KR20210046716A - 표적화된 TGF-β 억제에 의한 삼중 음성 유방암의 치료 - Google Patents

표적화된 TGF-β 억제에 의한 삼중 음성 유방암의 치료 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 항-TGFβ 작용제를 사용한 표적화된 TGF-β 억제를 통한 치료에 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하고, 상기 대상체를 항-TGFβ 작용제를 사용하여 치료하는 것을 수반하는, 삼중 음성 유방암 (TNBC)으로 진단된 환자를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

표적화된 TGF-β 억제에 의한 삼중 음성 유방암의 치료
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 22일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/721,249의 이익 및 우선권을 주장하며, 그의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2019년 6월 27일에 생성된 상기 ASCII 카피는 EMD-009WO_SL_ST25.txt로 명명되고 그 크기가 99,098 바이트이다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 일반적으로 항-TGFβ 작용제를 사용한 표적화된 TGF-β 억제를 통한 치료에 반응할 가능성이 있는 대상체를 확인하고, 항-TGFβ 작용제를 사용하여 상기 대상체를 치료하는 것을 수반하는, 삼중 음성 유방암 (TNBC)으로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
TNBC는 통상적으로 에스트로겐 수용체 (ER) 및 프로게스테론 수용체 (PR)를 전혀 발현하지 않고 호르몬 표피 성장 인자 수용체 2 (HER-2)를 과다발현하지 않는 종양에 대한 면역조직화학을 통해 진단되는 유방암 종양의 이종 군이다. TNBC는 불량한 예후와 연관된 공격적인 유형의 암이다. 이 종양 세포는 필요한 수용체가 결여되어 있기 때문에, 통상적인 치료, 예컨대 호르몬 요법 및 에스트로겐, 프로게스테론 및 HER-2를 표적화하는 약물은 효과가 없다. 독소루비신은 국부 진행성 및 재발성 또는 전이성 TNBC를 포함한, 악성종양의 숙주의 치료에 사용되는 표준 관리 DNA-손상 작용제이고; 독소루비신에 대한 반응은 다른 유형의 유방암과 비교하여 좋지 않다.
TNBC에 대한 요법을 개선시키기 위한 최근의 노력은, 유전자 발현 프로파일에 기초하여 4 (Lehmann, J. Clin. Invest. (2011) 121:2750-2767) 또는 6 (Burstein, Clin. Canc. Res. (2014) 21:1688-1698) 하위유형: BL1 (기저-유사 1), BL2 (기저-유사 2), LAR (내강 안드로겐 수용체), M (중간엽), IM (면역-조정) 및 MSL (중간엽-줄기 유사)에 따라 TNBC 종양 유형을 분류하는 것에 초점을 맞췄다. 하나의 유망한 접근법은 TNBC 환자의 10-20%를 구성하는 환자 군인 BRCA1/2 돌연변이를 갖는 환자에서 PARP 억제제를 사용하는 것이다. 환자의 이러한 하위군은 다른 요법, 예컨대 CDK 억제제 및 탁산이 또한 제안된 BL1 하위유형에 속한다. BL2 하위유형 (TNBC의 22%)은 성장 인자 신호전달에 대해 풍부화된 유전자를 포함하며, 이는 성장 인자 억제제 (키나제 억제제 포함)가 이러한 군에 대한 잠재적 요법임을 시사한다. LAR 하위유형은, 그의 명칭이 암시하는 바와 같이, 안드로겐 수용체 유전자를 함유하고, 따라서, 항안드로겐은 이러한 군에서의 잠재적 요법이다. 중간엽 경로를 표적화하는 약물, 예컨대 c-Met 억제제, TGFβ 억제제 및 Wnt 억제제가 M 하위유형에 대한 잠재적 요법으로서 제안되었다. 마지막으로, 체크포인트 억제제 (CPI)는 면역 과정에 수반되는 유전자에 대해 풍부화된 IM 군에 대한 우수한 선택일 수 있다. 많은 표적화된 치료제가, 대부분의 경우 비선별된 TNBC 환자에서 임상 시험을 받고 있다.
그러나, 지금까지 TNBC에 대한 정밀 의료의 적용은 쌍형성된 바이오마커 및 연관된 표적화 요법의 결여에 의해 제한되었다. TNBC 하위유형이 문헌에 기재되어 있지만, 전향적 바이오마커-유도 임상 시험은 이러한 질환에서 여전히 드물다. 특정 치료에 대해 감수성을 나타내는 환자 하위군의 확인은 바이오마커-음성 환자에 대한 불필요한 치료 (및 그의 잠재적 부작용)를 피하면서 바이오마커-양성 환자에 대한 보다 효과적인 치료를 달성할 수 있다. 이러한 표적화된 요법은 TNBC 환자에 대한 요법 선택을 개선시킬 수 있다. 본 개시내용은 TGFβ 차단제 및/또는 CPI에 대한 반응과 연관된 바이오마커를 확인한다. 바이오마커 양성 환자는 바이오마커 음성 환자보다 상기 요법에 반응할 가능성이 더 큰 것으로 예측된다.
본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 출원 공개 번호 US 20150225483 A1은 항-프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1) 항체와 TGFβ 중화 "트랩"으로서의 종양 성장 인자 베타 수용체 유형 II (TGFβRII)의 가용성 세포외 도메인을 단일 분자로 조합한 이중기능적 융합 단백질을 기재한다. 구체적으로, 상기 단백질은 인간 TGFβRII의 세포외 도메인에 가요성 글리신-세린 링커를 통해 유전자 융합된, 항-PD-L1의 2개의 이뮤노글로불린 경쇄 및 항-PD-L1의 중쇄를 포함하는 2개의 중쇄로 이루어진 이종사량체이다 (도 1 참조). 이러한 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자는 종양 미세환경에서 2가지의 주요 면역억제 메카니즘을 표적화하도록 설계된다. 미국 특허 출원 공개 번호 US 20150225483 A1은 환자의 체중을 기준으로 한 용량으로의 트랩 분자의 투여를 기재한다.
본 개시내용은 TNBC로 진단된 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 먼저, 공지된 대조군 발현 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 및/또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 단백질 EVI1 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정되었고, 이어서, 대상체에게 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 투여한다.
개시내용의 요약
TNBC로 진단된 환자의 효과적인 치료를 위해, 본 개시내용은 공지된 발현 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에서 TNBC를 치료하고, TNBC 환자의 질환 예후 및 전체 생존을 개선시키는 치료 레지멘을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 대상체에서 TNBC를 치료함으로써, 대상체에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 삼중 음성 유방암 (TNBC) 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성함으로써, 삼중 음성 유방암 (TNBC) 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 대상체에서의 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준은 상기 대상체를 항-TGFβ 작용제를 사용한 TNBC의 치료에 적합한 것으로서 확인하는 것인, 항-TGFβ 작용제를 사용하여 대상체의 TNBC를 치료 또는 관리하는 데 적합한 대상체를 확인하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 2단계 방법을 제공하며, 여기서 제1 단계는 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 대상체를 확인하는 것을 수반하고, 제2 단계는 증가된 HMGA2 또는 MECOM 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이로 인해 대상체에서 TNBC를 치료하는 것을 수반한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 삼중 음성 유방암 (TNBC) 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 2단계 방법을 제공하며, 여기서 제1 단계는 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 대상체를 확인하는 것을 수반하고, 제2 단계는 증가된 HMGA2 또는 MECOM 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 삼중 음성 유방암 (TNBC) 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 것을 수반한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서의 HMGA2 또는 MECOM의 수준이 결정되고, 여기서 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 대상체에서의 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준은 상기 대상체를 항-TGFβ 작용제를 사용한 TNBC의 치료에 적합한 것으로서 확인하는 것인, 항-TGFβ 작용제를 사용한 대상체의 TNBC의 치료에 대해 반응성인 대상체를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 각각의 방법에서, 대상체의 HMGA2 또는 MECOM 수준은 환자로부터의 조직 샘플을 분석함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, 조직 샘플은 생검 샘플, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다.
본 발명의 각각의 방법에서, HMGA2 또는 MECOM의 수준은 면역화학에 의해 또는 RNA 발현 분석에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 항-TGFβ 작용제는 (a) 적어도 인간 단백질 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 영역; 및 (b) 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)에 결합할 수 있는 인간 형질전환 성장 인자 β 수용체 II (TGFβRII) 또는 그의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 적어도 PD-L1에 결합하는 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, TNBC 환자의 치료에 유용한 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이고; 여기서 제1 폴리펩티드의 중쇄 및 제2 폴리펩티드의 경쇄는, 조합될 때, PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질은 서열식별번호(SEQ ID NO) 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 적어도 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 적어도 1800 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1800 mg 내지 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1200 mg 내지 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 2주마다 1회 투여된다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1800 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여된다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 2100 mg 또는 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 발현은 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균보다 적어도 2.0-배, 예를 들어, 2.27-배 더 크다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 발현은 HMGA2 발현의 공지된 집단 평균 수준보다 적어도 2-5-배 더 크다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 발현은 정상 HMGA2 발현 수준보다 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 대상체에서의 증가된 HMGA2 발현은 항-TGFβ 작용제를 사용한 치료에 대해 비반응성인 대상체에서의 HMGA2 발현보다 적어도 19- 내지 35-배 더 크다. 일부 실시양태에서, 하우스-키핑 유전자 또는 유전자들에 대해 정규화된 HMGA2 mRNA 전사체를 정량화함으로써 HMGA2 유전자의 발현 수준이 측정된다. HMGA2 mRNA 전사체 및 하우스키핑 유전자 또는 유전자들은 RNA 정량적 방법, 예컨대 정량적 역전사 PCR에 의해 정량화된다. 하우스키핑 유전자 또는 유전자들은 표적 집단 중에서 비교적 일정한 발현을 갖는 것들이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 MECOM 발현은 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균보다 적어도 1.5-배 더 크다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 MECOM 발현은 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균보다 적어도 1.5 내지 4-배 더 크다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 MECOM 발현은 정상 MECOM 발현 수준보다 적어도 100%, 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과이다.
mRNA의 결정은 종양 조직 또는 순환 종양 세포 또는 순환 종양 mRNA로부터 이루어질 수 있다. mRNA는 HMGA2 또는 MECOM 유전자의 높은 발현을 검출하는 데 사용될 것이다. 높은 발현은 PCR 또는 mRNA 발현을 정량화하는 다른 기술에 의해 특정 참조 수준 초과의 수준을 발현하는 종양 세포로서 간주될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현은 각각 HMGA2 및 MECOM mRNA의 정량화를 통해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, HMGA2 mRNA 또는 MECOM mRNA 수준은 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-qPCR) 검정을 통해 결정된다. 특정 실시양태에서, HMGA2 mRNA 또는 MECOM mRNA 수준은 디지털 액적 PCR (ddPCR)을 통해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현은 각각 HMGA2 및 MECOM 단백질의 정량화를 통해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 단백질 또는 MECOM 단백질 수준은 면역조직화학을 통해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, TNBC 대상체로부터 수득된 조직 샘플에서 1% 초과 (예를 들어, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과 또는 20% 초과)의 HMGA2 단백질 발현 종양 세포로 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준을 결정하였다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, TNBC 대상체로부터 수득된 조직 샘플에서 1% 초과 (예를 들어, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과 또는 20% 초과)의 MECOM 단백질 발현 종양 세포로 증가된 MECOM 단백질 발현 수준을 결정하였다.
본 개시내용의 다른 실시양태 및 세부사항이 본원 하기에 제시된다.
도 1은 (Gly4Ser)4Gly (서열식별번호: 11) 링커를 통해 TGFβ 수용체 II의 2개의 세포외 도메인 (ECD)에 융합된 1개의 항-PD-L1 항체를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자의 개략적 도면이다.
도 2a는 실시예 1에 기재된 연구로부터의 HMGA2에 대한 결과를 보여주는 박스 플롯이다. HMGA2 발현 수준을 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질에 대한 반응에 대해 플롯팅한다. TPM = 백만개당 전사체; PD = 진행성 질환; SD = 안정 질환; PR = 부분 반응. 높은 HMGA2 발현은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자 중에서 적어도 최저 HMGA2 발현만큼의 높은 발현 수준으로 간주된다.
도 2b는 TCGA 데이터베이스에서 유방암에서의 HMGA2 발현 분포의 히스토그램이다. TPM = 백만개당 전사체; NE = 평가가능하지 않음. NE 데이터는 가설 시험으로부터 배제하였다.
도 3a는 TCGA 데이터베이스에서 유방암에서의 MECOM 발현 분포의 히스토그램이다. TPM = 백만개당 전사체; NE = 평가가능하지 않음. 높은 MECOM 발현은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자 중에서 적어도 최저 MECOM 발현만큼의 높은 발현 수준으로 간주된다.
도 3b는 실시예 1에 기재된 연구로부터의 MECOM에 대한 결과를 보여주는 박스 플롯이다. MECOM 발현 수준은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질에 대한 반응에 대해 플롯팅된다. TPM = 백만개당 전사체; PD = 진행성 질환; SD = 안정 질환; PR = 부분 반응. 높은 MECOM 발현은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자 중에서 적어도 최저 MECOM 발현만큼의 높은 발현 수준으로 간주된다.
도 4a-d는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 여러 잠재적 예측 바이오마커의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다. 도 4a는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 HMGA2의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다. 도 4b는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 MECOM의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다. 도 4c는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 CLEC3A의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다. 도 4d는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 CCNDBP1의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다. (도면에서 사용된 약어: NE (평가가능하지 않음), PD = 진행성 질환; SD = 안정 질환; PR = 부분 반응).
도 5a-f는 HMGA2와 선택된 TGF-β 신호전달 코어 유전자 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5a는 HMGA2 발현과 Tgfbr1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5b는 HMGA2 발현과 Tgfbr2 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5c는 HMGA2 발현과 Smad3 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5d는 HMGA2 발현과 Tgfb1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5e는 HMGA2 발현과 Tgfb2 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5f는 HMGA2 발현과 Tgfb3 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다.
도 6a-f는 HMGA2와 선택된 TGF-β 신호전달 표적 유전자 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6a는 HMGA2 발현과 Col1a1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6b는 HMGA2 발현과 Col1a2 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6c는 HMGA2 발현과 Fn1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6d는 HMGA2 발현과 Vim 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6e는 HMGA2 발현과 Vegfa 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6f는 HMGA2 발현과 Zeb1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다.
도 7a는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfbr1의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 7b는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfbr2의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 7c는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Smad3의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 7d는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfb1의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 7e는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfb2의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 7f는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfb3의 발현을 보여주는 플롯이다.
도 8a는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 HMGA2의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 8b는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Col1a1의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 8c는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Col1a2의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 8d는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Fn1의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 8e는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Vim의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 8f는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Vegfa의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 8g는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Zeb1의 발현을 보여주는 플롯이다.
도 9a는 HMGA2 발현과 Ifng 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 9b는 HMGA2 발현과 Gzmb 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 9c는 HMGA2 발현과 Gzmk 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 9d는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물에서의 Ifng의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 9e는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물에서의 Gzmb의 발현을 보여주는 플롯이다. 도 9f는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물에서의 Gzmk의 발현을 보여주는 플롯이다.
도 10은 대상체의 HMGA2의 발현 (로그-TPM (백만개당 전사체)) 및 TNBC 상태를 보여주는 박스 플롯이다.
도 11은 비-TNBC (좌측) 및 TNBC (우측) 대상체에 대한 별개의 패널에서의 HMGA2 발현 (TPM) 대 반응을 보여준다. [도면에서 사용된 약어: NE: 평가가능하지 않음; PD: 진행성 질환; SD: 안정 질환; PR: 부분 반응; CR: 완전 반응; METBRC: 전이성 유방암; TPM: HMGA2 유전자에 대한 백만개당 전사체].
상세한 설명
"TGFβRII" 또는 "TGFβ 수용체 II"는 야생형 인간 TGFβ 수용체 유형 2 이소형 A 서열 (예를 들어, NCBI 참조 서열 (RefSeq) 수탁 번호 NP_001020018의 아미노산 서열 (서열식별번호: 8))을 갖는 폴리펩티드, 또는 야생형 인간 TGFβ 수용체 유형 2 이소형 B 서열 (예를 들어, NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_003233의 아미노산 서열 (서열식별번호: 9))을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. TGFβRII는 야생형 서열의 TGFβ-결합 활성의 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 35%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99%를 보유할 수 있다. 발현된 TGFβRII의 폴리펩티드는 신호 서열이 결여되어 있다.
"TGFβ에 결합할 수 있는 TGFβRII의 단편"은 야생형 수용체 또는 상응하는 야생형 단편의 TGFβ-결합 활성의 적어도 일부 (예를 들어, 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 35%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99%)를 보유하는, 적어도 20개 (예를 들어, 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 175 또는 200개)의 아미노산 길이의 NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_001020018 (서열식별번호: 8) 또는 NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_003233 (서열식별번호: 9), 또는 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 9와 실질적으로 동일한 서열의 임의의 부분을 의미한다. 전형적으로, 이러한 단편은 가용성 단편이다. 예시적인 이러한 단편은 서열식별번호: 10의 서열을 갖는 TGFβRII 세포외 도메인이다.
"PD-L1-높은" 또는 "높은 PD-L1"은 PD-L1 IHC 73-10 검정 (다코(Dako))에 의해 결정된 ≥ 80%의 PD-L1 양성 종양 세포, 또는 다코 IHC 22C3 PharmDx 검정에 의해 결정된 ≥ 50%의 종양 비율 스코어 (TPS) (TPS는 부분적이거나 완전한 막 염색 (예를 들어, PD-L1에 대한 염색)으로 생존 종양 세포의 백분율을 설명하는 IHC 22C3 PharmDx 검정과 관련된 기술분야의 용어임)를 지칭한다. IHC 73-10 및 IHC 22C3 검정은 둘 다 이들의 각각의 컷오프에서 유사한 환자 집단을 선택한다. 특정 실시양태에서, 22C3 PharmDx 검정과 높은 일치도를 갖는 벤타나(VENTANA) PD-L1 (SP263) 검정 (문헌 [Sughayer et al., Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol., (2018)] 참조)이 또한 PD-L1-높은 발현 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
"PD-L1 양성" 또는 "PD-L1+"는 예를 들어, 다코 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 검정에 의해 결정된 ≥ 1% PD-L1 양성 종양 세포의 TPS를 나타낸다.
"실질적으로 동일한"은 참조 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 75%, 또는 80%, 보다 바람직하게는 85%, 90%, 또는 95%, 가장 바람직하게는 99%의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 비교 서열의 길이는 일반적으로 적어도 10개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 15개의 인접 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 20, 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300 또는 350개의 인접 아미노산, 가장 바람직하게는 전장 아미노산 서열일 것이다.
"환자"는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 포유동물)을 의미한다. "환자", "대상체", "그를 필요로 하는 환자" 및 "그를 필요로 하는 대상체"는 본 개시내용에서 상호교환가능하게 사용되며, 본 개시내용에서 제공된 방법 및 조성물을 사용한 투여에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 상태를 앓고 있거나 또는 이에 걸리기 쉬운 살아있는 유기체를 지칭한다.
본 개시내용에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료", 및 다른 문법적 등가물은 질환, 상태 또는 증상의 완화, 약화, 호전, 또는 방지, 추가의 증상의 방지, 증상의 기저 대사 원인의 호전 또는 방지, 질환 또는 상태의 억제, 예를 들어, 질환 또는 상태의 발생 정지, 질환 또는 상태의 경감, 질환 또는 상태의 퇴행 유발, 질환 또는 상태에 의해 유발된 상태의 경감, 또는 질환 또는 상태의 증상의 중단을 포함하며, 예방을 포함하도록 의도된다. 상기 용어는 치료적 이익 및/또는 예방적 이익을 달성하는 것을 추가로 포함한다. 치료적 이익은 치료될 기저 장애의 근절 또는 호전을 의미한다. 또한, 치료적 이익은, 환자가 여전히 기저 장애를 앓을 수도 있지만, 기저 장애와 연관된 생리학적 증상 중 1종 이상의 근절 또는 호전에 의해 환자에서 개선이 관찰되는 것으로 달성된다.
본 개시내용의 치료 레지멘과 관련하여 용어 "강화"는 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 바와 같이 사용된다. 예를 들어, 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에 따르면, 용어 "강화 요법"은 하기와 같다: "초기 요법 후 암이 사라진 뒤에 제공되는 치료. 강화 요법은 체내에 남아 있을 수 있는 임의의 암 세포를 사멸시키기 위해 사용된다. 이는 방사선 요법, 줄기 세포 이식, 또는 암 세포를 사멸시키는 약물로의 치료를 포함할 수 있다. 또한, 증강(intensification) 요법 및 완화후 요법으로도 불린다". https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/consolidation-therapy, 최종 방문 2018년 6월 9일.
용어 "무진행 생존" 또는 PFS는 무작위화 (치료 개시 6주 이상 후에 이루어질 수 있음)로부터 최초 문서화된 종양 진행 사건의 날짜 또는 질환 진행의 부재 하의 사망까지의 시간으로 정의된다. 용어 "전체 생존"은 무작위화로부터 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간으로 정의된다. 무진행 생존은 연구자에 의해, RECIST, 버전 1.1에 따라, 미리 규정된 감수성 분석으로서 평가된다.
"암"은 면역조직화학을 통해 유방암이 에스트로겐 수용체 (ER) 및 프로게스테론 수용체 (PR)를 전혀 발현하지 않고, 또한 HER2를 과다발현하지 않는 것으로 확인된 것인 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 의미한다.
"진행성 삼중 음성 유방암 (TNBC)"은 전이성 질환, 치료-불응성 질환 또는 이전에 국부 진행되었고 현재 진행된 암을 의미한다.
"반응성" 대상체 또는 "반응자"는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용한 치료를 받는 TNBC를 갖는 대상체가 RECIST 1.1에 의해 결정 시 적어도 부분 반응 (PR) 또는 완전 반응 (CR)의 최상의 전체 반응을 경험할 것임을 의미한다.
"비-반응성" 대상체 또는 "비-반응자"는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용한 치료를 받는 TNBC를 갖는 대상체가 RECIST 1.1에 의해 결정 시 진행성 질환 (PD)의 최상의 전체 반응을 경험할 것임을 의미한다.
용어 "위험", "위험이 있는" 및 "위험 인자"는 본원에서 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 바와 같이 사용된다. 예를 들어, 위험 인자는 질환 또는 손상이 발생할 가능성을 증가시키는 개체의 임의의 속성, 특징 또는 노출이다. 특정 실시양태에서, 질환, 장애 또는 상태가 발생할 위험이 있는 사람은 그 질환, 장애 또는 상태의 발생 확률에 기여하거나 또는 이를 증진시키는 위험 인자에 사람이 노출된다는 것을 의미한다.
본 개시내용의 상세한 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐 단어 "포함하다" 및 상기 단어의 다른 형태, 예컨대 "포함하는" 및 "포함한다"는 비제한적으로 포함하는 것을 의미하며, 예를 들어, 다른 구성요소를 제외하도록 의도되지 않는다.
"공동-투여하다"란 본원에 기재된 조성물이 추가의 요법의 투여와 동시에, 그의 직전에, 또는 그의 직후에 투여되는 것을 의미한다. 본 개시내용의 단백질 및 조성물은 환자에게 단독으로 투여될 수 있거나 또는 제2, 제3 또는 제4 치료제(들)와 공동-투여될 수 있다. 공동-투여는 개별적으로 또는 조합하여 단백질 또는 조성물 (1종 초과의 치료제)의 동시적 또는 순차적 투여를 포함하도록 의도된다.
단수 용어는 단수로 제한되도록 의도되지 않는다. 특정 실시양태에서, 단수 용어는 복수 형태를 지칭할 수도 있다. 본 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 단수 형태는, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "조성물"이라는 언급은 단일 조성물뿐만 아니라, 복수의 이러한 조성물을 포함한다.
"재구성된" 제제는 동결건조 제제를 수성 담체 중에 용해시켜, 이중기능적 분자가 재구성된 제제 중에 용해되도록 하여 제조된 것이다. 재구성된 제제는 그를 필요로 하는 환자에게의 정맥내 투여 (IV)에 적합하다.
용어 "약"은 제제의 제조 및 질환 또는 장애의 치료에서 작용제의 효능을 변화시키지 않는, 작용제의 농도 또는 양에서의 임의의 최소한의 변경을 지칭한다. 실시양태에서, 용어 "약"은 명시된 수치 값 또는 데이터 포인트의 ±15%를 포함할 수 있다.
본 개시내용에서 범위는 "약"으로 수식된 하나의 특정한 값에서부터 및/또는 "약"으로 수식된 또 다른 특정한 값까지로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우에, 또 다른 측면은 하나의 특정한 값에서부터 및/또는 다른 특정한 값까지를 포함한다. 유사하게, 선행하는 "약"의 사용에 의해 값이 근사값으로서 표현되는 경우에, 특정한 값은 또 다른 측면을 형성하는 것으로 이해된다. 추가로, 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여 및 다른 종점과 독립적으로 둘 다 유의한 것으로 이해된다. 또한, 본 개시내용에 개시된 다수의 값이 존재하며, 각각의 값이 또한 자체의 그 값뿐만 아니라 "약"으로 수식된 그 특정한 값으로 개시되는 것으로 이해된다. 또한, 본 출원 전반에 걸쳐, 데이터는 다수의 상이한 포맷으로 제공되며, 상기 데이터는 종점 및 시작점 및 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 범위를 나타내는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정한 데이터 포인트 "10" 및 특정한 데이터 포인트 "15"가 개시된다면, 10 내지 15뿐만 아니라 10 및 15 초과, 이상, 미만, 이하, 및 그와 동일한 것이 개시된 것으로 간주된다는 것이 이해된다. 또한, 2개의 특정한 단위 사이의 각각의 단위가 또한 개시된 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시된다면, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된 것이다.
"등장성" 제제는 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 것이다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsmol/kgH2O의 삼투압을 가질 것이다. 용어 "고장성"은 인간 혈액의 삼투압을 초과하는 삼투압을 갖는 제제를 기재하는 데 사용된다. 등장성은, 예를 들어 증기압 또는 빙결 유형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다.
용어 "완충제"는, 수용액에 첨가되는 경우에, 산 또는 알칼리 첨가시 또는 용매로의 희석시 pH 변동에 대해 용액을 보호할 수 있는 1종 이상의 성분을 지칭한다. 포스페이트 완충제 이외에도, 글리시네이트, 카르보네이트, 시트레이트 완충제 등이 사용될 수 있으며, 이러한 경우에, 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온이 반대이온으로서 작용할 수 있다.
"산"은 수용액 중에서 수소 이온을 생성하는 물질이다. "제약상 허용되는 산"은, 이들이 제제화되는 농도 및 방식에서 비독성인 무기 및 유기 산을 포함한다.
"염기"는 수용액 중에서 히드록실 이온을 생성하는 물질이다. "제약상 허용되는 염기"는, 이들이 제제화되는 농도 및 방식에서 비-독성인 무기 및 유기 염기를 포함한다.
"동결건조보호제"는, 관심 단백질과 조합되는 경우에, 동결건조 및 후속 저장 시 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 방지 또는 감소시키는 분자이다.
"보존제"는 박테리아 작용을 감소시키며 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있는 작용제이다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-사용 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다. 잠재적 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알콜, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.
"계면활성제"는 소수성 부분 (예를 들어, 알킬 쇄) 및 친수성 부분 (예를 들어, 카르복실 및 카르복실레이트 기) 둘 다를 함유하는 표면 활성 분자이다. 계면활성제가 본 발명의 제제에 첨가될 수 있다. 본 발명의 제제에서 사용하기에 적합한 계면활성제는 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188); 소르비탄 에스테르 및 유도체; 트리톤; 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우르아미도프로필-코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일- 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿼트(MONAQUAT)™ 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.(Mona Industries, Inc.), 뉴저지주 패터슨), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어, 플루로닉스(Pluronics), PF68 등)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
삼중 음성 유방암 (TNBC)으로 진단된 환자의 효과적인 치료를 위해, 본 개시내용은 공지된 발현 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에서 TNBC를 치료하고, TNBC 환자의 질환 예후 및 전체 생존을 개선시키는 치료 레지멘을 제공한다. 공지된 발현 수준은 대조군 집단 또는 조직 샘플에서의 HMGA2 발현 수준이다. 특정 실시양태에서, 환자는 진행성 TNBC로 진단된다. 특정 실시양태에서, 환자는 선행 치료 차수에 불응성인 전이성 TNBC로 진단된다.
본 개시내용의 항-TGFβ 작용제는 TGFβ 트랩, 항체, 소분자 억제제, 및 TGFβ 발현을 표적화하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 항-TGFβ 작용제는 TGFβ-중화 항체 ID11, 2G7, 프레솔리무맙 (GC1008; 사노피(Sanofi), 겐자임(Genzyme)), 메텔리무맙 (CAT-192; 아스트라 제네카(Astra Zeneca), 캠브리지 안티바디 테크놀로지(Cambridge Antibody Technology)), TGFβ 수용체-차단 항체 예컨대 LY3022859 (일라이 릴리 & 캄파니(Eli Lilly & Co)) 및 소분자 TGFβ 수용체 키나제 억제제 갈루니세르팁 (LY2157299; 일라이 릴리 & 캄파니), SD-208 (사이오스 인크(Scios Inc)), 및 LY2109761 (일라이 릴리 & 캄파니)을 포함한다.
본 개시내용의 이중기능적 단백질 (항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자)은 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함한다. 제1 폴리펩티드는 (a) 적어도, 인간 단백질 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 영역; 및 (b) 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)에 결합할 수 있는 인간 형질전환 성장 인자 β 수용체 II (TGFβRII) 또는 그의 단편 (예를 들어, 가용성 단편)을 포함한다. 제2 폴리펩티드는 적어도, PD-L1에 결합하는 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드의 중쇄 및 제2 폴리펩티드의 경쇄는, 조합될 때, PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항체 단편)를 형성한다. 본 개시내용의 이중기능적 단백질이 2개의 표적, 즉, (1) 대부분 막 결합되어 있는 PD-L1 및 (2) 혈액 및 간질 중에 가용성인 TGFβ에 결합하기 때문에, BW-비의존성 투약 레지멘은 종양 부위에서의 PD-L1을 억제하는 데 효과적일 뿐만 아니라 TGFβ를 억제하기에도 충분한 용량을 요구한다.
암을 치료하거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법
한 측면에서, 본 발명은 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 대상체에서 TNBC를 치료함으로써, 대상체에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 삼중 음성 유방암 (TNBC) 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성함으로써, TNBC 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 2단계 방법을 제공하며, 여기서 제1 단계는 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 대상체를 확인하는 것을 수반하고, 제2 단계는 증가된 HMGA2 또는 MECOM 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이로 인해 대상체에서 TNBC를 치료하는 것을 수반한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 삼중 음성 유방암 (TNBC) 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 2단계 방법을 제공하며, 여기서 제1 단계는 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 대상체를 확인하는 것을 수반하고, 제2 단계는 증가된 HMGA2 또는 MECOM 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 투여하고, 이에 의해 삼중 음성 유방암 (TNBC) 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 것을 수반한다.
본 발명의 각각의 방법에서, 대상체의 HMGA2 또는 MECOM 수준은 환자로부터의 조직 샘플을 분석함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, 조직 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다. 특정한 실시양태에서, 대상체로부터의 조직 샘플은 생검에 의해 수득된 유방 조직 (예를 들어, 치료 개시 전에 환자로부터 수집된 바늘 생검 샘플)이다. 본 발명의 각각의 방법에서, HMGA2 또는 MECOM의 수준은 생검 샘플의 면역화학에 의해 또는 치료 개시 전에 환자로부터 수집된 생검 샘플 또는 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플의 RNA 발현 분석에 의해 결정된다.
특정한 실시양태에서, 대상체로부터의 조직 샘플은 생검에 의해 수득된 유방암 조직 (예를 들어, 치료 개시 전에 환자로부터 수집된 바늘 생검 샘플)이다. 본 발명의 각각의 방법에서, HMGA2 또는 MECOM의 수준은 생검 샘플의 면역화학에 의해 또는 치료 개시 전에 환자로부터 수집된 생검 샘플 또는 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플의 RNA 발현 분석에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 mRNA 및 MECOM mRNA 수준은 널리 공지된 mRNA 정량화 방법을 통해 결정된다. 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, HMGA2 mRNA 및 MECOM mRNA 수준은 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-qPCR) 검정을 통해 결정된다. 예시적인 실시양태에서, HMGA2 mRNA 및 MECOM mRNA 수준은 디지털 액적 PCR (ddPCR)을 통해 결정된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 삼중 음성 유방암으로 진단된 환자의 항-TGFβ 작용제에 대한 반응을 예측하고 항-TGFβ 작용제를 투여함으로써 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, HMGA2의 수준은 신선한 파라핀 포매 종양 샘플로부터 RNA를 추출함으로써 결정된다. 예시적인 실시양태에서, HMGA2의 수준은 동결된 파라핀 포매 종양 샘플로부터 RNA를 추출함으로써 결정된다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, HMGA2의 수준은 고정된 파라핀 포매 종양 샘플로부터 RNA를 추출함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, 추출된 RNA는 역전사되어 cDNA를 생산한다. 특정 실시양태에서, 역전사된 cDNA는 PCR-기반 방법 (예를 들어, RT-qPCR, 디지털 액적 PCR)을 사용하여 증폭된다. 예시적인 실시양태에서, PCR-기반 방법 (예를 들어, RT-qPCR, 디지털 액적 PCR)을 이용하여 HMGA2 발현의 RNA 전사체 수준을 정량적으로 검정한다. 특정 실시양태에서, HMGA2 RNA 전사체 수준은 적어도 하나의 하우스키핑 유전자의 RNA 전사체의 수준에 대해 정규화되어 정규화된 HMGA2 전사체 수준을 제공한다. 널리 공지된 하우스키핑 유전자 (예를 들어, GAPDH, 액틴, 유비퀴틴)를 사용하여 유전자 발현 데이터를 정규화하는 방법은 널리 공지되어 있다 (문헌 [Dheda K. et al., Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. Biotechniques 2004; 37: 112-119.] 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명은, 집단 내의 모든 종양에 걸친 HMGA2 RNA 전사체 수준의 분포와 비교하여 증가된 수준의 HMGA2 RNA 전사체 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 투여하고, 이에 의해 삼중 음성 유방암 (TNBC) 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 것을 수반한다.
특정 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현 컷오프는 대상체에서 HMGA2 발현을 정량화하는 데 사용된 정량화 방법에 기초하여 설정된다. 예시적인 실시양태에서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응할 환자 집단을 선택하기 위한 HMGA2 높은 발현 컷오프는 RNA-seq로부터 수득된 데이터 및 qPCR 및/또는 ddPCR로부터 수득된 데이터의 혼입에 의해 추론된다. RNA-seq로부터 수득된 TPM 값은 절대 정량화 방법 (예를 들어, qPCR 또는 ddPCR)으로부터 수득될 수 있는 정량화 값으로 해석될 수 있다. RNA-seq로부터 수득된 TPM 값으로부터 Ct 값 (qPCR의 경우) 또는 ddPCR 비 값 (ddPCR의 경우)으로 맵핑되는 전달 함수를 생성한다. 이러한 전달 함수는 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 Ct 또는 ddPCR 비 수준을 찾기 위해 사용된다. 예시적인 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 Ct 값을 찾기 위해 사용되는 전달 함수는 하기와 같다:
Y1= X1 - log2 (TPM 최저/TPM 기준선);
여기서 Y1= Ct 값 컷오프;
X1= 정규화된 ΔCt 값 (HMGA2에 대한 상대적인 qPCR 발현 중앙값);
TPM 최저= 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자들 사이에서 RNA-seq로부터 수득된 최저 HMGA2 발현 (TPM 값);
TPM 기준선= 임상 반응에 관계없이 모든 환자들 중에서의 HMGA2 발현 중앙값.
예시적인 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 Ct 값을 찾기 위해 사용되는 전달 함수는 하기와 같다:
Y1= X1 - log2 (TPM 제2 최저/TPM 기준선);
여기서 Y1= Ct 값 컷오프;
X1= 정규화된 ΔCt 값 (HMGA2에 대한 상대적인 qPCR 발현 중앙값);
TPM 제2 최저 = 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자들 사이에서 RNA-seq로부터 수득된 최저 HMGA2 발현 (TPM 값);
TPM 기준선= 임상 반응에 관계없이 모든 환자들 중에서의 HMGA2 발현 중앙값.
특정 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 ddPCR 비 값을 찾기 위해 사용되는 전달 함수는 하기와 같다:
Y1= X1 × (TPM 최저/TPM 기준선);
여기서 Y1= ddPCR 비 값 컷오프;
X1= 정규화된 ddPCR 비 값 (HMGA2에 대한 ddPCR 비 중앙값);
TPM최저 = 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자들 사이에서 RNA-seq로부터 수득된 최저 HMGA2 발현 (TPM 값);
TPM 기준선= 임상 반응에 관계없이 모든 환자들 중에서의 HMGA2 발현 중앙값.
특정 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 ddPCR 비 값을 찾기 위해 사용되는 전달 함수는 하기와 같다:
Y1= X1 × (TPM 제2 최저/TPM 기준선);
여기서 Y1= ddPCR 비 값 컷오프;
X1= 정규화된 ddPCR 비 값 (HMGA2에 대한 ddPCR 비 중앙값);
TPM제2 최저 = 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자들 사이에서 RNA-seq로부터 수득된 제2 최저 HMGA2 발현 (TPM 값);
TPM 기준선= 임상 반응에 관계없이 모든 환자들 중에서의 HMGA2 발현 중앙값.
예시적인 실시양태에서, 환자는, 해당 대상체의 종양에서 HMGA2의 발현이 TNBC 집단 내 모든 종양에 걸친 HMGA2 발현의 분포에 비해 높은 경우에, HMGA2 높은 것으로 간주된다. 예시적인 실시양태에서, HMGA2 발현의 참조 수준은 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 반응한 환자의 코호트 및 반응하지 않은 환자의 코호트 (각각 반응자 및 비-반응자)의 종양 샘플을 수집하고; 샘플 내의 HMGA2 발현을 측정하고; 반응자 및 비-반응자 사이의 발현의 분포를 구별짓는 컷오프 값으로 반영된 이들 분포를 특징화하고; 반응자와 비-반응자 사이의 선택된 컷-오프에 상응하는 역치 값을 참조 발현 수준으로서 설정함으로써 결정된다.
한 측면에서, 본 발명은 표적화된 TGFβ 억제에 의한 치료에 반응할 가능성이 있는 (예를 들어, 부분 반응 (PR), 개선된 생존) TNBC 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 항-TGFβ 작용제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 TNBC 환자를 확인하기 위해, HMGA2 및/또는 MECOM의 발현 수준을 각각 상응하는 공지된 대조군 발현 수준에 비해 분석한다. 특정 실시양태에서, HMGA2 또는 MECOM 발현 수준의 분석은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자를 사용한 표적화된 TGFβ 억제에 의한 치료 7-30일 (예를 들어, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일) 또는 그 초과 전에 수행된다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 TNBC 환자에서 HMGA2 및/또는 MECOM의 수준을 결정하기 위해, 환자로부터 샘플을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, TNBC 환자에서의 HMGA2 및/또는 MECOM의 수준이 TNBC 환자로부터 수득된 샘플에서 결정된다. 특정 실시양태에서, 항-TGFβ 작용제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 TNBC 환자를 확인하기 위해, HMGA2 및/또는 MECOM의 발현 수준을 대상체로부터 수집된 조직 샘플에서 분석한다. 특정한 실시양태에서, 대상체로부터의 조직 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다. 특정한 실시양태에서, 대상체로부터의 조직 샘플은 생검에 의해 수득된 유방 조직 (예를 들어, 치료 개시 전에 환자로부터 수집된 바늘 생검 샘플)이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 TGFβ를 표적화하는 작용제를 사용하여 일반적 TNBC 집단의 공지된 대조군 발현 수준에 비해 높은 HMGA2 발현을 갖는 TNBC 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, TGFβ를 표적화하는 작용제는 소분자, 모노클로날 항체, TGFβ 수용체의 융합 단백질, 및/또는 안티센스 RNA 유도체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 이들 작용제는 TGFβ 경로를 표적화하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어: 갈루니세르팁 (LY-2157299; 일라이 릴리 & 캄파니), 박토세르팁 (TEW-7197, NOV-1301; 메드팩토, 인크.(MedPacto, Inc.), 내셔널 온코벤처(National OncoVenture)), LY3200882 (일라이 릴리 & 캄파니), NIS-793 (XOMA-089; 노파르티스(Novartis), XOMA 코포레이션(XOMA corporation)), SAR-439459 (사노피(Sanofi)), ABBV-151 (AGRX-115, 아브비(AbbVie), 아르젠스(Argenx)), AVID-200 (포르비우스(Forbius)), PF-06952229 (화이자(Pfizer)), 및 YL-13027 (상하이 잉리 파마슈티칼 캄파니, 리미티드(Shanghai YingLi Pharmaceutical Co., Ltd.)).
일부 실시양태에서, HMGA2 및/또는 MECOM의 수준은 환자로부터의 샘플을 분석함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, 대상체로부터의 조직 샘플은 생검에 의해 수득된 유방 조직 (예를 들어, 치료 개시 전에 환자로부터 수집된 바늘 생검 샘플)이다. 본 발명의 각각의 방법에서, HMGA2 또는 MECOM의 수준은 생검 샘플의 면역화학에 의해 또는 치료 개시 전에 환자로부터 수집된 생검 샘플 또는 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플의 RNA 발현 분석에 의해 결정된다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, HMGA2 및/또는 MECOM의 수준은 면역화학에 의해, 예를 들어 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 또는 뉴클레오티드 분석에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 TNBC 환자로부터 수득된 샘플 내의 HMGA2 및/또는 MECOM의 mRNA 발현의 측정된 수준을 다수의 환자의 데이터베이스인 TCGA 데이터베이스 (더 캔서 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas) - 국립 보건원)에서 이용가능한 공지된 값의 mRNA 발현의 수준과 비교하는 것을 수반한다.
RNA-seq 데이터세트를 비교하는 것은 통상적으로 배치 효과라 불리는 것을 초래하는 기술적 플랫폼 및 샘플 제조에서의 변동으로 인해 단순하지 않으며; HMGA2 및/또는 MECOM 발현의 관찰치 수준을 TCGA에 따른 수준과 차이나게 하는 배치 효과를 보정하기 위해, 컴뱃(ComBat) 알고리즘을 sva 바이오컨덕터(Bioconductor) 패키지 (sva version 3.28.0, Leek JT, Johnson WE, Parker HS, Fertig EJ, Jaffe AE, Storey JD, Zhang Y, Torres LC (2018). sva: 대리 변수 검정(Surrogate Variable Analysis))에서 실행하였다. 이 방법은 TCGA 유방암 데이터세트 (이하 TCGA-BRCA)에서의 삼중-음성 (이하 TCGA_BRCA_TNBC)인 환자 임상 데이터를 HMGA2 및/또는 MECOM의 관찰치 수준과 비교가능하게 만들었다.
특정 실시양태에서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 TNBC 환자를 확인하기 위해, HMGA2 또는 MECOM의 발현 수준을 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플로부터 추출된 RNA를 서열분석함으로써 분석한다. 예를 들어, RN이지(RNeasy) FFPE 키트 (퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴)에 의해 1 내지 2개의 5-10 μm FFPE 컬로부터 총 RNA를 단리함으로써 FFPE 샘플로부터 RNA를 추출하고, 큐비트(Qubit) 2.0 형광계에서 큐비트 HS RNA 검정 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 미국)을 사용하여 RNA 농도를 결정한다. 이어서 추출된 RNA를 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 서열분석한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 사용하여 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 분석한다. 특정 실시양태에서, qPCR을 택맨(TaqMan) 유전자 발현 마스터 믹스를 사용하여 이중으로 수행하고, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 7500 신속 실시간 PCR 시스템 (96-웰 포맷) 상에서 제조업체의 권장 사이클링 프로토콜을 사용하여 실행한다. 표적 유전자에 대한 프라이머/프로브 세트 (서열식별번호: 63 및/또는 서열식별번호: 64) 및 하우스키핑 유전자는 "기성품" 유전자 발현 검정이 이용가능하지 않은 경우 프라이머 익스프레스(Primer Express)®를 사용하여 설계될 수 있다. 비교 ΔCt 방법을 사용하여 유전자 발현의 상대적 정량화를 할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 디지털 액적 PCR (ddPCR)을 사용하여 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 분석한다. 특정 실시양태에서, ddPCR은 바이오라드(BioRad) ddPCR 프로토콜에 따라 표적 유전자를 표적화하는 프라이머 및 프로브 (서열식별번호: 63 및/또는 서열식별번호: 64) 및 하우스키핑 유전자를 함유하는 검정을 사용하여 수행된다. 퀀타소프트(QuantaSoft) 소프트웨어를 사용하여 각각의 실험의 샘플 분석을 수행한다. 모든 샘플에서의 양성 액적 농도는 상응하는 주형이 없는 대조군 (NTC)에서 검출된 바와 같은 음성 클러스터를 기준으로 수동으로 배치된 형광 역치를 사용하여 결정된다. 단일 샘플 내의 표적 DNA 농도 (카피/μL) 및 절대 액적 계수가 정량적 결과 측정으로서 사용된다.
또 다른 실시양태에서, HTG EdgeSeq 시스템이 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 분석하는 데 사용된다.　 FFPE 시편을 튜브 내로 스크랩핑하고, HTG의 용해 완충제 중에 용해시킨 후, 유전자-특이적 DNA 뉴클레아제 보호 프로브 (NPP)를 도입한다.　 NPP가 생물학적 매트릭스에서 가용성이거나 또는 가교된 것 둘 다일 수 있는 그의 표적 RNA에 혼성화되도록 한 후, 과량의 비혼성화 NPP 및 RNA를 제거하는 S1 뉴클레아제를 첨가하여, 그의 표적 RNA에 혼성화된 NPP만을 남긴다.
이에 따라, 표적 RNA에서 NPP로의 화학량론적 전환이 달성되어, 거의 1:1 비의 NPP 대 RNA를 생산한다.　 qNPA 단계는 HTG EdgeSeq 프로세서 상에서 자동화되고, 서열분석 어댑터 및 태그를 첨가하기 위해 PCR이 이어진다. 표지된 샘플을 풀링하고, 세정하고, 표준 프로토콜을 사용하여 차세대 서열분석 (NGS) 플랫폼 상에서 서열분석한다.　 NGS 기기로부터의 데이터를 가공하고 HTG EdgeSeq 파서 소프트웨어에 의해 기록한다.
도 2a (HMGA2) 및 도 3b (MECOM)에 제시된 바와 같이, HMGA2 및 MECOM은 둘 다 비-반응자와 비교하여 반응자에서 20배 초과만큼 과다발현된다. 도 2a에서, HMGA2 발현 수준 (백만개당 전사체 (TPM)의 로그)이 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질에 대한 반응 (PD = 진행성 질환; SD = 안정 질환; PR = 부분 반응)에 대해 플롯팅된다. 널리 사용되는 전사체 풍부도의 척도인 TPM은 RSEM에 의해 계산되었다. 문헌 [Li & Dewey, (2011), BMC Bioinformatics, 12:323]을 참조한다.　 HMGA2의 높은 발현 수준 및 낮은 발현 수준이 도 2b에 기록되고, MECOM의 높은 발현 수준 및 낮은 발현 수준이 도 3a에 기록된다. 높은 발현 수준-대-낮은 발현 수준의 비는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응할 가능성이 있는 TNBC 환자를 확인할 수 있는 독립적인 값 (인자)을 제공한다.
높은 HMGA2 발현은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자 중에서 적어도 최저 HMGA2 발현만큼의 높은 발현 수준이다. 도 2a에 제시된 바와 같이, HMGA2 발현은 비-반응자 사이의 발현 수준에 비해 유의하게 더 높다 (적어도 35배).
도 3b에서, MECOM 발현 수준 (백만개당 전사체 (TPM)의 로그)이 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용한 치료에 대한 반응에 대해 플롯팅된다 (PD = 진행성 질환; SD = 안정 질환; PR = 부분 반응). 높은 MECOM 발현은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자 중에서 적어도 최저 MECOM 발현만큼의 높은 발현 수준이다. 도 3b에 제시된 바와 같이, MECOM 발현은 비-반응자 사이의 발현 수준에 비해 유의하게 더 높다 (적어도 20배).
특정 실시양태에서, HMGA2 또는 MECOM의 발현 수준은 면역조직화학 (IHC)에 의해 분석된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, FFPE 조직 시편에서 종양 세포 핵 내 HMGA2 또는 MECOM의 발현을 검정하기 위한 자동화 IHC 방법이 개발될 수 있다. 본 개시내용은 시험 샘플 및 음성 대조군 샘플을, Ab 또는 그의 부분과 인간 HMGA2 또는 MECOM 사이에 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에, 인간 HMGA2 또는 MECOM에 특이적으로 결합하는 mAb와 접촉시키는 것을 포함하는, 시험 조직 샘플에서 인간 HMGA2 또는 MECOM 항원의 존재를 검출하거나, 또는 인간 HMGA2 또는 MECOM 항원의 수준 또는 상기 항원을 발현하는 세포의 샘플 내 비율을 정량화하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 시험 및 대조군 조직 샘플은 FFPE 샘플이다. 이어서 복합체의 형성을 검출하며, 여기서 시험 샘플과 음성 대조군 샘플 사이에 복합체 형성의 차이는 샘플 내 인간 HMGA2 또는 MECOM 항원의 존재를 나타낸다. 다양한 방법이 HMGA2 또는 MECOM 발현을 정량화하는 데 사용된다.
특정한 실시양태에서, 자동화 IHC 방법은 (a) 자동염색기에서 탑재된 조직 절편을 탈파라핀화 및 재수화시키고; (b) 전처리 모듈을 사용하여 적절한 pH에서 표적 복원 용액에서 항원을 회복하고; (c) 조직 시편에서 내인성 퍼옥시다제를 중화시키는 단계; 슬라이드 상의 비-특이적 단백질-결합 부위를 차단하는 단계; 슬라이드를 1차 Ab 또는 음성 대조군 시약과 함께 인큐베이션하는 단계; 1차 후 차단제와 함께 인큐베이션하는 단계; 발색원 기질을 첨가하고 현상하는 단계; 및 헤마톡실린으로 대조염색하는 단계를 포함하여 자동염색기를 실행하고; (d) 등급화된 에탄올 시리즈에서 탈수시키고 깨끗히 하여 영구 매질로 장착하는 것을 포함한다.
종양 조직 샘플에서 HMGA2 또는 MECOM 발현을 평가하기 위해, 병리학자는 현미경 하에서 각각의 필드 내 HMGA2+ 또는 MECOM+ 종양 세포의 수를 조사하고, 양성인 세포의 백분율을 속으로 추정한 다음, 이를 평균내어 최종 백분율을 얻는다. 상이한 염색 강도는 0/음성, 1+/약함, 2+/중간, 및 3+/강함으로 지정된다. 전형적으로, 백분율 값은 먼저, 0 및 3+ 버킷에 할당된 다음, 중간 1+ 및 2+ 강도가 고려된다. 고도로 불균질한 조직에 대해서는, 시편이 구역들로 분할되고, 각각의 구역이 개별적으로 스코어링된 다음, 백분율 값의 단일 세트로 합해진다. 상이한 염색 강도에 대한 음성 및 양성 세포의 백분율이 각각의 영역으로부터 결정되고, 각각의 구역에 대한 중앙값이 제공된다. 최종 백분율 값이 각각의 염색 강도 카테고리: 음성, 1+, 2,+ 및 3+에 대해 조직에 주어진다. 모든 염색 강도의 합은 100%여야 한다.
이들 스코어링 방법의 특정 실시양태에서, 상기 샘플은 독립적으로 작업하는 2명의 병리학자에 의해 스코어링한 다음, 이러한 스코어를 통합한다. 특정의 다른 실시양태에서, 양성 및 음성 세포의 확인은 적절한 소프트웨어를 사용하여 스코어링된다.
히스토스코어는 IHC 데이터의 보다 정량적인 척도로서 사용된다. 히스토스코어는 하기와 같이 계산된다: 히스토스코어 = [(% 종양.곱하기.1 (낮은 강도))+(% 종양.곱하기.2 (중간 강도))+(% 종양.곱하기.3 (높은 강도)]. 히스토스코어를 결정하기 위해, 시편 내의 각각의 강도 카테고리 내의 염색된 세포의 백분율을 추정한다. 최종 히스토스코어 범위는 0 (발현 없음) 내지 300 (최대 발현)일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 발현은 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균보다 적어도 2.0-배, 예를 들어, 2.27-배 더 크다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 발현은 HMGA2 발현의 공지된 집단 평균 수준 (예를 들어, TNBC 환자 사이의 집단 평균)보다 적어도 2 내지 7-배 (예를 들어, 2.1-배, 2.2-배, 2.3-배, 2.4-배, 2.5-배, 2.6-배, 2.7-배, 2.8-배, 2.9-배, 3.0-배, 3.1-배, 3.2-배, 3.3-배, 3.4-배, 3.5-배, 3.6-배, 3.7-배, 3.8-배, 3.9-배, 4.0-배, 4.1-배, 4.2-배, 4.3-배, 4.4-배, 4.5-배, 4.6-배, 4.7-배, 4.8-배, 4.9-배, 5.0-배, 5.1-배, 5.2-배, 5.3-배, 5.4-배, 5.5-배, 5.6-배, 5.7-배, 5.8-배, 5.9-배, 6.0-배, 6.1-배, 6.2-배, 6.3-배, 6.4-배, 6.5-배, 6.6-배, 6.7-배, 6.8-배, 6.9-배, 또는 7.0-배) 더 크다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 MECOM 발현은 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균보다 적어도 1.5-배 더 크다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 MECOM 발현은 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균보다 적어도 1.5 내지 4-배 (예를 들어, 2.1-배, 2.2-배, 2.3-배, 2.4-배, 2.5-배, 2.6-배, 2.7-배, 2.8-배, 2.9-배, 3.0-배, 3.1-배, 3.2-배, 3.3-배, 3.4-배, 3.5-배, 3.6-배, 3.7-배, 3.8-배, 3.9-배, 또는 4.0-배) 더 크다.
특정 실시양태에서, HMGA2 또는 MECOM의 발현 수준을 일반적 TNBC 집단의 공지된 발현 수준과 비교한다. 특정 실시양태에서, HMGA2 발현 수준은, HMGA2 RNA 발현 수준이 일반적 TNBC 집단의 HMGA2 RNA 발현 수준보다 2.60배 초과인 것으로 결정되는 경우에, 높은 것으로 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, TNBC 대상체로부터 수득된 조직 샘플에서 1% 초과 (예를 들어, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과 또는 20% 초과)의 HMGA2 단백질 발현 종양 세포로 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준을 결정하였다. 특정 실시양태에서, MECOM 발현 수준은, MECOM RNA 발현 수준이 일반적 TNBC 집단의 MECOM RNA 발현 수준보다 1.7배 초과인 경우에, 높은 것으로 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, TNBC 대상체로부터 수득된 조직 샘플에서 1% 초과 (예를 들어, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과 또는 20% 초과)의 MECOM 단백질 발현 종양 세포로 증가된 MECOM 단백질 발현 수준을 결정하였다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 대상체에서의 증가된 HMGA2 발현은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용한 치료에 대해 비반응성인 대상체에서의 HMGA2 발현보다 적어도 19- 내지 40-배 (예를 들어, 19-배, 20-배, 21-배, 22-배, 23-배, 24-배, 25-배, 26-배, 27-배, 28-배, 29-배, 30-배, 31-배, 32-배, 33-배, 34-배, 35-배, 36-배, 37-배, 38-배, 39-배, 또는 40-배) 더 크다.
특정 실시양태에서, HMGA2 또는 MECOM의 발현 수준을 TNBC 집단 내의 반응자와 비-반응자 사이에서 비교한다. 특정 실시양태에서, HMGA2 발현 수준은, HMGA2 RNA 발현 수준이 비반응자 TNBC 집단의 HMGA2 RNA 발현 수준보다 적어도 19 내지 35배 더 큰 것으로 결정되는 경우에, 높은 것으로 결정된다. 특정 실시양태에서, MECOM 발현 수준은, MECOM RNA 발현 수준이 비반응자 TNBC 집단의 MECOM RNA 발현 수준보다 적어도 18 내지 35배 더 큰 것으로 결정되는 경우에, 높은 것으로 결정된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 발현은 정상 HMGA2 발현 수준보다 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에서, 증가된 HMGA2 및/또는 MECOM 발현은 HMGA2 및/또는 MECOM 발현의 정상 집단 수준보다 100% - 1000% 더 높은 (200% - 1000% 더 높은, 300% - 1000% 더 높은, 400% - 1000% 더 높은, 500% - 1000% 더 높은, 600% - 1000% 더 높은, 700% - 1000% 더 높은, 800% - 1000% 더 높은, 900% - 1000% 더 높은, 100% - 900% 더 높은, 100% - 800% 더 높은, 100% - 700% 더 높은, 100% - 600% 더 높은, 100% - 500% 더 높은, 100% - 400% 더 높은, 100% - 300% 더 높은, 또는 100% - 200% 더 높은) 전사체 발현이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 TGFβ 억제에 의한 치료에 대해 반응성인 것으로 확인된 대상체는 증가된 HMGA2 전사체 발현을 갖는 것으로 결정되었고, 여기서 증가된 HMGA2 전사체 발현은 정상 HMGA2 전사체 발현 수준보다 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과이다. 특정 실시양태에서, 표적화된 TGFβ 억제에 의한 치료에 대해 반응성인 것으로 확인된 대상체는 증가된 MECOM 발현을 갖는 것으로 결정되었고, 여기서 증가된 MECOM 전사체 발현은 정상 MECOM 전사체 발현 수준보다 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과이다.
본 발명의 실시양태에서, HMGA2 및/또는 MECOM의 증가된 수준은 항-PDL1/TGFβ 트랩 분자의 초기 용량을 투여하기 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 11, 주, 약 12주, 약 13주, 약 14주, 약 15주, 약 16주, 약 17주, 약 18주, 약 19주, 약 20주, 약 21주, 약 22주, 약 23주, 약 24주, 약 25주, 약 26주, 약 27주, 약 28주, 약 29주, 약 30주, 약 31주, 약 32주, 약 33주, 약 34주, 약 35주, 약 36주, 약 37주, 약 38주, 약 39주, 약 40주, 약 41주, 약 42주, 약 43주, 약 44주, 약 45주, 약 46주, 약 47주, 약 48주, 약 49주, 약 50주, 약 51주, 약 52주, 약 1주 내지 약 2주, 약 2주 내지 약 3주, 3주 내지 4주, 4주 내지 5주, 5주 내지 6주, 6주 내지 7주, 7주 내지 8주, 8주 내지 9주, 9주 내지 10주, 10주 내지 11주, 11주 내지 12주, 12주 내지 16주, 16주 내지 20주, 20주 내지 24주, 24주 내지 28주, 28주 내지 32주, 32주 내지 36주, 36주 내지 40주, 40주 내지 44주, 44주 내지 48주, 48주 내지 52주 및/또는 52주 초과 전에 결정된다.
본 발명의 방법에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 TNBC 환자에게 적어도 1200 mg의 용량의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 제1 폴리펩티드는 (a) 적어도 인간 단백질 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 영역; 및 (b) 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)에 결합할 수 있는 인간 형질전환 성장 인자 β 수용체 II (TGFβRII) 또는 그의 단편을 포함한다. 제2 폴리펩티드는 적어도, PD-L1에 결합하는 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하고, 제1 폴리펩티드의 중쇄 및 제2 폴리펩티드의 경쇄는, 조합될 때, PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다.
특정 실시양태에서, TNBC를 치료하거나 또는 종양 성장을 억제하는 본 개시내용의 방법은 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 제1 폴리펩티드가 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 투여하는 것을 수반한다.
특정 실시양태에서, TNBC를 치료하거나 또는 종양 성장을 억제하는 본 개시내용의 방법은 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것; 또는 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물))을 약 1200 mg 내지 약 3000 mg (예를 들어, 약 1200 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg 내지 약 2900 mg, 약 1200 mg 내지 약 2800 mg, 약 1200 mg 내지 약 2700 mg, 약 1200 mg 내지 약 2600 mg, 약 1200 mg 내지 약 2500 mg, 약 1200 mg 내지 약 2400 mg, 약 1200 mg 내지 약 2300 mg, 약 1200 mg 내지 약 2200 mg, 약 1200 mg 내지 약 2100 mg, 약 1200 mg 내지 약 2000 mg, 약 1200 mg 내지 약 1900 mg, 약 1200 mg 내지 약 1800 mg, 약 1200 mg 내지 약 1700 mg, 약 1200 mg 내지 약 1600 mg, 약 1200 mg 내지 약 1500 mg, 약 1200 mg 내지 약 1400 mg, 약 1200 mg 내지 약 1300 mg, 약 1300 mg 내지 약 3000 mg, 약 1400 mg 내지 약 3000 mg, 약 1500 mg 내지 약 3000 mg, 약 1600 mg 내지 약 3000 mg, 약 1700 mg 내지 약 3000 mg, 약 1800 mg 내지 약 3000 mg, 약 1900 mg 내지 약 3000 mg, 약 2000 mg 내지 약 3000 mg, 약 2100 mg 내지 약 3000 mg, 약 2200 mg 내지 약 3000 mg, 약 2300 mg 내지 약 3000 mg, 약 2400 mg 내지 약 3000 mg, 약 2500 mg 내지 약 3000 mg, 약 2600 mg 내지 약 3000 mg, 약 2700 mg 내지 약 3000 mg, 약 2800 mg 내지 약 3000 mg, 약 2900 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 약 2500 mg, 약 2600 mg, 약 2700 mg, 약 2800 mg, 약 2900 mg, 또는 약 3000 mg)의 용량으로 투여하는 것을 수반한다. 특정 실시양태에서, 약 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자가 TNBC 환자에게 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 1800 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자가 TNBC 환자에게 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자가 TNBC 환자에게 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 1200 mg의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물이 대상체에게 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 1800 mg의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물이 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 TNBC 환자에게 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 1800 mg의 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물이 TNBC 환자에게 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 2400 mg의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물이 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 TNBC 환자에게 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 2400 mg의 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물이 TNBC 환자에게 3주마다 1회 투여된다.
특정 실시양태에서, TNBC 환자에게 투여되는 용량은 약 1200 mg, 약 1225 mg, 약 1250 mg, 약 1275 mg, 약 1300 mg, 약 1325 mg, 약 1350 mg, 약 1375 mg, 약 1400 mg, 약 1425 mg, 약 1450 mg, 약 1475 mg, 약 1500 mg, 약 1525 mg, 약 1550 mg, 약 1575 mg, 약 1600 mg, 약 1625 mg, 약 1650 mg, 약 1675 mg, 약 1700 mg, 약 1725 mg, 약 1750 mg, 약 1775 mg, 약 1800 mg, 약 1825 mg, 약 1850 mg, 1875 mg, 약 1900 mg, 약 1925 mg, 약 1950 mg, 약 1975 mg, 약 2000 mg, 약 2025 mg, 약 2050 mg, 약 2075 mg, 2100 mg, 약 2125 mg, 약 2150 mg, 약 2175 mg, 약 2200 mg, 약 2225 mg, 약 2250 mg, 약 2275 mg, 약 2300 mg, 약 2325 mg, 약 2350 mg, 약 2375 mg, 또는 약 2400 mg일 수 있다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 적어도 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 적어도 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1200 mg 내지 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1200 mg 내지 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1800 mg 내지 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 1800 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여된다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 2100 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 2100 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 HMGA2 또는 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 2400 mg 또는 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여된다.
특정 실시양태에서, TNBC 환자에게 투여되는 용량은 2주마다 1회 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, TNBC 환자에게 투여되는 용량은 3주마다 1회 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질은 정맥내 투여에 의해, 예를 들어, 사전충전된 백, 사전충전된 펜 또는 사전충전된 시린지로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질은 250 ml 염수 백으로부터 정맥내로 투여되고, 정맥내 주입은 약 1시간 (예를 들어, 50 내지 80분) 동안 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 백은 튜브 및/또는 바늘을 포함하는 채널에 연결된다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 적어도 1200 mg (예를 들어, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 또는 그 초과)의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 특정 실시양태에서, TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 적어도 1200 mg (예를 들어, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 또는 그 초과)의 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 특정 실시양태에서, TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 1200 mg의 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 특정 실시양태에서, TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 2400 mg의 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 정맥내로 투여함으로써 치료된다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 약 1200 mg - 약 2400 mg (예를 들어, 약 1200 mg 내지 약 2400 mg, 약 1200 mg 내지 약 2300 mg, 약 1200 mg 내지 약 2200 mg, 약 1200 mg 내지 약 2100 mg, 약 1200 mg 내지 약 2000 mg, 약 1200 mg 내지 약 1900 mg, 약 1200 mg 내지 약 1800 mg, 약 1200 mg 내지 약 1700 mg, 약 1200 mg 내지 약 1600 mg, 약 1200 mg 내지 약 1500 mg, 약 1200 mg 내지 약 1400 mg, 약 1200 mg 내지 약 1300 mg, 약 1300 mg 내지 약 2400 mg, 약 1400 mg 내지 약 2400 mg, 약 1500 mg 내지 약 2400 mg, 약 1600 mg 내지 약 2400 mg, 약 1700 mg 내지 약 2400 mg, 약 1800 mg 내지 약 2400 mg, 약 1900 mg 내지 약 2400 mg, 약 2000 mg 내지 약 2400 mg, 약 2100 mg 내지 약 2400 mg, 약 2200 mg 내지 약 2400 mg, 또는 약 2300 mg 내지 약 2400 mg)의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 정맥내로 투여함으로써 치료된다.
특정 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 약 1200 mg - 약 2400 mg (예를 들어, 약 1200 mg 내지 약 2400 mg, 약 1200 mg 내지 약 2300 mg, 약 1200 mg 내지 약 2200 mg, 약 1200 mg 내지 약 2100 mg, 약 1200 mg 내지 약 2000 mg, 약 1200 mg 내지 약 1900 mg, 약 1200 mg 내지 약 1800 mg, 약 1200 mg 내지 약 1700 mg, 약 1200 mg 내지 약 1600 mg, 약 1200 mg 내지 약 1500 mg, 약 1200 mg 내지 약 1400 mg, 약 1200 mg 내지 약 1300 mg, 약 1300 mg 내지 약 2400 mg, 약 1400 mg 내지 약 2400 mg, 약 1500 mg 내지 약 2400 mg, 약 1600 mg 내지 약 2400 mg, 약 1700 mg 내지 약 2400 mg, 약 1800 mg 내지 약 2400 mg, 약 1900 mg 내지 약 2400 mg, 약 2000 mg 내지 약 2400 mg, 약 2100 mg 내지 약 2400 mg, 약 2200 mg 내지 약 2400 mg, 또는 약 2300 mg 내지 약 2400 mg)의 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 정맥내로 투여함으로써 치료된다.
일부 실시양태에서, 상응하는 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 또는 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 약 1200 mg의 용량으로 2주마다 1회 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 일부 실시양태에서, 진행성 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 1200 mg의 용량으로 2주마다 1회 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 일부 실시양태에서, 진행성 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 약 1800 mg의 용량으로 3주마다 1회 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 일부 실시양태에서, 진행성 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 약 2400 mg의 용량으로 3주마다 1회 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 일부 실시양태에서, 진행성 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 2400 mg의 용량으로 3주마다 1회 정맥내로 투여함으로써 치료된다.
특정 실시양태에서, 치료될 TNBC는 PD-L1 양성이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 치료될 TNBC는 PD-L1+ 발현을 나타낸다 (예를 들어, 높은 PD-L1 발현). 일부 실시양태에서, 예를 들어 PD-L1-높은이란 73-10 검정에 의해 결정 시 ≥ 80% PD-L1 양성 종양 세포 (종양 비율 점수 [TPS])로서 규정될 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-L1-높은이란 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 검정에 의해 결정 시 종양 비율 점수 (TPS) ≥ 50%로서 규정될 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-L1-높은이란 PD-L1 IHC SP263 검정에 의해 결정 시 종양 비율 점수 (TPS) ≥ 25%로서 규정될 수 있다. 예를 들어 암 또는 종양 상에서 바이오마커, 예컨대 PD-L1을 검출하는 방법은 관련 기술분야에서 상용적이며, 본원에서 고려된다. 비제한적 예는 면역조직화학, 면역형광 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-L1-높은 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 약 1200 mg의 용량으로 2주마다 1회 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 일부 실시양태에서, PD-L1-높은 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 약 1800 mg의 용량으로 3주마다 1회 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 일부 실시양태에서, PD-L1-높은 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 약 2100 mg의 용량으로 3주마다 1회 정맥내로 투여함으로써 치료된다. 일부 실시양태에서, PD-L1-높은 TNBC를 갖는 대상체 또는 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 약 2400 mg의 용량으로 3주마다 1회 정맥내로 투여함으로써 치료된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 방법은 대상체 또는 환자의 질환 반응 또는 개선된 생존을 이루어낸다. 일부 실시양태에서 예를 들어, 질환 반응은 완전 반응, 부분 반응 또는 안정 질환일 수 있다. 일부 실시양태에서 예를 들어, 개선된 생존은 무진행 생존 (PFS) 또는 전체 생존일 수 있다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, PFS에서의) 개선은 본 개시내용의 항-PD-L1/TGFβ 트랩으로의 치료 개시 전의 기간에 비하여 결정된다. 암 또는 종양 요법에 대한 질환 반응 (예를 들어, 완전 반응, 부분 반응, 또는 안정 질환) 및 환자 생존 (예를 들어, PFS, 전체 생존)을 결정하는 방법는 관련 기술분야에서 상용적이며 본원에서 고려된다. 일부 실시양태에서, 질환 반응은 치료된 환자를 이환 부위의 조영-증강 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 자기 공명 영상화 (MRI)로 처리한 후 RECIST 1.1에 따라 평가된다.
암 표적으로서의 TGFβ
본 개시내용은 특정 종양 세포 또는 면역 세포의 외부 표면 상에서 발견되는 세포성 면역 체크포인트 수용체를 표적화하는 항체 모이어티에 테더링된 가용성 시토카인 수용체 (TGFβRII)를 사용하여 TGFβ를 포착함으로써 종양 미세환경에서의 TGFβ의 국부적인 감소를 가능하게 한다. 면역 체크포인트 단백질에 대한 본 개시내용의 항체 모이어티의 예는 항-PD-L1이다. 본원에서 때때로 "항체-시토카인 트랩"으로 지칭되는 본 개시내용의 이중기능적 분자는 항-수용체 항체 및 시토카인 트랩이 물리적으로 연결되기 때문에 정확하게 효과적이다. (예를 들어, 항체 및 수용체를 별개의 분자로서 투여하는 것에 비한) 결과적인 장점은, 부분적으로, 시토카인이 자가분비 및 주변분비 기능을 통해 국부 환경에서 우세하게 기능하기 때문이다. 항체 모이어티는 국부 면역억제성 자가분비 또는 주변분비 효과를 중화함으로써 가장 효과적일 수 있는 종양 미세환경으로 시토카인 트랩을 향하게 한다. 또한, 항체의 표적이 항체 결합 시 내재화되는 경우에, 시토카인/시토카인 수용체 복합체의 클리어런스를 위한 효과적인 메카니즘이 제공된다. 항체-매개 표적 내재화가 PD-L1에 대해 제시되었고, 항-PD-L1/TGFβ 트랩은 항-PD-L1과 유사한 내재화 속도를 갖는 것으로 제시되었다. 이는 첫째로, 항-TGFβ 항체가 완전히 중화되지 않았을 수도 있고; 둘째로, 항체가 시토카인의 반감기를 연장하는 담체로서 작용할 수 있기 때문에 항-TGFβ 항체를 사용하는 것에 비해 뚜렷한 이점이다.
실제로, 하기 기재된 바와 같이, 항-PD-L1/TGFβ 트랩으로의 치료는 종양 세포 상의 PD-L1과 면역 세포 상의 PD-1 사이의 상호작용 및 종양 미세환경에서의 TGFβ의 중화의 동시 차단으로 인해 상승작용적 항종양 효과를 도출한다. 이론에 얽매이지는 않지만, 이는 아마도 2가지의 주요 면역 회피 메카니즘을 동시에 차단하는 것과, 추가적으로 단일 분자 개체에 의한 종양 미세환경에서의 TGFβ의 고갈로부터 얻어지는 상승작용적 효과 때문일 것이다. 이러한 고갈은 (1) 종양 세포의 항-PD-L1 표적화; (2) TGFβ 트랩에 의한 종양 미세환경에서의 TGFβ 자가분비/주변분비의 결합; 및 (3) 결합된 TGFβ의 PD-L1 수용체-매개 세포내이입을 통한 파괴에 의해 달성된다. 또한, Fc (IgG의 결정화 단편)의 C-말단에 융합된 TGFβRII는 Fc의 N-말단에 TGFβRII가 위치한 TGFβRII-Fc보다 수배 더 강력하였다.
TGFβ는 암의 분자상 지킬과 하이드로서의 그의 모순적인 역할로 인해 암 면역요법에서 다소 모호한 표적이었다 (Bierie et al., Nat. Rev. Cancer, 2006; 6:506-20). 일부 다른 시토카인과 같이, TGFβ 활성은 발생 단계 및 상황 의존적이다. 실제로, TGFβ는 종양 촉진자 또는 종양 억제자로서 작용하여, 종양 개시, 진행 및 전이에 영향을 미칠 수 있다. TGFβ의 이러한 이중 역할의 기저 메카니즘은 여전히 불명확하다 (Yang et al., Trends Immunol. 2010; 31:220-227). Smad-의존성 신호전달이 TGFβ 신호전달의 성장 억제를 매개하는 한편, Smad 비의존성 경로는 그의 종양-촉진 효과에 기여하는 것으로 상정되어 있지만, Smad-의존성 경로가 종양 진행에 수반된다는 것을 나타내는 데이터도 또한 존재한다 (Yang et al., Cancer Res. 2008; 68:9107-11).
TGFβ 리간드 및 수용체 둘 다는 치료 표적으로서 집중적으로 연구되고 있다. 3가지 리간드 이소형, TGFβ1, 2 및 3이 존재하고, 이들은 모두 동종이량체로서 존재한다. 또한 3가지 TGFβ 수용체 (TGFβR)가 존재하고, 이들은 TGFβR 유형 I, II 및 III로 불린다 (Lopez-Casillas et al., J. Cell Biol. 1994; 124:557-68). TGFβRI는 신호전달 쇄이고, 리간드에 결합할 수 없다. TGFβRII는 높은 친화도로 리간드 TGFβ1 및 3에 결합하지만, TGFβ2에는 결합하지 않는다. TGFβRII/TGFβ 복합체는 TGFβRI를 동원하여, 신호전달 복합체를 형성한다 (Won et al., Cancer Res. 1999; 59:1273-7). TGFβRIII는 TGFβ가 그의 신호전달 수용체에 결합하는 것의 양성 조절자이고, 모든 3가지 TGFβ 이소형에 높은 친화도로 결합한다. 세포 표면 상에서, TGFβ/TGFβRIII 복합체는 TGFβRII에 결합하고, 이어서 TGFβRI를 동원하고, 이는 TGFβRIII를 대체하여 신호전달 복합체를 형성한다.
3가지 상이한 TGFβ 이소형 모두가 동일한 수용체를 통해 신호를 전달하지만, 이들은 생체 내에서 차등 발현 패턴 및 비-중첩 기능을 갖는 것으로 공지되어 있다. 3가지 상이한 TGF-β 이소형 녹아웃 마우스는 별개의 표현형을 갖고, 이는 수많은 비-보상 기능을 나타낸다 (Bujak et al., Cardiovasc. Res. 2007; 74:184-95). TGFβ1 널 마우스는 조혈 및 혈관생성 결함을 갖고, TGFβ3 널 마우스는 폐 발생 및 결함있는 구개발생을 나타내는 한편, TGFβ2 널 마우스는 다양한 발달 이상을 나타내고, 가장 현저한 것은 다중 심장 변형이다 (Bartram et al., Circulation 2001; 103:2745-52; Yamagishi et al., Anat. Rec. 2012; 295:257-67). 또한, TGFβ는 허혈 및 재관류 손상 후의 심근 손상의 복구에서 주요 역할을 하는 것에 연루된다. 성인 심장에서, 심근세포는 TGFβ를 분비하고, 이는 자가분비로서 작용하여 자발적인 박동수를 유지시킨다. 중요하게는, 심근세포에 의해 분비되는 TGFβ의 70-85%는 TGFβ2이다 (Roberts et al., J. Clin. Invest. 1992; 90:2056-62). TGFβRI 키나제 억제제로의 치료에 의해 제기된 심장독성 우려에도 불구하고, 본 출원인은 원숭이에서의 항-PD-L1/TGFβ 트랩에 있어서, 심장독성을 포함한 독성의 결여를 관찰하였다.
TGFβ를 중화하는 치료 접근법은 가용성 수용체 트랩으로서의 TGFβ 수용체의 세포외 도메인 및 중화 항체를 사용하는 것을 포함한다. 수용체 트랩 접근법에서, 가용성 TGFβRIII는 모든 3가지 TGFβ 리간드에 결합하기 때문에 확실한 선택으로 보일 수 있다. 그러나, 762개의 아미노산 잔기의 세포외 도메인을 갖는 280-330 kD 글리코사미노글리칸 (GAG)-당단백질로서 자연 발생하는 TGFβRIII는 생물요법제 개발을 위한 매우 복합적인 단백질이다. GAG가 없는 가용성 TGFβRIII이 곤충 세포에서 생산될 수 있고, 이는 강력한 TGFβ 중화제인 것으로 제시되었다 (Vilchis-Landeros et al., Biochem. J., (2001), 355:215). TGFβRIII의 2개의 개별 결합 도메인 (엔도글린-관련 및 우로모듈린-관련)은 독립적으로 발현될 수 있지만, 이들은 가용성 TGFβRIII의 친화도보다 20 내지 100배 더 낮은 친화도 및 훨씬 감소된 중화 활성을 갖는 것으로 제시되었다 (Mendoza et al., Biochemistry 2009; 48:11755-65). 다른 한편으로는, TGFβRII의 세포외 도메인은 단지 136개의 아미노산 잔기 길이이고, 25-35 kD의 글리코실화 단백질로서 생산될 수 있다. 추가로 재조합 가용성 TGFβRII는 200 pM의 KD로 TGFβ1에 결합하는 것으로 제시되었고, 이는 세포 상의 전장 TGFβRII에 대한 50 pM의 KD와 꽤 유사하다 (Lin et al., J. Biol. Chem. 1995; 270:2747-54). 가용성 TGFβRII-Fc가 항암제로서 시험되었고, 종양 모델에서 이는 확립된 뮤린 악성 중피종 성장을 억제하는 것으로 제시되었다 (Suzuki et al., Clin. Cancer Res., 2004; 10:5907-18). TGFβRII는 TGFβ2에 결합하지 않고, TGFβRIII는 TGFβRII보다 더 낮은 친화도로 TGFβ1 및 3에 결합하기 때문에, TGFβRIII의 엔도글린 도메인과 TGFβRII의 세포외 도메인의 융합 단백질이 박테리아에서 생산되었고, 이는 TGFβRII 또는 RIII보다 더 효과적으로 세포 기반 검정에서 TGFβ1 및 2의 신호전달을 억제하는 것으로 제시되었다 (Verona et al., Protein Eng'g. Des. Sel. 2008; 21:463-73).
TGFβ 리간드의 모든 3가지 이소형을 중화하는 또 다른 접근법은 범-중화 항-TGFβ 항체, 또는 수용체가 TGFβ1, 2 및 3에 결합하는 것을 차단하는 항-수용체 항체를 스크리닝하는 것이다. TGFβ의 모든 이소형에 대해 특이적인 인간 항체인 GC1008이 진행성 악성 흑색종 또는 신세포 암종을 갖는 환자에서 I상/II상 연구 중이다 (Morris et al., J. Clin. Oncol. 2008; 26:9028 (Meeting abstract)). 치료가 안전하고 잘 허용되는 것으로 확인되었지만, 제한된 임상 효능만이 관찰되었고, 따라서 면역학적 효과의 추가의 특징화 없이 항-TGFβ 요법의 중요성을 해석하기는 어려웠다 (Flavell et al., Nat. Rev. Immunol. 2010; 10:554-67). 또한 임상에서 시험된 TGFβ-이소형-특이적 항체가 존재하였다. TGFβ1에 특이적인 항체인 메텔리무맙은 녹내장 수술에 대한 과도한 수술후 반흔형성을 방지하기 위한 치료로서 2상 임상 시험에서 시험되었고; TGFβ2에 특이적인 항체인 레르델리무맙은 3상 연구에서 눈 수술 후, 안전하지만 반흔형성을 개선시키는 데 비효과적인 것으로 확인되었다 (Khaw et al., Ophthalmology 2007; 114:1822-1830). 또한 수용체가 모든 3가지 TGFβ 이소형에 결합하는 것을 차단하는 항-TGFβRII 항체, 예컨대 항-인간 TGFβRII 항체 TR1 및 항-마우스 TGFβRII 항체 MT1은 마우스 모델에서 원발성 종양 성장 및 전이에 대해 일부 치료 효능을 나타내었다 (Zhong et al., Clin. Cancer Res. 2010; 16:1191-205). 그러나, 항체 TR1 (LY3022859)의 최근 I상 연구에서, 25 mg (균일 용량) 이상으로의 용량 증량은, 예방적 치료에도 불구하고, 제어되지 않는 시토카인 방출로 인해 불안전한 것으로 간주되었다 (Tolcher et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 2017; 79:673-680). 지금까지, 종종 꽤 독성인 TGFβ 신호전달의 소분자 억제제를 포함한, TGFβ 표적화 항암 치료에 대한 연구의 대부분은 거의 전임상 단계이고, 수득된 항종양 효능은 제한적이었다 (Calone et al., Exp Oncol. 2012; 34:9-16; Connolly et al., Int. J. Biol. Sci. 2012; 8:964-78).
본 개시내용의 항체-TGFβ 트랩은 TGFβ에 결합할 수 있는 인간 TGFβ 수용체 II (TGFβRII)의 적어도 일부분을 함유하는 이중기능적 단백질이다. 특정 실시양태에서, TGFβ 트랩 폴리펩티드는 TGFβ에 결합할 수 있는 인간 TGFβ 수용체 유형 2 이소형 A (서열식별번호: 8)의 가용성 부분이다. 특정 실시양태에서, TGFβ 트랩 폴리펩티드는 서열식별번호: 8의 아미노산 73-184를 적어도 함유한다. 특정 실시양태에서, TGFβ 트랩 폴리펩티드는 서열식별번호: 8의 아미노산 24-184를 함유한다. 특정 실시양태에서, TGFβ 트랩 폴리펩티드는 TGFβ에 결합할 수 있는 인간 TGFβ 수용체 유형 2 이소형 B (서열식별번호: 9)의 가용성 부분이다. 특정 실시양태에서, TGFβ 트랩 폴리펩티드는 서열식별번호: 9의 아미노산 48-159를 적어도 함유한다. 특정 실시양태에서, TGFβ 트랩 폴리펩티드는 서열식별번호: 9의 아미노산 24-159를 함유한다. 특정 실시양태에서, TGFβ 트랩 폴리펩티드는 서열식별번호: 9의 아미노산 24-105를 함유한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, TGFβ 트랩 폴리펩티드는 서열식별번호: 10, 50, 51, 52, 53 또는 54의 서열을 함유한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항체-TGFβ 트랩은 WO 2018/205985에 개시된 융합 단백질 중 하나이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 상기 공보의 표 2에 열거된 구축물 중 하나, 예컨대 그의 구축물 9 또는 15이다. 다른 실시양태에서, 상기 공보의 서열식별번호: 11의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 12의 경쇄 서열 [각각 본 개시내용의 서열식별번호: 61 및 62에 상응함]을 갖는 항체는 연결 서열 (G4S)xG (여기서 x는 4-5임)를 통해 상기 공보의 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15의 TGFβRII 세포외 도메인 서열 [각각 본 개시내용의 서열식별번호: 50 및 51에 상응함]에 융합된다.
작용 메카니즘
치료 항체에 의한 탈-억제를 위해 T 세포 억제 체크포인트를 표적화하는 접근법은 집중 연구 분야이다 (검토를 위해, 문헌 [Pardoll, Nat. Rev. Cancer 2012, 12:253-264] 참조). 하나의 접근법에서, 항체 모이어티 또는 그의 항원 결합 단편은 T 세포 상의 T 세포 억제 체크포인트 수용체 단백질, 예컨대, 예를 들어, CTLA-4, PD-1, BTLA, LAG-3, TIM-3 또는 LAIR1을 표적화한다. 또 다른 접근법에서, 항체 모이어티는 항원 제시 세포 및 종양 세포 (이들은 자신의 면역 회피를 위해 상기 반대-수용체 중 일부를 끌어들임) 상의 반대-수용체, 예컨대, 예를 들어 PD-L1 (B7-H1), B7-DC, HVEM, TIM-4, B7-H3 또는 B7-H4를 표적화한다.
본 개시내용은 자신의 항체 모이어티 또는 그의 항원 결합 단편을 통해 탈-억제를 위해 T 세포 억제 체크포인트를 표적화하는 항체 TGFβ 트랩을 고려한다. 이를 위해, 본 출원인은 TGFβ 트랩을, 다양한 T 세포 억제 체크포인트 수용체 단백질을 표적화하는 항체, 예컨대 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-TIM-3 및 항-LAG3과 조합하는 것의 항종양 효능을 시험하였다.
프로그램화된 사멸 1 (PD-1)/PD-L1 축은 종양 면역 회피를 위한 중요한 메카니즘이다. 항원을 만성적으로 감지하는 이펙터 T 세포는 PD-1 발현에 의해 표시되는 소진된 표현형을 띠며, 이러한 상태 하에 종양 세포가 PD-L1을 상향조절함으로써 관여한다. 추가적으로, 종양 미세환경에서, 골수 세포, 대식세포, 실질 세포 및 T 세포는 PD-L1을 상향조절한다. 상기 축의 차단이 이들 T 세포에서의 이펙터 기능을 회복시킨다. 항-PD-L1/TGFβ 트랩은, 종양 미세환경에서 아폽토시스 호중구, 골수-유래 억제 세포, T 세포 및 종양을 포함한 세포에 의해 생산된 억제성 시토카인인, TGFβ (1, 2 및 3 이소형)에도 또한 결합한다. 가용성 TGFβRII에 의한 TGFβ의 억제는 CD8+ T 세포 항종양 효과의 증가와 연관된 방식으로 악성 중피종을 감소시켰다. 활성화된 CD4+ T 세포 및 Treg 세포에 의해 생산되는 TGFβ1의 부재는 종양 성장을 억제하며 마우스를 자발성 암으로부터 보호하는 것으로 나타났다. 따라서, TGFβ는 종양 면역 회피에 있어서 중요해 보인다.
TGFβ는 정상 상피 세포에 대해 성장 억제 효과를 가져, 상피 세포 항상성의 조절인자로서 기능하며, 이는 초기 발암 동안 종양 억제인자로서 작용한다. 종양이 악성종양으로 진행됨에 따라, 종양에 대한 TGFβ의 성장 억제 효과는 1종 이상의 TGFβ 경로 신호전달 구성요소에서의 돌연변이를 통해 또는 종양원성 재프로그램화를 통해 소실된다. TGFβ 억제에 대한 감수성이 소실되면, 종양은 계속해서 높은 수준의 TGFβ를 생산하며, 이는 종양 성장을 촉진하는 작용을 한다. TGFβ 시토카인은 다양한 암 유형에서 과다발현되며, 이는 종양 병기와 상관관계가 있다. 종양 미세환경에서 종양 세포 자체, 미성숙 골수 세포, 조절 T 세포 및 기질 섬유모세포를 포함한 많은 유형의 세포가 TGFβ를 생산하고; 이들 세포는 집합적으로 세포외 기질에 TGFβ의 거대 저장소를 생성한다. TGFβ 신호전달은 전이를 촉진하고, 혈관신생을 자극하고, 선천성 및 적응성 항종양 면역을 억제함으로써 종양 진행에 기여한다. 전반적으로 면역억제 인자로서, TGFβ는 활성화된 세포독성 T 세포 및 NK 세포의 이펙터 기능을 직접적으로 하향-조절하며, 나이브 CD4+ T 세포의 면역억제 조절 T 세포 (Treg) 표현형으로의 분화를 강력하게 유도한다. 추가로, TGFβ는 대식세포 및 호중구를, 면역억제 시토카인의 생산과 연관된 상처-치유 표현형으로 분극화시킨다. 치료 전략으로서, TGFβ 활성의 중화는 효과적인 항종양 면역을 회복시키고, 전이를 차단하고, 혈관신생을 억제함으로써 종양 성장을 제어하는 잠재력을 갖는다.
본 개시내용은 TNBC로 진단된 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자를 사용한 표적화된 TGF-β 억제를 위한 투여 레지멘을 제공한다.
PD-1 및 TGFβ 동시 차단은 염증유발 시토카인을 회복시킬 수 있다. 항-PD-L1/TGFβ 트랩은, 예를 들어, 완전 인간 IgG1 항-PD-L1 항체의 각각의 중쇄의 C 말단에 글리신/세린 링커를 통해 공유 연결된 인간 TGFβ 수용체 TGFβRII의 세포외 도메인을 포함한다. 반응은 분명하지만, 효과 크기 증가의 여지가 있는 항-PD-1/PD-L1 부류에 대해 새로 드러난 상황을 고려하면, 보완적 면역 조정 단계의 공동-표적화가 종양 반응을 개선시킬 것이라고 추정된다. 유사한 TGF-표적화제로서, TGFβ1, 2 및 3을 표적화하는 모노클로날 항체인 프레솔리무맙은 흑색종을 갖는 대상체에 대한 I상 시험에서 종양 반응의 초기 증거를 제시하였다.
항-PD-L1 항체
본 개시내용의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자는 관련 기술분야에 기재된, 임의의 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 항-PD-L1 항체, 예를 들어, 29E2A3 항체 (바이오레전드(Biolegend), 카탈로그 번호 329701)는 상업적으로 입수가능하다. 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 항체 단편은 Fab, F(ab')2, scFv 및 Fv 단편을 포함하고, 이는 하기의 추가의 세부사항에 기재되어 있다.
예시적인 항체는 PCT 공개 WO 2013/079174에 기재되어 있다. 이들 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함한 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 여기서
(a) HVR-H1 서열은 X1YX2MX3 (서열식별번호: 21)이고;
(b) HVR-H2 서열은 SIYPSGGX4TFYADX5VKG (서열식별번호: 22)이고;
(c) HVR-H3 서열은 IKLGTVTTVX6Y (서열식별번호: 23)이고;
추가로 여기서: X1은 K, R, T, Q, G, A, W, M, I 또는 S이고; X2는 V, R, K, L, M 또는 I이고; X3은 H, T, N, Q, A, V, Y, W, F 또는 M이고; X4는 F 또는 I이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 E 또는 D이다.
한 실시양태에서, X1은 M, I 또는 S이고; X2는 R, K, L, M 또는 I이고; X3은 F 또는 M이고; X4는 F 또는 I이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 E 또는 D이다.
또 다른 실시양태에서 X1은 M, I 또는 S이고; X2는 L, M 또는 I이고; X3은 F 또는 M이고; X4는 I이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 D이다.
또 다른 실시양태에서, X1은 S이고; X2는 I이고; X3은 M이고; X4는 I이고; X5는 T이고; X6은 D이다.
또 다른 측면에서, 폴리펩티드는 하기 식에 따라 HVR 사이에 병치된 가변 영역 중쇄 프레임워크 서열을 추가로 포함한다: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4).
또 다른 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열 또는 인간 배선 프레임워크 서열로부터 유래된다.
추가 측면에서, 프레임워크 서열 중 적어도 1개는 하기이다:
HC-FR1은 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열식별번호: 24)이고;
HC-FR2는 WVRQAPGKGLEWVS (서열식별번호: 25)이고;
HC-FR3은 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열식별번호: 26)이고;
HC-FR4는 WGQGTLVTVSS (서열식별번호: 27)이다.
추가 측면에서, 중쇄 폴리펩티드는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함한 가변 영역 경쇄와 추가로 조합되고, 여기서:
(a) HVR-L1 서열은 TGTX7X8DVGX9YNYVS (서열식별번호: 28)이고;
(b) HVR-L2 서열은 X10VX11X12RPS (서열식별번호: 29)이고;
(c) HVR-L3 서열은 SSX13TX14X15X16X17RV (서열식별번호: 30)이고;
추가로 여기서: X7은 N 또는 S이고; X8은 T, R 또는 S이고; X9는 A 또는 G이고; X10은 E 또는 D이고; X11은 I, N 또는 S이고; X12는 D, H 또는 N이고; X13은 F 또는 Y이고; X14는 N 또는 S이고; X15는 R, T 또는 S이고; X16은 G 또는 S이고; X17은 I 또는 T이다.
또 다른 실시양태에서, X7은 N 또는 S이고; X8은 T, R 또는 S이고; X9는 A 또는 G이고; X10은 E 또는 D이고; X11은 N 또는 S이고; X12는 N이고; X13은 F 또는 Y이고; X14는 S이고; X15는 S이고; X16은 G 또는 S이고; X17은 T이다.
또 다른 실시양태에서, X7은 S이고; X8은 S이고; X9는 G이고; X10은 D이고; X11은 S이고; X12는 N이고; X13은 Y이고; X14는 S이고; X15는 S이고; X16은 S이고; X17은 T이다.
추가 측면에서, 경쇄는 하기 식에 따라 HVR 사이에 병치된 가변 영역 경쇄 프레임워크 서열을 추가로 포함한다: (LC-FR1MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열 또는 인간 배선 프레임워크 서열로부터 유래된다.
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 람다 경쇄 서열이다.
추가 측면에서, 프레임워크 서열 중 적어도 1개는 하기이다:
LC-FR1은 QSALTQPASVSGSPGQSITISC (서열식별번호: 31)이고;
LC-FR2는 WYQQHPGKAPKLMIY (서열식별번호: 32)이고;
LC-FR3은 GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC (서열식별번호: 33)이고;
LC-FR4는 FGTGTKVTVL (서열식별번호: 34)이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서:
(a) 중쇄는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 여기서 추가로: (i) HVR-H1 서열은 X1YX2MX3 (서열식별번호: 21)이고; (ii) HVR-H2 서열은 SIYPSGGX4TFYADX5VKG (서열식별번호: 22)이고; (iii) HVR-H3 서열은 IKLGTVTTVX6Y (서열식별번호: 23)이고;
(b) 경쇄는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고, 여기서 추가로: (iv) HVR-L1 서열은 TGTX7X8DVGX9YNYVS (서열식별번호: 28)이고; (v) HVR-L2 서열은 X10VX11X12RPS (서열식별번호: 29)이고; (vi) HVR-L3 서열은 SSX13TX14X15X16X17RV (서열식별번호: 30)이고; 여기서: X1은 K, R, T, Q, G, A, W, M, I 또는 S이고; X2는 V, R, K, L, M 또는 I이고; X3은 H, T, N, Q, A, V, Y, W, F 또는 M이고; X4는 F 또는 I이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 E 또는 D이고; X7은 N 또는 S이고; X8은 T, R 또는 S이고; X9는 A 또는 G이고; X10은 E 또는 D이고; X11은 I, N 또는 S이고; X12는 D, H 또는 N이고; X13은 F 또는 Y이고; X14는 N 또는 S이고; X15는 R, T 또는 S이고; X16은 G 또는 S이고; X17은 I 또는 T이다.
한 실시양태에서, X1은 M, I 또는 S이고; X2는 R, K, L, M 또는 I이고; X3은 F 또는 M이고; X4는 F 또는 I이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 E 또는 D이고; X7은 N 또는 S이고; X8은 T, R 또는 S이고; X9는 A 또는 G이고; X10은 E 또는 D이고; X11은 N 또는 S이고; X12는 N이고; X13은 F 또는 Y이고; X14는 S이고; X15는 S이고; X16은 G 또는 S이고; X17은 T이다.
또 다른 실시양태에서, X1은 M, I 또는 S이고; X2는 L, M 또는 I이고; X3은 F 또는 M이고; X4는 I이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 D이고; X7은 N 또는 S이고; X8은 T, R 또는 S이고; X9는 A 또는 G이고; X10은 E 또는 D이고; X11은 N 또는 S이고; X12는 N이고; X13은 F 또는 Y이고; X14는 S이고; X15는 S이고; X16은 G 또는 S이고; X17은 T이다.
또 다른 실시양태에서, X1은 S이고; X2는 I이고; X3은 M이고; X4는 I이고; X5는 T이고; X6은 D이고; X7은 S이고; X8은 S이고; X9는 G이고; X10은 D이고; X11은 S이고; X12는 N이고; X13은 Y이고; X14는 S이고; X15는 S이고; X16은 S이고; X17은 T이다.
추가 측면에서, 중쇄 가변 영역은 하기와 같이 HVR 사이에 병치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함하고: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), 경쇄 가변 영역은 하기와 같이 HVR 사이에 병치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1 MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).
추가 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 컨센서스 프레임워크 서열 또는 인간 배선 서열로부터 유래된다.
추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기이다:
HC-FR1은 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열식별번호: 24)이고;
HC-FR2는 WVRQAPGKGLEWVS (서열식별번호: 25)이고;
HC-FR3은 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열식별번호: 26)이고;
HC-FR4는 WGQGTLVTVSS (서열식별번호: 27)이다.
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 람다 경쇄 서열이다.
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기이다:
LC-FR1은 QSALTQPASVSGSPGQSITISC (서열식별번호: 31)이고;
LC-FR2는 WYQQHPGKAPKLMIY (서열식별번호: 32)이고;
LC-FR3은 GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC (서열식별번호: 33)이고;
LC-FR4는 FGTGTKVTVL (서열식별번호: 34)이다.
추가 측면에서, 중쇄 가변 영역 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편은 적어도 CH1 도메인을 추가로 포함한다.
보다 구체적 측면에서, 중쇄 가변 영역 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편은 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 가변 영역 경쇄, 항체 또는 항체 단편은 CL 도메인을 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 항체는 CH1, CH2, CH3, 및 CL 도메인을 추가로 포함한다.
추가의 구체적 측면에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 구체적 측면에서, 인간 또는 뮤린 불변 영역은 IgG1이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 특색으로 하며, 여기서:
(a) 중쇄는 SYIMM (서열식별번호: 35), SIYPSGGITFYADTVKG (서열식별번호: 36), 및 IKLGTVTTVDY (서열식별번호: 37)에 대해 각각 적어도 80%의 전체 서열 동일성을 갖는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고,
(b) 경쇄는 TGTSSDVGGYNYVS (서열식별번호: 38), DVSNRPS (서열식별번호: 39), 및 SSYTSSSTRV (서열식별번호: 40)에 대해 각각 적어도 80%의 전체 서열 동일성을 갖는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다.
구체적 측면에서, 서열 동일성은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 특색으로 하며, 여기서:
(a) 중쇄는 MYMMM (서열식별번호: 41), SIYPSGGITFYADSVKG (서열식별번호: 42), 및 IKLGTVTTVDY (서열식별번호: 37)에 대해 각각 적어도 80%의 전체 서열 동일성을 갖는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함하고,
(b) 경쇄는 TGTSSDVGAYNYVS (서열식별번호: 43), DVSNRPS (서열식별번호: 39), 및 SSYTSSSTRV (서열식별번호: 40)에 대해 각각 적어도 80%의 전체 서열 동일성을 갖는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함한다.
구체적 측면에서, 서열 동일성은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다.
추가 측면에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항체 단편에서, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3의 서열과 비교하여, 적어도 하기와 같이 밑줄로 강조된 아미노산은 변화없이 유지되고:
(a) HVR-H1에서 SYIMM (서열식별번호: 35),
(b) HVR-H2에서 SIYPSGGITFYADTVKG (서열식별번호: 36),
(c) HVR-H3에서 IKLGTVTTVDY (서열식별번호: 37);
추가로 여기서, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 서열과 비교하여, 적어도 하기와 같이 밑줄로 강조된 아미노산은 변화없이 유지된다:
(a) HVR-L1 TGTSSDVGGYNYVS (서열식별번호: 38)
(b) HVR-L2 DVSNRPS (서열식별번호: 39)
(c) HVR-L3 SSYTSSSTRV (서열식별번호: 40).
또 다른 측면에서, 중쇄 가변 영역은 하기와 같이 HVR 사이에 병치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함하고: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), 경쇄 가변 영역은 하기와 같이 HVR 사이에 병치된 1개 이상의 프레임워크 서열을 포함한다: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).
또 다른 측면에서, 프레임워크 서열은 인간 배선 서열로부터 유래된다.
추가 측면에서, 중쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기이다:
HC-FR1은 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열식별번호: 24)이고;
HC-FR2는 WVRQAPGKGLEWVS (서열식별번호: 25)이고;
HC-FR3은 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열식별번호: 26)이고;
HC-FR4는 WGQGTLVTVSS (서열식별번호: 27)이다.
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열은 람다 경쇄 서열로부터 유래된다.
추가 측면에서, 경쇄 프레임워크 서열 중 1개 이상은 하기이다:
LC-FR1은 QSALTQPASVSGSPGQSITISC (서열식별번호: 31)이고;
LC-FR2는 WYQQHPGKAPKLMIY (서열식별번호: 32)이고;
LC-FR3은 GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC (서열식별번호: 33)이고;
LC-FR4는 FGTGTKVTVL (서열식별번호: 34)이다.
추가의 구체적 측면에서, 항체는 인간 또는 뮤린 불변 영역을 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 특색으로 하며, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMVWRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADWKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 44),
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSN RPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL (서열식별번호: 45).
다양한 실시양태에서, 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 44에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나; 또는 중쇄 서열은 서열식별번호: 44를 포함하고 경쇄 서열은 서열식별번호: 45를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 제공하며, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEVWSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWG QGTLVTVSS (서열식별번호: 46),
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNR PSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL (서열식별번호: 47).
다양한 실시양태에서, 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 46에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나; 또는 중쇄 서열은 서열식별번호: 46을 포함하고 경쇄 서열은 서열식별번호: 47을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 인간, 마우스 또는 시노몰구스 원숭이 PD-L1에 결합한다. 구체적 측면에서, 항체는 인간, 마우스 또는 시노몰구스 원숭이 PD-L1과 각각의 인간, 마우스 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1 수용체 사이의 상호작용을 차단할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 인간 PD-L1에 5x10-9 M 이하의 KD, 바람직하게는 2x10-9 M 이하의 KD, 보다 더 바람직하게는 1x10-9 M 이하의 KD로 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 PD-L1의 잔기 Y56 및 D61을 포함하는 기능적 에피토프에 결합하는 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
구체적 측면에서, 기능적 에피토프는 인간 PD-L1의 E58, E60, Q66, R113, 및 M115를 추가로 포함한다.
보다 구체적 측면에서, 항체는 인간 PD-L1의 잔기 54-66 및 112-122를 포함하는 입체형태적 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 PD-L1에의 결합에 대해 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용에 따른 항체와 교차-경쟁하는 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 임의의 상기 기재된 항-PD-L1 항체를, 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체와 조합하여 포함하는 단백질 및 폴리펩티드를 특색으로 한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 특색으로 한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 항-PD-L1 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서:
(a) 중쇄는 SYIMM (서열식별번호: 35), SIYPSGGITFYADTVKG (서열식별번호: 36), 및 IKLGTVTTVDY (서열식별번호: 37)에 대해 각각 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3 서열을 포함하거나, 또는
(b) 경쇄는 TGTSSDVGGYNYVS (서열식별번호: 38), DVSNRPS (서열식별번호: 39), 및 SSYTSSSTRV (서열식별번호: 40)에 대해 각각 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 서열을 포함한다.
구체적 측면에서, 서열 동일성은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다.
추가 측면에서, 중쇄에 대한 핵산 서열은 하기이고:
Figure pct00001
경쇄에 대한 핵산 서열은 하기이다:
Figure pct00002
항-PD-L1/TGFβ 트랩에 사용될 수 있는 추가의 예시적인 항-PD-L1 항체는 미국 특허 출원 공개 US 2010/0203056에 기재되어 있다. 본 개시내용의 한 실시양태에서, 항체 모이어티는 YW243.55S70이다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 항체 모이어티는 MPDL3289A이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체 모이어티를 특색으로 하며, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 12),
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열식별번호: 13).
다양한 실시양태에서, 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 12에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나; 또는 중쇄 서열은 서열식별번호: 12를 포함하고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체 모이어티를 특색으로 하며, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA (서열식별번호: 14),
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR (서열식별번호: 13).
다양한 실시양태에서, 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 14에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나; 또는 중쇄 서열은 서열식별번호: 14를 포함하고 경쇄 서열은 서열식별번호: 13을 포함한다.
항-PD-L1/TGFβ 트랩에 사용될 수 있는 추가의 예시적인 항-PD-L1 항체는 미국 특허 출원 공개 US 2018/0334504에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체 모이어티를 특색으로 하며, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS (서열식별번호: 55),
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 56).
다양한 실시양태에서, 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 55에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나; 또는 중쇄 서열은 서열식별번호: 55를 포함하고 경쇄 서열은 서열식별번호: 56을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체 모이어티를 특색으로 하며, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS (서열식별번호: 57),
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK (서열식별번호: 58).
다양한 실시양태에서, 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 57에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나; 또는 중쇄 서열은 서열식별번호: 57을 포함하고 경쇄 서열은 서열식별번호: 58을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체 모이어티를 특색으로 하며, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 59),
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 60).
다양한 실시양태에서, 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 59에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나; 또는 중쇄 서열은 서열식별번호: 59를 포함하고 경쇄 서열은 서열식별번호: 60을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체 모이어티를 특색으로 하며, 여기서:
(a) 중쇄 서열은 하기 중쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖고:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGA (서열식별번호: 61),
(b) 경쇄 서열은 하기 경쇄 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다:
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 62).
다양한 실시양태에서, 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 86% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 87% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 88% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 89% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 91% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 92% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 93% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 94% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖거나; 중쇄 서열은 서열식별번호: 61에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나; 또는 중쇄 서열은 서열식별번호: 61을 포함하고 경쇄 서열은 서열식별번호: 62를 포함한다.
항-PD-L1/TGFβ 트랩에 사용될 수 있는 추가의 예시적인 항-PD-L1 항체는 미국 특허 공개 US 7,943,743에 기재되어 있다.
본 개시내용의 한 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 MDX-1105이다.
특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 MEDI-4736이다.
불변 영역
본 개시내용의 단백질 및 펩티드는 이뮤노글로불린의 불변 영역, 또는 불변 영역의 단편, 유사체, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 불변 영역은 인간 이뮤노글로불린 중쇄, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 다른 부류로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 불변 영역은 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 불변 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하거나, 또는 힌지-CH2-CH3을 포함한다. 대안적으로, 불변 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 친화도를 감소시키거나 또는 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 예를 들어, 불변 영역은 IgG 중쇄의 불변 영역 내의 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 IgG1의 Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Asn297, 또는 Pro331 (아미노산은 EU 명명법에 따라 넘버링됨)에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 함유한다. 특정한 실시양태에서, 불변 영역은 IgG1의 Asn297에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 함유한다. 대안적 실시양태에서, 불변 영역은 IgG1의 Leu281, Leu282, Gly283, Gly284, Asn344, 또는 Pro378에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 함유한다.
일부 실시양태에서, 불변 영역은 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄로부터 유래된 CH2 도메인을 함유한다. 바람직하게는, CH2 도메인은 CH2 도메인 내의 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유한다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 IgG2 또는 IgG4 중쇄의 CH2 도메인 내의 Gln-Phe-Asn-Ser (서열식별번호: 15) 아미노산 서열 내의 아스파라긴을 변경시킨다. 바람직하게는, 돌연변이는 아스파라긴을 글루타민으로 변화시킨다. 대안적으로, 돌연변이는 Gln-Phe-Asn-Ser (서열식별번호: 15) 아미노산 서열 내의 페닐알라닌 및 아스파라긴 둘 다를 변경시킨다. 한 실시양태에서, Gln-Phe-Asn-Ser (서열식별번호: 15) 아미노산 서열은 Gln-Ala-Gln-Ser (서열식별번호: 16) 아미노산 서열로 대체된다. Gln-Phe-Asn-Ser (서열식별번호: 15) 아미노산 서열 내의 아스파라긴은 IgG1의 Asn297에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 불변 영역은 CH2 도메인, 및 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 힌지 영역은 이뮤노글로불린 중쇄, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 부류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 적합한 부류로부터 유래된다. 보다 바람직하게는, 힌지 영역은 인간 IgG1 중쇄로부터 유래된다. 한 실시양태에서, IgG1 힌지 영역의 Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys (서열식별번호: 17) 아미노산 서열 내의 시스테인이 변경된다. 특정 실시양태에서, Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys (서열식별번호: 17) 아미노산 서열은 Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys (서열식별번호: 18) 아미노산 서열로 대체된다. 특정 실시양태에서, 불변 영역은 제1 항체 이소형으로부터 유래된 CH2 도메인 및 제2 항체 이소형으로부터 유래된 힌지 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, CH2 도메인은 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄로부터 유래되는 한편, 힌지 영역은 변경된 인간 IgG1 중쇄로부터 유래된다.
Fc 부분과 비-Fc 부분의 접합부 근처의 아미노산의 변경은 Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 극적으로 증가시킬 수 있다 (PCT 공개 WO 0158957, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 본 개시내용의 단백질 또는 폴리펩티드의 접합부 영역은, 이뮤노글로불린 중쇄 및 에리트로포이에틴의 자연-발생 서열 대비, 바람직하게는 접합부 지점으로부터 약 10개 아미노산 이내에 존재하는 변경을 함유할 수 있다. 이들 아미노산 변화는 소수성의 증가를 유발할 수 있다. 한 실시양태에서, 불변 영역은 C-말단 리신 잔기가 대체된 IgG 서열로부터 유래된다. 바람직하게는, 혈청 반감기를 추가로 증가시키기 위해 IgG 서열의 C-말단 리신은 비-리신 아미노산, 예컨대 알라닌 또는 류신으로 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 불변 영역은 잠재적인 접합부 T-세포 에피토프를 제거하기 위해 불변 영역의 C-말단 근처의 Leu-Ser-Leu-Ser (서열식별번호: 19) 아미노산 서열이 변경된 IgG 서열로부터 유래된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, Leu-Ser-Leu-Ser (서열식별번호: 19) 아미노산 서열은 Ala-Thr-Ala-Thr (서열식별번호: 20) 아미노산 서열로 대체된다. 다른 실시양태에서, Leu-Ser-Leu-Ser (서열식별번호: 19) 절편 내의 아미노산은 다른 아미노산 예컨대 글리신 또는 프롤린으로 대체된다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 이뮤노글로불린 부류 분자의 C-말단 근처의 Leu-Ser-Leu-Ser (서열식별번호: 19) 절편의 아미노산 치환을 생성하는 상세한 방법이 미국 특허 공개 번호 20030166877에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용을 위한 적합한 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 다른 이뮤노글로불린 부류로부터 유래될 수 있다. IgG1 힌지 영역은 3개의 시스테인을 갖고, 이 중 2개는 이뮤노글로불린의 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 수반된다. 이들 동일한 시스테인은 Fc 부분 사이에 효율적이고 일관적인 디술피드 결합 형성을 가능하게 한다. 따라서, 본 개시내용의 힌지 영역은 IgG1, 예를 들어 인간 IgG1로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG1 힌지 영역 내의 제1 시스테인은 또 다른 아미노산, 바람직하게는 세린으로 돌연변이된다. IgG2 이소형 힌지 영역은 4개의 디술피드 결합을 갖고, 이는 재조합 시스템에서 분비 동안 올리고머화 및 가능하게는 부정확한 디술피드 결합을 촉진하는 경향이 있다. 적합한 힌지 영역이 IgG2 힌지로부터 유래될 수 있고; 바람직하게는 처음 2개의 시스테인이 각각 또 다른 아미노산으로 돌연변이된다. IgG4의 힌지 영역은 쇄간 디술피드 결합을 비효율적으로 형성하는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 본 개시내용을 위한 적합한 힌지 영역이, 바람직하게는 중쇄-유래 모이어티 사이의 디술피드 결합의 정확한 형성을 증진시키는 돌연변이를 함유하는 IgG4 힌지 영역으로부터 유래될 수 있다 (Angal S., et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8).
본 개시내용에 따르면, 불변 영역은 상이한 항체 이소형으로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 힌지 영역을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 하이브리드 불변 영역일 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 불변 영역은 IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 IgG1로부터 유래된 돌연변이체 힌지 영역을 함유한다. 대안적으로, 또 다른 IgG 하위부류로부터의 돌연변이체 힌지 영역이 하이브리드 불변 영역에 사용된다. 예를 들어, 2개의 중쇄 사이의 효율적인 디술피드 결합을 가능하게 하는 IgG4 힌지의 돌연변이체 형태가 사용될 수 있다. 또한 처음 2개의 시스테인이 각각 또 다른 아미노산으로 돌연변이된 IgG2 힌지로부터 돌연변이체 힌지가 유래될 수 있다. 이러한 하이브리드 불변 영역의 어셈블리는 미국 특허 공개 번호 20030044423에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용에 따르면, 불변 영역은 본원에 기재된 1개 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. Fc 부분에서의 돌연변이의 조합은 이중기능적 분자의 연장된 혈청 반감기 및 증가된 생체내 효력에 대해 상가적 또는 상승작용적 효과를 가질 수 있다. 따라서, 하나의 예시적 실시양태에서, 불변 영역은 (i) Leu-Ser-Leu-Ser (서열식별번호: 19) 아미노산 서열이 Ala-Thr-Ala-Thr (서열식별번호: 20) 아미노산 서열로 대체된 IgG 서열로부터 유래된 영역; (ii) 리신 대신 C-말단 알라닌 잔기; (iii) 상이한 항체 이소형으로부터 유래된 CH2 도메인 및 힌지 영역, 예를 들어, IgG2 CH2 도메인 및 변경된 IgG1 힌지 영역; 및 (iv) IgG2-유래 CH2 도메인 내의 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이, 예를 들어, IgG2-유래 CH2 도메인 내의 Gln-Phe-Asn-Ser (서열식별번호: 15) 아미노산 서열 대신 Gln-Ala-Gln-Ser (서열식별번호: 16) 아미노산 서열을 함유할 수 있다.
항체 단편
본 개시내용의 단백질 및 폴리펩티드는 또한 항체의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 예시적인 항체 단편은 scFv, Fv, Fab, F(ab')2, 및 단일 도메인 VHH 단편 예컨대 낙타류 기원의 단편을 포함한다.
단일쇄 항체 (scFv)로도 공지되어 있는 단일쇄 항체 단편은 전형적으로 항원 또는 수용체에 결합하는 재조합 폴리펩티드이고; 이들 단편은 1개 이상의 상호연결 링커의 존재 또는 부재 하에 항체 가변 경쇄 서열 (VL)의 적어도 1개의 단편에 테더링된 항체 가변 중쇄 아미노산 서열 (VH)의 적어도 1개의 단편을 함유한다. 이러한 링커는 VL 및 VH 도메인이 연결되면 VL 및 VH 도메인의 적절한 3차원 폴딩이 발생하는 것을 확실하게 하여 단일쇄 항체 단편이 유래되는 전체 항체의 표적 분자 결합-특이성을 유지하도록 선택된 짧은 가요성 펩티드일 수 있다. 일반적으로, VL 및 VH 서열의 카르복실 말단이 이러한 펩티드 링커에 의해 상보적 VL 및 VH 서열의 아미노산 말단에 공유 연결된다. 분자 클로닝, 항체 파지 디스플레이 라이브러리 또는 유사한 기술에 의해 단일쇄 항체 단편이 생성될 수 있다. 이들 단백질은 진핵 세포 또는 박테리아를 포함한 원핵 세포에서 생산될 수 있다.
단일쇄 항체 단편은 본 명세서에 기재된 전체 항체의 가변 영역 또는 CDR 중 적어도 1개를 갖는 아미노산 서열을 함유하지만, 그러한 항체의 불변 도메인 중 일부 또는 모두는 결여되어 있다. 이들 불변 도메인은 항원 결합에 필요하지 않지만, 전체 항체의 구조의 주요 부분을 구성한다. 따라서 단일쇄 항체 단편은 불변 도메인의 일부 또는 모두를 함유하는 항체를 사용하는 것과 연관된 문제 중 일부를 극복할 수 있다. 예를 들어, 단일쇄 항체 단편은 생물학적 분자와 중쇄 불변 영역 사이의 바람직하지 않은 상호작용, 또는 다른 원치 않는 생물학적 활성이 없는 경향이 있다. 추가적으로, 단일쇄 항체 단편은 전체 항체보다 상당히 더 작고, 따라서 전체 항체보다 더 큰 모세관 투과성을 가져, 단일쇄 항체 단편이 표적 항원-결합 부위에 보다 효율적으로 국재화하고 결합하게 할 수 있다. 또한, 항체 단편은 원핵 세포에서 비교적 대규모로 생산될 수 있어서, 그의 생산을 용이하게 할 수 있다. 또한, 단일쇄 항체 단편의 비교적 작은 크기는 그것이 수용자에서 면역 반응을 유발할 가능성을 전체 항체보다 더 낮게 한다.
전체 항체의 것과 동일하거나 대등한 결합 특징을 갖는 항체 단편이 또한 존재할 수 있다. 이러한 단편은 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편 중 하나 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 항체 단편은 전체 항체의 모든 6개의 CDR을 함유할 수 있지만, 이러한 영역 모두보다 적은, 예컨대 3, 4 또는 5개의 CDR을 함유하는 단편이 또한 기능적이다.
제약 조성물
본 개시내용은 또한 치료 유효량의 본원에 기재된 단백질을 함유하는 제약 조성물을 특색으로 한다. 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용을 위해 제제화될 수 있다. 1종 이상의 생리학상 허용되는 부형제 또는 담체가 또한 적절한 제제를 위해 조성물 내에 포함될 수 있다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985]에서 확인된다. 약물 전달 방법의 간략한 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Langer (Science 249:1527-1533, 1990)]을 참조한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 500 mg - 2400 mg의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 포함하는, TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 정맥내 약물 전달 제제를 제공하고, 제1 폴리펩티드는 (a) 적어도, 인간 단백질 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 영역; 및 (b) 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)에 결합할 수 있는 인간 형질전환 성장 인자 β 수용체 II (TGFβRII) 또는 그의 단편을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 적어도, PD-L1에 결합하는 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하고, 제1 폴리펩티드의 중쇄 및 제2 폴리펩티드의 경쇄는, 조합될 때, PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질 산물은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질 산물은 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
본 개시내용의 특정 실시양태에서, TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 정맥내 약물 전달 제제는 약 1200 mg 내지 약 2400 mg 용량 (예를 들어, 약 1200 mg 내지 약 2300 mg, 약 1200 mg 내지 약 2200 mg, 약 1200 mg 내지 약 2100 mg, 약 1200 mg 내지 약 2000 mg, 약 1200 mg 내지 약 1900 mg, 약 1200 mg 내지 약 1800 mg, 약 1200 mg 내지 약 1700 mg, 약 1200 mg 내지 약 1600 mg, 약 1200 mg 내지 약 1500 mg, 약 1200 mg 내지 약 1400 mg, 약 1200 mg 내지 약 1300 mg, 약 1300 mg 내지 약 2400 mg, 약 1400 mg 내지 약 2400 mg, 약 1500 mg 내지 약 2400 mg, 약 1600 mg 내지 약 2400 mg, 약 1700 mg 내지 약 2400 mg, 약 1800 mg 내지 약 2400 mg, 약 1900 mg 내지 약 2400 mg, 약 2000 mg 내지 약 2400 mg, 약 2100 mg 내지 약 2400 mg, 약 2200 mg 내지 약 2400 mg, 또는 약 2300 mg 내지 약 2400 mg)의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 약 2100 내지 약 2000 mg 용량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 약 2100 mg 용량의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 본 개시내용의 단백질 산물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 2100 mg 용량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 약 1200 mg 용량의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 본 개시내용의 단백질 산물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 1200 mg 용량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 약 1800 mg 용량의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 본 개시내용의 단백질 산물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 1800 mg 용량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 약 2400 mg 용량의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 본 개시내용의 단백질 산물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 약 2400 mg 용량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 2400 mg 용량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 1800 mg 용량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 2100 mg 용량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정맥내 약물 전달 제제는 2400 mg 용량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 정맥내 약물 전달 제제는 약 1200 mg 내지 약 3000 mg (예를 들어, 약 1200 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg 내지 약 2900 mg, 약 1200 mg 내지 약 2800 mg, 약 1200 mg 내지 약 2700 mg, 약 1200 mg 내지 약 2600 mg, 약 1200 mg 내지 약 2500 mg, 약 1200 mg 내지 약 2400 mg, 약 1200 mg 내지 약 2300 mg, 약 1200 mg 내지 약 2200 mg, 약 1200 mg 내지 약 2100 mg, 약 1200 mg 내지 약 2000 mg, 약 1200 mg 내지 약 1900 mg, 약 1200 mg 내지 약 1800 mg, 약 1200 mg 내지 약 1700 mg, 약 1200 mg 내지 약 1600 mg, 약 1200 mg 내지 약 1500 mg, 약 1200 mg 내지 약 1400 mg, 약 1200 mg 내지 약 1300 mg, 약 1300 mg 내지 약 3000 mg, 약 1400 mg 내지 약 3000 mg, 약 1500 mg 내지 약 3000 mg, 약 1600 mg 내지 약 3000 mg, 약 1700 mg 내지 약 3000 mg, 약 1800 mg 내지 약 3000 mg, 약 1900 mg 내지 약 3000 mg, 약 2000 mg 내지 약 3000 mg, 약 2100 mg 내지 약 3000 mg, 약 2200 mg 내지 약 3000 mg, 약 2300 mg 내지 약 3000 mg, 약 2400 mg 내지 약 3000 mg, 약 2500 mg 내지 약 3000 mg, 약 2600 mg 내지 약 3000 mg, 약 2700 mg 내지 약 3000 mg, 약 2800 mg 내지 약 3000 mg, 약 2900 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 약 2500 mg, 약 2600 mg, 약 2700 mg, 약 2800 mg, 약 2900 mg, 또는 약 3000 mg)의 본 개시내용의 단백질 산물 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 정맥내 약물 전달 제제는 약 1200 mg 내지 약 3000 mg (예를 들어, 약 1200 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg 내지 약 2900 mg, 약 1200 mg 내지 약 2800 mg, 약 1200 mg 내지 약 2700 mg, 약 1200 mg 내지 약 2600 mg, 약 1200 mg 내지 약 2500 mg, 약 1200 mg 내지 약 2400 mg, 약 1200 mg 내지 약 2300 mg, 약 1200 mg 내지 약 2200 mg, 약 1200 mg 내지 약 2100 mg, 약 1200 mg 내지 약 2000 mg, 약 1200 mg 내지 약 1900 mg, 약 1200 mg 내지 약 1800 mg, 약 1200 mg 내지 약 1700 mg, 약 1200 mg 내지 약 1600 mg, 약 1200 mg 내지 약 1500 mg, 약 1200 mg 내지 약 1400 mg, 약 1200 mg 내지 약 1300 mg, 약 1300 mg 내지 약 3000 mg, 약 1400 mg 내지 약 3000 mg, 약 1500 mg 내지 약 3000 mg, 약 1600 mg 내지 약 3000 mg, 약 1700 mg 내지 약 3000 mg, 약 1800 mg 내지 약 3000 mg, 약 1900 mg 내지 약 3000 mg, 약 2000 mg 내지 약 3000 mg, 약 2100 mg 내지 약 3000 mg, 약 2200 mg 내지 약 3000 mg, 약 2300 mg 내지 약 3000 mg, 약 2400 mg 내지 약 3000 mg, 약 2500 mg 내지 약 3000 mg, 약 2600 mg 내지 약 3000 mg, 약 2700 mg 내지 약 3000 mg, 약 2800 mg 내지 약 3000 mg, 약 2900 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 약 2500 mg, 약 2600 mg, 약 2700 mg, 약 2800 mg, 약 2900 mg, 또는 약 3000 mg)의 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물; 또는 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 정맥내 약물 전달 제제는 약 1200 mg, 약 1225 mg, 약 1250 mg, 약 1275 mg, 약 1300 mg, 약 1325 mg, 약 1350 mg, 약 1375 mg, 약 1400 mg, 약 1425 mg, 약 1450 mg, 약 1475 mg, 약 1500 mg, 약 1525 mg, 약 1550 mg, 약 1575 mg, 약 1600 mg, 약 1625 mg, 약 1650 mg, 약 1675 mg, 약 1700 mg, 약 1725 mg, 약 1750 mg, 약 1775 mg, 약 1800 mg, 약 1825 mg, 약 1850 mg, 약 1875 mg, 약 1900 mg, 약 1925 mg, 약 1950 mg, 약 1975 mg, 약 2000 mg, 약 2025 mg, 약 2050 mg, 약 2075 mg, 약 2100 mg, 약 2125 mg, 약 2150 mg, 약 2175 mg, 약 2200 mg, 약 2225 mg, 약 2250 mg, 약 2275 mg, 약 2300 mg, 약 2325 mg, 약 2350 mg, 약 2375 mg, 또는 약 2400 mg의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩)을 포함할 수 있다.
TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 정맥내 약물 전달 제제는 백, 펜 또는 시린지에 함유될 수 있다. 특정 실시양태에서, 백은 튜브 및/또는 바늘을 포함하는 채널에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 동결건조 제제 또는 액체 제제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 냉동-건조 (동결건조)될 수 있고 약 12-60개의 바이알에 함유될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 냉동-건조될 수 있고 냉동-건조된 제제의 약 45 mg이 1개의 바이알에 함유될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 40 mg - 약 100 mg의 냉동-건조된 제제가 1개의 바이알에 함유될 수 있다. 특정 실시양태에서, 12, 27 또는 45개의 바이알로부터의 냉동 건조 제제를 합하여 정맥내 약물 제제 내 치료 용량의 단백질을 수득한다. 특정 실시양태에서, 제제는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물; 또는 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물의 액체 제제일 수 있고; 약 250 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알 (예를 들어, 약 250 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1900 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1800 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1700 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1600 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1500 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1400 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1300 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1200 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1100 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 1000 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 900 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 800 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 700 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 600 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 500 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 400 mg/바이알, 약 250 mg/바이알 내지 약 300 mg/바이알, 약 300 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 400 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 500 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 600 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 700 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 800 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 900 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 1000 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 1100 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 1200 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 1300 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 1400 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 1500 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 1600 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 1700 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알, 약 1800 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알 또는 약 1900 mg/바이알 내지 약 2000 mg/바이알)로 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 액체 제제일 수 있고, 약 600 mg/바이알로 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 액체 제제일 수 있고, 약 1200 mg/바이알로 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 액체 제제일 수 있고, 약 1800 mg/바이알로 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 액체 제제일 수 있고, 약 2400 mg/바이알로 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 액체 제제일 수 있고, 약 250 mg/바이알로 저장될 수 있다.
본 개시내용은 TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 제제를 형성하는, 완충 용액 중에 치료 유효량의 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩)을 포함하는 액체 수성 제약 제제를 제공한다.
TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이들 조성물은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용되도록 패키징될 수 있거나, 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 조합된다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다. 생성된 고체 형태의 조성물은 다수의 단일 용량 단위로 패키징될 수 있으며, 이들 각각은 고정 양의 상기 언급된 작용제 또는 작용제들을 함유한다. 고체 형태의 조성물은 또한 가변적인 양으로 용기에 패키징될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것))을, 만니톨, 시트르산 1수화물, 시트르산나트륨, 인산이나트륨 2수화물, 인산이수소나트륨 2수화물, 염화나트륨, 폴리소르베이트 80, 물, 및 수산화나트륨과 조합하여 포함하는, 연장된 보관 수명을 갖는, TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 제제를 제공한다.
특정 실시양태에서, pH-완충 용액 중 본 개시내용의 단백질 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것; 또는 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물)을 포함하는, TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 수성 제제가 제조된다. 본 발명의 완충제는 약 4 내지 약 8, 예를 들어, 약 4 내지 약 8, 약 4.5 내지 약 8, 약 5 내지 약 8, 약 5.5 내지 약 8, 약 6 내지 약 8, 약 6.5 내지 약 8, 약 7 내지 약 8, 약 7.5 내지 약 8, 약 4 내지 약 7.5, 약 4.5 내지 약 7.5, 약 5 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 6 내지 약 7.5, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 4 내지 약 7, 약 4.5 내지 약 7, 약 5 내지 약 7, 약 5.5 내지 약 7, 약 6 내지 약 7, 약 4 내지 약 6.5, 약 4.5 내지 약 6.5, 약 5 내지 약 6.5, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 4 내지 약 6.0, 약 4.5 내지 약 6.0, 약 5 내지 약 6, 또는 약 4.8 내지 약 5.5 범위의 pH를 가질 수 있거나, 또는 약 5.0 내지 약 5.2의 pH를 가질 수 있다. 상기 열거된 pH의 중간 범위가 또한 본 개시내용의 일부이도록 의도된다. 예를 들어, 상한치 및/또는 하한치로서 임의의 상기 열거된 값의 조합을 사용하는 값의 범위가 포함되도록 의도된다. 상기 범위 내에서 pH를 제어할 완충제의 예는 아세테이트 (예를 들어 아세트산나트륨), 숙시네이트 (예컨대 숙신산나트륨), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기 산 완충제를 포함한다.
특정 실시양태에서, TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 제제는 약 4 내지 약 8 범위의 pH를 유지하기 위해 시트레이트 및 포스페이트를 함유하는 완충제 시스템을 포함한다. 특정 실시양태에서, pH 범위는 약 4.5 내지 약 6.0, 또는 약 pH 4.8 내지 약 5.5일 수 있거나, 또는 약 5.0 내지 약 5.2의 pH 범위일 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충제 시스템은 시트르산 1수화물, 시트르산나트륨, 인산이나트륨 2수화물 및/또는 인산이수소나트륨 2수화물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제 시스템은 약 1.3 mg/ml의 시트르산 (예를 들어, 1.305 mg/ml), 약 0.3 mg/ml의 시트르산나트륨 (예를 들어, 0.305 mg/ml), 약 1.5 mg/ml의 인산이나트륨 2수화물 (예를 들어, 1.53 mg/ml), 약 0.9 mg/ml의 인산이수소나트륨 2수화물 (예를 들어, 0.86), 및 약 6.2 mg/ml의 염화나트륨 (예를 들어, 6.165 mg/ml)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제 시스템은 약 1-1.5 mg/ml의 시트르산, 약 0.25 내지 약 0.5 mg/ml의 시트르산나트륨, 약 1.25 내지 약 1.75 mg/ml의 인산이나트륨 2수화물, 약 0.7 내지 약 1.1 mg/ml의 인산이수소나트륨 2수화물, 및 6.0 내지 6.4 mg/ml의 염화나트륨을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제의 pH는 수산화나트륨으로 조정된다.
장성개질제로서 작용하며 항체를 안정화시킬 수 있는 폴리올이 또한 제제에 포함될 수 있다. 폴리올은 제제의 목적하는 등장성과 관련하여 달라질 수 있는 양으로 제제에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 수성 제제는 등장성일 수 있다. 첨가되는 폴리올의 양은 또한 폴리올의 분자량과 관련하여 변경될 수 있다. 예를 들어, 모노사카라이드 (예를 들어 만니톨)는 디사카라이드 (예컨대 트레할로스)에 비해 보다 적은 양으로 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 장성 작용제로서 제제에 사용될 수 있는 폴리올은 만니톨이다. 특정 실시양태에서, 만니톨 농도는 약 5 내지 약 20 mg/ml일 수 있다. 특정 실시양태에서, 만니톨의 농도는 약 7.5 내지 약 15 mg/ml일 수 있다. 특정 실시양태에서, 만니톨의 농도는 약 10 - 약 14 mg/ml일 수 있다. 특정 실시양태에서, 만니톨의 농도는 약 12 mg/ml일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리올 소르비톨이 제제에 포함될 수 있다.
세제 또는 계면활성제가 또한 제제에 첨가될 수 있다. 예시적인 세제는 비이온성 세제 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188)를 포함한다. 첨가되는 세제의 양은 제제화된 항체의 응집을 감소시키고/거나 제제 중 미립자의 형성을 최소화하고/거나 흡착을 감소시키도록 하는 양이다. 특정 실시양태에서, 제제는 폴리소르베이트인 계면활성제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 세제로서 폴리소르베이트 80 또는 트윈 80을 함유할 수 있다. 트윈 80은 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄모노올레에이트를 기재하기 위해 사용되는 용어이다 (문헌 [Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th edi., 1996] 참조). 특정 실시양태에서, 제제는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 0.5 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 0.1% 폴리소르베이트 80이 제제에 첨가될 수 있다.
동결건조 제제
본 개시내용의 TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 동결건조 제제는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 분자 및 동결건조보호제를 포함한다. 동결건조보호제는 당, 예를 들어, 디사카라이드일 수 있다. 특정 실시양태에서, 동결건조보호제는 수크로스 또는 말토스일 수 있다. 동결건조 제제는 또한 완충제, 계면활성제, 벌킹제 및/또는 보존제 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
동결건조 약물 제품의 안정화에 유용한 수크로스 또는 말토스의 양은 적어도 1:2의 단백질 대 수크로스 또는 말토스의 중량비일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 대 수크로스 또는 말토스의 중량비는 1:2 내지 1:5일 수 있다.
특정 실시양태에서, 제제의 pH는, 동결건조 전에, 제약상 허용되는 산 및/또는 염기의 첨가에 의해 설정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 산은 염산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 염기는 수산화나트륨일 수 있다.
동결건조 전에, 본 개시내용의 단백질을 함유하는 용액의 pH는 약 6 내지 약 8에서 조정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 동결건조 약물 제품의 pH 범위는 약 7 내지 약 8일 수 있다.
특정 실시양태에서, 염 또는 완충제 성분은 약 10 mM - 약 200 mM의 양으로 첨가될 수 있다. 염 및/또는 완충제는 제약상 허용되는 것이며, "염기 형성" 금속 또는 아민과 함께 다양한 공지된 산 (무기 및 유기)으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 완충제는 포스페이트 완충제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충제는 글리시네이트, 카르보네이트, 시트레이트 완충제일 수 있으며, 이러한 경우에 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온이 반대이온으로서 작용할 수 있다.
특정 실시양태에서, "벌킹제"가 첨가될 수 있다. "벌킹제"는 동결건조된 혼합물에 질량을 더하며, 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여하는 (예를 들어, 개방 세공 구조를 유지하는, 본질적으로 균일한 동결건조된 케이크의 제조를 가능하게 함) 화합물이다. 예시적인 벌킹제는 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비톨을 포함한다. 본 발명의 동결건조 제제는 이러한 벌킹제를 함유할 수 있다.
보존제가 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-사용 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 암 환자에서 TNBC를 치료하거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법에 사용하기 위한 동결건조 약물 제품은 수성 담체와 함께 구성될 수 있다. 본원에서 관심 수성 담체는 제약상 허용되며 (예를 들어, 인간에게 투여하기에 안전하고 비-독성임), 동결건조 후, 액체 제제의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 희석제는 멸균 주사용수 (SWFI), 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 동결건조 약물 제품은 멸균 주사용수, USP (SWFI) 또는 0.9% 염화나트륨 주사액, USP로 재구성된다. 재구성 동안, 동결건조 분말은 용액으로 용해된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 동결건조된 단백질 산물은 약 4.5 mL 주사용수로 구성되고 0.9% 염수 용액 (염화나트륨 용액)으로 희석된다.
액체 제제
실시양태에서, 본 개시내용의 단백질 산물은 TNBC를 치료하는 방법에 사용하기 위한 액체 제제로서 제제화된다. 액체 제제는 고무 마개로 밀폐되고 알루미늄 크림프 밀봉 마개로 밀봉된 USP / Ph Eur 유형 I 50R 바이알 내에 10 mg/mL 농도로 제시될 수 있다. 마개는 USP 및 Ph Eur에 따르는 엘라스토머로 만들어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 60 mL의 추출가능한 부피를 가능하게 하기 위해 약 61.2 mL의 단백질 산물 용액이 바이알에 충전될 수 있다. 특정 실시양태에서, 액체 제제는 0.9% 염수 용액으로 희석될 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이알은 약 1200 mg 내지 약 3000 mg (예를 들어, 약 1200 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg 내지 약 2900 mg, 약 1200 mg 내지 약 2800 mg, 약 1200 mg 내지 약 2700 mg, 약 1200 mg 내지 약 2600 mg, 약 1200 mg 내지 약 2500 mg, 약 1200 mg 내지 약 2400 mg, 약 1200 mg 내지 약 2300 mg, 약 1200 mg 내지 약 2200 mg, 약 1200 mg 내지 약 2100 mg, 약 1200 mg 내지 약 2000 mg, 약 1200 mg 내지 약 1900 mg, 약 1200 mg 내지 약 1800 mg, 약 1200 mg 내지 약 1700 mg, 약 1200 mg 내지 약 1600 mg, 약 1200 mg 내지 약 1500 mg, 약 1200 mg 내지 약 1400 mg, 약 1200 mg 내지 약 1300 mg, 약 1300 mg 내지 약 3000 mg, 약 1400 mg 내지 약 3000 mg, 약 1500 mg 내지 약 3000 mg, 약 1600 mg 내지 약 3000 mg, 약 1700 mg 내지 약 3000 mg, 약 1800 mg 내지 약 3000 mg, 약 1900 mg 내지 약 3000 mg, 약 2000 mg 내지 약 3000 mg, 약 2100 mg 내지 약 3000 mg, 약 2200 mg 내지 약 3000 mg, 약 2300 mg 내지 약 3000 mg, 약 2400 mg 내지 약 3000 mg, 약 2500 mg 내지 약 3000 mg, 약 2600 mg 내지 약 3000 mg, 약 2700 mg 내지 약 3000 mg, 약 2800 mg 내지 약 3000 mg, 약 2900 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 약 2500 mg, 약 2600 mg, 약 2700 mg, 약 2800 mg, 약 2900 mg, 또는 약 3000 mg)의 단백질 산물 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것; 또는 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물))을 대상체에게 전달하기 위한 60 mL의 추출가능한 부피를 가능하게 하기 위해, 약 20 mg/mL 내지 약 50 mg/mL (예를 들어, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 35 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 45 mg/mL 또는 약 50 mg/mL)의 단백질 산물 (예를 들어, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 (예를 들어, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것)) 용액 약 61.2 mL를 함유할 수 있다.
특정 실시양태에서, 바이알은 약 1200 mg 내지 약 3000 mg (예를 들어, 약 1200 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg 내지 약 2900 mg, 약 1200 mg 내지 약 2800 mg, 약 1200 mg 내지 약 2700 mg, 약 1200 mg 내지 약 2600 mg, 약 1200 mg 내지 약 2500 mg, 약 1200 mg 내지 약 2400 mg, 약 1200 mg 내지 약 2300 mg, 약 1200 mg 내지 약 2200 mg, 약 1200 mg 내지 약 2100 mg, 약 1200 mg 내지 약 2000 mg, 약 1200 mg 내지 약 1900 mg, 약 1200 mg 내지 약 1800 mg, 약 1200 mg 내지 약 1700 mg, 약 1200 mg 내지 약 1600 mg, 약 1200 mg 내지 약 1500 mg, 약 1200 mg 내지 약 1400 mg, 약 1200 mg 내지 약 1300 mg, 약 1300 mg 내지 약 3000 mg, 약 1400 mg 내지 약 3000 mg, 약 1500 mg 내지 약 3000 mg, 약 1600 mg 내지 약 3000 mg, 약 1700 mg 내지 약 3000 mg, 약 1800 mg 내지 약 3000 mg, 약 1900 mg 내지 약 3000 mg, 약 2000 mg 내지 약 3000 mg, 약 2100 mg 내지 약 3000 mg, 약 2200 mg 내지 약 3000 mg, 약 2300 mg 내지 약 3000 mg, 약 2400 mg 내지 약 3000 mg, 약 2500 mg 내지 약 3000 mg, 약 2600 mg 내지 약 3000 mg, 약 2700 mg 내지 약 3000 mg, 약 2800 mg 내지 약 3000 mg, 약 2900 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 약 2500 mg, 약 2600 mg, 약 2700 mg, 약 2800 mg, 약 2900 mg, 또는 약 3000 mg)의 단백질 산물을 대상체에게 전달하기 위한 60 mL의 추출가능한 부피를 가능하게 하기 위해, 약 20 mg/mL 내지 약 50 mg/mL (예를 들어, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 35 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 45 mg/mL 또는 약 50 mg/mL)의 단백질 산물 용액 (서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물; 또는 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는 단백질 산물)) 약 61.2 mL를 함유할 수 있다.
특정 실시양태에서, 암 환자에서 TNBC를 치료하거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 액체 제제는 안정화 수준으로 당과 조합하여 10 mg/ml 농도 용액으로서 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 액체 제제는 수성 담체 중에 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 안정화제는 정맥내 투여에 바람직하지 않거나 또는 적합하지 않은 점도를 초래할 수 있는 양 이하로 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 당은 디사카라이드, 예를 들어, 수크로스일 수 있다. 특정 실시양태에서, 액체 제제는 또한 완충제, 계면활성제, 및 보존제 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 액체 제제의 pH는 제약상 허용되는 산 및/또는 염기의 첨가에 의해 설정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 산은 염산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 염기는 수산화나트륨일 수 있다.
응집 이외에도, 탈아미드화는 발효, 수거/세포 정제, 정제, 약물 물질/약물 제품 저장 동안 및 샘플 분석 동안 발생할 수 있는, 펩티드 및 단백질의 흔한 산물 변이체이다. 탈아미드화는 가수분해를 겪을 수 있는 숙신이미드 중간체를 형성하는 단백질로부터의 NH3의 손실이다. 숙신이미드 중간체는 모 펩티드의 17 단위 질량 감소를 초래한다. 후속 가수분해는 18 단위 질량 증가를 초래한다. 숙신이미드 중간체의 단리는 수성 조건 하에서의 불안정성으로 인해 어렵다. 이에 따라, 탈아미드화는 전형적으로 1 단위 질량 증가로서 검출가능하다. 아스파라긴의 탈아미드화는 아스파르트산 또는 이소아스파르트산을 초래한다. 탈아미드화의 속도에 영향을 미치는 파라미터는 pH, 온도, 용매 유전 상수, 이온 강도, 1차 서열, 국부 폴리펩티드 입체형태 및 3차 구조를 포함한다. 펩티드 쇄 내 Asn에 인접한 아미노산 잔기는 탈아미드화 속도에 영향을 미친다. 단백질 서열 내 Asn 다음의 Gly 및 Ser은 탈아미드화에 보다 높은 감수성을 초래한다.
특정 실시양태에서, 암 환자에서 TNBC를 치료하거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법에 사용하기 위한 본 개시내용의 액체 제제는 단백질 산물의 탈아미드화를 방지하기 위한 pH 및 습도의 조건 하에 보존될 수 있다.
본원에서 관심 수성 담체는 제약상 허용되며 (인간에게 투여하기에 안전하고 비-독성임), 액체 제제의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 담체는 멸균 주사용수 (SWFI), 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
보존제가 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-사용 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다.
정맥내 (IV) 제제는 특정한 경우에, 예컨대 환자가 IV 경로를 통해 모든 약물을 제공받고 있는 이식 후 입원 상태일 때 바람직한 투여 경로일 수 있다. 특정 실시양태에서, 액체 제제는 투여 전에 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석된다. 특정 실시양태에서, 주사를 위한 희석된 약물 제품은 등장성이며 정맥내 주입에 의한 투여에 적합하다.
특정 실시양태에서, 염 또는 완충제 성분은 10 mM - 200 mM의 양으로 첨가될 수 있다. 염 및/또는 완충제는 제약상 허용되는 것이며, "염기 형성" 금속 또는 아민과 함께 다양한 공지된 산 (무기 및 유기)으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 완충제는 포스페이트 완충제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충제는 글리시네이트, 카르보네이트, 시트레이트 완충제일 수 있으며, 이러한 경우에 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온이 반대이온으로서 작용할 수 있다.
보존제가 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-사용 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다.
본원에서 관심 수성 담체는 제약상 허용되며 (인간에게 투여하기에 안전하고 비-독성임), 액체 제제의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 담체는 멸균 주사용수 (SWFI), 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
보존제가 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-사용 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다.
상기 기재는 본 발명의 다수의 측면 및 실시양태를 설명한다. 특허 출원은 특히 측면 및 실시양태의 모든 조합 및 순열을 고려한다.
실시예
지금 일반적으로 기재되어 있는 본 개시내용은 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이며, 이들 실시예는 단지 본 개시내용의 특정 측면 및 실시양태를 예시하려는 목적으로 포함된 것으로, 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 요법에 대한 반응에 있어서 TNBC 환자 중의 예측인자로서의 HMGA2 및 MECOM의 확인
본 실시예는 TNBC 환자 사이에서 HMGA2 및 MECOM을 항-PD-L1/TGFβ 단백질 요법에 대한 반응성의 2종의 예측인자로서 확인한 방법에 관한 것이다.　 33명의 TNBC 환자를 항-PD-L1/TGFβ 트랩 이중기능적 단백질로 치료하고, 이들 환자로부터의 종양 샘플을 분석하여 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용한 치료에 대한 반응자 대 비-반응자를 구별하였다.
30개의 종양 샘플 각각에 공인 병리학자가 주석을 달았다. 포르말린-고정 파라핀-포매 샘플에 대해 리커버올(Recoverall) 총 핵산 단리 키트 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))를 사용하여, 종양 함량 >50%인 4-5 μm-두께 절편의 3개의 전체-슬라이드 스크랩으로부터 RNA를 추출하였다. 리보그린(RiboGreen)® RNA 시약 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 사용하여 정량화된 200 ng의 총 RNA를, 리보-제로 골드(Ribo-Zero Gold) rRNA 제거 키트 (일루미나(Illumina))를 사용하여 리보솜 RNA에 대해 고갈시켰다. 가닥-특이적 라이브러리를 NEBNext 울트라 방향성 RNA 라이브러리 프렙 키트 (NEB)를 사용하여 제조하고, 2x50 염기쌍 쌍형성-말단 서열분석을 사용하여 HiSeq2500 (일루미나) 상에서 서열분석하였다. 샘플당 대략 1억개의 판독물을 수득하였다.
항-PD-L1/TGFβ 트랩 치료에 대한 환자 반응을 RECIST 1.1 기준을 사용하여 코딩하였다. 반응자 (안정 질환, 부분 반응 또는 완전 반응의 최상의 전체 반응을 갖는 대상체의 군) 사이의 유전자 발현 수준을 비-반응자 (진행성 질환의 최상의 전체 반응을 갖는 대상체) 사이의 수준과 비교하였다.
서열분석 판독물을 보타이2(Bowtie2) 버전 2.2.3을 사용하여 앙상블(Ensembl) 75 인간 게놈 (GRCh37 2014년 2월)에 대해 정렬하였다. (Langmead, Nat Methods, 9:357-359 (2012)). 유전자 발현을 앙상블 유전자 주석을 갖는 RSEM 버전 1.2.31을 사용하여 결정하였다. (Li, BMC Bioinformatics 12:323(2011)). 비정상적으로 소수의 검출가능한 유전자를 갖는 1개의 이상치 샘플은 추가의 분석으로부터 배제하였다.　 RSEM-계산된 예상 계수를 비교함으로써 가설 시험을 수행하였다. 백만개당 전사체 (TPM) 값을 추가의 분석을 위해 상위-사분위수로 정규화하고 로그-변환하였다.
R 버전 3.3.1을 사용하여 기술 통계 분석을 수행하였다. (Hornik K, The R FAQ, https://CRAN.R-project.org/doc/FAQ/R-FAQ.html에서 이용가능함). 상관 계수는 피어슨(Pearson) 방법을 사용하여 계산하였다. 개별 유전자에 대해 'R' 패키지 'DESeq2'를 사용하여 차등 발현의 유의성을 확립하였고; FDR-보정된 p 값 <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 'R' 패키지 'ggplot2'를 사용하여 플롯을 생성하였다.
시험된 60,234개의 주석이 달린 전사체 중에서, 후보 바이오마커의 세트를 하기 요건에 따라 필터링함으로써 확인하였다: (1) 차등 발현을 필요로 함; (2) 단백질 코딩 유전자를 필요로 함; (3) 최소 발현을 필요로 함; (4) 군의 분리를 필요로 함.
차등 발현을 필요로 함: 모든 주석이 달린 유전자를 상기 기재된 바와 같은 DESeq2를 사용하여 먼저 시험하였으며; 차등 발현의 유의성을 나타내는 q 값을 수득하였다.　 0.05 초과의 q 값을 갖는 모든 유전자는 거부되었다.
단백질 코딩 유전자를 필요로 함: 바이오마트(BiomaRt)를 사용하여, 본 발명자들이 맵핑한 각각의 전사체에 대한 앙상블 유전자 식별자가 단백질 코딩 유전자 모델에 상응하는지 여부를 확립하였다. 바이오마트로부터의 각각의 유전자 ID에 대한 "유전자_생물형"을 수득하고, 코딩 또는 비-코딩으로서 카테고리화하였다. 하기 생물형을 비-코딩으로서 분류하였다: 3프라임_오버랩핑_ncrna, 안티센스, IG_C_유사유전자, IG_J_유사유전자, IG_V_유사유전자, lincRNA, miRNA, misc_RNA, Mt_rRNA, Mt_tRNA, 유사유전자, rRNA, 센스_인트론, 센스_오버랩핑, snoRNA, snRNA, TR_J_유사유전자, 및 TR_V_유사유전자. 하기 생물형을 코딩으로서 카테고리화하였다: TR_D_유전자, TR_C_유전자, IG_C_유전자, IG_J_유전자, IG_D_유전자, 다형성_유사유전자, TR_J_유전자, TR_V_유전자, IG_V_유전자, 프로세싱된_전사체, 단백질_코딩. 비-코딩 생물형을 갖는 유전자는 낮은 해석성으로 인해 바이오마커 후보로서 거부되었다.
최소 발현을 필요로 함: 각각의 유전자에 대해, 반응자 사이의 중앙값 TPM 및 비-반응자 사이의 중앙값 TPM을 확인하였다. 주어진 유전자에 대한 중앙값 TPM이 반응자 및 비-반응자에서 0.5 미만인 경우, 그 유전자는 바이오마커 후보로서 거부되었다.
군의 분리를 필요로 함: 이상적 예측 바이오마커는 반응자를 비-반응자로부터 정확하게 분리한다.　 DESeq2는 군들 사이의 평균 발현의 차이를 평가하지만, 각각의 군에서의 발현 수준에서 현저한 중복이 존재하더라도 평균의 차이는 유의한 것으로 불릴 수 있다 (도 4a-d 참조). 또한, DESeq2는 큰 이상치에 민감할 수 있다. 두 문제에 대해 보정하기 위해, 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 적용하여 군의 분리를 시험하였다. 공칭 p-값이 0.05를 초과하는 모든 유전자는 거부되었다.
28종의 유전자가 모든 요건을 충족시키는 것으로 확인되었다. 이들 28종의 유전자 중에서, 2종의 유전자 HMGA2 및 MECOM이 모든 분석된 유전자 중 최대 통계적 유의성을 갖는 것으로 확인되었다. 도 4a-d는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 여러 잠재적 예측 바이오마커의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다. 도 4a는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 HMGA2의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다. 도 4b는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 MECOM의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다. 도 4c는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 CLEC3A의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다. 도 4d는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 환자의 반응 상태에 대해 플롯팅된 CCNDBP1의 로그-TPM의 박스 플롯을 보여준다.
군의 분리 요건의 효과를 입증하기 위해, CLEC3A 및 CCNDBP1에 대한 발현 수준을 또한 분석하였다. 이들 2개의 유전자는 차등 발현, 단백질 코딩, 및 최소 발현 요건을 통과하고 모든 유전자 중에서 가장 낮은 DESeq2 계산치 q 값을 가졌지만, 이들은 군의 분리 요건에 실패하였다 (도 4c-d 참조 (NE 데이터는 가설 시험으로부터 배제됨)). 이들 유전자에 대한 큰 배수-변화가 비-반응자에서부터 반응자 둘 다에서 관찰되었다.　 CLEC3A에 대해 계산된 큰 배수-변화는 단일의 큰 이상치에 의해 유도되는 것으로 보였고, 나머지 반응자들 간의 유전자 발현은 단지 약간 상승하였다 (도 4c 참조 (NE 데이터는 가설 시험으로부터 배제됨)). CCNDBP1 발현이 반응자들 사이에서 9.6-배 상승되었지만, 반응자들 사이의 CCNDBP1 발현 수준은 비-반응자들 사이의 거의 전체 발현 범위에 이르렀다 (도 4d 참조 (NE 데이터는 가설 시험으로부터 배제됨)). 이들 유전자에 대한 만-휘트니 U 검정으로부터 수득한 큰 p 값은 이들 단점을 정확하게 반영한다.
HMGA2 및 MECOM 유전자의 발현 증가가 유방암에서 불량한 예후와 연관된 것으로 나타났다 (Wu et al., Cancer Letters 2016; Wang et al., Cancer Research 2017). 이러한 연관성은, 반응과의 양성 연관성의 관찰이 반응자들 사이의 감소된 질환 중증도에 의해 혼동되지 않았음을 시사하였다. 또한, 유전자 둘 다는 TGFβ 생물학과 널리 공지된 연관성을 가지며 (Thualt et al., Cell Biology 2006; Liu et al., Oncogene 2006), 이는 본 발명의 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용하여 TNBC 환자를 치료하는 데 있어서의 그의 예측력에 대한 메카니즘적 설명을 뒷받침한다.
도 2a (HMGA2) 및 3b (MECOM)에 제시된 바와 같이, HMGA2 및 MECOM 둘 다는 비-반응자와 비교하여 반응자에서 20배 초과만큼 과다발현되는 것으로 밝혀졌다. 도 2a에서, HMGA2 발현 수준 (백만개당 전사체 (TPM)의 로그)이 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질에 대한 반응 (PD = 진행성 질환; SD = 안정 질환; PR = 부분 반응)에 대해 플롯팅된다. 높은 HMGA2 발현은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자 중에서 적어도 최저 HMGA2 발현만큼의 높은 발현 수준으로 간주된다. 도 2a에 제시된 바와 같이, HMGA2 발현은 비-반응자 사이의 발현 수준에 비해 유의하게 더 높은 (적어도 35배) 것으로 밝혀졌다.　 NE 데이터는 가설 시험으로부터 배제하였다.
도 3b에서, MECOM 발현 수준 (백만개당 전사체 (TPM)의 로그)이 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질에 대한 반응 (PD = 진행성 질환; SD = 안정 질환; PR = 부분 반응)에 대해 플롯팅된다. 높은 MECOM 발현은 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자 중에서 적어도 최저 MECOM 발현만큼의 높은 발현 수준으로 간주된다. 도 3b에 나타난 바와 같이, MECOM 발현은 비-반응자 사이의 발현 수준에 비해 유의하게 더 높은 (적어도 20배) 것으로 밝혀졌다.　 NE 데이터는 가설 시험으로부터 배제하였다.
임상 반응이 항-PD-L1 항체를 사용하여 치료된 TNBC 환자에서 예측될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 전이성 유방암 코호트 (METBRC) 내의 전이성 유방암 대상체로부터 데이터를 추출하였다. 항-PD-L1 항체를 사용한 치료에 대한 반응자 대 비-반응자를 구별하기 위해 본 연구를 수행하였다. 본 연구에서, 전이성 유방암 환자를 항-PD-L1 항체를 사용하여 치료하였다.　 3가지 상이한 카테고리가 고려되었다: (1) 인간 표피 성장 인자 수용체 2 양성, "HER2+", (2) 인간 표피 성장 인자 수용체 2 음성, (에스트로겐 수용체 양성 또는 프로게스테론 수용체 양성), "HER2-, (ER+ 또는 PR+)", 및 (3) 인간 표피 성장 인자 수용체 2 음성, (에스트로겐 수용체 음성 및 프로게스테론 수용체 음성), "HER2-, (ER- 및 PR-)". 후자 군은 삼중 음성 유방암 (TNBC)에 상응했지만, 처음 2개의 군은 비-TNBC로 간주되었다.
RNAseq 데이터는 항-PD-L1 항체를 사용하여 치료된 16명의 TNBC 대상체 및 21명의 비-TNBC 대상체에 대해 이용가능하였다. 도 10은 항-PD-L1 항체를 사용하여 치료된 대상체의 HMGA2의 발현 (백만개당 전사체, TPM) 및 TNBC 상태를 보여주는 박스 플롯이다. 도 10은 항-PD-L1 항체를 사용하여 치료된 비-TNBC를 갖는 대상체 대 TNBC를 갖는 대상체 사이에 HMGA2 유전자의 발현의 명백한 차이는 없음을 보여준다.
HMGA2 발현 및 그의 항-PD-L1 항체에 대한 임상 반응과의 연관성을 또한 평가하였다. 도 11은 항-PD-L1 항체를 사용하여 비-TNBC (좌측) 및 TNBC (우측) 대상체에 대해 별개의 패널에서 HMGA2 발현 (TPM) 대 반응을 보여준다. 도 11에 제시된 바와 같이, HMGA2 유전자의 낮은 발현 수준이 완전 반응 (CR)을 갖는 비-TNBC를 갖는 1명의 대상체에 존재하였고, 모든 다른 대상체는 항-PD-L1 항체에 대한 반응과 무관하게 중첩되는 HMGA2 발현 수준을 나타내었다.　 HMGA2 유전자의 낮은 발현 수준이 부분 반응 (PR)을 갖는 TNBC를 갖는 1명의 대상체에 존재하였고, 모든 다른 대상체는 중첩되는 HMGA2 발현 수준을 나타내었다. 두 경우 모두 (비-TNBC 및 TNBC)에서, 반응자 (CR/PR)와 비-반응자 (안정 질환, SD/ 진행성 질환, PD) 사이에 명백한 차이가 없는 것으로 보인다.
본 실시예에 제시된 데이터는, 본 발명의 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용하여 치료된 TNBC 환자에서 임상 반응이 예측될 수 있다는 것을 보여준다. 임상 반응의 예측은 TNBC 환자가 단지 항-PD-L1 항체만으로 치료되는 경우에는 명확하지 않다.
실시예 2: HMGA2 발현과 TGF-β 신호전달 사이의 연관성의 평가
HMGA2 발현과 TGF-β 신호전달 사이의 연관성을 평가하기 위해, 동물 연구를 수행하였다. 간략하게, 0.1 mL 1 x PBS에 현탁된 0.2 x 106개 생존 4T1 세포를 8-10주령 Balb/C 마우스의 유방 지방 패드 내로 주사함으로써 동소 종양 주사를 수행하였다. 일단 종양 부피가 100-150 mm3에 도달하면, 마우스를 무작위화하고, 하기 처리군 중 하나에 할당하였다: 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩. 대조군 내의 마우스에게 400 μg의 이소형 대조군 (hIgG1) - 항-PD-L1(mut)을 투여하고; 트랩 대조군 내의 마우스에게 492 μg의 항-PD-L1(mut)/TGFβ 트랩 (항-PD-L1(mut)/TGFβ 트랩 융합 단백질은 유사한 중쇄 융합 폴리펩티드 (서열식별번호: 7) 및 PD-L1에의 결합을 제거하는 가변 영역 내의 돌연변이 A31G, D52E, R99Y를 갖는 경쇄 (서열식별번호: 6)를 함유함)을 투여하고; 항-PD-L1 군 내의 마우스에게 400 μg의 항-PD-L1을 투여하고; 항-PD-L1/TGFβ 트랩 군 내의 마우스에게 492 μg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 정맥내 주사를 통해 3주마다 1회 (QDx3) 투여하였다. 실험 동물을 제6일에 안락사시키고, 종양 샘플을 수거하였다.
RNAseq를 4개의 처리군으로부터 수거된 종양 조직 샘플에 대해 수행하였다. 서열분석 판독물을 앙상블 75 마우스 게놈 (GRCm38 2014년 2월)에 대해 맵핑하는 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 바와 같은 표준 품질 관리 (QC) 및 정렬 파이프라인을 사용하여 미가공 서열분석 데이터를 가공하였다. 정규화된 발현 데이터를 생성하고, HMGA2 및 TGF-β 관련 유전자 발현 분석에 사용하였다.
HMGA2 발현과 TGF-β 신호전달 사이의 연관성을 평가하기 위해, 스피어만(Spearman) 상관관계 분석을 HMGA2 및 TGF-β 유전자 서명에 대해 수행하였다 (문헌 [Korkut et al., Cell Syst. 2018, 7, 422-437.e7] 참조). 별개의 분석을 대조군 동물 (N=12) 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리된 동물 (N=15)에 대해 수행하였다. 대조군에서, 30% (27종/89종)의 HMGA2/TGF-β 신호전달 유전자 쌍은 통계적으로 유의한 R을 나타내었다. 즉, 27종의 TGF-β 신호전달 유전자의 발현은 대조군-처리된 마우스로부터 추출된 RNA에서의 HMGA2의 발현과 상관관계가 있었다. 표 1은 대조군-처리된 동물에서 유전자 쌍 (HMGA2 및 TGF-β 신호전달 유전자)과 연관된 스피어만 상관관계 R 및 p 값을 열거한다. 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리군에서, 55% (48종/89종)의 HMGA2/TGF-β 신호전달 유전자 쌍은 통계적으로 유의한 R을 나타내었다. 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 처리는 TGF-β 특이적 전사체 변화를 유도하였고, 48종의 TGF-β 신호전달 유전자 발현과 HMGA2 발현의 상관관계를 발생시켰다. 표 2는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리군에서의 유전자 쌍과 연관된 스피어만 상관관계 R 및 p 값을 열거한다. 도 5a-f는 HMGA2와 각각, 선택된 TGF-β 신호전달 코어 유전자 Tgfbr1, Tgfbr2, Smad3, Tgfb1, Tgfb2, 및 Tgfb3 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5a는 HMGA2 발현과 Tgfbr1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5b는 HMGA2 및 Tgfbr2 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5c는 HMGA2 발현과 Smad3 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5d는 HMGA2 발현과 Tgfb1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5e는 HMGA2 발현과 Tgfb2 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 5f는 HMGA2 발현과 Tgfb3 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6a-f는 HMGA2와 각각, 선택된 TGF-β 신호전달 표적 유전자 Col1a1, Col1a2, Fn1, Vim, Vegfa, 및 Zeb1 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6a-f는 HMGA2와 선택된 TGF-β 신호전달 표적 유전자 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6a는 HMGA2 발현과 Col1a1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6b는 HMGA2 발현과 Col1a2 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6c는 HMGA2 발현과 Fn1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6d는 HMGA2 발현과 Vim 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6e는 HMGA2 발현과 Vegfa 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 6f는 HMGA2 발현과 Zeb1 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 이들 플롯은 HMGA2 발현이 TGF-β 신호전달 경로 유전자의 발현과 연관된다는 것을 나타낸다.
표 1. 대조군 동물에서의 HMGA2 및 TGF-β 신호전달 경로 유전자와 연관된 스피어만 상관관계 R 및 p 값.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
표 2. 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리된 동물 군에서의 HMGA2 및 TGF-β 신호전달 경로 유전자와 연관된 스피어만 상관관계 R 및 p 값.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
연관성 연구 이외에, HMGA2 및 주요 TGF-β 신호전달 코어 및 표적 유전자 발현의 유의한 하향조절이 대조군 마우스와 비교하여 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 마우스에서 관찰되었다. 도 7a-f는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 TGF-β 신호전달 유전자의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 7a는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfbr1의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 7b는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfbr2의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 7c는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Smad3의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 7d는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfb1의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 7e는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfb2의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 7f는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Tgfb3의 발현을 제시하는 플롯이다. 이들 플롯은 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군이 Tgfbr1, Tgfbr2, Smad3, Tgfb1, Tgfb2, 및 Tgfb3의 발현에서 하향조절을 나타내었음을 보여준다. 도 8a-g는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 주요 TGF-β 표적 유전자의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 8a는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 HMGA2의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 8b는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Col1a1의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 8c는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Col1a2의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 8d는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Fn1의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 8e는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Vim의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 8f는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Vegfa의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 8g는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 Zeb1의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 8a-g는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리된 동물 군이 HMGA2 및 각각, TGF-β 표적 유전자 Col1a1, Col1a2, Fn1, Vim, Vegfa, 및 Zeb1의 발현에서 하향조절을 나타내었음을 보여준다.
스피어만 상관관계 분석을 또한 HMGA2 및 PD-1/IFNγ (인터페론 감마) 신호전달 서명에 대해 수행하였으며 (문헌 [M. Ayers et al., J. Clin. Invest. 127, 2930-2940 (2017)] 참조), 이는 PD-1/IFNγ 신호전달 유전자 쌍의 단지 11% (2종/18종) 및 17% (3종/18종) 만이 각각 대조군 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리군에서 통계적으로 유의한 R을 갖는 것을 나타냈다. 표 3은 대조군 동물 군에서의 유전자 쌍과 연관된 스피어만 상관관계 R 및 p 값을 열거한다. 표 4는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리군에서의 유전자 쌍과 연관된 스피어만 상관관계 R 및 p 값을 열거한다. 도 9a-c는 HMGA2 및 각각, 선택된 PD-1/IFNγ 관련 유전자 Ifng, Gzmb, 및 Gzmk 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 9d-f는 각각 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물에서의 선택된 PD-1/IFNγ 관련 유전자 Ifng, Gzmb, 및 Gzmk의 발현 수준을 보여준다. 도 9a는 HMGA2 발현과 Ifng 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 9b는 HMGA2 발현과 Gzmb 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 9c는 HMGA2 발현과 Gzmk 발현 사이의 연관성을 보여주는 산포도이다. 도 9d는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물에서의 Ifng의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 9e는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물에서의 Gzmb의 발현을 제시하는 플롯이다. 도 9f는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물에서의 Gzmk의 발현을 제시하는 플롯이다.
표 3. 대조군 동물 군에서의 HMGA2 및 PD-1/IFNγ 신호전달 경로 유전자와 연관된 스피어만 상관관계 R 및 p 값.
Figure pct00009
표 4. 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리된 동물 군에서의 HMGA2 및 PD-1/IFNγ 신호전달 경로 유전자와 연관된 스피어만 상관관계 R 및 p 값.
Figure pct00010
표 5는 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 TGF-β 신호전달 유전자에 대한 유전자 발현 데이터의 요약을 제공한다. 표 6은 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 PD-1/IFNγ 신호전달 유전자에 대한 유전자 발현 데이터의 요약을 제공한다.
표 5. 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 TGF-β 신호전달 유전자에 대한 유전자 발현 데이터의 요약.
Figure pct00011
Figure pct00012
표 6. 대조군, 트랩 대조군, 항-PD-L1, 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩-처리된 동물 군에서의 PD-1/IFNγ 신호전달 유전자에 대한 유전자 발현 데이터의 요약.
Figure pct00013
전체적으로, HMGA2 발현은 스피어만 R의 크기 및 통계적으로 유의한 P-값을 갖는 유전자 쌍의 수에 기초하여 대조군 처리군과 비교시에 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리군에서 TGF-β 신호전달과 더 강한 연관성을 가졌고, 이는 HMGA2 발현이 항-PD-L1/TGFβ 트랩 처리에 의해 유도된 TGF-β 특이적 전사체 변화에 반응성임을 나타낸다. 보다 낮은 백분율의 HMGA2와 PD-1 차단 반응 서명 사이의 통계적으로 유의한 연관성은 HMGA2 발현이 면역 관련 유전자에서 변화를 덜 나타낸다는 것을 제시한다. 데이터는 HMGA2 발현이 TGF-β 신호전달 활성을 나타내고, 따라서 계층화 및/또는 치료 반응 바이오마커로서 사용될 수 있음을 예증한다.
실시예 3: 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 요법에 반응할 가능성이 있는 TNBC 환자를 확인하는 방법
RT-qPCR은 표적의 유전자 발현을 분석하는 반-정량적 방법이고, HMGA2 유전자 발현 수준을 결정하는 데 사용되는 하나의 방법이다. 대안적으로, 주어진 샘플 내의 표적의 카피에서의 절대 정량화를 가능하게 하는 디지털 액적 PCR (ddPCR)을 사용하여 HMGA2 유전자 발현 수준을 결정한다.　 HMGA2 유전자 발현 수준을 결정하기 위한 또 다른 대안적 검정은 HTG EdgeSeq NGS 기술이며, 이는 FFPE 조직 및 다양한 다른 샘플 유형으로부터의 mRNA/miRNA의 무-추출 정량화를 가능하게 하고 HMGA2 및 상류/하류 마커의 광범위한 경로 커버리지를 제공할 수 있는 정량적 뉴클레아제 보호 화학에 기초한 표적화된 RNA-서열분석이다. 검정 수용 기준은 특이성, 강건성, 감수성 (LOD & LOQ), 효율 & 선형성, 정밀도 (반복성) 및 검정내 & 검정간 가변성을 포함한다. 일단 검정이 설정되면, 분석적 검증, 임상 검증은 CLIA/CAP 인증된 실험실에서 수행될 것이다.
RT-qPCR
RT-qPCR은 하우스-키핑 유전자의 발현 수준 대비 표적의 유전자 발현을 분석하는 반-정량적 방법이다.　 HMGA2에 대한 다수의 택맨 qPCR 검정뿐만 아니라 HMGA2에 대한 바이오-라드 프라임(Bio-Rad Prime) PCR 검정이 존재하며, 이는 상업적으로 입수가능하다. 각각의 검정에 포함된 모든 영역에 걸쳐 있는 합성 구축물 (서열식별번호: 65)을 사용하여 검정의 선형성 및 프라이머/프로브 세트의 효율을 보장하는 프라이머/프로브의 세트를 사용하여 TNBC 환자로부터 수득된 샘플 내의 HMGA2 RNA 발현 수준을 결정한다. 생물학적 샘플은 HMGA2의 높은 발현을 갖는 세포주 (예를 들어, 유방암 세포주 예를 들어, HMGA2로 형질감염된 SW480 또는 MCF7)로부터 추출된 RNA로부터 전환된 cDNA 및 TNBC를 갖는 환자로부터의 FFPE 샘플에 대해 추출된 RNA로부터 전환된 cDNA를 사용하여 시험된다.
합성 구축물은 서열식별번호: 65에 제공된다.
Figure pct00014
디지털 액적 PCR
디지털 액적 PCR (ddPCR)은 주어진 샘플에서의 표적의 카피의 절대 정량화를 가능하게 한다. 이는 qPCR에 비해 뚜렷한 이점이지만, 임상 환경에서 실행하기가 더 어려울 수 있다. 그러나, 낮은 HMGA2 조직 풍부도를 갖는 조직 샘플의 경우, ddPCR은 HMGA2 발현 수준을 결정하는 것으로 간주된다. 각각의 검정은 cDNA 구축물의 희석물, 환자 유래 cDNA, 및 HMGA2에 대해 양성 또는 음성인 세포주로부터의 cDNA을 사용하여 비교된다.
HTG EdgeSeq
HTG EdgeSeq NGS 기술은 FFPE 조직 및 다양한 다른 샘플 유형으로부터의 mRNA/miRNA의 무-추출 정량화를 가능하게 하는 정량적 뉴클레아제 보호 화학에 기초한 표적화된 RNA-서열분석이다. 화학은 표준 RNA-서열분석에 비해 샘플 입력 요건을 유의하게 감소시킨다. 낮은 샘플 투입과 단순화된 작업흐름의 조합은 HTG EdgeSeq NGS를 임상 적용을 위한 매력적인 기술로 만든다. 패널은 기성품으로 입수가능하고, 이를 사용하여 HMGA2 및 상류/하류 마커의 경로 커버리지를 확장한다.
RNA-seq의 분석
RNA-seq는 단지 상대적 RNA 존재비를 제공하기 때문에, 집단 평균에 대한 컷오프를 하기와 같이 결정하였다: 먼저, 큰 RNA-seq 데이터세트 (TCGA)를 검사하고, HMGA2 및 MECOM에 대한 집단 발현 중앙값을 데이터베이스로부터 수득하였다. 본 연구의 반응자들 간의 가장 낮은 발현으로부터 데이터베이스의 이러한 집단 중앙값을 구분짓는 분리 인자는 HMGA2의 경우 2.27 및 MECOM의 경우 1.54인 것으로 확인되었다.
RNA-seq를 사용하여 이들 인자를 결정함에 따라, 절대 컷오프를, 먼저 발현의 (상대가 아닌) 절대 정량화를 사용하는 유전자 발현 검정을 선택하고, 이 검정을 사용하여 TNBC 환자 중에서 각각 HMGA2 및 MECOM 발현 중앙값을 측정하고, 이어서 그 중앙값에 각각의 분리 인자를 곱함으로써 결정하였다.
컴뱃으로의 배치 보정 후, 반응자 중 가장 낮은 HMGA2 발현은 0.700 로그-TPM인 것으로 밝혀졌다.　 TCGA-BRCA-TNBC에서 HMGA2의 발현 중앙값은 -0.483이었다. 로그-2 스케일에서 1.18의 차이는 2.27의 분리 인자에 상응한다. 다시 말해서, HMGA2 발현이 TNBC 환자 사이의 집단 평균보다 적어도 2.27배 더 높은 환자는 항-PD-L1-TGFβ 치료에 반응할 가능성이 있었다.　 MECOM의 경우, 반응자 중 가장 낮은 발현은 2.35 로그-TPM이었고, TCGA-BRCA-TNBC에서의 발현 중앙값은 1.54의 분리 인자인 1.73 로그-TPM이었으며, 이는 MECOM 발현이 TNBC 환자 사이의 집단 평균보다 적어도 1.54배 더 높은 환자가 항-PD-L1-TGFβ 치료에 반응할 가능성이 있음을 시사한다.
실시예 4: 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 TNBC 환자로부터 수득된 샘플 내의 HMGA2 수준을 결정하는 방법
본 실시예는 항-PD-L1/TGFβ 단백질 요법에 대한 반응성을 확인하기 위해 TNBC 환자로부터 수득된 샘플 내의 HMGA2 수준을 결정하는 방법에 관한 것이다. 정량적 실시간 PCR, 디지털 액적 PCR 및 HTG EdgeSeq 시스템을 인간 FFPE 샘플을 사용한 고-이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2)의 검출을 위해 사용하였다.
RNA 추출: 삼중 음성 유방암 (TNBC) 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 샘플을 다양한 상업적 공급원으로부터 입수하였다 (종양 백분율 범위 25-100%). FFPE 블록을 5 μM 절편으로 절단하고, 튜브에 개별적으로 수집하였다. 퀴아젠 RN이지 FFPE 키트 (제품 #73504)를 사용하여 각각의 샘플에 대해 2개의 FFPE 컬로부터 RNA를 추출하였다. 샘플을 막 스핀 칼럼에 첨가할 때까지 각각의 샘플에 대해 2회의 분취물을 별도로 남겨두었다. 이는 파라핀의 보다 완전한 용융뿐만 아니라 샘플 농축을 가능하게 하였다. 샘플을 30 μL의 물 중에서 스핀 칼럼으로부터 용리시켰다.
RNA 정량화
추출 후, RNA를 큐비트 RNA 광범위 검정 키트 (제품 #Q10211)를 사용하여 정량화하였다. 추출된 RNA를 1:66.67 (3 μL RNA + 197 μL 큐비트 작업 용액)로 희석하였다. 샘플이 큐비트 검정에서 대조군으로서 간주되는 허용되는 범위 밖에 있는 경우에, 샘플을 추가로 희석하거나 또는 필요에 따라 보다 낮은 희석을 사용하여 신뢰할만한 농도 판독치를 생성하였다.
RNA 품질 평가
RNA 샘플을 또한 애질런트(Agilent) 바이오애널라이저 플랫폼 상에서 실행시켜, 애질런트 RNA 6000 나노 키트 (제품 #5067-1512)를 사용하여 추출된 RNA의 품질을 평가하였다.
역전사
인비트로젠/ 써모피셔 슈퍼스크립트(Superscript) IV VILO 마스터 믹스 (제품 #11766050)를 사용하여 주형 RNA로부터 cDNA를 전사하였다. 각각의 반응에 대해 100 ng의 RNA를 사용하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라, 4 μL의 슈퍼스크립트 IV VILO 마스터 믹스를 총 부피가 20 μL가 되도록 하기에 충분한 뉴클레아제 무함유 물과 함께 각각의 반응에 첨가하였다. 각각의 샘플에 대한 다수의 반응을 합하여 하나의 반응에서 가능한 한 많은 RNA를 cDNA로 전환시킬 수 있었다.　 RNA의 농도가 너무 낮은 경우에, 전사 반응은 가능한 가장 큰 농도에서 이루어졌다. 이어서 모든 반응 혼합물을 25℃에서 15분 동안, 이어서 50℃에서 15분 동안, 및 마지막으로 85℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 cDNA를 사용 준비가 될 때까지 -20℃에서 보관하였다.
qPCR을 어플라이드 바이오시스템즈 7500Dx 기기를 사용하여 수행하였다. 간략하게, qPCR 혼합물은 20 μL의 총 반응 부피에 대해 써모 피셔로부터의 택맨 2X 유전자 발현 마스터 믹스 (제품 #4369016) 10 μL, 택맨 HMGA2 프라이머 프로브 세트 Hs0017569_m1 (서열식별번호: 63 및/또는 서열식별번호: 64) 또는 택맨 ACTB 프라이머 프로브 세트 Hs01060665_g1 1 μL, 샘플로부터의 cDNA 4 μL, 및 H2O 5 μL로 이루어졌다. 표적 유전자에 대한 프라이머/프로브 세트 (서열식별번호: 63 및/또는 서열식별번호: 64) 및 하우스키핑 유전자는 "기성품" 유전자 발현 검정이 이용가능하지 않은 경우 프라이머 익스프레스®를 사용하여 설계될 수 있다. 이어서 qPCR을 하기 프로토콜로 실행하였다: 50℃에서 2분 동안 유지, 95℃에서 10분 동안 유지, 15초 동안 95℃에 이어서 1분 동안 60℃의 40회 사이클. 역치화는 소프트웨어의 자동 분석 기능을 사용하여 수행하였다.
qPCR 분석:
비교 델타 Ct (ΔCt) 방법을 유전자 발현의 상대적 정량화에 사용하였다. 미가공 HMGA2 사이클 역치 (Ct) 값 및 하우스키핑 유전자 Ct 값 둘 다, 뿐만 아니라 (HMGA2의 Ct 값 - 하우스키핑 유전자의 Ct 값)으로서 계산된 델타 Ct 값을 관찰하여 qPCR 샘플 분석을 수행하였다. 예시적인 실시양태에서, ACTB (베타 액틴)가 하우스키핑 유전자로서 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 델타 Ct 값은 (HMGA2의 Ct 값 - ACTB의 Ct 값)으로서 계산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 초과의 하우스키핑 유전자가 사용될 수 있고, 하우스키핑 유전자로부터 수득된 Ct 값을 평균할 수 있다. 특정 실시양태에서, 델타 Ct 값은 (HMGA2의 Ct 값 - 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 평균 Ct 값)으로서 계산될 수 있다. 보다 낮은 ΔCt 값 또는 보다 낮은 미가공 Ct 값은 보다 높은 HMGA2 발현을 의미한다.
디지털 액적 PCR (ddPCR)
초기 qPCR 결과를 확인하기 위해, ddPCR 적용에 보다 적절한 상이한 프라이머/프로브 세트를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 샘플에 대해 직교 방법으로서의 ddPCR을 수행하였다.　 이루어진 ddPCR 반응 혼합물 22 μL를 하기로 제조하였다: 프로브용 바이오-라드 ddPCR 슈퍼믹스 (제품 #186-3026) 11 μL, HMGA2 바이오-라드 ddPCR 검정 ID: dHSaCPE5029086 FAM 프로브 1 μL, ACTB 바이오-라드 ddPCR 검정 ID: dHsaCPE5190200 HEX 프로브 1μL, 샘플로부터의 cDNA 4 μL, 및 H2O 5 μL. 액적을 바이오-라드 오토DG 기기에서 생성시킨 후, 하기 조건을 사용하여 VeritiDx 써멀 사이클러에서 증폭시켰다: 10분 동안 95℃로 유지, 30초 동안 94℃에 이어서 1분 동안 60℃의 40회 사이클, 10분 동안 98℃로 유지, 적어도 30분 동안 4℃로 유지. 증폭 후, PCR 반응물을 바이오-라드 QX200 플레이트 판독기로 옮기고, 액적을 분석하였다. 각각의 샘플에 대해 역치를 수동으로 설정하여 각각의 샘플에 대해 양성 액적을 음성 액적과 구별하였다.
ddPCR 분석:
퀀타소프트(QuantaSoft) 소프트웨어를 사용하여 각각의 실험의 샘플 분석을 수행한다. 상응하는 주형이 없는 대조군 (NTC)에서 검출된 바와 같은 음성 클러스터를 기준으로 수동으로 배치된 형광 역치를 사용하여 모든 샘플에서의 양성 액적 농도를 결정하였다. 단일 샘플 내의 표적 DNA 농도 (카피/μL) 및 절대 액적 계수를 정량적 결과 측정으로서 사용하였다.　 ddPCR은 카피/웰 (반응)로서 절대 정량화를 제공하므로, 보다 높은 ddPCR 비 값은 보다 높은 HMGA2 발현에 상응한다. 미가공 HMGA2 카피수 값뿐만 아니라 하나 이상의 하우스키핑 유전자로부터 수득된 카피수 값에 대해 정규화된 HMGA2 카피수 값을 둘 다 관찰하여 ddPCR 샘플 분석을 수행하였다. 정규화된 카피수 값은 (HMGA2의 카피수 값 / 단일 (또는 평균) 하우스키핑 유전자의 카피수 값)으로서 계산된다. 예시적인 실시양태에서, ACTB (베타 액틴)가 하우스키핑 유전자로서 사용될 수 있다.
HTG EdgeSeq:
FFPE 시편을 튜브 내로 스크랩핑하고, HTG의 용해 완충제 중에 용해시킨 후, 유전자-특이적 DNA 뉴클레아제 보호 프로브 (NPP)를 도입하였다.　 NPP가 생물학적 매트릭스에서 가용성이거나 또는 가교된 것 둘 다일 수 있는 그의 표적 RNA에 혼성화되도록 한 후, 과량의 비혼성화 NPP 및 RNA를 제거하는 S1 뉴클레아제를 첨가하여, 그의 표적 RNA에 혼성화된 NPP만을 남긴다. 이에 따라, 표적 RNA에서 NPP로의 화학량론적 전환이 달성되어, 거의 1:1 비의 NPP 대 RNA를 생산한다.　 qNPA 단계는 HTG EdgeSeq 프로세서 상에서 자동화되고, 서열분석 어댑터 및 태그를 첨가하기 위해 PCR이 이어진다. 표지된 샘플을 풀링하고, 세정하고, 표준 프로토콜을 사용하여 차세대 서열분석 (NGS) 플랫폼 상에서 서열분석한다.　 NGS 기기로부터의 데이터를 가공하고 HTG EdgeSeq 파서 소프트웨어에 의해 기록한다.
항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료를 위한 환자 집단의 HMGA2 발현에 기초한 선택
실시예 1에 제시된 데이터는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질에 반응하지 않은 TNBC 환자 (비-반응자)와 비교하여 항-PD-L1/TGFβ 트랩 치료에 반응한 TNBC 환자 (반응자)에서 HMGA2의 유의한 과다발현이 존재함을 제시하였다. 본 섹션은 높은 HMGA2 발현을 의미하는 컷오프 (예를 들어, Ct 값 또는 계수 수준)를 사용함으로써 항-PD-L1/TGFβ를 사용한 치료를 위한 환자를 선택하는 방법을 예시한다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응할 환자 집단을 선택하기 위한 HMGA2 높은 발현 컷오프는 RNA-seq로부터 수득된 데이터 및 qPCR 및/또는 ddPCR로부터 수득된 데이터의 혼입에 의해 추론된다.　 RNA-seq로부터 수득된 TPM 값은 절대 정량화 방법 (예를 들어, qPCR 또는 ddPCR)으로부터 수득될 수 있는 정량화 값으로 해석될 수 있다.　 RNA-seq로부터 수득된 TPM 값으로부터 Ct 값 (qPCR의 경우) 또는 ddPCR 비 값 (ddPCR의 경우)으로 맵핑되는 전달 함수를 생성한다. 이러한 전달 함수는 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 Ct 또는 ddPCR 비 수준을 찾기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 Ct 값을 찾기 위해 사용되는 전달 함수는 하기와 같다:
Y1= X1 - log2 (TPM 최저/TPM 기준선);
여기서 Y1= Ct 값 컷오프;
X1= 정규화된 ΔCt 값 (HMGA2에 대한 상대적인 qPCR 발현 중앙값);
TPM 최저= 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자들 사이에서 RNA-seq로부터 수득된 최저 HMGA2 발현 (TPM 값);
TPM 기준선= 임상 반응에 관계없이 모든 환자들 중에서의 HMGA2 발현 중앙값.
특정 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 Ct 값을 찾기 위해 사용되는 전달 함수는 하기와 같다:
Y1= X1 - log2 (TPM 제2 최저/TPM 기준선);
여기서 Y1= Ct 값 컷오프;
X1= 정규화된 ΔCt 값 (HMGA2에 대한 상대적인 qPCR 발현 중앙값);
TPM 제2 최저 = 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자들 사이에서 RNA-seq로부터 수득된 최저 HMGA2 발현 (TPM 값);
TPM 기준선= 임상 반응에 관계없이 모든 환자들 중에서의 HMGA2 발현 중앙값.
특정 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 ddPCR 비 값을 찾기 위해 사용되는 전달 함수는 하기와 같다:
Y1= X1 × (TPM 최저/TPM 기준선);
여기서 Y1= ddPCR 비 값 컷오프;
X1= 정규화된 ddPCR 비 값 (HMGA2에 대한 ddPCR 비 중앙값);
TPM최저 = 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자들 사이에서 RNA-seq로부터 수득된 최저 HMGA2 발현 (TPM 값);
TPM 기준선= 임상 반응에 관계없이 모든 환자들 중에서의 HMGA2 발현 중앙값.
특정 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현과 관련하여 컷오프를 제공할 수 있는 상응하는 ddPCR 비 값을 찾기 위해 사용되는 전달 함수는 하기와 같다:
Y1= X1 × (TPM 제2 최저/TPM 기준선);
여기서 Y1= ddPCR 비 값 컷오프;
X1= 정규화된 ddPCR 비 값 (HMGA2에 대한 ddPCR 비 중앙값);
TPM제2 최저 = 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질 치료에 반응하는 환자들 사이에서 RNA-seq로부터 수득된 제2 최저 HMGA2 발현 (TPM 값);
TPM 기준선= 임상 반응에 관계없이 모든 환자들 중에서의 HMGA2 발현 중앙값.
특정 실시양태에서, 충분한 크기의 종양 샘플의 세트 (예를 들어, 50, 100, 150, 200 또는 250개의 종양 샘플)를 수득하고, RNA-seq 및 qPCR (또는 ddPCR)을 각각의 샘플에 대해 수행하여, RNA-seq 및 qPCR에 의한 HMGA2 발현 정량화의 직접 비교를 가능하게 하는 매칭된 데이터세트를 생성한다. qPCR Ct 값 (또는 ddPCR 비 값)으로부터의 모델 전달 함수는 TPM의 함수로서 스플라인 회귀 모델링 발현 수준을 수행함으로써 수득할 수 있다 (문헌 [Friedman, Jerome H. "Multivariate adaptive regression splines." Annals of Statistics 19.1 (1991): 1-67] 참조; 또한 문헌 [Kuhn, Max, 및 Kjell Johnson. Applied Predictive Modeling. Vol. 26. New York: Springer, 2013] 참조). 새로운 데이터세트 내의 HMGA2의 분포를 실시예 1에 기재된 데이터 세트로부터 수득된 것과 비교함으로써 전달 함수의 유효성 및 임의의 전체 배치 효과의 크기를 시험한다. 배치 효과가 이러한 모델 전달 함수의 유용성을 손상시키지 않는다는 것이 확립되면, 이러한 전달 함수를 이용하여 높은 HMGA2 발현 컷오프를 수득할 것이다.
RNA-seq로부터의 HMGA2 발현 데이터 (배수-변화 유도 방법): 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 TNBC 환자의 예시적인 집단 코호트에서, 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 종양 샘플 (n = 118)을 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 RNA를 추출하고 RNA의 품질을 평가한다. 품질 관리를 통과한 샘플 (n = 103)에 대해 수행된 RNA-seq (실시예 1에 기재된 바와 같음)의 분석은 반응자 대 비-반응자에서의 HMGA2 발현에 있어서 32배의 평균 차이를 나타낸다. 동일한 예시적인 집단 코호트는 임상 반응에 관계없이 모든 환자들 중에서 HMGA2의 발현 중앙값을 9.82 TPM (백만개당 전사체)으로서, 반응자 중에서 최저 HMGA2 발현을 18.86 TPM으로서, 반응자 중에서 두 번째로 낮은 HMGA2 발현을 177.75 TPM으로서 나타낸다.
Ct 값을 사용한 HMGA2 발현 컷오프 (배수-변화 유도 방법): 동시에, qPCR 실험을 실시예 4에 기재된 방법을 사용하여 품질 관리를 통과한 모든 샘플 (n = 103)에 대해 수행하여 HMGA2 및 하우스키핑 유전자, 베타-액틴에 대한 발현 Ct 값을 수득한다. 실시예 4에 기재된 qPCR 실험을 위한 분석 방법 (비교 ΔCt 방법)을 사용하여, 12.1의 ΔCt (HMGA2에 대한 중앙값 상대 qPCR 발현)를 수득한다. 이어서 하기 방정식을 사용하여 완화적 컷오프 Ct 값을 수득한다:
완화적 컷오프 Ct 값 = HMGA2에 대한 정규화된 ΔCt 값 - log2 (18.86/9.82)
예시적인 실시양태에서, 11.6의 완화적 컷오프 Ct 값은 12.1의 ΔCt 값을 사용하여 수득되며, 이는 11.16 이하의 Ct 값을 갖는 환자가 HMGA2가 높고 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 적합한 것으로 분류된다는 것을 시사한다.
유사하게, 보수적 컷오프 Ct 값은 하기 방정식을 사용하여 수득할 수 있다:
보수적 컷오프 Ct 값 = HMGA2에 대한 정규화된 ΔCt 값 - log2 (177.75/9.82)
예시적인 실시양태에서, 7.92의 보수적 컷오프 Ct 값은 12.1의 ΔCt 값을 사용하여 수득되며, 이는 7.92 이하의 Ct 값을 갖는 환자가 HMGA2가 높고 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 적합한 것으로 분류된다는 것을 시사한다.
ddPCR 비 값을 사용한 HMGA2 발현 컷오프 (배수-변화 유도 방법): 동시에, 실시예 4에 기재된 방법을 사용하여 103개의 종양 샘플 중 58개의 종양 샘플에 대해 ddPCR 실험을 수행하여 HMGA2 및 하우스키핑 유전자, 베타-액틴에 대한 발현 값을 수득한다. 특정 실시양태에서, ddPCR에 의해 베타-액틴에 비한 HMGA2 발현의 정량화를 수행하여 높은 HMGA2 발현과 낮은 HMGA2 발현 사이의 컷오프를 확립한다. 예시적인 실시양태에서, 0.054의 ddPCR 비 중앙값은 하기 방정식을 사용하여 수득된다:
ddPCR 비 = (HMGA2 카피수/베타-액틴 카피수) x 10000
ddPCR 비 중앙값을 사용하여, 완화적 컷오프 값을 하기 방정식을 사용하여 수득한다:
완화적 컷오프 값 = HMGA2에 대한 ddPCR 비 중앙값 x (18.86/9.82)
예시적인 실시양태에서, 0.104의 완화적 컷오프 값은 0.054의 ddPCR 비 중앙값을 사용하여 수득되며, 이는 0.104 이상의 ddPCR 비를 갖는 환자가 HMGA2가 높고 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 적합한 것으로 분류된다는 것을 시사한다. 유사하게, 보수적 컷오프 값은 하기 방정식을 사용하여 수득할 수 있다:
보수적 컷오프 값 = HMGA2에 대한 ddPCR 중앙값 x (177.75/9.82)
예시적인 실시양태에서, 0.976의 보수적 컷오프 값은 0.054의 중앙값 ddPCR 값을 사용하여 수득되며, 이는 0.976 이상의 ddPCR 비를 갖는 환자가 HMGA2가 높고 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 적합한 것으로 분류된다는 것을 시사한다.
RNA-seq로부터의 HMGA2 발현 데이터 (백분위수 유도 방법): 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료된 TNBC 환자의 예시적인 집단 코호트에서, 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 종양 샘플 (n = 118)을 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 RNA를 추출하고 RNA의 품질을 평가한다. 품질 관리를 통과한 샘플 (n = 103)에 대해 수행된 RNA-seq (실시예 1에 기재된 바와 같음)의 분석은 반응자 중에서 가장 낮은 HMGA2 발현이 28개의 샘플 중에서 22번으로 순위화되고, 78.6번째 백분위수에 상응한다는 것을 보여준다. 반응자 중에서 두 번째로 낮은 HMGA2 발현은 28개의 샘플 중 26번으로 순위화되고, 92.9번째 백분위수에 상응하였다.
Ct 값을 사용한 HMGA2 발현 컷오프 (백분위수 유도 방법): 특정 실시양태에서, 높은 HMGA2 발현과 낮은 HMGA2 발현 사이의 컷오프를 확립하기 위해 qPCR 실험을 수행하여 HMGA2 발현의 상대적 정량화를 수득한다. 예시적인 실시양태에서, 78.6번째 백분위수에서의 상대 qPCR 발현은 8.7의 ΔCt 값 (완화적 컷오프)이며, 이는 8.7 이하의 ΔCt 값을 갖는 환자가 HMGA2가 높고 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 적합한 것으로 분류될 것임을 시사한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 92.9번째 백분위수에서의 상대 qPCR 발현은 6.9의 ΔCt 값 (보수적 컷오프)이며, 이는 6.9 이하의 ΔCt 값을 갖는 환자가 HMGA2가 높고 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 적합한 것으로 분류될 것임을 시사한다.
ddPCR 비 값을 사용한 HMGA2 발현 컷오프 (백분위수 유도 방법): 특정 실시양태에서, HMGA2 발현은 ddPCR에 의해 정량화되어 높은 HMGA2 발현과 낮은 HMGA2 발현 사이의 컷오프를 확립할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 78.6번째 백분위수에서의 상대 ddPCR 발현은 0.467의 ddPCR 비 값 (완화적 컷오프)이며, 이는 0.467 이상의 HMGA2 상대 발현을 갖는 환자가 HMGA2가 높고 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 적합한 것으로 분류될 것임을 시사한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 92.9번째 백분위수에서의 상대 ddPCR 발현은 1.375 (보수적 컷오프)이며, 이는 1.375 이상의 HMGA2 상대 발현을 갖는 환자가 HMGA2가 높고 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 적합한 것으로 분류될 것임을 시사한다. 표 7은 qPCR 및 ddPCR에 의해 수득되고, 배수 변화 유도 방법 및 백분위수 유도 방법에 의해 분석된 예시적인 발현 컷오프 값을 열거한다. 컷오프 값은 분석 방법의 검정력 (예를 들어 집단 코호트 크기)에 좌우되고, 샘플 크기 및 집단 특징 사이의 차이 (예를 들어, 연령, 성별, 인종 기원, 흡연 습관, 식이 습관, 체질량 지수 (BMI), 기분전환 약물 사용, 의료 약물 사용, 및/또는 운동 습관)에 따라 달라질 수 있다.
표 7. 계산된 바와 같은 HMGA2 발현 컷오프 값 및 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 반응할 것으로 예측된 샘플의 수의 요약.
Figure pct00015
실시예 5: 선행 치료에 대해 불응성이거나 저항성인 TNBC 환자의 치료
목적: 전이성 및 불응성 (3L+) 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 갖는 환자를 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 요법을 사용한 치료를 위해 선택하고, 안전성 및 효능을 평가하였다.
연구 설계 및 결과: 확인된 진행성 질환, 허용되지 않는 독성 또는 시험 철회까지 총 33명의 환자를 1200 mg의 용량으로 항-PD-L1/TGFβ 트랩으로 2주마다 치료하였다. 삼중 음성 유방암 환자에서의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 확장 코호트의 안전성 요약은 하기와 같이 열거된다. 이 코호트의 환자는 1,200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 2주마다 제공받았다.
이 코호트에 등록된 33명의 환자는 18.0주 (범위: 4.0-31.7주)의 중앙값 추적을 가졌고, 평균 3.8회 용량 (범위: 1.0-12.0 용량)을 제공받았다. 2명의 환자 (6.1%)가 진행 중이었다. 31명의 환자는 진행성 질환 (n=26, 78.8%), 사망 (n=1, 3.0%, 질환 진행으로 인함), 유해 사건 (n=2, 6.1%, 트랜스아미니티스, 용혈), 프로토콜 비-순응도 (n=1, 3.0%, 환자는 약속을 유지할 수 없음)로 인해 시험을 중단하였고, 동의를 철회 (n=1, 3.0%, 임상적으로 진행 중이고 호스피스에 입원함)하였다.
표 8은 항-PD-L1/TGFβ 트랩에 대한 관계와 무관하게 3명 이상의 환자에서 발생하는 치료 응급 유해 사건 (TEAE), 뿐만 아니라 등급 3 이상인 모든 AE를 열거한다. 가장 흔한 TEAE는 호흡곤란 (n=10, 30.3%), 빈혈 (n=9, 27.3%), 설사 (n=8, 24.2%), 무력증 (n=8, 24.2%), 발열 (n=8, 24.2%), 감소된 식욕 (8, 24.2%) 및 두통 (n=8, 24.2%)을 포함하였다. 연구자에 의해 항-PD-L1/TGFβ 트랩과 관련된 것으로 평가된 7건의 등급 3+ 사건을 갖는 5명의 환자 (15.2%)가 존재하였다. 이들은 용혈 (등급 5), 혈소판감소증 (등급 5), 호흡곤란 (등급 5), 빈혈 (등급 3, 3건의 사건) 및 증가된 트랜스아미나제 (등급 3)를 포함한다. 연구 조사자에 의해 항-PD-L1/TGFβ 트랩과 관련된 것으로 평가된 3건의 G5 사건은, 시험 진입 시에 광범위한 질환을 가졌던 1명의 환자에서 발생하였고, 동시에 3회 용량 후 다수의 폐 색전, 진행성 질환 및 확장 흉막 삼출을 갖는 것으로 발견되었다. 용혈 또는 혈소판감소증을 매개하는 어떠한 자가-항체도 후처리 시에 확인되지 않았다. 각화극세포종 및 피부 편평 세포 암종을 포함한 피부 병변 (다른 TGF-β-억제제로 확인된 것들과 유사함)은 시험 중인 모든 투여된 환자의 대략 3-5%에서 발생하였으며, 외과적 절제에 의해 잘 관리되었다. 그러나, 이들 피부 병변 중 어느 것도 이 코호트에서 발생하지 않았다. 요약하면, 항-PD-L1/TGFβ 트랩은 내약성이 우수하였고, 안전성 프로파일은 이러한 과도하게 선행치료된 진행성 삼중 음성 유방암 코호트에서의 예상과 일치하였다.
표 8. 삼중 음성 유방암 환자에서의 항-PD-L1/TGFβ 트랩에 의한 치료 응급 유해 사건 (TEAE). 선호 용어는 3명 이상의 환자에서 발생하는 AE 및 모든 등급 3+ 사건에 대해 열거된다. 사건은 항-PD-L1/TGFβ 트랩에 대한 관계와 무관하게 열거된다.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
해설부에 기재된 바와 같이, 1명의 환자는 연구 조사자에 의해 항-PD-L1/TGFβ 트랩과 관련된 것으로 평가된 3건의 G5 TEAE (호흡곤란, 용혈, 혈소판감소증)를 가졌다. G5 사건을 갖는 추가의 7명의 환자는 항-PD-L1/TGFβ 트랩과 관련된 것으로 간주되지 않았다. 프로토콜에 따라, TEAE "진행성 질환"은 환자가 가장 최근 약물 투여의 28일 내에 진행성 질환으로 인해 사망한 경우 또는 질환 진행이 연구자에 의해 예상된 것보다 더 신속하게 발생한 것으로 평가된 경우 문서화하였다.
하나의 예시적 실시양태에서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 1800 mg의 BW-비의존성 용량으로서 TNBC를 갖는 암 환자에게 3주마다 1회 투여한다. 투여를 약 1시간 (-10분 / +20분, 예를 들어, 50분 내지 80분) 동안 정맥내로 수행한다. 하나의 예시적 실시양태에서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 2100 mg의 BW-비의존성 용량으로서 TNBC를 갖는 암 환자에게 3주마다 1회 투여한다. 투여를 약 1시간 (-10분 / +20분, 예를 들어, 50분 내지 80분) 동안 정맥내로 수행한다. 하나의 예시적 실시양태에서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 2400 mg의 BW-비의존성 용량으로서 TNBC를 갖는 암 환자에게 3주마다 1회 투여한다. 투여를 약 1시간 (-10분 / +20분, 예를 들어, 50분 내지 80분) 동안 정맥내로 수행한다. 하나의 예시적 실시양태에서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 2600 mg, 2800 mg, 또는 3000 mg의 BW-비의존성 용량으로서 TNBC를 갖는 암 환자에게 3주마다 1회 투여한다. 투여를 약 1시간 (-10분 / +20분, 예를 들어, 50분 내지 80분) 동안 정맥내로 수행한다. 하나 이상의 예시적 실시양태에서, 잠재적 주입-관련 반응을 완화시키기 위해, 항히스타민제 및 파라세타몰 (아세트아미노펜)로의 예비투약 (예를 들어, 25-50 mg 디펜히드라민 및 500-650 mg 파라세타몰 [아세트아미노펜] IV 또는 경구 등가물)을 처음 2회 주입에 대해 각각의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 투여 대략 30 내지 60분 전에 투여한다. 처음 2회 주입 동안 등급 ≥ 2의 주입 반응이 관찰되면, 예비투약을 중단하지 않는다. 예비투약으로서 스테로이드는 허용하지 않는다.
하기는 본 실시예에 사용된 환자에 대한 포함 기준을 기재한다. 환자는:
- 사전 동의 시점에서, ≥ 18세이다
- TNBC의 조직학상 확인된 진단을 갖는다
- RECIST 1.1에 기초하여 측정가능한 질환을 갖는다 (문헌 [Eisenhauer et al., EJC. 2009; 45:228-247] 참조)
- 전이성 및 불응성 (3L+) TNBC의 진단 이후 선행 전신 요법 치료 또는 T-세포 공동조절 단백질 (면역 체크포인트)을 표적화하는 임의의 항체 또는 약물, 예컨대 항-PDL1 또는 항-CTLA-4 항체를 받은 적이 없다 (신보조/보조 요법의 일부로서 세포독성 화학요법, 생물학적 요법, 및/또는 방사선으로의 치료의 완료는, 요법이 전이성 질환의 진단의 적어도 6개월 전에 완료된 것인 한, 허용됨)
- 적어도 12주의 기대 수명을 갖는다 (진단 후 환자 예후에 대한 의사의 평가에 기초함)
- 바이오마커 분석에 적절한 이용가능한 종양 물질 (< 6개월령)을 갖는다
- 0 내지 1의 동부 협동 종양학 그룹 수행 상태(Eastern Cooperative Oncology Group Performance Status) (ECOG PS)를 갖는다
- 절대 호중구 계수 (ANC) ≥ 1.5 x 109개/L, 혈소판 계수 ≥ 100 x 109개/L, 및 Hgb ≥ 9 g/dL로 간주된 적절한 혈액학적 기능을 갖는다
- 총 빌리루빈 수준 ≤ 1.5 x 정상 상한치 (ULN), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 수준 ≤ 3.0 x ULN, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 수준 ≤ 3.0 x ULN 및 알칼리성 포스파타제 ≤ 2.5 ULN에 의해 간주된 적절한 간 기능을 갖는다. 종양이 간 침범된 참여자의 경우, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) ≤ 5.0 x ULN, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) ≤ 5.0 x ULN, 및 빌리루빈 ≤ 3.0 x ULN이 허용가능하다.
- 크레아티닌 ≤ 1.5 x ULN, 또는 계산된 크레아티닌 클리어런스 ＞ 30 mL/분에 의해 간주된 적절한 신장 기능을 갖는다; 및
- 참여자가 항응고제 요법을 받고 있지 않는 경우 국제 정규화 비 (INR) 또는 프로트롬빈 시간 (PT) ≤ 1.5 x ULN, 및 참여자가 항응고제 요법을 받고 있지 않는 경우 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) ≤ 1.5 x ULN으로 간주된 적절한 응고 기능을 갖는다.
실시예 6: 높은 HMGA2 발현을 갖는 TNBC 환자의 치료
목적: 본 연구의 목적은 1차 전신 화학요법 중 또는 그 후에 높은 HMGA2 발현 및 질환 진행을 나타내는 종양을 갖는, 진행성 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 갖는 환자에서 항-PD-L1/TGFβ 트랩 치료의 최상의 전체 반응 (BOR)을 결정하는 것이다.
연구 설계: 본 연구는 높은 HMGA2 발현을 나타내는 진행성 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 갖는 환자에서 항-PD-L1/TGFβ 트랩의 임상 효능을 평가하기 위한 II상 단일 아암 바이오마커-구동 시험이다.
하나의 예시적인 실시양태에서, TNBC 환자로부터의 종양은 높은 HMGA2 발현에 대해 스크리닝되고, 이는 TNBC 환자 사이의 집단 평균보다 적어도 2.27배 더 높은 HMGA2 발현 수준으로 간주된다. 집중 RT-PCR에 의해 HMGA2 상태를 확인하기 위해 모든 참가자에 대해 종양 물질이 요구되고, 신선한 생검 또는 보관된 물질을 포함할 수 있다.
높은 HMGA2 발현에 대한 미리 결정된 컷오프를 충족하는 대략 29명의 환자가 연구에 등록된다. 환자를 14일 (+/-3일)마다 1회 주입 당 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질을 사용하여 치료한다. 치료는 확인된 질환 진행, 허용되지 않는 독성, 지속적인 확인된 완전 반응, 또는 최대 2년의 기간 동안의 시험 철회까지 계속된다. 임의로, 환자가 계속된 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 것으로 결정되는 경우에, 연구 의료 모니터링 요원과의 논의 후에, 보다 긴 치료 및 확인된 질환 진행 이후의 치료가 가능하다.
잠재적 주입-관련 반응을 완화시키기 위해, 항히스타민제 및 아세트아미노펜으로의 예비투약을 임의로 항-PD-L1/TGFβ 트랩의 처음 2회 투여 전에 투여한다. 스테로이드로 예비투약된 환자는 연구로부터 배제되지 않는다.
효능 평가: 항-PD-L1/TGFβ 트랩 치료에 대한 반응은 RECIST 1.1 기준에 따라 6-8주 +/-7일마다 CT 영상화에 의해 평가된다. 기준선에서 수행된 스캔은 후속 방문에서 반복된다. 일반적으로, 기준선에서 검출된 병변은 후속 종양 평가 방문에서 동일한 영상화 방법론 및 바람직하게는 동일한 영상화 장비를 사용하여 추적된다. 전체 반응률 (ORR), 무진행 생존 (PFS) 및 반응 지속기간 (DOR)을 계산하고, 과거 대조군과 비교한다.
치료는 고형 종양의 반응 평가 기준 버전 1.1 (RECIST 1.1)에 따른 확인된 진행성 질환 (PD), 허용되지 않는 독성, 또는 최대 24개월 동안까지 계속된다. 안정 질환 (SD), 부분 반응 (PR) 또는 완전 반응 (CR)을 경험한 환자는 24개월의 종료시까지 치료를 계속할 것이며, 추가 치료가 가능하다. 환자가 계속된 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 것으로 결정되는 경우에, 연구 의료 모니터링 요원과의 논의 후, 확인된 질환 진행 이후의 치료가 가능할 것이다.
치료 전반에 걸쳐, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 치료의 안전성은, 높은 HMGA2를 나타내는 치료 경험이 있는 진행성 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 갖는 환자에서, 기준선 의학적 상태, 유해 사건 (AE), 신체 검사 소견, 예컨대 활력 징후, ECOG 수행 상태, 및 실험실 시험의 기록, 보고 및 분석을 통해 평가된다.
결과: 객관적 종양 반응은 완전 반응 (CR) 또는 부분 반응 (PR)의 최상의 전체 반응 (BOR)에 도달한 참여자의 수를 분석 집단 내의 참여자의 수로 나눈 것으로서 정의되는 전체 반응률 (ORR)에 의해 평가된다. 무진행 생존은 무작위화로부터 RECIST 1.1에 따라 평가된 객관적 질환 진행 (PD)의 최초 문서화 또는 임의의 원인으로 인한 사망 중 먼저 발생하는 날짜까지의 시간으로 정의된다. 항-PD-L1/TGFβ 트랩으로의 치료는 높은 HMGA2-발현 TNBC 환자에 대해 개선된 임상 반응을 이루어내는 것으로 고려된다. 치료된 환자는 질환 반응 (예를 들어, 부분 반응, 완전 반응, 안정 질환) 및/또는 개선된 생존 (예를 들어, 무진행 생존 및/또는 전체 생존)을 나타낸다. 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료는, 전신 화학요법에 비해 높은 HMGA2-발현 TNBC 환자의 우수한 생존을 이루어내는 것으로 고려된다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, TNBC 환자 사이의 집단 평균보다 1.73배 더 높은 MECOM 발현 수준으로서 간주되는 높은 MECOM 발현에 대해 TNBC 환자를 스크리닝한다. 이어서, 높은 MECOM 발현에 대한 미리 결정된 컷오프에 부합하는 30명의 환자로 동일한 연구를 수행한다.
요약하면, HMGA2는 TNBC 환자에서 항-PD-L1/TGFβ 트랩을 사용한 치료에 대한 개선된 반응을 결정하는 데 있어서 신뢰할만한 신규 바이오마커인 것으로 밝혀졌다.
넘버링된 실시양태
본원에 개시된 실시양태는 본 개시내용의 넘버링된　실시양태에 제공된 바와 같은 실시양태 P1 내지 P92를 포함한다.
실시양태 P1: 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 것을 포함하는, 환자에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 방법.
실시양태 P2: 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 것을 포함하는, TNBC 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 방법.
실시양태 P3: 환자에서 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 공지된 대조군 수준에 비해 환자에서의 증가된 HMGA2 발현 수준은 상기 환자를 항-TGFβ 작용제를 사용한 삼중 음성 유방암 (TNBC)의 치료에 적합한 것으로서 확인하는 것인, 항-TGFβ 작용제를 사용하여 환자의 TNBC를 치료 또는 관리하는 데 적합한 환자를 확인하는 방법.
실시양태 P4: 실시양태 P1 내지 P3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자의 HMGA2 수준이 환자로부터의 조직 샘플을 분석함으로써 결정되는 것인 방법.
실시양태 P5: 실시양태 P4에 있어서, 조직 샘플이 생검 샘플, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인 방법.
실시양태 P6: 실시양태 P4 또는 P5에 있어서, HMGA2의 수준이 면역화학에 의해 또는 RNA 발현 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
실시양태 P7: 실시양태 P1 내지 P6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-TGFβ 작용제가 (a) 적어도 인간 단백질 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 영역; 및 (b) 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)에 결합할 수 있는 인간 형질전환 성장 인자 β 수용체 II (TGFβRII) 또는 그의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 적어도 PD-L1에 결합하는 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이고; 여기서 제1 폴리펩티드의 중쇄 및 제2 폴리펩티드의 경쇄는, 조합될 때, PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하는 것인 방법.
실시양태 P8: 실시양태 P7에 있어서, 환자에게 적어도 1200 mg의 항-TGFβ 작용제가 투여되는 것인 방법.
실시양태 P9: 실시양태 P7에 있어서, 환자에게 적어도 1800 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P10: 실시양태 P7에 있어서, 환자에게 1800 mg 내지 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P11: 실시양태 P7에 있어서, 환자에게 1800 mg 내지 2100 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P12: 실시양태 P7에 있어서, 환자에게 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P13: 실시양태 P12에 있어서, 환자에게 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여되는 것인 방법.
실시양태 P14: 실시양태 P10에 있어서, 환자에게 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P15: 실시양태 P14에 있어서, 환자에게 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여되는 것인 방법.
실시양태 P16: 실시양태 P10에 있어서, 환자에게 2100 mg 또는 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여되는 것인 방법.
실시양태 P17: 실시양태 P1 내지 P16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 HMGA2 mRNA 발현의 정량화를 통해 결정된 것인 방법.
실시양태 P18: 실시양태 P17에 있어서, HMGA2 mRNA 발현의 정량화가 PCR을 통해 이루어지는 것인 방법.
실시양태 P19: 실시양태 P1 내지 P18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균 HMGA2 발현보다 적어도 2.27-배 더 큰 것인 방법.
실시양태 P20: 실시양태 P1 내지 P19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균 HMGA2 발현보다 적어도 5-배 더 큰 것인 방법.
실시양태 P21: 실시양태 P1 내지 P18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 정상 HMGA2 발현 수준보다 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과인 방법.
실시양태 P22: 실시양태 P1 내지 P18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자에서의 증가된 HMGA2 발현은 항-TGFβ 작용제를 사용한 치료에 대해 비반응성인 환자에서의 HMGA2 발현보다 적어도 19- 내지 35-배 더 큰 것인 방법.
실시양태 P23: 실시양태 P1 내지 P16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 HMGA2 단백질 발현 수준에 의해 결정된 것인 방법.
실시양태 P24: 실시양태 P23에 있어서, 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준이 면역조직화학을 통해 결정된 것인 방법.
실시양태 P25: 실시양태 P24에 있어서, TNBC 환자로부터 수득된 조직 샘플에서의 1% 초과의 HMGA2 단백질 발현 종양 세포로 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준을 결정한 것인 방법.
실시양태 P26: 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 것을 포함하는, 환자에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 방법.
실시양태 P27: 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 것을 포함하는, TNBC 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 방법.
실시양태 P28: 환자에서 MECOM의 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 공지된 대조군 수준에 비해 환자에서의 증가된 MECOM 발현 수준이 환자를 항-TGFβ 작용제를 사용하여 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 데 적합한 것으로서 확인하는 것인, 항-TGFβ 작용제를 사용하여 환자의 TNBC를 치료 또는 관리하는 데 적합한 환자를 확인하는 방법.
실시양태 P29: 실시양태 P26 내지 P28 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자의 MECOM 수준이 환자로부터의 샘플을 분석함으로써 결정되는 것인 방법.
실시양태 P30: 실시양태 P29에 있어서, 샘플이 생검 샘플, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인 방법.
실시양태 P31: 실시양태 P29 또는 P30에 있어서, MECOM 수준이 면역화학에 의해 또는 RNA 발현 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
실시양태 P32: 실시양태 P26 내지 P31 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-TGFβ 작용제가 (a) 적어도 인간 단백질 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 영역; 및 (b) 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)에 결합할 수 있는 인간 형질전환 성장 인자 β 수용체 II (TGFβRII) 또는 그의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 적어도 PD-L1에 결합하는 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이고; 여기서 제1 폴리펩티드의 중쇄 및 제2 폴리펩티드의 경쇄는, 조합될 때, PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하는 것인 방법.
실시양태 P33: 실시양태 P32에 있어서, 환자에게 적어도 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P34: 실시양태 P32 또는 P33에 있어서, 환자에게 적어도 1800 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P35: 실시양태 P34에 있어서, 환자에게 1800 mg 내지 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P36: 실시양태 P35에 있어서, 환자에게 1800 mg 내지 2100 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P37: 실시양태 P36에 있어서, 환자에게 1200 mg의 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P38: 실시양태 P37에 있어서, 환자에게 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 2주마다 1회 투여되는 것인 방법.
실시양태 P39: 실시양태 P35에 있어서, 환자에게 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
실시양태 P40: 실시양태 P39에 있어서, 환자에게 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여되는 것인 방법.
실시양태 P41: 실시양태 P35에 있어서, 환자에게 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여되는 것인 방법.
실시양태 P42: 실시양태 P26 내지 P41 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 MECOM mRNA 발현의 정량화를 통해 결정된 것인 방법.
실시양태 P43: 실시양태 P42에 있어서, MECOM mRNA 발현의 정량화가 PCR을 통해 이루어지는 것인 방법.
실시양태 P44: 실시양태 P26 내지 P43 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 TNBC 환자 사이의 MECOM 발현의 공지된 집단 평균 수준보다 적어도 1.5-배 더 큰 것인 방법.
실시양태 P45: 실시양태 P26 내지 P43 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 TNBC 환자 사이의 MECOM 발현의 공지된 집단 평균 수준보다 적어도 2.5-배 더 큰 것인 방법.
실시양태 P46: 실시양태 P26 내지 P43 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 정상 MECOM 발현 수준보다 적어도 100%, 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과인 방법.
실시양태 P47: 실시양태 P26 내지 P43 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자에서의 증가된 MECOM 발현이 항-TGFβ 작용제를 사용한 치료에 대해 비반응성인 환자에서의 MECOM 발현보다 적어도 19-배 더 큰 것인 방법.
실시양태 P48: 실시양태 P26 내지 P41 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 MECOM 단백질의 정량화를 통해 결정된 것인 방법.
실시양태 P49: 실시양태 P48에 있어서, 증가된 MECOM 단백질 수준이 면역조직화학을 통해 결정된 것인 방법.
실시양태 P50: 실시양태 P49에 있어서, TNBC 환자로부터 수득된 조직 샘플에서의 1% 초과의 MECOM 단백질 발현 종양 세포로 증가된 MECOM 단백질 발현 수준을 결정한 것인 방법.
실시양태 P51: 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 것을 포함하는, 환자에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 방법에 사용하기 위한 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P52: 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 것을 포함하는, TNBC 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 방법에 사용하기 위한 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P53: 환자에서 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 공지된 대조군 수준에 비해 환자에서의 증가된 HMGA2 발현 수준은 상기 환자를 항-TGFβ 작용제를 사용한 삼중 음성 유방암 (TNBC)의 치료에 적합한 것으로서 확인하는 것인, 항-TGFβ 작용제를 사용하여 환자의 TNBC를 치료 또는 관리하는 데 적합한 환자를 확인하는 방법에 사용하기 위한 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P54: 실시양태 P51 내지 P53 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자의 HMGA2 수준이 환자로부터의 조직 샘플을 분석함으로써 결정되는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P55: 실시양태 P54에 있어서, 조직 샘플이 생검 샘플, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P56: 실시양태 P54 또는 P55에 있어서, HMGA2의 수준이 면역화학에 의해 또는 RNA 발현 분석에 의해 결정되는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P57: 실시양태 P51 내지 P56 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 HMGA2 mRNA 발현의 정량화를 통해 결정된 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P58: 실시양태 P57에 있어서, HMGA2 mRNA 발현의 정량화가 PCR을 통해 이루어지는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P59: 실시양태 P51 내지 P58 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균 HMGA2 발현보다 적어도 2.27-배 더 큰 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P60: 실시양태 P51 내지 P59 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균 HMGA2 발현보다 적어도 5-배 더 큰 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P61: 실시양태 P51 내지 P58 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 정상 HMGA2 발현 수준보다 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P62: 실시양태 P51 내지 P58 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자에서의 증가된 HMGA2 발현이 항-TGFβ 작용제를 사용한 치료에 대해 비반응성인 환자에서의 HMGA2 발현보다 적어도 19- 내지 35-배 더 큰 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P63: 실시양태 P51 내지 P56 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 HMGA2 단백질 발현 수준에 의해 결정된 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P64: 실시양태 P63에 있어서, 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준이 면역조직화학을 통해 결정된 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P65: 실시양태 P64에 있어서, TNBC 환자로부터 수득된 조직 샘플에서의 1% 초과의 HMGA2 단백질 발현 종양 세포로 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준을 결정한 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P66: 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 것을 포함하는, 환자에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 방법에 사용하기 위한 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P67: 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 MECOM 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 것을 포함하는, TNBC 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 방법에 사용하기 위한 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P68: 환자에서 MECOM의 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 공지된 대조군 수준에 비해 환자에서의 증가된 MECOM 발현 수준이 환자를 항-TGFβ 작용제를 사용하여 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 데 적합한 것으로서 확인하는 것인, 항-TGFβ 작용제를 사용하여 환자의 TNBC를 치료 또는 관리하는 데 적합한 환자를 확인하는 방법에 사용하기 위한 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P69: 실시양태 P66 내지 P68 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자의 MECOM 수준이 환자로부터의 샘플을 분석함으로써 결정되는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P70: 실시양태 P69에 있어서, 샘플이 생검 샘플, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P71: 실시양태 P69 또는 P70에 있어서, MECOM 수준이 면역화학에 의해 또는 RNA 발현 분석에 의해 결정되는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P72: 실시양태 P66 내지 P71 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 MECOM mRNA 발현의 정량화를 통해 결정된 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P73: 실시양태 P72에 있어서, MECOM mRNA 발현의 정량화가 PCR을 통해 이루어지는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P74: 실시양태 P66 내지 P73 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 TNBC 환자 사이의 MECOM 발현의 공지된 집단 평균 수준보다 적어도 1.5-배 더 큰 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P75: 실시양태 P66 내지 P73 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 TNBC 환자 사이의 MECOM 발현의 공지된 집단 평균 수준보다 적어도 2.5-배 더 큰 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P76: 실시양태 P66 내지 P73 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 정상 MECOM 발현 수준보다 적어도 100%, 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P77: 실시양태 P66 내지 P73 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자에서의 증가된 MECOM 발현이 항-TGFβ 작용제를 사용한 치료에 대해 비반응성인 환자에서의 MECOM 발현보다 적어도 19-배 더 큰 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P78: 실시양태 P66 내지 P71 중 어느 한 실시양태에 있어서, 증가된 MECOM 발현이 MECOM 단백질의 정량화를 통해 결정된 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P79: 실시양태 P78에 있어서, 증가된 MECOM 단백질 수준이 면역조직화학을 통해 결정된 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P80: 실시양태 P79에 있어서, TNBC 환자로부터 수득된 조직 샘플에서의 1% 초과의 MECOM 단백질 발현 종양 세포로 증가된 MECOM 단백질 발현 수준을 결정한 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P81: 실시양태 P51 내지 P80 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-TGFβ 작용제가 (a) 적어도 인간 단백질 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 영역; 및 (b) 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)에 결합할 수 있는 인간 형질전환 성장 인자 β 수용체 II (TGFβRII) 또는 그의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 적어도 PD-L1에 결합하는 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이고; 여기서 제1 폴리펩티드의 중쇄 및 제2 폴리펩티드의 경쇄는, 조합될 때, PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P82: 실시양태 P51 내지 P81 중 어느 한 실시양태에 있어서, 용량이 1200 mg 내지 3000 mg인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P83: 실시양태 P82에 있어서, 용량이 1200 mg인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P84: 실시양태 P83에 있어서, 용량이 2주마다 1회 투여되는 1200 mg인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P85: 실시양태 P51 내지 P82 중 어느 한 실시양태에 있어서, 용량이 2100 mg 내지 2400 mg인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P86: 실시양태 P85에 있어서, 단백질이 3주마다 1회 투여되는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P87: 실시양태 P86에 있어서, 용량이 3주마다 1회 투여되는 2100 mg인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P88: 실시양태 P86에 있어서, 용량이 3주마다 1회 투여되는 2400 mg인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P89: 실시양태 P51 내지 P82 중 어느 한 실시양태에 있어서, 용량이 3주마다 1회 투여되는 3000 mg인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P90: 실시양태 P51 내지 P89 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단백질이 정맥내 투여에 의해 투여되는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P91: 실시양태 P90에 있어서, 정맥내 투여가 단백질 포함 제제를 포함하는 사전충전 백, 사전충전 펜 또는 사전충전 시린지로 수행되는 것인 항-TGFβ 작용제.
실시양태 P92: 실시양태 P91에 있어서, 백이 튜브 및/또는 바늘을 포함하는 채널에 연결되는 것인 항-TGFβ 작용제.
서열
서열식별번호: 1
분비된 항-PD-L1 람다 경쇄의 펩티드 서열
Figure pct00019
서열식별번호: 2
항-PDL1의 분비된 H 쇄의 펩티드 서열
Figure pct00020
서열식별번호: 3
항-PDL1/TGFβ 트랩의 분비된 H 쇄의 펩티드 서열
Figure pct00021
서열식별번호: 4
항-PD-L1 람다 경쇄의 번역 개시 코돈에서부터 번역 정지 코돈까지의 DNA 서열 (VL에 선행하는 리더 서열은 유로키나제 플라스미노겐 활성화제로부터의 신호 펩티드임)
Figure pct00022
서열식별번호: 5
번역 개시 코돈에서부터 번역 정지 코돈까지의 DNA 서열 (mVK SP 리더: 밑줄표시한 소문자; VH: 대문자; K에서 A로의 돌연변이를 갖는 IgG1m3: 소문자; (G4S)x4-G (서열식별번호: 11) 링커: 볼드체 대문자; TGFβRII: 볼드체 밑줄표시한 소문자; 2개의 정지 코돈: 볼드체 밑줄표시한 대문자)
Figure pct00023
서열식별번호: 6
A31G, D52E, R99Y 돌연변이가 있는, 항-PD-L1(mut)/TGFβ 트랩의 분비된 람다 경쇄의 폴리펩티드 서열
Figure pct00024
서열식별번호: 7
항-PD-L1(mut)/TGFβ 트랩의 분비된 중쇄의 폴리펩티드 서열
Figure pct00025
서열식별번호: 8
인간 TGFβRII 이소형 A 전구체 폴리펩티드 (NCBI RefSeq 수탁 번호: NP_001020018)
Figure pct00026
서열식별번호: 9
인간 TGFβRII 이소형 B 전구체 폴리펩티드 (NCBI RefSeq 수탁 번호: NP_003233)
Figure pct00027
서열식별번호: 10
인간 TGFβRII 이소형 B 세포외 도메인 폴리펩티드
Figure pct00028
서열식별번호: 11
(Gly4Ser)4Gly 링커
Figure pct00029
서열식별번호: 12
항-PD-L1 항체 MPDL3289A의 분비된 중쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열
Figure pct00030
서열식별번호: 13
항-PD-L1 항체 MPDL3289A의 분비된 경쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열
Figure pct00031
서열식별번호: 14
항-PD-L1 항체 YW243.55S70의 분비된 중쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열
Figure pct00032
서열식별번호: 50
말단절단된 인간 TGFβRII 이소형 B 세포외 도메인 폴리펩티드
Figure pct00033
서열식별번호: 51
말단절단된 인간 TGFβRII 이소형 B 세포외 도메인 폴리펩티드
Figure pct00034
서열식별번호: 52
말단절단된 인간 TGFβRII 이소형 B 세포외 도메인 폴리펩티드
Figure pct00035
서열식별번호: 53
말단절단된 인간 TGFβRII 이소형 B 세포외 도메인 폴리펩티드
Figure pct00036
서열식별번호: 54
돌연변이된 인간 TGFβRII 이소형 B 세포외 도메인 폴리펩티드
Figure pct00037
서열식별번호: 55
항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열
Figure pct00038
서열식별번호: 56
항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열
Figure pct00039
서열식별번호: 57
항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열
Figure pct00040
서열식별번호: 58
항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열
Figure pct00041
서열식별번호: 59
항-PD-L1 항체의 중쇄의 폴리펩티드 서열
Figure pct00042
서열식별번호: 60
항-PD-L1 항체의 경쇄의 폴리펩티드 서열
Figure pct00043
서열식별번호: 61
항-PD-L1 항체의 중쇄의 폴리펩티드 서열
Figure pct00044
서열식별번호: 62
항-PD-L1 항체의 경쇄의 폴리펩티드 서열
Figure pct00045
서열식별번호: 63
HMGA2 변이체 1 RefSeq NM_003483.4
>NM_003483.4 호모 사피엔스 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2), 전사체 변이체 1, mRNA
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
서열식별번호: 64
MECOM RefSeq NM_001105077.3
>NM_001105077.3 호모 사피엔스 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 (MECOM), 전사체 변이체 1, mRNA
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
서열식별번호: 65
합성 구축물
Figure pct00053
서열식별번호: 66
>NP_003474.1 고 이동성 그룹 단백질 HMGI-C 이소형 a [호모 사피엔스]
Figure pct00054
서열식별번호: 67
>NP_001098547.3 MDS1 및 EVI1 복합체 유전자좌 단백질 이소형 a [호모 사피엔스]
Figure pct00055
참조로 포함
본원에 언급된 각 특허 문헌 및 과학 논문의 전체 개시내용이 모든 목적을 위해 참고로 포함된다.
등가물
본 개시내용은 그의 취지 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않으면서 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서 상기 실시양태는 모든 측면에서 본원에 기재된 본 개시내용을 제한하기보다는 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 상이한 실시양태의 다양한 구조적 요소 및 다양한 개시된 방법 단계가 다양한 조합 및 순열로 활용될 수 있고, 모든 이러한 변형예는 본 개시내용의 형태로 간주되어야 한다. 따라서, 본 개시내용의 범주는 상기 상세한 설명보다는 첨부된 청구범위에 의해 나타내어지고, 청구범위의 의미 및 등가물의 범위 내에 속하는 모든 변화는 본원에 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> MERCK PATENT GMBH <120> TREATMENT OF TRIPLE NEGATIVE BREAST CANCER WITH TARGETED TGF-B INHIBITION <130> EMD-009WO <150> 62/721,249 <151> 2018-08-22 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 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180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaaccggcc ctccggcgtg 240 tccaacagat tctccggctc caagtccggc aacaccgcct ccctgaccat cagcggactg 300 caggcagagg acgaggccga ctactactgc tcctcctaca cctcctccag caccagagtg 360 ttcggcaccg gcacaaaagt gaccgtgctg ggccagccca aggccaaccc aaccgtgaca 420 ctgttccccc catcctccga ggaactgcag gccaacaagg ccaccctggt ctgcctgatc 480 tcagatttct atccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ctgatggctc cccagtgaag 540 gccggcgtgg aaaccaccaa gccctccaag cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc 600 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctacagctg ccaggtcaca 660 cacgagggct ccaccgtgga aaagaccgtc gcccccaccg agtgctcatg a 711 <210> 5 <211> 1887 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 atggaaacag acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg ctccacaggc 60 gaggtgcagc tgctggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 120 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacatca tgatgtgggt gcgacaggcc 180 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctacccct ccggcggcat caccttctac 240 gccgacaccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 300 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatcaag 360 ctgggcaccg tgaccaccgt ggactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 420 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtgct ggcggcggag gaagcggagg aggtggcagc 1440 ggtggcggtg gctccggcgg aggtggctcc ggaatccctc cccacgtgca gaagtccgtg 1500 aacaacgaca tgatcgtgac cgacaacaac ggcgccgtga agttccctca gctgtgcaag 1560 ttctgcgacg tgaggttcag cacctgcgac aaccagaagt cctgcatgag caactgcagc 1620 atcacaagca tctgcgagaa gccccaggag gtgtgtgtgg ccgtgtggag gaagaacgac 1680 gaaaacatca ccctcgagac cgtgtgccat gaccccaagc tgccctacca cgacttcatc 1740 ctggaagacg ccgcctcccc caagtgcatc atgaaggaga agaagaagcc cggcgagacc 1800 ttcttcatgt gcagctgcag cagcgacgag tgcaatgaca acatcatctt tagcgaggag 1860 tacaacacca gcaaccccga ctgataa 1887 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met Met Val Trp Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Trp Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro 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900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcacg ggatgagctg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtcccc gggtaaa 1407 <210> 49 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide from human Fab library <400> 49 atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cttaagccag 60 tccgccctga cccagcctgc ctccgtgtct ggctcccctg gccagtccat caccatcagc 120 tgcaccggca cctccagcga cgtgggcggc tacaactacg tgtcctggta tcagcagcac 180 cccggcaagg cccccaagct gatgatctac gacgtgtcca accggccctc cggcgtgtcc 240 aacagattct ccggctccaa gtccggcaac accgcctccc tgaccatcag cggactgcag 300 gcagaggacg aggccgacta ctactgctcc tcctacacct cctccagcac cagagtgttc 360 ggcaccggca caaaagtgac cgtgctgggc cagcccaagg ccaacccaac cgtgacactg 420 ttccccccat cctccgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatctca 480 gatttctatc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggctg atggctcccc agtgaaggcc 540 ggcgtggaaa ccaccaagcc ctccaagcag tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac 600 ctgtccctga cccccgagca gtggaagtcc caccggtcct acagctgcca ggtcacacac 660 gagggctcca ccgtggaaaa gaccgtcgcc cccaccgagt gctca 705 <210> 50 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe 1 5 10 15 Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr 20 25 30 Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys 35 40 45 Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu 50 55 60 Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys 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Ser Leu Gly Ala 435 440 445 <210> 62 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His 20 25 30 Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu 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cggcggcagc 660 ctaagcaaca gcagccctcg cagcccgcca gctcgcgctc gccccgccgg cgtccccagc 720 cctatcacct catctcccga aaggtgctgg gcagctccgg ggcggtcgag gcgaagcggc 780 tgcagcggcg gtagcggcgg cgggaggcag gatgagcgca cgcggtgagg gcgcggggca 840 gccgtccact tcagcccagg gacaacctgc cgccccagcg cctcagaaga gaggacgcgg 900 ccgccccagg aagcagcagc aagaaccaac cggtgagccc tctcctaaga gacccagggg 960 aagacccaaa ggcagcaaaa acaagagtcc ctctaaagca gctcaaaaga aagcagaagc 1020 cactggagaa aaacggccaa gaggcagacc taggaaatgg ccacaacaag ttgttcagaa 1080 gaagcctgct caggaggaaa ctgaagagac atcctcacaa gagtctgccg aagaggacta 1140 gggggcgcca acgttcgatt tctacctcag cagcagttgg atcttttgaa gggagaagac 1200 actgcagtga ccacttattc tgtattgcca tggtctttcc actttcatct ggggtggggt 1260 ggggtggggt gggggagggg ggggtggggt ggggagaaat cacataacct taaaaaggac 1320 tatattaatc accttctttg taatcccttc acagtcccag gtttagtgaa aaactgctgt 1380 aaacacaggg gacacagctt aacaatgcaa cttttaatta ctgttttctt ttttcttaac 1440 ctactaatag tttgttgatc tgataagcaa gagtgggcgg gtgagaaaaa ccgaattggg 1500 tttagtcaat cactgcactg catgcaaaca agaaacgtgt cacacttgtg acgtcgggca 1560 ttcatatagg aagaacgcgg tgtgtaacac tgtgtacacc tcaaatacca ccccaaccca 1620 ctccctgtag tgaatcctct gtttagaaca ccaaagataa ggactagata ctactttctc 1680 tttttcgtat aatcttgtag acacttactt gatgattttt aactttttat ttctaaatga 1740 gacgaaatgc tgatgtatcc tttcattcag ctaacaaact agaaaaggtt atgttcattt 1800 ttcaaaaagg gaagtaagca aacaaatatt gccaactctt ctatttatgg atatcacaca 1860 tatcagcagg agtaataaat ttactcacag cacttgtttt caggacaaca cttcattttc 1920 aggaaatcta cttcctacag agccaaaatg ccatttagca ataaataaca cttgtcagcc 1980 tcagagcatt taaggaaact agacaagtaa aattatcctc tttgtaattt aatgaaaagg 2040 tacaacagaa taatgcatga tgaactcacc taattatgag gtgggaggag cgaaatctaa 2100 atttcttttg ctatagttat acatcaattt aaaaagcaaa aaaaaaaaag gggggggcaa 2160 tctctctctg tgtctttctc tctctctctt cctctccctc tctcttttca ttgtgtatca 2220 gtttccatga aagacctgaa taccacttac ctcaaattaa gcatatgtgt tacttcaagt 2280 aatacgtttt gacataagat ggttgaccaa ggtgcttttc ttcggcttga gttcaccatc 2340 tcttcattca aactgcactt ttagccagag atgcaatata tccccactac tcaatactac 2400 ctctgaatgt tacaacgaat ttacagtcta gtacttatta catgctgcta tacacaagca 2460 atgcaagaaa aaaacttact gggtaggtga ttctaatcat ctgcagttct ttttgtacac 2520 ttaattacag ttaaagaagc aatctcctta ctgtgtttca gcatgactat gtatttttct 2580 atgttttttt aattaaaaat ttttaaaata cttgtttcag cttctctgct agatttctac 2640 attaacttga aaatttttta accaagtcgc tcctaggttc ttaaggataa ttttcctcaa 2700 tcacactaca catcacacaa gatttgactg taatatttaa atattaccct ccaagtctgt 2760 acctcaaatg aattctttaa ggagatggac taattgactt gcaaagacct acctccagac 2820 ttcaaaagga atgaacttgt tacttgcagc attcatttgt tttttcaatg tttgaaatag 2880 ttcaaactgc agctaaccct agtcaaaact atttttgtaa aagacatttg atagaaagga 2940 acacgttttt acatactttt gcaaaataag taaataataa ataaaataaa agccaacctt 3000 caaagaaact tgaagctttg taggtgagat gcaacaagcc ctgcttttgc ataatgcaat 3060 caaaaatatg tgtttttaag attagttgaa tataagaaaa tgcttgacaa atattttcat 3120 gtattttaca caaatgtgat ttttgtaata tgtctcaacc agatttattt taaacgcttc 3180 ttatgtagag tttttatgcc tttctctcct agtgagtgtg ctgacttttt aacatggtat 3240 tatcaactgg gccaggaggt agtttctcat gacggctttt gtcagtatgg cttttagtac 3300 tgaagccaaa tgaaactcaa aaccatctct cttccagctg cttcagggag gtagtttcaa 3360 aggccacata cctctctgag actggcagat cgctcactgt tgtgaatcac caaaggagct 3420 atggagagaa ttaaaactca acattactgt taactgtgcg ttaaataagc aaataaacag 3480 tggctcataa aaataaaagt cgcattccat atctttggat gggcctttta gaaacctcat 3540 tggccagctc ataaaatgga agcaattgct catgttggcc aaacatggtg caccgagtga 3600 tttccatctc tggtaaagtt acacttttat ttcctgtatg ttgtacaatc aaaacacact 3660 actacctctt aagtcccagt atacctcatt tttcatactg aaaaaaaaag cttgtggcca 3720 atggaacagt aagaacatca taaaattttt atatatatag tttatttttg tgggagataa 3780 attttatagg actgttcttt gctgttgttg gtcgcagcta cataagactg gacatttaac 3840 ttttctacca tttctgcaag ttaggtatgt ttgcaggaga aaagtatcaa gacgtttaac 3900 tgcagttgac tttctccctg ttcctttgag tgtcttctaa ctttattctt tgttctttat 3960 gtagaattgc tgtctatgat tgtactttga atcgcttgct tgttgaaaat atttctctag 4020 tgtattatca ctgtctgttc tgcacaataa acataacagc ctctgtgatc cccatgtgtt 4080 ttgattcctg ctctttgtta cagttccatt aaatgagtaa taaagtttgg tcaaaacaga 4140 aaaaaaaaaa 4150 <210> 64 <211> 4900 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 ccttgccaag taacagcttt gctgtccaac atcgtgtgct gcttcgcgag aaagtcacat 60 tcggaccctt tggctagatt gcttattcat agggcttctt gactaaagcc cttggagcac 120 tgggtttttc ttgaagtata tgatcttaga cgaattttac aatgtgaagt tctgcataga 180 tgccagtcaa ccagatgttg gaagctggct caagtacatt agattcgctg gctgttatga 240 tcagcacaac cttgttgcat gccagataaa tgatcagata ttctatagag tagttgcaga 300 cattgcgccg ggagaggagc ttctgctgtt catgaagagc gaagactatc cccatgaaac 360 tatggcgccg gatatccacg aagaacggca atatcgctgc gaagactgtg accagctctt 420 tgaatctaag gctgaactag cagatcacca aaagtttcca tgcagtactc ctcactcagc 480 attttcaatg gttgaagagg actttcagca aaaactcgaa agcgagaatg atctccaaga 540 gatacacacg atccaggagt gtaaggaatg tgaccaagtt tttcctgatt tgcaaagcct 600 ggagaaacac atgctgtcac atactgaaga gagggaatac aagtgtgatc agtgtcccaa 660 ggcatttaac tggaagtcca atttaattcg ccaccagatg tcacatgaca gtggaaagca 720 ctatgaatgt gaaaactgtg ccaagcaggt tttcacggac cctagcaacc ttcagcggca 780 cattcgctct cagcatgtcg gtgcccgggc ccatgcatgc ccggagtgtg gcaaaacgtt 840 tgccacttcg tcgggcctca aacaacacaa gcacatccac agcagtgtga agccctttat 900 ctgtgaggtc tgccataaat cctatactca gttttcaaac ctttgccgtc ataagcgcat 960 gcatgctgat tgcagaaccc aaatcaagtg caaagactgt ggacaaatgt tcagcactac 1020 gtcttcctta aataaacaca ggaggttttg tgagggcaag aaccattttg cggcaggtgg 1080 attttttggc caaggcattt cacttcctgg aaccccagct atggataaaa cgtccatggt 1140 taatatgagt catgccaacc cgggccttgc tgactatttt ggcgccaata ggcatcctgc 1200 tggtcttacc tttccaacag ctcctggatt ttcttttagc ttccctggtc tgtttccttc 1260 cggcttgtac cacaggcctc ctttgatacc tgctagttct cctgttaaag gactatcaag 1320 tactgaacag acaaacaaaa gtcaaagtcc cctcatgaca catcctcaga tactgccagc 1380 tacacaggat attttgaagg cactatctaa acacccatct gtaggggaca ataagccagt 1440 ggagctccag cccgagaggt cctctgaaga gaggcccttt gagaaaatca gtgaccagtc 1500 agagagtagt gaccttgatg atgtcagtac accaagtggc agtgacctgg aaacaacctc 1560 gggctctgat ctggaaagtg acattgaaag tgataaagag aaatttaaag aaaatggtaa 1620 aatgttcaaa gacaaagtaa gccctcttca gaatctggct tcaataaata ataagaaaga 1680 atacagcaat cattccattt tctcaccatc tttagaggag cagactgcgg tgtcaggagc 1740 tgtgaatgat tctataaagg ctattgcttc tattgctgaa aaatactttg gttcaacagg 1800 actggtgggg ctgcaagaca aaaaagttgg agctttacct tacccttcca tgtttcccct 1860 cccatttttt ccagcattct ctcaatcaat gtacccattt cctgatagag acttgagatc 1920 gttacctttg aaaatggaac cccaatcacc aggtgaagta aagaaactgc agaagggcag 1980 ctctgagtcc ccctttgatc tcaccactaa gcgaaaggat gagaagccct tgactccagt 2040 cccctccaag cctccagtga cacctgccac aagccaagac cagcccctgg atctaagtat 2100 gggcagtagg agtagagcca gtgggacaaa gctgactgag cctcgaaaaa accacgtgtt 2160 tgggggaaaa aaaggaagca acgtcgaatc aagacctgct tcagatggtt ccttgcagca 2220 tgcaagaccc actcctttct ttatggaccc tatttacaga gtagagaaaa gaaaactaac 2280 tgacccactt gaagctttaa aagagaaata cttgaggcct tctccaggat tcttgtttca 2340 cccacaattc caactgcctg atcagagaac ttggatgtca gctattgaaa acatggcaga 2400 aaagctagag agcttcagtg ccctgaaacc tgaggccagt gagctcttac agtcagtgcc 2460 ctctatgttc aacttcaggg cgcctcccaa tgccctgcca gagaaccttc tgcggaaggg 2520 aaaggagcgc tatacctgca gatactgtgg caagattttt ccaaggtctg caaacctaac 2580 acggcacttg agaacccaca caggagagca gccttacaga tgcaaatact gtgacagatc 2640 atttagcata tcttctaact tgcaaaggca tgttcgcaac atccacaata aagagaagcc 2700 atttaagtgt cacttatgtg ataggtgttt tggtcaacaa accaatttag acagacacct 2760 aaagaaacat gagaatggga acatgtccgg tacagcaaca tcgtcgcctc attctgaact 2820 ggaaagtaca ggtgcgattc tggatgacaa agaagatgct tacttcacag aaattcgaaa 2880 tttcattggg aacagcaacc atggcagcca atctcccagg aatgtggagg agagaatgaa 2940 tggcagtcat tttaaagatg aaaaggcttt ggtgaccagt caaaattcag acttgctgga 3000 tgatgaagaa gttgaagatg aggtgttgtt agatgaggag gatgaagaca atgatattac 3060 tggaaaaaca ggaaaggaac cagtgacaag taatttacat gaaggaaacc ctgaggatga 3120 ctatgaagaa accagtgccc tggagatgag ttgcaagaca tccccagtga ggtataaaga 3180 ggaagaatat aaaagtggac tttctgctct agatcatata aggcacttca cagatagcct 3240 caaaatgagg aaaatggaag ataatcaata ttctgaagct gagctgtctt cttttagtac 3300 ttcccatgtg ccagaggaac ttaagcagcc gttacacaga aagtccaaat cgcaggcata 3360 tgctatgatg ctgtcactgt ctgacaagga gtccctccat tctacatccc acagttcttc 3420 caacgtgtgg cacagtatgg ccagggctgc ggcggaatcc agtgctatcc agtccataag 3480 ccacgtatga cgttatcaag gttgaccaga gtgggaccaa gtccaacagt agcatggctc 3540 tttcatatag gactatttac aagactgctg agcagaatgc cttataaacc tgcagggtca 3600 ctcatctaaa gtctagtgac cttaaactga atgatttaaa aaagaaaaga aagaaaaaag 3660 aaactattta ttctcgatat tttgttttgc acagcaaagg cagctgctga cttctggaag 3720 atcaatcaat gcgacttaaa gtgattcagt gaaaacaaaa aacttggtgg gctgaaggca 3780 tcttccagtt taccccacct tagggtatgg gtgggtgaga agggcagttg agatggcagc 3840 attgatatga atgaacactc catagaaact gaattctctt ttgtacaaga tcacctgaca 3900 tgattgggaa cagttgcttt taattacaga tttaattttt ttcttcgtta aagttttatg 3960 taatttaacc ctttgaagac agaagtagtt ggatgaaatg cacagtcaat tattatagaa 4020 actgataaca gggagtactt gttccccctt ttgccttctt aagtacattg tttaaaacta 4080 gggaaaaagg gtatgtgtat attgtaaact atggatgtta acactcaaag aggttaagtc 4140 agtgaagtaa cctattcatc accagtaccg ctgtaccact aataaattgt ttgccaaatc 4200 cttgtaataa catcttaatt ttagacaatc atgtcactgt ttttaatgtt tatttttttg 4260 tgtgtgttgc gtgtatcatg tatttatttg ttggcaaact attgtttgtt gattaaaata 4320 gcactgttcc agtcagccac tactttatga cgtctgaggc acaccccttt ccgaatttca 4380 aggaccaagg tgacccgacc tgtgtatgag agtgccaaat ggtgtttggc ttttcttaac 4440 attccttttt gtttgtttgt tttgttttcc ttcttaatga actaaatacg aatagatgca 4500 acttagtttt tgtaatactg aaatcgattc aattgtataa acgattataa tttctttcat 4560 ggaagcatga ttcttctgat taaaaactgt actccatatt ttatgctggt tgtctgcaag 4620 cttgtgcgat gttatgttca tgttaatcct atttgtaaaa tgaagtgttc ccaaccttat 4680 gttaaaagag agaagtaaat aacagactgt attcagttat tttgcccttt attgaggaac 4740 cagatttgtt ttctttttgt ttgtaatctc attttgaaat aatcagcaag ttgaggtact 4800 ttcttcaaat gctttgtaca atataaactg ttatgccttt cagtgcatta ctatgggagg 4860 agcaactaaa aaataaagac ttacaaaaag gagtattttt 4900 <210> 65 <211> 386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 gcgaagcggc tgcagcggcg gtagcggcgg cgggaggcag gatgagcgca cgcggtgagg 60 gcgcggggca gccgtccact tcagcccagg gacaacctgc cgccccagcg cctcagaaga 120 gaggacgcgg ccgccccagg aagcagcagc aagaaccaac cggtgagccc tctcctaaga 180 gacccagggg aagacccaaa ggcagcaaaa acaagagtcc ctctaaagca gctcaaaaga 240 aagcagaagc cactggagaa aaacggccaa gaggcagacc taggaaatgg ccacaacaag 300 ttgttcagaa gaagcctgct caggtcaatg ttgccttgcc tgggaaggac cacccgggca 360 atcttatata tctactgttc tctaaa 386 <210> 66 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Met Ser Ala Arg Gly Glu Gly Ala Gly Gln Pro Ser Thr Ser Ala Gln 1 5 10 15 Gly Gln Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gln Lys Arg Gly Arg Gly Arg Pro 20 25 30 Arg Lys Gln Gln Gln Glu Pro Thr Gly Glu Pro Ser Pro Lys Arg Pro 35 40 45 Arg Gly Arg Pro Lys Gly Ser Lys Asn Lys Ser Pro Ser Lys Ala Ala 50 55 60 Gln Lys Lys Ala Glu Ala Thr Gly Glu Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro 65 70 75 80 Arg Lys Trp Pro Gln Gln Val Val Gln Lys Lys Pro Ala Gln Glu Glu 85 90 95 Thr Glu Glu Thr Ser Ser Gln Glu Ser Ala Glu Glu Asp 100 105 <210> 67 <211> 1116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Met Ile Leu Asp Glu Phe Tyr Asn Val Lys Phe Cys Ile Asp Ala Ser 1 5 10 15 Gln Pro Asp Val Gly Ser Trp Leu Lys Tyr Ile Arg Phe Ala Gly Cys 20 25 30 Tyr Asp Gln His Asn Leu Val Ala Cys Gln Ile Asn Asp Gln Ile Phe 35 40 45 Tyr Arg Val Val Ala Asp Ile Ala Pro Gly Glu Glu Leu Leu Leu Phe 50 55 60 Met Lys Ser Glu Asp Tyr Pro His Glu Thr Met Ala Pro Asp Ile His 65 70 75 80 Glu Glu Arg Gln Tyr Arg Cys Glu Asp Cys Asp Gln Leu Phe Glu Ser 85 90 95 Lys Ala Glu Leu Ala Asp His Gln Lys Phe Pro Cys Ser Thr Pro His 100 105 110 Ser Ala Phe Ser Met Val Glu Glu Asp Phe Gln Gln Lys Leu Glu Ser 115 120 125 Glu Asn Asp Leu Gln Glu Ile His Thr Ile Gln Glu Cys Lys Glu Cys 130 135 140 Asp Gln Val Phe Pro Asp Leu Gln Ser Leu Glu Lys His Met Leu Ser 145 150 155 160 His Thr Glu Glu Arg Glu Tyr Lys Cys Asp Gln Cys Pro Lys Ala Phe 165 170 175 Asn Trp Lys Ser Asn Leu Ile Arg His Gln Met Ser His Asp Ser Gly 180 185 190 Lys His Tyr Glu Cys Glu Asn Cys Ala Lys Gln Val Phe Thr Asp Pro 195 200 205 Ser Asn Leu Gln Arg His Ile Arg Ser Gln His Val Gly Ala Arg Ala 210 215 220 His Ala Cys Pro Glu Cys Gly Lys Thr Phe Ala Thr Ser Ser Gly Leu 225 230 235 240 Lys Gln His Lys His Ile His Ser Ser Val Lys Pro Phe Ile Cys Glu 245 250 255 Val Cys His Lys Ser Tyr Thr Gln Phe Ser Asn Leu Cys Arg His Lys 260 265 270 Arg Met His Ala Asp Cys Arg Thr Gln Ile Lys Cys Lys Asp Cys Gly 275 280 285 Gln Met Phe Ser Thr Thr Ser Ser Leu Asn Lys His Arg Arg Phe Cys 290 295 300 Glu Gly Lys Asn His Phe Ala Ala Gly Gly Phe Phe Gly Gln Gly Ile 305 310 315 320 Ser Leu Pro Gly Thr Pro Ala Met Asp Lys Thr Ser Met Val Asn Met 325 330 335 Ser His Ala Asn Pro Gly Leu Ala Asp Tyr Phe Gly Ala Asn Arg His 340 345 350 Pro Ala Gly Leu Thr Phe Pro Thr Ala Pro Gly Phe Ser Phe Ser Phe 355 360 365 Pro Gly Leu Phe Pro Ser Gly Leu Tyr His Arg Pro Pro Leu Ile Pro 370 375 380 Ala Ser Ser Pro Val Lys Gly Leu Ser Ser Thr Glu Gln Thr Asn Lys 385 390 395 400 Ser Gln Ser Pro Leu Met Thr His Pro Gln Ile Leu Pro Ala Thr Gln 405 410 415 Asp Ile Leu Lys Ala Leu Ser Lys His Pro Ser Val Gly Asp Asn Lys 420 425 430 Pro Val Glu Leu Gln Pro Glu Arg Ser Ser Glu Glu Arg Pro Phe Glu 435 440 445 Lys Ile Ser Asp Gln Ser Glu Ser Ser Asp Leu Asp Asp Val Ser Thr 450 455 460 Pro Ser Gly Ser Asp Leu Glu Thr Thr Ser Gly Ser Asp Leu Glu Ser 465 470 475 480 Asp Ile Glu Ser Asp Lys Glu Lys Phe Lys Glu Asn Gly Lys Met Phe 485 490 495 Lys Asp Lys Val Ser Pro Leu Gln Asn Leu Ala Ser Ile Asn Asn Lys 500 505 510 Lys Glu Tyr Ser Asn His Ser Ile Phe Ser Pro Ser Leu Glu Glu Gln 515 520 525 Thr Ala Val Ser Gly Ala Val Asn Asp Ser Ile Lys Ala Ile Ala Ser 530 535 540 Ile Ala Glu Lys Tyr Phe Gly Ser Thr Gly Leu Val Gly Leu Gln Asp 545 550 555 560 Lys Lys Val Gly Ala Leu Pro Tyr Pro Ser Met Phe Pro Leu Pro Phe 565 570 575 Phe Pro Ala Phe Ser Gln Ser Met Tyr Pro Phe Pro Asp Arg Asp Leu 580 585 590 Arg Ser Leu Pro Leu Lys Met Glu Pro Gln Ser Pro Gly Glu Val Lys 595 600 605 Lys Leu Gln Lys Gly Ser Ser Glu Ser Pro Phe Asp Leu Thr Thr Lys 610 615 620 Arg Lys Asp Glu Lys Pro Leu Thr Pro Val Pro Ser Lys Pro Pro Val 625 630 635 640 Thr Pro Ala Thr Ser Gln Asp Gln Pro Leu Asp Leu Ser Met Gly Ser 645 650 655 Arg Ser Arg Ala Ser Gly Thr Lys Leu Thr Glu Pro Arg Lys Asn His 660 665 670 Val Phe Gly Gly Lys Lys Gly Ser Asn Val Glu Ser Arg Pro Ala Ser 675 680 685 Asp Gly Ser Leu Gln His Ala Arg Pro Thr Pro Phe Phe Met Asp Pro 690 695 700 Ile Tyr Arg Val Glu Lys Arg Lys Leu Thr Asp Pro Leu Glu Ala Leu 705 710 715 720 Lys Glu Lys Tyr Leu Arg Pro Ser Pro Gly Phe Leu Phe His Pro Gln 725 730 735 Phe Gln Leu Pro Asp Gln Arg Thr Trp Met Ser Ala Ile Glu Asn Met 740 745 750 Ala Glu Lys Leu Glu Ser Phe Ser Ala Leu Lys Pro Glu Ala Ser Glu 755 760 765 Leu Leu Gln Ser Val Pro Ser Met Phe Asn Phe Arg Ala Pro Pro Asn 770 775 780 Ala Leu Pro Glu Asn Leu Leu Arg Lys Gly Lys Glu Arg Tyr Thr Cys 785 790 795 800 Arg Tyr Cys Gly Lys Ile Phe Pro Arg Ser Ala Asn Leu Thr Arg His 805 810 815 Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Gln Pro Tyr Arg Cys Lys Tyr Cys Asp 820 825 830 Arg Ser Phe Ser Ile Ser Ser Asn Leu Gln Arg His Val Arg Asn Ile 835 840 845 His Asn Lys Glu Lys Pro Phe Lys Cys His Leu Cys Asp Arg Cys Phe 850 855 860 Gly Gln Gln Thr Asn Leu Asp Arg His Leu Lys Lys His Glu Asn Gly 865 870 875 880 Asn Met Ser Gly Thr Ala Thr Ser Ser Pro His Ser Glu Leu Glu Ser 885 890 895 Thr Gly Ala Ile Leu Asp Asp Lys Glu Asp Ala Tyr Phe Thr Glu Ile 900 905 910 Arg Asn Phe Ile Gly Asn Ser Asn His Gly Ser Gln Ser Pro Arg Asn 915 920 925 Val Glu Glu Arg Met Asn Gly Ser His Phe Lys Asp Glu Lys Ala Leu 930 935 940 Val Thr Ser Gln Asn Ser Asp Leu Leu Asp Asp Glu Glu Val Glu Asp 945 950 955 960 Glu Val Leu Leu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Asn Asp Ile Thr Gly Lys 965 970 975 Thr Gly Lys Glu Pro Val Thr Ser Asn Leu His Glu Gly Asn Pro Glu 980 985 990 Asp Asp Tyr Glu Glu Thr Ser Ala Leu Glu Met Ser Cys Lys Thr Ser 995 1000 1005 Pro Val Arg Tyr Lys Glu Glu Glu Tyr Lys Ser Gly Leu Ser Ala 1010 1015 1020 Leu Asp His Ile Arg His Phe Thr Asp Ser Leu Lys Met Arg Lys 1025 1030 1035 Met Glu Asp Asn Gln Tyr Ser Glu Ala Glu Leu Ser Ser Phe Ser 1040 1045 1050 Thr Ser His Val Pro Glu Glu Leu Lys Gln Pro Leu His Arg Lys 1055 1060 1065 Ser Lys Ser Gln Ala Tyr Ala Met Met Leu Ser Leu Ser Asp Lys 1070 1075 1080 Glu Ser Leu His Ser Thr Ser His Ser Ser Ser Asn Val Trp His 1085 1090 1095 Ser Met Ala Arg Ala Ala Ala Glu Ser Ser Ala Ile Gln Ser Ile 1100 1105 1110 Ser His Val 1115

Claims (56)

  1. 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 것을 포함하는, 환자에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 방법.
  2. 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 것을 포함하는, TNBC 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 방법.
  3. 환자에서 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 공지된 대조군 수준에 비해 환자에서의 증가된 HMGA2 발현 수준은 상기 환자를 항-TGFβ 작용제를 사용한 삼중 음성 유방암 (TNBC)의 치료에 적합한 것으로서 확인하는 것인, 항-TGFβ 작용제를 사용하여 환자의 TNBC를 치료 또는 관리하는 데 적합한 환자를 확인하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 HMGA2 수준이 환자로부터의 조직 샘플을 분석함으로써 결정되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 조직 샘플이 생검 샘플, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, HMGA2의 수준이 면역화학에 의해 또는 RNA 발현 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TGFβ 작용제가 (a) 적어도 인간 단백질 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 영역; 및 (b) 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)에 결합할 수 있는 인간 형질전환 성장 인자 β 수용체 II (TGFβRII) 또는 그의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 적어도 PD-L1에 결합하는 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이고; 여기서 제1 폴리펩티드의 중쇄 및 제2 폴리펩티드의 경쇄는, 조합될 때, PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 서열식별번호(SEQ ID NO): 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 적어도 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 적어도 1800 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
  12. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 1800 mg 내지 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
  13. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 1800 mg 내지 2100 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
  14. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 환자에게 1200 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 2주마다 1회 투여되는 것인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 환자에게 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 투여되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 환자에게 2400 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여되는 것인 방법.
  18. 제12항에 있어서, 환자에게 2100 mg 또는 3000 mg의 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여되는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 HMGA2 mRNA 발현의 정량화를 통해 결정된 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, HMGA2 mRNA 발현의 정량화가 PCR을 통해 이루어지는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균 HMGA2 발현보다 적어도 2.27-배 더 큰 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균 HMGA2 발현보다 적어도 5-배 더 큰 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 정상 HMGA2 발현 수준보다 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과인 방법.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서의 증가된 HMGA2 발현이 항-TGFβ 작용제를 사용한 치료에 대해 비반응성인 환자에서의 HMGA2 발현보다 적어도 19- 내지 35-배 더 큰 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 HMGA2 단백질 발현 수준에 의해 결정된 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준이 면역조직화학을 통해 결정된 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, TNBC 환자로부터 수득된 조직 샘플에서의 1% 초과의 HMGA2 단백질 발현 종양 세포로 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준을 결정한 것인 방법.
  28. 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 것을 포함하는, 환자에서 TNBC를 치료 또는 관리하는 방법에 사용하기 위한 항-TGFβ 작용제.
  29. 공지된 대조군 수준에 비해 증가된 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 환자에게 항-TGFβ 작용제를 투여하고, 이에 의해 환자에서 삼중 음성 유방암 (TNBC)을 치료하는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 것을 포함하는, TNBC 환자를 치료하거나 또는 그의 생존을 증가시키는 데 있어서 적어도 부분 반응을 달성하는 방법에 사용하기 위한 항-TGFβ 작용제.
  30. 환자에서 고 이동성 그룹 AT-hook 2 (HMGA2) 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 공지된 대조군 수준에 비해 환자에서의 증가된 HMGA2 발현 수준은 상기 환자를 항-TGFβ 작용제를 사용한 삼중 음성 유방암 (TNBC)의 치료에 적합한 것으로서 확인하는 것인, 항-TGFβ 작용제를 사용하여 환자의 TNBC를 치료 또는 관리하는 데 적합한 환자를 확인하는 방법에 사용하기 위한 항-TGFβ 작용제.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 HMGA2 수준이 환자로부터의 조직 샘플을 분석함으로써 결정되는 것인 항-TGFβ 작용제.
  32. 제31항에 있어서, 조직 샘플이 생검 샘플, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인 항-TGFβ 작용제.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, HMGA2의 수준이 면역화학에 의해 또는 RNA 발현 분석에 의해 결정되는 것인 항-TGFβ 작용제.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 HMGA2 mRNA 발현의 정량화를 통해 결정된 것인 항-TGFβ 작용제.
  35. 제34항에 있어서, HMGA2 mRNA 발현의 정량화가 PCR을 통해 이루어지는 것인 항-TGFβ 작용제.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균 HMGA2 발현보다 적어도 2.27-배 더 큰 것인 항-TGFβ 작용제.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 TNBC 환자 사이의 공지된 집단 평균 HMGA2 발현보다 적어도 5-배 더 큰 것인 항-TGFβ 작용제.
  38. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 정상 HMGA2 발현 수준보다 적어도 200% 더 높거나, 적어도 300% 더 높거나, 적어도 400% 더 높거나, 적어도 500% 더 높거나, 적어도 600% 더 높거나, 적어도 700% 더 높거나, 적어도 800% 더 높거나, 적어도 900% 더 높거나, 적어도 1000% 더 높거나, 또는 그 초과인 항-TGFβ 작용제.
  39. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서의 증가된 HMGA2 발현이 항-TGFβ 작용제를 사용한 치료에 대해 비반응성인 환자에서의 HMGA2 발현보다 적어도 19- 내지 35-배 더 큰 것인 항-TGFβ 작용제.
  40. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 HMGA2 발현이 HMGA2 단백질 발현 수준에 의해 결정된 것인 항-TGFβ 작용제.
  41. 제40항에 있어서, 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준이 면역조직화학을 통해 결정된 것인 항-TGFβ 작용제.
  42. 제41항에 있어서, TNBC 환자로부터 수득된 조직 샘플에서의 1% 초과의 HMGA2 단백질 발현 종양 세포로 증가된 HMGA2 단백질 발현 수준을 결정한 것인 항-TGFβ 작용제.
  43. 제28항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TGFβ 작용제가 (a) 적어도 인간 단백질 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체의 중쇄의 가변 영역; 및 (b) 형질전환 성장 인자 β (TGFβ)에 결합할 수 있는 인간 형질전환 성장 인자 β 수용체 II (TGFβRII) 또는 그의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 적어도 PD-L1에 결합하는 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이고; 여기서 제1 폴리펩티드의 중쇄 및 제2 폴리펩티드의 경쇄는, 조합될 때, PD-L1에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하는 것인 항-TGFβ 작용제.
  44. 제43항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 서열식별번호: 35, 36, 및 37의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 38, 39, 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-TGFβ 트랩 작용제.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-TGFβ 트랩 작용제.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질의 용량이 1200 mg 내지 3000 mg인 항-TGFβ 작용제.
  47. 제46항에 있어서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질의 용량이 1200 mg인 항-TGFβ 작용제.
  48. 제47항에 있어서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질의 용량이 2주마다 1회 투여되는 1200 mg인 항-TGFβ 작용제.
  49. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질의 용량이 2100 mg 내지 2400 mg인 항-TGFβ 작용제.
  50. 제49항에 있어서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 3주마다 1회 투여되는 것인 항-TGFβ 작용제.
  51. 제50항에 있어서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질의 용량이 3주마다 1회 투여되는 2100 mg인 항-TGFβ 작용제.
  52. 제50항에 있어서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질의 용량이 3주마다 1회 투여되는 2400 mg인 항-TGFβ 작용제.
  53. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질의 용량이 3주마다 1회 투여되는 3000 mg인 항-TGFβ 작용제.
  54. 제43항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-L1/TGFβ 트랩 단백질이 정맥내 투여에 의해 투여되는 것인 항-TGFβ 작용제.
  55. 제54항에 있어서, 정맥내 투여가 단백질 포함 제제를 포함하는 사전충전 백, 사전충전 펜 또는 사전충전 시린지로 수행되는 것인 항-TGFβ 작용제.
  56. 제55항에 있어서, 백이 튜브 및/또는 바늘을 포함하는 채널에 연결된 것인 항-TGFβ 작용제.
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