BR112021008360A2 - ureia 6,7-di-hidro-4h-pirazolo[1,5-a]pirazinas ativas inovadoras contra o vírus da hepatite b (hbv) - Google Patents

Abstract

UREIA 6,7-DI-HIDRO-4H-PIRAZOLO[1,5-A]PIRAZINAS ATIVAS INOVADORAS CONTRA O VÍRUS DA HEPATITE B (HBV). A presente invenção se refere, em geral, a agentes antivirais inovadores. Especificamente, a presente invenção se refere a compostos que podem inibir a(s)proteína(s) codificada(s) por vírus da hepatite B (HBV) ou interferir com a função do ciclo de replicação de HBV, composições que compreendem tais compostos, métodos para inibir replicação viral de HBV, métodos para tratar ou prevenir infecção por HBV, e processos e intermediários para produzir os compostos.

Description

“UREIA 6,7-DI-HIDRO-4H-PIRAZOLO[1,5-A]PIRAZINAS ATIVAS INOVADORAS CONTRA O VÍRUS DA HEPATITE B (HBV)” Campo Técnico

[0001] A presente invenção se refere, em geral, a agentes antivirais inovadores. Especificamente, a presente invenção se refere a compostos que podem inibir a(s) proteína(s) codificada(s) por vírus da hepatite B (HBV) ou interferir com a função do ciclo de replicação de HBV, composições que compreendem tais compostos, métodos para inibir replicação viral de HBV, métodos para tratar ou prevenir infecção por HBV e processos para produzir os compostos. Antecedentes da Invenção

[0002] A infecção por HBV crônica é um problema de saúde global significativo, que afeta cerca de 5 % da população mundial (cerca de 350 milhões de pessoas no mundo todo e 1,25 milhões de indivíduos nos EUA). Apesar da disponibilidade de uma vacina contra HBV profilática, o ônus da infecção por HBV crônica continua a ser um problema médico mundial não atendido, devido às opções de tratamento subideal e taxas sustentadas de novas infecções na maior parte do mundo em desenvolvimento. Os tratamentos atuais não fornecem uma cura e se limitam apenas a duas classes de agentes (interferon alfa e análogos/inibidores de nucleosídeo da polimerase viral); a resistência ao fármaco, baixa eficácia e problemas de tolerabilidade limitam seu impacto.

[0003] As taxas de cura baixas de HBV são atribuídas pelo menos em parte ao fato de que a supressão completa de produção de vírus é difícil de alcançar com um único agente antiviral, e à presença e à persistência de DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) no núcleo de hepatócitos infectados. Entretanto, a supressão persistente de DNA de HBV mostra progressão de doença hepática e ajuda a prevenir carcinoma hepatocelular (HCC).

[0004] Os objetivos de terapia atuais para pacientes infectados por HBV são direcionados para reduzir DNA de HBV sérico em níveis baixos ou indetectáveis, e para reduzir ou prevenir por fim o desenvolvimento de cirrose e HCC.

[0005] O HBV é um vírus de DNA parcialmente de fita dupla envelopado (dsDNA) da família de hepadnavírus (Hepadnaviridae). A proteína de capsídeo de HBV (HBV-CP) desempenha papéis essenciais em replicação de HBV. A função biológica predominante de HBV-CP é agir como uma proteína estrutural para encapsidar RNA pré-genômico e formar partículas de capsídeo imaturas, que se montam automaticamente de modo espontâneo a partir de diversas cópias de dímeros de proteína de capsídeo no citoplasma.

[0006] A HBV-CP também regula a síntese de DNA viral através de estados de fosforilação diferenciais de seus sítios de fosforilação de C-terminal. Ademais, a HBV-CP pode facilitar a translocação nuclear de genoma circular relaxado viral por meio dos sinais de localização nuclear localizados no domínio rico em arginina da região de C-terminal de HBV- CP.

[0007] No núcleo, como um componente do minicromossomo de cccDNA viral, a HBV-CP poderia desempenhar um papel estrutural e regulatório na funcionalidade de minicromossomos de cccDNA. A HBV-CP também interage com proteína de envelope grande viral no retículo endoplasmático (ER) e dispara a liberação de partículas viral intactas de hepatócitos.

[0008] Compostos anti-HBV relacionados à HBV-CP foram relatados. Por exemplo, os derivados de fenilpropenamida, incluindo os compostos chamados de AT-61 e AT-130 (Feld J. et al. Antiviral Res. 2007, 76, 168), e uma classe de tiazolidin-4-onas de Valeant (documento WO2006/033995), demonstraram inibição de empacotamento de RNA pré-genômico (pgRNA).

[0009] F. Hoffmann-LA Roche AG revelou uma série de tetra- hidro-pirazolo[1,5-a]pirazinas 3-substituídas para a terapia de HBV (documentos WO2016/113273, WO2017/198744, WO2018/011162, WO2018/011160, WO2018/011163).

[0010] Heteroarildi-hidropirimidinas (HAPs) foram descobertas em uma triagem à base de cultura de tecido (Weber et al., Antiviral Res. 2002, 54, 69). Esses análogos de HAP atuam como ativadores alostéricos sintéticos e são capazes de induzir formação de capsídeo anormal que leva à degradação de HBV-CP (documentos WO 99/54326, WO 00/58302, WO 01/45712, WO 01/6840). Análogos de HAP adicionais também foram descritos (J. Med. Chem. 2016, 59 (16), 7651-7666).

[0011] Uma subclasse de HAPs de F. Hoffmann-La Roche também mostra atividade contra HBV (documentos WO2014/184328, WO2015/132276 e WO2016/146598). Uma subclasse similar de Sunshine Lake Pharma também mostra atividade contra HBV (documento WO2015/144093). HAPs adicionais também demonstraram possuir atividade contra HBV (documento WO2013/102655, Bioorg. Med. Chem. 2017, 25(3) pp. 1042-1056, e uma subclasse similar da Enanta Therapeutics mostra atividade similar (documento WO2017/011552). Uma subclasse adicional da Medshine Discovery mostra atividade similar

(documento WO2017/076286). Uma subclasse adicional (Janssen Pharma) mostra atividade similar (documento WO2013/102655).

[0012] Uma subclasse de piridazonas e triazinonas (F. Hoffman-La Roche) também mostrou atividade contra HBY (documento WO2016/023877), como uma subclasse de tetra- hidropiridopiridinas (documento WO2016/177655). Uma subclasse de derivados de ácido 4-piridona-3-carboxílico tricíclico da Roche também mostra atividade anti-HBV similar (documento WO2017/013046).

[0013] Uma subclasse de sulfamoil-arilamidas da Novira Therapeutics (agora parte da Johnson & Johnson Inc.) também mostra atividade contra HBV (documentos WO2013/006394, WO2013/096744, WO2014/165128, WO2014/184365, WO2015/109130, WO2016/089990, WO2016/109663, WO2016/109684, WO2016/109689, WO2017/059059). Uma subclasse similar de tioéter-arilamidas (também da Novira Therapeutics) mostra atividade contra HBV (documento WO2016/089990). Adicionalmente, uma subclasse de aril-azepanos (também da Novira Therapeutics) mostra atividade contra HBV (documento WO2015/073774). Uma subclasse similar de arilamidas da Enanta Therapeutics mostra atividade contra HBV (documento WO2017/015451).

[0014] Os derivados de sulfamoíla da Janssen Pharma também demonstraram possuir atividade contra HBV (documentos WO2014/033167, WO2014/033170, WO2017001655, J. Med. Chem, 2018, 61(14) 6247-6260)

[0015] Uma subclasse de derivados de pirrolamida substituída por glioxamida também da Janssen Pharma também demonstrou possuir atividade contra HBV (documento WO2015/011281). Uma classe similar de pirrolamidas substituídas por glioxamida (Gilead Sciences) também foi descrita (documento WO2018/039531).

[0016] Uma subclasse de sulfamoil- e oxalil- heterobiarilas da Enanta Therapeutics também mostra atividade contra HBV (documentos WO2016/161268, WO2016/183266, WO2017/015451, WO2017/136403 & US20170253609).

[0017] Uma subclasse de anilina-pirimidinas da Assembly Biosciences também mostra atividade contra HBV (documentos WO2015/057945, WO2015/172128). Uma subclasse de triciclos fusionados da Assembly Biosciences (dibenzo-tiazepinonas, dibenzo-diazepinonas, dibenzo-oxazepinonas) mostra atividade contra HBV (documentos WO2015/138895, WO2017/048950).

[0018] Uma série de sulfamidas cíclicas foi descrita como moduladores de função de HBV-CP pela Assembly Biosciences (documento WO2018/160878).

[0019] Uma série de sulfamidas cíclicas foi descrita como moduladores de função de HBV-CP pela Assembly Biosciences (documento WO2018/160878).

[0020] Arbutus Biopharma revelou uma série de benzamidas para a terapia de HBV (documentos WO2018/052967, WO2018/172852).

[0021] Foi também mostrado que a bis-ANS de molécula pequena atua como uma “cunha” molecular e interfere com a geometria de capsídeo-proteína normal e formação de capsídeo (Zlotnick A et al. J. Virol. 2002, 4848).

[0022] Os problemas que os antivirais que atuam diretamente em HBV podem encontrar são toxicidade, mutagenicidade, falta de seletividade, eficácia fraca, biodisponbilidade deficiente, baixa solubilidade e dificuldade de síntese. Assim, há uma necessidade de inibidores adicionais para o tratamento, melhora ou prevenção de HBV que possam superar pelo menos uma dessas desvantagens ou que tenham vantagens adicionais como potência aumentada ou uma janela de segurança aumentada.

[0023] A administração de tais agentes terapêuticos a um paciente infectado com HBV, como monoterapia ou em combinação com outros tratamentos de HBV ou tratamentos auxiliares, levará à carga viral significativamente reduzida, prognóstico melhorado, progressão diminuída da doença e/ou taxas de seroconversão acentuadas. Sumário da invenção

[0024] São fornecidos no presente documento compostos úteis para o tratamento ou a prevenção de infecção por HBV em um indivíduo em necessidade do mesmo, e intermediários úteis em sua preparação. A matéria da invenção é um composto da Fórmula I em que - R1 é fenila ou piridila, opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes por halo, C1-C4-alquila, C3-C6-cicloalquila, C1-C4-haloalquila ou C≡N - R2 é H ou metila - Ra e Rb são independentemente selecionados a partir do grupo que compreende C1-C6-alquila, C1-C6-haloalquila,

C3-C6-cicloalquila, C3-C7-heterocicloalquila, C2-C6- hidroxialquila e C2-C6-alquil-O-C1-C6-alquila, opcionalmente substituídas com 1, 2 ou 3 grupos, cada um independentemente selecionado a partir de OH, halo, carbóxi, C3-C7-heterocicloalquila, C1-C6-alquila, C1- C6-haloalquila, C1-C6-hidroxialquila, C1-C6-alquil-O- C1-C6-alquila, C1-C6-alquil-O-C1-C6-haloalquil C1-C6- alquil-S-C1-C6-alquila, C1-C6-alquil-SO2-C1-C6- alquila, C1-C6-alquil-C≡N, C1-C2-alquil-O-C3-C6- cicloalquila, C1-C2-alquil-C3-C7-heterocicloalquila, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C3-C7-cicloalquil)NH2, C1-C2- alquil-O-C(=O)(C1-C6-alquil)NH2, arila e heteroarila, em que arila ou heteroarila é opcionalmente substituída com 1, 2 ou 3 grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halo e C1-C6-alquila - Ra e Rb são opcionalmente conectados para formar um anel de C3-C7-heterocicloalquila ou sistema heteroespirocíclico que consiste em 2 ou 3 anéis C3-C7 opcionalmente substituídos com 1, 2 ou 3 grupos selecionados a partir de OH, halo, carbóxi, OCF3, OCHF2 e C≡N.

[0025] Em uma modalidade, a matéria da presente invenção é um composto de acordo com a Fórmula I em que R1 é fenila ou piridila, opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes por halo, C1-C4-alquila, C3-C6-cicloalquila, C1-C4-haloalquila ou C≡N.

[0026] Em uma modalidade, a matéria da presente invenção é um composto de acordo com a Fórmula I em que R2 é selecionado a partir do grupo que compreende H e metila.

[0027] Em uma modalidade, a matéria da presente invenção é um composto de acordo com a Fórmula I em que R a e Rb são independentemente selecionados a partir do grupo que compreende C1-C6-alquila, C1-C6-haloalquila, C3-C6- cicloalquila, C3-C7-heterocicloalquila, C2-C6- hidroxialquila, C2-C6-alquil-O-C1-C6-alquila opcionalmente substituída com 1, 2 ou 3 grupos, cada um independentemente selecionado a partir de OH, halo, carbóxi, C3-C7- heterocicloalquila, C1-C6-alquila, C1-C6-haloalquila, C1- C6-hidroxialquila, C1-C6-alquil-O-C1-C6-alquila, C1-C6- alquil-O-C1-C6-haloalquila, C1-C6-alquil-S-C1-C6-alquila, C1-C6-alquil-SO2-C1-C6-alquila, C1-C6-alquil-C≡N, C1-C2- alquil-O-C3-C6-cicloalquila, C1-C2-alquil-C3-C7- heterocicloalquila, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C3-C7- cicloalquil)NH2, C1-C2-alquil-O- C(=O)(C1-C6-alquil)NH2, arila e heteroarila, em que arila ou heteroarila é opcionalmente substituída com 1, 2 ou 3 grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halo e C1-C6- alquila.

[0028] Em uma modalidade, a matéria da presente invenção é um composto de acordo com a Fórmula I em que R a e Rb são opcionalmente conectados para formar um anel C3-C7- heterocicloalquila ou sistema heteroespirocíclico que consiste em 2 ou 3 anéis C3-C7 opcionalmente substituídos com 1, 2 ou 3 grupos selecionados a partir de OH, halo, carbóxi, OCF3, OCHF2 e C≡N.

[0029] Uma modalidade da invenção é um composto da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a invenção, para uso na prevenção ou no tratamento de uma infecção por HBV no indivíduo.

[0030] Uma modalidade da invenção é uma composição farmacêutica que compreende um composto da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção, juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0031] Uma modalidade da invenção é um método de tratamento de uma infecção por HBV em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção.

[0032] Uma modalidade adicional da invenção é um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a invenção, para uso na prevenção ou no tratamento de uma infecção por HBV no indivíduo em necessidade do mesmo em que - R1 é fenila ou piridila opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes por halo, C1-C4-alquila, C3-C6-cicloalquila, C1-C4-haloalquila ou C-≡N - R2 é H ou metila - R3 é C1-C4 alquila, em que a dita C1-C4-alquila é não substituída ou substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com deutério, OH ou halo - R4 é selecionado a partir do grupo que compreende C1-

C2-alquil-O-C1-C4-alquila, C1-C2-hidroxialquila, C1- C2-alquil-O-C1-C4-haloalquila, C1-C2-alquil-NH-C1-C4- haloalquila, C1-C2-alquil-O-C3-C6-cicloalquila, C1-C2- alquil-S-C1-C4-alquila, C1-C2-alquil-SO2-C1-C4- alquila, C1-C2-alquil-C≡N, C1-C2-alquil-C3-C7- heterocicloalquila, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C3-C7- cicloalquil)NH2, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C1-C6- alquil)NH2, arila e heteroarila, em que arila ou heteroarila é opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com halo ou C1-C6 alquila - R3 e R4 são opcionalmente conectados para formar um anel heterocíclico de cinco, seis ou sete membros, em que o dito anel heterocíclico é não substituído ou substituído uma vez, duas vezes ou três vezes com halo, OH, carbóxi, OCF3, OCHF2 ou C≡N - X é O, CH2 ou NR5 - m é 0, 1, 2 ou 3 - R5 é H ou C1-C4-alquila.

[0033] Em uma modalidade da invenção, a matéria da presente invenção é um composto da Fórmula II em que R1 é fenila ou piridila, opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes por halo, C1-C4-alquila, C3-C6- cicloalquila, C1-C4-haloalquila ou C≡N.

[0034] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R2 é H ou metila.

[0035] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R3 é C1-C4 alquila, a dita C1-C4-alquila é não substituída ou substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com halo ou OH.

[0036] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R4 e C1-C2- alquil-O-C1-C4-alquila, C1-C2-hidroxialquila, C1-C2-alquil- O-C1-C4-haloalquila, C1-C2-alquil-NH-C1-C4-haloalquila, C1- C2-alquil-O-C3-C6-cicloalquila, C1-C2-alquil-S-C1-C4- alquila, C1-C2-alquil-SO2-C1-C4-alquila, C1-C2-alquil-C≡N, C1-C2-alquil-C3-C7- heterocicloalquila, C1-C2-alquil-O- C(=O)(C3-C7-cicloalquil)NH2, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C1-C6- alquil)NH'2, arila ou heteroarila, em que arila ou heteroarila é opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com halo ou C1-C6 alquila.

[0037] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que X é O, CH2 ou NR5.

[0038] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R5 é H ou C1-C4- alquila.

[0039] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que m é 0, 1, 2 ou 3

[0040] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R3 e R4 são opcionalmente conectados para formar um anel carbocíclico ou heterocíclico de cinco, seis ou sete membros, o dito anel carbocíclico ou heterocíclico é não substituído ou substituído uma vez, duas vezes ou três vezes com halo, carbóxi, OH, OCF3, OCHF2 ou C≡N.

[0041] Uma modalidade da invenção é um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a invenção, para uso na prevenção ou no tratamento de uma infecção por HBV no indivíduo.

[0042] Uma modalidade da invenção é uma composição farmacêutica que compreende um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção, juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0043] Uma modalidade da invenção é um método de tratamento de uma infecção por HBV em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção.

[0044] Uma modalidade adicional da invenção é um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a invenção, para uso na prevenção ou no tratamento de uma infecção por HBV no indivíduo em necessidade do mesmo em que - R1 é fenila ou piridila, opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes por halo, C1-C4-alquila, C3-C6-cicloalquila, C1-C4-haloalquila ou C≡N - R2 é H ou metila - R3 é C1-C4 alquila, em que a dita C1-C4-alquila é não substituída ou substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com deutério ou halo - R4 é selecionado a partir do grupo que compreende C1- C2-alquil-O-C1-C4-alquila, C1-C2-hidroxialquila, C1- C2-alquil-O-C1-C4-haloalquila, C1-C2-alquil-O-C3-C6- cicloalquila, C1-C2-alquil-S-C1-C4-alquila, C1-C2- alquil-SO2-C1-C4-alquila, C1-C2-alquil-C≡N, C1-C2- alquil-C3-C7-heterocicloalquila, C1-C2-alquil-O- C(=O)(C3-C7-cicloalquil)NH2, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C1- C6-alquil)NH2, arila e heteroarila, em que arila ou heteroarila é opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com halo ou C1-C6 alquila - R3 e R4 são opcionalmente conectados para formar um anel heterocíclico de cinco, seis ou sete membros, em que o dito anel heterocíclico é não substituído ou substituído uma vez, duas vezes ou três vezes com halo, OH, carbóxi, OCF3, OCHF2 ou C≡N - X é 0, CH2 ou NR5 - m é 0, 1 ou 2 - R5 é H ou C1-C4-alquila.

[0045] Em uma modalidade da invenção, a matéria da presente invenção é um composto da Fórmula II em que R1 é fenila ou piridila, opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes por halo, C1-C4-alquila, C3-C6- cicloalquila, C1-C4-haloalquila ou C≡N.

[0046] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R2 é H ou metila.

[0047] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R3 é C1-C4- alquila, a dita C1-C4-alquila é não substituída ou substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com halo.

[0048] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R4 é C1-C2- alquil-O-C1-C4-alquila, C1-C2-hidroxialquila, C1-C2-alquil- O-C1-C4-haloalquila, C1-C2-alquil-O-C3-C6-cicloalquila, C1- C2-alquil-S-C1-C4-alquila, C1-C2-alquil-SO2-C1-C4-alquila, C1-C2-alquil-C≡N, C1-C2-alquil-C3-C7-heterocicloalquila, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C3-C7-cicloalquil)NH2, C1-C2-alquil-O- C(=O)(C1-C6-alquil)NH2, arila ou heteroarila, em que arila ou heteroarila é opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com halo ou C1-C6 alquila.

[0049] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que X é G, CH2 ou NR5.

[0050] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R5 é H ou C1-C4- alquila.

[0051] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que m é 0, 1 ou 2.

[0052] Em uma modalidade da invenção, a matéria da invenção é um composto da Fórmula II em que R3 e R4 são opcionalmente conectados para formar um anel carbocíclico ou heterocíclico de cinco, seis ou sete membros, o dito anel carbocíclico ou heterocíclico é não substituído ou substituído uma vez, duas vezes ou três vezes com halo, carbóxi, OH, OCF3, OCHF2 ou C≡N.

[0053] Uma modalidade da invenção é um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a invenção, para uso na prevenção ou no tratamento de uma infecção por HBV no indivíduo.

[0054] Uma modalidade da invenção é uma composição farmacêutica que compreende um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção, juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0055] Uma modalidade da invenção é um método de tratamento de uma infecção por HBV em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção.

[0056] Em algumas modalidades, a dose de um composto da invenção é de cerca de 1 mg a cerca de 2.500 mg. Em algumas modalidades, uma dose de um composto da invenção usado em composições descritas no presente documento é menos que cerca de 10.000 mg, ou menos que cerca de 8.000 mg, ou menos que cerca de 6.000 mg, ou menos que cerca de 5.000 mg, ou menos que cerca de 3.000 mg, ou menos que cerca de 2.000 mg, ou menos que cerca de 1.000 mg, ou menos que cerca de 500 mg, ou menos que cerca de 200 mg, ou menos que cerca de 50 mg. Similarmente, em algumas modalidades, uma dose de um segundo composto (isto é, outro fármaco para tratamento de HBV) como descrito no presente documento é menos que cerca de 1.000 mg, ou menos que cerca de 800 mg, ou menos que cerca de 600 mg, ou menos que cerca de 500 mg, ou menos que cerca de 400 mg, ou menos que cerca de 300 mg, ou menos que cerca de 200 mg, ou menos que cerca de 100 mg, ou menos que cerca de 50 mg, ou menos que cerca de 40 mg, ou menos que cerca de 30 mg, ou menos que cerca de 25 mg, ou menos que cerca de 20 mg, ou menos que cerca de 15 mg, ou menos que cerca de 10 mg, ou menos que cerca de 5 mg, ou menos que cerca de 2 mg,

ou menos que cerca de 1 mg, ou menos que cerca de 0,5 mg, e quaisquer e todos os incrementos integrais ou parciais da mesma. Todas as doses mencionadas anteriormente se referem a doses diárias por paciente.

[0057] Em geral, contempla-se que uma quantidade diária eficaz antiviral seria de cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg ou cerca de 0,01 a cerca de 30 mg/kg de peso corporal. Pode ser apropriado administrar a dose requerida como duas, três, quatro ou mais subdoses em intervalos apropriados ao longo do dia. As ditas subdoses podem ser formuladas como formas de dosagem unitárias, por exemplo, contendo cerca de 1 a cerca de 500 mg, ou cerca de 1 a cerca de 300 mg ou cerca de 1 a cerca de 100 mg, ou cerca de 2 a cerca de 50 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária.

[0058] Os compostos da invenção podem, dependendo de sua estrutura, existem como sais, solvatos ou hidratos. Portanto, a invenção também abrange os sais, solvatos ou hidratos e respectivas misturas dos mesmos.

[0059] Os compostos da invenção podem, dependendo de sua estrutura, existir em formas tautoméricas ou estereoisoméricas (enantiômeros, diastereômeros). Portanto, a invenção também abrange os tautômeros, enantiômeros ou diastereômeros e respectivas misturas dos mesmos. Os constituintes estereisomericamente uniformes podem ser isolados de uma maneira conhecida a partir dessas misturas de enantiômeros e/ou diastereômeros. Definições

[0060] São listadas abaixo definições de vários termos usados para descrever esta invenção. Essas definições se aplicam aos termos conforme são usados ao longo deste relatório descritivo e reivindicações salvo se limitado de outro modo em casos específicos individualmente ou como parte de um grupo maior.

[0061] Salvo se definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm, de modo geral, o mesmo significado como comumente entendido por aqueles elementos de habilidade comum na técnica ao qual esta invenção pertence. De modo geral, a nomenclatura usada no presente documento e os procedimentos laboratoriais em cultura celular, genética molecular, química orgânica e química peptídeo são aqueles conhecidos e empregados na técnica.

[0062] Como usado no presente documento, os artigos “um” e “uma” se referem a um ou a mais que um (isto é, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por meio de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais que um elemento. Adicionalmente, o uso do termo “que inclui”, bem como outras formas, como “incluir”, “inclui” e “incluído”, não é limitante.

[0063] Como usado no presente documento, o termo “modulador de montagem de capsídeo” se refere a um composto que interrompe ou acelera ou inibe ou prejudica ou atrasa ou reduz ou modifica a montagem de capsídeo normal (por exemplo, durante a maturação) ou desmontagem de capsídeo normal (por exemplo, durante a infectividade) ou perturba a estabilidade de capsídeo, induzindo, por meio disso, morfologia de capsídeo anormal ou função de capsídeo anormal. Em uma modalidade, um modulador de montagem de capsídeo acelera a montagem ou a desmontagem de capsídeo induzindo, por meio disso, a morfologia de capsídeo anormal. Em outra modalidade,

um modulador de montagem de capsídeo interage (por exemplo, se liga em um sítio ativo, se liga em um sítio alostérico ou modifica e/ou prejudica o enovelamento e similares), com a proteína de montagem de capsídeo principal (HBV-CP), interrompendo, por meio disso, a montagem ou desmontagem de capsídeo. Ainda em outra modalidade, um modulador de conjunto de capsídeo provoca uma perturbação na estrutura ou função de HBV-CP (por exemplo, a capacidade de HBV-CP em montar, desmontar, se ligar a um substrato, enovelar em uma conformação adequada ou similares que atenua a infectividade viral e/ou é letal para o vírus).

[0064] Como usado no presente documento, o termo "tratamento” ou "tratando” é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico, isto é, um composto da invenção (em separado ou em combinação com outro agente farmacêutico) a um paciente, ou aplicação ou administração de um agente terapêutico a um tecido ou linhagem celular isolado de um paciente (por exemplo, para diagnóstico ou aplicações ex vivo) que tem uma infecção por HBV, um sintoma de infecção por HBV, ou o potencial de desenvolver uma infecção por HBV com o propósito de curar, sanar, aliviar, amenizar, alterar, remediar, melhorar, recuperar ou afetar a infecção por HBV, os sintomas de infecção por HBV ou o potencial de desenvolver uma infecção por HBV. Tais tratamentos podem ser especificamente personalizados ou modificados com base no conhecimento obtido a partir do campo da farmacogenômica.

[0065] Como usado no presente documento, o termo “prevenir” ou “prevenção” significa nenhum desenvolvimento de transtorno ou doença se nenhum tiver ocorrido ou nenhum desenvolvimento de transtorno ou doença adicional se já tiver havido desenvolvimento do transtorno ou doença. Também é considerada a capacidade de prevenir alguns ou todos os sintomas associados ao transtorno ou doença.

[0066] Como usado no presente documento, o termo "paciente", “indivíduo” ou "sujeito” se refere a um mamífero não humano ou não humano. Mamíferos não humanos incluem, por exemplo, gado e animais de estimação como mamíferos ovinos, bovinos, suínos, felinos e murinos. Preferencialmente, o paciente, sujeito ou indivíduo é um ser humano.

[0067] Como usado no presente documento, os termos "quantidade eficaz”, "quantidade farmaceuticamente eficaz” e "quantidade terapeuticamente eficaz” se referem a uma quantidade suficiente, mas não tóxica de um agente para fornecer o resultado biológico desejado. Esse resultado pode ser redução e/ou alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Uma quantidade terapêutica apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada por um técnico no assunto usando experimentação de rotina.

[0068] Como usado no presente documento, o termo “farmaceuticamente aceitável” se refere a um material como um carreador ou diluente que não anula a atividade ou propriedades biológicas do composto e é relativamente não tóxico, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma maneira prejudicial com qualquer um dos componentes da composição em que o mesmo está contido.

[0069] Como usado no presente documento, o termo "sal farmaceuticamente aceitável” se refere a derivados dos compostos revelados em que o composto original é modificado ao converter uma fração ácida ou básica existente em sua forma de sal. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, sais de ácido mineral ou orgânico de resíduos básicos, como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos, como ácidos carboxílicos; e similares. Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção incluem os sais não tóxicos convencionais do composto parental formados, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto parental que contém uma fração básica ou ácida por métodos químicos convencionais. De modo geral, tais sais podem ser preparados reagindo-se o ácido livre ou as formas de base desses compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou do ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico ou em uma mistura dos dois; meios geralmente não aquosos como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrila são preferenciais. Listas de sais adequados são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences 17ª ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985 p. 1418 e em Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977), cada um dos quais é incorporado em sua totalidade a título de referência no presente documento.

[0070] Como usado no presente documento, o termo “composição” ou “composição farmacêutica” se refere a uma mistura de pelo menos um composto útil na invenção com um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica facilita a administração do composto a um paciente ou indivíduo. Múltiplas técnicas de administrar um composto existem na técnica, incluindo, mas sem limitação a, administração intravenosa, oral, aerossol, retal, parenteral, oftálmica, pulmonar e tópica.

[0071] Como usado no presente documento, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” significa um material, composição ou carreador farmaceuticamente aceitável como uma carga líquida ou sólida, estabilizador, agente dispersante, agente de suspensão, diluente, excipiente, agente espessante, solvente ou material de encapsulamento envolvido no carregamento ou transporte de um composto útil na invenção em ou para o paciente de modo que possa realizar sua função destinada. Tipicamente, tais construtos são carregados ou transportados a partir de órgão, ou porção do corpo, para outro órgão ou porção do corpo. Cada carreador precisa ser “aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação incluindo o uso de composto na invenção e não ser prejudicial ao paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: açúcares, como lactose, glicose e sacarose; amidos, como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte, gelatina, talco; excipientes, como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos, como óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, como propileno glicol; polióis, como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ésteres, como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes de tamponamento, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; agentes tensoativos; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções de tampão de fosfato e outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.

[0072] Como usado no presente documento, "carreador farmaceuticamente aceitável” também inclui todos e quaisquer revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos e agentes de retardamento de absorção e similares que são compatíveis com a atividade do composto útil na invenção e são fisiologicamente aceitáveis para o paciente. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. O "carreador farmaceuticamente aceitável” pode incluir adicionalmente um sal farmaceuticamente aceitável do composto útil na invenção. Outros ingredientes adicionais que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas usadas na prática da invenção são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985) que é incorporado a título de referência no presente documento.

[0073] Como usado no presente documento, o termo "substituído” significa que um átomo ou grupo de átomos substituiu hidrogênio como o substituinte ligado a outro grupo.

[0074] Como usado no presente documento, o termo "que compreende” também abrange a opção “que consiste em".

[0075] Como usado no presente documento, o termo "alquila" por si só ou como parte de outro substituinte significa, salvo se apresentado de outro modo, um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificado que tem o número de átomos de carbono designado (isto é, C1-C6-alquila significa um a seis átomos de carbono) e inclui cadeias lineares e ramificadas. Exemplos incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila, neopentila e hexila. Além disso, o termo “alquila” por si só ou como parte de outro substituinte também pode significar um C1-C3 hidrocarboneto de cadeia linear substituída com um C3-C5-anel carbocílico. Exemplos incluem (ciclopropil)metila, (ciclobutil)metila e (ciclopentil)metila. Para evitar dúvidas, onde duas frações de alquila estão presentes em um grupo, as frações podem ser iguais ou diferentes.

[0076] Como usado no presente documento, o termo "alquenila" denota um grupo monovalente derivado de uma fração de hidrocarboneto contendo pelo menos dois átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla de carbono-carbono de estereoquímica E ou Z. A ligação dupla pode ser ou não o ponto de ligação a outro grupo. Os grupos alquenilas (por exemplo, C2-C8-alquenila) incluem, mas não se limitam a, por exemplo, etenila, propenila, prop-1-en-2-ila, butenila, metil-2-buten-1-ila, heptenila e octenila. Para evitar dúvidas, onde duas frações de alquenila estão presentes em um grupo, as frações de alquila podem ser iguais ou diferentes.

[0077] Como usado no presente documento, um grupo ou fração de C2-C6-alquinila é um grupo ou fração de alquinila linear ou ramificado contendo de 2 a 6 átomos de carbono, por exemplo, um grupo ou fração de C2-C4 alquinila contendo de 2 a 4 átomos de carbono. Grupos alquinila exemplificativos incluem-C≡CH ou -CH2-C≡C, bem como 1- e 2-butinila, 2-

pentinila, 3-pentinila, 4-pentinila, 2-hexinila, 3-hexinila, 4- hexinila e 5-hexinila. Para evitar dúvidas, onde duas frações de alquinila estão presentes em um grupo, as mesmas podem ser iguais ou diferentes.

[0078] Como usado no presente documento, o termo "halo” ou "halogênio” em separado ou como parte de outro substituinte significa, salvo se apresentado de outro modo, um átomo flúor, cloro, bromo ou iodo, preferencialmente, flúor, cloro ou bromo, mais preferencialmente, flúor ou cloro. Para evitar dúvidas, onde duas frações de halo estão presentes em um grupo, as mesmas podem ser iguais ou diferentes.

[0079] Como usado no presente documento, um grupo C1-C6- alcóxi ou grupo C2-C6-alquenilóxi é tipicamente um dito grupo C1-C6-alquila (por exemplo, uma C1-C4 alquila) ou um dito grupo C2-C6-alquenila (por exemplo, uma C2-C4 alquenila) respectivamente que é ligado a um átomo de oxigênio.

[0080] Como usado no presente documento, o termo "arila" empregado em separado ou em combinação com outros termos significa, salvo se apresentado de outro modo, um sistema aromático carbocíclico contendo um ou mais anéis (tipicamente um, dois ou três anéis) em que tais anéis podem ser ligados juntamente de uma maneira pendente como uma bifenila, ou pode ser fusionado, como naftaleno. Exemplos de grupos arila incluem fenila, antracila e naftila. Exemplos preferenciais são fenila (por exemplo, C6-arila) e bifenila (por exemplo, C12-arila). Em algumas modalidades, os grupos arila têm de seis a dezesseis átomos de carbono. Em algumas modalidades, os grupos arila têm de seis a doze átomos de carbono (por exemplo, C6-C12-arila). Em algumas modalidades,

os grupos arila têm seis átomos de carbono (por exemplo, C6- arila).

[0081] Como usado no presente documento, os termos "heteroarila" e "heteroaromático” se referem a um heterociclo que tem caráter aromático contendo um ou mais anéis (tipicamente um, dois ou três anéis). Os substituintes heteroarila podem ser definidos pelo número de átomos de carbono, por exemplo, C1-C9-heteroarila indica o número de átomos de carbono contido no grupo heteroarila sem incluir o número de heteroátomos. Por exemplo, uma C1-C9-heteroarila incluirá um a quatro heteroátomos adicionais. Uma heteroarila policíclica pode incluir um ou mais anéis que são parcialmente saturados. Exemplos não limitantes de heteroarilas incluem:

[0082] Exemplos não limitantes de grupos heteroarila grupos incluem piridila, pirazinila, pirimidinila (incluindo, por exemplo, 2- e 4-pirimidinila), piridazina tienila, furila, pirrolila (incluindo, por exemplo, 2- pirrolila), imidazolila, tiazolila, oxazolila, pirazolila (incluindo, por exemplo, 3- e 5-pirazolila), isotiazolila, 1,2,3-triazolila, 1,2,4-triazolila, 1,3,4-triazolila,

tetrazolila, 1,2,3-tiadiazolila, 1,2,3-oxadiazolila, 1,3,4- tiadiazolila e 1,3,4-oxadiazolila. Exemplos não limitantes de heterociclos policíclicos e heteroarilas incluem indolila (incluindo 3-, 4-, 5-, 6- e 7-indolila), indolinila, quinolila, tetra-hidroquinolila, isoquinolila (incluindo, por exemplo, 1- e 5-isoquinolila), 1,2,3,4- tetra- hidroisoquinolila, cinolinila, quinoxalinila (incluindo, por exemplo, 2- e 5-quinoxalinila), quinazolinila, ftalazinila, 1,8-naftiridinila, 1,4-benzodioxanila, cumarina, di- hidrocumarina, 1,5-naftiridinila, benzofurila (incluindo, por exemplo, 3-, 4-, 5-, 6- e 7- benzofurila), 2,3 -di- hidrobenzofurila, 1,2-benzisoxazolila, benzotienila (incluindo, por exemplo, 3-, 4-, 5-, 6- e 7-benzotienila), benzoxazolila, benzotiazolila (incluindo, por exemplo, 2- benzotiazolila e 5- benzotiazolila), purinila, benzimidazolila (incluindo, por exemplo, 2-benzimidazolila), benzotriazolila, tioxantinila, carbazolila, carbolinila, acridinila, pirrolizidinila e quinolizidinila.

[0083] Como usado no presente documento, o termo "haloalquila” é tipicamente um dito grupo alquila, alquenila, alcóxi ou alquenóxi, respectivamente, em que quaisquer um ou mais dos átomos de carbono são substituídos com um ou mais ditos átomos de halo conforme definido abaixo. A haloalquila abrange radicais mono-haloalquila, di- haloalquila e poli-haloalquila. O termo "haloalquila” inclui, mas não se limita a fluorometila, 1-fluoroetila, difluorometila, 2,2-difluoroetila, 2,2,2-trifluoroetila, trifluorometila, clorometila, diclorometila, triclorometila, pentafluoroetila, difluorometóxi e trifluorometóxi.

[0084] Como usado no presente documento, um grupo C1-C6- hidroxialquila é um dito grupo C1-C6 alquila substituído por um ou mais grupos hidróxi. Tipicamente, o mesmo é substituído por um, dois ou três grupos hidroxila. Preferencialmente, o mesmo é substituído por um único grupo hidróxi.

[0085] Como usado no presente documento, um grupo C1-C6- aminoalquila é um dito grupo C1-C6 alquila substituído por um ou mais grupos amino. Tipicamente, o mesmo é substituído por um, dois ou três grupos amino. Preferencialmente, o mesmo é substituído por um único grupo amino.

[0086] Como usado no presente documento, um grupo C1-C4- carboxialquila é um dito grupo C1-C4 alquila substituído por grupo carboxila.

[0087] Como usado no presente documento, um grupo C1-C4- carboxamidoalquila é um dito grupo C1-C4 alquila substituído por um grupo carboxamida substituído ou não substituído.

[0088] Como usado no presente documento, um grupo C1-C4- acilsulfonamido-alquila é um dito grupo C1-C4 alquila substituído por um grupo acilsulfonamida de fórmula geral C(=O)NHSO2CH3 ou C(=O)NHSO2-c-Pr.

[0089] Como usado no presente documento, o termo "cicloalquila" se refere a um grupo não aromático monocíclico ou policíclico em que cada um dos átomos que forma o anel (isto é, átomos estruturais) é um átomo de carbono. Em uma modalidade, o grupo cicloalquila é saturado ou parcialmente insaturado. Em outra modalidade, o grupo cicloalquila é fusionado com um anel aromático. Os grupos cicloalquila incluem grupos que têm 3 a 10 átomos no anel (C3-C10- cicloalquila), grupos que têm 3 a 8 átomos no anel (C3-C8- cicloalquila), grupos que têm 3 a 7 átomos no anel (C3-C7-

cicloalquila) e grupos que têm 3 a 6 átomos no anel (C3-C6- cicloalquila). Exemplos ilustrativos de grupos cicloalquila incluem, mas não se limitam às seguintes frações:

[0090] As cicloalquilas monocíclicas incluem, mas não se limitam a ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo- hexila, ciclo-heptila e ciclo-octila. As cicloalquilas dicíclicas incluem, mas não se limitam a tetra-hidronaftila, indanila e tetra-hidropentaleno. As cicloalquilas policíclicas incluem adamantina e norbomano. O termo cicloalquila inclui tanto grupos "carbociclila não aromática insaturada” quanto "carbociclila insaturada não aromática" que se referem a um carbociclo não aromático como definido no presente documento que contém pelo menos uma ligação dupla de carbono-carbono ou uma ligação tripla de carbono-carbono.

[0091] Como usado no presente documento, o termo “espirocíclico” se refere a qualquer composto contendo dois ou mais anéis em que dois dos anéis têm um carbono de anel em comum.

[0092] Como usado no presente documento, os termos "heterocicloalquila" e "heterociclila” se referem a um grupo heteroalicíclico contendo um ou mais anéis (tipicamente um, dois ou três anéis) que contêm um a quatro heteroátomos de anel, cada um selecionado a partir de oxigênio, enxofre e nitrogênio.

Em uma modalidade, cada grupo heterociclila tem de 3 a 10 átomos em seu sistema de anel com a condição de que o anel do dito grupo não contenha dois átomos de oxigênio ou enxofre adjacentes.

Em uma modalidade, cada grupo heterociclila tem um sistema de anel bicíclico fusionado com 3 a 10 átomos no sistema de anel, novamente com a condição de que o anel do dito grupo não contenha dois átomos de oxigênio ou enxofre adjacentes.

Em uma modalidade, cada grupo heterociclila tem um sistema de anel bicíclico em ponte com 3 a 10 átomos no sistema de anel, novamente com a condição de que o anel do dito grupo não contenha dois átomos de oxigênio ou enxofre adjacentes.

Em uma modalidade, cada grupo heterociclila tem um sistema de anel espiro-bicíclico com 3 a 10 átomos no sistema de anel, novamente com a condição de que o anel do dito grupo não contenha dois átomos de oxigênio ou enxofre adjacentes.

Os substituintes de heterociclila podem ser definidos alternativamente pelo número de átomos de carbono, por exemplo, C2-C8-heterociclila indica o número de átomos de carbono contidos no grupo heterocíclico sem incluir o número de heteroátomos.

Por exemplo, uma C2-C8- heterociclila incluirá um a quatro heteroátomos adicionais.

Em outra modalidade, o grupo heterocicloalquila é fusionado com um anel aromático.

Em outra modalidade, o grupo heterocicloalquila é fusionado com um anel de heteroarila.

Em uma modalidade, os heteroátomos de nitrogênio e enxofre podem ser oxidados opcionalmente e o átomo de nitrogênio pode ser quaternizado opcionalmente.

O sistema heterocíclico pode estar ligado, salvo se apresentado de outro modo, em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que produz uma estrutura estável.

Um exemplo de um grupo heterociclila de

3 membros inclui e não se limita à aziridina. Exemplos de grupos heterocicloalquila de 4 membros incluem, e não se limitam à azetidina e a uma beta-lactama. Exemplos de grupos heterociclila de 5 membros incluem, e não se limitam à pirrolidina, oxazolidina e tiazolidinadiona. Exemplos de grupos heterocicloalquila de 6 membros incluem, e não se limitam a, piperidina, morfolina, piperazina, N- acetilpiperazina e N-acetilmorfolina. Outros exemplos não limitantes de grupos heterociclila são

[0093] Exemplos de heterociclos incluem grupos monocíclicos, como aziridina, oxirano, ti-irano, azetidina, oxetano, tietano, pirrolidina, pirrolina, pirazolidina, imidazolina, dioxolano, sulfolano, 2,3-di-hidrofurano, 2,5- di-hidrofurano, tetra-hidrofurano, tiofano, piperidina, 1,2,3,6- tetra-hidropiridina, 1,4-di-hidropiridina, piperazina, morfolina, tiomorfolina, pirano, 2,3- di- hidropirano, tetra-hidropirano, 1,4-dioxano, 1,3-dioxano, 1,3-dioxolano, homopiperazina, homopiperidina, 1,3- dioxepano, 47-di-hidro-1,3-dioxepin e óxido de hexametileno.

O termo “C3-C7-heterocicloalquila” inclui, mas não se limita à tetra-hidrofuran-2-ila, tetra-hidrofuran-3-ila, 3- oxabiciclo[3.1.0]hexan-6-ila, 3-azabiciclo[3.1.0]hexan-6- ila, tetra-hidropiran-4-ila, tetra-hidropiran-3-ila, tetra- hidropiran-2-ila e azetidin-3-ila.

[0094] Como usado no presente documento, o termo "aromático” se refere a um carbociclo ou heterociclo com um ou mais anéis poli-insaturados e que tem caráter aromático, isto é, tem (4n + 2) elétrons π(pi) deslocalizados em que n é um número inteiro.

[0095] Como usado no presente documento, o termo “acila” empregado em separado ou em combinação com outros termos significa, salvo se apresentado de outro modo, um grupo alquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila ou heteroarila ligado a um grupo carbonila.

[0096] Como usado no presente documento, os termos “carbamoíla” e “carbamoíla substituída” empregados em separado ou em combinação com outros termos significam, salvo se apresentado de outro modo, um grupo carbonila ligado a um grupo amino opcionalmente mono ou dissubstituído por hidrogênio, alquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila ou heteroarila. Em algumas modalidades, os substituintes de nitrogênio serão conectados para formar um anel de heterociclila como definido acima.

[0097] Como usado no presente documento, o termo "carbóxi" por si só ou como parte de outro substituinte significa, salvo se apresentado de outro modo, um grupo de fórmula C(=O)OH.

[0098] Como usado no presente documento, o termo “éster carboxílico” por si só ou como parte de outro substituinte significa, salvo se apresentado de outro modo, um grupo de fórmula C(=O)OX, em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C6-alquila, C3-C7-cicloalquila e arila.

[0099] Como usado no presente documento, o termo “pró- fármaco” representa um derivado de um composto da Fórmula I ou Fórmula II que é administrado em uma forma que, uma vez administrada, é metabolizada in vivo em um metabólito ativo também da Fórmula I ou Fórmula II.

[0100] Várias formas de pró-fármaco são conhecidas na técnica. A título de exemplos de tais pró-fármacos, consulte: Design of Prodrugs, editado por H. Bundgaard, (Elsevier, 1985) e Methods in Enzymology, Volume 42, p. 309-396, editado por K. Widder, et al. (Academic Press, 1985); A Textbook of Drug Design and Development, editado por Krogsgaard-Larsen e H. Bundgaard, Capítulo 5 “Design and Application of Prodrugs” de H. Bundgaard p. 113-193 (1991); H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews 8, 1-38 (1992); H. Bundgaard, et al, Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988); e N. Kakeya, et al., Chem. Pharm. Bull., 32, 692 (1984).

[0101] Exemplos de pró-fármacos inclui ésteres cliváveis dos compostos da Fórmula I ou Fórmula II. Um éster clivável in vivo de um composto da invenção contendo um grupo carbóxi é, por exemplo, um éster farmaceuticamente aceitável que é clivado no corpo humano ou animal para produzir o ácido original. Ésteres farmaceuticamente aceitáveis adequados para carbóxi incluem éster C1-C6 alquílico, por exemplo, ésteres metílicos ou etílicos; ésteres C1-C6 alcoximetílicos, por exemplo, éster metoximetílico; ésteres C1-C6 aciloximetílicos; ésteres ftalidílicos; ésteres C3-C8 cicloalcoxicarbonilóxi C1-C6 alquílicos, por exemplo, 1-

ciclo-hexilcarboniloxietila; ésteres 1-3- dioxolan-2- ilmetílicos, por exemplo, 5-metil-1,3-dioxolan-2-ilmetila; ésteres C1-C6 alcoxicarboniloxietílicos, por exemplo, 1- metoxicarboniloxietila; ésteres aminocarbonilmetílicos e versões mono-ou di-N-(C1-C6 alquila) dos mesmos, por exemplo, ésteres N,N-dimetilaminocarbonílicos e ésteres N- etilaminocarbonilmetílicos; e podem ser formados em qualquer grupo carbóxi nos compostos da invenção.

[0102] Um éster clivável in vivo de um composto da invenção contendo um grupo hidróxi é, por exemplo, um éster farmaceuticamente aceitável que é clivado no corpo humano ou animal para produzir o grupo hidróxi original. Ésteres farmaceuticamente aceitáveis adequados para hidróxi incluem ésteres C1-C6-acílicos, por exemplo, ésteres acetílicos; e ésteres de benzoíla em que o grupo fenila pode ser substituído com aminometila ou mono-ou di-C1-C6 alquil aminometila substituído com N, por exemplo, ésteres de 4- aminometilbenzoíla e ésteres de 4-N,N- dimetilaminometilbenzoíla.

[0103] Os pró-fármacos preferenciais da invenção incluem acetilóxi e derivados de carbonato. Por exemplo, um grupo hidróxi de um composto da Fórmula I ou Fórmula II pode estar presente em um pró-fármaco como -O-CORi ou -O-C(O)ORi em que Ri é C1-C4 alquila não substituída ou substituída. Os substituintes nos grupos alquila são conforme definidos anteriormente. Preferencialmente, os grupos alquila em Ri são não substituídos, preferencialmente, metila, etila, isopropila ou ciclopropila.

[0104] Outros pró-fármacos preferenciais da invenção incluem derivados de aminoácido. Aminoácidos adequados incluem α-aminoácidos ligados a compostos da Fórmula I ou Fórmula II através de seu grupo C(O)OH. Tais pró-fármacos clivam in vivo para produzir compostos da Fórmula I ou Fórmula II que portam um grupo hidróxi. Consequentemente, tais grupos de aminoácido são posições preferencialmente empregadas da Fórmula I ou Fórmula II em que um grupo hidróxi é eventualmente exigido. Pró-fármacos exemplificativos desta modalidade da invenção são, portanto, compostos da Fórmula I ou Fórmula II que portam um grupo da Fórmula -OC(O)- CH(NH2)Rii em que Rii é uma cadeia lateral de aminoácido. Aminoácidos preferenciais incluem glicina, alanina, valina e serina. O aminoácido também pode ser funcionalizado, por exemplo, o grupo amino pode ser alquilado. Um aminoácido funcionalizado adequado é N,N-dimetilglicina. Preferencialmente, o aminoácido é valina.

[0105] Outros pró-fármacos preferenciais da invenção incluem derivados de fosforamidato. Várias formas de pró- fármacos de fosforamidato são conhecidas na técnica. A título de exemplo de tais pró-fármacos, consulte Serpi et al., Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2013, Capítulo 15, Unidade 15.5 e Mehellou et al., ChemMedChem, 2009, 4 pp. 1779-1791. Fosforamidatos adequados incluem (fenoxi)-α-aminoácidos ligados a compostos da Fórmula I ou Fórmula II através de seu grupo-OH. Tais pró-fármacos clivam in vivo para produzir compostos da Fórmula I ou Fórmula II que portam um grupo hidróxi. Consequentemente, tais grupos fosforamidato são posições preferencialmente empregadas da Fórmula I ou Fórmula II em que um grupo hidróxi é eventualmente exigido. Pró-fármacos exemplificativos desta modalidade da invenção são, portanto, compostos da Fórmula I ou Fórmula II que portam um grupo da Fórmula -OP(O)(ORiii)Riv em que Riii é alquila, cicloalquila, arila ou heteroarila, e Riv é um grupo da Fórmula -NH-CH(Rv)C(O)ORvi, em que Rv é uma cadeia lateral de aminoácido e Rvi é alquila, cicloalquila, arila ou heterociclila. Aminoácidos preferenciais incluem glicina, alanina, valina e serina. Preferencialmente, o aminoácido é alanina. Rv é, preferencialmente, alquila, com máxima preferência, isopropila.

[0106] A matéria da presente invenção também é um método de preparação dos compostos da presente invenção. A matéria da invenção é, assim, um método para a preparação de um composto da Fórmula I de acordo com a presente invenção ao reagir um composto da Fórmula III em que R1 é como definido acima, com um composto da Fórmula

IV em que R2, Ra e Rb são conforme definidos acima. Exemplos

[0107] A invenção é agora descrita em referência aos seguintes Exemplos. Esses Exemplos são fornecidos apenas com o propósito de ilustração, e a invenção não é limitada a esses Exemplos, mas, de preferência, abrange todas as variações que são evidentes como um resultado dos ensinamentos fornecidos no presente documento.

[0108] Os moduladores de proteína de núcleo de HBY podem ser preparados de diversas formas. Os Esquemas 1 e 2 ilustram as principais vias empregadas para o propósito deste pedido. Para o químico versado na técnica, estará evidente que há outras metodologias que alcançarão a preparação desses intermediários e Exemplos.

Esquema 1: Síntese dos compostos da Fórmula I

[0109] O composto 1 descrito no Esquema 1 é acoplado na etapa 1 a uma amina com métodos conhecidos na literatura (A. El-Faham, F. Albericio, Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602), por exemplo, com KATU para gerar um composto com a estrutura geral 2. O grupo de proteção de nitrogênio de composto 2 no Esquema 1 está desprotegido na etapa 2 (documento WO2018/011162, A. Isidro-Llobet et al., Chem. Rev., 2009, 109, 2455-2504), estabelecido como, mas sem limitação a Boc, por exemplo, com HCl para gerar uma amina de estrutura geral

3. A formação de ureia na etapa 3 com métodos bem conhecidos na literatura (Pearson, A. J.; Roush, W. R.; Handbook of Reagents for Organic Syntheses, Activating Agents and Protecting Groups), por exemplo, com fenilisocianato resulta nos compostos da Fórmula I.

Esquema 2: Síntese dos compostos da Fórmula I

[0110] O Composto 1 descrito no Esquema 2 está na etapa 1 transformado na ureia da estrutura geral 2 com métodos bem conhecidos na literatura (Pearson, A. J.; Roush, W. R.; Handbook of Reagents for Organic Synthesis, Activating Agents and Protecting Groups), por exemplo, com fenilisocianato. O grupo éster do composto 2 está na etapa 2 hidrolisado com o uso de métodos conhecidos na literatura, por exemplo, com LiOH (documento WO2015/0133428) para gerar um ácido carboxílico da estrutura geral 3. Um acoplamento de amida na etapa 3 com métodos conhecidos na literatura (A. El-Faham, F. Albericio, Chem, Rev. 2011, 111, 6557-6602), por exemplo, com HATU resulta nos compostos da Fórmula I.

[0111] Os seguintes exemplos ilustram a preparação e as propriedades de alguns compostos específicos da invenção.

[0112] As seguintes abreviaturas são usadas: A - adenina de nucleobase de DNA ACN - acetonitrila Ar - argônio BODIPY-FL - ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora- 3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiônico (corante fluorescente)

Boc - terc-butoxicarbonila BnOH - álcool benzílico n-BuLi - n-butil lítio t-BuLi - t-butil lítio C - citosina de nucleobase de DNA CC50 - metade da concentração citotóxica máxima CO2 - dióxido de carbono CuCN - cianeto de cobre (I) DCE - dicloroetano DCM - diclorometano Periodinano de Dess-Martin - 1,1,1-triacetoxi-1,1-di- hidro-1,2-benziodoxol-3(1H)-ona DIPEA - di-isopropiletilamina DIPE - éter di-isopropílico DMAP - 4-dimetilaminopiridina DMF - N,N-dimetilformamida DMP - Periodinano de Dess-Martin DMSO - sulfóxido de dimetila DNA - ácido desoxirribonucleico DPPA - difenilfosforilazida DTT - ditiotreitol EC50 - metade da concentração eficaz máxima EDCI - cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodi-imida Et2O - éter dietílico EtOAc - acetato de etila EtOH - etanol FL-- extremidade cinco prime apresentada com fluoresceína NEt3 - trietilamina

ELS - Espalhamento de Luz Evaporativa g - grama (ou gramas) G - guanina de nucleobase de DNA HBV - vírus de hepatite B HATU - hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazol-1- il)-1,1,3,3-tetrametil urônio HCl- ácido clorídrico HEPES - ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinaetanossulfônico HOAt - 1-hidroxi-7-azabenzotriazol HOBt - 1-hidroxibenzotriazol HPLC - cromatografia líquida de alta eficiência IC50 - metade da concentração inibitória máxima LC640- - modificação de extremidade 3 prime com corante fluorescente LightCycler® Red 640 LC/MS - cromatografia líquida/espectrometria de massa LiAlH4 - hidreto de alumínio e lítio LiOH - hidróxido de lítio MeOH - metanol MeCN - acetonitrila MgSO4 - sulfato de magnésio mg - miligrama (ou miligramas) min - minutos mol - mol mmol - milimol ml - mililitro (ou mililitros) MTBE – metil terc-butil éter N2 - nitrogênio Na2CO3 - carbonato de sódio NaHCO3 - hidrogenocarbonato de sódio

Na2SO4 - sulfato de sódio NdeI - enzima de restrição reconhece sítios CA^TATG NEt3 - trietilamina NaH - hidreto de sódio NaOH - hidróxido de sódio NH3 - amônia NH4Cl - cloreto de amônio RMN - ressonância magnética nuclear PAGE - eletroforese em gel de poliacrilamida PCR - reação em cadeia de polimerase qPCR - PCR quantitativo Pd/C - paládio em carbono -PH - modificação de fosfato de extremidade 3 prime pTSA - ácido 4-tolueno-sulfônico Rt - tempo de retenção t.a. - temperatura ambiente sat. - solução aquosa saturada SDS - sulfato de sódio dodecila SI - índice de seletividade (= CC50/ EC50) STAB – triacetoxiboro-hidreto de sódio T - timina de nucleobase de DNA TBAF - fluoreto de tetrabutilamônio TFA - ácido trifluoroacético THF - tetra-hidrofurano TLC - cromatografia de camada fina Tris - tris(hidroximetil)-aminometano XhoI - enzima de restrição reconhece sítios C^TCGAG Identificação de composto - RMN

[0113] Para diversos compostos, espectros de RMN foram gravados usando um espectrômetro Bruker DPX400 equipado com uma cabeça de sonda de ressonância tripla inversa de 5 mm que opera a 400 MHz para próton e 100 MHz para carbono. Os solventes deuterados foram clorofórmio-d (clorofórmio deuterado, CDCl3) ou d6-DMSO (DMSO deuterado, d6- dimetilssulfóxido). Os deslocamentos químicos são relatados em partes por milhão (ppm) em relação a tetrametilssilano (TMS) que foi usado como padrão interno. Identificação de composto - HPLC/MS

[0114] Para diversos compostos, espectros de LC-MS foram gravados usando os seguintes métodos analíticos. Método A

[0115] Coluna - Waters Xselect CSH C18 de fase Reversa (50 x 2,1 mm, 3,5 mícrons) Fluxo - 0,8 ml/min, 25 graus Celsius Eluente A – 95 % de acetonitrila + 5 % de carbonato de amônio a 10 mM em água (pH 9) Eluente B – carbonato de amônio a 10 mM em água (pH 9) Gradiente linear t=0 min 5 % de A, t=3,5 min 98 % de A. t=6 min 98 % de A Método A2

[0116] Coluna - Waters Xselect CSH C18 de fase Reversa (50 x 2,1 mm, 3,5 mícrons) Fluxo - 0,8 ml/min, 25 graus Celsius Eluente A – 95 % de acetonitrila + 5 % de carbonato de amônio a 10 mM em água (pH 9) Eluente B – carbonato de amônio a 10 mM em água (pH 9) Gradiente linear t=0 min 5 % de A, t=4,5 min 98 % de A. t=6 min 98 % de A Método B

[0117] Coluna - Waters Xselect CSH C18 de fase Reversa

(50 x 2,1 mm, 3,5 mícrons) Fluxo - 0,8 ml/min, 35 graus Celsius Eluente A – 0,1 % de ácido fórmico em acetonitrila Eluente B – 0,1 % de ácido fórmico em água Gradiente linear t=0 min 5 % de A, t=3,5 min 98 % de A. t=6 min 98 % de A Método B2

[0118] Coluna - Waters Xselect CSH C18 de fase Reversa (50 x 2,1 mm, 3,5 mícrons) Fluxo - 0,8 ml/min, 40 graus Celsius Eluente A – 0,1 % de ácido fórmico em acetonitrila Eluente B – 0,1 % de ácido fórmico em água Gradiente linear t=0 min 5 % de A, t=4,5 min 98 % de A. t=6 min 98 % de A Método C

[0119] Coluna - Waters Xselect CSH C18 de fase Reversa (50 x 2,1 mm, 3,5 mícrons) Fluxo - 1 ml/min, 35 graus Celsius Eluente A – 0,1 % de ácido fórmico em acetonitrila Eluente B – 0,1 % de ácido fórmico em água Gradiente linear t=0 min 5 % de A, t=1,6 min 98 % de A. t=3 min 98 % de A Método D

[0120] Coluna - Phenomenex Gemini NX C18 (50 x 2,0 mm, 3,0 mícrons) Fluxo - 0,8 ml/min, 35 graus Celsius Eluente A - 95 % acetonitrila + 5 % de bicarbonato de amônio a 10 mM em água Eluente B - bicarbonato de amônio a 10 mM em água pH=9,0 Gradiente linear t=0 min 5 % de A, t=3,5 min 98 % de A.

t=6 min 98 % de A Método E

[0121] Coluna - Phenomenex Gemini NX C18 (50 x 2,0 mm, 3,0 mícrons) Fluxo - 0,8 ml/min, 25 graus Celsius Eluente A - 95 % acetonitrila + 5 % de bicarbonato de amônio a 10 mM em água Eluente B - bicarbonato de amônio a 10 mM em água (pH 9) Gradiente linear t=0 min 5 % de A, t=3,5 min 30 % de A. t=7 min 98 % de A, t=10 min 98 % de A Método F

[0122] Coluna - Waters XSelect HSS C18 (150 x 4,6 mm, 3,5 mícrons) Fluxo - 1,0 ml/min, 25 graus Celsius Eluente A – 0,1 % de TFA em acetonitrila Eluente B – 0,1 % de TFA em água Gradiente linear t=0 min 2 % de A, t=1 min 2 % de A, t=15 min 60 % de A, t=20 min 60 % de A Método G

[0123] Coluna - Zorbax SB-C18 1,8 µm 4,6 x 15 mm cartucho de Resolução Rápida (PN 821975-932) Fluxo - 3 ml/min Eluente A – 0,1 % de ácido fórmico em acetonitrila Eluente B – 0,1 % de ácido fórmico em água Gradiente linear t=0 min 0 % de A, t=1,8 min 100 % de

A Método H

[0124] Coluna- Waters Xselect CSH C18 (50 x 2,1 mm, 2,5 mícrons)

Fluxo - 0,6 ml/min Eluente A – 0,1 % de ácido fórmico em acetonitrila Eluente B – 0,1 % de ácido fórmico em água Gradiente linear t=0 min 5 % de A, t=2,0 min 98 % de A, t=2,7 min 98 % de A Método J

[0125] Coluna - Waters Xselect CSH C18 de fase Reversa (50 x 2,1 mm, 2,5 mícrons) Fluxo - 0,6 ml/min Eluente A - 100 % de acetonitrila Eluente B – bicarbonato de amônio a 10 mM em água (pH 7,9) Gradiente linear t=0 min 5 % de A, t=2,0 min 98 % de A, t=2,7 min 98 % de A Preparação de 6,6-difluoro-4-azaspiro[2.4]heptano

[0126] Etapa 1: A uma solução de anidrido succínico (100 g, 1000 mmol) em tolueno (3000 ml) foi adicionada benzilamina (107 g, 1000 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente por 24 h, então, aquecida em refluxo com um aparelho Dean-Stark por 16 horas. A mistura foi, então, concentrada sob pressão reduzida para gerar 1-benzilpirrolidina-2,5- diona (170 g, 900 mmol, 90 % de rendimento).

[0127] Etapa 2: A uma mistura resfriada (0 °C) de 1- benzilpirrolidina-2,5-diona (114 g, 600 mmol) e Ti(Oi-Pr)4 (170,5 g, 600 mmol) em THF seco (2000 ml) sob atmosfera de argônio foi adicionada por gotejamento uma solução de brometo de etilmagnésio a 3,4 M em THF (1200 mmol). A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 4 h. BF3.Et2O (170 g, 1200 mmol) foi, então, adicionado por gotejamento e a solução agitada por 6 h. A mistura foi resfriada (0 °C) e adicionou-se ácido clorídrico a 3 N (500 ml). A mistura foi extraída com Et2O, e os extratos orgânicos combinados lavados com salmoura, secos e concentrados sob pressão reduzida para gerar 4- benzil-4- azaspiro[2.4]heptan-5-ona (30,2 g, 150 mmol, 25 % de rendimento).

[0128] Etapa 3: A uma solução resfriada (-78 °C) de 4- benzil-4-azaspiro[2.4]heptan-5-ona (34,2 g, 170 mmol) em THF seco (1000 ml) em argônio foi adicionado LiHMDS em THF (solução a 1,1 M, 240 mmol). A mistura foi agitada por 1 h, então, uma solução de N-fluorobenzenossulfonimida (75,7 g, 240 mmol) em THF (200 ml) foi adicionada por gotejamento. A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 6 h. A mistura foi, então, resfriada novamente (-78 °C) e LiHMDS adicionado (solução a 1,1 M em THF, 240 mmol).

[0129] A solução foi agitada por 1 h, então, N- fluorobenzenossulfonimida (75,7 g, 240 mmol) em THF (200 ml) foi adicionada por gotejamento. A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 6 h.

[0130] A mistura foi vertida em uma solução saturada de NH4Cl (300 ml) e extraída duas vezes com Et2O. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura e concentrados sob pressão reduzida. O produto foi purificado por cromatografia em coluna para fornecer 4-benzil-6,6- difluoro-4-azaspiro[2,4]heptan-5-ona (18 g, 75,9 mmol, 45 % de rendimento).

[0131] Etapa 4: A uma solução aquecida (40 °C) de BH3,Me2S (3,42 g, 45 mmol) em THF (200 ml) foi adicionado por gotejamento 4-benzil-6,6-difluoro-4-azaspiro[2.4]heptan-5- ona (11,9 g, 50 mmol). A mistura foi agitada por 24 h a 40 °C, então, resfriada até a temperatura ambiente. A água (50 ml) foi adicionada por gotejamento, e a mistura extraída com Et2O (2 x 200 ml). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, diluídos com solução de HCl a 10 % em dioxano (50 ml) e evaporados sob pressão reduzida para gerar 4-benzil-6,6-difluoro-4-azaspiro[2.4]heptano (3 g, 13,4 mmol, 27 % de rendimento).

[0132] Etapa 5: 4-Benzil-6,6-difluoro-4- azaspiro[2.4]heptano (2,68 g, 12 mmol) e hidróxido de paládio (0,5 g) em metanol (500 ml) foram agitados à temperatura ambiente sob uma atmosfera de H2 por 24 h. A mistura foi filtrada e, então, o filtrado concentrado sob pressão reduzida para obter 6,6-difluoro-4- azaspiro[2.4]heptano(0,8 g, 6,01 mmol, 50 % de rendimento). Preparação de 7,7-difluoro-4-azaspiro[2.4]heptano

[0133] Etapa 1: A uma solução resfriada (0 °C) de 1- benzilpirrolidina-2,3-diona (8 g, 42,3 mmol) em DCM (100 ml) foi adicionado por gotejamento por 30 minutos DAST (20,4 g, 127 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, então, extinta por adição por gotejamento de NaHCO3 saturado. A camada orgânica foi separada, e a fração aquosa extraída duas vezes com DCM (2 x 50 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4 e concentradas sob pressão reduzida para produzir 1-benzil- 3,3-difluoropirrolidin-2-ona (26,0 mmol, 61 % de rendimento), que é usada na próxima etapa sem purificação adicional.

[0134] Etapa 2: A uma solução de 1-benzil-3,3- difluoropirrolidin-2-ona bruta (5,5 g, 26 mmol) e Ti(Oi-Pr)4 (23,4 ml, 78 mmol) em THF (300 ml) foi adicionada por gotejamento sob atmosfera de argônio a solução de EtMgBr a 3,4 M em 2-MeTHF (45,8 ml, 156 mmol). Após a agitação por 12 h, a água (10 ml) foi adicionada para obter um precipitado branco. O precipitado foi lavado com MTBE (3 x 50 ml). As frações orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4, concentradas e purificadas por cromatografia (hexanos-EtOAc de 9:1) para obter 4-benzil-7,7-difluoro-4- azaspiro[2.4]heptano (1,3 g, 5,82 mmol, 22 % de rendimento) como um óleo amarelo pálido.

[0135] Etapa 3: 4-benzil-7,7-difluoro-4- azaspiro[2.4]heptano (0,55 g, 2,46 mmol) foi dissolvido em solução de CHCl3 (1 ml) e MeOH (20 ml) e Pd/C (0,2 g, 10 %) foi adicionado. Essa mistura foi agitada sob e em uma atmosfera de H2 por 5 h, então, filtrada. O filtrado foi concentrado para gerar 7,7-difluoro-4-azaspiro[2,4]heptano (0,164 g, 1,23 mmol, 50 % de rendimento) Síntese de 1-[(difluorometoxi)metil]-N-metilciclopropan-1- amina

[0136] Etapa 1: A uma solução de 1- ((tercbutoxicarbonil)(metil)amino)ciclopropano-1- carboxilato de metila (1,05 g, 4,58 mmol) em THF seco (5 ml) sob N2 foi adicionado boro-hidreto de lítio (1,259 ml, 4 M em THF, 5,04 mmol). A mistura foi agitada à ta por 4 dias. Sulfato de sódio e água foram adicionados, a mistura foi filtrada em um bloco de sulfato de sódio que foi lavado com diclorometano. O filtrado foi concentrado para gerar (1- (hidroximetil)ciclopropil)(metil)carbamato de terc-butila como um sólido branco (0,904 g, 95 % de rendimento).

[0137] Etapa 2: A uma solução de (1- (hidroximetil)ciclopropil)(metil)carbamato de terc-butila (0,100 g, 0,497 mmol) e (bromodifluorometil)trimetilssilano (0,155 ml, 0,994 mmol) em diclorometano(0,5 ml) foi adicionada uma gota de uma solução de acetato de potássio (0,195 g, 1,987 mmol) em água (0,5 ml). A mistura foi agitada por 40 h. A mistura foi diluída com diclorometano e água, a camada orgânica foi separada e concentrada. A purificação por cromatografia flash (20 % de acetato de etila em heptano) gerou um N-{1[(difluorometoxi)metil]ciclopropil}-N- metilcarbamato de terc-butila como óleo incolor (0,058 g, 46 % de rendimento)

[0138] Etapa 3: A (1- ((difluorometoxi)metil)ciclopropil)(metil)carbamato de terc-butila (0,058 g, 0,231 mmol) foi adicionado HCl em dioxano (solução a 4 M, 2 ml, 8,00 mmol). A mistura foi agitada por 30 min à ta, então, concentrada para produzir o produto desejado que foi usado sem purificação adicional

[0139] LC-MS: m/z 152,2 (M+H)+ Síntese de 3-{metil[1-(piridin-3-il)ciclopropil]carbamoil}- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila

[0140] Etapa 1: A uma solução de cloridrato de ácido 1- (piridin-3-il)ciclopropano-1-carboxílico (498,46 mg, 2,5 mmol) em uma mistura de tolueno (30 ml) e t-BuOH (1,0 ml) foram adicionadas difenilfosforil azida (687,14 mg, 2,5 mmol) e trietilamina (631,62 mg, 6,24 mmol, 870,0 µl). A mistura de reação foi aquecida em refluxo durante a noite. A mistura de reação foi resfriada e filtrada. O filtrado foi lavado com água (3x10 ml), seco em Na2SO4 e concentrado em vácuo para gerar N-[1-(piridin-3-il)ciclopropil]carbamato de terc-butila e (250,0 mg, 95,0 % de pureza, 1,01 mmol, 40,6 % de rendimento) como óleo castanho claro.

[0141] Etapa 2: Hidreto de sódio (154,24 mg, 6,43 mmol) foi suspenso em DMF seco (5 ml) e, então, resfriado a 0 °C. Uma solução de N-[1-(piridin-3-il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (1,51 g, 6,43 mmol) em DMF seco (5 ml) foi adicionada por gotejamento. A mistura resultante foi agitada até cessar a evolução gasosa. Iodometano (1,0 g, 7,07 mmol, 440,0 µl) foi adicionado por gotejamento na mesma temperatura; a mistura resultante foi aquecida até a t.a. e, então, agitada durante a noite. Após o consumo do material inicial (controle de 1H RMN), a mistura de reação foi vertida em água. A mistura resultante foi extraída duas vezes com MTBE (2 x 50 ml). As fases orgânicas foram combinadas, lavadas com água, secas em sulfato de sódio e concentradas para gerar N-metil-N-[1-(piridin-3-il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (1,1 g, 4,43 mmol, 68,9 % de rendimento). O produto foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.

[0142] Etapa 3: A uma solução de N-metil-N-[1-(piridin- 3-il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (1,1 g, 4,43 mmol) em metanol (10 ml) foi adicionada a solução de HCl a 4 M em dioxano (2 ml). A solução resultante foi agitada por 12 h a 25 °C. Após a conclusão da reação (monitorada por 1H RMN ou LCMS), a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O produto foi triturado com MTBE e coletado por filtração, então, seco em vácuo a 40 °C para gerar dicloridrato de N-metil-1-(piridin-3-il)ciclopropan-1-amina (900,0 mg, 95,0 % de pureza, 3,87 mmol, 87,2 % de rendimento).

[0143] Etapa 4: A uma solução agitada de dicloridrato de N-metil-1-(piridin-3-il)ciclopropan-1-amina (398,89 mg, 1,8 mmol) e ácido 5-[(terc-butoxi)carbonil]-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-3-carboxílico (482,15 mg, 1,8 mmol) em DMF (2 ml) foram adicionados HATU (891,67 mg, 2,35 mmol) e trietilamina (638,88 mg, 6,31 mmol, 880,0 µl). A mistura foi agitada durante a noite à t.a. e, então, vertida em água e extraída com MTBE (2x15 ml). As frações orgânicas combinadas foram lavadas três vezes com água, secas em sulfato de sódio anidro, e o solvente foi removido em vácuo. O produto bruto foi purificado por HFLC para gerar 3- metil[1-(piridin-3-il)ciclopropil]carbamoil-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc-butila (230,0 mg, 82,0 % de pureza, 474,5 µmol, 26,3 % de rendimento).

[0144] 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,41 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,56 (m, 2H), 3,07 (m, 3H), 3,82 (m, 2H), 4,07 (m, 2H), 4,75 (m, 2H), 6,99 (m, 1H), 7,37 (m, 1H), 7,48 (d, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,44 (s, 1H).

[0145] LCMS: m/z 398,2 Síntese de 3-{metil[1-(piridin-4-il)ciclopropil]carbamoil}- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila

[0146] Etapa 1: Cloridrato de ácido 2-(piridin-4- il)acético (5,0 g, 28,8 mmol) foi dissolvido em MeOH (20 ml), então, H2SO4 (0,5 ml) foi adicionado. A mistura de reação foi aquecida a 85 °C durante a noite. O MeOH foi removido para gerar um resíduo que foi neutralizado com cuidado com solução de NaHCO3 aquosa saturada e, então, extraído com EtOAc (3 x 100 ml). Os extratos orgânicos foram combinados,

secos e concentrados para gerar 2-(piridin-4-il)acetato de metila (4,0 g, 95,0 % de pureza, 25,14 mmol, 87,3 % de rendimento) como um óleo amarelo, que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.

[0147] Etapa 2: 2-(piridin-4-il)acetato de metila (4,0 g, 26,46 mmol) foi dissolvido em DMF (5 ml) e adicionado a uma suspensão resfriado (0 °C) de hidreto de sódio (825,52 mg, 34,4 mmol) em DMF (5 ml). A mistura resultante foi agitada a 0 °C por 30 min e, então, tratada com 1,2-dibromoetano (6,46 g, 34,4 mmol) na mesma temperatura. A mistura de reação foi agitada à t.a. por 12 h. A mistura de reação foi, então, diluída com acetato de etila e lavada com água e salmoura. A fase orgânica foi separada, seca em Na2SO4 e filtrada; o filtrado foi concentrado. O óleo resultante foi triturado com hexano para gerar 1-(piridin-4-il)ciclopropano-1- carboxilato de metila (2,3 g, 12,98 mmol, 49,1 % de rendimento) como um sólido.

[0148] Etapa 3: 1-(piridin-4-il)ciclopropano-1- carboxilato de metila (2,3 g, 12,98 mmol) foi dissolvido em MeOH (20 ml), ao qual foi adicionada uma solução de hidróxido de sódio (778,67 mg, 19,47 mmol) em água (20 ml). A mistura foi agitada a 20 °C por 20 h. MeOH foi removido por evaporação e o resíduo aquoso foi neutralizado em resfriamento de gelo com ácido clorídrico (a pH 7). A mistura foi concentrada até secura, o resíduo foi triturado três vezes com CHCl3, e os filtrados combinados concentrados até secura para gerar cloridrato de ácido 1-(piridin-4-il)ciclopropano-1- carboxílico (2,0 g, 10,02 mmol, 77,2 % de rendimento).

[0149] Etapa 4: À solução de ácido 1-(piridin-4- il)ciclopropano-1-carboxílico (599,43 mg, 3,67 mmol) em mistura de tolueno (30 ml) e t-BuOH (10 ml) foram adicionadas difenilfosforil azida (1,01 g, 3,67 mmol) e trietilamina (929,28 mg, 9,18 mmol, 1,28 ml). A mistura de reação foi submetida a refluxo durante a noite, então, resfriada e filtrada. O filtrado foi lavado com água (3 x 10 ml), seco em Na2SO4 e concentrado para gerar N-[1-(piridin-4- il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (300,0 mg, 1,28 mmol, 34,9 % de rendimento) como óleo castanho claro. O produto foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.

[0150] Etapa 5: Hidreto de sódio (94,22 mg, 3,93 mmol) foi suspenso em DMF (5 ml) e, então, resfriado a 0 °C. Uma solução de N-[1-(piridin-4-il)ciclopropil]carbamato de terc- butila (919,93 mg, 3,93 mmol) em DMF (5 ml) foi, então, adicionada por gotejamento. A mistura resultante foi agitada até cessar a evolução gasosa. Iodometano (613.04 mg, 4,32 mmol) foi adicionado por gotejamento a essa mesma temperatura; a mistura resultante foi aquecida até a t.a. e, então, agitada durante a noite. Após o consumo do material inicial (controle de 1H RMN), a mistura de reação foi vertida em água. A mistura foi extraída duas vezes com MTBE (50 ml). As fases orgânicas foram combinadas, lavadas com água, secas em sulfato de sódio e concentradas para gerar N-metil-N-[1- (piridin-4-il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (900,0 mg, 98,0 % de pureza, 3,55 mmol, 90,5 % de rendimento). O produto foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.

[0151] Etapa 6: A uma solução de N-metil-N-[1-(piridin- 4-il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (900,0 mg, 3,62 mmol) em metanol (10 ml) foi adicionado HCl a 4 M em dioxano (2 ml) e a solução resultante foi agitada por 12 h a 25 °C. Após a conclusão da reação (monitorado por 1H RMN), a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O produto foi tratado com MTBE e coletado por filtração, então, seco em vácuo a 40 °C para gerar dicloridrato de N-metil-1- (piridin-4-il)ciclopropan-1-amina (600,0 mg, 2,71 mmol, 74,9 % de rendimento).

[0152] Etapa 7: A uma solução agitada de dicloridrato de N-metil-1-(piridin-4-il)ciclopropan-1-amina (600,0 mg, 2,71 mmol) e ácido 5-[(terc-butoxi)carbonil]-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-3-carboxílico (724,91 mg, 2,71 mmol) em DMF (5 ml) foram adicionados HATU (1,34 g, 3,53 mmol) e trietilamina (960,55 mg, 9,49 mmol, 1,32 ml). A mistura foi agitada durante a noite à t.a. e, então, vertido em água e extraída com MTBE (3 x 15 ml). As frações orgânicas combinadas foram lavadas três vezes com água, secas em sulfato de sódio anidro e concentrados. O produto bruto foi purificado por HPLC para gerar 3-metil[1-(piridin-4- il)ciclopropil]carbamoil-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-5-carboxilato de terc-butila (169,0 mg, 425,19 µmol, 15,7 % de rendimento).

[0153] 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,38 (m, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,60 (m, 3H), 3,03 (m, 3H), 3,71 (m, 1H), 3,84 (m, 1H), 4,06 (m, 2H), 4,75 (m, 2H), 6,92 (m, 1H), 7,07 (m, 2H), 8,52 (m, 2H).

[0154] LCMS: m/z 398,4 Síntese de 3-{metil[1-(pirimidin-2- il)ciclopropil]carbamoil}-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-5-carboxilato de terc-butila

[0155] Etapa 1: A uma suspensão resfriada (0 °C) de cloridrato de 1-(pirimidin-2-il)ciclopropan-1-amina (996,43 mg, 5,81 mmol) em DCM seco (30 ml) foi adicionado dicarbonato de di-terc-butila (1,27 g, 5,81 mmol). Trietilamina (646,14 mg, 6,39 mmol, 890,0 µl) foi, então, adicionada por gotejamento. A mistura de reação foi agitada durante a noite à t.a e diluída com água (5 ml). A fase orgânica foi separada, lavada com água, seca em sulfato de sódio, filtrada e concentrada para produzir N-[1-(pirimidin-2- il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (1,17 g, 4,97 mmol, 85,7 % de rendimento) como um sólido amarelo claro.

[0156] Etapa 2: A uma solução agitada de n-[1-(pirimidin- 2-il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (499,99 mg, 2,13 mmol) em DMF seco (4 ml) foi adicionado hidreto de sódio (127,49 mg, 5,31 mmol). A mistura de reação foi agitada à t.a. por 1 h, então, resfriada a 0 °C. Iodometano (603,26 mg, 4,25 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada à t.a. durante a noite. A mistura foi vertida em salmoura; então, extraída com EtOAc (2x10 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas em Na2SO4, filtradas e concentradas para produzir N-metil-N-[1-(pirimidin-2- il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (400,0 mg, 1,6 mmol, 75,5 % de rendimento) como sólido amarelo.

[0157] Etapa 3: A uma solução agitada de N-metil-N-[1- (pirimidin-2-il)ciclopropil]carbamato de terc-butila (400,0 mg, 1,6 mmol) em DCM seco (5 ml) foi adicionado HCl a 4 M em dioxano (2 ml, 8 mmol). A mistura de reação foi agitada à t.a. por 5 h. A mistura foi concentrada, o resíduo foi triturado com hexano e removido por filtração para produzir cloridrato de N-metil-1-(pirimidin-2-il)ciclopropan-1- amina (280,0 mg, 1,51 mmol, 94 % de rendimento) como sólido cinza.

[0158] Etapa 4: A uma solução resfriada (0 °C) de HATU (573,46 mg, 1,51 mmol) e ácido 5-[(tercbutoxi)carbonil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3-carboxílico (403,11 mg, 1,51 mmol) em DMF (3 ml) foram adicionados sucessivamente por gotejamento cloridrato de N-metil-1-(pirimidin-2- il)ciclopropan-1-amina (280,0 mg, 1,51 mmol) e N,N-di- isopropiletilamina (779,69 mg, 6,03 mmol). A mistura de reação foi agitada à t.a. durante a noite e diluída com salmoura. A mistura foi extraída com EtOAc (2 x 10 ml), as fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas em Na2SO4 e concentradas. O resíduo foi purificado por HPLC para gerar 3-metil[1-(pirimidin-2-il)ciclopropil]carbamoil- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila (332,9 mg, 835,47 µmol, 55,4 % de rendimento) como sólido amarelo.

[0159] 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,43 (s, 9H), 1,57 (m, 2H), 1,89 (m, 1H), 3,31 (m, 2H), 3,71 (m, 1H), 3,83 (m, 2H),

4,03 (m, 2H), 4,12 (m, 1H), 4,69 (m, 1H), 4,78 (m, 1H), 6,78 (s, 1H), 7,36 (t, 1H), 8,78 (d, 2H).

[0160] LCMS: m/z 399,2 Síntese de 3-[(1-{[(2,2- difluoroetil)amino]metil}ciclopropil)(metil)carbamoil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila

[0161] Etapa 1: A uma solução agitada de N-[1-

(hidroximetil)ciclopropil]-N-metilcarbamato de terc-butila (2,25 g, 11,18 mmol) em DCM seco (30 ml) à t.a. foi adicionada em porções 1,1,1-tris(acetoxi)-1,1-di-hidro-1,2- benziodoxol-3(1H)-ona (4,74 g, 11,18 mmol). A mistura de reação foi agitada à t.a. por 1 h e, então, resfriada a 0 °C. Uma solução de hidróxido de sódio (2,01 g, 50,3 mmol) em água (5 ml) foi, então, adicionada por gotejamento e a mistura foi agitada à t.a. por 15 min. A fase orgânica foi separada, seca em Na2SO4, filtrada e concentrada para produzir N-(1-formilciclopropil)-N-metilcarbamato de terc- butila (2,2 g, 11,04 mmol, 98,8 % de rendimento) como óleo amarelo.

[0162] Etapa 2: A uma solução agitada de N-(1- formilciclopropil)-N-metilcarbamato de terc-butila (2,2 g, 11,04 mmol) em DCM seco (50 ml) foi adicionada fenilmetanamina (1,18 g, 11,04 mmol). A mistura foi agitada à t.a. Por 5 h. A uma mistura de reação resfriada foi adicionado acetato de sódio bis(acetiloxi)boramidila (7,02 g, 33,12 mmol) em uma porção e a agitação continuou por 5 h. A mistura foi resfriada a 0 °C e solução de NaOH aq. A 15 % (20 ml) foi adicionada. A mistura foi agitada por 30 min e a fase orgânica foi separada, seca em Na2SO4, filtrada e concentrada para produzir N-1- [(benzilamino)metil]ciclopropil-N-metila carbamato de terc- butila (2,75 g, 85 % de rendimento) como óleo amarelo.

[0163] Etapa 3: A uma solução resfriada (0 °C) e agitada de N-1-[(benzilamino)metil]ciclopropil-N-metilcarbamato de terc-butila (1,75 g, 6,02 mmol) em acetonitrila seca (10 ml) foi adicionado carbonato de potássio (1,67 g, 12,05 mmol) seguido por adição por gotejamento de trifluorometanossulfonato de 2,2-difluoroetila (1,68 g, 7,83 mmol). A mistura de reação foi aquecida à t.a. e agitada durante a noite. A mistura foi vertida em água (30 ml) e extraída com DCM (3x10 ml). As fases orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4, filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash em sílica com hexano-MTBE (4:1) como eluente para produzir N-(1- [benzil(2,2-difluoroetil)amino]metilciclopropil)-N- metilcarbamato de terc-butila (900,0 mg, 2,54 mmol, 42,2 % de rendimento) como óleo incolor.

[0164] Etapa 4: A uma solução de N-(1-[benzil(2,2- difluoroetil)amino]metilciclopropil)-N-metilcarbamato de terc-butila (199,9 mg, 564,0 µmol) em CH2Cl2 (3 ml) foi adicionado HCl a 4 M em dioxano (1 ml). A solução resultante foi agitada por 12 h à t.a., então, concentrada. O resíduo foi triturado com hexano e coletado por filtração para gerar dicloridrato de 1-[benzil(2,2-difluoroetil)amino]metil-N- metilciclopropan-1-amina (156,0 mg, 95,1 % de rendimento) como sólido branco.

[0165] Etapa 5: A uma solução de dicloridrato de 1- [benzil(2,2-difluoroetil)amino]metil-N-metilciclopropan-1- amina (155,96 mg, 476,58 µmol) e [(dimetilamino)(3H- [1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-iloxi}metilideno] dimetil azânio; hexafluoro-lambda5-fosfamida (181,21 mg, 476,58 µmol) em DMF (2 ml) foi adicionada trietilamina (241,13 mg, 2,38 mmol). A mistura foi agitada à t.a. por 15 min. Ácido 5-[(terc-butoxi)carbonil]-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-3-carboxílico (127,38 mg, 476,58 µmol) foi adicionado, e a reação agitada à t.a. por 24 h, então, diluída com salmoura. A mistura foi extraída com EtOAc (2 x

20 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas em Na2SO4, filtradas e concentradas para produzir 3-[(1-[benzil(2,2- difluoroetil)amino]metilciclopropil)(metil)carbamoil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila bruto (200,0 mg, 397,15 µmol, 83,3 % de rendimento) como óleo castanho que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.

[0166] Etapa 6: A uma solução agitada de 3-[(1- [benzil(2,2- difluoroetil)amino]metilciclopropil)(metil)carbamoil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila (200,0 mg, 397,15 µmol) em MeOH (5 ml) foi adicionado paládio em carbono (10 %, 0,05 g). A mistura foi agitada à t.a. em hidrogênio (balão) por 48 h. A mistura foi purgada com nitrogênio, então, filtrada, e o filtrado concentrado. O resíduo foi purificado por HPLC para gerar 3-[(1-[(2,2- difluoroetil)amino]metilciclopropil)(metil)carbamoil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila (70,0 mg, 42,7 % de rendimento) como óleo incolor.

[0167] 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 0,76 (m, 3H), 1,43 (s, 9H), 2,26 (m, 1H), 2,90 (m, 4H), 3,05 (s, 3H), 3,80 (s, 2H), 4,10 (d, 2H), 4,71 (s, 2H), 5,96 (tt, 1H), 7,84 (s, 1H).

[0168] LCMS: m/z 414,1 Síntese de 3-[metil(1-{[(2,2,2- trifluoroetil)amino]metil}ciclopropil)carbamoil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila

[0169] Etapa 1: A uma solução agitada de N-1- [(benzilamino)metil]ciclopropil-N-metilcarbamato de terc- butila (537,25 mg, 1,85 mmol) em acetonitrila seca (10 ml) foi adicionado carbonato de potássio (767,06 mg, 5,55 mmol) seguido por trifluorometanossulfonato de 2,2,2- trifluoroetila (644,56 mg, 2,78 mmol, 400,0 µl). A mistura de reação foi agitada a 80 °C durante a noite.

A mistura foi, então, resfriada, concentrada, e o resíduo obtido foi dissolvido em DCM (10 ml). A fase orgânica foi lavada com água (3 ml), seca em Na2SO4 e concentrada.

O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash em hexano-MTBE (10:1) para produzir N-(1-[benzil(2,2,2- trifluoroetil)amino]metilciclopropil)-N-metilcarbamato de terc-butila (410,0 mg, 1,1 mmol, 59,5 % de rendimento) como óleo incolor.

[0170] Etapa 2: A uma solução agitada de N-(1- [benzil(2,2,2-trifluoroetil)amino]metilciclopropil)-N- metilcarbamato de terc-butila (410,0 mg, 1,1 mmol) em DCM (5 ml) foi adicionado HCl a 4 M em dioxano (3 ml, 12 mmol). A mistura resultante foi agitada durante a noite, então, evaporada até secura para gerar dicloridrato de 1- [benzil(2,2,2-trifluoroetil)amino]metil-N-metilciclopropan- 1-amina (330,0 mg, 955,88 µmol, 86,8 % de rendimento) como óleo amarelo.

[0171] Etapa 3: A uma solução de HATU (381,96 mg, 1,0 mmol) em DMF (3 ml) foram adicionados trietilamina (484,05 mg, 4,78 mmol) e ácido 5-[(terc-butoxi)carbonil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3-carboxílico (255,71 mg, 956,72 µmol). A mistura de reação foi agitada à t.a. por 30 min, então, uma solução de dicloridrato de 1- [benzil(2,2,2-trifluoroetil)amino]metil-N-metilciclopropan- 1-amina (330,29 mg, 956,72 µmol) em DMF (1 ml) foi adicionada. A mistura de reação foi agitada à t.a. durante a noite e vertida em água (5 ml). A mistura foi extraída com EtOAc (2 x 5 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água, NaHCO3 aq., secas em Na2SO4, filtradas e concentradas para produzir 3-[(1-[benzil(2,2,2- trifluoroetil)amino]metilciclopropil)(metil)carbamoil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila bruto (600,0 mg, 77,0 % de pureza, 885,78 µmol, 92,6 % de rendimento) como óleo castanho, que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.

[0172] Etapa 4: A uma solução agitada de 3-[(1-

[benzil(2,2,2- trifluoroetil)amino]metilciclopropil)(metil)carbamoil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila (600,0 mg, 1,15 mmol) em MeOH (10 ml) foi adicionado paládio em carbono (10 %, 70 mg). A mistura foi agitada sob H2 (balão) por 5 dias. A mistura foi filtrada, concentrada e purificada por HPLC para gerar 3-[metil(1-[(2,2,2- trifluoroetil)amino]metilciclopropil)carbamoil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila (218,5 mg, 506,43 µmol, 44,1 % de rendimento) como óleo castanho.

[0173] 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 0,76 (s, 3H), 1,43 (s, 9H), 2,65 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 3,11 (m, 3H), 3,27 (m, 3H), 3,80 (m, 2H), 4,10 (m, 2H), 4,71 (m, 2H), 7,83 (m, 1H).

[0174] LCMS: m/z 432,2 Síntese de 4-{4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3- carbonil}-8-oxa-4-azaspiro[2.6]nonano

[0175] Etapa 1: A uma solução agitada de ácido 5-[(terc- butoxi)carbonil]-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3- carboxílico (489,9 mg, 1,83 mmol) e cloridrato de 8-oxa-4- azaspiro[2,6]nonano (300,0 mg, 1,83 mmol) em DMF (5 ml) foram adicionados HATU (906,01 mg, 2,38 mmol) e trietilamina (649,15 mg, 6,42 mmol, 890,0 µl). Então, a mistura foi agitada durante a noite à t.a. e, então, vertida em água e extraída com MTBE (2 x 15 ml). As frações orgânicas combinadas foram lavadas três vezes com água (20 ml), secas em Na2SO4, e concentradas para gerar 3-8-oxa-4- azaspiro[2.6]nonano-4-carbonil-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-5-carboxilato de terc-butila (500,0 mg, 91,0 % de pureza, 1,21 mmol, 65,9 % de rendimento).

[0176] Etapa 2: A uma solução de 3-8-oxa-4- azaspiro[2.6]nonano-4-carbonil-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-5-carboxilato de terc-butila (500,0 mg, 1,33 mmol) em MeOH (10 ml) foi adicionado HCl a 4 M em dioxano (2 ml, 8 mmol). A solução resultante foi agitada por 12 h, e, então, concentrada sob pressão reduzida. O produto foi tratado com MTBE (50 ml) e coletada por filtração, então, seco em vácuo a 40 °C para gerar cloridrato de 4-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-3-carbonil-8-oxa-4- azaspiro[2.6]nonano (220,0 mg, 90,0 % de pureza, 633,0 µmol, 54 % de rendimento).

[0177] 1H RMN (500 MHz, d.6-DMSO) δ 0,90 (m, 4H), 1,95 (m, 2H), 3,50 (m, 3H), 3,64 (m, 5H), 4,37 (m, 2H), 4,47 (m, 2H), 7,77 (s, 1H), 10,09 (m, 2H).

[0178] LCMS: m/z 277,2 Síntese de 4-{4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3- carbonil}-7-oxa-4-azaspiro[2,6]nonano

[0179] Etapa 1: A uma solução agitada de ácido 5-[(terc- butoxi)carbonil]-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3- carboxílico (489,9 mg, 1,83 mmol) e cloridrato de 7-oxa-4- azaspiro[2,6]nonano (300,0 mg, 1,83 mmol) em DMF (5 ml) foram adicionados HATU (906,01 mg, 2,38 mmol) e trietilamina

(649,15 mg, 6,42 mmol, 890,0 µl). A mistura foi agitada durante a noite à t.a. e, então, vertida em água e extraída com MTBE (2 x 15 ml). As frações orgânicas combinadas foram lavadas três vezes com água, secas em sulfato de sódio anidro e concentradas para gerar 3-7-oxa-4-azaspiro[2.6]nonano-4- carbonil-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc-butila (350,0 mg, 95,0 % de pureza, 883,25 µmol, 48,2 % de rendimento).

[0180] Etapa 2: A uma solução de 3-7-oxa-4- azaspiro[2.6]nonano-4-carbonil-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-5-carboxilato de terc-butila (350,0 mg, 929,74 µmol) em metanol (10 ml) foi adicionada solução de HCl a 4 N em dioxano (2 ml) e a solução resultante foi agitada por 12 h a 25 °C. Após a conclusão da reação (monitorada por HRMN), a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O produto foi tratado com MTBE e coletado por filtração, então, seco em vácuo a 40 °C para gerar cloridrato de 4-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3-carbonil-7-oxa- 4-azaspiro[2.6]nonano (110,0 mg, 91,0 % de pureza, 320,02 µmol, 34,4 % de rendimento).

[0181] 1H RMN (400 MHz, D2O) δ 0,87 (m, 4H), 1,73 (m, 1H), 3,71 (m, 5H), 3,93 (m, 2H), 4,39 (m, 2H), 4,55 (m, 3H), 7,82 (m, 1H).

[0182] LCMS: m/z 277,2 Síntese de 3-{7-hidroxi-4-azaspiro[2,5]octano-4-carbonil}- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxilato de terc- butila

[0183] A uma solução de ácido 5-[(terc-butoxi)carbonil]- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3-carboxílico (1,13 g, 4,22 mmol) e trietilamina (1,07 g, 10,55 mmol, 1,47 ml) em MeCN (20 ml) foi adicionado HATU (1,77 g, 4,64 mmol). A mistura resultante foi agitada por 10 min, então, cloridrato de 4-azaspiro[2.5]octan-7-ol (760,0 mg, 4,64 mmol) foi adicionado e a agitação continuou durante a noite. A mistura de reação foi dividida entre EtOAc (50 ml) e água (100 ml). A fase orgânica foi lavada com água (2 x 20 ml), salmoura, seca em sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O produto foi purificado por HPLC para gerar 3-7-hidroxi-4- azaspiro[2.5]octano-4-carbonil-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-5-carboxilato de terc-butila (275,0 mg, 730,51 µmol, 17,3 % de rendimento).

[0184] 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 0,56 (m, 2H), 0,82 (m, 1H), 0,92 (m, 1H), 1,20 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,81 (m, 2H), 3,75 (m, 1H), 3,83 (m, 3H), 4,11 (m, 4H), 4,62 (m, 1H), 4,71 (m, 1H), 4,76 (m, 1H), 7,70 (s, 1H).

[0185] LCMS: m/z 377,2 Exemplo 1 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-[1-(metoximetil)ciclopropil]- N3,6-dimetil-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5- dicarboxamida

[0186] Rt (Método A) 3,16 min, m/z 450 / 452 [M+H]+

[0187] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,01 (s, 1H), 8,05 - 7,80 (m, 1H), 7,74 (dd, J = 6,9, 2,6 Hz, 1H), 7,45 - 7,39 (m, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 5,39 - 5,10 (m, 1H), 4,98 - 4,78 (m, 1H), 4,55 - 4,35 (m, 1H), 4,27 - 4,19 (m, 1H), 4,13 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 3,65 - 3,45 (m, 2H), 3,29 (s, 3H), 3,23 - 2,87 (m, 3H), 1,25 - 0,67 (m, 7H). Exemplo 2 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N 3-metil-N 3-{1-[(propan-2- iloxi}metil] ciclopropil}-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0188] Rt (Método J) 1,51 min, m/z 464/466 [M+H]+

[0189] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,07 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,72 (dd, J = 6,8, 2,6 Hz, 1H), 7,41 (ddd, J = 9,0, 4,3, 2,6 Hz, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 4,85 (m, 2H), 4,17 (m, 2H), 4,13 - 3,68 (m, 2H), 3,56 (m, 3H), 3,04 (m, 3H), 1,07 (m, 7H), 0,81 (m, 3H). Exemplo 3 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-[1-(etoximetil)ciclopropil]-N

3-metil-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5- dicarboxamida

[0190] Rt (Método J) 1,42 min, m/z 450/452 [M+H]+

[0191] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,07 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,73 (dd, J = 6,8, 2,6 Hz, 1H), 7,41 (ddd, J = 9,1, 4,3, 2,6 Hz, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 4,85 (m, 2H), 4,18 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,98 (m, 2H), 3,58 (m, 2H), 3,46 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,05 (m, 3H), 1,10 (m, 4H), 0,83 (s, 3H). Exemplo 4 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-{1- [(difluorometoxi}metil]ciclopropil}-N3-metil-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0192] Rt (Método B) 3,24 min, m/z 472/474 [M+H]+

[0193] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,08 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,73 (dd, J = 6,9, 2,6 Hz, 1H), 7,41 (ddd, J = 9,0, 4,4, 2,6 Hz, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 6,71 (t, J =

75,8 Hz, 1H), 4,90 - 4,81 (m, 2H), 4,21 - 4,14 (m, 2H), 4,11 - 3,82 (m, 4H), 3,20 - 2,98 (m, 3H), 1,20 - 0,79 (m, 4H). Exemplo 5 N-(3-cloro-4-fluorofenil)-3-{6,6-difluoro-4- azaspiro[2.4]heptano-4-carbonil}-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-5-carboxamida

[0194] Rt (Método J) 1,47 min, m/z 454/456 [M+H]+

[0195] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,08 (s, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,75 - 7,69 (m, 1H), 7,44 - 7,38 (m, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 4,83 (m, 2H), 4,27 (t, J = 13,1 Hz, 2H), 4,22 - 4,12 (m, 2H), 3,98 - 3,87 (m, 2H), 2,50 - 2,43 (m, 2H), 1,92 - 1,84 (m, 2H), 0,69 - 0,62 (m, 2H). Exemplo 6 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-{1- [(difluorometoxi)metil]ciclopropil}-N3,6-dimetil- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0196] Rt (Método B) 3,37 min, m/z 486/488 [M+H]+

[0197] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,02 (s, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,74 (dd, J = 6,9, 2,5 Hz, 1H), 7,45 - 7,38 (m, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 6,71 (t, J = 75,8 Hz, 1H), 5,35 - 5,18 (m, 1H), 4,94 - 4,82 (m, 1H), 4,44 (d, 1H), 4,24 (dd, J = 12,8, 4,3 Hz, 1H), 4,17 - 3,95 (m, 3H), 3,22 - 2,90 (m, 3H), 1,12 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,95 (s, 4H). Exemplo 7 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-metil-N3-[1-(piridin-4- il)ciclopropil]-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5- dicarboxamida

[0198] Rt (Método A) 2,95 min, m/z 469/471 [M+H]+

[0199] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,08 (s, 1H), 8,63 - 8,37 (m, 2H), 8,00 - 7,68 (m, 1H), 7,64 - 7,36 (m, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 7,20 - 6,80 (m, 3H), 5,07 - 4,74 (m,

2H), 4,31 - 3,67 (m, 4H), 3,23 - 2,94 (m, 3H), 1,84 - 1,30 (m, 4H). Exemplo 8 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-metil-N3-[1-(pirimidin-2- il)ciclopropil]-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5- dicarboxamida

[0200] Rt (Método A) 3 min, m/z 470/472 [M+H]+

[0201] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,07 (s, 1H), 8,84 - 8,63 (m, 2H), 7,79 - 7,67 (m, 1H), 7,46 - 7,24 (m, 3H), 6,78 (s, 1H), 5,00 - 4,76 (m, 2H), 4,26 - 3,90 (m, 3H), 3,84 - 3,68 (m, 1H), 3,10 (s, 3H), 1,96 - 1,80 (m, 1H), 1,66 - 1,33 (m, 3H). Exemplo 9 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-[1- (hidroximetil)ciclopropil]-N3-metil-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0202] Rt (Método A) 2,77 min, m/z 422/424 [M+H]+

[0203] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,07 (s, 1H), 8,17 - 7,76 (m, 1H), 7,73 (dd, J = 6,8, 2,6 Hz, 1H), 7,41 (ddd, J = 9,1, 4,4, 2,6 Hz, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 5,32 - 4,92 (m, 1H), 4,92 - 4,72 (m, 2H), 4,24 - 4,12 (m, 2H), 4,12 - 3,73 (m, 2H), 3,72 - 3,53 (m, 2H), 3,22 - 2,88 (m, 3H), 1,21 - 0,60 (m, 4H). Exemplo 10 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-(2-hidroxietil)-N3-[1- (hidroximetil)ciclopropil]-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5- a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0204] Rt (Método B) 2,72 min, m/z 452/454 [M+H]+

[0205] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,08 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,73 (dd, J = 6,8, 2,6 Hz, 1H), 7,41 (ddd, J = 9,1, 4,4, 2,6 Hz, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 5,18 - 5,01 (m, 1H), 4,94 - 4,73 (m, 3H), 4,22 - 3,39 (m, 10H), 1,39 - 0,61 (m, 4H). Exemplo 11 N-(3-cloro-4-fluorofenil)-3-{8-oxa-4-azaspiro[2.6]nonano-4- carbonil}-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxamida

[0206] Rt (Método B) 2,95 min, m/z 448/450 [M+H]+

[0207] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,08 (s, 1H), 7,76 - 7,68 (m, 2H), 7,42 (ddd, J = 9,1, 4,4, 2,7 Hz, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 4,93 - 4,79 (m, 2H), 4,23 - 4,14 (m, 2H), 4,11 - 3,37 (m, 8H), 2,01 - 1,91 (m, 2H), 1,19 - 0,78 (m, 4H). Exemplo 12 N-(3-cloro-4-fluorofenil)-3-{7-oxa-4-azaspiro[2.6]nonano-4- carbonil}-4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-5-carboxamida

[0208] Rt (Método B) 2,95 min, m/z 448/450 [M+H]+

[0209] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,09 (s, 1H), 7,99 - 7,60 (m, 2H), 7,42 (ddd, J = 9,1, 4,4, 2,7 Hz, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 4,97 - 4,76 (m, 2H), 4,39 - 3,46 (m, 10H), 2,06 - 1,21 (m, 2H), 1,13-0,71 (m, 4H). Exemplo 13 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-metil-N3-(1-{[(2,2,2- trifluoroetil)amino]metil}ciclopropil)-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0210] Rt (Método A) 3,22 min, m/z 503/505 [M+H]+

[0211] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,09 (s, IB), 8,04 - 7,65 (m, 2H), 7,49 - 7,38 (m, 1H), 7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 4,99 - 4,72 (m, 2H), 4,28 - 3,66 (m, 4H), 3,30 - 2,55 (m, 8H), 1,33 - 0,61 (m, 4H). Exemplo 14 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-{1-[2- (difluorometoxi)etil]ciclobutil)-N3-metil-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0212] Rt (Método A2) 3,86 min, m/z 500/502 [M+H]+ Exemplo 15 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-{1-[2- (difluorometoxi)etil]ciclopentil}-N3-metil-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0213] Rt (Método A2) 4,01 min, m/z 514/516 [M+H]+ Exemplo 16 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-{4-[2- (difluorometoxi)etil]oxan-4-il}-N3-metil-4H,5H,6H,7H- pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0214] Rt (Método A2) 3,58 min, m/z 530/532 [M+H]+ Exemplo 17 N5-(3-cloro-4-fluorofenil)-N3-ciclopropil-N3,6-dimetil- 4H,5H,6H,7H-pirazolo[1,5-a]pirazina-3,5-dicarboxamida

[0215] Rt (Método A) 3,11 min, m/z 406/408 [M+H]+

[0216] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,99 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,74 (dd, J = 6,9, 2,6 Hz, 1H), 7,46 - 7,39 (m, 1H),

7,31 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 5,25 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 4,93 - 4,84 (m, 1H), 4,46 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 4,25 (dd, J = 12,9, 4,4 Hz, 1H), 4,14 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 3,13 - 3,04 (m, 1H), 2,96 (s, 3H), 1,12 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,84 - 0,75 (m, 2H), 0,69 - 0,51 (m, 2H). Ensaio de montagem de capsídeo bioquímico

[0217] A triagem para atividade efetora de montagem foi feita com base em um ensaio de extinção de fluorescência publicado por Zlotnick et al. (2007). A proteína de núcleo truncada de terminal C contendo 149 aminoácidos do domínio de montagem de terminal N fusionado a um único resíduo de cisteína na posição 150 e foi expressa em E. coli usando o sistema de expressão de pET (Merck Chemicals, Darmstadt). A purificação de proteína dimérica de núcleo foi realizada usando uma sequência de etapas de cromatografia por exclusão de tamanho. Resumindo, o pélete celular de 1 l de cultura BL21 (DE3) Rosetta2 que expressa a sequência de codificação de proteína de núcleo clonada Ndel/Xhol em plasmídeo de expressão pET21b foi tratado por 1 h em gelo com um tampão de lise nativa (Qproteome Bacterial Protein Prep Kit; Qiagen, Hilden). Após uma etapa de centrifugação, o sobrenadante foi precipitado durante 2 h de agitação em gelo com 0,23 g/ml de sulfato de amônio sólido. Após a centrifugação adicional, o pélete resultante foi resolvido em tampão A (100 mM Tris, pH 7,5; NaCl a 100 mM; DTT a 2 mM) e foi carregado subsequentemente em um tampão em uma coluna CaptoCore 700 equilibrada (GE Healthcare, Frankfurt). O fluxo de coluna contendo o capsídeo de HBV montado foi dialisado contra tampão N (NaHCO3 a 50 mM com pH 9,6; 5 mM de DTT) antes de a ureia ser adicionada a uma concentração final de 3 M para dissociar o capsídeo em dímeros de núcleo por 1,5 h em gelo. A solução proteica foi, então, carregada em uma coluna Sephaeril S300 de 1 l. Após a eluição com tampão, as frações contendo dímero de núcleo contendo frações foi identificado por SDS-PAGE e agrupado subsequentemente e dialisado contra HEPES a 50 mM com pH 7,5; DTT a 5 mM. Para aprimorar a capacidade de montagem dos dímeros centrais purificados, foi realizada uma segunda rodada de montagem e desmontagem que inicia com a adição de NaCl a 5 M e incluindo as etapas de cromatografia por exclusão de tamanho descritas acima. A partir da última etapa de cromatografia, as frações contendo dímero principal foram agrupadas e armazenadas em alíquotas em concentrações entre 1,5 a 2,0 mg/ml a -80 °C.

[0218] Logo antes da marcação, a proteína de núcleo foi reduzida ao adicionar DTT recentemente preparado em uma concentração final de 20 mM. Após 40 min de incubação em tampão de armazenamento em gelo e DTT foi removido com o uso de uma coluna Sephadex G-25 (GE Healthcare, Frankfurt) e HEPES a 50 mM, pH 7,5. Para a marcação, 1,6 mg/ml de proteína de núcleo foi incubada a 4 °C e no escuro durante a noite com maleimida BODIPY-FL (Invitrogen, Karlsruhe) em uma concentração final de 1 mM. Após a marcação, o corante livre foi removido por uma etapa de dessalinização adicional com o uso de uma coluna Sephadex G-25. Os dímeros de núcleo marcados foram armazenados em alíquotas a 4 °C. No estado dimérico o sinal de fluorescência da proteína de núcleo marcada é alto e é extinto durante a montagem dos dímeros de núcleo a altas estruturas de capsídeo moleculares. O ensaio de triagem foi realizado em placas de microtitulação de 384 poços pretas em um volume de ensaio total de 10 µl com o uso de HEPES a 50 mM, pH 7,5 e 1,0 a 2,0 µM de proteína de núcleo marcada. Cada composto de triagem foi adicionado em 8 concentrações diferentes com o uso de uma diluição em série de unidade de 0,5 log que inicia em uma concentração final de 100 µM, 31,6 µM ou 10 µM. Em qualquer caso, a concentração de DMSO por toda a placa de microtitulação foi 0,5 %. A reação de montagem foi iniciada pela injeção de NaCl a uma concentração final de 300 µM que induz o processo de montagem a aproximadamente 25 % do sinal extinto máximo. 6 min após o início da reação o sinal de fluorescência foi medido com o uso de um leitor de placa Clariostar (BMG Labtech, Ortenberg) com uma excitação de 477 nm e uma emissão de 525 nm. Como 100 % e 0 % de controle de montagem tampão HEPES que contém NaCl a 2,5 M e 0 M foi usado. Os experimentos foram realizados três vezes em triplicatas. Os valores de EC50 foram calculados por análise de regressão não linear usando o software Graph Pad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, EUA). Determinação de DNA de HBV dos sobrenadantes de células de HepAD38

[0219] A atividade anti-HBV foi analisada na linhagem celular transfectada estável HepAD38, que foi descrita por secretar altos níveis de partículas de vírion de HBV (Ladner et al., 1997). Resumindo, as células de HepAD38 foram cultivadas a 37 °C a 5 % de CO2 e 95 % de umidade em 200 µl de meio de manutenção, que foi meio Eagle modificado Dulbecco/Nutrient Mixture F-12 (Gibco, Karlsruhe), 10 % de soro fetal bovino (PAN Biotech Aidenbach) complementado com 50 µg/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco, Karlsruhe), L- glutamina a 2 mM (PAN Biotech, Aidenbach), 400 µg/ml de G418

(AppliChem, Darmstadt) e 0,3 µg/ml de tetraciclina.

As células foram subcultivadas uma vez por semana em razão de 1:5, mas normalmente não foram passadas mais que dez vezes.

Para o ensaio, 60.000 células foram semeadas em meio de manutenção sem qualquer tetraciclina em cada poço de uma placa de 96 poços e tratadas com diluições de meio log em série de composto de teste.

Para minimizar efeitos de borda, os 36 poços da placa não foram usados, mas foram preenchidos com meio de ensaio.

Em cada placa de ensaio seis poços para o controle de vírus (células não tratadas de HepAD38) e seis poços para o controle celular (células de HepAD38 tratadas com 0,3 µg/ml de tetraciclina) foram alocados, respectivamente.

Além disso, um conjunto de placas com referência a inibidores como BAY 41-4109, entecavir e lamivudina em vez de triar compostos foi preparada em cada experimento.

De modo geral, os experimentos foram realizados três vezes em triplicatas.

No dia 6 DNA de HBV de 100 µl de sobrenadante de cultura celular filtrada (Placa de Filtro AcroPrep Advance 96, 0,45 µM de membrana Supor, PALL GmbH, Dreieich) foram automaticamente purificadas no instrumento MagNa Pure LC com o uso do Kit de Volume Pequeno de DNA e NA Viral MagNA Pure 96 (Roche Diagnostics, Mannheim) de acordo com as instruções do fabricante.

Os valores EC50 foram calculados a partir de números relativos de cópias de DNA de HBV.

Resumindo, 5 µl dos 100 µl de eluato que contém DNA de HBV foram submetidos a Kit Principal de Sondas PCR LC480 (Roche) em conjunto com 1 µM de iniciador antissenso tgcagaggtgaagcgaagtgcaca, 0,5 µM de iniciador senso gacgtcctttgtttacgtcccgtc, 0,3 µM de hybprobes acggggcgcacctctctttacgcgg-FL e LC640-

ctccccgtctgtgccttctcatctgc-PH (TIBMolBiol, Berlin) a um volume final de 12,5 µl. O PCR foi realizado no sistema em tempo real Light Cycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim) com o uso do seguinte protocolo: Pré-incubação por 1 min a 95 °C, amplificação: 40 ciclos x (10 s a 95 °C, 50 s a 60 °C, 1 s a 70 °C), resfriamento por 10 s a 40 °C. A carga viral foi quantificada em relação a padrões conhecidos com o uso de DNA plasmidial de HBV de pCH-9/3091 (Nassal et al, 1990, Cell 63: 1357-1363) e o software LightCycler 480 SW 1.5 (Roche Diagnostics, Mannheim) e os valores EC50 foram calculados com o uso de regressão não linear com GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, EUA). Tabela 1: Bioquímica e atividades antivirais

[0220] Na Tabela 1, "+++" representa uma EC50 < 1 µM; "++" representa 1 µM < EC50 < 10 µM; "+" representa EC50 < 100 µM (Ensaio de atividade celular)

[0221] Na Tabela 1, "A " representa uma IC50 < 5 µM; "B" representa 5 µM < IC50 < 10 µM; "C" representa IC50 < 100 µM (Atividade de ensaio de montagem) Atividade Atividade de Exemplo CC50 (µM) Celular Montagem Exemplo 1 > 10 +++ A Exemplo 2 > 10 +++ A Exemplo 3 > 10 +++ A Exemplo 4 > 10 +++ A Exemplo 5 > 10 +++ A Exemplo 6 > 10 +++ A Exemplo 7 > 10 +++ A Exemplo 8 > 10 +++ A

Atividade Atividade de Exemplo CC50 (µM) Celular Montagem Exemplo 9 > 10 +++ A Exemplo 10 > 10 +++ A Exemplo 11 > 10 +++ A Exemplo 12 > 10 +++ A Exemplo 13 > 10 +++ A Exemplo 14 > 10 +++ A Exemplo 15 > 10 +++ A Exemplo 16 > 10 +++ A Exemplo 17 > 10 +++ A Ensaio de Viabilidade Celular

[0222] Com o uso do ensaio de viabilidade AlamarBlue a citotoxicidade foi avaliada em células de HepAD38 na presença de 0,3 µg/ml de tetraciclina, que bloqueia a expressão do genoma de HBV. A condição de ensaio e o projeto de placa foram em analogia ao ensaio anti-HBV, no entanto, outros controles foram usados. Em cada placa de ensaio, seis poços que contém células não tratadas de HepAD38 foram usadas como o controle de viabilidade de 100 %, e seis poços foram preenchidas com meio de ensaio apenas após serem usadas como controle de viabilidade de 0 %. Além disso, uma série de concentrações geométricas de ciclo-heximida que começa em concentração de final ensaio de 60 µM foi usada como controle positivo em cada experimento. Após período de seis dias de incubação, o reagente de viabilidade celular Alamar Blue Presto (ThermoFisher, Dreieich) foi adicionado em 1/11 de diluição a cada poço da placa de ensaio. Após uma incubação por 30 a 45 min a 37 °C, o sinal de fluorescência, que é proporcional ao número de células vivas, foi lido com o uso de um leitor de placa Tecan Spectrafluor Plus com um filtro de excitação de 550 nm e filtro de emissão 595 nm, respectivamente. Os dados foram normalizados em porcentagens do controle não tratado (100 % de viabilidade) e meio de ensaio (0 % de viabilidade) antes de os valores CC50 serem calculados com o uso de regressão não linear e o GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, EUA). Os valores de EC50 e CC50 médios foram usados para calcular o índice de seletividade (SI = CC50/EC50) para cada composto de teste. Modelos de eficácia in vivo

[0223] A pesquisa de HBV e o teste pré-clínico de agentes antivirais são limitados pelo tropismo de espécies e tecido curto do vírus, a paucidade de modelos de infecção disponíveis e as restrições impostas pelo uso de chimpanzés, os únicos animais completamente suscetíveis à infecção por HBV. Modelos animais alternativos tem como base o uso de hepadnavírus relacionados ao HBV e vários compostos antivirais forma testados em marmotas infectadas com vírus de hepatite de marmota (WHV) ou em patos infectados com vírus de hepatite B de pato (DHBV) ou em macaco lanoso HBV (WM- HBV) tupaia infectado (visão geral em Dandri et al., 2017, Best Pract Res Clin Gastroenterol 31, 273-279). No entanto, o uso de substitutos de vírus possui diversas limitações. Por exemplo, a homologia de sequência entre o DHBV e o HBV mais distantemente relacionada é apenas cerca de 40 % e é por isso que os modificadores de montagem de proteína de núcleo da família HAP parecem inativos em DHBV e WHV, mas suprimiram eficientemente HBV (Campagna et al, 2013, J. Virol 87, 6931-6942). Os camundongos não são permissivos de HBV,

mas esforços grandes foram focados no desenvolvimentos de modelos de camundongo de replicação e infecção de HBV, como a geração de camundongos transgênicos para o HBV humano (camundongos tg HBV), a injeção hidrodinâmica (HDI) de genomas de HBV em camundongos ou a geração de camundongos que têm fígados humanizados e/ou sistemas imunológicos humanizados e a injeção intravenosa de vetores virais com base em adenovírus que contêm genomas de HBV (Ad-HBV) ou o vírus adenoassociado (AAV-HBV) em camundongos competentes imunes (visão geral em Dandri et al., 2017, Best Pract Res Clin Gastroenterol 31, 273-279). Com o uso de camundongos transgênicos para o genoma de HBV completo, a capacidade de hepatócitos murinos para produzir vírions de HBV infecciosos pode ser demonstrada (Guidotti et al, 1995, J. Virol., 69: 6158-6169). Visto que camundongos transgênicos são imunologicamente tolerantes a proteínas virais e nenhum dano ao fígado foi observado em camundongos que produzem HBV, esses estudos demonstraram que o próprio HBV não é citopático. Camundongos transgênicos de HBV foram empregados para testar a eficácia de vários agentes anti-HBV, como os inibidores de polimerase e modificadores de montagem de proteína de núcleo (Weber et al., 2002, Antiviral Research 54 69-78; Julander et al, 2003, Antivir. Res., 59: 155- 161), provando, assim, que camundongos transgênicos de HBV são bem adequados para muitos tipos de teste antiviral pré-clínico in vivo.

[0224] Como descrito em Paulsen et al., 2015; PLOSone, 10: eO 144383, camundongos transgênicos com HBV (Tg [HBV1.3 fsX'3’5’]) que carregam uma mutação por mudança de matriz de leitura (GC) na posição 2916/2917 poderiam ser usados para demonstrar atividade antiviral de modificadores de montagem de proteína de núcleo in vivo.

Resumindo, os camundongos transgênicos com HBV foram verificados quanto a DNA específico de HBV no soro por qPCR antes dos experimentos (consultar a seção “Determinação de DNA de HBV a partir dos sobrenadantes de células de HepAD38”). Cada grupo de tratamento consistiu em cinco animais machos e cinco animais fêmeas de aproximadamente 10 semanas de idade com um titulador de 107-108 vírions por ml de soro.

Os compostos foram formulados como uma suspensão em um veículo adequado, como 2 % de DMSO / 98 % de tilose (0,5 % de Metilcelulose / 99,5 % de PBS) ou 50 % de PEG400 e administrados por os aos animais uma a três vezes/dia por um período de 10 dias.

O veículo serviu como controle negativo, enquanto 1 µg/kg de entecavir em um veículo adequado foi o controle positivo.

O sangue foi obtido por amostragem sanguínea retrobulbar com o uso de um Vaporizador de Isoflurano.

Para a coleta de perfuração cardíaca terminal seis horas após o último sangue e órgãos de tratamento, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e subsequentemente sacrificados por exposição a CO2. As amostras sanguíneas retrobulbares (100-150 µl) e de punção cardíaca (400-500 µl) foram coletadas em um Microvette 300 LH ou Microvette 500 LH, respectivamente, seguido por separação de plasma através de centrifugação (10 min, 2000 g, 4 °C). Tecido hepático foi coletado e congelado rapidamente em N2 líquido.

Todas as amostras foram armazenadas a -80 °C até o uso adicional.

O DNA viral foi extraído de 50 µl de plasma ou 25 mg de tecido hepático e eluído em 50 µl de tampão de AE (plasma) com o uso do Kit de Sangue e Tecido DNeasy 96 (Qiagen, Hilden) ou 320 µl de tampão de AE (tecido hepático) com o uso do Kit de Tecido DNeasy (Qiagen, Hilden) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA viral eluído foi submetido a qPCR com o uso do kit PCR Principal de Sondas LightCycler 480 (Roche, Mannheim) de acordo com as instruções do fabricante para determinar o número de cópias de HBV. Os iniciadores específicos de HBV usados incluíram o iniciador direto 5’- CTG TAC CAA ACC TTC GGA CGG-3’, o iniciador reverso 5’- AGG AGA AAC GGG CTG AGG C-3’ e a sonda marcada com FAM FAM-CCA TCA TCC TGG GCT TTC GGA AAA TT-BBQ. Uma amostra de reação de PCR com um volume total de 20 µl continha 5 µl de eluato de DNA e 15 µl de mistura principal (compreendendo 0,3 µM do iniciador direto, 0,3 µM do iniciador reverso, 0,15 µM da sonda marcada com FAM). qPCR foi executado no Roche LightCycler 1480 com o uso do seguinte protocolo: Pré- incubação por 1 min a 95 °C, amplificação: (10 s a 95 °C, 50 s a 60 °C, 1 s a t 70 °C) x 45 ciclos, resfriamento por 10 s a 40 °C. Curvas padrão foram geradas como descrito acima. Todas as amostras foram testadas em duplicata. O limite de detecção do ensaio é ~50 de cópias de DNA de HBV (usando padrões que variam de 250-2,5 x 107 de números de cópia). Os resultados são expressos como cópias de DNA de HBV/10 µl de plasma ou cópias de DNA de HBV/100 mg de DNA hepático total (normalizado como controle negativo).

[0225] Mostrou-se, em múltiplos estudos, que não apenas camundongos transgênicos são um modelo adequado para comprovar a atividade antiviral das novas entidades químicas in vivo, o uso de injeção dinâmica de genomas de HBV em camundongos bem como o uso de camundongos quiméricas com fígado humano imunodeficientes infectados com soro de paciente positivo de HBV também foram usados frequentemente para perfilar fármacos que alvejam HBV (Li et al, 2016, Hepat.

Mon. 16: e34420; Qiu et al., 2016, J.

Med.

Chem. 59: 7651-7666; Lutgehetmann et al., 2011, Gastroenterology, 140: 2074-2083). Além disso, a infecção por HBV crônica também foi estabelecida com sucesso em camundongos imunocompetentes ao inocular baixas doses de adenovírus (Huang et al, 2012, Gastroenterology 142: 1447-1450) ou vírus adenoassociado (AAV) contendo genoma de HBV (Dion et al., 2013, J Virol. 87: 5554-5563). Esses modelos também poderiam ser usados para demonstrar a atividade antiviral in vivo de agentes anti-HBV inovadores.

Claims (8)

REIVINDICAÇÕES

1. Composto da Fórmula II caracterizado pelo fato de que - R1 é fenila ou piridila, opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes por halo, C1-C4-alquila, C3-C6-cicloalquila, C1-C4-haloalquila ou C≡N - R2 é H ou metila - R3 é C1-C4 alquila, em que a dita C1-C4-alquila é não substituída ou substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com deutério, OH ou halo - R4 é selecionado a partir do grupo que compreende C1- C2-alquil-O-C1-C4-alquila, C1-C2-hidroxialquila, C1- C2-alquil-O-C1-C4-haloalquila, C1-C2-alquil-NH-C1-C4- haloalquila, C1-C2-alquil-O-C3-C6-cicloalquila, C1-C2- alquil-S-C1-C4-alquila, C1-C2-alquil-SO2-C1-C4- alquila, C1-C2-alquil-C≡N, C1-C2-alquil-C3-C7- heterocicloalquila, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C3-C7- cicloalquil)NH2, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C1-C6- alquil)NH2, arila e heteroarila, em que arila ou heteroarila é opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com halo ou C1-C6 alquila - R3 e R4 são opcionalmente conectados para formar um anel heterocíclico de cinco, seis ou sete membros, em que o dito anel heterocíclico é não substituído ou substituído uma vez, duas vezes ou três vezes com halo, OH, carbóxi, OCF3, OCHF2 ou C≡N - X é O, CH2 ou NR5 - m é 0, 1, 2 ou 3 - R5 é H ou C1-C4-alquila ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato ou um hidrato de um composto da Fórmula II ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um pró-fármaco de um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um solvato ou um hidrato do mesmo.

2. Composto da Fórmula II, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que - R1 é fenila ou piridila, opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes por halo, C1-C4-alquila, C3-C6-cicloalquila, C1-C4-haloalquila ou C≡N - R2 é H ou metila - R3 é C1-C4 alquila, em que a dita C1-C4-alquila é não substituída ou substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com deutério ou halo - R4 é selecionado a partir do grupo que compreende C1-

C2-alquil-O-C1-C4-alquila, C1-C2-hidroxialquila, C1- C2-alquil-O-C1-C4-haloalquila, C1-C2-alquil-O-C3-C6- cicloalquila, C1-C2-alquil-S-C1-C4-alquila, C1-C2- alquil-SO2-C1-C4-alquila, C1-C2-alquil-C≡N, C1-C2- alquil-C3-C7-heterocicloalquila, C1-C2-alquil-O- C(=O)(C3-C7-cicloalquil)NH2, C1-C2-alquil-O-C(=O)(C1- C6-alquil)NH2, arila e heteroarila, em que arila ou heteroarila é opcionalmente substituída uma vez, duas vezes ou três vezes com halo ou C1-C6 alquila - R3 e R4 são opcionalmente conectados para formar um anel heterocíclico de cinco, seis ou sete membros, em que o dito anel heterocíclico é não substituído ou substituído uma vez, duas vezes ou três vezes com halo, OH, carbóxi, OCF3, OCHF2 ou C≡N - X é O, CH2 ou -NR5 - m é 0, 1 ou 2 - R5 é H ou C1-C4-alquila ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato ou um hidrato de um composto da Fórmula II ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um pró-fármaco de um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um solvato ou um hidrato do mesmo.

3. Composto da Fórmula II, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a arila é C6-arila e/ou heteroarila é C1-C9-heteroarila, e em que heteroarila e heterocicloalquila têm, cada uma, 1 a 4 heteroátomos cada um independentemente selecionado a partir de N, O e S, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato ou um hidrato de um composto da Fórmula II ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um pró-fármaco de um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um solvato ou um hidrato do mesmo.

4. Composto da Fórmula II, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato ou um hidrato de um composto da Fórmula II ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um pró-fármaco de um composto da Fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um solvato ou um hidrato do mesmo, caracterizado pelo fato de que o pró-fármaco é selecionado a partir do grupo que compreende ésteres, carbonatos, derivados de acetilóxi, derivados de aminoácido e derivados de fosforamidato.

5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato ou um hidrato do dito composto ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um pró-fármaco do dito composto ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um solvato ou um hidrato do mesmo, caracterizado por ser para uso na prevenção ou no tratamento de uma infecção por HBV no indivíduo.

6. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato ou um hidrato do dito composto ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um pró-fármaco do dito composto ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um solvato ou um hidrato do mesmo, juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável.

7. Método de tratamento de uma infecção por HBV em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um solvato ou um hidrato do dito composto ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um pró-fármaco do dito composto ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um solvato ou um hidrato do mesmo.

8. Método para a preparação de um composto da Fórmula II conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado por ser pela reação de um composto da Fórmula III em que R1 é conforme definido na reivindicação 1, com um composto da Fórmula IV em que R2, R3, R4, X e m são conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.