芯片置于夹具正中央位置，O形圈将芯片过滤区全部包含在内。另外夹具下板有两个销柱，上板对应位置有两个销孔。整个芯片夹具如图3和图4所示。

夹具上下板双O形圈设计将芯片悬空不与夹板直接接触，提高密封效果，有利于出液端流出，同时O形环将芯片四周固定绷紧，降低了实验过程中微孔的变形性，保证所富集的细胞选择性。该设计解决同类芯片实验过程中变形引起的系列问题。环形侧冲流路设计，为其他同类芯片夹具所未见，该设计配合泵2提供持续的波动液流，让细胞与芯片间不易形成稳定粘附，多点对称设计保证芯片各位置均收到有效冲洗。

优选的，管线上设置有控制阀以实现液体流的通断。

优选的，样品管和同类缓冲液管具有两个，以便根据需要进行重复操作；提高检测的准确性，其中，不同的样品管以及不同的同类缓冲液管中的液体为分别制备完成。由此能够防止当检测过程中，液体被污染时，能够通过备用的液体继续检测。如果未发生液体污染的情况，则通过两次操作能够提高准确性。

最后，结合图1、6，对血液稀有细胞富集分离与转移方案流程进行说明：

其中，图6中1为样品管，2为废液管，3为第一泵，4为第二泵，5为芯片夹具，主机及液体控制装置未在图6中示出；

在主机及液体控制装置的控制下，实现样品、缓冲液的管理控制，以及废液的处理，其中，各种液体的流转通过对微流控制芯片夹具的管理实现，具体如7所示。

步骤1：样本制备：2ml全血，用等体积等渗液稀释后，加入一定浓度的抗粘附剂；

步骤2：缓冲液制备：侧冲缓冲液、转移缓冲液；其中，步骤1,2的先后顺序可以根据实现需要进行调整。

步骤3：泵1与端口2连接，上样，流速0.1ml/min；泵2与端口1连接进侧冲缓冲液；流速0.2ml/min；端口3为出废液口。

步骤4：冲洗：冲洗体积为上样体积2倍；流路连接不变。

步骤5：转移：转移液体积为上体体积10倍；泵1与端口3连接，进混有一定比例气体转移缓冲液，流速0.4ml/min；泵2与端口1连接进侧冲缓冲液；流速0.4ml/min；端口2接转移细胞收集管。

步骤6：收集细胞离心：260g，离心5分钟。去上清，沉淀加等渗液悬浮，供下游使用。

本发明采用将微滤与微流控技术相结合，采用栅形孔设计替代微滤中常用的圆孔，通过仿真设计的3-D栅形微纳芯片，并根据常见肿瘤细胞的物理特性，优化栅形结构参数、富集分离条件，提高分离能力；通过优化芯片夹具结构保证芯片在运行中无可见变形（即在光学显微镜下不可见）；通过芯片表面涂层减少芯片与细胞粘附；通过加入抗粘附生物试剂，降低细胞间粘附；最后通过引入间歇波动性流体，将富集分离得细胞从芯片上转移出来，供下游检测需要。

现有的预实验结果显示：上样流速0.1-0.2ml/mim，富集分离时间30-40分钟， 转移时间10分钟，能去除血液中99.9%以上的红细胞，70%以上的白细胞，富集分离得细胞直径大于8微米，富集细胞转移率大于90%，活性细胞大于90%。基本解决现在同类芯片流速慢、易堵塞、细胞活性低且难以转移的问题。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种用于稀有细胞的分离富集与转移系统，其特征在于，所述系统至少包括：主机、液体控制系统、样品管、微流控芯片夹具、废液瓶和管线以及多种缓冲液管，

其中，主机上控制所有液体控制系统的运行与切换，

液体控制系统通过管线分别与缓冲液管、样品管和废液瓶相连接，

所述的样品管与微流控芯片夹具连接并且相互连通，

所述的微流控芯片夹具通过管线与废液瓶连接；所述的微流控芯片夹具包括上夹片、下夹片、密封圈和芯片，上下夹片内包埋有相关管道。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，上下夹片内同侧分别为进样、废液管道，上夹片进样边相邻两侧分别有侧冲洗管道。

3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，其中缓冲液管包括：上样缓冲液管、侧冲缓冲液管、转移缓冲液管。

4.如权利要求1-3任一项所述的系统，其特征在于，其中，芯片夹具整体结构采用三明治结构堆叠方式进行组装设计，芯片微过滤膜处于结构中间层，上下两层夹板分别为微流道及腔室层。

5.如权利要求4所述的系统，其特征在于，其中，芯片夹具通过具有栅形微纳芯片实现微滤。

6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，其中，所述系统通过引入间歇波动性流体，将富集分离得细胞从芯片上转移出来。

7.如权利要求6所述的系统，其特征在于，其中，夹具上下板采用双O形圈设计将芯片悬空不与夹板直接接触。

8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，其中，所述管线上具有控制阀以实现液体流的通断。

9.如权利要求7所述的系统，其特征在于，样品管和同类缓冲液管具有两个，且其中的液体为分别单独制备。

10.如权利要求4所述的系统，其特征在于，所述微流控芯片夹具配以优化后实验流程与方案，实现系统的分离富集与转移功能。