BR112021003093A2

BR112021003093A2 - tratamento de câncer de mama triplo negativo que visa a inibição de tgf-beta

Info

Publication number: BR112021003093A2
Application number: BR112021003093-0A
Authority: BR
Inventors: George Locke; Isabelle Dussault
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2018-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2021-05-11
Also published as: EP3840776A4; JP2021534195A; AU2019325593A1; CN113271962A; CA3110276A1; WO2020041607A1; SG11202101663WA; MX2021002006A; KR20210046716A; US20210196822A1; IL280958A; EP3840776A1

Abstract

A presente invenção refere-se, de modo geral, a métodos para o tratamento de um paciente diagnosticado com câncer de mama triplo negativo (TNBC), que envolve identificar um paciente provável de responder ao tratamento por meio da inibição de TGF-ß visada com um agente anti-TGFß, e tratar o indivíduo com o agente anti-TGFß.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "TRATAMENTO DE CÂNCER DE MAMA TRIPLO NEGATIVO QUE VISA A INIBIÇÃO DE TGF-BETA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de, e prioridade para, o Pedido de Patente Provisional Norte-americano No. 62/721.249, depositado em 22 de agosto de 2018, a íntegra das descrições do qual é aqui incorporada por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] O pedido inteiro contém uma Listagem de Sequência que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorporada por referência em sua íntegra. A referida cópia ASCII, criada em 27 de junho de 2019, é denominada EMD-009WO_SL_ST25.txt e é de 99,098 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se geralmente a métodos para o tratamento de um indivíduo diagnosticado com câncer de mama triplo negativo (TNBC), envolvendo a identificação de um indivíduo que provavelmente responderá ao tratamento por meio de inibição de TGF- β alvo com um agente anti-TGF-β, e tratamento do indivíduo com o agente anti-TGFβ.

ANTECEDENTES

[004] TNBC é um grupo heterogêneo de tumores de câncer de mama que geralmente é diagnosticado por meio da imunoistoquímica para tumores que não expressam receptor de estrogênio (ER) e receptor de progesterona (PR), e não superexpressor receptor de fator de crescimento epidérmico de hormônio 2 (HER-2). O TNBC é um tipo agressivo de câncer associado a um mau prognóstico. Visto que as células tumorais não são portadoras dos receptores necessários, tratamentos comuns como terapia hormonal e medicamentos que visam estrogênio, progesterona e HER-2 são ineficazes. A doxorrubicina é um agente padrão de tratamento de danos ao DNA usado no tratamento de um hospedeiro de malignidades, incluindo TNBC localmente avançado e recorrente ou metastático; a resposta à doxorrubicina é desanimadora em comparação com outros tipos de câncer de mama.

[005] Recentes esforços recentes para melhorar a terapia para TNBC focaram na classificação do tipo de tumor TNBC de acordo com 4 (Lehmann, J. Clin. Invest. (2011) 121: 2750-2767) ou 6 (Burstein, Clin. Canc. Res. (2014) 21: 1688-1698) subtipos: BL1 (tipo basal 1), BL2 (tipo basal 2), LAR (receptor de androgênio luminal), M (mesenquimal), IM (imunomodulador) e MSL (semelhante ao tronco mesenquimal) com base em perfis de expressão gênica. Uma método promissor é o uso de inibidores de PARP em pacientes com mutações BRCA1/2, um grupo de pacientes que constitui 10-20% dos pacientes de TNBC. Este subgrupo de pacientes se enquadra no subtipo BL1 para o qual outras terapias também foram sugeridas, como inibidores de CDK e taxanos. O subtipo BL2 (22% de TNBC) inclui genes enriquecidos para sinalização do fator de crescimento, o que sugere que os inibidores do fator de crescimento (incluindo inibidores da cinase) são terapias potenciais para este grupo. Os subtipos LAR, como o próprio nome indica, contém o gene do receptor de androgênio e, portanto, os antiandrogênios são terapias potenciais no grupo. Fármacos que se direcionam às vias mesenquimais, tal como inibidores de c-Met, inibidores de TGFβ e inibidores de Wnt, foram propostos como potenciais terapias para o subtipo M. Finalmente, os inibidores do ponto de verificação (CPI) podem ser boas escolhas para o grupo IM, que é enriquecido para genes envolvidos em processos imunológicos. Muitos agentes terapêuticos alvo estão sendo submetidos a testes clínicos, na maioria das vezes em pacientes de TNBC não selecionados.

[006] No entanto, a aplicação da medicina de precisão ao TNBC tem sido limitada até agora pela falta de biomarcadores pareados e terapia direcionada associada. Embora os subtipos de TNBC tenham sido descritos na literatura, os ensaios clínicos direcionados a biomarcadores prospectivos ainda são incomuns nessa doença. A identificação de subgrupos de pacientes que mostram sensibilidade a um tratamento específico pode resultar em um tratamento mais eficaz para os pacientes com biomarcador positivo, evitando o tratamento desnecessário (e seus potenciais efeitos colaterais) para os pacientes com biomarcador negativo. Essa terapia direcionada poderia melhorar as escolhas terapêuticas para o pacientes de TNBC. A presente invenção identifica biomarcadores associados à resposta a bloqueadores de TGFβ e/ou CPI. Prevê-se que os pacientes com biomarcador positivo têm maior probabilidade de respondedor à terapia do que os pacientes com biomarcador negativo.

[007] Publicação do pedido de patente Norte-americano número US 20150225483A1, incorporado aqui por referência, descreve uma proteína de fusão bifuncional que combina um anticorpo anti-Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1) com o domínio extracelular solúvel do receptor tipo II beta do fator de crescimento tumoral (TGFβRII) como uma "TRAP" neutralizante de TGFβ em uma única molécula. Especificamente, a proteína é um heterotetrâmero, consistindo nas duas cadeias leves de imunoglobulina de anti-PD-L1, e duas cadeias pesadas compreendendo a cadeia pesada do anti-PD-L1 geneticamente fundidas através de um ligante de glicina-serina flexível ao domínio extracelular do TGFpRII humano (ver FIG. 1). Esta molécula TRAP anti-PD-L1/TGFβ é projetada para atingir dois mecanismos principais de imunossupressão no microambiente tumoral. A publicação do pedido de patente Norte-americana número US 20150225483A1 descreve a administração da molécula TRAP em doses com base no peso do paciente.

[008] A presente invenção fornece métodos para o tratamento de um indivíduo diagnosticado comTNBC, no qual o indivíduo foi primeiro determinado ter um nível de expressão aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) e/ou proteína EVI1 de locus complexo MDS1 e EVI1 (MECOM) com relação a um nível de expressão de controle conhecido, e em seguida administrando proteína TRAP anti- PD-L1/TGFβ ao indivíduo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Para um tratamento eficaz de pacientes diagnosticados com TNBC, a presente invenção fornece um regime terapêutico que trata TNBC em pacientes determinados ter um nível de expressão aumentado de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de expressão conhecido, e melhora o prognóstico da doença e sobrevivência geral de pacientes de TNBC.

[0010] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou controle de TNBC em um indivíduo por administração de um agente anti-TGFβ a um indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo de MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente, e desse modo tratando TNBC no indivíduo.

[0011] Em outro aspecto, a presente invenção fornece método de obter pelo menos uma resposta parcial em tratamento ou aumento da sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC) por administração de um agente anti-TGFβ a um indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou locus complexo MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial em tratamento ou aumento da sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC).

[0012] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de identificação de um indivíduo adequado para o tratamento ou controle de TNBC no indivíduo com um agente anti-TGFβ, o método compreendendo determinar o nível de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou locus complexo MDS1 e EVI1 (MECOM) no indivíduo, em que um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM no indivíduo, relativo a um nível de controle conhecido correspondente, identifica o indivíduo como adequado para o tratamento de TNBC com o agente anti-TGFβ.

[0013] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de duas etapas de tratamento ou controle de TNBC em um indivíduo, no qual a primeira etapa envolve a identificação de um indivíduo que tem um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente, e a segunda etapa envolve a administração de um agente anti-TGFβ ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de HMGA2 ou MECOM, e desse modo tratando TNBC no indivíduo.

[0014] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de duas etapas de obtenção de pelo menos a resposta parcial em tratamento ou aumento da sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC), no qual a primeira etapa envolve a identificação de um indivíduo que tem um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente, e a segunda etapa envolve a administração de um agente anti-TGFβ ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de HMGA2 ou MECOM, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial em tratamento ou aumento da sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC).

[0015] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de identificação de um individuo responsivo ao tratamento de TNBC no indivíduo com um agente anti-TGFβ, no qual o nível de HMGA2 ou MECOM no indivíduo é determinado, e em que um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM no indivíduo, relativo a um nível de controle conhecido correspondente, identifica o indivíduo como adequado para o tratamento de TNBC com o agente anti-TGFβ.

[0016] Em cada um dos métodos da presente invenção, o nível de HMGA2 ou MECOM do indivíduo é determinado por análise de uma amostra de tecido do paciente. Em certas modalidades, a amostra de tecido é uma amostra de biópsia, amostra de sangue, soro, ou plasma.

[0017] Em cada um dos métodos da presente invenção, o nível de HMGA2 ou MECOM é determinado por imunoquímica ou por análise de expressão de RNA.

[0018] Em algumas modalidades, o agente anti-TGFβ é uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ usada no tratamento de pacientes de TNBC, compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo: (a) pelo menos uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga à proteína humana Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1); e (b) Receptor II de Fator β de Crescimento Transformante (TGFβRII), ou um fragmento do mesmo, capaz de se ligar ao Fator β de Crescimento Transformante (TGFβ), e um segundo polipeptídeo compreendendo pelo menos uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-L1; em que a cadeia pesada do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve do segundo polipeptídeo, quando combinadas, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga à PD- L1. Em algumas modalidades, uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ compreende aprimeiro polipeptídeo compreendendoas sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40. Em algumas modalidades, uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ compreende um primeiro polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e o segundo polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[0019] Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados pelo menos 1200 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados pelo menos 1800 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados1800 mg a 3000 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 1200 mg a 2400mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[0020] Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 1200 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 1200 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ, uma vez a cada duas semanas.

[0021] Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 1800 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas.

[0022] Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 2400 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 2400 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 2100 mg ou 3000 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas.

[0023] Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão aumentada de HMGA2 é de pelo menos 2,0 vezes, por exemplo, 2,27 mais do que uma média de população conhecida entre os pacientes de TNBC. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 2 a 5 vezes maior do que o nível médio de população conhecido de expressão de HMGA2. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais do que o nível normal de expressão de HMGA2. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão aumentada de HMGA2 no indivíduo é pelo menos 19 a 35 vezes maior do que a expressão de HMGA2 em um indivíduo que não é responsivo a um tratamento com um agente anti-TGFβ. Em algumas modalidades, o nível de expressão do gene HMGA2 é medido pela quantificação da transcrição de mRNA de HMGA2 normalizado para genes ou genes de manutenção. A transcrição de mRNA de HMGA2 e o gene ou genes de manutenção são quantificados por métodos quantitativos de RNA, tal como PCR de transcrição reversa quantitativa. O gene ou genes de manutenção são aqueles que têm expressão relativamente constante entre a população alvo.

[0024] Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão MECOM aumentada é de pelo menos 1,5 vez mais do que uma média de população conhecida entre os pacientes de TNBC. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão MECOM aumentada é de pelo menos 1,5 a 4 vezes mais do que a média da população conhecida entre os pacientes de TNBC.

[0025] Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão MECOM aumentada é de pelo menos 100%, pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais do que o nível normal de expressão MECOM.

[0026] Determinação de mRNA pode ser de tecido de tumor ou células de tumor circulante, ou mRNA de tumor circulante. O mRNA será usado para detectar a alta expressão dos genes HMGA2 ou MECOM. Alta expressão pode ser considerada como células de tumor expressando o nível acima de um determinado nível de referência por PCR ou outras tecnologias que quantificam a expressão de mRNA.

[0027] Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, as expressões de HMGA2 ou MECOM aumentadas são determinadas por meio da quantificação do mRNA de HMGA2 e MECOM, respectivamente. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, os níveis de mRNA de HMGA2 ou mRNA de MECOM são determinados por meio de ensaio de reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-qPCR). Em certas modalidades, os níveis de mRNA de HMGA2 ou mRNA de MECOM são determinados por meio de PCR de gota digital (ddPCR). Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, as expressões de HMGA2 ou MECOM aumentadas são determinadas por meio da quantificação da proteína HMGA2 e MECOM, respectivamente. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, os níveis de proteína HMGA2 ou proteína MECOM aumentados são determinados por meio da imunoistoquímica. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção,mais do que 1% de células tumorais (por exemplo, mais do que 5%, mais do que 10%, mais do que 15%, ou mais do que 20%) expressando a proteína HMGA2 em uma amostra de tecido obtida do indivíduo de TNBC determinado o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2 . Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, mais do que 1% de células tumorais (por exemplo, mais do que 5%, mais do que 10%, mais do que 15%, ou mais do que 20%) expressando a proteína MECOM em uma amostra de tecido obtida do indivíduo de TNBC determinado o nível de expressão de proteína MECOM aumentado.

[0028] Outras modalidades e detalhes da invenção são apresentados aqui abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0029] FIG. 1 é um desenho esquemático de uma molécula TRAP anti- PD-L1/TGFβ incluindo um anticorpo anti-PD-L1 fundido a dois domínios extracelulares (ECDs) de Receptor II de TGFβ por meio de um ligante (Gly4Ser)4Gly (SEQ ID NO: 11).

[0030] FIG. 2A é um gráfico de caixas mostrando resultados para HMGA2 a partir do estudo descrito no Exemplo 1. os níveis de expressão de HMGA2 são plotados contra a resposta à proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. TPM = transcrições por milhão; PD = doença progressiva; SD = doença estável; PR = resposta parcial. Alta expressão de HMGA2 é considerada como o nível de expressão pelo menos tão alto quanto a menor expressão de HMGA2 entre pacientes que respondem ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[0031] FIG. 2B é um histograma da distribuição de expressão de HMGA2 em câncer de mama na base de dados TCGA. TPM = transcrições por milhão; NE = não avaliável. Os dados de NE foram excluídos do teste de hipótese.

[0032] FIG. 3A é um histograma da distribuição de expressão de MECOM em câncer de mama na base de dados TCGA. TPM = transcrições por milhão; NE = não avaliável. Alta expressão de MECOM é considerada como o nível de expressão pelo menos tão alto quanto a menor expressão de MECOM entre pacientes que respondem ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[0033] FIG. 3B é um gráfico de caixas mostrando resultados para MECOM a partir do estudo descrito no Exemplo 1. Os níveis de expressão de MECOMsão plotados contra a resposta à proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. TPM = transcrições por milhão; PD = doença progressiva; SD = doença estável; PR = resposta parcial. Alta expressão de MECOM é considerada como o nível de expressão pelo menos tão alto quanto a menor expressão de MECOM entre pacientes que respondem ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[0034] FIGs. 4A-D mostram os gráficos de caixa de log-TPM de diversos biomarcadores preditivos potenciais plotados quanto ao status de resposta de pacientes tratados com a proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ. A FIG. 4A mostra um gráfico de caixa de log-TPM de HMGA2 traçado quanto ao status de resposta de pacientes tratados com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 4B mostra um gráfico de caixa de log-TPM de MECOM traçado quanto ao status de resposta de pacientes tratados com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 4C mostra um gráfico de caixa de log-TPM de CLEC3A traçado quanto ao status de resposta de pacientes tratados com a proteína TRAP anti-PD-

L1/TGFβ. FIG. 4D mostra um gráfico de caixa de log-TPM de CCNDBP1 traçado quanto ao status de resposta de pacientes tratados com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. (Abreviações usadas nas figuras: NE (não avaliável), PD = doença progressiva; SD = doença estável; PR = resposta parcial).

[0035] FIGs. 5A-F são gráficos de dispersão mostrando a associação entre HMGA2 e genes núcleo de sinalização de TGF-β selecionados. A FIG. 5A é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e expressão de Tgfbr1. A FIG. 5B é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e Tgfbr2. FIG. 5C é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e expressão de Smad3. A FIG. 5D é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Tgfb1. A FIG. 5E é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Tgfb2. A FIG. 5F é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Tgfb3.

[0036] As FIGs. 6A-F são gráficos de dispersão mostrando a associação entre HMGA2 e genes alvo de sinalização de TGF-β selecionados. A FIG. 6A é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Col1a1. A FIG. 6B é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Col1a2. FIG. 6C é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Fn1. FIG. 6D é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Vim. FIG. 6E é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Vegfa. FIG. 6F é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Zeb1.

[0037] A FIG. 7A é um gráfico mostrando a expressão de Tgfbr1 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 7B é um gráfico mostrando a expressão de Tgfbr2 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 7C é um gráfico mostrando a expressão de Smad3 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti- PD-L1/TGFβ. A FIG. 7D é um gráfico mostrando a expressão de Tgfb1 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 7E é um gráfico mostrando a expressão de Tgfb2 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 7F é um gráfico mostrando a expressão de Tgfb3 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti- PD-L1/TGFβ.

[0038] A FIG. 8A é um gráfico mostrando a expressão de HMGA2 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 8B é um gráfico mostrando a expressão de Col1a1 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 8C é um gráfico mostrando a expressão de Col1a2 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti- PD-L1/TGFβ. A FIG. 8D é um gráfico mostrando a expressão de Fn1 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 8E é um gráfico mostrando a expressão de Vim em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 8F é um gráfico mostrando a expressão de Vegfa em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti- PD-L1/TGFβ. A FIG. 8G é um gráfico mostrando a expressão de Zeb1 em grupos de animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ.

[0039] A FIG. 9A é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de lfng. A FIG. 9B é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Gzmb. A FIG. 9C é um gráfico de dispersão mostrando a associação entre a expressão de HMGA2 e a expressão de Gzmk. A FIG. 9D é um gráfico mostrando a expressão de Ifng em animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 9E é um gráfico mostrando a expressão de Gzmb em animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 9F é um gráfico mostrando a expressão de Gzmk em animais tratados com o controle, controle de TRAP, TRAP anti-PD-L1, e anti-PD-L1/TGFβ. .

[0040] A FIG. 10 é um gráfico de caixas mostrando a expressão de HMGA2 (em log-TPM (transcrição por milhão) e status de TNBU de indivíduos.

[0041] A FIG. 11 mostra a expressão de HMGA2 (em TPM) versus resposta em painéis separados para indivíduos não-TNBC (esquerda) e TNBC (direita). [Abreviações usadas na figura: NE: não avaliável; PD: doença progressiva; SD: doença estável; PR: resposta parcial; CR: resposta completa; METBRC: câncer de mama metastático; TPM: transcrição por milhão para o gene HMGA2].

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0042] Por Receptor II "TGFβRII" ou "TGFβ" entende-se um polipeptídeo tendo a sequência de Isoforma A Tipo 2 de Receptor TGFβ humano tipo selvagem (por exemplo, a sequência de aminoácido de Sequência de Referência NCBI (RefSeq) Acesso No. NP_001020018 (SEQ ID NO: 8)), ou um polipeptídeo tendo a sequência de Isoforma B Tipo 2 de Receptor TGFβ humano tipo selvagem (por exemplo, a sequência de aminoácido de RefSeq NCBI Acesso No. NP_003233 (SEQ ID NO: 9)) ou tendo uma sequência substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou de SEQ ID NO: 9. O TGFβRII pode reter pelo menos 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 35%, 50%, 75%, 90%, 95%, ou 99% da atividade de ligação a TGFβ da sequência tipo selvagem. O polipeptídeo de TGFβRII expresso não possuia sequência sinal.

[0043] Por um "fragmento de TGFβRII capaz de se ligar ao TGFβ" entende-se qualquer porção de RefSeq NCBI Acesso No. NP_001020018 (SEQ ID NO: 8) ou of RefSeq NCBI Acesso No. NP_003233 (SEQ ID NO: 9), ou uma sequência substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9 que é de pelo menos 20 (por exemplo, pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 175, ou 200) aminoácidos de comprimento que retém pelo menos um pouco da atividade de ligação a TGFβ (por exemplo, pelo menos 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 35%, 50%, 75%, 90%, 95%, ou 99%) do receptor tipo selvagem ou do correspondente fragmento tipo selvagem. Tipicamente tal fragmeto é um fragmento solúvel. Um tal fragmento exemplar é um domínio extracelular de TGFβRII tendo a sequência de SEQ ID NO: 10.

[0044] "PD-L1 alta" ou "alta PD-L1" refere-se a ≥ 80% de células de tumor positivas para PD-L1 como determinado pelo ensaio de PD-L1 IHC 73-10 (Dako), ou pontuação da proporção de tumor (TPS) ≥ 50% como determinado pelo Dako ensaio IHC 22C3 PharmDx (TPS é um termo de arte relacionada com o ensaio IHC 22C3 PharmDx, que descreve a percentagem de células de tumor viáveis com manchamento de membrana parcial ou completo (por exemplo, manchamento para PD-L1)). Ambos os ensaios IHC 73-10 e IHC 22C3 selecionam uma população de pacientes semelhante em seus respectivos pontos de corte. Em certas modalidades, ensaio VENTANA PD-L1 (SP263), que tem alta concordância com 22C3 PharmDx assay (veja Sughayer et al., Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol., (2018)), pode também ser usado para determinar alto nível de expressão de PD-L1.

[0045] "PD-L1 positivo" ou "PD-L1+" indica TPS ≥ 1% de células de tumor positivas para PD-L1 como determinado, por exemplo, pelo ensaio Dako PD-L1 IHC 22C3 PharmDx.

[0046] Por "substancialmente idêntico"entende-se um polipeptídeo exibindo pelo menos 50%, desejavelmente 60%, 70%, 75%, ou 80%, mais desejavelmente 85%, 90%, ou 95%, e ainda mais desejado 99% de identidade de sequência de aminoácico para uma sequência de aminoácido de referência. O comprimento de sequências de comparação geralmente será de pelo menos 10 amino acids, desejavelmente pelo menos 15 aminoácidos contíguos, mais desejavelmente pelo menos 20, 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300, ou 350 aminoácidos contíguos, e ainda mais desejado a sequência de aminoácido de tamanho natural.

[0047] Por "paciente" entende-se um animal humano ou não humano (por exemplo, um mamífero). "Paciente," "indivíduo," "paciente em necessidade do mesmo," e "indivíduo em necessidade do mesmo" são usados alternadamente na presente descrição, e refere-se a um organismo vivo sofrendo de, ou propenso a, uma doença ou condição que pode ser tratado por administração usando os métodos e compositições fornecidos na presente invenção.

[0048] Os termos "tratar," "tratando," ou "tratamento," e outros equivalentes gramaticaiscomo usado na presente descrição, incluem aliviar, abater, melhorar, ou prevenir uma doença, condição ou sintomas, prevenindo sintomas adicionais, melhorando ou prevenindo as causas metabólicas subjacentes de sintomas, innibindo a doença ou condição, por exemplo, interrompendo o desenvolvimento da doença ou condição, aliviando a doença ou condição, causando a regressão da doença ou condição, aliviando a condição causada pela doença ou condição, ou interrompendo os sintomas da doença ou condição, e destinam-se a incluir a profilaxia. Os termos também incluem a obtenção de um benefício terapêutico e/ou um benefício profilático. Por benefício terapêutico entende-se erradicação ou melhora do distúrbio subjacente que está sendo tratado. Além disso, um benefício terapêutico é obtido com a erradicação ou melhora de um ou mais dos sintomas fisiológicos associados com o distúrbio subjacente de modo que uma melhora seja observada no paciente, não obstante, o paciente ainda pode sofrer do distúrbio subjacente.

[0049] O termo "consolidação" no contexto de um regime terapêutico da presente invenção é usado como é comumente entendido na técnica. Por exemplo, de acordo com o National Cancer Institute, o termo "terapia de consolidação" é um "tratamento [t] que é feito após o câncer ter desaparecido após a terapia inicial. Terapia de consolidação é usada para matar quaisquer células de câncer que podem ser deixadas no corpo. Ela pode incluir terapia de radiação, um transplante de célula tronco, ou tratamento com fármacos que matam células de câncer. Também chamada terapia de intensificação e terapia após a remissão." https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer- terms/def/consolidação-therapy, última visita em 9 de junho de 2018.

[0050] O termo "sobrevivência livre de progressão" ou PFS é definido como o tempo de randomização (que pode ocorrer 6 ou mais semanas após o início do tratamento) até a data do primeiro evento documentado de progressão do tumor ou morte na ausência de progressão da doença. O termo "sobrevivência geral" é definido como o tempo de randomização até a morte por qualquer causa. Sobrevivência livre de progressão é avaliada pelos investigadores, de acordo com RECIST, versão 1.1, como uma análise de sensibilidade predefinida.

[0051] Por "câncer" entende-se câncer de mama triplo negativo (TNBC), para o qual imunoistoquímica confirmou que o câncer de mama não expressa receptor de estrogênio (ER) e receptor de progesterona (PR) de forma alguma, e também não superexpressa HER2.

[0052] Por "câncer de mama triplo negativo avançado (TNBC)" entende-se doença metastática, doença refratária ao tratamento, ou câncer que foi anteriormente localmente avançado e agora progrediu.

[0053] Por indivíduo "responsivo" ou "respondedor," entende-se que um indivíduo com TNBC recebendo tratamento com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ experimentará uma melhor resposta geral de pelo menos a resposta parcial (PR), ou a resposta completa (CR) como determinado por RECIST 1.1.

[0054] Por indivíduo "não responsivo" ou "não respondedor," entende-se que um indivíduo com TNBC recebendo tratamento com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ experimentará uma melhor resposta geral de doença progressiva (PD) como determinado por RECIST 1.1.

[0055] Os termos "risco," "em risco," e "fator de risco," são usados aqui como convencionalmente entendido na técnica. Por exemplo, um fator de risco é qualquer atributo, característica ou exposição de um indivíduo que aumenta a probabilidade de desenvolver uma doença ou lesão. Em certas modalidades, uma pessoa em risco de desenvolver uma doença, distúrbio, ou condição significa que a pessoa está exposta a um fator de risco que contribui ou realça a probabilidade de incidência daquela doença, distúrbio, ou condição.

[0056] Em toda a descrição e reivindicações da presente invenção a palavra "compreender" e outras formas da palavra, tais como "compreendendo" e "compreende," significam incluir mas não estão limitadas a, e não se destina a excluir, por exemplo, outros componentes.

[0057] Por "coadministrar" entende-se que uma composição descrita aqui é administrada ao mesmo tempo, exatamente antes de, ou exatamente após a administração de terapias adicionais. A proteína e a composição da presente invenção podem ser administradas sozinhas ou podem ser coadministradas com um segundo, terceiro, ou quarto agentes terapênticos a um paciente. Coadministração entende-se incluir administração simultânea ou sequencial de uma proteína ou composição individualmente ou em combinação (mais de um agente terapêutico).

[0058] O termo "um, uma" não significa limitar como um singular. Em certas modalidades, o termo "um, uma" pode se referir a uma forma plural. Como usado em toda a presente descrição, as formas singulares "um, uma (a)," "um, uma (an)," e "o, a" incluem referência plural a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Desse modo, por exemplo, uma referência a "uma composição" inclui uma pluralidade de tais composições, bem como uma única composição.

[0059] Uma formulação "reconstituída" é aquela que foi preparada dissolvendo uma formulação liofilizada em um carreador aquoso tal que a molécula bifuncional seja dissolvida na formulação reconstituída. A formulação reconstituída é adequada para administração intravenosa (IV) a um paciente em necessidade do mesmo.

[0060] O termo "cerca de" refere-se a qualquer alteração mínima na concentração ou quantidade de um agente que não altera a eficácia do agente na preparação de uma formulação e no tratamento de uma doença ou distúrbio. Em modalidades, o termo "cerca de" pode incluir ±15% de um valor numérico especificado ou ponto de dados.

[0061] As faixas podem ser expressas na presente invenção como de "cerca de" um valor particular, e/ou para "cerca de" outro valor particular. Quando tal faixa é expressa, outro aspecto inclui a partir de um valor particular e/ou a outro valor particular. Similarmente, quando valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente

"cerca de," entende-se que o valor particular forma outro aspecto. Entende-se também que os pontos finais de cada uma das faixas são significativos tanto em relação ao outro ponto final, quanto independentemente do outro ponto final. Entende-se também que existem diversos valores descritos na presente descrição, e que cada valor é também descrito como "cerca de" aquele valor particular além do próprio valor. Entende-se também que em todo o pedido, os dados são fornecidos em diversos diferentes formatos e que os dados representam pontos finais e pontos de partida e faixas para qualquer combinação dos pontos de dados. Por exemplo, se um ponto particular de dados "10" e um particular ponto de dados "15" são descritos, entende-se que maior que, maior que ou igual a, menor que, menor que ou igual a, e igual a 10 e 15 são considerados como descritos, bem como entre 10 e 15. Entende-se também que cada unidade entre duas unidades particulares é também descrita. Por exemplo, se 10 e 15 são descritos, então 11, 12, 13, e 14 são também descritos.

[0062] Uma formulação "isotônica" é aquela que tem essencialmente a mesma pressão osmótica do sangue humano. Formulações isotônicas geralmente terão uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsmol/kgH2O. O termo "hipertônica" é usado para descrever uma formulação com uma pressão osmótica acima daquela de sangue humano. Isotonicidade pode ser medida usando uma pressão de vapor ou osmômetro tipo congelamento, por exemplo.

[0063] O termo "agente de tamponamento" refere-se a um ou mais componentes que quando adicionados a uma solução aquosa é capaz de proteger a solução contra variações no pH quando adicionando ácido ou álcali, ou após diluição com um solvente. Além dos tampões de fosfato, podem ser usados glicinato, carbonate, tampões de citrato e similares, em cujo caso, íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contraíon.

[0064] Um "ácido" é uma substância que produz íons de hidrogênio em solução aquosa. Um "ácido farmaceuticamente aceitável" inclui ácidos inorgânicos e orgânicos que não são tóxicos na concentração e na forma na qual são formulados.

[0065] A "base" é uma substância que produz íons de hidroxila em solução aquosa. "Bases farmaceuticamente aceitáveis" incluem bases inorgânicas e orgânicas que não são tóxicas na concentração e na maneira como são formuladas.

[0066] Um "lioprotetor" é uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse, previne ou reduz a instabilidade química e/ou física da proteína após a liofilização e posterior armazenamento.

[0067] Um "preservativo" é um agente que reduz a ação bacteriana e pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (dose múltipla). Exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamônio em que os grupos alquila são compostos de cadeia longa) e cloreto de benzetônio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos tais como fenol, álcool butílico e benzílico, alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, cicloexanol, 3-pentanol, e m-cresol.

[0068] Um "tensoativo" é uma molécula tensoativa contendo uma porção hidrofóbica (por exemplo, cadeia alquila) e uma porção hidrofílica (por exemplo, grupos carboxila e carboxilato). O tensoativo pode ser adicionado às formulações da invenção. Os tensoativos adequados para uso nas formulações da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20 ou 80); poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); ésteres de sorbitano e derivados; Triton; sódio lauril sulfato; sódio octil glicosídeo;

lauril-, miristil-, linoleil-, ou estearil-sulfobetadina; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, ou cetil-betaína; lauramidopropil- cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isoestearamidopropilbetaína (por exemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isoestearamidopropil- dimetilamina; metil cocoil-, ou metil oleil-taurato dissódico; e a série MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilenoglicol, polipropilglicol e copolímeros de etileno e propilenoglicol (por exemplo, Pluronics, PF68 etc.).

[0069] Para um tratamento eficaz de pacientes diagnosticados com câncer de mama triplo negativo (TNBC), a presente invenção fornece um regime terapêutico que trata TNBC em pacientes determinados ter um nível de expressão aumentado de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de expressão conhecido, e melhora o prognóstico da doença e sobrevivência geral de pacientes de TNBC. O nível de expressão conhecido é o nível de expressão de HMGA2 em uma população de controle ou amostra de tecido. Em certas modalidades, o paciente é diagnosticado com TNBC avançado. Em certas modalidades, o paciente é diagnosticado com TNBC metastático refratário à linhas anteriores de tratamento.

[0070] Agentes anti-TGFβ da presente invenção incluem TRAPs TGFβ, anticorpos, inibidores de molécula pequena, e oligonucleotídeos direcionados à expressão de TGFβ. Por exemplo, agentes anti-TGFβ incluem anticorpos neutralizantes de TGFβ ID11, 2G7, Fresolimumabe (GC1008; Sanofi, Genzyme), Metelimumabe (CAT-192; Astra Zeneca, Cambridge Anticorpo Technology), anticorpos de bloqueio de receptor de TGFβ tais como LY3022859(Eli Lilly & Co) e inibidor de cinase de receptor de TGFβ de molécula pequena Galunisertibe (LY2157299; Eli Lilly & Co), SD-208 (Scios Inc), e LY2109761 (Eli Lilly & Co.).

[0071] A proteína bifuncional da presente invenção (molécula TRAP anti-PD-L1/TGFβ) inclui um primeiro e um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo inclui: (a) pelo menos uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga à proteína humana Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1); e (b) Receptor II de Fator β de Crescimento Transformante (TGFβRII), ou um fragmento do mesmo, capaz de se ligar ao Fator β de Crescimento Transformante (TGFβ) (por exemplo, um fragmento solúvel). O segundo polipeptídeo inclui pelo menos uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-L1, em que a cadeia pesada do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve do segundo polipeptídeo, quando combinadas, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga à PD-L1 (por exemplo, qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo descrito aqui). Por que a proteína bifuncional da presente invenção liga-se a dois alvos, (1) PD- L1, que é amplamente ligado à membrana, e (2) TGFβ, que é solúvel em sangue e interstício, o regime de dosagem independente de BW requer uma dose que seja eficaz não apenas para inibir PD-L1 no sítio do tumor, mas também suficiente para inibir TGFβ. Método de Tratamento de Câncer ou Inibição do Crescimento de Tumor

[0072] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou controle de TNBC em um indivíduo por administração de um agente anti-TGFβ a um indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente, e desse modo tratando TNBC no indivíduo.

[0073] Em outro aspecto, a presente invenção fornece método de obter pelo menos uma resposta parcial em tratamento ou aumento da sobrevivência de um paciente de TNBC por administração de um agente anti-TGFβ a um indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook 2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou locus complexo MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial em tratamento ou aumento da sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC).

[0074] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de duas etapas de tratamento ou controle de TNBC em um indivíduo, no qual a primeira etapa envolve a identificação de um indivíduo que tem um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente, e a segunda etapa envolve a administração de um agente anti-TGFβ ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de HMGA2 ou MECOM, e desse modo tratando TNBC no indivíduo.

[0075] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de duas etapas de obtenção de pelo menos a resposta parcial em tratamento ou aumento da sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC), no qual a primeira etapa envolve a identificação de um indivíduo que tem um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente, e a segunda etapa envolve a administração de uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de HMGA2 ou MECOM, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial em tratamento ou aumento da sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC).

[0076] Em cada um dos métodos da presente invenção, o nível de HMGA2 ou MECOM do indivíduo é determinado por análise de uma amostra de tecido do paciente. Em certas modalidades, a amostra de tecido é um amostra de sangue, soro, ou plasma. Em modalidades particulares, a amostra de tecido do indivíduo é um tecido de mama obtido por uma biópsia (por exemplo, amostra de biópsia com agulha coletada do paciente antes do início do tratamento). Em cada um dos métodos da presente invenção, o nível de HMGA2 ou MECOM é determinado por imunoquímica de amostra de biópsia ou por análise de expressão de RNA de uma amostra de biópsia ou amostra de sangue, soro, ou plasma coletado do paciente antes do início do tratamento.

[0077] Em modalidades particulares, a amostra de tecido do indivíduo é um tecido de câncer de mama obtido por uma biópsia (por exemplo, amostra de biópsia com agulha coletada do paciente antes do início do tratamento). Em cada um dos métodos da presente invenção, o nível de HMGA2 ou MECOM é determinado por imunoquímica de amostra de biópsia ou por análise de expressão de RNA de uma amostra de biópsia ou amostra de sangue, soro, ou plasma coletado do paciente antes do início do tratamento. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, os níveis aumentados de mRNA de HMGA2 mRNA e MECOM são determinados por meio de métodos de quantificação de mRNA bem conhecidos. Em uma modalidade exemplar, nos métodos da presente invenção, níveis de mRNA de HMGA2 mRNA e MECOM são determinados por meio de ensaio de reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-qPCR). Em uma modalidade exemplar, níveis de mRNA de HMGA2 mRNA e MECOM são determinados por meio de PCR de gota digital (ddPCR).

[0078] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método para prever a resposta de um paciente diagnosticado com câncer de mama triplo negativo a um agente anti-TGFβ e do tratamento do paciente por administração de um agente anti-TGFβ. Em uma modalidade exemplar, o nível de HMGA2 é determinado por extração de RNA de amostra de tumor embutida em parafina fresca. Em uma modalidade exemplar, o nível de HMGA2 é determinado por extração de RNA de amostra de tumor embutida em parafina congelada. Em outra modalidade exemplar, o nível de HMGA2 é determinado extraindo RNA de amostra de tumor embutida em parafina fixada. Em certas modalidades, o RNA extraído é transcrito reversamente para produzir cDNA. Em certas modalidades, o cDNA transcrito reversamente é amplificado usando um método com base em PCR (por exemplo, RT- qPCR, PCR de gota digital). Em uma modalidade exemplar, um método com base em PCR (por exemplo, RT-qPCR, PCR de gota digital) é utilizado para avaliar quantitativamente os níveis de transcrição de RNA de Expressão de HMGA2. Em certas modalidades, Nível de transcrição de RNA de HMGA2 é normalizado versus um nível de transcrição de RNA de pelo menos um gene de manutenção para fornecer um nível de transcrição de HMGA2 normalizado. Métodos para normalização dos dados de expressão de gene usando genes de manutenção bem conhecidos (por exemplo, GAPDH, actina, ubiquitina) são bem conhecidos (veja Dheda K. et. al.,Validação de genes de manutenção para normalização da expressão de RNA em PCR em tempo real. Biotechniques 2004; 37: 112-119.).

[0079] Em certas modalidades, a presente invenção envolve a administração de uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de níveis de transcrição de RNA de HMGA2 em comparação com a distribuição de íveis de transcrição de RNA de HMGA2 em todos os tumores na população, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial em tratamento ou aumento da sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC).

[0080] Em certas modalidades, um corte da alta expressão de HMGA2 é estabelecido com base no método de quantificação usado para quantificar a expressão de HMGA2 no indivíduo. Em uma modalidade exemplar, corte da alta expressão de HMGA2 para selecionar a população de paciente que responderá ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ é deduzida pela incorporação de dados obtidos de RNA-seq e dados obtidos de qPCR e/ou ddPCR. Os valores de TPM obtidos de RNA-seq podem ser transladados em valores de quantificação que podem ser obtidos de métodos de quantificação absoluta (por exemplo, qPCR ou ddPCR). Uma função de transferência que mapeia os valores TPM obtidos de RNA-seq para valores Ct (para qPCR) ou valores de relação de ddPCR (para ddPCR) é gerada. Esta função de transferência é usada para descobrir os correspondentes níveis de relação de Ct ou ddPCR que podem fornecer um corte com respeito à alta expressão de HMGA2. Em uma modalidade exemplar, função de transferência usada para encontrar os valores Ct correspondentes que podem fornecer um corte com respeito à alta expressão de HMGA2 é: Y1= X1 - log2 (TPM menor/TPM linha de base); onde Y1= corte de valor Ct; X1= valor ΔCt normalizado (expressão de qPCR relativa média para HMGA2); TPM menor= menor expressão de HMGA2 (Valor TPM) obtidas de RNA-seq entre pacientes que respondem ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ; TPM linha de base= expressão média de HMGA2 entre todos os pacientes, independentemente da resposta clínica.

[0081] Em uma modalidade exemplar, função de transferência usada para encontrar os valores Ct correspondentes que podem fornecer um corte com respeito à alta expressão de HMGA2 é: Y1= X1 - log2 (TPM segundo menor/TPM linha de base); onde Y1= corte de valor Ct; X1= valor ΔCt normalizado (expressão de qPCR relativa média para HMGA2); TPM segundo menor = menor expressão de HMGA2 (Valor TPM)

obtidas de RNA-seq entre pacientes que respondem ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ; TPM linha de base= expressão média de HMGA2 entre todos os pacientes, independentemente da resposta clínica.

[0082] Em certas modalidades, função de transferência usada para encontrar os correspondentes valores de relação de ddPCR que podem fornecer um corte com respeito à alta expressão de HMGA2 é: Y1= X1×(TPMmenor/TPM linha de base); onde Y1= ddPCR ratio value cutoff; X1= valor de relação de ddPCR normalizado (valor de relação de ddPCR médio para HMGA2); TPMmenor = menor expressão de HMGA2 (Valor TPM) obtida de RNA-seq entre pacientes que respondem ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ; TPM linha de base= expressão média de HMGA2 entre todos os pacientes, independentemente da resposta clínica.

[0083] Em certas modalidades, função de transferência usada para encontrar os correspondentes valores de relação de ddPCR que podem fornecer um corte com respeito à alta expressão de HMGA2 é: Y1= X1×(TPMsegundo menor/TPM linha de base); onde Y1= ddPCR ratio value cutoff; X1= valor de relação de ddPCR normalizado (valor de relação de ddPCR médio para HMGA2); TPMsegundo menor = segundo menor expressão de HMGA2 (Valor TPM) obtidas de RNA-seq entre pacientes que respondem ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ; TPM linha de base= expressão média de HMGA2 entre todos os pacientes, independentemente da resposta clínica.

[0084] Em uma modalidade exemplar, um paciente é considerado como HMGA2 alto quando a expressão de HMGA2 em que o tumor do indivíduo é elevado com respeito à distribuição de expressão de HMGA2 através de todos os tumores na população de TNBC. Em uma modalidade exemplar, o nível de referência de expressão de HMGA2 é determinado para coletar amostras de tumor de um coorte de pacientes que corresponde ao tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ e um coorte de pacientes que não responderam (respondedores e não respondedores, respectivamente); medição da expressão de HMGA2 dentro das amostras; caracterização das distribuições de expressão entre respondedores e não respondedores refletiu em um valor de corte separando estas distribuições; e definição do valor limite que correspondeu a um corte selecionado entre os respondedores e não respondedores como o nível de expressão de referência.

[0085] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para identificação de um paciente de TNBC provável de responder (por exemplo, resposta parcial (PR), sobrevivência melhorada) ao tratamento com inibição de TGFβ alvejada. Para identificarum paciente de TNBC provável de responder ao tratamento com agente anti-TGFβ, os níveis de expressão de HMGA2 e/ou MECOM com relação a um nível de expressão de controle conhecido correspondente, respectivamente, são analisados. Em certas modalidades, a análise dos níveis de expressão de HMGA2 ou MECOM é realizada 7 a 30 dias (por exemplo, 7 dias, 8 dias, 9 dias. 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias) ou mais, antes do tratamento com inibição de TGFβ direcionada com uma molécula TRAP anti-PD-L1/TGFβ. A fim de determinar os níveis de HMGA2 e/ou MECOM, em um paciente de TNBC usando os métodos descritos aqui, uma amostra pode ser obtida do paciente. No entanto, em algumas modalidades da invenção, o nível de HMGA2 e/ou MECOM no paciente de TNBC é determinado em uma amostra obtida do paciente de TNBC.

Em certas modalidades, para identificar um paciente de TNBC provável de responder ao tratamento com um agente anti-TGFβ, os níveis de expressão de HMGA2 e/ou MECOM são analisados em uma amostra de tecido coletado do indivíduo. Em modalidades particulares, a amostra de tecido do indivíduo é um amostra de sangue, soro, ou plasma. Em modalidades particulares, a amostra de tecido do indivíduo é um tecido de mama obtido por uma biópsia (por exemplo, amostra de biópsia com agulha coletada do paciente antes do início do tratamento).

[0086] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de pacientes de TNBC com alta expressão de HMGA2 com relação a um nível de expressão de controle conhecido da população de TNBC geral com agentes que se direcionam a TGFβ. Em certas modalidades, agentes que se direcionam a TGFβ podem ser moléculas pequenas, anticorpos monoclonais, proteínas de fusão de receptores de TGFβ, e/ou derivados de RNA antisenso. Em certas modalidades, estes agentes são conhecidos se direcionarem à via de TGFβ. Por exemplo: Galunisertibe (LY-2157299; Eli Lilly & Co.), vactosertibe (TEW-7197, NOV-1301; MedPacto, Inc., National OncoVenture), LY3200882 (Eli Lilly & Co.), NIS-793 (XOMA-089; Novartis, XOMA corporation), SAR-439459 (Sanofi), ABBV-151 (AGRX- 115, AbbVie, Argenx), AVID-200 (Forbius), PF-06952229 (Pfizer), e YL- 13027 (Shanghai YingLi Pharmaceutical Co., Ltd.).

[0087] Em algumas modalidades, o nível de HMGA2 e/ou MECOM é determinado por análise de uma amostra do paciente. Em certas modalidades, a amostra de tecido do indivíduo é um tecido de mama obtido por uma biópsia (por exemplo, amostra de biópsia com agulha coletada do paciente antes do início do tratamento). Em cada um dos métodos da presente invenção, o nível de HMGA2 ou MECOM é determinado por imunoquímica de amostra de biópsia ou por análise de expressão de RNA de uma amostra de biópsia ou amostra de sangue,

soro, ou plasma coletado do paciente antes do início do tratamento. Por exemplo, nos métodos da invenção, o nível de HMGA2 e/ou MECOM pode ser determinado por imunoquímica, por exemplo, por um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), ou por análise de nucleotídeo.

[0088] Em certas modalidades, os métodos da presente invenção envolvem comparar os níveis medidos de expressão de mRNA de HMGA2 e/ou MECOM em uma amostra obtida de um paciente de TNBC, com os níveis de expressão de mRNA de valores conhecidos disponíveis na base de dados TCGA (The Cancer Genome Atlas - National Institutes of Health) , que é uma base de dados de um grande número de pacientes.

[0089] Comparar conjuntos de dados RNA-seq não é trivial devido a variações na plataforma técnica e na preparação de amostras, levando ao que são comumente chamados de efeitos em lote; para corrigir os efeitos em lote separando os níveis observados de expressão de HMGA2 e/ou MECOM dos níveis de acordo com TCGA, o algoritmo ComBat foi implementado no pacote sva Bioconductor (sva versão

3.28.0, Leek JT, Johnson WE, Parker HS, Fertig EJ, Jaffe AE, Storey JD, Zhang Y, Torres LC (2018). Sva: Surrogate Variable Analysis.). Este método tornou comparáveis os dados clínicos do paciente no conjunto de dados de câncer de mama TCGA (doravante TCGA-BRCA) que eram triplo-negativos (doravante TCGA_BRCA_TNBC) aos níveis observados de HMGA2 e/ou MECOM.

[0090] Em certas modalidades, para identificar um paciente de TNBC provável de responder ao tratamento com molécula TRAP anti- PD-L1/TGFβ, o nível de expressão de HMGA2 ou MECOM é analisado por sequenciamento de RNA extraído de amostras de tecido embutidas em parafina, fixadas em formalina (FFPE). Por exemplo, RNA é extraído de amostras de FFPE isolando o RNA total de uma a duas ondulações de FFPE de 5 a 10 μm pelo kit RNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Alemanha), e a concentração de RNA é determinada usando o ensaio Qubit HS RNA (ThermoFisher Scientific, USA) no fluorômetro Qubit 2.0. O RNA extraído é então sequenciado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em certas modalidades, PCR em tempo real quantitativo (qPCR) é usado para analisar o nível de expressão de HMGA2 ou MECOM. Em certas modalidades, qPCR é realizado em duplicata usando TaqMan Gene Expression Master Mix e conduzido em Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (formato de 96 cavidades) usando o protocolo de ciclização recomendado pelo fabricante. Conjunto de iniciador/sonda para genes alvo (SEQ ID NO: 63 e/ou SEQ ID NO: 64) e genes de manutação podem ser designados usando Primer Express® se o ensaio de expressão de gene "pronto para uso" não estiver disponível. O método comparativo Ct pode ser usado para quantificação relative de expressão de gene.

[0091] Em outra modalidade, PCR de gota digital (ddPCR) é usado para analisar o nível de expressão de HMGA2 ou MECOM. Em certas modalidades, ddPCR é realizado usando ensaios contendo iniciadores e sondas que se direcionam a genes alvo (SEQ ID NO: 63 e/ou SEQ ID NO: 64) e genes de manutação seguindo o protocolo BioRad ddPCR. Análise de amostra de cada experimento é realizada usando o QuantaSoft software. Concentrações de gota positivas em todas as amostras são determinados usando limiares de fluorescência colocados manualmente com base em clusters negativos, conforme detectado no controle sem padrão correspondente (NTCs). Concentração de DNA alvo (copias/L) e contas de gota absoluta dentro de amostras individuais são usadas como a medição quantitativa de resultados .

[0092] Em outra modalidade, o sistema HTG EdgeSeq é usado para analisar o nível de expressão de HMGA2 ou MECOM. Os espécimes FFPE são raspados em tubos e lisados em tampão de lise de HTG,

seguido pela introdução de sondas de proteção de nuclease de DNA específicas do gene (NPP). Depois de permitir que as NPPs hibridizem com seus RNAs alvo, que podem ser solúveis ou reticulados na matriz biológica, a nuclease S1 é adicionada, o que remove o excesso de NPPs e RNAs não hibridizados, deixando para trás apenas NPPs hibridizados com seus RNAs alvo.

[0093] Desse modo, uma conversão estequiométrica do RNA alvo nas NPPs é alcançada, produzindo uma proporção virtual de 1: 1 de NPP para RNA. As etapas qNPA são automatizadas no processador HTG EdgeSeq, que é seguido por PCR para adicionar adaptadores de sequenciamento e marcações. As amostras marcadas são agrupadas, limpas e sequenciadas em uma plataforma de sequenciamento de última geração (NGS) usando protocolos padrão. Os dados do instrumento NGS são processados e relatados pelo HTG EdgeSeq parser software.

[0094] Como mostrado na FIG. 2A (HMGA2) e FIG. 3B (MECOM), ambos HMGA2 e MECOM superexpressos por mais do que 20 vezes em respondedores em comparação com não respondedores.Na FIG. 2A, os níveis de expressão de HMGA2 (log de transcrições por milhão (TPM)) são plotados contra a resposta à proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ (PD = doença progressiva; SD = doença estável; PR = resposta parcial). TPM, uma métrica amplamente usada de abundância de transcrições, foi computada por RSEM. Ver Li & Dewey, (2011), BMC Bioinformatics, 12: 323. Os níveis de expressão alto e baixo do HMGA2 são observados na FIG. 2B, de MECOM são observados na FIG. 3A. A relação entre os níveis de expressão alto-baixo fornece um valor independente (um fator) pelo qual os pacientes de TNBC que provavelmente responderia ao tratamento com proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ poderiam ser identificados.

[0095] Alta expressão de HMGA2 é um nível de expressão, que é de pelo menos tão alto quanto a menor expressão de HMGA2 entre pacientes que respondem ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ. Como mostrado na FIG. 2A, expressão de HMGA2 é significantemente maior (pelo menos 35 vezes) em comparação com os níveis de expressão entre os não respondedores.

[0096] Na FIG. 3B, os níveis de expressão de MECOM (log de transcrições por milhão (TPM)) são plotados contra a resposta à tratamento com uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ (PD = doença progressiva; SD = doença estável; PR = resposta parcial). Alta expressão de MECOM é um nível de expressão, que é de pelo menos tão alto quanto a menor expressão de MECOM entre pacientes que respondem ao tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Como mostrado na FIG. 3B, a expressão de MECOM é significantemente maior (pelo menos 20 vezes) em comparação com os níveis de expressão entre os não respondedores.

[0097] Em certas modalidades, o nível de expressão de HMGA2 ou MECOM é analisado por imunoistoquímica (IHC). Por exemplo, em certas modalidades, um método IHC automatizado pode ser desenvolvido para ensaiar a expressão de HMGA2 ou MECOM em núcleos de células de tumor em espécimens de tecido FFPE. A presente invenção fornece métodos para detectar a presença de antígeno humano de HMGA2 ou MECOM em uma amostra teste de tecido, ou quantificar o nível de antígeno humano de HMGA2 ou MECOM ou a proporção de células na amostra que expressam o antígeno, cujos métodos compreendem o contato da amostra teste, uma amostra de controle negativo, com um mabe que se liga especificamente a HMGA2 ou MECOM humano, sob condições que permitem a formação de um complexo entre os Ab ou sua porção e HMGA2 ou MECOM humano. De preferência, as amostras de teste e controle de tecidos são amostras FFPE. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença na formação do complexo entre a amostra teste e a amostra controle negativo é indicativo da presença do antígeno humano de HMGA2 ou MECOM na amostra. Vários métodos são usados para quantificar a expressão de HMGA2 ou MECOM.

[0098] Em uma modalidade particular, o método IHC compreende : (a) desparafinar e reidratar seções de tecido montadas em um autostainer; (b) recuperação do antígeno em uma solução de recuperação de alvo, no pH apropriado, usando um módulo de pré- tratamento. (c) executar o autostainer para incluir etapas de neutralização da peroxidase endógena na amostra de tecido; bloqueio de locais de ligação a proteínas não específicas nas lâminas; incubar as lâminas com o reagente de controle negativo primário de Ab ou; incubar com um agente de bloqueio pós-primário; adicionar um substrato cromógeno e desenvolver; e contracoloração com hematoxilina. (d) desidratação em séries de etanol graduado, e limpeza antes da montagem com meio permanente.

[0099] Para avaliar a expressão de HMGA2 ou MECOM em amostras de tecido de tumor, um patologista examina o número de Células de tumor HMGA2+ ou MECOM+ em cada campo sob um microscópio e estima mentalmente a porcentagem de células que são positivas, então calcula a média para chegar à porcentagem final. As diferentes intensidades de manchamento são designadas como 0/negativo, 1+/fraco, 2+/moderado e 3+/forte. Normalmente, os valores percentuais são atribuídos primeiro aos intervalos 0 e 3+ e, em seguida, são consideradas as intensidades intermediárias 1+ e 2+. Para tecidos altamente heterogêneos, a amostra é dividida em zonas, e cada zona é pontuada separadamente e então combinada em um único conjunto de valores percentuais. São dados os percentuais de células positivas e negativas para as diferentes intensidades de manchamento que são determinados de cada área e um valor mediano para cada zona. Um valor percentual final é dado ao tecido para cada categoria de intensidade de manchamento: negativo, 1+, 2+, e 3+. A soma de todas as intensidades de manchamento deve ser 100%.

[00100] Em certas modalidades desses métodos de pontuação, as amostras são pontuadas por dois patologistas que operam independentemente e as pontuações são posteriormente consolidadas. Em certas outras modalidades, a identificação de células positivas e negativas é pontuada usando software apropriado.

[00101] Um histoscore é usado como uma medida mais quantitativa dos dados de IHC. O histoscore é calculado da seguinte forma: Histoscore = [(% tumor x 1 (baixa intensidade)) + (% tumor x 2 (média intensidade)) + (% tumor x 3 (alta intensidade)]. Para determinar o histoscore, a porcentagem de células manchadas em cada categoria de intensidade dentro de uma amostra é estimada. A faixa final do histoscore pode ser de 0 (sem expressão) a 300 (expressão máxima).

[00102] Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão aumentada de HMGA2 é de pelo menos 2,0 vezes, por exemplo, 2,27 mais do que uma média de população conhecida entre os pacientes de TNBC. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão aumentada de HMGA2 é de pelo menos 2 a 7 vezes (por exemplo, 2,1 vezes, 2,2 vezes, 2,3 vezes, 2,4 vezes, 2,5 vezes, 2,6 vezes, 2,7 vezes, 2,8 vezes, 2,9 vezes, 3,0 vezes, 3,1 vezes, 3,2 vezes, 3,3 vezes, 3,4 vezes, 3,5 vezes, 3,6 vezes, 3,7 vezes, 3,8 vezes, 3,9 vezes, 4,0 vezes, 4,1 vezes, 4,2 vezes, 4,3 vezes, 4,4 vezes, 4,5 vezes, 4,6 vezes, 4,7 vezes, 4,8 vezes, 4,9 vezes, 5,0 vezes, 5,1 vezes, 5,2 vezes, 5,3 vezes, 5,4 vezes, 5,5 vezes, 5,6 vezes, 5,7 vezes, 5,8 vezes, 5,9 vezes, 6,0 vezes, 6,1 vezes, 6,2 vezes, 6,3 vezes, 6,4 vezes, 6,5 vezes, 6,6 vezes, 6,7 vezes, 6,8 vezes, 6,9 vezes, ou 7,0 vezes) mais do que o nível médio conhecido da população de expressão de HMGA2 (por exemplo, média de população entre os pacientes de TNBC).

[00103] Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão MECOM aumentada é de pelo menos 1,5 vez mais do que uma média de população conhecida entre os pacientes de TNBC. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão MECOM aumentada é de pelo menos1,5 a 4 vezes (por exemplo, 2,1 vezes, 2,2 vezes, 2,3 vezes, 2,4 vezes, 2,5 vezes, 2,6 vezes, 2,7 vezes, 2,8 vezes, 2,9 vezes, 3,0 vezes, 3,1 vezes, 3,2 vezes, 3,3 vezes, 3,4 vezes, 3,5 vezes, 3,6 vezes, 3,7 vezes, 3,8 vezes, 3,9 vezes, ou 4,0 vezes) mais do que a média da população conhecida entre os pacientes de TNBC.

[00104] Em certas modalidades, o nível de expressão de HMGA2 ou MECOM é comparado com o nível de expressão conhecido da população de TNBC geral. Em certas modalidades, o nível de expressão de HMGA2 é determinado ser elevado se o nível de expressão de RNA de HMGA2 é determinado ser maior do que 2,60 vezes do que nível de expressão de RNA de HMGA2 da população de TNBC geral. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, mais do que 1% de células tumorais (por exemplo, mais do que 5%, mais do que 10%, mais do que 15%, ou mais do que 20%) expressando a proteína HMGA2 em uma amostra de tecido obtida do indivíduo de TNBC determinado o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2 . Em certas modalidades, o nível de expressão de MECOM é determinado ser elevado se o nível de expressão de RNA de MECOM é maior do que 1,7 vezes do que o nível de expressão de RNA de MECOM da população de TNBC geral. Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, mais do que 1% de células de tumor (por exemplo, mais do que 5%, mais do que 10%, mais do que 15%, ou mais do que 20%) expressando a proteína MECOM em uma amostra de tecido obtida do indivíduo de TNBC determinado o nível de expressão de proteína MECOM aumentado.

[00105] Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão aumentada de HMGA2 no indivíduo é de pelo menos 19 a 40 vezes (por exemplo, 19 vezes, 20 vezes, 21 vezes, 22 vezes, 23 vezes, 24 vezes, 25 vezes, 26 vezes, 27 vezes, 28 vezes, 29 vezes, 30 vezes, 31 vezes, 32 vezes, 33 vezes, 34 vezes, 35 vezes, 36 vezes, 37 vezes, 38 vezes, 39 vezes, ou 40 vezes) mais do que a expressão de HMGA2 em um indivíduo que não é responsivo a um tratamento com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[00106] Em certas modalidades, o nível de expressão de HMGA2 ou MECOM é comparado entre respondedores e não respondedores dentro da população de TNBC. Em certas modalidades, o nível de expressão de HMGA2 for determinado ser elevado se o nível de expressão de RNA de HMGA2 é determinado ser pelo menos 19 a 35 vezes maior do que o nível de expressão de RNA de HMGA2 da população de TNBC não respondedora. Em certas modalidades, o nível de expressão de MECOM é determinado ser elevado se o nível de expressão de RNA de MECOM for maior do que pelo menos 18 a 35 vezes maior do que o nível de expressão de RNA de MECOM da população de TNBC não respondedora.

[00107] Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais do que o nível normal de expressão de HMGA2.

[00108] Em certas modalidades, nos métodos da presente invenção, a expressão aumentada de HMGA2 e/ou MECOM é a expressão de transcrição 100% - 1000% maior (200% - 1000% maior, 300% - 1000% maior, 400% - 1000% maior, 500% - 1000% maior, 600% - 1000% maior, 700% - 1000% maior, 800% - 1000% maior, 900% - 1000%

maior, 100% - 900% maior, 100% - 800% maior, 100% - 700% maior, 100% - 600% maior, 100% - 500% maior, 100% - 400% maior, 100% - 300% maior, ou 100% - 200% maior) do que o nível de população normal de expressão de HMGA2 e/ou MECOM. Em certas modalidades, o indivíduo identificado ser responsivo ao tratamento com inibição de TGFβ alvejada foi determinada ter expressão de transcrição aumentada de HMGA2, em que a expressão de transcrição aumentada de HMGA2 é pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais, do que o nível normal de expressão de transcrição de HMGA2. Em certas modalidades, o indivíduo identificado ser responsivo ao tratamento com inibição de TGFβ alvejada foi determinada ter expressão aumentada de MECOM, em que a expressão de transcrição aumentada de MECOM é pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais, do que o nível normal de expressão de transcrição de MECOM.

[00109] Em modalidades da invenção, o nível aumentado de HMGA2 e/ou MECOM é determinado a cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 11, semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 13 semanas, cerca de 14 semanas, cerca de 15 semanas, cerca de 16 semanas, cerca de 17 semanas, cerca de 18 semanas, cerca de 19 semanas, cerca de 20 semanas, cerca de 21 semanas, cerca de 22 semanas, cerca de 23 semanas, cerca de 24 semanas, cerca de 25 semanas, cerca de 26 semanas, cerca de 27 semanas, cerca de 28 semanas, cerca de 29 semanas, cerca de 30 semanas, cerca de 31 semanas, cerca de 32 semanas, cerca de 33 semanas, cerca de 34 semanas, cerca de 35 semanas, cerca de 36 semanas, cerca de 37 semanas, cerca de 38 semanas, cerca de 39 semanas, cerca de 40 semanas, cerca de 41 semanas, cerca de 42 semanas, cerca de 43 semanas, cerca de 44 semanas, cerca de 45 semanas, cerca de 46 semanas, cerca de 47 semanas, cerca de 48 semanas, cerca de 49 semanas, cerca de 50 semanas, cerca de 51 semanas, cerca de 52 semanas, cerca de 1 semana a cerca de 2 semanas, cerca de 2 semanas a cerca de 3 semanas, 3 semanas a 4 semanas, 4 semanas a 5 semanas, 5 semanas a 6 semanas, 6 semanas a 7 semanas, 7 semanas a 8 semanas, 8 semanas a 9 semanas, 9 semanas a 10 semanas, 10 semanas a 11 semanas, 11 semanas a 12 semanas, 12 semanas a 16 semanas,16 semanas a 20 semanas, 20 semanas a 24 semanas,24 semanas a 28 semanas,28 semanas a 32 semanas,32 semanas a 36 semanas,36 semanas a 40 semanas,40 semanas a 44 semanas,44 semanas a 48 semanas,48 semanas a 52 semanas, e/ou mais do que 52 semanas antes de administrar uma dose inicial de uma molécula TRAP anti-PDL1/TGFβ.

[00110] Nos métodos da presente invenção, um paciente de TNBC que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente, é administrado a dose de pelo menos 1200 mg de uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo inclui: (a) pelo menos uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga à proteína humana Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1); e (b) Receptor II de Fator β de Crescimento Transformante (TGFβRII), ou um fragmento do mesmo, capaz de se ligar ao Fator β de Crescimento Transformante (TGFβ). o segundo polipeptídeo inclui pelo menos uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-L1, e a cadeia pesada do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve do segundo polipeptídeo, quando combinadas, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga à PD-L1.

[00111] Em certas modalidades, o método de tratamento de TNBC ou inibição do crescimento de tumor da presente invenção envolve administrar a um indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo de MDS1 e EVI1 (MECOM) com relação a um nível de controle conhecido correspondente de uma proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ incluindo dois peptídeos nos quais o primeiro polipeptídeo inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[00112] Em certas modalidades, o método de tratamento de TNBC ou inibição do crescimento de tumor da presente invenção envolve administrar a um indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo de MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente, uma proteína (por exemplo, uma molécula TRAP anti-PD-L1/TGFβ(por exemplo, including um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; ou um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40)) em uma dose de cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2500 mg,

cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2300 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2200 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2100 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1300 mg, cerca de 1300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1900 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2000 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2100 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2900 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2100 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2400 mg, cerca de 2500 mg, cerca de 2600 mg, cerca de 2700 mg, cerca de 2800 mg, cerca de 2900 mg, ou cerca de 3000 mg). Em certas modalidades, cerca de 1200 mg de molécula TRAP anti-PD-L1/TGFβ são administrados a um paciente de TNBC uma vez a cada duas semanas.

Em certas modalidades, cerca de 1800 mg de molécula TRAP anti-PD-L1/TGFβ são administrados a um paciente de TNBC uma vez a cada três semanas.

Em certas modalidades, cerca de 2400 mg de molécula TRAP anti-PD-L1/TGFβ são administrados a um paciente de TNBC uma vez a cada três semanas.

Em certas modalidades, cerca de 1200 mg de um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 e o segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 é administrado a um indivíduo uma vez a cada duas semanas. Em certas modalidades, cerca de 1800 mg de um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 e o segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 são administrados a um paciente de TNBC, que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo de MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente, uma vez a cada três semanas. Em certas modalidades, cerca de 1800 mg de um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40 são administrados a um paciente de TNBC uma vez a cada três semanas. Em certas modalidades, cerca de 2400 mg de um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 e o segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 são administrados a um paciente de TNBC, que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo de MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente, uma vez a cada três semanas. Em certas modalidades, cerca de 2400 mg de um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40 são administrados a um paciente de TNBC uma vez a cada três semanas.

[00113] Em certas modalidades, a dose administrada a um paciente de TNBC pode ser de cerca de 1200 mg, cerca de 1225 mg, cerca de 1250 mg, cerca de 1275 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1325 mg, cerca de 1350 mg, cerca de 1375 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1425 mg, cerca de 1450 mg, cerca de 1475 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1525 mg, cerca de 1550 mg, cerca de 1575 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1625 mg, cerca de 1650 mg, cerca de 1675 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1725 mg, cerca de 1750 mg, cerca de 1775 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1825 mg, cerca de 1850 mg, 1875 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 1925 mg, cerca de 1950 mg, cerca de 1975 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2025 mg, cerca de 2050 mg, cerca de 2075 mg, 2100 mg, cerca de 2125 mg, cerca de 2150 mg, cerca de 2175 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2225 mg, cerca de 2250 mg, cerca de 2275 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2325 mg, cerca de 2350 mg, cerca de 2375 mg, ou cerca de 2400 mg.

[00114] Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados pelo menos 1200 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados pelo menos 1200 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 1200 mg a 3000 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 1200 mg a 2400 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 1800 mg a 2400 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[00115] Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 1200 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ, uma vez a cada duas semanas. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 1800 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 2400 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas.

[00116] Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 2100 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 2100 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas. Em certas modalidades, ao indivíduo que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de HMGA2 ou MECOM relativo a um nível de controle conhecido correspondente são administrados 2400 mg ou 3000 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas.

[00117] Em certas modalidades, a dose administrada a um paciente de TNBC pode ser administrada uma vez a cada duas semanas. Em certas modalidades, a dose administrada a um paciente de TNBC pode ser administrada uma vez a cada três semanas. Em certas modalidades, a proteína pode ser administrada por administração intravenosa, por exemplo, com uma bolsa pré-carregada, uma caneta pré-carregada, ou uma seringa pré-carregada. Em certas modalidades, a proteína é administrada intravenosamente de uma bolsa de salina de 250 ml, e a infusão intravenosa pode ser durante cerca de uma hora (por exemplo, 50 a 80 minutos). Em certas modalidades, a bolsa é conectada a um canal compreendendo um tubo e/ou uma agulha.

[00118] Em certas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo de MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente são tratados administrando intravenosamente pelo menos 1200 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2100 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2400 mg, ou mais) de TRAP anti-PD-L1/TGFβ, que inclui um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC (são tratados por administração intravenosa de pelo menos 1200 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2100 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2400 mg, ou mais) de TRAP anti-PD- L1/TGFβ, que inclui um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40. Em certas modalidades, indivíduos ou pacientes com

TNBC são tratados administrando intravenosamente 1200 mg de TRAP anti-PD-L1/TGFβ, que inclui um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40. Em certas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC são tratados administrando intravenosamente 2400 mg de TRAP anti-PD-L1/TGFβ, que inclui um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40.

[00119] Em certas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo de MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente são tratados administrando intravenosamente cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2300 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2200 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2100 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1300 mg, cerca de 1300 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1400 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1500 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1600 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1700 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1800 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1900 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 2000 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 2100 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 2200 mg a cerca de 2400 mg, ou cerca de 2300 mg a cerca de 2400 mg) de TRAP anti-PD- L1/TGFβ, que inclui um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[00120] Em certas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo de MDS1 e EVI1 (MECOM) relativo a um nível de controle conhecido correspondente são tratados administrando intravenosamente cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2300 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2200 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2100 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1300 mg, cerca de 1300 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1400 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1500 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1600 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1700 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1800 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1900 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 2000 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 2100 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 2200 mg a cerca de 2400 mg, ou cerca de 2300 mg a cerca de 2400 mg) de TRAP anti-PD- L1/TGFβ, que inclui um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40.

[00121] Em algumas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC que foi determinado ter um nível aumentado de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) ou expressão de locus complexo de MDS1 e EVI1 (MECOM) com relação a um nível de controle conhecido correspondente são tratados administrando intravenosamente TRAP anti-PD-L1/TGFβ em uma dose de cerca de 1200 mg uma vez a cada 2 semanas. Em algumas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC avançado são tratados administrando intravenosamente TRAP anti-PD-L1/TGFβ em uma dose de 1200 mg uma vez a cada 2 semanas. Em algumas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC avançado são tratados administrando intravenosamente TRAP anti-PD- L1/TGFβ em uma dose de cerca de 1800 mg uma vez a cada 3 semanas.Em algumas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC avançado são tratados administrando intravenosamente TRAP anti-PD- L1/TGFβ em uma dose de cerca de 2400 mg uma vez a cada 3 semanas. Em algumas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC avançado são tratados administrando intravenosamente TRAP anti-PD-L1/TGFβ em uma dose de 2400 mg uma vez a cada 3 semanas.

[00122] Em certas modalidades, o TNBC a ser tratado é PD-L1 positivo. Por exemplo, em certas modalidades, o TNBC a ser tratado exibe a expressão PD-L1+ (por exemplo, alta expressão PD-L1). Em algumas modalidades, por exemplo, alta PD-L1 pode ser definida como ≥ 80% de células de tumor positivas para PD-L1 (pontuação da proporção de tumor [TPS]) como determinado pelo ensaio 73-10. Em algumas modalidades, PD-L1 alto pode ser definida como pontuação da proporção de tumor (TPS) ≥ 50% como determinado pelo ensaio de PD- L1 IHC 22C3 PharmDx. Em algumas modalidades, PD-L1 elevada pode ser definida como pontuação da proporção de tumor (TPS) ≥ 25% como determinado pelo ensaio PD-L1 IHC SP263. Métodos de detecção de um biomarcador, tais como PD-L1 por exemplo, em um câncer ou tumor, são rotinas na técnica e são contemplados aqui. Exemplos não limitantes incluem classificação celular ativada por imunoistoquímica, imunofluorescência e fluorescência (FACS). Em algumas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC de alta PD-L1 são tratados administrando intravenosamente TRAP anti-PD-L1/TGFβ em uma dose de cerca de 1200 mg uma vez a cada 2 semanas. Em algumas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC de alta PD-L1 são tratados administrando intravenosamente TRAP anti-PD-L1/TGFβ em uma dose de cerca de 1800 mg uma vez a cada 3 semanas. Em algumas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC de alta PD- L1 são tratados administrando intravenosamente TRAP anti-PD- L1/TGFβ em uma dose de cerca de 2100 mg uma vez a cada 3 semanas. Em algumas modalidades, indivíduos ou pacientes com TNBC de alta PD-L1 são tratados administrando intravenosamente TRAP anti-PD-L1/TGFβ em uma dose de cerca de 2400 mg uma vez a cada 3 semanas.

[00123] Em algumas modalidades, os métodos de tratamento descritos aqui resultam em uma resposta à doença ou sobrevivência melhorada do indivíduo ou paciente. Em algumas modalidades por exemplo, a resposta da doença pode ser uma resposta completa, a resposta parcial, ou a doença estável. Em algumas modalidades por exemplo, a sobrevivência melhorada pode ser sobrevivência livre de progressão (PFS) ou sobrevivência geral. Em algumas modalidades, a melhora (por exemplo, em PFS) é determinada com relação a um período antes do início de tratamento com uma TRAP anti-PD-L1/TGFβ da presente invenção (por exemplo, resposta completa, resposta parcial, ou doença estável) e sobrevivência do paciente (por exemplo, PFS, sobrevivência geral) para terapia de câncer ou tumor são rotinas na técnica e são contemplados aqui. Em algumas modalidades, resposta da doença é avaliada de acordo com RECIST 1.1 após submeter o paciente tratado à tomografia computadorizada realçada por contraste (CT) ou imageamento por ressonância magnética (MRI) da área afetada. TGFβ como um Câncer Alvo

[00124] A presente invenção permite redução localizada em TGFβ em um microambiente tumoral capturando o TGFβ usando um receptor de citocina solúvel (TGFβRII) amarrado a um anticorpo que visa um receptor de ponto de verificação imunológico celular encontrado na superfície externa de certas células tumorais ou células imunes. Um exemplo de porção de anticorpo da invenção para uma proteína de ponto de verificação imune é anti-PD-L1. A molécula bifuncional da presente invenção, algumas vezes referida aqui como uma "TRAP de anticorpo-citocina", é eficaz precisamente porque o anticorpo anti- receptor e a TRAP de citocina estão fisicamente ligados. A vantagem resultante (em relação, por exemplo, à administração do anticorpo e do receptor como moléculas separadas) é em parte porque as citocinas funcionam predominantemente no ambiente local por meio de funções autócrinas e parácrinas. A porção de anticorpo direciona a TRAP de citocinas para o microambiente tumoral, onde pode ser mais eficaz, neutralizando os efeitos imunossupressores autócrinos ou parácrinos locais. Além disso, nos casos em que o alvo do anticorpo é internalizado após a ligação do anticorpo, é fornecido um mecanismo eficaz para a eliminação do complexo citocina / receptor de citocina. A internalização do alvo mediada por anticorpos foi mostrada para PD-L1, e TRAP anti- PD-L1 / TGFβ mostrou ter uma taxa de internalização semelhante ao anti-PD-L1. Esta é uma vantagem distinta sobre o uso de um anticorpo anti-TGFβ porque, primeiro, um anticorpo anti-TGFβ pode não ser completamente neutralizante; e segundo, o anticorpo pode atuar como um carreador estendendo a meia-vida da citocina.

[00125] Com efeito, conforme descrito a seguir, o tratamento com a TRAP anti-PD-L1 / TGFβ induz um efeito antitumoral sinérgico devido ao bloqueio simultâneo da interação entre PD-L1 nas células tumorais e PD-1 nas células imunológicas, e a neutralização de TGFβ no microambiente tumoral. Sem estar limitado pela teoria, isso presumivelmente se deve a um efeito sinérgico obtido do bloqueio simultâneo dos dois principais mecanismos de escape imunológico, e, além disso, a depleção do TGFβ no microambiente tumoral por uma única entidade molecular. Este esgotamento é alcançado por (1) direcionamento anti-PD-L1 de células tumorais; (2) ligação do TGFβ autócrino / parácrino no microambiente tumoral pelo TGFβ Trap; e (3) destruição do TGFβ ligado através da endocitose mediada pelo receptor PD-L1. Além disso, o TGFβRII fundido ao terminal C de Fc (fragmento de cristalização de IgG) foi várias vezes mais potente do que o TGFβRII- Fc que coloca o TGFβRII no terminal N de Fc.

[00126] O TGFβ tem sido um alvo um tanto questionável na imunoterapia do câncer por causa de seus papéis paradoxais como o Jekyll e Hyde molecular do câncer (Bierie et al., Nat. Rev. Cancer, 2006; 6: 506-20). Como algumas outras citocinas, a atividade do TGFβ é dependente do estágio de desenvolvimento e do contexto. De fato, o TGFβ pode atuar tanto como promotor tumoral quanto supressor tumoral, afetando o início, progressão e metástase do tumor. Os mecanismos subjacentes a este papel duplo do TGFβ permanecem obscuros (Yang et al., Trends Immunol. 2010; 31: 220-227). Embora tenha sido postulado que a sinalização dependente de Smad medeia a inibição do crescimento da sinalização de TGFβ, enquanto as vias independentes de Smad contribuem para seu efeito de promoção de tumor, também existem dados que mostram que as vias dependentes de Smad estão envolvidas na progressão do tumor (Yang et al., Cancer Res. 2008; 68:9107-11).

[00127] Tanto o ligante TGFβ quanto o receptor têm sido intensamente estudados como alvos terapêuticos. Existem três isoformas de ligantes, TGFβ1, 2 e 3, todas as quais existem como homodímeros. Existem também três receptores de TGFβ (TGFβR), que são chamados de TGFβR tipo I, II e III (López-Casillas et al., J. Cell Biol. 1994; 124: 557-68). TGFβRI é a cadeia de sinalização e não pode se ligar ao ligante. O TGFβRII se liga ao ligante TGFβ1 e 3, mas não ao TGFβ2, com alta afinidade. O complexo TGFβRII / TGFβ recruta TGFβRI para formar o complexo de sinalização (Won et al., Cancer Res. 1999; 59: 1273-7). TGFβRIII é um regulador positivo da ligação de TGFβ aos seus receptores de sinalização e se liga a todas as 3 isoformas de TGFβ com alta afinidade. Na superfície celular, o complexo TGFβ / TGFβRIII liga-se a TGFβRII e, então, recruta TGFβRI, que desloca TGFβRIII para formar o complexo de sinalização.

[00128] Embora as três diferentes isoformas de TGFβ sinalizem através do mesmo receptor, elas são conhecidas por terem padrões de expressão diferenciais e funções não sobrepostas in vivo. Os três camundongos nocaute da isoforma TGF-β diferentes têm fenótipos distintos, indicando várias funções não compensadas (Bujak et al., Cardiovasc. Res. 2007; 74: 184-95). Enquanto camundongos nulos para TGFβ1 têm hematopoiese e defeitos vasculogênicos e TGFβ3 nulo camundongos apresentam desenvolvimento pulmonar e palatogênese defeituosa, camundongos nulos para TGFβ2 mostram várias anormalidades de desenvolvimento, sendo a mais proeminente deformidades cardíacas múltiplas (Bartram et al., Circulation 2001; 103: 2745-52; Yamagishi et al., Anat. Rec. 2012; 295 : 257-67). Além disso, o TGFβ está implicado em um papel importante no reparo do dano miocárdico após lesão por isquemia e reperfusão. Em um coração adulto, os cardiomiócitos secretam TGFβ, que atua como um autócrino para manter a taxa de batimentos espontâneos. É importante notar que 70-85% do TGFp secretado pelos cardiomiócitos é TGFp2 (Roberts et al., J. Clin. Invest. 1992; 90: 2056-62). Apesar das preocupações de cardiotoxicidade levantadas pelo tratamento com inibidores da cinase TGFβRI, o presente requerente observou uma falta de toxicidade, incluindo cardiotoxicidade, para TRAP anti-PD-L1 / TGFβ em macacos.

[00129] Os métodos terapêuticos para neutralizar o TGFp incluem a utilização dos domínios extracelulares dos receptores de TGFp como receptores solúveis TRAPs anticorpos neutralizantes.

Da abordagem do receptor TRAP, o TGFβRIII solúvel pode parecer a escolha óbvia, uma vez que se liga a todos os três ligantes de TGFβ.

No entanto, o TGFβRIII, que ocorre naturalmente como uma glucosaminoglicano (GAG) -glicoproteína de 280-330 kD, com domínio extracelular de 762 resíduos de aminoácidos, é uma proteína muito complexa para o desenvolvimento bioterapêutico.

O TGFβRIII solúvel desprovido de GAG pode ser produzido em células de inseto e mostrou ser um agente neutralizante de TGFβ potente (Vilchis-Landeros et al., Biochem.

J., (2001), 355: 215). Os dois domínios de ligação separados (o relacionado à endoglina e o relacionado à uromodulina) do TGFβRIII podem ser expressos independentemente, mas mostraram ter afinidades 20 a 100 vezes menores do que a do TGFβRIII solúvel, e atividade neutralizante muito diminuída (Mendoza et al., Biochemistry 2009; 48: 11755-65). Por outro lado, o domínio extracelular de TGFβRII tem apenas 136 resíduos de aminoácidos de comprimento e pode ser produzido como uma proteína glicosilada de 25-35 kD.

O TGFβRII solúvel recombinante mostrou ainda se ligar a TGFβ1 com um KD de 200 pM, que é bastante semelhante ao KD de 50 pM para o TGFβRII de comprimento total em células (Lin et al., J.

Biol.

Chem. 1995; 270: 2747- 54). TGFβRII-Fc solúvel foi testado como um agente anticâncer e mostrou inibir o crescimento de mesotelioma maligno de murino estabelecido em um modelo de tumor (Suzuki et al., Clin.

Cancer Res., 2004; 10: 5907-18). Como o TGFβRII não se liga a TGFβ2, o TGFβRIII se liga a TGFβ1 e 3 com menor afinidade do que TGFβRII, uma proteína de fusão do domínio endoglina de TGFβRIII e domínio extracelular de TGFβRII foi produzida em bactérias e demonstrou inibir a sinalização de TGFβ1 e 2 na célula ensaios baseados de forma mais eficaz do que TGFβRII ou RIII (Verona et al., Protein Eng’g.

Des.

Sel. 2008; 21:463-

73).

[00130] Ainda outro método para neutralizer todas as três isoformas dos ligantes de TGFβ é pesquisar um anticorpo anti-TGFβ pan- neutralizante, ou um anticorpo anti-receptor que bloqueia a ligação do receptor a TGFβ1, 2 e 3. GC1008, um anticorpo humano específico para todas as isoformas de TGFβ, estava em uma Fase I / II estudo em pacientes com melanoma maligno avançado ou carcinoma de células renais (Morris et al., J. Clin. Oncol. 2008; 26: 9028 (Resumo do Encontro)). Embora o tratamento tenha sido considerado seguro e bem tolerado, observou-se apenas eficácia clínica limitada e, portanto, era difícil interpretar a importância da terapia anti-TGFβ sem uma posterior caracterização dos efeitos imunológicos (Flavell et al., Nat. Rev. Immunol. 2010; 10: 554-67). Também foram testados anticorpos específicos da isoforma TGFβ na clínica. Metelimumabe, um anticorpo específico para TGFβ1, foi testado em ensaio clínico de Fase 2 como um tratamento para prevenir cicatrizes pós-operatórias excessivas para cirurgia de glaucoma; e Lerdelimumabe, um antibodispecífico para TGFβ2, foi considerado seguro, mas ineficaz na melhora da cicatriz após cirurgia ocular em um estudo de Fase 3 (Khaw et al., Ophthalmology 2007; 114: 1822-1830). Os anticorpos anti-TGFβRII que bloqueiam a ligação do receptor a todas as três isoformas de TGFβ, tais como o anticorpo anti-TGFβRII humano TR1 e o anticorpo MT1 anti- TGFβRII de camundongo, também mostraram alguma eficácia terapêutica contra o crescimento de tumor primário e metástase em modelos de camundongo ( Zhong et al., Clin. Cancer Res. 2010; 16: 1191-205). No entanto, em um estudo recente de Fase I do anticorpo TR1 (LY3022859), o aumento da dose além de 25 mg (dose fixa) foi considerado inseguro devido à liberação descontrolada de citocinas, apesar do tratamento profilático (Tolcheret al., Cancer Chemother. Pharmacol.2017; 79: 673-680). Até o momento, a grande maioria dos estudos sobre o tratamento anticâncer direcionado a TGFβ, incluindo inibidores de molécula pequena de sinalização de TGFβ que muitas vezes são bastante tóxicos, estão principalmente no estágio pré-clínico e a eficácia antitumoral obtida foi limitada (Calone et al., Exp Oncol. 2012; 34: 9-16; Connolly et al., Int. J. Biol. Sci. 2012; 8: 964-78).

[00131] A TRAP anticorpo-TGFβ da divulgação é uma proteína bifuncional contendo pelo menos parte de um Receptor II de TGFβ humano (TGFβRII) que é capaz de se ligar ao TGFβ. Em certas modalidades, o polipeptídeo TRAP de TGFβ é uma porção solúvel da Isoforma A do Receptor TGFβ de Tipo 2 humano (SEQ ID NO: 8) que é capaz de se ligar ao TGFβ. Em certas modalidades, o polipeptídeo TGFβ Trap contém pelo menos os aminoácidos 73-184 de SEQ ID NO:

8. Em certas modalidades, o polipeptídeo TGFβ Trap contém os aminoácidos 24-184 de SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, a TRAP TGFβ O polipeptídeo é uma porção solúvel da Isoforma B do Receptor TGFβ humano Tipo 2 (SEQ ID NO: 9) que é capaz de se ligar ao TGFβ. Em certas modalidades, o polipeptídeo TGFβ Trap contém pelo menos os aminoácidos 48-159 de SEQ ID NO: 9. Em certas modalidades, o polipeptídeo TGFβ Trap contém os aminoácidos 24-159 de SEQ ID NO:

9. Em certas modalidades, o TGFβ Trap o polipeptídeo contém os aminoácidos 24-105 de SEQ ID NO: 9. Em certas modalidades exemplares, o polipeptídeo Trap de TGFβ contém a sequência de SEQ ID NOs: 10, 50, 51, 52, 53, ou 54.

[00132] Em outra modalidade, o anticorpo-TGFβ Trap da divulgação é uma das proteínas de fusão divulgadas em WO 2018/205985. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é uma das construções listadas na Tabela 2 desta publicação, tais como construção 9 ou 15 da mesma. Em outras modalidades, o anticorpo com a sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 11 e a sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 12 desta publicação [correspondente a SEQ ID NO: 61 e 62,

respectivamente, da presente invenção] é fundido via uma sequência de ligação (G4S) xG, em que x é 4-5, à sequência do domínio extracelular de TGFβRII de SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15 da referida publicação [correspondente a SEQ ID NO: 50 e 51, respectivamente, da presente invenção]. Mecanismos de Ação

[00133] O método de direcionar os pontos de verificação de inibição de células T para desinibição com anticorpos terapêuticos é uma área de intensa investigação (para uma revisão, ver Pardoll, Nat. Rev. Cancer2012, 12: 253-264). Em um método, a porção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo visa proteínas do receptor do ponto de verificação de inibição de células T na célula T, tais como, por exemplo: CTLA-4, PD-1, BTLA, LAG-3, TIM-3 ou LAIR1 . Em outro método, a porção do anticorpo tem como alvo os contra-receptores em células apresentadoras de antígeno e células tumorais (que cooptam alguns desses contra-receptores para sua própria evasão imune), tais como por exemplo: PD-L1 (B7-H1) , B7-DC, HVEM, TIM-4, B7-H3, ou B7-H4.

[00134] A invenção contempla TRAPs de TGFβ de anticorpo que visam, através de sua porção de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pontos de verificação de inibição de células T para desinibição. Para esse fim, os requerentes testaram a eficácia antitumoral da combinação de anticorpos TGFβ com TRAP direcionando várias proteínas do receptor de ponto de verificação de inibição de células T, tais como anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-TIM-3 e anti- LAG3.

[00135] O eixo morte programada 1 (PD-1) / PD-L1 é um mecanismo importante para a evasão imunológica do tumor. As células T efetoras cronicamente detectando antígeno assumem um fenótipo esgotado marcado pela expressão de PD-1, um estado em que as células tumorais se engajam pela regulação positiva de PD-L1. Além disso, no microambiente tumoral, células mieloides, macrófagos, células parenquimatosas e células T regulam positivamente PD-L1. O bloqueio do eixo restaura a função efetora nessas células T. TRAP anti-PD-L1 / TGFβ também se liga a TGFβ (isoformas 1, 2, e 3), que é uma citocina inibitória produzida no microambiente tumoral por células incluindo neutrófilos apoptóticos, células supressoras derivadas de mieloide, células T e tumor. A inibição de TGFβ por TGFβRII solúvel reduziu o mesotelioma maligno de uma maneira que foi associada a aumentos nos efeitos antitumorais de células T CD8 +. A ausência de TGFβ1 produzido por células T CD4 + ativadas e células Treg demonstrou inibir o crescimento tumoral e proteger camundongos do câncer espontâneo. Desse modo, o TGFβ parece ser importante para a evasão imune do tumor.

[00136] O TGFβ tem efeitos inibidores do crescimento em células epiteliais normais, funcionando como regulador da homeostase das células epiteliais, e atua como supressor de tumor durante a carcinogênese inicial. À medida em que os tumores progridem em direção à malignidade, os efeitos inibidores do crescimento do TGFβ no tumor são perdidos por meio de mutação em um ou mais componentes de sinalização da via do TGFβ ou por meio da reprogramação oncogênica. Após a perda de sensibilidade à inibição de TGFβ, o tumor continua a produzir altos níveis de TGFβ, que então servem para promover o crescimento do tumor. A citocina TGFβ é superexpressada em vários tipos de câncer com correlação com o estágio do tumor. Muitos tipos de células no microambiente tumoral produzem TGFβ, incluindo as próprias células tumorais, células mieloides imaturas, células T reguladoras e fibroblastos estromais; essas células geram coletivamente um grande reservatório de TGFβ na matriz extracelular. A sinalização do TGFβ contribui para a progressão tumoral promovendo metástases, estimulando a angiogênese, e suprimindo a imunidade antitumoral inata e adaptativa. Como um fator amplamente imunossupressor, o TGFβ desregula diretamente a função efetora de células T citotóxicas ativadas e células NK e induz potentemente a diferenciação de células T CD4 + virgens para o fenótipo de células T reguladoras imunossupressoras (Treg). Além disso, o TGFβ polariza macrófagos e neutrófilos a um fenótipo de cicatrização de feridas que está associado à produção de citocinas imunossupressoras. Como estratégia terapêutica, a neutralização da atividade do TGFβ tem o potencial de controlar o crescimento tumoral, restaurando a imunidade antitumoral efetiva, bloqueando metástases e inibindo a angiogênese.

[00137] A presente invenção oferece regimes de dosagem para inibição de TGF-β direcionada com uma molécula TRAP anti-PD-L1 / TGFβ para uso em um método de tratamento de um assunto diagnosticado com TNBC.

[00138] O bloqueio concomitante de PD-1 e TGFβ pode restaurar citocinas pró-inflamatórias. TRAP anti-PD-L1 / TGFβ inclui, por exemplo, um domínio extracelular do receptor de TGFβ humano TGFβRII covalentemente unido por meio de um ligante de glicina / serina ao terminal C de cada cadeia pesada do IgG1 totalmente humano ou anti-PD-L1 . Dada a imagem emergente para a classe anti-PD-1 / PD-L1, na qual as respostas são aparentes, mas com espaço para aumento no tamanho do efeito, presume-se que o codirecionamento de uma etapa de modulação imunológica complementar melhorará a resposta do tumor. Um agente de direcionamento de TGF semelhante, fresolimumabe, que é um anticorpo monoclonal direcionado a TGFβ1, 2 e 3, mostrou evidência inicial de resposta tumoral em um estudo de Fase I em indivíduos com melanoma. Anticorpos Anti-PD-L1

[00139] A molécula TRAP anti-PD-L1/TGFβ da presente invenção pode incluir qualquer anticorpo anti-PD-L1, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito na técnica. Os anticorpos anti-PD-L1 estão disponíveis comercialmente, por exemplo, o anticorpo 29E2A3 (Biolegend, Cat. No. 329701). Os anticorpos podem ser monoclonais, quiméricos, humanizados ou humanos. Fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, F (ab') 2, scFv e Fv, que são descritos em mais detalhes abaixo.

[00140] Anticorpos exemplares são descritos na Publicação PCT WO 2013/079174. Estes anticorpos podem incluir um polipeptídeo de região variável de cadeia pesada, incluindo uma sequência HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, onde: (a) a sequência HVR-H1 é X1YX2MX3 (SEQ ID NO: 21); (b) a sequência HVR-H2 é SIYPSGGX4TFYADX5VKG (SEQ ID NO: 22); (c) a sequência HVR-H3 é IKLGTVTTVX6Y (SEQ ID NO: 23); além disso, onde: X1 é K, R, T, Q, G, A, W, M, I, ou S; X2 é V, R, K, L, M, ou I; X3 é H, T, N, Q, A, V, Y, W, F, ou M; X4 é F ou I; X5 é S ou T; X6 é E ou D.

[00141] Em uma modalidade, X1 é M, I, ou S; X2 é R, K, L, M, ou I; X3 é F ou M; X4 é F ou I; X5 é S ou T; X6 é E ou D.

[00142] Em outra modalidade X1 é M, I, ou S; X2 é L, M, ou I; X3 é F ou M; X4 é I; X5 é S ou T; X6 é D.

[00143] Em ainda outra modalidade, X1 é S; X2 é I; X3 é M; X4 é I; X5 é T; X6 é D.

[00144] Em outro aspecto, o polipeptídeo inclui ainda sequências estruturais da cadeia pesada de região variável justapostas entre as HVRs de acordo com a fórmula: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR- H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4).

[00145] Em outro aspecto, as sequências estruturais são derivadas de sequências estruturais de consenso humano ou sequências estruturais de linha germinativa humana.

[00146] Em ainda outro aspecto, pelo menos uma das sequências estruturais é a seguinte: HC-FR1 é EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 24); HC-FR2 é WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 25); HC-FR3 é RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 26); HC-FR4 é WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27).

[00147] Em ainda outro aspecto, o polipeptídeo de cadeia pesada é também combinado com uma cadeia leve de região variável que inclui uma HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3, onde: (a) a sequência HVR-L1 é TGTX7X8DVGX9YNYVS (SEQ ID NO: 28); (b) a sequência HVR-L2 é X10VX11X12RPS (SEQ ID NO: 29); (c) a sequência HVR-L3 é SSX13TX14X15X16X17RV (SEQ ID NO: 30); também onde: X7 é N ou S; X8 é T, R, ou S; X9 é um ou G; X10 é E ou D; X11 é I, N ou S; X12 é D, H ou N; X13 é F ou Y; X14 é N ou S; X15 é R, T ou S; X16 é G ou S; X17 é I ou T.

[00148] Em outra modalidade, X7 é N ou S; X8 é T, R, ou S; X9 é um ou G; X10 é E ou D; X11 é N ou S; X12 é N; X13 é F ou Y; X14 é S; X15 é S; X16 é G ou S; X17 é T.

[00149] Em ainda outra modalidade, X7 é S; X8 é S; X9 é G; X10 é D; X11 é S; X12 é N; X13 é Y; X14 é S; X15 é S; X16 é S; X17 é T.

[00150] Em ainda outro aspecto, a cadeia leve também inclui sequências estruturais de cadeia leve de região variável justapostas entre as HVRs de acordo com o formula: (LC-FR1MHVR-L1)-(LC-FR2)- (HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).

[00151] Em ainda outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são derivadas de sequências estruturais de consenso humano ou sequências estruturais da linha germinativa humana.

[00152] Em ainda outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são sequências de cadeia leve lambda.

[00153] Em ainda outro aspecto, pelo menos uma das sequência estruturais é a seguinte: LC-FR1 é QSALTQPASVSGSPGQSITISC (SEQ ID NO: 31); LC-FR2 é WYQQHPGKAPKLMIY (SEQ ID NO: 32); LC-FR3 é GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC (SEQ ID NO: 33); LC-FR4 é FGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 34).

[00154] Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti- PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno incluindo uma sequência de região variável de cadeia pesada e uma cadeia leve, onde: (a) a cadeia pesada inclui uma HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, em que ainda: (i) a sequência HVR-H1 é X1YX2MX3 (SEQ ID NO: 21); (ii) a sequência HVR-H2 é SIYPSGGX4TFYADX5VKG (SEQ ID NO: 22); (iii) a sequência HVR-H3 é IKLGTVTTVX6Y (SEQ ID NO: 23), and; (b) a cadeia leve inclui uma HVR-L1, HVR-L2, e HVR-L3, em que ainda: (iv) a sequência HVR-L1 é TGTX7X8DVGX9YNYVS (SEQ ID NO: 28); (v) a sequência HVR-L2 é X10VX11X12RPS (SEQ ID NO: 29); (vi) a sequência HVR-L3 é SSX13TX14X15X16X17RV (SEQ ID NO: 30); em que: X1 é K, R, T, Q, G, A, W, M, I, ou S; X2is V, R, K, L, M, ou I; X3 é H, T, N, Q, A, V, Y, W, F, ou M; X4 é F ou I; X5 é S ou T; X6 é E ou D; X7 é N ou S; X8 é T, R, ou S; X9 é um ou G; X10 é E ou D; X11 é I, N, ou S; X12 é D, H, ou N; X13 é F ou Y; X14 é N ou S; X15 é R, T, ou S; X16 é G ou S; X17 é I ou T.

[00155] Em uma modalidade, X1 é M, I, ou S; X2 é R, K, L, M, ou I; X3 é F ou M; X4 é F ou I; X5 é S ou T; X6 é E ou D; X7 é N ou S; X8 é T, R, ou S; X9 é um ou G; X10 é E ou D; X11 é N ou S; X12 é N; X13 é F ou Y; X14 é S; X15 é S; X16 é G ou S; X17 é T.

[00156] Em outra modalidade, X1 é M, I, ou S; X2 é L, M, ou I; X3 é F ou M; X4 é I; X5 é S ou T; X6 é D; X7 é N ou S; X8 é T, R, ou S; X9 é um ou G; X10 é E ou D; X11 é N ou S; X12 é N; X13 é F ou Y; X14 é S; X15 é S; X16 é G ou S; X17 é T.

[00157] Em ainda outra modalidade, X1 é S; X2 é I; X3 é M; X4 é I; X5 é T; X6 é D; X7 é S; X8 é S; X9 é G; X10 é D; X11 é S; X12 é N; X13 é Y; X14 é S; X15 é S; X16 é S; X17 é T.

[00158] Em outro aspecto, a região variável de cadeia pesada inclui uma ou mais sequências estruturais justapostas entre as HVRs como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC- FR4), e as regiões variáveis de cadeia leve incluem uma ou mais sequências estruturais justapostas entre as HVRs como: (LC-FR1 MHVR-L1 )-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).

[00159] Em ainda outro aspecto, as sequências estruturais são derivadas de sequências estruturais de consenso humano ou human germline sequences.

[00160] Em ainda outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia pesada são as seguintes: HC-FR1 é EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 24); HC-FR2 é WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 25); HC-FR3 é RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 26); HC-FR4 é WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27).

[00161] Em ainda outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são sequências de cadeia leve lambda.

[00162] Em ainda outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia leve são as seguintes: LC-FR1 é QSALTQPASVSGSPGQSITISC (SEQ ID NO: 31); LC-FR2 é WYQQHPGKAPKLMIY (SEQ ID NO: 32); LC-FR3 é GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC (SEQ

ID NO: 33); LC-FR4 é FGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 34).

[00163] Em ainda outro aspecto, o polipeptídeo de região variável de cadeia pesada, anticorpo, ou fragmento de anticorpo também inclui pelo menos um domínio CH1.

[00164] Em um aspecto mais específico, o polipeptídeo de região variável de cadeia pesada, anticorpo, ou fragmento de anticorpo também inclui um domínio CH1, um CH2, e um domínio CH3.

[00165] Em ainda outro aspecto, a cadeia leve de região variável, anticorpo, ou fragmento de anticorpo também inclui um domínio CL.

[00166] Em ainda outro aspecto, o anticorpo também inclui um domínio CH1, um CH2, um CH3, e um CL.

[00167] Em ainda outro aspecto específico, o anticorpo também inclui uma região constante humana ou murina.

[00168] Em ainda outro aspecto, a região constante humana é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4.

[00169] Em ainda outro aspecto específico, a região constante humana ou murina é lgG1.

[00170] Em ainda outra modalidade, a invenção caracteriza um anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma sequência de região variável de cadeia pesada e uma cadeia leve, onde: (a) a cadeia pesada inclui uma HVR-H1, uma HVR-H2, e uma HVR-H3, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência geral para SYIMM (SEQ ID NO: 35), SIYPSGGITFYADTVKG (SEQ ID NO: 36), e IKLGTVTTVDY (SEQ ID NO: 37), respectivamente, e (b) a cadeia leve inclui uma HVR-L1, uma HVR-L2, e uma HVR- L3, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência geral para TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 38), DVSNRPS (SEQ ID NO: 39), e SSYTSSSTRV (SEQ ID NO: 40), respectivamente.

[00171] Em um aspecto específico, a identidade de sequência é 81%,

82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%.

[00172] Em ainda outra modalidade, a invenção caracteriza um anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma sequência de região variável de cadeia pesada e uma cadeia leve, onde: (a) a cadeia pesada inclui uma HVR-H1, uma HVR-H2, e uma HVR-H3, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência geral para MYMMM (SEQ ID NO: 41), SIYPSGGITFYADSVKG (SEQ ID NO: 42), e IKLGTVTTVDY (SEQ ID NO: 37), respectivamente, e (b) a cadeia leve inclui uma HVR-L1, uma HVR-L2, e uma HVR- L3, tendo pelo menos 80% de identidade de sequência geral para TGTSSDVGAYNYVS (SEQ ID NO: 43), DVSNRPS (SEQ ID NO: 39), e SSYTSSSTRV (SEQ ID NO: 40), respectivamente.

[00173] Em um aspecto específico, a identidade de sequência é 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%.

[00174] Em ainda outro aspecto, no anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a invenção, quando comparado com as sequências de HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, pelo menos aqueles aminoácidos permanecem inalterados, os quais são destacados pelo sublinhado a seguir: (a) em HVR-H1 SYIMM (SEQ ID NO: 35), (b) em HVR-H2 SIYPSGGITFYADTVKG (SEQ ID NO: 36), (c) em HVR-H3 IKLGTVTTVDY (SEQ ID NO: 37); e ainda onde, quando comparado com as sequências de HVR- L1, HVR-L2, e HVR-L3 pelo menos aqueles aminoácidos permanecem inalterados, os quais são destacados pelo sublinhado a seguir: (a) HVR-L1 TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 38) (b) HVR-L2 DVSNRPS (SEQ ID NO: 39) (c) HVR-L3 SSYTSSSTRV (SEQ ID NO: 40).

[00175] Em outro aspecto, a região variável de cadeia pesada inclui uma ou mais sequências estruturais justapostas entre as HVRs como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC- FR4), e as regiões variáveis de cadeia leve incluem uma ou mais sequências estruturais justapostas entre as HVRs como: (LC-FR1)- (HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).

[00176] Em ainda outro aspecto, as sequências estruturais são derivadas de sequências de linha germinativa humana.

[00177] Em ainda outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia pesada são as seguintes: HC-FR1 é EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 24); HC-FR2 é WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 25); HC-FR3 é RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 26); HC-FR4 é WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27).

[00178] Em ainda outro aspecto, as sequências estruturais de cadeia leve são derivadas de uma sequência de cadeia leve lambda.

[00179] Em ainda outro aspecto, uma ou mais das sequências estruturais de cadeia leve são as seguintes: LC-FR1 é QSALTQPASVSGSPGQSITISC (SEQ ID NO: 31); LC-FR2 é WYQQHPGKAPKLMIY (SEQ ID NO: 32); LC-FR3 é GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC (SEQ ID NO: 33); LC-FR4 é FGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 34).

[00180] Em ainda outro aspecto específico, o anticorpo também inclui uma região constante humana ou murina.

[00181] Em ainda outro aspecto, a região constante humana é selecionada do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4.

[00182] Em certas modalidades, a invenção caracteriza um anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma sequência de região variável de cadeia pesada e uma cadeia leve, onde: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMVWRQAPGKGLE

WVSSIYPSGGITFYADWKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 44), e (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve:

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAP KLMIYDVSN

RPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFG TGTKVTVL (SEQ ID NO: 45).

[00183] Em várias modalidades, a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45; ou a sequência de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 44 e a cadeia leve sequence compreende SEQ ID NO: 45.

[00184] Em certas modalidades, a descrição fornece um anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, onde: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVR

QAPGKGLEVWSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS LRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO: 46), e (b) a sequência da cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência da cadeia leve:

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAP KLMIYDVSNR

PSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGT GTKVTVL (SEQ ID NO: 47).

[00185] Em várias modalidades, a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47; ou a sequência de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 46 e a sequência de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 47.

[00186] Em outra modalidade o anticorpo se liga a PD-L1 humano, de camundongo ou de macaco cinomolgo. Em um aspecto específico,

o anticorpo é capaz de bloquear a interação entre PD-L1 humanos, de camundongos, ou de macaco cinomolgo e os respectivos receptores PD-1 humanos, de camundongos ou de macaco cinomolgo.

[00187] Em outra modalidade, o anticorpo se liga a PD-L1 humano com um KD de 5x10-9 M ou menos, de preferência com um KD de 2x10- 9 M ou menos, e ainda mais preferido com um KD de 1x10-9 M ou menos.

[00188] Em ainda outra modalidade, a descrição se refere a um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um epítopo funcional incluindo resíduos Y56 e D61 de PD- L1 humano.

[00189] Em um aspecto específico, o epítopo funcional inclui ainda E58, E60, Q66, R113, e M115 de PD-L1 humano.

[00190] Em um aspecto mais específico, o anticorpo se liga a um epítopo conformacional, incluindo os resíduos 54-66 e 112-122 de PD- L1 humano.

[00191] Em certas modalidades, a descrição está relacionada a um anticorpo anti-PD-L1, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compete de forma cruzada para a ligação a PD-L1 com um anticorpo de acordo com a descrição como aqui descrito.

[00192] Em certas modalidades, a descrição apresenta proteínas e polipeptídeos incluindo qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 descritos acima em combinação com pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00193] Em certas modalidades, a descrição apresenta um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo, ou cadeia leve ou uma sequência de região variável de cadeia pesada de um anticorpo anti- PD-L1, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como aqui descrito. Em certas modalidades, a descrição fornece um ácido nucleico isolado que codifica uma cadeia leve ou uma sequência de região variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-PD-L1, em que:

(a) a cadeia pesada inclui uma sequência HVR-H1, HVR-H2, e uma sequência HVR-H3 tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com SYIMM (SEQ ID NO: 35), SIYPSGGITFYADTVKG (SEQ ID NO: 36), e IKLGTVTTVDY ( SEQ ID NO: 37), respectivamente, ou (b) a cadeia leve inclui uma sequência HVR-L1, uma HVR- L2, e uma sequência HVR-L3 tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 38), DVSNRPS (SEQ ID NO: 39), e SSYTSSSTRV (SEQ ID NO: 40), respectivamente.

[00194] Em um aspecto específico, a identidade de sequência é 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%.

[00195] Em um aspecto adicional, a sequência de ácido nucleico para a cadeia pesada é:

(SEQ ID NO: 48) e a sequência de ácido nucleico para uma cadeia leve é: (SEQ ID NO: 49).

[00196] Outros anticorpos anti-PD-L1 exemplares que podem ser usados em uma TRAP anti-PD-L1/TGFβ são descritos na publicação do pedido de patente Norte Americana US 2010/0203056. Em uma modalidade da descrição, a porção do anticorpo é YW243.55S70. Em outra modalidade da descrição, a porção do anticorpo é MPDL3289A.

[00197] Em certas modalidades, a descrição apresenta uma porção de anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVR

QAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMN SLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12), e (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLL

IYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHP ATFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 13).

[00198] Em várias modalidades, a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; ou a sequência de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 12 e a sequência de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 13.

[00199] Em certas modalidades, a descrição apresenta uma porção de anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que: (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLE

WVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAV YYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 14), e (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% identidade de sequência com a sequência de cadeia leve:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLL

IYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHP ATFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:13).

[00200] Em várias modalidades, a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13; ou a sequência de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 14 e a sequência de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 13.

[00201] Outros anticorpos anti-PD-L1 exemplares que podem ser usados em uma TRAP anti-PD-L1/TGFβ são descritos na publicação do pedido de patente Norte Americana US 2018/0334504.

[00202] Em certas modalidades, a descrição apresenta uma porção de anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada:

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQ

HPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTA ADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 55), e (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPG

QPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYGYPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 56).

[00203] Em várias modalidades, a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56; ou a sequência de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 55 e a sequência de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 56.

[00204] Em certas modalidades, a descrição apresenta uma porção de anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma cadeia pesada e uma sequência de região variável de cadeia leve, em que (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGL

EWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDT AVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 57), e (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve:

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQP

PKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQS FEDPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO: 58).

[00205] Em várias modalidades, a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58; ou a sequência de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 57 e a sequência de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 58.

[00206] Em certas modalidades, a descrição apresenta uma porção de anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve, em que (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada:

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLE YIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC ARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 59), e (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve:

[00207] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAW

YQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAED VAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT

ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 60).

[00208] Em várias modalidades, a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60; ou a sequência de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 59 e a sequência de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 60.

[00209] Em certas modalidades, a descrição apresenta uma porção de anticorpo anti-PD-L1 incluindo uma cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve, em que (a) a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia pesada:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGL EWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDT AVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG

FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGA (SEQ ID NO: 61), e (b) a sequência de cadeia leve tem pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de cadeia leve:

[00210] DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWY

QQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDT ANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS

VVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 62).

[00211] Em várias modalidades, a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 86% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 87% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 88% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 89% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 91% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 92% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 93% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 94% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; a sequência de cadeia pesada tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve tem pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 62; ou a sequência de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 61 e a sequência de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 62.

[00212] Ainda, outros anticorpos anti-PD-L1 exemplares que podem ser usados em uma TRAP anti-PD-L1/TGFβ são descritos na publicação de patente Norte Americana US 7.943.743.

[00213] Em uma modalidade da descrição, o anticorpo anti-PD-L1 é MDX-1105.

[00214] Em certas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é MEDI-

4736. Região Constante

[00215] As proteínas e peptídeos da invenção podem incluir uma região constante de uma imunoglobulina ou um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. Em certas modalidades, a região constante é derivada de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ou outras classes. Em certas modalidades, a região constante inclui um domínio CH2. Em certas modalidades, a região constante inclui domínios CH2 e CH3 ou inclui articulação-CH2-CH3. Alternativamente, a região constante pode incluir toda ou uma porção da região de articulação, o domínio CH2 e/ou o domínio CH3.

[00216] Em uma modalidade, a região constante contém uma mutação que reduz a afinidade para um receptor Fc ou reduz a função efetora de Fc. Por exemplo, a região constante pode conter uma mutação que elimina o sítio de glicosilação dentro da região constante de uma cadeia pesada de IgG. Em algumas modalidades, a região constante contém mutações, deleções ou inserções em uma posição de aminoácido correspondente a Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Asn297, ou Pro331 de IgG1 (aminoácidos são numerados de acordo com a nomenclatura EU). Em uma modalidade particular, a região constante contém uma mutação em uma posição de aminoácido correspondente a Asn297 de IgG1. Em modalidades alternativas, a região constante contém mutações, deleções ou inserções em uma posição de aminoácido correspondente a Leu281, Leu282, Gly283, Gly284, Asn344, ou Pro378 de IgG1.

[00217] Em algumas modalidades, a região constante contém um domínio CH2 derivado de uma cadeia pesada de IgG2 ou IgG4 humana. De preferência, o domínio CH2 contém uma mutação que elimina o sítio de glicosilação dentro do domínio CH2. Em uma modalidade, a mutação altera a asparagina dentro da sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn- Ser (SEQ ID NO: 15) dentro do domínio CH2 da cadeia pesada de IgG2 ou IgG4. De preferência, a mutação altera a asparagina para uma glutamina. Alternativamente, a mutação altera a fenilalanina e a asparagina na sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15). Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos Gln-Phe- Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) é substituída por uma sequência de aminoácidos Gln-Ala-Gln-Ser (SEQ ID NO: 16). A asparagina dentro da sequência de aminoácidos Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) corresponde a Asn297 de IgG1.

[00218] Em outra modalidade, a região constante inclui um domínio CH2 e pelo menos uma porção de uma região de articulação. A região de articulação pode ser derivada de uma cadeia pesada de imunoglobulina, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ou outras classes. De preferência, a região de articulação é derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou outras classes adequadas. Mais preferivelmente, a região de articulação é derivada de uma cadeia pesada de IgG1 humana. Em uma Modalidade a cisteína na sequência de aminoácidos Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys (SEQ ID NO: 17) da região de articulação de IgG1 é alterada. Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys (SEQ ID NO: 17) é substituída por uma sequência de aminoácido Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys (SEQ ID NO: 18). Em certas modalidades, a região constante inclui um domínio CH2 derivado de um primeiro isótipo de anticorpo e uma região de articulação derivada de um segundo isótipo de anticorpo. Em certas modalidades, o domínio CH2 é derivado de uma cadeia pesada de IgG2 ou IgG4 humana, enquanto a região de articulação é derivada de uma cadeia pesada de IgG1 humana alterada.

[00219] A alteração de aminoácidos perto da junção da porção Fc e da porção não Fc pode aumentar drasticamente a meia-vida de soro da proteína de fusão Fc (publicação PCT WO 0158957, cuja descrição é aqui incorporada por referência). Por conseguinte, a região de junção de uma proteína ou polipeptídeo da presente descrição pode conter alterações que, em relação às sequências de ocorrência natural de uma cadeia pesada de imunoglobulina e eritropoietina, preferencialmente estão dentro de cerca de 10 aminoácidos do ponto de junção. Essas mudanças de aminoácidos podem causar um aumento na hidrofobicidade. Em uma modalidade, a região constante é derivada de uma sequência de IgG na qual o resíduo de lisina C-terminal é substituído. Preferivelmente, a lisina C-terminal de uma sequência de IgG é substituída por um aminoácido não lisina, como alanina ou leucina, para aumentar ainda mais a meia-vida do soro. Em outra modalidade, a região constante é derivada de uma sequência de IgG na qual a sequência de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) perto do C-terminal da região constante é alterada para eliminar epítopos de células T de junção potenciais. Por exemplo, em uma modalidade, a sequência de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) é substituída por uma sequência de aminoácidos Ala-Thr-Ala- Thr (SEQ ID NO: 20). Em outras modalidades, os aminoácidos dentro do segmento Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) são substituídos por outros aminoácidos, como glicina ou prolina. Métodos detalhados de geração de substituições de aminoácidos do segmento Leu-Ser-Leu- Ser (SEQ ID NO: 19) próximo ao C-terminal de uma IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou outra molécula de classe de imunoglobulina foram descritos na Publicação de Patente Norte Americana nº 20030166877, cuja descrição é aqui incorporada por referência.

[00220] As regiões de articulação adequadas para a presente descrição podem ser derivadas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e outras classes de imunoglobulina. A região de articulação IgG1 tem três cisteínas, duas das quais estão envolvidas em ligações dissulfeto entre as duas cadeias pesadas da imunoglobulina. Essas mesmas cisteínas permitem a formação eficiente e consistente de ligações dissulfeto entre as porções Fc. Portanto, uma região de articulação da presente descrição é derivada de IgG1, por exemplo, IgG1 humana. Em algumas modalidades, a primeira cisteína dentro da região de articulação de IgG1 humana é mutada para outro aminoácido, de preferência serina. A região de articulação do isótipo IgG2 tem quatro ligações dissulfeto que tendem a promover a oligomerização e possivelmente ligação dissulfeto incorreta durante a secreção em sistemas recombinantes. Uma região de articulação adequada pode ser derivada de uma articulação de IgG2; as duas primeiras cisteínas são, cada uma, preferencialmente mutadas para outro aminoácido. A região de articulação de IgG4 é conhecida por formar ligações dissulfeto intercadeias de maneira ineficiente. No entanto, uma região de articulação adequada para a presente descrição pode ser derivada da região de articulação de IgG4, de preferência contendo uma mutação que aumenta a formação correta de ligações dissulfeto entre porções derivadas de cadeia pesada (Angal S., et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8).

[00221] De acordo com a presente descrição, a região constante pode conter domínios CH2 e/ou CH3 e uma região de articulação que são derivados de diferentes isótipos de anticorpos, por exemplo, uma região constante híbrida. Por exemplo, em uma modalidade, a região constante contém domínios CH2 e/ou CH3 derivados de IgG2 ou IgG4 e uma região de articulação mutante derivada de IgG1. Alternativamente, uma região de articulação mutante de outra subclasse de IgG é usada em uma região constante híbrida. Por exemplo, uma forma mutante da articulação de IgG4 que permite a ligação dissulfeto eficiente entre as duas cadeias pesadas pode ser usada. Uma articulação mutante também pode ser derivada de uma articulação IgG2 na qual as duas primeiras cisteínas são mutadas para outro aminoácido. A montagem de tais regiões constantes híbridas foi descrita na Publicação de Patente Norte Americana No. 20030044423, cuja descrição é aqui incorporada por referência.

[00222] De acordo com a presente descrição, a região constante pode conter uma ou mais mutações aqui descritas. As combinações de mutações na porção Fc podem ter efeitos aditivos ou sinérgicos na meia-vida prolongada do soro e aumento na potência in vivo da molécula bifuncional. Assim, em uma modalidade exemplar, a região constante pode conter (i) uma região derivada de uma sequência de IgG na qual a sequência de aminoácidos Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 19) é substituída por uma sequência de aminoácidos Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 20); (ii) um resíduo de alanina C-terminal em vez de lisina; (iii)

um domínio CH2 e uma região de articulação que são derivados de diferentes isótipos de anticorpo, por exemplo, um domínio de CH2 de IgG2 e uma região de articulação de IgG1 alterada; e (iv) uma mutação que elimina o sítio de glicosilação dentro do domínio CH2 derivado de IgG2, por exemplo, uma sequência de aminoácidos Gln-Ala-Gln-Ser (SEQ ID NO: 16) em vez de Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 15) sequência de aminoácidos dentro do domínio CH2 derivado de IgG2. Fragmentos de Anticorpo

[00225] As proteínas e polipeptídeos da descrição também podem incluir fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno. Fragmentos de anticorpo exemplificativos incluem scFv, Fv, Fab, F(ab')2, e fragmentos VHH de domínio único, tais como aqueles de origem de camelídeo.

[00226] Os fragmentos de anticorpos de cadeia única, também conhecidos como anticorpos de cadeia única (scFvs), são polipeptídeos recombinantes que tipicamente se ligam a antígenos ou receptores; esses fragmentos contêm pelo menos um fragmento de um anticorpo de sequência de aminoácidos de cadeia pesada variável (VH) amarrado a pelo menos um fragmento de um anticorpo de sequência de cadeia leve variável (VL) com ou sem um ou mais ligantes de interconexão. Tal ligante pode ser um peptídeo curto e flexível selecionado para garantir que o dobramento tridimensional adequado dos domínios VL e VH ocorra uma vez que eles estão ligados de modo a manter a especificidade de ligação da molécula alvo de todo o anticorpo a partir do qual o único fragmento de anticorpo de cadeia é derivado. Geralmente, o terminal carboxila da sequência VL ou VH é covalentemente ligado por tal ligante peptídico ao terminal de aminoácido de uma sequência complementar VL e VH. Os fragmentos de anticorpo de cadeia única podem ser gerados por clonagem molecular, biblioteca de exibição de fago de anticorpo ou técnicas semelhantes. Estas proteínas podem ser produzidas em células eucarióticas ou procarióticas, incluindo bactérias.

[00227] Os fragmentos de anticorpos de cadeia única contêm sequências de aminoácidos com pelo menos uma das regiões variáveis ou CDRs de todos os anticorpos descritos nesta especificação, mas não possuem alguns ou todos os domínios constantes desses anticorpos. Esses domínios constantes não são necessários para a ligação ao antígeno, mas constituem uma parte importante da estrutura de anticorpos inteiros. Os fragmentos de anticorpos de cadeia única podem, portanto, superar alguns dos problemas associados ao uso de anticorpos contendo parte ou todo um domínio constante. Por exemplo, fragmentos de anticorpos de cadeia única tendem a estar livres de interações indesejadas entre as moléculas biológicas e a região constante da cadeia pesada, ou outra atividade biológica indesejada. Além disso, os fragmentos de anticorpos de cadeia simples são consideravelmente menores do que os anticorpos inteiros e podem, portanto, ter maior permeabilidade capilar do que os anticorpos inteiros, permitindo que os fragmentos de anticorpos de cadeia única localizem e se liguem a sítios de ligação ao antígeno alvo de forma mais eficiente. Além disso, fragmentos de anticorpos podem ser produzidos em uma escala relativamente grande em células procarióticas, facilitando assim sua produção. Além disso, o tamanho relativamente pequeno dos fragmentos de anticorpo de cadeia única torna-os menos prováveis do que os anticorpos inteiros de provocar uma resposta imune em um receptor.

[00228] Fragmentos de anticorpos que têm as mesmas ou características de ligação comparáveis às do anticorpo inteiro também podem estar presentes. Tais fragmentos podem conter um ou ambos os fragmentos Fab ou o fragmento F(ab')2. Os fragmentos de anticorpo podem conter todas as seis CDRs de todo o anticorpo, embora fragmentos contendo menos do que todas essas regiões, como três,

quatro ou cinco CDRs, também sejam funcionais. Composições Farmacêuticas

[00229] A presente descrição também apresenta composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína aqui descrita. A composição pode ser formulada para uso em uma variedade de sistemas de liberação de fármacos. Um ou mais excipientes ou carreadores fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos na composição para a formulação adequada. As formulações adequadas para uso na presente descrição são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadélfia, Pa., 17ª ed., 1985. Para uma breve revisão dos métodos para administração de fármacos, ver, por exemplo, Langer (Science 249:1527-1533, 1990).

[00230] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma formulação de administração intravenosa de fármacos para uso em um método de tratamento de TNBC que inclui 500 mg a 2.400 mg de uma proteína incluindo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, o primeiro polipeptídeo inclui: (a) pelo menos uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga à proteína humana Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1); e (b) Receptor II de Fator β de Crescimento Transformante (TGFβRII), ou um fragmento do mesmo, capaz de ligar o Fator β de Crescimento Transformante (TGFβ), o segundo polipeptídeo inclui pelo menos uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-L1, e a cadeia pesada do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve do segundo polipeptídeo, quando combinadas, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga à PD- L1.

[00231] Em certas modalidades, um produto de proteína da presente descrição inclui um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um produto de proteína da presente descrição inclui um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40.

[00232] Em certas modalidades da presente descrição, a formulação de liberação de fármaco intravenoso para uso em um método de tratamento de TNBC pode incluir uma dose de cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg a cerca de 2300 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2200 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2100 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1300 mg, cerca de 1300 mg a 2400 mg, cerca de 1400 mg a 2400 mg, cerca de 1500 mg a 2400 mg, cerca de 1600 mg a 2400 mg, cerca de 1700 mg a 2400 mg, cerca de 1800 mg a 2400 mg, cerca de 1900 mg a 2400 mg, cerca de 2000 mg a 2400 mg, cerca de 2100 mg a 2400 mg, cerca de 2200 mg a 2400 mg, ou cerca de 2300 mg a 2400 mg) de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1)). Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de cerca de 2100 a cerca de 2000 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1)). Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de cerca de 2100 mg de um produto proteico da presente descrição com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármacos intravenosos pode incluir uma dose de 2100 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1)). Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de cerca de 1200 mg de um produto de proteína da presente descrição com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de 1200 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD- L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1)). Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de cerca de 1800 mg de um produto de proteína da presente descrição com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de 1800 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1)).

[00233] Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de cerca de 2400 mg de um produto de proteína da presente descrição com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de cerca de 2400 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD- L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1)). Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de 2400 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40)).

[00234] Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenosa pode incluir uma dose de 1800 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e o segundo polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40)). Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de 2100 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo compreendendo como sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40)). Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso pode incluir uma dose de 2400 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40)).

[00235] Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso para uso em um método de tratamento de TNBC pode incluir de cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2300 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2200 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2100 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1300 mg, cerca de 1300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1900 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2000 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2100 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de

2800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2900 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2100 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2400 mg, cerca de 2500 mg, cerca de 2600 mg, cerca de 2700 mg, cerca de 2800 mg, cerca de 2900 mg, ou cerca de 3000 mg) de um produto de proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ). Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenoso para uso em um método de tratamento de TNBC pode incluir de cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2300 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2200 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2100 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1300 mg, cerca de 1300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1900 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2000 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2100 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de

2900 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2100 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2400 mg, cerca de 2500 mg, cerca de 2600 mg, cerca de 2700 mg, cerca de 2800 mg, cerca de 2900 mg, ou cerca de 3000 mg) de um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; ou um produto proteico com um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40.

[00236] Em certas modalidades, a formulação de liberação de fármaco intravenosa para uso em um método de tratamento de TNBC pode incluir cerca de 1.200 mg, cerca de 1.225 mg, cerca de 1.250 mg, cerca de 1.275 mg, cerca de 1.300 mg, cerca de 1.325 mg, cerca de

1.350 mg, cerca de 1.375 mg, cerca de 1.400 mg, cerca de 1.425 mg, cerca de 1.450 mg, cerca de 1.475 mg, cerca de 1.500 mg, cerca de

1.525 mg, cerca de 1550 mg, cerca de 1.575 mg, cerca de 1.600 mg, cerca de 1.625 mg, cerca de 1.650 mg, cerca de 1675 mg, cerca de

1.700 mg, cerca de 1.725 mg, cerca de 1.750 mg, cerca de 1.775 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1.825 mg, cerca de 1.850 mg, cerca de

1.875 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 1.925 mg, cerca de 1.950 mg, cerca de 1.975 mg, cerca de 2.000 mg, cerca de 2025 mg, cerca de

2.050 mg, cerca de 2.075 mg, cerca de 2.100 mg, cerca de 2.125 mg, cerca de 2.150 mg, cerca de 2.175 mg, cerca de 2200 mg, cerca de

2.225 mg, cerca de 2250 mg, cerca de 2.275 mg, cerca de 2.300 mg, cerca de 2.325 mg, cerca de 2.350 mg, cerca de 2.375 mg, ou cerca de

2.400 mg de uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ compreendendo um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40).

[00237] A formulação de liberação intravenosa de fármacos da presente descrição para uso em um método de tratamento de TNBC pode estar contida em uma bolsa, uma caneta ou uma seringa. Em certas modalidades, uma bolsa pode ser conectada a um canal compreendendo um tubo e/ou uma agulha. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liofilizada ou uma formulação líquida. Em certas modalidades, a formulação pode ser secada por congelamento (liofilizada) e contida em cerca de 12 a 60 frasconetes. Em certas modalidades, a formulação pode ser secada por congelamento e cerca de 45 mg da formulação liofilizada podem estar contidos em um frasconete. Em certas modalidades, cerca de 40 mg a cerca de 100 mg de formulação secada por congelamento podem estar contidos em um frasconete. Em certas modalidades, as formulações secadas por congelamento de 12, 27 ou 45 frasconetes são combinadas para obter uma dose terapêutica de proteína na formulação do fármaco intravenoso. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida de produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; ou um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40, e armazenado com cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete (por exemplo, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1900 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1800 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1700 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1600 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1500 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1400 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1300 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1200 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1100 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 1000 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 900 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 800 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 700 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 600 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 500 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 400 mg/frasconete, cerca de 250 mg/frasconete a cerca de 300 mg/frasconete, cerca de 300 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 400 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 500 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 600 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 700 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 800 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 900 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 1000 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 1100 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 1200 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 1300 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 1400 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 1500 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 1600 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 1700 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, cerca de 1800 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete, ou cerca de 1900 mg/frasconete a cerca de 2000 mg/frasconete). Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 600 mg/frasconete. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 1200 mg/frasconete. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 1800 mg/frasconete. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 2400 mg/frasconete. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasconete.

[00238] Esta descrição fornece uma formulação farmacêutica líquida aquosa incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína da presente descrição (por exemplo, anti-PD-L1/TGFβ Trap) em uma solução tamponada formando uma formulação para uso em um método de tratamento TNBC.

[00239] Essas composições para uso em um método de tratamento de TNBC podem ser esterilizadas por técnicas convencionais de esterilização, ou podem ser esterilizadas por filtração. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso no estado em que se encontram ou liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com um veículo aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações tipicamente estará entre 3 e 11, mais preferencialmente entre 5 e 9 ou entre 6 e 8, e mais preferencialmente entre 7 e 8, tal como 7 a 7,5. As composições resultantes na forma sólida podem ser embaladas em múltiplas unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do agente ou agentes mencionados acima. A composição na forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexível.

[00240] Em certas modalidades, a presente descrição fornece para uso em um método de tratamento de TNBC, uma formulação com uma vida útil estendida incluindo uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1)), em combinação com manitol, ácido cítrico mono- hidratado, citrato de sódio, fosfato dissódico di-hidratado , di- hidrogenofosfato de sódio di-hidratado, cloreto de sódio, polissorbato 80, água e hidróxido de sódio.

[00241] Em certas modalidades, uma formulação aquosa para uso em um método de tratamento de TNBC é preparada incluindo uma proteína da presente descrição (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; ou um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40) em uma solução tamponada com pH. O tampão desta invenção pode ter um pH variando de cerca de 4 a cerca de 8, por exemplo, de cerca de 4 a cerca de 8, de cerca de 4,5 a cerca de 8, de cerca de 5 a cerca de 8, de cerca de 5,5 a cerca de 8, de cerca de 6 a cerca de 8, de cerca de 6,5 a cerca de 8, de cerca de 7 a cerca de 8, de cerca de 7,5 a cerca de 8, de cerca de 4 a cerca de 7,5, de cerca de 4,5 a cerca de 7,5, de cerca de 5 a cerca de 7,5, de cerca de 5,5 a cerca de 7,5, de cerca de 6 a cerca de 7,5, de cerca de 6,5 a cerca de 7,5, de cerca de 4 a cerca de 7, de cerca de 4,5 a cerca de 7, de cerca de 5 a cerca de 7, de cerca de 5,5 a cerca de 7, de cerca de 6 a cerca de 7, de cerca de 4 a cerca de 6,5, de cerca de 4,5 a cerca de 6,5, de cerca de 5 a cerca de 6,5, de cerca de 5,5 a cerca de 6,5, de cerca de 4 a cerca de 6,0, de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, de cerca de 5 a cerca de 6, ou de cerca de 4,8 a cerca de 5,5, ou pode ter um pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Intervalos intermediários aos pHs citados acima também se destinam a fazer parte desta descrição. Por exemplo, intervalos de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores citados acima como limites superior e/ou inferior devem ser incluídos. Exemplos de tampões que irão controlar o pH dentro desta faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), sucinato (tal como sucinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácido orgânico.

[00242] Em certas modalidades, a formulação para uso em um método de tratamento de TNBC inclui um sistema tampão que contém citrato e fosfato para manter o pH em uma faixa de cerca de 4 a cerca de 8. Em certas modalidades, a faixa de pH pode ser de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, ou de cerca de pH 4,8 a cerca de 5,5, ou em uma faixa de pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui ácido cítrico mono-hidratado, citrato de sódio, fosfato dissódico di-hidratado e/ou di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado. Em certas modalidades, o sistema de tampão inclui cerca de 1,3 mg/ml de ácido cítrico (por exemplo, 1,305 mg/ml), cerca de 0,3 mg/ml de citrato de sódio (por exemplo, 0,305 mg/ml), cerca de 1,5 mg/ml de fosfato dissódico di-hidratado (por exemplo, 1,53 mg/ml), cerca de 0,9 mg/ml de di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (por exemplo, 0,86), e cerca de 6,2 mg/ml de cloreto de sódio (por exemplo, 6,165 mg/ml). Em certas modalidades, o sistema tampão inclui cerca de 1 a 1,5 mg/ml de ácido cítrico, cerca de 0,25 a cerca de 0,5 mg/ml de citrato de sódio, cerca de 1,25 a cerca de 1,75 mg/ml de fosfato dissódico di-hidratado, cerca de 0,7 a cerca de 1,1 mg/ml de di-hidrogenofosfato de sódio di- hidratado, e 6,0 a 6,4 mg/ml de cloreto de sódio. Em certas modalidades, o pH da formulação é ajustado com hidróxido de sódio.

[00243] Um poliol, que atua como um tonicificante e pode estabilizar o anticorpo, também pode ser incluído na formulação. O poliol é adicionado à formulação em uma quantidade que pode variar em relação à isotonicidade desejada da formulação. Em certas modalidades, a formulação aquosa pode ser isotônica. A quantidade de poliol adicionado também pode alterar em relação ao peso molecular do poliol. Por exemplo, uma quantidade inferior de um monossacarídeo (por exemplo, manitol) pode ser adicionada, em comparação com um dissacarídeo (como a trealose). Em certas modalidades, o poliol que pode ser usado na formulação como um agente de tonicidade é o manitol. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 5 a cerca de 20 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 7,5 a cerca de 15 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 10 a cerca de 14 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 12 mg/ml. Em certas modalidades, o poliol sorbitol pode ser incluído na formulação.

[00244] Um detergente ou tensoativo também pode ser adicionado à formulação. Detergentes exemplares incluem detergentes não iônicos, tais como polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80, etc.) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188). A quantidade de detergente adicionada é tal que reduz a agregação do anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de partículas na formulação e/ou reduz a adsorção. Em certas modalidades, a formulação pode incluir um tensoativo que é um polissorbato. Em certas modalidades, a formulação pode conter o detergente polissorbato 80 ou Tween 80. Tween 80 é um termo usado para descrever polioxietileno (20) mono-oleato de sorbitano (ver Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4ª edição, 1996). Em certas modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL de polissorbato 80, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL. Em certas modalidades, cerca de 0,1% de polissorbato 80 pode ser adicionado à formulação. Formulação Liofilizada

[00245] A formulação liofilizada para uso em um método de tratamento de TNBC da presente descrição inclui a molécula TRAP anti- PD-L1/TGFβ e um lioprotetor. O lioprotetor pode ser açúcar, por exemplo, dissacarídeos. Em certas modalidades, o lioprotetor pode ser sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode incluir um ou mais de um agente de tamponamento, um tensoativo, um agente de volume e/ou um conservante.

[00246] A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização do fármaco liofilizado pode estar em uma relação em peso de pelo menos 1:2 de proteína para sacarose ou maltose. Em certas modalidades, a relação em peso de proteína para sacarose ou maltose pode ser de 1:2 a 1:5.

[00247] Em certas modalidades, o pH da formulação, antes da liofilização, pode ser definido pela adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base farmaceuticamente aceitável pode ser hidróxido de sódio.

[00248] Antes da liofilização, o pH da solução contendo proteína da presente descrição pode ser ajustado entre cerca de 6 a cerca de 8. Em certas modalidades, a faixa de pH para o fármaco liofilizado pode ser de cerca de 7 a cerca de 8.

[00249] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tampão podem ser adicionados em uma quantidade de cerca de 10 mM a cerca de 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas "formadores de base". Em certas modalidades,

o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser glicinato, carbonato, tampões de citrato, caso em que, íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contraíon.

[00250] Em certas modalidades, um "agente de volume" pode ser adicionado. Um "agente de volume" é um composto que adiciona massa a uma mistura liofilizada e contribui para a estrutura física do bolo liofilizado (por exemplo, facilita a produção de um bolo liofilizado essencialmente uniforme que mantém uma estrutura de poro aberta). Agentes de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietilenoglicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter tais agentes de volume.

[00251] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (dose múltipla).

[00252] Em certas modalidades, o fármaco liofilizado para uso em um método de tratamento de TNBC ou inibição do crescimento tumoral em um paciente com câncer pode ser constituído com um carreador aquoso. O carreador aquoso de interesse aqui é aquele que é farmaceuticamente aceitável (por exemplo, seguro e não tóxico para administração a um humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida, após liofilização. Os diluentes ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[00253] Em certas modalidades, o fármaco liofilizado da descrição atual é reconstituído com Água Estéril para Injeção, USP (SWFI) ou Injeção de Cloreto de Sódio a 0,9%, USP. Durante a reconstituição, o pó liofilizado se dissolve em uma solução.

[00254] Em certas modalidades, o produto de proteína liofilizada da presente descrição é constituído em cerca de 4,5 ml de água para injeção e diluído com solução salina a 0,9% (solução de cloreto de sódio). Formulação Líquida

[00255] Em modalidades, o produto de proteína da presente invenção é formulado como uma formulação líquida para uso em um método de tratamento de TNBC. A formulação líquida pode ser apresentada em uma concentração de 10 mg/mL em ambos os frascos USP/Ph Eur tipo I 50R fechados com uma tampa de borracha e selados com um fecho de alumínio franzido. A tampa pode ser feita de elastômero de acordo com USP e Ph Eur. Em certas modalidades, frasconetes podem ser preenchidos com cerca de 61,2 mL de um produto de solução de proteína de modo a permitir um volume extraível de 60 mL. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser diluída com 0,9% de solução salina. Em certas modalidades frascos podem conter cerca de 61,2 mL de um produto de proteína (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1)) solução de cerca de 20 mg/mL a cerca de 50 mg/mL (por exemplo, cerca de 20 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 30 mg/mL, cerca de 35 mg/mL, cerca de 40 mg/mL, cerca de 45 mg/mL ou cerca de 50 mg/mL) de modo a permitir um volume extraível de 60 mL para liberação de cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2300 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2200 mg, cerca de

1200 mg a cerca de 2100 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1300 mg, cerca de 1300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1900 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2000 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2100 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2900 mg a cerca de 3000 mg,about 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2100 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2400 mg, cerca de 2500 mg, cerca de 2600 mg, cerca de 2700 mg, cerca de 2800 mg, cerca de 2900 mg, ou cerca de 3000 mg) de um produto de proteína (por exemplo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ (por exemplo, incluindo um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; ou um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40)) a um indivíduo.

[00256] Em certas modalidades, frascos podem conter cerca de 61,2 mL de um produto de solução de proteína (produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e um segundo polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; ou um produto de proteína com um primeiro polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e um segundo polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40) de cerca de 20 mg/mL a cerca de 50 mg/mL (por exemplo, cerca de 20 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 30 mg/mL, cerca de 35 mg/mL, cerca de 40 mg/mL, cerca de 45 mg/mL ou cerca de 50 mg/mL) de modo a permitir um volume extraível de 60 mL para liberação de cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg (por exemplo, cerca de 1200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2300 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2200 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2100 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1900 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1800 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1700 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1600 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1500 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1400 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1300 mg, cerca de 1300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 1900 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2000 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2100 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2300 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2400 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2500 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2600 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2700 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 2800 mg a cerca de 3000 mg, cerca de

2900 mg a cerca de 3000 mg,about 1200 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg, cerca de 2000 mg, cerca de 2100 mg, cerca de 2200 mg, cerca de 2300 mg, cerca de 2400 mg, cerca de 2500 mg, cerca de 2600 mg, cerca de 2700 mg, cerca de 2800 mg, cerca de 2900 mg, ou cerca de 3000 mg) de um produto de proteína a um indivíduo.

[00257] Em certas modalidades, a formulação líquida para uso em um método de tratamento de TNBC ou inibição de crescimento de tumor em um paciente com câncer da invenção pode ser preparada como uma solução de concentração de 10 mg/mL em combinação com um açúcar em níveis estabilizantes. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser preparada em um veículo aquoso. Em certas modalidades, um estabilizante pode ser adicionado em uma quantidade não maior que aquela que pode resultar em uma viscosidade indesejada ou inadequada para administração intravenosa. Em certas modalidades, o açúcar pode ser dissacarídeo, por exemplo, sacarose. Em certas modalidades, a formulação líquida pode também incluir um ou mais agentes de tamponamento, um tensoativo, e um conservante.

[00258] Em certas modalidades, o pH da formulação líquida pode ser definido pela adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido hidroclórico. Em certas modalidades, a base pode ser hidróxido de sódio.

[00259] Além de agregação, desamidação, é uma variante de produto comum de peptídeos e proteínas que podem ocorrer durante fermentação, colheita/clarificação de células, purificação, armazenamento de substância de fármaco/produto de fármaco e durante a análise da amostra. Desamidação é a perda de NH3 de uma proteína formando um intermediário de sucinimida que pode sofrer hidrólise. O intermediário de sucinimida resulta em uma diminuição de 17 unidades de massa do peptídeo. A hidrólise subsequente resulta em um aumento de 18 unidades de massa. Isolamento do intermediário de sucinimida é difícil devido à instabilidade sob condições aquosas. Sendo assim, desamidação é normalmente detectável como aumento de 1 unidade de massa. Desamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de desamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica de solvente, força iônica, sequência primária, conformação de polipeptídeo local e estrutura terciária. Os resíduos de aminoácidos adjacentes ao Asn na cadeia do peptídeo afetam as taxas de desamidação. Gly e Ser seguindo um Asn em sequências de proteínas resultam em uma maior suscetibilidade à desamidação.

[00260] Em certas modalidades, a formulação líquida para uso em um método de tratamento de TNBC ou inibição de crescimento de tumor em um paciente com câncer da presente invenção pode ser preservada sob condições de pH e umidade para prevenir desaminação de um produto de proteína.

[00261] O veículo aquoso de interesse é aquele que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

[00262] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (dose múltipla).

[00263] Formulações intravenosas (IV) podem ter a taxa de administração preferida em casos particulares, tal como quando um paciente está no hospital após transplante recebendo todos os fármacos por meio da via IV. Em certas modalidades, a formulação líquida é diluída com 0,9% de solução de Cloreto de Sódio antes da administração. Em certas modalidades, o produto de fármaco diluído para injeção é isotônico e adequado para administração por infusão intravenosa.

[00264] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tamponamento podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM a 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas "de formação de base". Em certas modalidades, o tampão pode ser um tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões de glicinato, carbonato, citrato, em cujos casos, íons de sódio, potássio, ou amônio podem servir como contra- íon.

[00265] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (dose múltipla).

[00266] O veículo aquoso de interesse aqui é aquele que é farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração em um humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Veículos ilustrativos incluem água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, salina tamponada de fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução dextrose.

[00267] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações aqui para reduzir ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (dose múltipla).

[00268] A descrição acima descreve múltiplos aspectos e modalidades da invenção. O pedido de patente especificamente contempla todas as combinações e permutações dos aspectos e modalidades.

EXEMPLOS

[00269] A invenção sendo agora geralmente descrita será mais facilmente entendida por referência aos seguintes exemplos, que estão incluídos meramente para propósitos de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não se destinam a limitar o escopo da invenção de qualquer jeito. EXEMPLO 1: Identificação de HMGA2 e MECOM como preditores entre pacientes com TNBC para resposta a uma terapia de proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ

[00270] Este exemplo refere-se a um método que identificou HMGA2 e MECOM como dois preditores de responsividade a uma terapia de proteína anti-PD-L1/TGFβ entre os pacientes com TNBC. 33 pacientes com TNBC foram tratados com proteína bifuncional TRAP anti-PD- L1/TGFβ, e amostras de tumor destes pacientes foram analisadas para distinguir respondedores versus não respondedores para tratamento com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[00271] Cada uma das 30 amostras de tumor foi anotada por um patologista credenciada. RNA foi extraído de três raspagens de lâmina inteira de seções de 4 a 5 µm de espessura com um conteúdo de tumor de >50%, usando Recoverall Total Nucleic Acid Isolation Kit para amostras embebidas por parafina fixadas por formalina (ThermoFisher Scientific). 200 ng de RNA total, quantificados usando reagente de RNA RiboGreen® (Life Technologies), foi esgotado de RNA ribossômico usando o Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Illumina). Bibliotecas específicas de cadeias foram preparadas usando o NEBNext Ultra

Directional RNA Library Prep Kit (NEB) e sequenciadas em um HiSeq2500 (Illumina) usando sequenciamento de extremidade pareada de 2x50 pares de base. Aproximadamente 100 milhões de leituras por amostra foram obtidas.

[00272] Resposta do paciente a tratamento com TRAP anti-PD- L1/TGFβ foi codificada usando critério RECIST 1,1. Níveis de expressão de gene entre respondedores (um grupo de indivíduos com melhor resposta geral de doença estável, resposta parcial ou resposta completa) foram comparados com níveis entre não respondedores (indivíduos com melhor resposta geral de doença progressiva).

[00273] Leituras de sequenciamento foram alinhadas contra o genoma humano Ensembl 75 (GRCh37 Fevereiro de 2014) usando Bowtie2 versão 2.2.3. (Langmead, Nat Methods, 9:357-359 (2012)). Expressão de gene foi determinada usando RSEM versão 1.2.31 com as anotações de gene Ensembl. (Li, BMC Bioinformatics 12:323(2011)). Uma amostra indefinida com anormalmente poucos genes detectáveis foi excluída de análises posteriores. Teste de hipóteses foi realizado comparando contagens esperadas calculadas por RSEM. Valores de transcrito por milhão (TPM) foram normalizados no quartil superior e transformados por log para análise adicional.

[00274] Análises estatísticas descritivas foram realizadas usando R versão 3.3.1. (Hornik K, The R FAQ, disponível em https://CRAN.R- project.org/doc/FAQ/R-FAQ.html). Coeficientes de correlação foram calculados usando o método Pearson. Significado da expressão diferencial foi estabelecido usando o pacote ‘R’ ‘DESeq2’ para genes individuais; valores de p corrigidos por FDR < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Planos foram gerados usando o pacote ‘R‘ ‘ggplot2’.

[00275] De 60.234 transcritos anotados que foram testados, um conjunto de biomarcadores candidatos foi identificado filtrando de acordo com os seguintes requisitos: (1) Requer expressão diferencial; (2) requer genes codificadores de proteína; (3) requer expressão mínima; (4) requer separação de grupos.

[00276] Requer expressão diferencial: Todos os genes anotados foram primeiro testados usando DESeq2 como descrito acima; valores de q foram obtidos, denotando a importância da expressão diferencial. Qualquer gene com valor de q maior do que 0,05 foi rejeitado.

[00277] Requer genes codificadores de proteína: BiomaRt foi usado para estabelecer se o identificador do gene Ensembl para cada transcrito mapeado correspondeu a um modelo de gene codificador de proteína. O "gene_biotipo" para cada ID de gene de biomaRt foi obtido, e categorizado como codificador ou não codificador. Os seguintes biotipos foram categorizados como não codificadores: 3prime_overlapping_ncrna, antisense, IG_C_pseudogene, IG_J_pseudogene, IG_V_pseudogene, lincRNA, miRNA, misc_RNA, Mt_rRNA, Mt_tRNA, pseudogene, rRNA, sense_intronic, sense_overlapping, snoRNA, snRNA, TR_J_pseudogene, e TR_V_pseudogene. Os seguintes biotipos foram categorizados como codificadores: TR_D_gene, TR_C_gene, IG_C_gene, IG_J_gene, IG_D_gene, polymorphic_pseudogene, TR_J_gene, TR_V_gene, IG_V_gene, processed_transcript, protein_coding. Genes com um biotipo não codificador foram rejeitados como biomarcadores candidatos devido à baixa interpretabilidade.

[00278] Requer expressão mínima: Para cada gene, o TPM médio entre respondedores e entre não respondedores foi identificado. Se o TPM médio para um determinado gene for abaixo de 0,5 em respondedores e não respondedores, aquele gene é rejeitado como um biomarcador candidato.

[00279] Requer separação de grupos: um biomarcador predizível ideal separa respondedores de não respondedores com precisão.

DESeq2 avalia a diferença na expressão média entre grupos, porém a diferença de médias pode ser chamada de significativa mesmo que haja sobreposição perceptível nos níveis de expressão em cada grupo (ver FIGs. 4A-D). Além disso, DESeq2 pode ser sensível a grandes valores indefinidos. Para corrigir ambos os problemas, um teste Mann-Whitney U foi aplicado para testar separação de grupos. Todos os genes cujo valor de p nominal p ultrapassou 0,05 foram rejeitados.

[00280] 28 genes foram identificados como atendendo a todos os requisitos. Destes 28 genes, dois genes, HMGA2 e MECOM, foram identificados como tendo a maior significância estatística de todos os genes analisados. FIGs. 4A-D mostra gráficos de caixa de log-TPM de diversos biomarcadores preditivos potenciais plotados quanto ao status de resposta de pacientes tratados com a proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ. A FIG. 4A mostra um gráfico de caixa de log-TPM de HMGA2 traçado quanto ao status de resposta de pacientes tratados com a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. A FIG. 4B mostra um gráfico de caixa de log-TPM de MECOM traçado quanto ao status de pacientes tratados com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. FIG. 4B mostra um gráfico de caixa de log-TPM de MECOM plotado quanto ao status de resposta de pacientes tratados com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. FIG. 4C mostra um gráfico de caixa de log-TPM de CLEC3A plotado quanto ao status de resposta de pacientes tratados com proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ. FIG. 4D mostra um gráfico de caixa de log-TPM de CCNDBP1 plotado quanto ao status de resposta de pacientes tratados com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[00281] Para demonstrar o efeito do requisito de separação de grupos, níveis de expressão para CLEC3A e CCNDBP1 foram também analisados. Estes dois genes tiveram os menores valores de q calculados por DESeq2 entre todos os genes que passaram nos requisitos de expressão diferencial, codificação de proteína e expressão mínima, mas falharam no requisito de separação de grupos (ver FIGs. 4C-D (dados NE foram excluídos do teste de hipótese)). Grandes mudanças duplicadas para estes genes foram observadas em ambos os respondedores e não respondedores. As grandes mudanças duplicadas calculadas para CLEC3A pareceram ser conduzidas por um único, grande valor extremo, e expressão de gene entre os respondedores restantes foi apenas modestamente elevado (ver FIG. 4C (dados NE foram excluídos do teste de hipótese)). Embora a expressão de CCNDBP1 tenha sido elevada 9,6 vezes entre os respondedores, os níveis de expressão de CCNDBP1 entre os respondentes abrangeram quase toda a faixa de expressão entre os não respondedores (ver FIG. 4D (Dados de NE foram excluídos do teste de hipótese)). Os grandes valores de p obtidos do teste U de Mann-Whitney para esses genes refletirem com precisão essas deficiências.

[00282] Expressão aumentada de genes HMGA2 e MECOM se mostrou ser associado com mau prognóstico em câncer de mama (Wu et al., Cancer Letters 2016; Wang et al., Cancer Research 2017). Essa associação sugeriu que a observação de uma associação positiva com a resposta não foi confundida pela redução da gravidade da doença entre os respondentes. Além disso, ambos os genes têm associação bem conhecida com biologia de TGFβ (Thualt et al., Cell Biology 2006; Liu et al., Oncogene 2006), apoiando uma explicação mecânica para seu poder predizível em tratamento de pacientes com TNBC com TRAP anti-PD-L1/TGFb da presente invenção.

[00283] Como mostrado em FIGs. 2A (HMGA2) e 3B (MECOM), ambos HMGA2 e MECOM foram considerados superexpressos por mais do que 20 vezes em respondedores quando comparados com não respondedores. Em FIG. 2A, níveis de expressão de HMGA2 (log de transcritos por milhão (TPM)) são plotados quanto à resposta à proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ (PD = doença progressiva; SD = doença estável; PR = resposta parcial). Alta expressão de HMGA2 é considerada como o nível de expressão pelo menos tão alta quanto à expressão mais baixa de HMGA2 entre os pacientes que respondem ao tratamento com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Como mostrado em FIG. 2A, expressão de HMGA2 foi considerada significativamente maior (pelo menos 35 vezes) em comparação com os níveis de expressão entre os não respondedores. Dados de NE foram excluídos do teste de hipótese.

[00284] Em FIG. 3B, níveis de expressão de MECOM (log de transcritos por milhão (TPM)) são plotados quanto à resposta à proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ (PD = doença progressiva; SD = doença estável; PR = resposta parcial). Alta expressão de MECOM é considerada como o nível de expressão pelo menos tão alta quanto a menor expressão de MECOM entre os pacientes que respondem ao tratamento com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Como mostrado em FIG. 3B, expressão de MECOM foi considerada significantemente mais alta (pelo menos 20 vezes) comparada com os níveis de expressão entre os não respondedores. Dados de NE foram excluídos do teste de hipótese.

[00285] De modo a testar se uma resposta clínica pode ser prevista em pacientes com TNBC tratados com um anticorpo anti-PD-L1, os dados foram extraídos de indivíduos com câncer de mama metastático em coorte de câncer de mama metastático (METBRC). Este estudo foi realizado para distinguir respondedores versus não respondedores para tratamento com um anticorpo anti-PD-L1. Neste estudo, pacientes com câncer de mama metastático foram tratados com um anticorpo anti-PD- L1. Três categorias diferentes foram consideradas: (1) receptor 2 positivo do fator de crescimento epidérmico humano, "HER2+", (2) receptor 2 negativo do fator de crescimento epidérmico humano, (receptor de estrogênio positivo ou receptor de progesterona positivo),

"HER2-, (ER+ ou PR+)", e (3) receptor 2 negativo do fator de crescimento epidérmico humano, (receptor de estrogênio negativo e receptor de progesterona negativo),"HER2-, (ER- e PR-)". Enquanto o último grupo correspondia a câncer de mama triplo negativo (TNBC), os primeiros 2 grupos foram considerados não TNBC.

[00286] Dados de RNAseq estavam disponíveis para 16 indivíduos com TNBC e para 21 com não TNBC tratados com um anticorpo anti- PD-L1. FIG. 10 é um gráfico de caixa mostrando expressão de HMGA2 (em transcrito por milhão, TPM) e status de TNBC de indivíduos tratados com um anticorpo anti-PD-L1. FIG. 10 mostra que não há diferença aparente na expressão do gene HMGA2 entre os indivíduos com não TNBC versus aqueles com TNBC tratados com um anticorpo anti-PD- L1.

[00287] Expressão de HMGA2 e sua associação com resposta clínica a um anticorpo anti-PD-L1 foram também avaliadas. FIG. 11 mostra expressão de HMGA2 (em TPM) versus resposta em painéis separados para indivíduos não TNBC (esquerda) e para TNBC (direita) tratados com um anticorpo anti-PD-L1. Como mostrado em FIG. 11, níveis baixos de expressão de gene HMGA2 estavam presentes em 1 indivíduo com não TNBC com uma resposta completa (CR), enquanto todos os outros indivíduos mostraram níveis sobrepostos de expressão de HMGA2 independentemente de resposta ao anticorpo anti-PD-L1. Níveis de expressão baixos de gene HMGA2 estavam presentes em 1 indivíduo com TNBC com a resposta parcial (PR), enquanto todos os outros indivíduos mostraram níveis sobrepostos de expressão de HMGA2. Em ambos os casos (não TNBC e TNBC), parece não haver diferença clara entre respondedores (CR/PR) e não respondedores (doença estável, SD/doença progressiva, PD).

[00288] Os dados apresentados neste exemplo mostram que uma resposta clínica pode ser prevista em pacientes com TNBC tratados com a TRAP anti-PD-L1/TGFβ da presente invenção. A previsão da resposta clínica não é clara quando os pacientes com TNBC são tratados apenas com anticorpo anti-PD-L1. EXEMPLO 2: Avaliação de associação entre expressão de HMGA2 e sinalização de TGF-β

[00289] De modo a avaliar a associação entre expressão de HMGA2 e sinalização de TGF-β, estudos em animais foram realizados. Resumidamente, injeção de tumor ortotópica foi realizada injetando 0,2 x 106 células 4T1 viáveis suspensas em 0,1 mL de 1 x PBS na gordura mamária de camundongos Balb/C com 8 a 10 semanas de idade. Uma vez que o volume do tumor atingiu 100 a 150 mm3, camundongos foram randomizados e atribuídos a um dos seguintes grupos de tratamento: controle, controle de TRAP, anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Os camundongos do grupo de controle foram dosados com 400 µg de controle de isotipo (hIgG1) - anti-PD-L1(mut); camundongos no controle de TRAP foram dosados com 492 µg de TRAP anti-PD-L1(mut)/TGFβ (proteína de fusão TRAP anti-PD-L1(mut)/TGFβ contém um polipeptídeo de fusão de cadeia pesada análoga (SEQ ID No: 7) e uma cadeia leve com as mutações A31G, D52E, R99Y na região variável que revogam a ligação a PD-L1 (SEQ ID No: 6)); camundongos no grupo anti-PD-L1 foram dosados com 400 µg de anti-PD-L1; e camundongos no grupo TRAP anti-PD-L1/TGFβ foram dosados com 492 µg de TRAP anti-PD-L1/TGFβ por meio de injeção intravenosa uma vez a cada três semanas (QDx3). Os animais experimentais foram sacrificados no dia 6 e as amostras de tumor foram colhidas.

[00290] RNAseq foi realizado nas amostras de tecido tumoral colhidas dos quatro grupos de tratamento. Os dados de sequenciamento brutos foram processados com controle de qualidade padrão (QC) e pipeline de alinhamento, como descrito no Exemplo 1, com a exceção de que as leituras de sequenciamento foram mapeadas quanto ao o genoma do mouse Ensemble 75 (GRCm38 Fevereiro de 2014). Dados de expressão normalizados foram gerados e usados para a análise de expressão de gene relacionada a HMGA2 e TGF-β.

[00291] Para avaliar a associação entre expressão de HMGA2 e sinalização de TGF-β, análise de correlação de Spearman foi realizada em HMGA2 e uma assinatura de gene TGF-β (ver Korkut et al., Cell Syst. 2018, 7, 422–437.e7). Análise separada foi feita nos animais de controle (N=12) e animais tratados com TRAP anti-PD-L1/TGFβ (N=15). No grupo de controle, 30% (27/89) dos pares de gene de sinalização de HMGA2/TGF-β mostrou um R estatisticamente significativo. Em outras palavras, expressão de 27 genes de sinalização de TGF-β correlacionados com a expressão de HMGA2 em RNA extraído de camundongos tratados com controle. Tabela 1 lista valores de R e p de correlação de Spearman associados com pares de gene (genes de sinalização HMGA2 e TGF-β) em animais tratados com controle. No grupo de tratamento de TRAP anti-PD-L1/TGFβ, 55% (48/89) dos pares de gene de sinalização HMGA2/TGF-β mostrou um R estatisticamente significativo. Tratamento com a TRAP anti-PD-L1/TGFβ induziu alterações transcriptômicas específicas de TGF-β e resultou em correlação de expressão de 48 genes de sinalização TGF-β com expressão de HMGA2. Tabela 2 lista valor de R e p de correlação de Spearman associado com pares de gene em grupo de tratamento de TRAP anti-PD-L1/TGFβ. FIGs. 5A-F são gráficos de dispersão mostrando associação entre HMGA2 e genes de núcleo de sinalização TGF-β selecionados Tgfbr1, Tgfbr2, Smad3, Tgfb1, Tgfb2, e Tgfb3, respectivamente. FIG. 5A é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Tgfbr1. FIG. 5B é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e Tgfbr2. FIG. 5C é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Smad3. FIG.

5D é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Tgfb1. FIG. 5E é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Tgfb2. FIG. 5F é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Tgfb3. FIGs. 6A-F são gráficos de dispersão mostrando associação entre HMGA2 e genes direcionados de sinalização TGF-β selecionados Col1a1, Col1a2, Fn1, Vim, Vegfa, e Zeb1, respectivamente.

FIGs. 6A-F são gráficos de dispersão mostrando associação entre HMGA2 e genes direcionados de sinalização TGF-β selecionados.

FIG. 6A é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Col1a1. FIG. 6B é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Col1a2. FIG. 6C é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Fn1. FIG. 6D é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Vim.

FIG. 6E é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Vegfa.

FIG. 6F é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Zeb1. Estes gráficos mostram que a expressão de HMGA2 está associada com expressão de genes de via de sinalização de TGF-β.

Tabela 1. Valor de R e p de correlação de Spearman associada com genes de via de sinalização de HMGA2 e TGF-β em animais de controle.

Par de Gene R de Spearman Valor de P Hmga2 - Acvr2b 0,82517483 0,001592 Hmga2 - Zfyve9 0,8041958 0,002518 Hmga2 - Bmpr2 0,77622378 0,004331 Hmga2 - Snai1 0,77622378 0,004331 Hmga2 - Runx1 0,74825175 0,006974

Hmga2 - Fn1 0,73426573 0,008667 Hmga2 - Smad3 0,72027972 0,010637 Hmga2 - Bmp7 0,71328671 0,011766 Hmga2 - Pja2 0,6993007 0,014208 Hmga2 - Cdkn2b -0,69230769 0,015546 Hmga2 - Inhbb 0,68531469 0,017015 Hmga2 - Tgfb3 0,67832168 0,018522 Hmga2 - Stat3 0,67832168 0,018522 Hmga2 - Smad1 0,67132867 0,020194 Hmga2 - Bcl2l11 0,66433566 0,021901 Hmga2 - Tgfb1 0,65034965 0,0257 Hmga2 - Smad6 0,65034965 0,0257 Hmga2 - Myc 0,64335664 0,027801 Hmga2 - Inhbe 0,63810013 0,030102 Hmga2 - Foxo3 0,62937063 0,032296 Hmga2 - Vim 0,62937063 0,032296 Hmga2 - Acvr1 0,61538462 0,037277 Hmga2 - Acvr1b 0,61538462 0,037277 Hmga2 - Runx2 0,61538462 0,037277 Hmga2 - Tert 0,61538462 0,037277 Hmga2 - Gadd45b -0,59440559 0,045705 Hmga2 - Pard6a -0,57342657 0,055552 Hmga2 - Bmp4 -0,56643357 0,059053 Hmga2 - Col1a1 0,56643357 0,059053 Hmga2 - Zeb2 0,55944056 0,062845 Hmga2 - Foxk1 0,53846154 0,074952 Hmga2 - Dab2 0,53146853 0,079434 Hmga2 - Pja1 0,53146853 0,079434 Hmga2 - Sptbn1 0,51838959 0,086831 Hmga2 - Tgfbr3 0,48251748 0,11541 Hmga2 - Smad4 0,48251748 0,11541 Hmga2 - Dapk1 0,46853147 0,127507

Hmga2 - Foxo1 0,46853147 0,127507 Hmga2 - Foxo4 0,46853147 0,127507 Hmga2 - Inhba 0,45454545 0,140439 Hmga2 - Tgfbrap1 0,45454545 0,140439 Hmga2 - Smad7 0,44055944 0,154234 Hmga2 - Smad7 0,44055944 0,154234 Hmga2 - Bmp10 -0,48038446 0,166667 Hmga2 - Cdh1 0,42657343 0,168896 Hmga2 - Il6 -0,41958042 0,176733 Hmga2 - Jun 0,40559441 0,192767 Hmga2 - Col1a2 0,38461538 0,218343 Hmga2 - Cdkn1a 0,37762238 0,227594 Hmga2 - Vegfa 0,37062937 0,236687 Hmga2 - Bmp6 -0,3677764 0,238531 Hmga2 - Gdf1 -0,35916384 0,252159 Hmga2 - Snai2 -0,33566434 0,286861 Hmga2 - Itgb6 -0,32167832 0,308488 Hmga2 - Runx3 0,31468531 0,319405 Hmga2 - Gdf11 0,30769231 0,331041 Hmga2 - Smad2 -0,3006993 0,342415 Hmga2 - Fos 0,29370629 0,354539 Hmga2 - Bmpr1a 0,26573427 0,404188 Hmga2 - Serpine1 0,24475524 0,443418 Hmga2 - Tgfbr2 0,23776224 0,457295 Hmga2 - Tgfb2 0,23076923 0,470802 Hmga2 - Bmpr1b -0,23076923 0,470802 Hmga2 - Cdh2 -0,22377622 0,485124 Hmga2 - Id1 -0,21678322 0,499001 Hmga2 - Acvr2a -0,2027972 0,527959 Hmga2 - Acvrl1 0,1958042 0,543064 Hmga2 - Tgfbr1 0,18881119 0,557684 Hmga2 - Twist1 0,18881119 0,557684

Hmga2 - Foxk2 0,18181818 0,573147 Hmga2 - Mmp2 0,18181818 0,573147 Hmga2 - Nodal 0,15384615 0,635329 Hmga2 - Acvr1c -0,14502276 0,654079 Hmga2 - Aldh1a1 -0,12587413 0,699883 Hmga2 - Col3a1 0,11188811 0,732948 Hmga2 - Bmp15 -0,09122863 0,778113 Hmga2 - Bmp2 0,09090909 0,782983 Hmga2 - Smad5 -0,08391608 0,800385 Hmga2 - Mapk14 0,08391608 0,800385 Hmga2 - Bmp5 0,07746671 0,816129 Hmga2 - Inha 0,06293706 0,851456 Hmga2 - Igf2 0,06293706 0,851456 Hmga2 - Twist2 -0,06293706 0,851456 Hmga2 - Bmp3 -0,04903685 0,881392 Hmga2 - Zeb1 -0,03496503 0,920974 Hmga2 - Itgb8 -0,01398601 0,973891 Hmga2 - Mmp9 -0,01398601 0,973891 Hmga2 - Smad9 -0,0036324 0,995863 Hmga2 - Inhbc 0,04367131 1

Tabela 2. Valor de R e p de correlação de Spearman associado com genes de via de sinalização HMGA2 e TGF-β no grupo de animais tratados com TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

Par de Gene R de Spearman Valor P Hmga2 - Tert 0,969409 2,62E-09 Hmga2 - Bmpr2 0,964286 7,82E-08 Hmga2 - Inhba 0,942857 1,42E-07 Hmga2 - Acvr2a 0,953571 2,80E-07 Hmga2 - Smad3 0,942857 7,96E-07 Hmga2 - Cdkn2b -0,92143 1,07E-06 Hmga2 - Bmpr1a 0,925 3,23E-06

Hmga2 - Zfyve9 0,903571 3,88E-06 Hmga2 - Tgfbr2 0,910714 8,04E-06 Hmga2 - Mapk14 0,853571 5,17E-05 Hmga2 - Smad6 0,85 6,00E-05 Hmga2 - Dapk1 0,85 6,00E-05 Hmga2 - Inhbb 0,846429 6,92E-05 Hmga2 - Acvr1 0,864286 7,40E-05 Hmga2 - Runx1 0,839286 9,14E-05 Hmga2 - Tgfb3 0,85 0,000126 Hmga2 - Smad7 0,828571 0,000135 Hmga2 - Pard6a -0,82857 0,000135 Hmga2 - Smad7 0,828571 0,000135 Hmga2 - Tgfbr1 0,846429 0,000143 Hmga2 - Acvr1b 0,842857 0,000162 Hmga2 - Foxk1 0,817857 0,000195 Hmga2 - Fos 0,8 0,000342 Hmga2 - Mmp9 -0,79643 0,00038 Hmga2 - Vegfa 0,75 0,001281 Hmga2 - Col1a2 0,746429 0,001391 Hmga2 - Tgfbrap1 0,742857 0,001509 Hmga2 - Vim 0,732143 0,001913 Hmga2 - Fn1 0,721429 0,002399 Hmga2 - Bmp7 0,732143 0,002677 Hmga2 - Col1a1 0,714286 0,002774 Hmga2 - Tgfb2 0,696429 0,005091 Hmga2 - Pja2 0,678571 0,005417 Hmga2 - Runx2 0,675 0,005763 Hmga2 - Bmp4 0,682143 0,006433 Hmga2 - Id1 -0,65714 0,00777 Hmga2 - Bmp6 0,671317 0,007926 Hmga2 - Mmp2 0,646429 0,009215 Hmga2 - Bmp5 0,618284 0,016496

Hmga2 - Foxo4 0,589286 0,020794 Hmga2 - Twist2 -0,58571 0,021777 Hmga2 - Tgfb1 0,589286 0,023175 Hmga2 - Col3a1 0,571429 0,026063 Hmga2 - Serpine1 0,571429 0,026063 Hmga2 - Bmpr1b 0,575 0,027413 Hmga2 - Bmp2 -0,56836 0,029259 Hmga2 - Zeb1 0,525 0,044484 Hmga2 - Acvr1c 0,527046 0,046534 Hmga2 - Cdh1 0,514286 0,049839 Hmga2 - Jun 0,507143 0,053664 Hmga2 - Gadd45b -0,48929 0,06416 Hmga2 - Runx3 0,478571 0,071131 Hmga2 - Smad4 0,446429 0,095293 Hmga2 - Smad9 0,41654 0,122471 Hmga2 - Bmp10 0,347192 0,210989 Hmga2 - Itgb8 0,339286 0,216029 Hmga2 - Nodal -0,29286 0,289472 Hmga2 - Gdf1 -0,28666 0,300272 Hmga2 - Acvrl1 0,28597 0,301485 Hmga2 - Zeb2 -0,28571 0,301936 Hmga2 - Smad1 0,271429 0,327789 Hmga2 - Foxo3 0,267857 0,334444 Hmga2 - Snai1 0,264286 0,341174 Hmga2 - Gdf11 0,253571 0,361816 Hmga2 - Pja1 0,239286 0,390379 Hmga2 - Bmp3 -0,23214 0,403941 Hmga2 - Foxo1 0,192857 0,491049 Hmga2 - Acvr2b -0,18929 0,498335 Hmga2 - Twist1 0,178571 0,524284 Hmga2 - Igf2 -0,17143 0,541272 Hmga2 - Cdkn1a -0,16071 0,567197

Hmga2 - Smad2 0,153571 0,584764 Hmga2 - Inha 0,137623 0,624765 Hmga2 - Smad5 -0,13571 0,62962 Hmga2 - Bmp15 0,127997 0,648966 Hmga2 - Dab2 0,110714 0,694463 Hmga2 - Itgb6 -0,10357 0,71338 Hmga2 - Inhbe -0,09798 0,728305 Hmga2 - Aldh1a1 0,085714 0,761334 Hmga2 - Snai2 0,085714 0,761334 Hmga2 - Stat3 0,067857 0,810109 Hmga2 - Sptbn1 0,064286 0,819948 Hmga2 - Il6 -0,06071 0,829812 Hmga2 - Myc -0,05714 0,8397 Hmga2 - Tgfbr3 -0,05357 0,852484 Hmga2 - Cdh2 0,010714 0,96977 Hmga2 - Foxk2 0,010714 0,96977 Hmga2 - Bcl2l11 -0,00714 0,979844 Hmga2 - Inhbc Nenhuma expressão Nenhuma expressão de Inhbc de Inhbc

[00292] Além dos estudos de associação, regulação negativa significativa de HMGA2 e expressão de núcleo de sinalização e gene direcionado TGF-β chave foi observada em camundongos tratados com TRAP anti-PD-L1/TGFβ em comparação com camundongos de controle. FIGs. 7A-F são gráficos mostrando expressão de genes de sinalização de TGF-β em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ. FIG. 7A é um gráfico mostrando expressão de Tgfbr1 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ. FIG. 7B é um gráfico mostando expressão de Tgfbr2 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ. FIG. 7C é um gráfico mostrando expressão de Smad3 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti- PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIG. 7D é um gráfico mostrando expressão de Tgfb1 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIG. 7E é um gráfico mostrando expressão de Tgfb2 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIG. 7F é um gráfico mostrando expressão de Tgfb3 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

Estes gráficos mostram que um grupo de animais tratados com TRAP anti-PD-L1/TGFβ mostrou regulação negativa na expressão de Tgfbr1, Tgfbr2, Smad3, Tgfb1, Tgfb2, e Tgfb3. FIGs. 8A- G são gráficos mostrando expressão de genes direcionados de TGF-β chave em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIG. 8A é um gráfico mostrando expressão de HMGA2 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIG. 8B é um gráfico mostrando expressão de Col1a1 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD- L1/TGFβ.

FIG. 8C é um gráfico mostrando expressão de Col1a2 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD- L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIG. 8D é um gráfico mostrando expressão de Fn1 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIG. 8E é um gráfico mostrando expressão de Vim em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIG. 8F é um gráfico mostrando expressão de Vegfa em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIG. 8G é um gráfico mostrando expressão de Zeb1 em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti- PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

FIGs. 8A-G mostram que grupo de animais tratados com TRAP anti-PD-L1/TGFβ mostrou uma regulação negativa na expressão de HMGA2 e genes direcionados de TGF-β Col1a1, Col1a2, Fn1, Vim, Vegfa, e Zeb1, respectivamente.

[00293] Análise de correlação de Spearman foi também realizada em HMGA2 e uma assinatura de sinalização de PD-1/IFNγ (Interferon gamma) (ver M. Ayers et al., J. Clin. Invest. 127, 2930–2940 (2017)) que mostrou que apenas 11% (2/18) e 17% (3/18) dos pares de gene de sinalização de PD-1/IFNγ tem um R estatisticamente significativo no grupo de tratamento de TRAP de controle e anti-PD-L1/TGFβ, respectivamente. Tabela 3 lista valor de R e p de correlação de Spearman associado com pares de gene em grupo de animal de controle. Tabela 4 lista valor de R e p de correlação de Spearman associado com pares de gene em grupo de tratamento de TRAP anti- PD-L1/TGFβ. FIGs. 9A-C são gráficos de dispersão mostrando associação entre HMGA2 e genes relacionados de PD-1/IFNγ selecionados Ifng, Gzmb, e Gzmk, respectivamente. FIGs. 9D-F mostram níveis de expressão de genes relacionados de PD-1/IFNγ selecionados Ifng, Gzmb, e Gzmk em animais tratados com controle, controle de TRAP, Anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ, respectivamente. FIG. 9A é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Ifng. FIG. 9B é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Gzmb. FIG. 9C é um gráfico de dispersão mostrando associação entre expressão de HMGA2 e expressão de Gzmk. FIG. 9D é um gráfico mostrando expressão de Ifng em animais tratados com controle, controle de TRAP, Anti-PD-L1, e TRAP anti-PD- L1/TGFβ. FIG. 9E é um gráfico mostrando expressão de Gzmb em animais tratados com controle, controle de TRAP, Anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ. FIG. 9F é um gráfico mostrando expressão de Gzmk em animais tratados com controle, controle de TRAP, Anti-PD-L1, e

TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

Tabela 3. Valor de R e p de correlação de Spearman associado com genes de via de sinalização HMGA2 e PD-1/IFNγ em grupo de animais de controle.

Par de gene R de Spearman Valor de P Hmga2 - Cxcr6 -0,66434 0,021901 Hmga2 - Gzmk -0,59441 0,045705 Hmga2 - Ifng -0,49387 0,105021 Hmga2 - Cxcl9 -0,3986 0,200954 Hmga2 - Tagap -0,39161 0,209711 Hmga2 - Cd3d -0,36364 0,246411 Hmga2 - Nkg7 -0,32867 0,297333 Hmga2 - Ccl5 -0,3007 0,342415 Hmga2 - Stat1 -0,23077 0,470802 Hmga2 - Lag3 -0,1958 0,543064 Hmga2 - Gzmb 0,174825 0,588091 Hmga2 - Cd2 -0,13287 0,68316 Hmga2 - Cxcl10 -0,11888 0,71599 Hmga2 - Ciita -0,1049 0,749263 Hmga2 - Ido1 -0,08392 0,800385 Hmga2 - Il2rg 0,013986 0,973891 Hmga2 - Cd3e 0,006993 0,991026 Hmga2 - Cxcl13 -0,00699 0,991026

Tabela 4. Valor de R e p de correlação de Spearman associado com genes de via de sinalização de HMGA2 e PD-1/IFNγ em grupo de animal tratado com TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

Par de Gene R de Spearman Valor de P Hmga2 - Lag3 -0,89643 1,76E-05 Hmga2 - Cd3d -0,875 4,78E-05 Hmga2 - Gzmb 0,717857 0,0035 Hmga2 - Nkg7 -0,47857 0,073469

Hmga2 - Ccl5 -0,45219 0,091978 Hmga2 - Cd2 -0,39286 0,148547 Hmga2 - Tagap 0,389286 0,152504 Hmga2 - Gzmk -0375 0,169155 Hmga2 - Ifng -0,32857 0,231684 Hmga2 - Cxcl10 0,3 0,276736 Hmga2 - Cxcr6 -0,26988 0,328113 Hmga2 - Stat1 -0,25357 0,360726 Hmga2 - Ciita 0,253571 0,360726 Hmga2 - Cxcl9 -0,24643 0,374827 Hmga2 - Ido1 0,235714 0,396592 Hmga2 - Cxcl13 -0,20714 0,457799 Hmga2 - Cd3e -0,20357 0,465738 Hmga2 - Il2rg 0,175 0,532005 Tabela 5 fornece um resumo dos dados de expressão de gene para genes de sinalização TGF-β em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

Tabela 6 fornece um resumo dos dados de expressão de genes para genes de sinalização de PD-1/IFNγ em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

Tabela 5. Resumo dos dados de expressão de genes para genes de sinalização de TGF-β em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

Genes Log2 TPM médio Valor de P Controle Controle Anti- TRAP Controle Anti-PD- TRAP anti- de PD-L1 anti-PD- de TRAP L1 vs PD- TRAP L1/TGFβ vs Controle L1/TGFβ Controle vs Controle Col1a1 6,052 3,855 6,251 4,462 <0,0001 0,8099 <0,0001 Dapk1 1,356 0,465 1,353 0,541 <0,0001 >0,9999 <0,0001 Foxk1 1,751 0,442 1,853 0,55 <0,0001 0,9109 <0,0001 Mapk14 3,542 2,672 3,744 2,766 <0,0001 0,3943 <0,0001 Runx1 2,578 1,622 2,772 1,856 <0,0001 0,3289 <0,0001 Runx2 1,636 0,494 1,95 0,891 <0,0001 0,1418 <0,0001 Runx3 1,878 0,438 1,621 0,841 <0,0001 0,3667 <0,0001 Smad7 3,155 2,296 3,016 2,243 <0,0001 0,6174 <0,0001 Tert 0,113 -0,621 0,092 -0,57 <0,0001 0,9956 <0,0001

Zeb1 0,901 0,098 0,992 0,188 <0,0001 0,81 <0,0001 Pard6a 2,292 3,477 2,099 3,216 <0,0001 0,6598 0,0001 Il6 1,338 2,457 1,938 2,532 0,0007 0,0938 0,0003 Col1a2 6,472 5,217 6,747 5,589 <0,0001 0,4436 0,0005 Snai1 3,643 3,2 3,302 3,145 0,0042 0,0334 0,0012 Gadd45b 3,166 3,559 2,987 4,005 0,214 0,7653 0,0017 Hmga2 4,838 3,818 4,929 4,177 <0,0001 0,9325 0,0036 Foxk2 3,308 3,293 3,384 3,098 0,9899 0,4989 0,0061 Pja2 3,399 2,941 3,735 3,019 0,001 0,0179 0,0066 Mmp2 3,883 2,297 3,956 3,113 <0,0001 0,9805 0,0084 Itgb8 -0,526 -0,436 -0,274 -0,258 0,5952 0,0156 0,0094 Foxo1 2,008 1,557 2,046 1,567 0,009 0,9864 0,0108 Cdh1 3,996 3,454 4,124 3,403 0,0227 0,8473 0,0116 Foxo4 1,914 0,865 2 1,419 <0,0001 0,9242 0,0194 Foxo3 1,771 1,243 1,973 1,469 <0,0001 0,1843 0,0269 Id1 4,659 5,146 4,23 5,02 0,0018 0,0066 0,0274 Vim 9,749 8,852 9,909 9,374 <0,0001 0,5559 0,0363 Jun 4,145 4,137 4,244 3,896 0,9997 0,6829 0,0693 Stat3 4,412 3,945 4,59 4,137 0,003 0,4055 0,1125 Twist2 1,86 1,557 1,219 1,538 0,2471 0,0031 0,2059 Dab2 4,888 4,688 4,958 4,632 0,4165 0,938 0,2315 Fn1 7,615 7,492 8,069 7,295 0,8605 0,0636 0,25 Fos 2,637 2,354 3,037 2,349 0,288 0,0852 0,2756 Igf2 -0,433 0,064 -0,432 -0,15 0,0287 >0,9999 0,304 Mmp9 4,929 5,866 4,716 5,402 0,0119 0,8309 0,305 Cdkn1a 4,02 3,206 4,364 4,221 <0,0001 0,0396 0,323 Vegfa 3,936 3,43 4,3 3,665 0,0722 0,2518 0,4752 Serpine1 4,932 4,214 5,642 4,658 0,0172 0,0185 0,5561 Col3a1 7,679 7,78 7,877 7,471 0,9277 0,6598 0,6258 Cdh2 -0,605 -0,764 -0,541 -0,661 0,0296 0,5672 0,6682 Itgb6 -0,748 -0,784 -0,589 -0,68 0,9248 0,0921 0,6801 Zeb2 2,51 2,349 2,999 2,663 0,6715 0,0192 0,6998 Twist1 3,221 3,299 3,04 3,152 0,8229 0,2583 0,8643 Pja1 4,26 4,317 4,159 4,213 0,8141 0,4533 0,8826 Bcl2l11 3,551 2,906 3,772 3,447 0,0037 0,5005 0,8983 Snai2 0,38 0,27 0,411 0,308 0,7796 0,9929 0,921 Cdkn2b 0,852 0,819 0,605 0,899 0,9925 0,2543 0,9783 Myc 4,979 5,669 4,854 4,948 <0,0001 0,5452 0,9851 Aldh1a1 -0,338 -0,633 0,004 -0,369 0,3836 0,273 0,9976

Tabela 6. Resumo dos dados de expressão de gene para genes de sinalização de PD-1/IFNγ em controle, controle de TRAP, grupos de animais tratados com anti-PD-L1, e TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Genes Log2 TPM médio Valor de P Controle Controle Anti- TRAP Controle Anti-PD-L1 TRAP de PD-L1 anti-PD- de TRAP vs anti-PD- TRAP L1/TGFβ vs Controle L1/TGFβ Controle vs Controle Lag3 1,037 2,018 0,705 1,988 0,0008 0,4053 0,0012 Cd3d 2,059 4,733 0,964 4,241 0,0001 0,1767 0,0019 Nkg7 2,334 3,313 1,442 3,415 0,0103 0,021 0,0042 Gzmk -0,589 -0,072 -0,74 0,057 0,0395 0,7935 0,0078 Gzmb 3,227 4,786 2,804 4,064 <0,0001 0,3584 0,0203 Cxcl9 2,124 2,701 1,325 3,486 0,5039 0,2542 0,022 Ciita 1,142 0,075 0,511 0,384 0,001 0,0705 0,0237 Ifng -0,582 -0,292 -0,766 -0,134 0,2953 0,6422 0,057 Stat1 3,554 4,087 3,307 4,077 0,0706 0,5849 0,0777 Cxcr6 0,817 1,92 0,302 1,379 0,0002 0,1156 0,0777 Cxcl10 3,398 2,546 3,056 2,898 0,0206 0,5388 0,249 Ido1 -0,119 0,055 -0,225 0,262 0,791 0,9394 0,2522 Cd2 1,663 2,027 1,069 2,47 0,8246 0,5343 0,2983 Il2rg 3,545 2,191 3,208 3,003 0,0015 0,6707 0,3173 Tagap 1,433 1,24 1,27 1,249 0,4463 0,5751 0,4856 Ccl5 4,516 4,648 3,682 4,941 0,9738 0,103 0,5705 Cd3e 1,133 0,42 0,326 0,875 0,3522 0,2596 0,9147 Cxcl13 1,159 0,888 0,776 1,216 0,9634 0,907 0,9996

[00294] Em geral, expressão de HMGA2 teve uma associação mais forte com a sinalização de TGF-β no grupo de tratamento de TRAP anti- PD-L1/TGFβ quando comparado ao grupo de tratamento de controle com base na magnitude de R de Spearman e o número de pares de genes com valores de P estatisticamente significativos, indicando que a expressão de HMGA2 é responsiva a alterações transcriptômicas específicas de TGF-β induzidas por tratamento de TRAP anti-PD- L1/TGFβ. O menor percentual de associação estatisticamente significativa entre a assinatura de resposta de bloqueio de HMGA2 e PD-1 mostra que expressão de HMGA2 é menos indicativa das mudanças em genes relacionados ao sistema imunológico. Os dados ilustram que expressão de HMGA2 é indicativa da atividade de sinalização de TGF-β e, portanto, pode ser usada como um biomarcador de estratificação e/ou resposta ao tratamento. EXEMPLO 3: Métodos para identificação de pacientes com TNBC que provavelmente respondem a uma terapia de proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ

[00295] RT-qPCR é um método semiquantitativo para analisar a expressão do gene de um alvo e é um método usado para determinar o nível de expressão do gene HMGA2. Alternativamente, PCR digital de gotas (ddPCR), que permite a quantificação absoluta em cópias do alvo em uma determinada amostra, é usado para determinar o nível de expressão do gene HMGA2. Outro ensaio alternativo para determinar o nível de expressão do gene HMGA2 é a tecnologia HTGEdgeSeq NGS, que é um sequenciamento de RNA direcionado com base em uma química de proteção de nuclease quantitativa que permite a quantificação livre de extração de mRNA/miRNAs de tecido FFPE e uma variedade de outros tipos de amostra e pode oferecer ampla cobertura de via de marcadores HMGA2 e a montante / a jusante. Os critérios de aceitação do ensaio incluem especificidade, robustez, sensibilidade (LOD e LOQ), eficiência e linearidade, precisão (repetibilidade) e a variabilidade intra e inter-ensaio. Após a configuração do ensaio, a validação analítica e a validação clínica serão realizadas em um laboratório certificado por CLIA/CAP. RT-qPCR

[00296] RT-qPCR é um método semiquantitativo para analisar a expressão de gene de um alvo em relação ao nível de expressão de um gene de manutenção. Existem numerosos ensaios Taqman qPCR para HMGA2, bem como ensaios Bio-Rad PrimePCR para HMGA2, que estão disponíveis comercialmente. Um conjunto de iniciadores/sondas, que garante a linearidade do ensaio e a eficiência do conjunto de iniciadores/sondas usando uma construção sintética (SEQ ID NO: 65), que abrange todas as regiões cobertas em cada ensaio, é usado para determinar o nível de expressão de RNA HMGA2 em amostras obtidas de pacientes com TNBC. Amostras biológicas são testadas usando cDNA convertido de RNA extraído de uma linhagem celular com alta expressão de HMGA2 (por exemplo, linhagens celulares de câncer de mama, por exemplo, SW480 ou MCF7, transfectadas com HMGA2)) e cDNA convertido de RNA extraído para amostras de FFPE de pacientes com TNBC.

[00297] Construção sintética é fornecida em SEQ ID NO: 65

GCGAAGCGGCTGCAGCGGCGGTAGCGGCGGCGGGAGGCAGGAT GAGCGCACGCGGTGAGGGCGCGGGGCAGCCGTCCACTTCAGCC CAGGGACAACCTGCCGCCCCAGCGCCTCAGAAGAGAGGACGCG GCCGCCCCAGGAAGCAGCAGCAAGAACCAACCGGTGAGCCCTCT CCTAAGAGACCCAGGGGAAGACCCAAAGGCAGCAAAAACAAGAG TCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAGAAAGCAGAAGCCACTGGAGAAAA ACGGCCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGGCCACAACAAGTTGTTCA GAAGAAGCCTGCTCAGGTCAATGTTGCCTTGCCTGGGAAGGACC

ACCCGGGCAATCTTATATATCTACTGTTCTCTAAA PCR digital de gota

[00298] PCR digital de gota (ddPCR) permite a quantificação absoluta em cópias do alvo em uma determinada amostra. Esta é uma vantagem distinta sobre qPCR, porém pode ser mais difícil de implementar em um ambiente clínico. No entanto, para amostras de tecido com baixa abundância de tecido HMGA2, o ddPCR é considerado para determinar o nível de expressão de HMGA2. Cada ensaio é comparado usando uma diluição de construções de cDNA, cDNA derivado de paciente e cDNA de linhagens celulares que são positivas ou negativas para HMGA2. HTG EdgeSeq

[00299] A tecnologia HTG EdgeSeq NGS é um sequenciamento de RNA direcionado, que se baseia em uma química de proteção de nuclease quantitativa que permite a quantificação livre de extração de mRNA/miRNAs de tecido FFPE e uma variedade de outros tipos de amostra. A química reduz significativamente os requisitos de entrada de amostra em comparação com o sequenciamento de RNA padrão. A combinação de baixa entrada de amostra e fluxo de trabalho simplificado torna HTG EdgeSeq NGS uma tecnologia atraente para aplicações clínicas. O painel está disponível no mercado e é usado para ampliar a cobertura de vias dos marcadores HMGA2 e a jusante/a montante. Análise de RNA-seq

[00300] Como o RNA-seq fornece apenas a abundância relativa do RNA, um ponto de corte em relação à média da população foi determinado da seguinte forma: primeiro, um grande conjunto de dados de RNA-seq (TCGA) foi examinado, e a expressão média da população para HMGA2 e MECOM foram obtidos do banco de dados. O fator de separação que separa essa mediana populacional do banco de dados da expressão mais baixa entre os respondedores do estudo atual foi determinado como 2,27 para HMGA2 e 1,54 para MECOM.

[00301] Tendo determinado esses fatores usando RNA-seq, um ponto de corte absoluto foi determinado pela primeira escolha de um ensaio de expressão de gene com quantificação absoluta (em vez de relativa) da expressão, medindo a expressão média de HMGA2 e MECOM, respectivamente, entre os pacientes com TNBC usando este ensaio, então multiplicando essa média pelo respectivo fator de separação.

[00302] Após a correção do lote com ComBat, a expressão de HMGA2 mais baixa entre os respondedores foi de 0,700 log-TPM. A expressão média de HMGA2 em TCGA-BRCA-TNBC foi de -0,483. Uma diferença de 1,18 na escala log-2 corresponde a um fator de separação de 2,27. Em outras palavras, pacientes cuja expressão de HMGA2 é pelo menos 2,27 vezes maior do que a média da população entre os pacientes com TNBC eram propensos a responder ao tratamento anti- PD-L1-TGFβ. Para MECOM, a expressão mais baixa entre os respondedores foi 2,35 log-TPM, enquanto a expressão média em TCGA-BRCA-TNBC foi 1,73 log-TPM, um fator de separação de 1,54, sugerindo que pacientes cuja expressão MECOM é pelo menos 1,54 vezes maior do que a média da população entre os pacientes com TNBC foram propensos a responder ao tratamento anti-PD-L1-TGFβ. EXEMPLO 4: Método para determinação de níveis de HMGA2 em amostras obtidas de pacientes com TNBC tratados com uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ

[00303] Este exemplo refere-se a um método para determinação de níveis de HMGA2 em amostras obtidas de pacientes com TNBC para verificar a capacidade de resposta a uma terapia de proteína anti-PD- L1/TGFβ. PCR quantitativo em tempo real, PCR digital de gota e sistema HTG EdgeSeq foram usados para a detecção do grupo de alta mobilidade AT-hook 2 (HMGA2) usando amostras humanas FFPE. Extração de RNA:

[00304] Amostras embebidas em parafina fixadas em formalina de câncer de mama triplo negativo (TNBC) (FFPE) foram adquiridas de várias fontes comerciais (faixa de porcentagem de tumor de 25 a 100%). Bloqueios FFPE foram cortados em seções de 5 µM e coletados individualmente em tubos. RNA foi extraído de duas ondas FFPE para cada amostra usando o Qiagen RNesay FFPE kit (Product #73504). As duas alíquotas para cada amostra permaneceram separadas até a amostra ser adicionada às colunas de rotação da membrana. Isso permitiu uma fusão mais completa da parafina, mas também concentrou as amostras. As amostras foram eluídas da coluna de rotação em 30 µL de água. Quantificação de RNA

[00305] Após extração, RNA foi quantificado usando o Qubit RNA Broad Range Assay Kit (Product #Q10211). O RNA extraído foi diluído 1:66,67 (3µL de RNA + 197µL de solução de trabalho Qubit). Se uma amostra estava fora da faixa aceitável, considerada como controle no ensaio Qubit, a amostra era diluída ainda mais, ou uma diluição mais baixa foi usada como necessário para produzir uma leitura de concentração confiável. Avaliação de qualidade de RNA

[00306] Amostras de RNA também foram executadas na plataforma Agilent Bioanalyzer para avaliar a qualidade do RNA extraído usando o Agilent RNA 6000 Nano kit (Product #5067-1512). Transcrição Reversa

[00307] cDNA foi transcrito do modelo de RNA usando o Invitrogen/ ThermoFisher Superscript IV VILO Master Mix (Product #11766050). 100 ng de RNA foi usado para cada reação. De acordo com o protocolo do fabricante, 4 µL do Superscript IV VILO Master mix foi adicionado a cada reação juntamente com água livre de nuclease suficiente para trazer o volume total para 20 µL. Múltiplas reações para cada amostra podem ser combinadas para converter tanto RNA em cDNA quanto possível em uma reação. Nos casos em que a concentração de RNA era muito baixa, as reações de transcrição foram feitas na maior concentração possível. Todas as misturas de reações foram então incubadas a 25°C por 15 minutos, depois a 50°C por 15 minutos e finalmente a 85°C por 10 minutos. cDNA foi armazenado a -20°C até ficar pronto para uso.

[00308] qPCR foi realizado usando o instrumento Applied Biosystems 7500Dx. Resumidamente, as misturas de qPCR consistiam em 10 µL de Taqman 2X Gene expression master mix de Thermo Fisher

(Product #4369016), 1 µL der Taqman HMGA2 Primer Probe Set Hs0017569_m1 (SEQ ID NO: 63 e/ou SEQ ID NO: 64) ou Taqman ACTB Primer Probe Set Hs01060665_g1, 4 µL de cDNA de amostras, e 5 µL de H2O para um volume de reação total de 20 µL. Conjunto de iniciador/sonda para genes direcionados (SEQ ID NO: 63 e/ou SEQ ID NO: 64) e genes de manutenção podem ser designados usando Primer Express® se o ensaio de expressão de gene "pronto para uso" não está disponível. qPCR foi então executado com o seguinte protocolo: Manter a 50°C por 2 minutos, manter a 95°C por 10 minutos, 40 ciclos de 95°C por 15 segundos seguidos de 60°C por 1 minuto. Limiar foi realizado usando a função de auto-análise do software. Análise de qPCR:

[00309] O método delta comparativo Ct(Ct) foi usado para quantificação relativa da expressão de gene. Análise de amostra qPCR foi realizada olhando para ambos os valores de limiar de ciclo de HMGA2 bruto (Ct) e valores de Ct do gene de manutenção, bem como valores de Delta Ct calculados como (valor de Ct de HMGA2 - valor de Ct do gene de manutenção). Em uma modalidade exemplar, ACTB (Beta Actina) pode ser usado como um gene de manutenção. Em uma modalidade exemplar, os valores de delta Ct podem ser calculados como (valor de Ct de HMGA2 – valor de Ct de ACTB). Em certas modalidades, mais do que um gene de manutenção pode ser usado e valores de Ct obtidos de genes de manutenção podem ter a média calculada. Em certas modalidades, valores de delta Ct podem ser calculados como (valor de Ct de HMGA2 – valor de Ct médio de um ou mais genes de manutenção). Menor valor de ΔCt ou menor valor de Ct bruto significa uma maior expressão de HMGA2. PCR digital de gota (ddPCR)

[00310] Para confirmar os resultados de qPCR iniciais, ddPCR como um método ortogonal foi realizado nas mesmas amostras, mas usando conjuntos de iniciador/sonda diferentes que eram mais apropriados para a aplicação de ddPCR. 22 µL de misturas de reação de ddPCR foram feitos consistindo no seguinte: 11 µL de Bio-Rad ddPCR Supermix para Sondas (Product #186-3026), 1µL de HMGA2 Bio-Rad ddPCR ID de ensaio: dHSaCPE5029086 sonda FAM, 1µL ACTB Bio-Rad ddPCR ID de ensaio: dHsaCPE5190200 sonda HEX, 4 µL de cDNA de amostras, e 5 µL de H2O. Gotículas foram geradas em um instrumento Bio-Rad AutoDG e então amplificadas em VeritiDx Thermal Cycler com as seguintes condições: Manter 95 °C por 10 minutos, 40 ciclos de 94 °C por 30 segundos depois 60 °C por 1 minuto, manter 98 °C por 10 minutos, manter 4 °C por pelo menos 30 minutos. Após a amplificação, as reações de PCR foram transferidas para um leitor de placas Bio-Rad QX200 e as gotículas foram analisadas. Os limiares foram definidos manualmente para cada amostra para diferenciar as gotículas positivas das gotículas negativas para cada amostra. Análise de ddPCR:

[00311] A análise da amostra de cada experimento é realizada usando o software QuantaSoft. As concentrações de gotículas positivas em todas as amostras foram determinadas usando limiares de fluorescência colocados manualmente com base em agrupamentos negativos, como detectado no controle sem modelo correspondente (NTCs). Concentração de DNA direcionado (cópias/L) e contagem de gotícula absoluta dentro de amostras únicas foram usadas como uma medição de resultado quantitativo. ddPCR fornece quantificação absoluta como cópias/cavidade (reação), e, portanto, valores de relação de ddPCR mais altos correspondem com alta expressão de HMGA2. Análise de amostra de ddPCR foi realizada olhando para ambos os valores de número de cópia de HMGA2 brutos, bem como valores de número de cópia de HMGA2 que foram normalizados para valores de número de cópia obtidos de um ou mais genes de manutenção. Os valores do número de cópias normalizados são calculados como valor do número de cópias de HMGA2/valor do número de cópias de um único (ou médio) gene de manutenção. Em uma modalidade exemplar, ACTB (Beta Actin) pode ser usada como um gene de manutenção. HTG EdgeSeq:

[00312] Os espécimes FFPE foram raspados em tubos e lisados em tampão de lise de HTG, seguido pela introdução de sondas de proteção de nuclease de DNA específicas para genes (NPP). Depois de permitir que as NPPs hibridizem com seus RNAs alvo, que podem ser solúveis ou reticulados na matriz biológica, a nuclease S1 é adicionada, que remove o excesso de NPPs e RNAs não hibridizados, deixando para trás apenas NPPs hibridizados com seus RNAs alvo. Assim, uma conversão estequiométrica do RNA alvo em NPPs é alcançada, produzindo uma razão virtual de 1:1 de NPP para RNA. As etapas qNPA são automatizadas no processador HTG EdgeSeq, que é seguido por PCR para adicionar adaptadores de sequenciamento e marcadores. As amostras marcadas são agrupadas, limpas e sequenciadas em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração (NGS) usando protocolos padrão. Os dados do instrumento NGS são processados e relatados pelo software analisador HTG EdgeSeq. Seleção de População de Pacientes para Tratamento com TRAP Anti-PD-L1/TGFβ com base na expressão de HMGA2

[00313] Dados apresentados no Exemplo 1 mostraram que existe uma superexpressão significativa de HMGA2 em pacientes com TNBC que respondem ao tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ (respondedores) em comparação com pacientes com TNBC que não respondem a proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ (não respondedores). Esta seção ilustra métodos de seleção de pacientes para tratamento com anti-PD-L1/TGFβ usando cortes (por exemplo, valores de Ct ou níveis de contagem) que significa alta expressão de HMGA2. Em certas modalidades, corte de alta expressão de HMGA2 para selecionar população de paciente que irá responder ao tratamento com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ é deduzida pela incorporação de dados obtidos a partir de dados de RNA-seq e obtidos de qPCR e/ou ddPCR. Os valores de TPM obtidos a partir de RNA-seq podem ser traduzidos em valores de quantificação que podem ser obtidos a partir de métodos de quantificação absoluta (por exemplo, qPCR ou ddPCR). É gerada a função de transferência que mapeia os valores de TPM obtidos de RNA- seq para valores Ct (para qPCR) ou valores de razão de ddPCR (para ddPCR). Esta função de transferência é usada para encontrar os níveis de relação de Ct ou ddPCR correspondentes que podem fornecer um corte em relação a uma alta expressão de HMGA2. Em certas modalidades, função de transferência usada para encontrar valores de Ct correspondentes que podem fornecer um corte em relação a uma alta expressão de HMGA2 é: Y1= X1- log2 (TPM menor / TPM linha de base); onde Y1= corte de valor de Ct; X1= valor de ΔCt normalizado (expressão de qPCR relativa média para HMGA2); TPM menor = expressão mais baixa de HMGA2 (valor de TPM) obtida de RNA-seq entre pacientes que respondem ao tratamento com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ; TPM linha de base = expressão média de HMGA2 entre todos os pacientes independentemente da resposta clínica.

[00314] Em certas modalidades, função de transferência usada para encontrar valores de Ct correspondentes que podem fornecer um corte em relação a uma alta expressão de HMGA2 é: Y1= X1 - log2 (TPM segundo menor / TPM linha de base); onde Y1= corte de valor de Ct; X1= valor de ΔCt normalizado (expressão de qPCR relativa média para HMGA2); TPM segundo menor = expressão mais baixa de HMGA2 (valor de TPM) obtido de RNA-seq entre pacientes que respondem ao tratamento de proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ; TPM linha de base = expressão média de HMGA2 entre todos os pacientes independente de resposta clínica.

[00315] Em certas modalidades, função de transferência usada para encontrar valores de relação ddPCR correspondentes que podem fornecer um corte em relação a uma alta expressão de HMGA2 é: Y1= X1×( TPM menor / TPMlinha de base); onde Y1= cote de valor de relação de ddPCR; X1= valor de relação de ddPCR normalizada (valor de relação de ddPCR média para HMGA2); TPM menor = expressão mais baixo de HMGA2 (valor de TPM) obtida de RNA-seq entre pacientes que respondem ao tratamento de proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ; TPMlinha de base = expressão média de HMGA2 entre todos os pacientes independente de resposta clínica.

[00316] Em certas modalidades, função de transferência usada para encontrar valores de relação de ddPCR correspondentes que podem fornecer um corte em relação a uma alta expressão de HMGA2 é: Y1= X1×( TPMsegundo menor / TPMlinha de base); onde Y1= corte de valor de relação de ddPCR; X1= valor de relação de ddPCR normalizado (valor de relação de ddPCR médio para HMGA2); TPM segundo menor = segunda mais baixa expressão de HMGA2 (valor de TPM) obtida de RNA-seq entre pacientes que respondem ao tratamento de proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ; TPMlinha de base = expressão média de HMGA2 entre todos os pacientes independente de resposta clínica.

[00317] Em certas modalidades, um conjunto de amostras de tumor de tamanho suficiente (por exemplo, 50, 100, 150, 200, ou 250 de amostras de tumor) é obtido, e RNA-seq e qPCR (ou ddPCR) são realizados em cada amostra para produzir um conjunto de dados correspondente que permite uma comparação direta de quantificação de expressão de HMGA2 por RNA-seq e qPCR. Uma função de transferência de modelo de valor de Ct de qPCR (ou valor de relação de ddPCR) pode ser obtida realizando nível de expressão de modelagem de regressão de ranhura como uma função de TPM (ver Friedman, Jerome H. "Multivariate adaptive regression splines." Annals of Statistics 19,1 (1991): 1-67; ver também Kuhn, Max, e Kjell Johnson. APPLIED PREDICTIVE MODELING. Vol. 26. New York: Springer, 2013). A validade da função de transferência e magnitude de quaisquer efeitos gerais da batelada é testada comparando a distribuição de HMGA2 no novo conjunto de dados àquela obtida a partir do conjunto de dados descrito em Exemplo 1. Uma vez estabelecido que os efeitos da batelada não prejudicam a utilidade desta função de transferência de modelo, então esta função de transferência será utilizada para obter alta expressão de cortes de HMGA2.

[00318] Dados de Expressão de HMGA2 de RNA-seq (Método de Derivação de Dupla Mudança): Em uma coorte de população exemplar de pacientes com TNBC tratados com proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ, amostras de tumor embebidas em parafina (FFPE), fixadas em formalina (n = 118) são usados para extrair RNA e avaliar a qualidade de RNA como descrito em Exemplo 4. Análise de RNA-seq (como descrito em Exemplo 1) realizada em amostras que passaram no controle de qualidade (n = 103) mostra uma diferença média de 32 vezes na expressão de HMGA2 em respondedores vs não respondedores. O mesmo exemplo de coorte populacional mostra a expressão média de HMGA2 entre todos os pacientes independente de resposta clínica como 9,82 transcritos por milhão (TPM), expressão mais baixa de HMGA2 entre respondedores como 18,86 TPM, e segunda expressão mais baixa de HMGA2 entre respondedores como 177,75 TPM.

[00319] Corte de Expressão de HMGA2 usando Valores de Ct (Método de Derivação de Dupla Mudança): Em paralelo, o experimento de qPCR é realizado em todas as amostras (n = 103) que passaram no controle de qualidade usando os métodos descritos em Exemplo 4 para obter expressão de valores de Ct para HMGA2 e um gene de manutenção, beta-actina. Usando o método de análise (método de ΔCt comparativo) para o experimento de qPCR descrito em Exemplo 4, um ΔCt de 12,1 (Expressão qPCR relativa média para HMGA2) é óbtido. Um valor de Ct de corte liberal é então obtido usando a equação: Valor de Ct de corte liberal = valor de ΔCt normalizado para HMGA2 - log2 (18,86/9,82)

[00320] Em uma modalidade exemplar, um valor de Ct de corte liberal de 11,6 é obtido usando um valor de ΔCt de 12,1 sugerindo que pacientes com um valor Ct de 11,16 ou menos são classificados como HMGA2 alto e adequado para tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[00321] Similarmente, um valor de Ct de corte conservativo pode ser obtido usando a equação: Valor de Ct de corte conservativo = valor de ΔCt normalizado para HMGA2 - log2 (177,75/9,82)

[00322] Em uma modalidade exemplar, um valor de Ct de corte conservativo de 7,92 é obtido usando um valor de ΔCt de 12,1 sugerindo que pacientes com um valor de Ct de 7,92 ou menos são classificados como HMGA2 alto e adequado para tratamento com TRAP anti-PD- L1/TGFβ.

[00323] Corte de Expressão de HMGA2 usando Valores de Relação de ddPCR (Método de Derivação de Dupla Mudança): Em paralelo, experimento de ddPCR é realizado em 58 de 103 amostras de tumor usando métodos descritos em Exemplo 4 para obter valores de expressão para HMGA2 e um gene de manutenção, beta-actina. Em certas modalidades, quantificação de expressão de HMGA2 em relação à beta-actina por ddPCR é realizada para estabelecer um corte entre alta e baixa expressão de HMGA2. Em uma modalidade exemplar, uma relação de ddPCR média de 0,054 é obtida usando a equação abaixo: relação de ddPCR = (número de cópia de HMGA2/número de cópia de beta-actina) x 10000

[00324] Usando a relação de ddPCR mediano, um valor de corte liberal é obtido usando a equação: Valor de corte liberal = relação de ddPCR médio para HMGA2 x (18,86/9,82)

[00325] Em uma modalidade exemplar, um valor de corte liberal de 0,104 é obtido usando uma relação de ddPCR médio de 0,054 sugerindo que pacientes com uma relação de ddPCR de 0,104 ou maior são classificados como HMGA2 alto e adequado para tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Similarmente, um valor de corte conservativo pode ser obtido usando a equação: Valor de corte conservativo = ddPCR médio para HMGA2 x (177,75/9,82)

[00326] Em uma modalidade exemplar, um valor de corte conservativo de 0,976 é obtido usando um valor de ddPCR médio de 0,054 sugerindo que pacientes com uma relação de ddPCR de 0,976 ou maior são classificados como HMGA2 alto e adequado para tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[00327] Dados de Expressão de HMGA2 de RNA-seq (Método de derivação de percentil): Em uma coorte de população exemplar de pacientes com TNBC tratados com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ, amostras de tumor embebidas em parafina (FFPE), fixadas em formalina (n = 118) são usadas para extrair RNA e avaliar a qualidade de RNA como descrito em Exemplo 4. Análise de RNA-seq (como descrito em Exemplo 1) realizada em amostras que passaram no controle de qualidade (n = 103) mostra que expressão mais baixa de HMGA2 entre respondedores classificados em 22º de 28 amostras correspondendo ao percentil 78,6. A segunda expressão de HMGA2 mais baixa entre respondedores classificados em 26º de 28 amostras correspondendo ao percentil 92,9.

[00328] Corte de Expressão de HMGA2 usando Valores de Ct (Método de derivação de percentil): Em certas modalidades, um experimento de qPCR é realizado para obter quantificação relativa de expressão de HMGA2 para estabelecer um corte entre alta e baixa expressão de HMGA2. Em uma modalidade exemplar, a expressão de qPCR relativa no percentil 78,6 é um valor de ΔCt de 8,7 (corte liberal), sugerindo que pacientes com valor de ΔCt de 8,7 ou menos seria classificado como HMGA2 alto e adequado para tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em outra modalidade exemplar, a expressão de qPCR relativa no percentil 92,9 é um valor de ΔCt de 6,9 (corte conservativo), sugerindo que pacientes com valor de ΔCt de 6,9 ou menos seria classificado como HMGA2 alto e adequado para tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[00329] Corte de Expressão de HMGA2 usando Valores de Relação de ddPCR (Método de derivação de percentil): Em certas modalidades, expressão de HMGA2 pode ser quantificada por ddPCR para estabelecer um corte entre alta e baixa expressão de HMGA2. Em uma modalidade exemplar, a expressão de ddPCR relativa no percentil 78,6 é um valor de relação de ddPCR de 0,467 (corte liberal), sugerindo que pacientes com expressão relativa de HMGA2 de 0,467 ou mais seria classificado como HMGA2 alto e adequado para tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Em outra modalidade exemplar, a expressão de ddPCR relativa no percentil 92,9 é 1,375 (corte conservativo), sugerindo que pacientes com expressão relativa de HMGA2 de 1,375 ou mais seria classificado como HMGA2 alto e adequado para tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

Tabela 7 lista valores de corte de expressão exemplares obtidos por qPCR e ddPCR, e analisados por Método de Derivação de Dupla Mudança e método de derivação percentil.

Os valores de corte dependem do poder do método analítico (por exemplo, tamanho da coorte populacional), e pode variar dependendo do tamanho da amostra e as diferenças entre características populacionais (por exemplo, idade, gênero, origem étnica, hábitos de fumar, hábitos alimentares, índice de massa corporal (BMI), uso de drogas recreativas, uso de drogas médicas e/ou hábitos de exercício). Tabela 7. Resumo de expressão de valores de corte de HMGA2 e número de amostras previstas para responder a um tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ como calculado.

Corte Corte Corte Corte liberal de conservativo liberal de conservativo qPCR de qPCR ddPCR de ddPCR (Valor de (Valor de (relação de (relação de ΔCt) ΔCt) ddPCR) ddPCR) Método de Derivação de Mudança Duplicada Corte de expressão de 11,16 7,92 0,104 0,976 HMGA2 Número de amostras 43/103 16/103 25/58 4/58 (6,9%) com alta expressão de (41,7%) (15,5%) (43,1%) HMGA2 com base nos valores de corte Método de derivação de percentil Corte de expressão de 8,7 6,9 0,467 1,375 HMGA2 Número de amostras 22/103 7/103 12/58 4/58 (6,9%) com alta expressão de (21,4%) (6,8%) (20,7%)

Corte Corte Corte Corte liberal de conservativo liberal de conservativo qPCR de qPCR ddPCR de ddPCR (Valor de (Valor de (relação de (relação de ΔCt) ΔCt) ddPCR) ddPCR) HMGA2 com base nos valores de corte EXEMPLO5: Tratamento de pacientes com TNBC refratário ou resistente ao tratamento anterior

[00330] Objetivo: pacientes com (3L+) câncer de mama triplo negativo refratário ou metastático (TNBC) foram selecionados para tratamento com 1200 mg de terapia de TRAP anti-PD-L1/TGFβ e segurança e eficácia foram avaliadas.

[00331] Desenho do Estudo e Resultados: Um total de 33 pacientes foram tratados com TRAP anti-PD-L1/TGFβ em uma dose de 1200 mg a cada 2 semanas até confirmação dedoença progressiva, toxicidade inaceitável, ou retirada do ensaio. O resumo de segurança da coorte de expansão de TRAP anti-PD-L1/TGFβ em pacientes com câncer de mama triplo negativo é listado como abaixo. Pacientes nesta coorte receberam 1,200 mg de TRAP anti-PD-L1/TGFβ a cada 2 semanas.

[00332] 33 pacientes inscritos nesta coorte tiveram acompanhamento médio de 18,0 semanas (faixa: 4,0 a 31,7 semanas) e receberam uma média de 3,8 doses (faixa: 1,0 a 12,0 doses). Dois pacientes (6,1%) estavam em andamento. 31 pacientes interromperam o ensaio devido a doença progressiva (n = 26, 78,8%), morte (n = 1, 3,0%, devido à progressão da doença), evento adverso (n = 2, 6,1%, transaminite, hemólise), não conformidade do protocolo (n = 1, 3,0%, paciente incapaz de manter consultas) e retirou o consentimento (n=1, 3,0%, progredindo clinicamente e internado em hospício).

[00333] Tabela 8 lista eventos adversos emergentes do tratamento

(TEAEs) independentemente da relação com TRAP anti-PD-L1/TGFβ ocorrendo em 3 ou mais pacientes bem como todoso os AEs que são grau 3 ou superior. Os TEAEs mais comuns incluíram dispneia (n = 10, 30,3%), anemia (n = 9, 27,3%), diarreia (n = 8, 24,2%), astenia (n = 8, 24,2%), pirexia (n = 8, 24,2%), diminuição do apetite (8, 24,2%) e dor de cabeça (n = 8, 24,2%). Havia 5 pacientes (15,2%) com 7 eventos de grau 3+ avaliados como relacionados a TRAP anti-PD-L1/TGFβ pelo investigador. Isso inclui hemólise (grau 5), trombocitopenia (grau 5), dispneia (grau 5), anemia (grau 3, 3 eventos) e aumento de transaminases (grau 3). Os 3 eventos de G5 avaliados pelo investigador do estudo como relacionado com TRAP anti-PD-L1/TGFβ ocorreram em um paciente que apresentava doença extensa no início do estudo, e ao mesmo tempo descobriu-se que tinha múltiplos êmbolos pulmonares, doença progressiva e expanding pleural effusion after 3 doses. Nenhum auto-anticorpo mediando hemólise ou trombocitopenia foi identificado na preparação. Lesões cutâneas incluindo ceratoacantoma e carcinoma cutâneo de células escamosas (semelhantes aos identificados com outros agentes inibidores de TGF-β) ocorreram em aproximadamente 3 a 5% de todos os pacientes dosados no ensaio e foram bem tratados por excisão cirúrgica. No entanto, nenhuma dessas lesões cutâneas ocorreu nesta coorte. Resumindo, TRAP anti-PD-L1/TGFβ foi bem tolerado e o perfil de segurança foi consistente com as expectativas nesta coorte de câncer de mama triplo negativo altamente pré-tratado, avançado.

[00334] Tabela 8. Eventos Adversos Emergentes de Tratamento (TEAEs) em pacientes com Câncer de mama triplo negativo com TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Termos preferidos são listados para AE ocorrendo em três ou mais pacientes, e todos os eventos de grau 3+. Eventos são listados independentemente da relação com TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

Classe de órgão do sistema Qualquer Grau ≥3 Grau ≥4 Grau 5 primário grau Termo preferido n (%) n (%) n (%) n (%) Indivíduos com pelo menos 1 33 19 (57,6) 11 (33,3) 8 (24,2) evento (100%) Dispneia 10 (30,3) 3 (9,1) 1 (3,0) 1 (3,0) Anemia 9 (27,3) 5 (15,2) 0 0 Diarreia 8 (24,2) 0 0 0 Astenia 8 (24,2) 2 (6,1) 2 (6,1) 0 Pirexia 8 (24,2) 1 (3,0) 0 0 Diminuição do apetite 8 (24,2) 0 0 0 Dor de Cabeça 8 (24,2) 0 0 0 Dor abdominal 5 (15,2) 0 0 0 Constipação 5 (15,2) 0 0 0 Náusea 5 (15,2) 0 0 0 Vômito 5 (15,2) 0 0 0 Progressão de doença 5 (15,2) 4 (12,1) 4 (12,1) 4 (12,1) Aumento de AST 5 (15,2) 2 (6,1) 0 0 Dor nas extremidades 5 (15,2) 1 (3,0) 0 0 Epistaxe 4 (12,1) 0 0 0 Tosse 5 (15,2) 0 0 0 Infecção do trato respiratório 4 (12,1) 0 0 0 superior Hipocalemia 4 (12,1) 1 (3,1) 0 0 Ansiedade 4 (12,1) 0 0 0 Derrame pleural 4 (12,1) 2 (6,1) 0 0 Prurido 4 (12,1) 0 0 0 Taquicardia 3 (9,1) 0 0 0 Deterioração geral da saúde 3 (9,1) 3 (9,1) 1 (3,0) 1 (3,0) física Fadiga 3 (9,1) 1 (3,0) 0 0 Edema periférico 3 (9,1) 0 0 0 Pele seca 3 (9,1) 0 0 0 Irritação na pele 3 (9,1) 0 0 0 Aumento de ALT 2 (6,1) 1 (3,0) 0 0

Aumento de ALP 2 (6,1) 2 (6,1) 0 0 Aumento de GGT 2 (6,1) 2 (6,1) 0 0 Aumento de bilirrubina no 2 (6,1) 1 (3,0) 0 0 sangue Hipoalbuminemia 2 (6,1) 1 (3,0) 0 0 Artralgia 2 (6,1) 1 (3,0) 0 0 Hemólise 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) Leucocitose 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Trombocitopenia 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) Microangiopatia trombótica 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) Tamponamento cardíaco 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) 0 Disfunção de múltiplos órgãos 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) Mastite 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Contusão 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Fratura por compressão da 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 coluna vertebral Aumento de amilase 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Diminuição da hemoglobina 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Diminuição da contagem de 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) 0 linfócitos Aumento de transaminases 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Hipomagnesemia 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Hiponatremia 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Dor musculoesquelética 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Metástases para o sistema 1 (3,0) 1 (3,0) 1 (3,0) 0 nervoso central Dor tumoral 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Encefalopatia 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Embolia pulmonar 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Lesão cutânea 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Trombose da veia jugular 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Linfedema 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0 Síndrome de veia cava superior 1 (3,0) 1 (3,0) 0 0

[00335] Como descrito na narrativa, 1 paciente teve 3 TEAEs G5 avaliados como relacionado com TRAP anti-PD-L1/TGFβ (dispneia,

hemólise, trombocitopenia) pelo investigador do estudo. Os 7 pacientes adicionais com eventos G5 não foram atribuídos como relacionados a TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Por protocolo, a "Doença Progressiva" TEAE, foi documentada quando um paciente morreu devido a doença progressiva dentro de 28 dias de administração de fármaco mais recente, ou se progressão de doença foi avaliada pelo investigador ter ocorrido mais rapidamente do que o esperado.

[00336] Em uma modalidade exemplar, TRAP anti-PD-L1/TGFβ é administrada como uma dose independente de BW de 1800 mg para pacientes com câncer TNBC uma vez a cada três semanas. A administração é realizada intravenosamente por cerca de uma hora (- 10 minutos / +20 minutos, por exemplo, 50 minutos a 80 minutos). Em uma modalidade exemplar, TRAP anti-PD-L1/TGFβ é administrada como uma dose independente de BW de 2100 mg para pacientes de câncer TNBC uma vez a cada três semanas. A administração é realizada intravenosamente por cerca de uma hora (-10 minutos / +20 minutos, por exemplo, 50 minutos a 80 minutos). Em uma modalidade exemplar, TRAP anti-PD-L1/TGFβ é administrada como uma dose independente de BW de 2400 mg para pacientes com câncer com TNBC uma vez a cada três semanas. A administração é realizada intravenosamente por cerca de uma hora (-10 minutos / +20 minutos, por exemplo, 50 minutos a 80 minutos). Em uma modalidade exemplar, TRAP anti-PD-L1/TGFβ é administrada como uma dose independente de BW de 2600 mg, 2800 mg, ou 3000 mg para pacientes com câncer com TNBC uma vez a cada três semanas. A administração é realizada intravenosamente por cerca de uma hora (-10 minutos / +20 minutos, por exemplo, 50 minutos a 80 minutos). Em uma ou mais modalidades exemplares, a fim de mitigar possíveis reações relacionadas à infusão, pré-medicação com um anti-histamínico e com paracetamol (acetaminofeno) (por exemplo, 25 a 50 mg de difenidramina e 500 a 650 mg de paracetamol [acetaminofeno] IV ou equivalente a oral) aproximadamente 30 a 60 minutos antes de cada dose de TRAP anti- PD-L1/TGFβ é administrada para as 2 primeiras infusões. Se forem observadas reações à infusão de Grau ≥ 2 durante as duas primeiras infusões, a pré-medicação não é interrompida. Esteroides como pré- medicação não são permitidos.

[00337] O que se segue descreve os critérios de inclusão para os pacientes usados neste exemplo. Pacientes:  têm ≥ 18 anos, inclusive no momento do consentimento informado  têm diagnóstico histologicamente confirmado de TNBC  têm doença mensurável com base em RECIST 1,1 (ver, Eisenhauer et al., EJC. 2009; 45:228-247)  não receberam tratamento de terapia sistêmica anterior, ou qualquer anticorpo ou fármaco direcionado a proteínas co- reguladoras de células T (pontos de verificação imunes), tal como anticorpo anti-PDL1, ou anti-CTLA-4, desde o diagnóstico de TNBC metastático e refratário (3L+) (conclusão de tratamento com quimioterapia citotóxica, terapia biológica e/ou radiação como parte da terapia neoadjuvante/adjuvante é permitido, desde que a terapia tenha sido concluída pelo menos 6 meses antes do diagnóstico de doença metastática)  têm uma expectativa de vida de pelo menos 12 semanas (com base na avaliação do médico do prognóstico do paciente após o diagnóstico)  têm material tumoral disponível (< 6 meses de idade) adequado para análise de biomarcador  têm status de desempenho Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG PS) de 0 a 1

 têm função hematológica adequada considerada como contagem absoluta de neutrófilos (ANC) ≥ 1,5 × 109/L, contagem de plaquetas ≥ 100 × 109/L, e Hgb ≥ 9 g/dL  têm função hepática adequada considerada como um nível de bilirrubina total ≤ 1,5 × limite superior do normal (ULN), um nível de aspartato aminotransferase (AST) ≤ 3,0 × ULN, um nível de alanina aminotransferase (ALT) ≤ 3,0 × ULN e fosfatase alcalina ≤ 2,5 ULN. Para participantes com envolvimento hepático em seu tumor, aspartato aminotransferase (AST) ≤ 5,0 × ULN, alanina aminotransferase (ALT) ≤ 5,0 × ULN, e bilirrubina ≤ 3,0 × ULN é aceitável  têm função renal adequada considerada ascreatinina ≤ 1,5 × ULN ou depuração de creatinina calculada > 30 mL / min; e  têm função de coagulação adequada considerada como relação normalizada internacional (INR) ou tempo de protrombina (PT) ≤1,5 × ULN, a menos que o participante esteja recebendo terapia anticoagulante, e tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) ≤1,5 × ULN, a menos que o participante esteja recebendo terapia anticoagulante. EXEMPLO 6: Tratamento de pacientes com TNBC com alta expressão de HMGA2

[00338] Objetivo: O propósito deste estudo é determinar a melhor resposta geral (BOR) de tratamento de TRAP anti-PD-L1/TGFβ em pacientes com câncer de mama triplo negativo avançado (TNBC) que têm tumores tem alta expressão de HMGA2 e progressão de doença em ou após quimioterapia sistêmica de primeira linha.

[00339] Desenho do Estudo: Este é um ensaio clínico de fase II conduzido por biomarcador de único braço para avaliar a eficácia clínica da TRAP anti-PD-L1/TGFβ em pacientes com câncer de mama triplo negativo avançado (TNBC) com alta expressão de HMGA2.

[00340] Em uma modalidade exemplar, os tumores de pacientes com TNBC são classificados para alta expressão de HMGA2, considerados como nível de expressão de HMGA2 que é pelo menos 2,27 vezes maior do que a média da população entre os pacientes com TNBC. O material do tumor é necessário para todos os participantes para verificar o status do HMGA2 por RT-PCR centralizado e pode incluir biópsia recente ou material de arquivo.

[00341] Aproximadamente 29 pacientes atendendo o corte predeterminado para alta expressão de HMGA2 estão incluídos no estudo. Pacientes são tratados com proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ a 1200 mg por infusão uma vez a cada 14 dias (+/- 3 dias). O tratamento é continuado até a progressão da doença confirmada, toxicidade inaceitável, resposta completa confirmada sustentada ou retirada do ensaio por um período de até dois anos. Opcionalmente, um tratamento mais longo e após a progressão da doença confirmada é possível após discussão com a supervisão médica do estudo e se for determinado que o paciente pode se beneficiar do tratamento contínuo.

[00342] A fim de mitigar possíveis reações relacionadas à infusão, a pré-medicação com um anti-histamínico e com acetaminofeno é opcionalmente administrada antes das duas primeiras doses de TRAP anti-PD-L1/TGFβ. Pacientes que foram pré-medicados com esteroides não são excluídos do estudo.

[00343] Avaliações de eficácia: Resposta ao tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ é avaliada por imageamento CT a cada 6 a 8 semanas +/- 7 dias de acordo com critérios RECIST 1,1. Varreduras realizadas na linha de base são repetidas nas visitas subsequentes. Em geral, lesões detectadas na linha de base são acompanhadas usando a mesma metodologia de imagem e de preferência o mesmo equipamento de imagem em visitas de avaliação do tumor subsequentes. Taxa de resposta geral (ORR), sobrevivência livre de progressão (PFS) e a duração da resposta (DOR) são calculadas e comparadas com o controlo histórico.

[00344] Tratamento é continuado até confirmação de doença progressiva (PD) por Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos versão 1,1 (RECIST 1,1), toxicidade inaceitável, ou por até 24 meses. Pacientes que experimentam doença estável (SD), resposta parcial (PR), ou resposta completa (CR) continuarão o tratamento até o final de 24 meses, embora um tratamento adicional seja possível. O tratamento após a progressão da doença confirmada será possível após discussão com o monitor médico do estudo, se for determinado que o paciente pode se beneficiar do tratamento contínuo.

[00345] Ao longo do tratamento, segurança de tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ é avaliada em pacientes com câncer de mama triplo negativo avançado que experimentaram tratamento (TNBC) com alto HMGA2 através da gravação, relatórios e análise de condições médicas de linha de base, eventos adversos (AEs), achados do exame físico, incluindo sinais vitais, status de perfomance ECOG, e testes de laboratório.

[00346] Resultados: A resposta objetiva do tumor é avaliada pela taxa de resposta geral (ORR), definida como o número de participantes que alcançaram uma melhor resposta geral (BOR) de resposta completa (CR) ou resposta parcial (PR) dividido pelo número de participantes na população de análise. A sobrevivência livre de progressão é definida como o tempo desde a randomização até a data da primeira documentação de progressão objetiva da doença (PD) avaliada de acordo com RECIST 1,1 ou morte por qualquer causa, o que ocorrer primeiro. É contemplado que tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ resulta na melhora da resposta clínica para pacientes com TNBC expressando alto HMGA2. Os pacientes tratados exibem resposta à doença (por exemplo, resposta parcial, resposta completa, doença estável) e/ou sobrevivência aumentada (por exemplo, sobrevivência livre de progressão e/ou sobrevivência). É contemplado que tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ resulta em sobrevivência superior de pacientes com TNBC expressando alto HMGA2 em comparação com a quimioterapia sistêmica.

[00347] Em outra modalidade exemplar, pacientes com TNBC são rastreados para alta expressão de MECOM, considerada como nível de expressão de MECOM que é 1,73 vezes maior do que a média da população entre os pacientes com TNBC. O mesmo estudo é conduzido com 30 pacientes atendendo ao corte predeterminado para alta expressão de MECOM.

[00348] Em resumo, HMGA2 são considerados novos biomarcadores confiáveis para determinar uma resposta melhorada ao tratamento com TRAP anti-PD-L1/TGFβ em pacientes com TNBC.

MODALIDADES NUMERADAS

[00349] Modalidades divulgadas aqui incluem modalidades P1 a P92 como fornecido nas modalidades numeradas da invenção.

[00350] Modalidade P1: Método de tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) em um paciente, o método compreendendo administrar um agente anti-TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook 2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) relativa a um nível de controle conhecido, e desse modo tratando TNBC no paciente.

[00351] Modalidade P2: Método de obter pelo menos uma resposta parcial tratando ou aumentanto a sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC), o método compreendendo administrar um agente anti-TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook 2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) relativa a um nível de controle conhecido, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial ao tratamento de TNBC no paciente.

[00352] Modalidade P3: Método de identificação de um paciente adequado para o tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) no paciente com um agente anti-TGFβ, o método compreendendo determinar o nível de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) no paciente, em que um nível aumentado de expressão de HMGA2 no paciente, relativa a um nível de controle conhecido, identifica o paciente como adequado para o tratamento de TNBC com o referido agente anti-TGFβ.

[00353] Modalidade P4: O método de qualquer uma das modalidades P1 a P3, em que o nível de HMGA2 do paciente é determinado por análise de uma amostra de tecido do paciente.

[00354] Modalidade P5: O método de modalidade P4, em que a amostra de tecido é uma amostra de biópsia, amostra de sangue, soro, ou plasma.

[00355] Modalidade P6: O método de modalidade P4 ou P5, em que o nível de HMGA2 é determinado por imunoquímica ou por análise de expressão de RNA.

[00356] Modalidade P7: O método de qualquer uma das modalidades P1 a P6, em que o agente anti-TGFβ é uma proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo: (a) pelo menos uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga à proteína humana Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1); e (b) Receptor II de Fator β de Crescimento Transformante (TGFβRII), ou um fragmento do mesmo, capaz de ligar Fator β de Crescimento Transformante (TGFβ), e um segundo polipeptídeo compreendendo pelo menos uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-L1; em que a cadeia pesada do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve do segundo polipeptídeo, quando combinadas, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga à PD- L1.

[00357] Modalidade P8: O método de modalidade P7, em que ao paciente são administrados pelo menos 1200 mg do agente anti-TGFβ.

[00358] Modalidade P9: O método de modalidade P7, em que ao paciente são administrados pelo menos 1800 mg da proteína TRAP anti- PD-L1/TGFβ.

[00359] Modalidade P10: O método de modalidade P7, em que ao paciente são administrados 1800 mg a 3000 mg da proteína TRAP anti- PD-L1/TGFβ.

[00360] Modalidade P11: O método de modalidade P7, em que ao paciente são administrados 1800 mg a 2100 mg da proteína TRAP anti- PD-L1/TGFβ.

[00361] Modalidade P12: O método de modalidade P7, em que ao paciente são administrados 1200 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ.

[00362] Modalidade P13: O método de modalidade P12, em que ao paciente são administrados 1200 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas.

[00363] Modalidade P14: O método de modalidade P10, em que ao paciente são administrados 2400 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ.

[00364] Modalidade P15: O método de modalidade P14, em que ao paciente são administrados 2400 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas.

[00365] Modalidade P16: O método de modalidade P10, em que ao paciente são administrados 2100 mg ou 3000 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas.

[00366] Modalidade P17: O método de qualquer uma das modalidadess P1 a P16, em que a expressão aumentada de HMGA2 foi determinada por meio de quantificação de expressão de mRNA de HMGA2.

[00367] Modalidade P18: O método de modalidade P17, em que a quantificação de expressão de mRNA de HMGA2 é por meio de PCR.

[00368] Modalidade P19: O método de qualquer uma das modalidades P1 a P18, em que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 2,27 vezes maior do que uma expressão média da população conhecida de HMGA2 entre os pacientes com TNBC.

[00369] Modalidade P20: O método de qualquer uma das modalidades P1 a P19, em que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 5 vezes maior do que uma expressão média da população conhecida de HMGA2 entre os pacientes com TNBC.

[00370] Modalidade P21: O método de qualquer uma das modalidades P1 a P18, em que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais do que o nível normal de expressão de HMGA2.

[00371] Modalidade P22: O método de qualquer uma das modalidades P1 a P18, em que a expressão aumentada de HMGA2 no paciente é pelo menos 19 a 35 vezes maior do que a expressão de HMGA2 em um paciente que não é responsivo a um tratamento com o agente anti-TGFβ.

[00372] Modalidade P23: O método de qualquer uma das modalidades P1 a P16, em que a expressão aumentada de HMGA2 foi determinada pelo nível de expressão da proteína HMGA2.

[00373] Modalidade P24: O método de modalidade P23, em que o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2 foi determinado por meio da imunoistoquímica.

[00374] Modalidade P25: O método de modalidade P24, em que mais do que 1% células de tumor expressando a proteina HMGA2 em uma amostra de tecido obtida do paciente de TNBC determinado o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2 .

[00375] Modalidade P26: Método de tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) em um paciente, o método compreendendo administrar um agente anti-TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de MECOM relativa a um nível de controle conhecido, e desse modo tratando TNBC no paciente.

[00376] Modalidade P27: Método de obter pelo menos uma resposta parcial tratando ou aumentanto a sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC), o método compreendendo administrar um agente anti-TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de MECOM relativa a um nível de controle conhecido, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial ao tratamento de TNBC no paciente.

[00377] Modalidade P28: Método de identificação de um paciente adequado para o tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) do paciente com um agente anti-TGFβ, o método compreendendo determinar o nível de MECOM no paciente, em que um nível aumentado de expressão de MECOM no paciente, relativa a um nível de controle conhecido, identifica o paciente como adequado para o tratamento de TNBC com o agente anti-TGFβ.

[00378] Modalidade P29: O método de qualquer uma das modalidades P26 a P28, em que o nível de MECOM do paciente é determinado analisando uma amostra do paciente.

[00379] Modalidade P30: O método de modalidade P29, em que a amostra é uma amostra de biópsia, amostra de sangue, soro, ou plasma.

[00380] Modalidade P31: O método de modalidade P29 ou P30, em que o nível de MECOM é determinado por imunoquímica ou por análise de expressão de RNA.

[00381] Modalidade P32: O método de qualquer uma das modalidades P26 a P31, em que o agente anti-TGFβ é uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo: (a) pelo menos uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga à proteína humana Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1); e (b) Receptor II de Fator β de Crescimento Transformante (TGFβRII), ou um fragmento do mesmo, capaz de ligar Fator β de Crescimento Transformante (TGFβ), e um segundo polipeptídeo compreendendo pelo menos uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-L1; em que a cadeia pesada do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve do segundo polipeptídeo, quando combinadas, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga à PD-L1.

[00382] Modalidade P33: O método de modalidade P32, em que ao paciente são administrados pelo menos 1200 mg da proteína TRAP anti- PD-L1/TGFβ.

[00383] Modalidade P34: O método de modalidade P32 ou P33, em que ao paciente são administrados pelo menos 1800 mg da proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ.

[00384] Modalidade P35: O método de modalidade P34, em que ao paciente são administrados 1800 mg a 3000 mg da proteína TRAP anti- PD-L1/TGFβ.

[00385] Modalidade P36: O método de modalidade P35, em que ao paciente são administrados 1800 mg a 2100 mg da proteína TRAP anti- PD-L1/TGFβ.

[00386] Modalidade P37: O método de modalidade P36, em que ao paciente são administrados 1200 mg de uma proteína.

[00387] Modalidade P38: O método de modalidade P37, em que ao paciente são administrados 1200 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ, uma vez a cada duas semanas.

[00388] Modalidade P39: O método de modalidade P35, em que ao paciente são administrados 2400 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ.

[00389] Modalidade P40: O método de modalidade P39, em que ao paciente são administrados 2400 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas.

[00390] Modalidade P41: O método de modalidade P35, em que ao paciente são administrados 3000 mg da proteína TRAP anti-PD- L1/TGFβ, uma vez a cada três semanas.

[00391] Modalidade P42: O método de qualquer uma das modalidades P26 a P41, em que o aumento de expressão de MECOM foi determinado por meio de quantificação de expressão de mRNA de MECOM.

[00392] Modalidade P43: O método de modalidade P42, em que a quantificação de expressão de mRNA de MECOM é por meio de PCR.

[00393] Modalidade P44: O método de qualquer uma das modalidades P26 a P43, em que o aumento da expressão de MECOM é pelo menos 1,5 vezes maior do que um nível médio de população conhecido de expressão de MECOM entre os pacientes com TNBC.

[00394] Modalidade P45: O método de qualquer uma das modalidades P26 a P43, em que o aumento da expressão de MECOM é pelo menos 2,5 vezes maior do que o nível médio de população conhecido de expressão de MECOM entre os pacientes com TNBC.

[00395] Modalidade P46: O método de qualquer uma das modalidades P26 a P43, em que o aumento de expressão de MECOM é pelo menos 100%, pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600%

maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais do que o nível normal de expressão MECOM.

[00396] Modalidade P47: O método de qualquer uma das modalidades P26 a P43, em que o aumento da expressão de MECOM no paciente é pelo menos 19 vezes maior do que a expressão de MECOM em um paciente que não é responsivo a um tratamento com o agente anti-TGFβ.

[00397] Modalidade P48: O método de qualquer uma das modalidades P26 a P41, em que o aumento da expressão de MECOM foi determinado por meio de quantificação da proteína MECOM.

[00398] Modalidade P49: O método de modalidade P48, em que o aumento de nível de proteína MECOM foi determinado por meio da imunoistoquímica.

[00399] Modalidade P50: O método de modalidade P49, em que mais do que 1% das células de tumor expressando proteína MECOM em uma amostra de tecido obtida do paciente de TNBC determinou o aumento de nível de expressão de proteína MECOM.

[00400] Modalidade P51: Agente anti-TGFβ no método de tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) em um paciente, o método compreendendo administrar um agente anti- TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook 2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) relativa a um nível de controle conhecido, e desse modo tratando TNBC no paciente.

[00401] Modalidade P52: Agente anti-TGFβ no método de obter pelo menos uma resposta parcial tratando ou aumentanto a sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC), o método compreendendo administrar um agente anti-TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook 2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) relativa a um nível de controle conhecido, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial ao tratamento de TNBC no paciente.

[00402] Modalidade P53: Agente anti-TGFβ no método de identificação de um paciente adequado para o tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) no paciente com um agente anti-TGFβ, o método compreendendo determinar o nível de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) no paciente, em que um nível aumentado de expressão de HMGA2 no paciente, em relação a um nível de controle conhecido, identifica o paciente como adequado para o tratamento de TNBC com o referido agente anti-TGFβ.

[00403] Modalidade P54: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P53, em que o nível de HMGA2 do paciente é determinado por análise de uma amostra de tecido do paciente.

[00404] Modalidade P55: O agente anti-TGFβ de modalidade P54, em que a amostra de tecido é uma amostra de biópsia, amostra de sangue, soro, ou plasma.

[00405] Modalidade P56: O agente anti-TGFβ de modalidade P54 ou P55, em que o nível de HMGA2 é determinado por imunoquímica ou por análise de expressão de RNA.

[00406] Modalidade P57: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P56, em que a expressão aumentada de HMGA2 foi determinada por meio de quantificação de expressão de mRNA de HMGA2.

[00407] Modalidade P58: O agente anti-TGFβ de modalidade P57, em que a quantificação de expressão de mRNA de HMGA2 é por meio de PCR.

[00408] Modalidade P59: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P58, em que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 2,27 vezes maior do que uma expressão média da população conhecida de HMGA2 entre os pacientes com TNBC.

[00409] Modalidade P60: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P59, em que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 5 vezes maior do que uma expressão média da população conhecida de HMGA2 entre os pacientes com TNBC.

[00410] Modalidade P61: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P58, em que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais do que o nível normal de expressão de HMGA2.

[00411] Modalidade P62: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P58, em que a expressão aumentada de HMGA2 no paciente é pelo menos 19 a 35 vezes maior do que a expressão de HMGA2 em um paciente que não é responsivo a um tratamento com o agente anti-TGFβ.

[00412] Modalidade P63: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P56, em que a expressão aumentada de HMGA2 foi determinada pelo nível de expressão da proteína HMGA2.

[00413] Modalidade P64: O agente anti-TGFβ de modalidade P63, em que o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2 foi determinado por meio da imunoistoquímica.

[00414] Modalidade P65: O agente anti-TGFβ de modalidade P64, em que mais do que 1% células de tumor expressando a proteina HMGA2 em uma amostra de tecido obtida do paciente de TNBC determinado o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2 .

[00415] Modalidade P66: Agente anti-TGFβ no método de tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) em um paciente, o método compreendendo administrar um agente anti-

TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de MECOM relativa a um nível de controle conhecido, e desse modo tratando TNBC no paciente.

[00416] Modalidade P67: Agente anti-TGFβ no método de obter pelo menos uma resposta parcial tratando ou aumentanto a sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC), o método compreendendo administrar um agente anti-TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de MECOM relativa a um nível de controle conhecido, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial ao tratamento de TNBC no paciente.

[00417] Modalidade P68: Agente anti-TGFβ no método de identificação de um paciente adequado para o tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) do paciente com um agente anti-TGFβ, o método compreendendo determinar o nível de MECOM no paciente, em que um nível aumentado de expressão de MECOM no paciente, relativa a um nível de controle conhecido, identifica o paciente como adequado para o tratamento de TNBC com o agente anti-TGFβ.

[00418] Modalidade P69: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P66 a P68, em que o nível de MECOM do paciente é determinado analisando uma amostra do paciente.

[00419] Modalidade P70: O agente anti-TGFβ de modalidade P69, em que a amostra é uma amostra de biópsia, amostra de sangue, soro, ou plasma.

[00420] Modalidade P71: O agente anti-TGFβ de modalidade P69 ou P70, em que o nível de MECOM é determinado por imunoquímica ou por análise de expressão de RNA.

[00421] Modalidade P72: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P66 a P71, em que o aumento da expressão de MECOM foi determinado por meio de quantificação de expressão de mRNa de MECOM.

[00422] Modalidade P73: O agente anti-TGFβ de modalidade 72, em que a quantificação de expressão de mRNa de MECOM é por meio de PCR.

[00423] Modalidade P74: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P66 a P73, em que o aumento da expressão de MECOM é pelo menos 1,5 vezes maior do que um nível médio de população conhecido de expressão de MECOM entre os pacientes com TNBC.

[00424] Modalidade P75: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P66 a P73, em que o aumento da expressão de MECOM é pelo menos 2,5 vezes maor do que o nível médio de população conhecido de expressão de MECOM entre os pacientes com TNBC.

[00425] Modalidade P76: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P66 a P73, em que o aumento da expressão de MECOM é pelo menos 100%, pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais do que o nível normal de expressão MECOM.

[00426] Modalidade P77: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P66 a P73, em que o aumento da expressão de MECOM no paciente é pelo menos 19 vezes maior do que a expressão de MECOM em um paciente que não é responsivo a um tratamento com o agente anti-TGFβ.

[00427] Modalidade P78: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P66 a P71, em que o aumento da expressão de MECOM foi determinado por meio de quantificação da proteína MECOM.

[00428] Modalidade P79: O agente anti-TGFβ de modalidade P78, em que o aumento de nível de proteína MECOM foi determinado por meio da imunoistoquímica.

[00429] Modalidade P80: O agente anti-TGFβ de modalidade P79,

em que mais do que 1% das células de tumor expressando proteína MECOM em uma amostra de tecido obtida do paciente de TNBC determinou o aumento do nível de expressão de proteína MECOM.

[00430] Modalidade P81: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P80, em que o agente anti-TGFβ é uma proteína TRAP anti-PD-L1/TGFβ compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo: (a) pelo menos uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga à proteína humana Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1); e (b) Receptor II de Fator β de Crescimento Transformante (TGFβRII), ou um fragmento do mesmo, capaz de ligar Fator β de Crescimento Transformante (TGFβ), e um segundo polipeptídeo compreendendo pelo menos uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-L1; em que a cadeia pesada do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve do segundo polipeptídeo, quando combinadas, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga à PD-L1.

[00431] Modalidade P82: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P81, em que a dose é 1200 mg a 3000 mg.

[00432] Modalidade P83: O agente anti-TGFβ de modalidade P82, em que a dose é 1200 mg.

[00433] Modalidade P84: O agente anti-TGFβ de modalidade P83, em que a dose é 1200 mg, administrado uma vez a cada duas semanas.

[00434] Modalidade P85: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P82, em que a dose é 2100 mg a 2400 mg.

[00435] Modalidade P86: O agente anti-TGFβ de modalidade P85, em que a proteína é administrada uma vez a cada três semanas.

[00436] Modalidade P87: O agente anti-TGFβ de modalidade P86, em que a dose é 2100 mg, administrada uma vez a cada três semanas.

[00437] Modalidade P88: O agente anti-TGFβ de modalidade P86, em que a dose é 2400 mg, administrada uma vez a cada três semanas.

[00438] Modalidade P89: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P82, em que a dose é 3000 mg, administrada uma vez a cada três semanas.

[00439] Modalidade P90: O agente anti-TGFβ de qualquer uma das modalidades P51 a P89, em que a proteína é administrada por administração intravenosa.

[00440] Modalidade P91: O agente anti-TGFβ de modalidade P90, em que a administração intravenosa é realizada com uma bolsa pré- carregada, uma caneta pré-carregada, ou uma seringa pré-carregada compreendendo uma formulação compreendendo a proteína.

[00441] Modalidade P92: O agente anti-TGFβ de modalidade P91, em que a bolsa é conectada com um canal compreendendo um tubo e/ou uma agulha.

SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:1 Sequência de peptídeo da cadeia leve lambda anti-PD-L1 secretada

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAP KLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSY TSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPE

QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 2 Sequência de peptídeo da cadeia H secretada de anti-PDL1

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLE WVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 3 Sequência de peptídeo da cadeia H secretada de anti-PDL1/TGFβ Trap

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLE WVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQ KSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFI

LEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 4 Sequência de DNA do códon de iniciação da translação para o códon de interrupção da translação da cadeia leve lambda anti-PD-L1 (a sequência líder que precede a VL é o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de urocinase) atgagggccctgctggctagactgctgctgtgcgtgctggtcgtgtccgacagcaagggcCAG

TCCGCCCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCCCCTGGCCA GTCCATCACCATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCG GCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCC CCCAAGCTGATGATCTACGACGTGTCCAACCGGCCCTCCGGCGT GTCCAACAGATTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCTCCCT GACCATCAGCGGACTGCAGGCAGAGGACGAGGCCGACTACTACT

GCTCCTCCTACACCTCCTCCAGCACCAGAGTGTTCGGCACCGGC ACAAAAGTGACCGTGCTGggccagcccaaggccaacccaaccgtgacactgttcc ccccatcctccgaggaactgcaggccaacaaggccaccctggtctgcctgatctcagatttctatc caggcgccgtgaccgtggcctggaaggctgatggctccccagtgaaggccggcgtggaaacc accaagccctccaagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccccg agcagtggaagtcccaccggtcctacagctgccaggtcacacacgagggctccaccgtggaa aagaccgtcgcccccaccgagtgctcaTGA SEQ ID NO: 5 Sequência de DNA do códon de iniciação da traslação para o códon de interrupçãp da translação (líder mVK SP: sublinhado pequeno; VH: capitais; IgG1m3 com translação de K para A: letras pequenas; (G4S)x4-G (SEQ ID NO: 11) ligante: letras maiúsculas em negrito; TGFβRII: letras minúsculas sublinhadas em negrito; dois códons de interrupção: letras capital sublinhadas em negrito) atggaaacagacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcccggctccacaggcGAG

GTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCG GCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCA GCTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTG GAATGGGTGTCCTCCATCTACCCCTCCGGCGGCATCACCTTCTAC GCCGACACCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTC CAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGG ACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGATCAAGCTGGGCACCGTG

ACCACCGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTC CTCCgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgg gggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtgg aactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactcta ctccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac gtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaa aactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccc cccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggac gtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatg ccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc gtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctc ccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgt acaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtca aaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaac tacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtg gacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcaca accactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtgctGGCGGCGGAGGAAGC

GGAGGAGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGAGGTGGC TCCGGAatccctccccacgtgcagaagtccgtgaacaacgacatgatcgtgaccgac aacaacggcgccgtgaagttccctcagctgtgcaagttctgcgacgtgaggttcagcac ctgcgacaaccagaagtcctgcatgagcaactgcagcatcacaagcatctgcgagaag ccccaggaggtgtgtgtggccgtgtggaggaagaacgacgaaaacatcaccctcgaga ccgtgtgccatgaccccaagctgccctaccacgacttcatcctggaagacgccgcctcc cccaagtgcatcatgaaggagaagaagaagcccggcgagaccttcttcatgtgcagctg cagcagcgacgagtgcaatgacaacatcatctttagcgaggagtacaacaccagcaac cccgacTGATAA SEQ ID NO: 6 Sequência de polipeptídeo da cadeia leve lambda secretada de Trap anti-PD-L1 (mut)/TGFβ, com mutações A31G,D52E,R99Y

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAP KLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSY TSSSTYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPE

QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 7 Sequência de polipeptídeo da cadeia pesada secretada de Trap anti- PD-L1 (mut)/TGFβ TrapEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPG

KGLEWVSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAIYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFST CDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLP YHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNT

SNPD SEQ ID NO: 8 Polipeptídeo Precursor da Isoforma A de TGFβRII Humano (Nº de Acesso NCBI RefSeq: NP_001020018)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCN RTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMS NCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAA SPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ VTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEH CAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQ NTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERK TELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLH SDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSV DDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWE MTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPS FWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLS

GRSCSEEKIPEDGSLNTTK SEQ ID NO: 9

Polipeptídeo Precursor de Isoforma B de TGFβRII humano (No. de Acesso NCBI RefSeq: NP_003233)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKF PQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDE NITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSD ECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNR QQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTEL LPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKT EKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLT RHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNIL VKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESR MNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKV REHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHD

PEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK SEQ ID NO: 10 Um polipeptídeo de domínio extracelular da isoforma B humana de TGFβRII

IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMS NCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAA

SPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 11 ligante (Gly4Ser)4Gly

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG SEQ ID NO: 12 Sequência de polipeptídeo da região variável da cadeia pesada secretada do anticorpo MPDL3289A anti-PD-L1

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLE WVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAV

YYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 13

Sequência de polipeptídeo da região variável da cadeia pesada secretada do anticorpo MPDL3289A anti-PD-L1

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHP

ATFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 14 Sequência de polipeptídeo da região variável da cadeia pesada secretada do anticorpo anti-PD-L1 YW243.55S70

YYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA SEQ ID NO: 50 Um polipeptídeo de domínio extracelular de isoforma B humano truncado de TGFβRII

GAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVW RKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMC

SCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 51 Um polipeptídeo de domínio extracelular de isoforma B humano truncado de TGFβRII

VKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRK NDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSC

SSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 52 Um polipeptídeo de domínio extracelular de isoforma B humano truncado de TGFβRII

VTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVC VAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGET

FFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 53

Um polipeptídeo de domínio extracelular de isoforma B humano truncado de TGFβRII

LCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENIT LETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDEC

NDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 54 Um polipeptídeo de domínio extracelular de isoforma B humano mutado TGFβRII

VTDNAGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVC VAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGET

FFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 55 Sequência de polipeptídeo da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-PD-L1

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLE YIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC

ARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS SEQ ID NO: 56 Sequência de polipeptídeo de uma região variável de cadeia leve de anticorpo anti-PD-L1

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPG QPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC

QQYYGYPYTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 57 Sequência de polipeptídeo da região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-PD-L1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGL EWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDT

AVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 58

Sequência de polipeptídeo de uma região variável de cadeia leve do anticorpo anti-PD-L1

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQP PKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQS

FEDPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 59 Sequência de polipeptídeo de cadeia pesada do anticorpo anti-PD-L1

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLE YIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC ARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 60 Sequência de polipeptídeo de uma cadeia leve do anticorpo anti-PD-L1

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPG QPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS

KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 61 Sequência de polipeptídeo da cadeia pesada do anticorpo anti-PD-L1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGL EWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDT AVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW

QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGA SEQ ID NO: 62 Sequência de polipeptídeo de uma cadeia leve do anticorpo anti-PD-L1

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQP PKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQS FEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:63 HMGA2 variante 1 RefSeq NM_003483.4 >NM_003483.4 Homo sapiens AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2), variante de transcrição 1, mRNA

CTTGAATCTTGGGGCAGGAACTCAGAAAACTTCCAGCCCGGGCA GCGCGCGCTTGGTGCAAGACTCAGGAGCTAGCAGCCCGTCCCCC TCCGACTCTCCGGTGCCGCCGCTGCCTGCTCCCGCCACCCTAGG AGGCGCGGTGCCACCCACTACTCTGTCCTCTGCCTGTGCTCCGT GCCCGACCCTATCCCGGCGGAGTCTCCCCATCCTCCTTTGCTTTC CGACTGCCCAAGGCACTTTCAATCTCAATCTCTTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGCAGGGTGGGGGGAA GAGGAGGAGGAATTCTTTCCCCGCCTAACATTTCAAGGGACACAA TTCACTCCAAGTCTCTTCCCTTTCCAAGCCGCTTCCGAAGTGCTCC CGGTGCCCGCAACTCCTGATCCCAACCCGCGAGAGGAGCCTCTG CGACCTCAAAGCCTCTCTTCCTTCTCCCTCGCTTCCCTCCTCCTCT TGCTACCTCCACCTCCACCGCCACCTCCACCTCCGGCACCCACC CACCGCCGCCGCCGCCACCGGCAGCGCCTCCTCCTCTCCTCCTC CTCCTCCCCTCTTCTCTTTTTGGCAGCCGCTGGACGTCCGGTGTT GATGGTGGCAGCGGCGGCAGCCTAAGCAACAGCAGCCCTCGCA GCCCGCCAGCTCGCGCTCGCCCCGCCGGCGTCCCCAGCCCTAT CACCTCATCTCCCGAAAGGTGCTGGGCAGCTCCGGGGCGGTCGA GGCGAAGCGGCTGCAGCGGCGGTAGCGGCGGCGGGAGGCAGG ATGAGCGCACGCGGTGAGGGCGCGGGGCA GCCGTCCACTTCAGCCCAGGGACAACCTGCCGCCCCAGCGCCTC AGAAGAGAGGACGCGGCCGCCCCAGGAAGCAGCAGCAAGAACC AACCGGTGAGCCCTCTCCTAAGAGACCCAGGGGAAGACCCAAAG GCAGCAAAAACAAGAGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAGAAAGCAG AAGCCACTGGAGAAAAACGGCCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGG CCACAACAAGTTGTTCAGAAGAAGCCTGCTCAGGAGGAAACTGAA GAGACATCCTCACAAGAGTCTGCCGAAGAGGACTAGGGGGCGCC AACGTTCGATTTCTACCTCAGCAGCAGTTGGATCTTTTGAAGGGA GAAGACACTGCAGTGACCACTTATTCTGTATTGCCATGGTCTTTCC ACTTTCATCTGGGGTGGGGTGGGGTGGGGTGGGGGAGGGGGGG GTGGGGTGGGGAGAAATCACATAACCTTAAAAAGGACTATATTAA TCACCTTCTTTGTAATCCCTTCACAGTCCCAGGTTTAGTGAAAAAC TGCTGTAAACACAGGGGACACAGCTTAACAATGCAACTTTTAATTA CTGTTTTCTTTTTTCTTAACCTACTAATAGTTTGTTGATCTGATAAG CAAGAGTGGGCGGGTGAGAAAAACCGAATTGGGTTTAGTCAATCA CTGCACTGCATGCAAACAAGAAACGTGTCACACTTGTGACGTCGG GCATTCATATAGGAAGAACGCGGTGTGTAACACTGTGTACACCTC AAATACCACCCCAACCCACTCCCTGTAGTGAATCCTCTGTTTAGAA CACCAAAGATAAGGACTAGATACTACTTTCTCTTTTTCGTATAATCT TGTAGACACTTACTTGATGATTTTTAACTTTTTATTTCTAAATGAGA CGAAATGCTGATGTATCCTTTCATTCAGCTAACAAACTAGAAAAGG TTATGTTCATTTTTCAAAAAGGGAAGTAAGCAAACAAATATTGCCA ACTCTTCTATTTATGGATATCACACATATCAGCAGGAGTAATAAATT TACTCACAGCACTTGTTTTCAGGACAACACTTCATTTTCAGGAAAT CTACTTCCTACAGAGCCAAAATGCCATTTAGCAATAAATAACACTT GTCAGCCTCAGAGCATTTAAGGAAACTAGACAAGTAAAATTATCCT CTTTGTAATTTAATGAAAAGGTACAACAGAATAATGCATGATGAAC TCACCTAATTATGAGGTGGGAGGAGCGAAATCTAAATTTCTTTTGC TATAGTTATACATCAATTTAAAAAGCAAAAAAAAAAAAGGGGGGGG CAATCTCTCTCTGTGTCTTTCTCTCTCTCTCTTCCTCTCCCTCTCTC TTTTCATTGTGTATCAGTTTCCATGAAAGACCTGAATACCACTTAC CTCAAATTAAGCATATGTGTTACTTCAAGTAATACGTTTTGACATAA GATGGTTGACCAAGGTGCTTTTCTTCGGCTTGAGTTCACCATCTCT TCATTCAAACTGCACTTTTAGCCAGAGATGCAATATATCCCCACTA CTCAATACTACCTCTGAATGTTACAACGAATTTACAGTCTAGTACTT ATTACATGCTGCTATACACAAGCAATGCAAGAAAAAAACTTACTGG GTAGGTGATTCTAATCATCTGCAGTTCTTTTTGTACACTTAATTACA GTTAAAGAAGCAATCTCCTTACTGTGTTTCAGCATGACTATGTATT TTTCTATGTTTTTTTAATTAAAAATTTTTAAAATACTTGTTTCAGCTT CTCTGCTAGATTTCTACATTAACTTGAAAATTTTTTAACCAAGTCGC TCCTAGGTTCTTAAGGATAATTTTCCTCAATCACACTACACATCAC ACAAGATTTGACTGTAATATTTAAATATTACCCTCCAAGTCTGTACC TCAAATGAATTCTTTAAGGAGATGGACTAATTGACTTGCAAAGACC TACCTCCAGACTTCAAAAGGAATGAACTTGTTACTTGCAGCATTCA TTTGTTTTTTCAATGTTTGAAATAGTTCAAACTGCAGCTAACCCTAG TCAAAACTATTTTTGTAAAAGACATTTGATAGAAAGGAACACGTTTT TACATACTTTTGCAAAATAAGTAAATAATAAATAAAATAAAAGCCAA CCTTCAAAGAAACTTGAAGCTTTGTAGGTGAGATGCAACAAGCCC TGCTTTTGCATAATGCAATCAAAAATATGTGTTTTTAAGATTAGTTG AATATAAGAAAATGCTTGACAAATATTTTCATGTATTTTACACAAAT GTGATTTTTGTAATATGTCTCAACCAGATTTATTTTAAACGCTTCTT ATGTAGAGTTTTTATGCCTTTCTCTCCTAGTGAGTGTGCTGACTTT TTAACATGGTATTATCAACTGGGCCAGGAGGTAGTTTCTCATGAC GGCTTTTGTCAGTATGGCTTTTAGTACTGAAGCCAAATGAAACTCA AAACCATCTCTCTTCCAGCTGCTTCAGGGAGGTAGTTTCAAAGGC CACATACCTCTCTGAGACTGGCAGATCGCTCACTGTTGTGAATCA CCAAAGGAGCTATGGAGAGAATTAAAACTCAACATTACTGTTAACT GTGCGTTAAATAAGCAAATAAACAGTGGCTCATAAAAATAAAAGTC GCATTCCATATCTTTGGATGGGCCTTTTAGAAACCTCATTGGCCAG CTCATAAAATGGAAGCAATTGCTCATGTTGGCCAAACATGGTGCA CCGAGTGATTTCCATCTCTGGTAAAGTTACACTTTTATTTCCTGTAT GTTGTACAATCAAAACACACTACTACCTCTTAAGTCCCAGTATACC TCATTTTTCATACTGAAAAAAAAAGCTTGTGGCCAATGGAACAGTA AGAACATCATAAAATTTTTATATATATAGTTTATTTTTGTGGGAGAT AAATTTTATAGGACTGTTCTTTGCTGTTGTTGGTCGCAGCTACATA AGACTGGACATTTAACTTTTCTACCATTTCTGCAAGTTAGGTATGTT TGCAGGAGAAAAGTATCAAGACGTTTAACTGCAGTTGACTTTCTCC CTGTTCCTTTGAGTGTCTTCTAACTTTATTCTTTGTTCTTTATGTAG AATTGCTGTCTATGATTGTACTTTGAATCGCTTGCTTGTTGAAAATA TTTCTCTAGTGTATTATCACTGTCTGTTCTGCACAATAAACATAACA GCCTCTGTGATCCCCATGTGTTTTGATTCCTGCTCTTTGTTACAGT

TCCATTAAATGAGTAATAAAGTTTGGTCAAAACAGAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:64 MECOM RefSeq NM_001105077.3 >NM_001105077.3 Homo sapiens locus complexo MDS1 e EVI1 (MECOM), variante de transcrição 1, mRNA

CCTTGCCAAGTAACAGCTTTGCTGTCCAACATCGTGTGCTGCTTC GCGAGAAAGTCACATTCGGACCCTTTGGCTAGATTGCTTATTCATA GGGCTTCTTGACTAAAGCCCTTGGAGCACTGGGTTTTTCTTGAAG TATATGATCTTAGACGAATTTTACAATGTGAAGTTCTGCATAGATG CCAGTCAACCAGATGTTGGAAGCTGGCTCAAGTACATTAGATTCG CTGGCTGTTATGATCAGCACAACCTTGTTGCATGCCAGATAAATGA TCAGATA TTCTATAGAGTAGTTGCAGACATTGCGCCGGGAGAGGAGCTTCTG CTGTTCATGAAGAGCGAAGACTATCCCCATGAAACTATGGCGCCG GATATCCACGAAGAACGGCAATATCGCTGCGAAGACTGTGACCAG CTCTTTGAATCTAAGGCTGAACTAGCAGATCACCAAAAGTTTCCAT GCAGTACTCCTCACTCAGCATTTTCAATGGTTGAAGAGGACTTTCA GCAAAAACTCGAAAGCGAGAATGATCTCCAAGAGATACACACGAT CCAGGAGTGTAAGGAATGTGACCAAGTTTTTCCTGATTTGCAAAG CCTGGAGAAACACATGCTGTCACATACTGAAGAGAGGGAATACAA GTGTGATCAGTGTCCCAAGGCATTTAACTGGAAGTCCAATTTAATT CGCCACCAGATGTCACATGACAGTGGAAAGCACTATGAATGTGAA AACTGTGCCAAGCAGGTTTTCACGGACCCTAGCAACCTTCAGCGG CACATTCGCTCTCAGCATGTCGGTGCCCGGGCCCATGCATGCCC GGAGTGTGGCAAAACGTTTGCCACTTCGTCGGGCCTCAAACAACA CAAGCACATCCACAGCAGTGTGAAGCCCTTTATCTGTGAGGTCTG CCATAAATCCTATACTCAGTTTTCAAACCTTTGCCGTCATAAGCGC ATGCATGCTGATTGCAGAACCCAAATCAAGTGCAAAGACTGTGGA CAAATGTTCAGCACTACGTCTTCCTTAAATAAACACAGGAGGTTTT GTGAGGGCAAGAACCATTTTGCGGCAGGTGGATTTTTTGGCCAAG GCATTTCACTTCCTGGAACCCCAGCTATGGATAAAACGTCCATGG TTAATATGAGTCATGCCAACCCGGGCCTTGCTGACTATTTTGGCG CCAATAGGCATCCTGCTGGTCTTACCTTTCCAACAGCTCCTGGATT TTCTTTTAGCTTCCCTGGTCTGTTTCCTTCCGGCTTGTACCACAGG CCTCCTTTGATACCTGCTAGTTCTCCTGTTAAAGGACTATCAAGTA CTGAACAGACAAACAAAAGTCAAAGTCCCCTCATGACACATCCTC AGATACTGCCAGCTACACAGGATATTTTGAAGG CACTATCTAAACACCCATCTGTAGGGGACAATAAGCCAGTGGAGC TCCAGCCCGAGAGGTCCTCTGAAGAGAGGCCCTTTGAGAAAATCA GTGACCAGTCAGAGAGTAGTGACCTTGATGATGTCAGTACACCAA GTGGCAGTGACCTGGAAACAACCTCGGGCTCTGATCTGGAAAGT GACATTGAAAGTGATAAAGAGAAATTTAAAGAAAATGGTAAAATGT TCAAAGACAAAGTAAGCCCTCTTCAGAATCTGGCTTCAATAAATAA TAAGAAAGAATACAGCAATCATTCCATTTTCTCACCATCTTTAGAG GAGCAGACTGCGGTGTCAGGAGCTGTGAATGATTCTATAAAGGCT ATTGCTTCTATTGCTGAAAAATACTTTGGTTCAACAGGACTGGTGG GGCTGCAAGACAAAAAAGTTGGAGCTTTACCTTACCCTTCCATGTT TCCCCTCCCATTTTTTCCAGCATTCTCTCAATCAATGTACCCATTTC CTGATAGAGACTTGAGATCGTTACCTTTGAAAATGGAACCCCAATC ACCAGGTGAAGTAAAGAAACTGCAGAAGGGCAGCTCTGAGTCCC CCTTTGATCTCACCACTAAGCGAAAGGATGAGAAGCCCTTGACTC CAGTCCCCTCCAAGCCTCCAGTGACACCTGCCACAAGCCAAGAC CAGCCCCTGGATCTAAGTATGGGCAGTAGGAGTAGAGCCAGTGG GACAAAGCTGACTGAGCCTCGAAAAAACCACGTGTTTGGGGGAAA AAAAGGAAGCAACGTCGAATCAAGACCTGCTTCAGATGGTTCCTT GCAGCATGCAAGACCCACTCCTTTCTTTATGGACCCTATTTACAGA GTAGAGAAAAGAAAACTAACTGACCCACTTGAAGCTTTAAAAGAGA AATACTTGAGGCCTTCTCCAGGATTCTTGTTTCACCCACAATTCCA ACTGCCTGATCAGAGAACTTGGATGTCAGCTATTGAAAACATGGC AGAAAAGCTAGAGAGCTTCAGTGCCCTGAAACCTGAGGCCAGTGA GCTCTTACAGTCAGTGCCCTCTATGTTCAACTTCAGGGCGCCTCC CAATGCCCTGCCAGAGAACCTTCTGCGGAAGGGAAAGGAGCGCT ATACCTGCAGATACTGTGGCAAGATTTTTCCAAGGTCTGCAAACCT AACACGGCACTTGAGAACCCACACAGGAGAGCAGCCTTACAGAT GCAAATACTGTGACAGATCATTTAGCATATCTTCTAACTTGCAAAG GCATGTTCGCAACATCCACAATAAAGAGAAGCCATTTAAGTGTCAC TTATGTGATAGGTGTTTTGGTCAACAAACCAATTTAGACAGACACC TAAAGAAACATGAGAATGGGAACATGTCCGGTACAGCAACATCGT CGCCTCATTCTGAACTGGAAAGTACAGGTGCGATTCTGGATGACA AAGAAGATGCTTACTTCACAGAAATTCGAAATTTCATTGGGAACAG CAACCATGGCAGCCAATCTCCCAGGAATGTGGAGGAGAGAATGA ATGGCAGTCATTTTAAAGATGAAAAGGCTTTGGTGACCAGTCAAAA TTCAGACTTGCTGGATGATGAAGAAGTTGAAGATGAGGTGTTGTT AGATGAGGAGGATGAAGACAATGATATTACTGGAAAAACAGGAAA GGAACCAGTGACAAGTAATTTACATGAAGGAAACCCTGAGGATGA CTATGAAGAAACCAGTGCCCTGGAGATGAGTTGCAAGACATCCCC AGTGAGGTATAAAGAGGAAGAATATAAAAGTGGACTTTCTGCTCTA GATCATATAAGGCACTTCACAGATAGCCTCAAAATGAGGAAAATG GAAGATAATCAATATTCTGAAGCTGAGCTGTCTT CTTTTAGTACTTCCCATGTGCCAGAGGAACTTAAGCAGCCGTTACA CAGAAAGTCCAAATCGCAGGCATATGCTATGATGCTGTCACTGTC TGACAAGGAGTCCCTCCATTCTACATCCCACAGTTCTTCCAACGT GTGGCACAGTATGGCCAGGGCTGCGGCGGAATCCAGTGCTATCC AGTCCATAAGCCACGTATGACGTTATCAAGGTTGACCAGAGTGGG ACCAAGTCCAACAGTAGCATGGCTCTTTCATATAGGACTATTTACA AGACTGCTG AGCAGAATGCCTTATAAACCTGCAGGGTCACTCATCTAAAGTCTA GTGACCTTAAACTGAATGATTTAAAAAAGAAAAGAAAGAAAAAAGA AACTATTTATTCTCGATATTTTGTTTTGCACAGCAAAGGCAGCTGC TGACTTCTGGAAGATCAATCAATGCGACTTAAAGTGATTCAGTGAA AACAAAAAACTTGGTGGGCTGAAGGCATCTTCCAGTTTACCCCAC CTTAGGGTATGGGTGGGTGAGAAGGGCAGTTGAGATGGCAGCAT TGATATGAATGAACACTCCATAGAAACTGAATTCTCTTTTGTACAA GATCACCTGACATGATTGGGAACAGTTGCTTTTAATTACAGATTTA ATTTTTTTCTTCGTTAAAGTTTTATGTAATTTAACCCTTTGAAGACA GAAGTAGTTGGATGAAATGCACAGTCAATTATTATAGAAACTGATA ACAGGGAGTACTTGTTCCCCCTTTTGCCTTCTTAAGTACATTGTTT AAAACTAGGGAAAAAGGGTATGTGTATATTGTAAACTATGGATGTT AACACTCAAAG AGGTTAAGTCAGTGAAGTAACCTATTCATCACCAGTACCGCTGTAC CACTAATAAATTGTTTGCCAAATCCTTGTAATAACATCTTAATTTTA GACAATCATGTCACTGTTTTTAATGTTTATTTTTTTGTGTGTGTTGC GTGTATCATGTATTTATTTGTTGGCAAACTATTGTTTGTTGATTAAA ATAGCACTGTTCCAGTCAGCCACTACTTTATGACGTCTGAGGCAC ACCCCTTTCCGAATTTCAAGGACCAAGGTGACCCGACCTGTGTAT GAGAGTGCCAAATGGTGTTTGGCTTTTCTTAACATTCCTTTTTGTTT GTTTGTTTTGTTTTCCTTCTTAATGAACTAAATACGAATAGATGCAA CTTAGTTTTTGTAATACTGAAATCGATTCAATTGTATAAACGATTAT AATTTCTTTCATGGAAGCATGATTCTTCTGATTAAAAACTGTACTCC ATATTTTATGCTGGTTGTCTGCAAGCTTGTGCGATGTTATGTTCAT GTTAATCCTATTTGTAAAATGAAGTGTTCCCAACCTTATGTTAAAAG AGAGAAGTAAATAACAGACTGTATTCAGTTATTTTGCCCTTTATTGA GGAACCAGATTTGTTTTCTTTTTGTTTGTAATCTCATTTTGAAATAA TCAGCAAGTTGAGGTACTTTCTTCAAATGCTTTGTACAATATAAACT GTTATGCCTTTCAGTGCATTACTATGGGAGGAGCAACTAAAAAATA

AAGACTTACAAAAAGGAGTATTTTT SEQ ID NO: 65 construção sintética

ACCCGGGCAATCTTATATATCTACTGTTCTCTAAA SEQ ID NO: 66 Isoforma A HMGI-C de proteína de grupo de alta mobilidade >NP_003474.1 [Homo sapiens]

MSARGEGAGQPSTSAQGQPAAPAPQKRGRGRPRKQQQEPTGEPS PKRPRGRPKGSKNKSPSKAAQKKAEATGEKRPRGRPRKWPQQVVQ

KKPAQEETEETSSQESAEED SEQ ID NO: 67 Isoforma a de proteína de locus complexo de >NP_001098547.3 MDS1 e EVI1 [Homo sapiens]

MILDEFYNVKFCIDASQPDVGSWLKYIRFAGCYDQHNLVACQINDQIF YRVVADIAPGEELLLFMKSEDYPHETMAPDIHEERQYRCEDCDQLFE SKAELADHQKFPCSTPHSAFSMVEEDFQQKLESENDLQEIHTIQECK ECDQVFPDLQSLEKHMLSHTEEREYKCDQCPKAFNWKSNLIRHQMS HDSGKHYECENCAKQVFTDPSNLQRHIRSQHVGARAHACPECGKTF ATSSGLKQHKHIHSSVKPFICEVCHKSYTQFSNLCRHKRMHADCRTQ IKCKDCGQMFSTTSSLNKHRRFCEGKNHFAAGGFFGQGISLPGTPA MDKTSMVNMSHANPGLADYFGANRHPAGLTFPTAPGFSFSFPGLFP SGLYHRPPLIPASSPVKGLSSTEQTNKSQSPLMTHPQILPATQDILKA LSKHPSVGDNKPVELQPERSSEERPFEKISDQSESSDLDDVSTPSGS DLETTSGSDLESDIESDKEKFKENGKMFKDKVSPLQNLASINNKKEYS NHSIFSPSLEEQTAVSGAVNDSIKAIASIAEKYFGSTGLVGLQDKKVG ALPYPSMFPLPFFPAFSQSMYPFPDRDLRSLPLKMEPQSPGEVKKLQ KGSSESPFDLTTKRKDEKPLTPVPSKPPVTPATSQDQPLDLSMGSRS RASGTKLTEPRKNHVFGGKKGSNVESRPASDGSLQHARPTPFFMDP IYRVEKRKLTDPLEALKEKYLRPSPGFLFHPQFQLPDQRTWMSAIEN MAEKLESFSALKPEASELLQSVPSMFNFRAPPNALPENLLRKGKERY TCRYCGKIFPRSANLTRHLRTHTGEQPYRCKYCDRSFSISSNLQRHV RNIHNKEKPFKCHLCDRCFGQQTNLDRHLKKHENGNMSGTATSSPH SELESTGAILDDKEDAYFTEIRNFIGNSNHGSQSPRNVEERMNGSHF KDEKALVTSQNSDLLDDEEVEDEVLLDEEDEDNDITGKTGKEPVTSN LHEGNPEDDYEETSALEMSCKTSPVRYKEEEYKSGLSALDHIRHFTD SLKMRKMEDNQYSEAELSSFSTSHVPEELKQPLHRKSKSQAYAMML SLSDKESLHSTSHSSSNVWHSMARAAAESSAIQSISHV INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00442] Toda a descrição de cada um dos documentos de patente e artigos científicos referidos aqui é incorporada por referência para todos os propósitos.

EQUIVALENTES

[00443] A invenção pode ser apresentada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou características essenciais dos mesmos. As seguintes modalidades devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos. As modalidades a seguir devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos ilustrativas em vez de limitantes da invenção aqui descrita. Vários elementos estruturais das diferentes modalidades e várias etapas do método descrito podem ser utilizados em várias combinações e permutações, e todas as tais variantes devem ser consideradas formas da invenção. O escopo da invenção é desse modo indicado pelas reivindicações anexas, em vez de pela descrição anterior, e todas as mudanças que se incluem no significado e faixa de equivalência das reivindicações pretende-se que sejam abrangidas aqui.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) em um paciente, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar um agente anti-TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook 2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) relativa a um nível de controle conhecido, e desse modo tratando TNBC no paciente.

2. Método de obter pelo menos uma resposta parcial tratando ou aumentanto a sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC), o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar um agente anti-TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook 2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) relativa a um nível de controle conhecido, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial ao tratamento de TNBC no paciente.

3. Método de identificação de um paciente adequado para o tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) no paciente com um agente anti-TGFβ, o método caracterizado pelo fato de que compreende determinar o nível de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) no paciente, em que um nível aumentado de expressão de HMGA2 no paciente, relativa a um nível de controle conhecido, identifica o paciente como adequado para o tratamento de TNBC com o referido agente anti-TGFβ.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o nível de HMGA2 do paciente é determinado por análise de uma amostra de tecido do paciente.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é uma amostra de biópsia, amostra de sangue, soro, ou plasma.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5,

caracterizado pelo fato de que o nível de HMGA2 é determinado por imunoquímica ou por análise de expressão de RNA.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o agente anti-TGFβ é uma proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ que compreende um primeiro polipeptídeo compreendendo: (a) pelo menos uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga à proteína humana Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1); e (b) Receptor II de Fator β de Crescimento Transformante (TGFβRII), ou um fragmento do mesmo, capaz de ligar o Fator β de Crescimento Transformante (TGFβ), e um segundo polipeptídeo compreendendo pelo menos uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-L1; em que a cadeia pesada do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve do segundo polipeptídeo, quando combinadas, formam um sítio de ligação a antígeno que se liga à PD-L1.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e o segundo polipeptídeo compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e

40.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que ao paciente são administrados pelo menos 1200 mg da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que ao paciente são administrados pelo menos 1800 mg da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que ao paciente são administrados 1800 mg a 3000 mg da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que ao paciente são administrados 1800 mg a 2100 mg da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que ao paciente são administrados 1200 mg da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que ao paciente são administrados 1200 mg da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ uma vez a cada duas semanas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que ao paciente são administrados 2400 mg da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que ao paciente são administrados 2400 mg da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ uma vez a cada três semanas.

18. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que ao paciente são administrados 2100 mg ou 3000 mg da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ uma vez a cada três semanas.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 foi determinada por meio de quantificação de expressão de mRNA de HMGA2.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a quantificação de expressão de mRNA de HMGA2 é por meio de PCR.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de

HMGA2 é pelo menos 2,27 vezes maior do que uma expressão média da população conhecida de HMGA2 entre os pacientes de TNBC.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 5 vezes maior do que uma expressão média da população conhecida de HMGA2 entre os pacientes de TNBC.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais do que o nível normal de expressão de HMGA2.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 no paciente é pelo menos 19 a 35 vezes maior do que a expressão de HMGA2 em um paciente que não é responsivo a um tratamento com o agente anti-TGFβ.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 foi determinada pelo nível de expressão da proteína HMGA2.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2 foi determinado por meio da imunoistoquímica.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que mais do que 1% células de tumor expressando a proteina HMGA2 em uma amostra de tecido obtida do paciente de TNBC determinou o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2.

28. Agente Trap anti-TGFβ no método de tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) em um paciente, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar um agente anti-TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook 2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) relativa a um nível de controle conhecido, e desse modo tratando TNBC no paciente.

29. Agente Trap anti-TGFβ no método de obter pelo menos uma resposta parcial tratando ou aumentanto a sobrevivência de um paciente de câncer de mama triplo negativo (TNBC), o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar um agente anti- TGFβ a um paciente que foi determinado ter um nível aumentado de expressão de AT-hook 2 de grupo de alta mobilidade (HMGA2) relativa a um nível de controle conhecido, desse modo obtendo pelo menos uma resposta parcial ao tratamento de TNBC no paciente.

30. Agente Trap anti-TGFβ em um método de identificação de um paciente adequado para tratamento ou controle de câncer de mama triplo negativo (TNBC) no paciente com um agente anti-TGFβ, o método caracterizado pelo fato de que compreende determinar o nível de AT-hook2 do grupo de alta mobilidade (HMGA2) no paciente, em que um nível aumentado de expressão de HMGA2 no paciente, relativa a um nível de controle conhecido, identifica o paciente como adequado para o tratamento de TNBC com o referido agente anti-TGFβ.

31. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que o nível de HMGA2 do paciente é determinado por análise de uma amostra de tecido do paciente.

32. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é uma amostra de biópsia, amostra de sangue, soro, ou plasma.

33. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o nível de HMGA2 é determinado por imunoquímica ou por análise de expressão de RNA.

34. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 33, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 foi determinada por meio de quantificação de expressão de mRNA de HMGA2.

35. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a quantificação de expressão de mRNA de HMGA2 é por meio de PCR.

36. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 35, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 2,27 vezes maior do que uma expressão média da população conhecida de HMGA2 entre os pacientes de TNBC.

37. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 5 vezes maior do que uma expressão média da população conhecida de HMGA2 entre os pacientes de TNBC.

38. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 35, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 é pelo menos 200% maior, pelo menos 300% maior, pelo menos 400% maior, pelo menos 500% maior, pelo menos 600% maior, pelo menos 700% maior, pelo menos 800% maior, pelo menos 900% maior, pelo menos 1000% maior, ou mais do que o nível normal de expressão de HMGA2.

39. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 35, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 no paciente é pelo menos 19 a 35 vezes maior do que a expressão de HMGA2 em um paciente que não é responsivo a um tratamento com o agente anti-TGFβ.

40. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 33, caracterizado pelo fato de que a expressão aumentada de HMGA2 foi determinada pelo nível de expressão da proteína HMGA2.

41. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2 foi determinado por meio da imunoistoquímica.

42. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que mais do que 1% de células de tumor expressando a proteina HMGA2 em uma amostra de tecido obtida do paciente de TNBC determinou o nível aumentado de expressão da proteína HMGA2.

43. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 42, caracterizado pelo fato de que o agente anti- TGFβ é uma proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo: (a) pelo menos uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga à proteína humana Ligante 1 de Morte Programada (PD-L1); e (b) Receptor II de Fator β de Crescimento Transformante (TGFβRII), ou um fragmento do mesmo, capaz de ligar Fator β de Crescimento Transformante (TGFβ), e um segundo polipeptídeo compreendendo pelo menos uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-L1; em que a cadeia pesada do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve do segundo polipeptídeo, quando combinadas, formam um sítio de ligação ao antígeno que se liga à PD-L1.

44. Agente Trap anti-TGFβ para uso, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 35, 36, e 37, e o segundo polipeptídeo compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 38, 39, e 40.

45. Agente Trap anti-TGFβ para uso, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, e o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

46. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado pelo fato de que a dose da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ é de 1200 mg a 3000 mg.

47. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a dose da proteína Trap anti-PD- L1/TGFβ é de 1200 mg.

48. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a dose da proteína Trap anti-PD- L1/TGFβ é de 1200 mg, administrada uma vez a cada duas semanas.

49. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizado pelo fato de que a dose da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ é de 2100 mg a 2400 mg.

50. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ é administrada uma vez a cada três semanas.

51. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a dose da proteína Trap anti-PD- L1/TGFβ é de 2100 mg, administrados uma vez a cada três semanas.

52. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a dose da proteína Trap anti-PD- L1/TGFβ é de 2400 mg, administrados uma vez a cada três semanas.

53. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizado pelo fato de que a dose da proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ é de 3000 mg, administrados uma vez a cada três semanas.

54. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 53, caracterizado pelo fato de que a proteína Trap anti-PD-L1/TGFβ é administrada por administração intravenosa.

55. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a administração intravenosa é realizada com uma bolsa pré-carregada, uma caneta pré-carregada, ou uma seringa pré-carregada compreendendo uma formulação compreendendo a proteína.

56. Agente Trap anti-TGFβ, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a bolsa é conectada a um canal compreendendo um tubo e/ou uma agulha.