BR112020025381A2 - Degradadores seletivos do receptor de estrogênio - Google Patents

Abstract

“degradadores seletivos do receptor de estrogênio”. a presente invenção refere-se a degradadores seletivos do receptor de estrogênio (serds) de acordo com a fórmula: são fornecidos sais farmaceuticamente aceitáveis, composições farmacêuticas, usos, e métodos de uso dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “DEGRADADORES SELETIVOS DO RECEPTOR DE ESTROGÊNIO”. Antecedentes

[001] Os degradadores seletivos do receptor de estrogênio (SERDs) se ligam ao receptor de estrogênio (ER) e autorregulam a atividade transcricional mediada pelo ER. Esta degradação e autorregulação causada pelos SERDs pode ser útil no tratamento de distúrbios de proliferação de célula, tal como câncer. Os pequenos exemplos de moléculas de SERDs foram descritos na literatura (veja, por exemplo, WO2005073204, WO2014205136, e WO2016097071). Entretanto, os SERDs conhecidos foram ainda úteis, visto que é necessário tratar câncer. Por exemplo, encontrar SERDs com melhores propriedades farmacocinéticas (PK) e farmacodinâmicas (PD), maior eficácia na clínica, e boa biodisponibilidade oral seria muito útil no tratamento de câncer. Um SERD antagonista puro com inibição potente de trancrição mediada por ER seria expressamente benéfico no tratamento de câncer. Há uma necessidade de novos SERDs para tratar tais cânceres tais como câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, e câncer de pulmão bem como mutações ebm como mutações devido à resistência emergente. Em particular, há uma necessidade de novos SERDs para tratar câncer de mama positivo de ER, câncer gástrico, e/ou câncer de pulmão. Sumário

[002] Um composto da fórmula:

[003] e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, e composições farmacêuticas do mesmo, são fornecidos aqui.

[004] Os métodos de uso de um composto, como descrito aqui, sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, e composições farmacêuticas dos mesmos, para tratar câncer de mama, câncer ovariano, câncer endométrico, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, ou câncer de pulmão são também fornecidos. Os métodos incluem adminnistração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto como descrito aqui, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a um paciente com necessidade do mesmo.

[005] É também fornecido o composto, como descrito aqui, e um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em terapia. O composto descrito aqui, e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, podem ser usados no tratamento de câncer de mama, câncer ovariano, câncer endócrino, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, ou câncer de pulmão.

[006] O uso de um composto como descrito aqui, e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, para a fabricação de um medicamento para tratamento de câncer de mama, câncer ovariano, câncer endócrino, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, ou câncer de pulmão é também descrito. Descrição

[007] Um novo composto tetracíclico e sais farmacêuticos do mesmo que agem SERDs são descritos aqui. Os SERDs podem ser usados como agentes únicos ou em combinação com outras classes de fármacos que incluem moduladores de inibidores de aromatase de receptor de estrogênio seletivos (SERMs), inibidores de CDK4, inibidores de CDK6, inibidores de PI3K, e inibidores de mTOR para tratar câncer de mama positivo de receptor de hormônio.

[008] O novo composto descrito aqui é um composto da fórmula:

[009] Os sais farmaceuticamente aceitáveis do composto são também descritos. O composto pode ser nomeado usando a nomeclatura de IUPAC como (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1- il]etóxi}fenil){3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4- il}metanona.

[0010] Além disso, é descrita aqui uma composição famrcêutica que inclui um composto como descrito aqui, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um excipiente, veículo, ou composto farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêticasdescritas aqui podem ser preparadas usando aditivos farmaceuticamente ativos. O termo “aditivo(s) farmaceuticamente(s) ativo(s)”, como usado aqui, refere-se a um ou mais veículos, diluentes, e excipientes que são compatíveis com os outros aditivos das composições ou formulações e não deletérios ao paciente. O composto, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, descrito aqui pode ser formulado como composições farmacêuticas administradas por várias rotinas, tal como oral ou IV. A biodisponibilidade é frequentemente um fator no tratamento de câncer e na capacidade de avaliar os métodos de administração e composições farmacêuticas para controlar ou otimizar a biodisponibilidade de um ingrediente ativo ser útil. Uma composição de SERD oralmente biodisponível seria particularmente útil. Acredita-se que o composto, ou sais farmaceuticamente aceitável do mesmo, como descrito aqui tenha biodisponibilidade oral. Os exemplos composições e processos farmacêuticos para sua preparação podem ser encontrados no “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, L. V. Allen Jr, Editor, 22ª Ed., Mack Publishing Co., 2012.

Os exemplos não limitantes de veículos, diluentes, e excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem os seguintes: derivados de salina, água, amido, açúcares, manitol, e derivados de sílica; agentes de ligação tais como carboximetil celulose e outros derivados de celulose, alginatos, gelatina, e polivinil-pirrolidona; caulim e bentonita; polietileno glicóis.

[0011] São também descritos aqui métodos de tratamento de um câncer. Os métodos descritos aqui incluem administração a um paciente com necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto como descrito aqui, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Por exemplo, o método de administração da quantidade eficaz de um composto como descrito aqui, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser por adminstração oral. O câncer pode ser um câncer responsive ao estrogênio. Além disso, o câncer pode ser câncer de mama, câncer ovariano, câncer endócrino, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, ou câncer de pulmão. Por exemplo, o câncer pode ser câncer de mama positivo de ER, câncer gástrico positivo de ER, ou câncer de pulmão positivo de ER.

[0012] É também descrito aqui um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em terapia. O composto como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, como descrito aqui pode ser usado no tratamento de câncer de mama, câncer ovariano, câncer endócrino, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, ou câncer de pulmão. Em particular, o câncer pode ser câncer de mama positivo de ER, câncer gástrico positivo de ER, ou câncer de pulmão positivo de ER. Por exemplo, o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser oralmente administrado.

[0013] Além disso, o composto como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, pode ser usado na fabricação de um medicamente para o tratamento de um câncer. Por exemplo, o medicamento pode ser oralmente administrado. Os tipos de medicamentos, como descrito aqui, podem ser usados para tratar câncer de mama, câncer ovariano, câncer endócrino, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, ou câncer de pulmão. Em particular, o câncer pode ser câncer de mama positivo de ER, câncer gástrico positivo de ER, ou câncer de pulmão positivo de ER.

[0014] O composto como descrito aqui, e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, pode ter utilidade clínica como um agente único ou em combinação com outros agentes anticâncer, para o tratamento de cânceres tais como câncer de mama, câncer ovariano, câncer endócrino, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, e câncer de pulmão. Quando usados em combinação com outros agentes anticâncer, o composto como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, pode ser usado simultaneamente, sequencialmente, ou separadamente com os outros agentes anticâncer. Um exemplo de um outro agente anticâncer que pode ser combinado com o composto como descrito aqui é 5-(4-{2-[3- (fluorometil)azetidin-1-il]etóxi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-

[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol.

[0015] Como usado aqui, o termo “quantidade eficaz” refere-se à quantidade ou dose do composto como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, que, na administração de dose única ou múltiplas ao paciente, fornece o efeito desejado no paciente sob diagnóstico ou tratamento. Preferivelmente, um efeito desejado é inibição de proliferação de célula de tumor, morte de célula tumoral, ou ambos. O composto como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, como descrito aqui são geralmente eficazes sobre uma ampla faixa de dosgagem. Por exemplo, as dosagens por dia geralmente incluem-se na faixa diária de cerca de 100 mg a cerca de 2000 mg.

[0016] Como usado aqui, “tratar”, “tratando” ou “tratamento” refere- se a restrição, retardo, interrupção ou reversão da progressão ou gravidade de um sintoma ou distúrbio existente.

[0017] Como usado aqui, o termo “paciente” refere-se a um ser humano que sofre de uma doença, distúrbio ou condição particular.

[0018] O composto como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, como descrito aqui, por vários procedimentos conhecidos na técnica, alguns dos quais são ilustrados na Preparação e Exemplo abaixo. As etapas sintéticas específicas para cada das rotinas descritas aqui podem ser combinadas de diferentes modos, ou em conjunto com etapas de diferentes procedimentos, para preparar o composto como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo. Os produtos podem ser convertidos em métodos convencionais bem conhecidos na técnica, incluindo extração, evaporação, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, e cristalização. Os reagentes e materiais de partida são facilmente disponíveis por uma pessoa versada na técnica.

[0019] Em uma etapa opcional, um sal farmaceuticamente aceitável de um composto como descrito aqui pode ser formado pela reação de uma base livre apropriada da presente Invenção com um sal farmaceuticamente aceitável aprorpiado em um solvente adequado sob condições padrão. Adicionalmente, a formação de tais ácidos pode ocorrer simultaneamente na desproteção de um grupo de proteção de nitrogênio. O formação possível de sais farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecido. Veja, por exemplo, Gould, P.L., “Salt selection for basic drugs,” International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. “Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical

Entities,” Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); and Berge, S.M., et al., “Pharmaceutical Salts,” Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Alguém versado na técnica apreciará que um composto como descrito aqui é facilmente convertido em e pode ser isolado como um sal farmaceuticamente aceitável.

[0020] A menos que especificamente observado, as abreviações usadas aqui são definidas de acordo com Aldrichimica Acta, Vol. 17, nº 1, 1984, ou o significado geralmente aceito por aqueles versados na técnica. Outras abreviações são definidas como segue: “AUC” refere- se à área sob a curva; “BSA” refere-se à Albunina Sérica Bovina; “DCM” refere-se a diclorometano ou cloreto de metileno; “DMA” refere- se a dimetilamina; “DMEM” refere-se ao Meio de Eagle Modificado por Dulbecco; “DMF” refere-se a N,N-dimetilformamida; “DMSO” refere-se a sulfóxido de dimetila; “DNA” refere-se a ácido deoxiribonucleico; “cDNA” refere-se a DNA complementar; “DNase” refere-se a desoxirribonuclease; “DTT” refere-se a ditiotreitol; “EC50” refere-se à concentração de um agente que produz 50 % de resposta da atividade alvo em comparação com um composto de controle positivo pré- definido (EC50absoluto); “EDTA” refere-se a ácido ácido etilenodiaminatetraacético; “ERα” refere-se a receptor de estrogênio alfa; “EtOAc” refere-se ao acetato de etila; “EtOH” refere-se a etanol; “FBS” refere-se ao Soro Bovino Fetal; “HBSS” refere-se a uma Solução de Sal Equilibrado de Hank; “HEPES” refere-se a ácido 4-(2- hidroxietil)-1-pipαzinaetanossulfônico; “IC50” refere-se à concentração de um agente que produz 50% da resposta inibidora máxima possível para aquele agente, (relativa a IC50), ou a concentração de um agente que produz 50% de inibição da atividade de enzima alvo em comparação ao controle de placebo (IC50 absoluto); “iPrOH” refere-se a isopropanol ou álcool isopropílico; “IV” refere-se à administração intravenosa; “Ki” refere-se à constante de inibição; “MeOH” refere-se a álcool metílico ou metanol; “MTBE” refere-se a metil t-butil éter; “PBS” refere-se à Salina Tamponada por Fosfato; “PO” refere-se à adminnistração oral; “PRα” refere-se ao receptor de progesterone alfa; “QD” refere-se a dosage uma vez ao dia; “RNA” refere-se a ácido ribonucleico; “RNase” refere-se a ribonuclease; “RT-PCR” refere-se à reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa; “RT-qPCR” refere-se à reação de cadeia de polimerase quantitative de transcrição reversa; “THF” refere-se a tetrahidrofurano; e “XPhos Pd G2” refere-se a cloro(2-diciciclo-hexilfosfino-2',4',6'-triisopropil-1,1'-bifenil)[2-(2'- amino-1,1'-bifenil)]paládio(II).

[0021] As preparações e exemplos também ilustram a invenção. Preparações e Exemplos Preparação 1 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol

[0022] Adicionar triacetoxiboro-hidreto de sódio (405 g, 1,91 mol) em porções durante um período de 15 minutos a uma solução a 0 °C agitada de cloridrato de 3-(fluorometil)azetidina (160 g, 1,28 mol) em DCM (2,4 L) sob N2 e agitar a 0 °C durante 10 minutos. Adicionar 1,4- dioxano-2,5-diol (99 g, 0,83 mol) a 0 °C em 6 porções durante um período de 1 hora, em seguida agitar a 0 a 5 °C durante 15 minutos. Deixar a reação aquecer para temperatura ambiente e agiitar durante 2 horas sob N2. Resfriar a reação para 10-15 °C durante um período de 20 minutos. Adicionar água (800 mL) durante um período de 25 a 30 minutos a 10 a 15 °C, permitir aquecer para temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos e, em seguida, separar as camadas. Lavar a camada aquosa com DCM (800 mL), separar as camadas, em seguida resfriar as camadas aquosas combinadas para 10 a 15 °C e ajustar o pH para 13 a 14 usando 50% de solução de hidróxido de sódio (~540 mL). Permitir que a camada aqueça para temperatura ambiente, extrair com DCM (4 X 800 mL), secar com sulfato de sódio (80 g), filtrar e concentrar até secura para obter o composto título. Após esta Preparação, fornecer 139 g (82%) do composto título como um óleo amarelo espresso com um ES/EM (m/z) de 134,1 (M+H). Preparação 2 Cloridrato de 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol HCl

[0023] Dissolver 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol (529 g, 4 mol) em MTBE (2,6 L) e resfriar para 0 °C. Adicionar solução de HCl/EtOH (492 mL, 30 % em peso) gota a gota durante 30 minutos, em seguida agitar a 0 °C durante 30 minutos. Filtrar os sólidos e lavar a massa de filtro com MTBE (2 X 200 mL). Secar sob N2 durante 8 horas para obter o composto do título. Após esta Preparação, fornecer 580 g (86%) do composto do título como um sólido branco com um ES/EM (m/z) de 134,0 (M+H). Preparação 3 (3-cloro-7-metoxiquinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanona

[0024] Resfriar uma mistura de 4-bromo-3-cloro-7-metoxiquinolina (70 g, 254 mmol) e THF (1 L) para -40 ºC sob N2 resultando na precipitação do material. Adicionar cloreto de isopropilmagnésio (2 M em THF, 254 mL, 509 mmol) durante 20 minutos e agitar a mistura durante 1 hora. Adicionar uma solução de cloreto de 4-fluorobenzoíla (66 mL, 559 mmol) em THF (140 mL) gota a gota, em seguida permitir aquecer para temperatura ambiente. Extinguir a reação com solução de cloreto de sódio aquoso (300 mL) e água (200 mL) e separar as camadas. Lavar a camada orgânica com solução de cloreto de sódio aquoso (300 mL), secar sobre MgSO4, filtrar, e concentrar para fornecer um resíduo oleoso. Filtrar o óleo marrom bruto através de sílica-gel eluindo com uma mistura de MTBE/hexano (1:1) para obter o produto bruto como um sólido amarelo (84 g). Tratar o sólido com 10% de metilacetato/heptano (800 mL) e agitar em temperatura ambiente durante a noite. Filtrar para coletar os sólidos e reservar. Concentrar o filtrado e purificar sobre sílica eluindo com 10 a 40% de EtOAc/hexanos em seguida tratar o produto com 10% de metilacetato/heptano (200 mL) e agitar em tempetratura ambiente durante 3 horas. Filtrar os sólidos resultantes, combinar com sólidos da filtração prévia e secar sob vácuo durante a noite para obter o composto do título. Após esta preparação, fornecer 31 g (38%) do composto do título como um sólido amarelo com um ES/EM (m/z) de 316,0 (M+H). Preparação 4 (3-cloro-7-hidroxiquinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanona

[0025] Adicionar tribrometo de brometo (1 M em DCM, 295 mL, 295 mmol) a uma mistura de (3-cloro-7-metoxiquinolin-4-il)-(4- fluorofenil)metanona (31 g, 98 mmol) em DCM (217 ml) e agitar a mistura em tempetratura ambiente durante 3 dias. Despejar a mistura lentamente em uma solução a 0 °C de fosfato de potássio dibásico (2 M em água, 700 mL) e água (200 mL). Permitir que a mistura aquecer para temperatura ambiente e agiitar durante 1 hora. Concentrar a solução a vácuo para remover solventes orgânicos, filtrar, coletar o filtrado e secar o filtrado sob vácuo a 5 °C durante a noite. Tratar os sólidos como DCM/heptano (1:1, 450 mL) e agitar durante a noite. Coletar os sólidos e secar sob vácuo durante a noite para obter o composto do título. Após esta preparação, fornecer 32 g (produção quantitativa) do composto do título como um sólido marrom claro com um ES/EM (m/z) de 302,0 (M+H). Preparação 5 (3-cloro-7-hidroxiquinolin-4-il)-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1- il]etóxi}fenil)metanona

[0026] Adicionar cloridrato de 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etan-1- ol (3,90 g, 23,0 mmol) a uma solução agitada de (3-cloro-7- hidroxiquinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanona (5,00 g, 15,3 mmol) em DMF (75 ml) seguido pela hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 3,07 g, 76,6 mmol). Agitar sob N2 e aquecer para 40 °C durante 45 minutos. Extinguir a solução com água e concentrar. Dividir o resíduo entre 20% de iPrOH/CHCl3 e solução de bicarbonato de sódio aquoso saturado e separar, extrair o material aquoso com 2 X 20% de iPrOH/CHCl3, combiner os extratos orgânicos, secar as camadas combinadas sobre sulfato de magnésio, filtrar e concentrar o filtrado para obter o produto bruto como um óleo vermelho escuro. Purificar o material bruto por cromatografia de coluna de sílica gel que elui com um gradiente de 5 a 10% de NH3 a 7 N em MeOH/DCM para forncer o composto do título. Após esta preparação, fornecer 5,31 g (84%) do composto do título como um sólido amarelo com um ES/EM (m/z) de 415,0 (M+H). Preparação 6

(4-fluorofenil)-[3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidróxi-4- quinolil]metanona

[0027] Desgaseificar/purgar com 5 X N2 uma mistura de (3-cloro-7- hidróxi-4-quinolil)-(4-fluorofenil)metanona (140 g, 440,8 mmol), ácido 2-fluoro-4-(trifluorometil)fenilborônico (183,3 g, 881,7 mmol), carbonato de potássio (184,6 g, 1,3 mol), 2-metil-2-butanol (1,7 L) e água (0,56 L). Adicionar XPhos Pd G2 (7,1 g, 8,82 mmol) e aquecer a 80 °C durante 2 horas. Resfriar a mistura para temperatura ambiente e evaporar o solvente orgânico. Adicionar EtOAc (1 L) e água (0,2 L). Separar a camada orgânica e secá-la sobre sulfato de magnésio. Filtrar esta mistura através de sílica gel e concentrar até secura. Triturar o material bruto com uma mistura de hexanos (1,25 L) e MTBE (0,25 L) para fornecer um sólido. Filtrar o sólido e secar sob vácuo. Dissolver o sólido em THF (1,5 L) e adicionar um recuperador de SiliaMetS® Thiol (150 g). Agir a mistura em temperatura ambiente durante a noite. Filtrar a recuperação e evaporar o filtrado até secura para forncer o composto do título. Após esta preparação, fornecer 185,5 g (96%) do composto do título como um sólido branco com um ES/EM (m/z) de 430,0 (M+H). Exemplo 1 (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etóxi}fenil){3-[2-fluoro-4- (trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4-il}metanona

[0028] A um vaso, equipado com uma entrada N2, adicionar THF (2,8 L), terc-butóxido de potássio (274,5 g, 2,45 mol) e 2-(3- (fluorometil)azetidin-1-il)etan-1-ol (168 g, 1,22 mol). Agir a mistura durante 10 minutos. Adicionar gota a gota uma solução de (4- fluorofenil)-[3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidróxi-4- quinolil]metanona (350 g, 0,81 mol) em THF (0,7 L). Agitar em temperatura ambiente durante uma hora. Extinguir a reação com HCl a 1 N até pH 8 e diluir com EtOAc (4 L). Separar a camada orgânica e lavá-la com salmoura (2 L). Secagem da solução sobre sulfato de magnésio, filtrar a solução, e concentrar até secura para forncer o composto do título. Após esta preparação, fornecer 415 g (93,8%) do composto do título como um sólido marrom com um ES/EM (m/z) de 543,2 (M+H). Exemplo Alternado 1

[0029] Desgaseificar/purgar com N2 x 5 uma mistura de (3-cloro-7- hidroxiquinolin-4-il)-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1- il]etóxi}fenil)metanona (200 mg, 0,48 mmol), ácido 2-fluoro-4- (trifluorometil)fenilborônico (158 mg, 0,72 mmol), carbonato de potássio (202 mg, 1,45 mmol), 2-metil-2-butanol (3 ml), e água (1 ml) em um frasconete de micro-ondas. Adicionar XPhos Pd G2 (12 mg, 0,015 mmol), selar a mistura, e micro-ondas a 80 °C durante 2 horas. Dividir o resíduo entre MTBE e solução de cloreto de amônio saturado. Separar as camadas e extrair o material aquoso com MTBE. Combinar os extratos orgânicos, secá-los sobre sulfato de magnésio, filtrar, e concentrar o filtrado para obter um resíduo laranja. Purificar o material bruto por cromatografia de coluna de sílica gel que elui com de 5% de MeOH/DCM para forncer o composto do título. Após esta preparação, fornecer 205 mg (78%) do composto do título como um sólido amarelo com ES/EM (m/z) de 543,2 (M+H). EXEMPLO 2

5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etóxi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-

[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol racêmico

[0030] Resfriar uma solução de (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1- il]etóxi}fenil){3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4- il}metanona (5,27 g, 9,71 mmol) em 1,4-dioxano (100 mL) para 5 °C. Adicionar trietilboroidreto de lítio (1 M em THF, 30,0 mL, 30,0 mmol). Remover o banho de resfriamento e agiitar durante 1,5 hora em tempratura ambiente. Extinguir a mistura com água. Adicionar solução de NH4Cl saturado e EtOAc. Separar as camadas e extrair a camada aquosa com EtOAc. Combinar os extratos orgânicos, secar sobre MgSO4 anidroso, filtrar, e concentrar o filtrado. Dissolver o resíduo bruto em THF (100 mL). Adicionar hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 1,94 g, 48,5 mmol). Aquecer em refluxo a soluçãodurante 1,5 hora. Adicionar hidreto de sódio adicional (60% em óleo mineral, 1,94 g, 48,5 mmol), em seguida refluxar durante mais 30 minutos. Resfriar a solução para temperatura ambiente e extinguir com água. Adicionar EtOAc e asolução de NH4Cl saturado. Separar as camadas e extrair a camada aquosa com EtOAc. Combinar o o extrato orgânico, secar sobre MgSO4 anidroso, filtrar, e concentrar o filtrado. Purificar o resíduo por cromatografia de coluna de sílica gel que elui com um gradiente de 5 a 7% de MeOH em DCM para forncer o composto do título (3,70 g, 72%) como uma espuma amarela clara. ES/EM (m/z): 525,2 (M+H). Ensaios Biológicos

[0031] A relação entre expressão de receptor de estrogênio e certos câncers foi reportada na literatura, (para câncer de mama, veja,

por exemplo, Puhalla S, Bhattacharya S, Davidson N., Hormonal therapy in breast cancer: A model disease for the personalization of cancer care, Molecular Oncology, 2012, 6:222-236; Kennecke H, Yerushalmi R, Woods R, Cheang MCU, Voduc D, Speers CH, Nielsen TO, Gelmon K, Metastatic behavior of breast cancer subtypes, J Clin Oncol, 2010, 28(20):3271-3277; Para câncer ovariano, veja, por exemplo, O'Donnell AJ, Macleod KG, Burns DJ, Smyth JF, Langdon SP, Estrogen receptor-alpha mediates gene expression changes and growth response in ovarian cancer cells exposed to estrogen, Endocr Relat Cancer, 2005;12(4):851–66; Walker G, MacLeod K, Williams AR, Cameron DA, Smyth JF, Langdon SP, Estrogen regulated gene expression predicts response to endocrine therapy in patients with ovarian cancer, Gynecol Oncol, 2007, 106(3):461–8; Smyth JF, Gourley C, Walker G, MacKean MJ, Stevenson A, Williams AR, et al., Antiestrogen therapy is active in selected ovarian cancer cases: The use of letrozole in estrogen receptor-positive patients, Clin cancer Res, 2007, 13(12):3617–22; for prostate cancer veja, por exemplo, Bonkohoff H, Fixemer T, Hunsicker I and Remberger K, Estrogen receptor expression in prostate cancer and premalignant prostate lesions, Am J Pathol, 1999, 155:641-647; para câncer de urina e endometrial, veja, por exemplo, Krasner C, Aromatase inhibitors in gynecologic cancer, J Steroid Biochem Mol Biol, 2007, Ag–Set;106(1– 5):76–80; Boisen MM, Andersen CL, Sreekumar S, et al., Treating gynecologic malignancies with selective estrogen receptor downregulators (SERDs): Promise and challenges, Mol Cell Endocrinol, 2015, 418:322–3330; Para câncer de pulmão, veja, por exemplo, Baik CS, Eaton KD et al., Estrogen signaling in lung cancer: An opportunity for novel therapy, cancer, 2012, 4:969-988; Marquez- Garban DC, Chen H-W, Goodglick L, Fishbein MC and Pietras RJ, Targeting aromatase and estrogen signaling in human non-small cell lung cancer. Steroid enzymes and cancer, Ann. N. Y. Acad Sci, 2009, 1155:194-205; Hamilton DH, Griner LM, Keller JM, Hu X, Southall N, Marugan J, David JM, Ferrer M and Palena C, Targeting estrogen receptor signaling with fluvestranto enhances immune and chemotherapy mediated cytotoxicity of human lung cancer, Clin Cancer Res, 2016, 22(24):6204-16; Rodriguez-Lara V, Hernandez-Martinez JM, Arrieta O, Influence of estrogen in non-small cell lung cancer and its clinical implications, J Thoracic Disease, 2018, 10(1):482-497; for gastric cancer veja, por exemplo, Tang W, Liu R, Yan Y, Pan X, Wang M, Han X, Ren H, e Zhang Z, Expression of estrogen receptors and androgen receptor and their clinical significance in gastric cancer, Oncotarget, 2017, 8(25) 40765-777).

[0032] Os ensaios seguintes demonstram que os compostos exemplificados são degradadores potentes de proteínas mutantes e do tipo selvagem ERα. Os resultados dos ansaios também demonstram que os compostos exemplos são antagonostas potentes de receptores mutantes e do tipo salvagem ERα e inibem a atividade transcricional mediada de ER. Adicionalmente, os ensaios demonstram que o composto de exemplo 1, inibe a proliferação de linhagens de célula de câncer de mama de ER+, e a sinalização de ERα e a inibição do crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto de câncer de mama de ER-positivo. Ensaio de ligação de competição de Erα (tipo selvagem) e ERα (mutante Y537S)

[0033] O propósito dos seguintes dos ensaios de ligação de competição de ER é determinar a afinidade de ligação de um composto de teste contra Erα (tipo selvagem) e ERα (mutante Y537S). Veja Fanning et al., “Estrogen receptor alpha somatic mutations Y537S and D538G confer breast cancer endocrine resistance by stabilizing the activating function-2 binding conformation,” eLife 2016;5:e12792.

[0034] Realizar o ensaio de ligação de competição em um tampão contendo HEPES a 50 mM, pH 7,5, EDTA a 1,5 mM, NaCl a 150 mM, 10% de glicerol, 1 mg/mL de ovalbumina, e DTT a 5 mM, usando 0,025 μCi por cavidade de 3H-estradiol (118 Ci/mmol, 1 mCi/mL), 7,2 ng/cavidade de ERα (tipo selvagem), ou 7,2 ng/cavidade de Mutante Y537S de ERα). Adicionar o composto de teste em 10 concentrações diferentes, variando de 10,00\a0 nM a 0,5 nM, e determinar a ligação não específica na presença de 1 μM de 17-β estradiol. Incluir a reação de ligação (140 μL) durante 4 horas em tempratura ambiente, e em seguida adicionar tampão de dextrano-cavão vegetal frio (70 μL) (contendo por 50 mL de tampão de ensaio, 0,75 g de carvão vegetal e 0,25 g de dextrano) a cada reação. Misturar como placas durante 8 minutos em um agitador orbital a 4 C e em seguida centrifugar a 3000 rpm a 4 C durante 10 minutos. Transferir uma alíquota (120 μL) da mistura para outra placa de fundo plano branca, de 96 cavidades, (Costar) e adicionar fluido de cintilação Perkin Elmer Optiphase Supermix (175 μL) para cada cavidade. Selar as placas e agitar vigorosamente em um agitador orbital. Após uma incubação de 2,5 horas, ler as placas em um contador de Wallac Microbeta. Calcular o IC50 usando um ajuste de curva logística de 4 parâmetros e calcular % de inibição a 10 μM. Converter os valores de IC50 para o composto em Ki usando equação de Cheng-Prusoff. Os resultados deste ensaio demonstram que o composto de exemplo 1 liga-se ao ERα tipo selvagem recombinante com um Ki (nM) de 3,78 + 0,74 (n=3) e se liga ao mutante de ERα (Y537S) com um Ki (nM) de 21,24 + 2,12 (n=3).

[0035] Os resultados deste ensaio demonstram a afinidade de ligação e potência do composto exemplificado contra o ERα tipo selvagem e proteínas mutantes (ESR1 Y537S). Ensaio de degradação de ERα em células de MCF7

[0036] O propósito do ensaio de degradação de ERα seguinte é medir a degradação de ERα por um composto de teste em uma linhagem de célula de câncer de mama positiva de ERα tal como MCF7.

[0037] Células de MCF7 de cultura (comprador de ATCC HTB-22) em meios de DMEM suplementados com 10% de FBS, 0,01 mg/mL de insulina humana 1 e 1% de antibióticos de penicilina/estreptomicina e placa em placas de fundo plano de 384 cavidades em uma densidade de 4.000 células por cavidade em meios de DMEM livres de vermelho de fenol (20 µL) contendo 10% de FBS removido com carvão vegetal. Incluir as células durante a noite em uma incubadora de cultura celular (5% de CO2, 95% de umidade relativa e 37 °C) e deixar as células se ligarem à placa. Dosar no dia seguintes as células com o composto de teste. Usar um dispensador acústico Echo 555 para preparar as diluições em série de composto de teste (1:3) em uma faixa de 6 μM a 0,0003 μM. Dosar as células com a adição de 5 μL da placa de diluição em série à placa celular que produz uma concentração de DMSO final de 0,2% com uma faixa de dose de concentração de composto de teste final entre 2 e 0,0001 μM. Para o ponto máximo, usar meios contendo 0,2% de DMSO e para o ponto mínimo, usar fluvestranto diluído em concentrações finais a 2 μM nos meios de crescimento contendo 0,2% de DMSO. Após dosagem com composto de teste, incubar como placas celulares a 37 °C e 5% de CO2 durante 24 horas. Fixar as células adicionando-se 14% de para-formaldeído (10 μL) durante 30 minutos em tempratura ambiente. Lavar as células uma vez com PBS (20 µL) e incubar com PBS (20 µL) contendo 0,5% (v/v) de TWEEN® 20 durante 1 hora. Lavar as células com PBS contendo 0,05% de TWEEN® 20 (2×) e bloquear com 3% de BSA em PBS contendo 0,05% de TWEEN® 20 e 0,1% de TRITON™ X-100 (20 μL/cavidade) durante 1 hora em tempratura ambiente. Adicionar diluição de anticorpo primário em 1:500 (20 μL) (anticorpo monoclonal de Coelho de ERα (Clone SP1) #RM-9101-S, Thermo Scientific) em 1% de BSA em PBS contendo 0,05% de TWEEN® 20 por cavidade, selar como placas e incubar durante a noite a 4 °C. Lavar as células no dia seguinte com PBS contendo 0,05% de TWEEN® 20 (2×) e incubar com anticorpo secundário (20 μL/cavidade) (1:1000 de diluição, anti-coelho de cabra IgM ALEXA FLUOR™ 488) em PBS a 1% de BSA durante 105 minutos em tempratura ambiente. Após lavagem das placas com PBS (2×20 µL), adicionar RNase (Sigma) (20 μL de 50 μg/mL) e diluição de iodo de propídio em 1:1000 em PBS por cavidade (20 µL). Selar como placas e incubar 1 hora em tempetratura ambiente no banco (protegido da luz). Digitalizar como placas com ACUMEN EXPLORER™ [Citômetro de microplaca fluorescente de varredura a laser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir ERα. Análise de imagem é com base em sinais fluorescentes celulares para identificar células positivas. Identificar células positivas receptoras de estrogênio por intensidade média. Usar a intensidade total em 575-640 nm a partir do iodeto de propídio/DNA para identificar células individuais. A saída do ensaio é a % das células positivas de receptor de estrogênio. Determinar o IC50 por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE DATA™.

[0038] Os resultados deste ensaio demonstram que o composto de fórmula (I) é um SERD com atividade de degradação de ERα potente em células. Especificamente, os resultados mostram degradação potente de ERα pelo composto de exemplo 1 em células de câncer de mama de MCF7. Usando este ensaio, o valor de IC50 relativo (µM) para o composto de exemplo 1 é 2,16 + 0,96 nM (n=15). Ensaio de introdução de PRα em células de MCF7

[0039] O propósito do ensaio de de indução de PRα seguinte é determinar se um composto de teste tem atividade agonística contra receptor de ERα (um agonista seria esperado ativar o receptor).

[0040] Cultivar a MCF7 (comprada de ATCC HTB-22) em meios de DMEM suplementados com 10% de FBS, 0,01 mg/mL de insulina humana 1 e 1% de antibióticos de penicilina/estreptomicina e semear as células (antes de se tornarem 70% confluentes) em placas de fundo plano de 384 cavidades em uma densidade de 4.000 células por cavidade de em 20 μL de volume em meios livre de vermelho de fenol de DMEM contendo 10% de FBS (removido com carvão vegetal). Incubar as células durante a noite em uma incubadora de cultura celular (5% de CO2, 95% de umidade relativa a 37 °C) e deixar as células se ligarem à placa.

No dia seguinte, dosar as células com composto de teste.

Usar um dispensador acústico Echo 555 para preparar as diluições em série do composto (1:3) em uma faixa de 6 μM a 0,0003 μM.

Dosar as células com a adição do composto de teste (5 μL) a partir da placa de diluição em série à placa de células produzindo uma concentração de DMSO final de 0,2% com uma concentração final do composto faixa de dose teste entre 2 e 0,0001 μM.

Para o ponto máximo, usar meios contendo 0,2% de DMSO e, para o ponto mínimo, usar fluvestranto diluído em concentrações finais a 2 μM nos meios de crescimento contendo 0,2% de DMSO.

Após dosagem com composto de teste, incubar como placas celulares a 37 °C e 5% de CO2 durante 24 horas.

Fixar as células adicionando-se 14% de para-formaldeído (10 μL) durante 30 minutos em tempratura ambiente.

Lavar as células uma vez com PBS (20 µL) e incubar com PBS (20 µL) contendo 0,5% (v/v) de TWEEN® 20 durante 1 hora.

Lavar as células duas vezes com PBS (20 µL) contendo 0,05% de TWEEN® 20 e bloquear com 3% de BSA em PBS contendo 0,05% de TWEEN® 20 e 0,1% de TRITON™ X-100 (20 μL/cavidade) durante 1 hora em tempratura ambiente.

Adicionar diluição de anticorpo primário em 1:500 (20 μL) (Anticorpo antiumano de camundongo monoclonal receptor de progesterona, clone PgR 636 Dako, M3569) em 1% de

BSA/PBS com 0,05 % de TWEEN® 20 por cavidade, selar como placas e incubar durante a noite a 4 ºC.

[0041] No dia seguinte, lavar as células com PBS 0,05% de TWEEN® 20 (2×20 µL) e incubar com anticorpo secundário (20 μL/cavidade) (1:1000 de diluição, anti-coelho de cabra IgM ALEXA FLUOR™ 488) em PBS a 1% de BSA durante 105 minutos em tempratura ambiente. Após lavagem com PBS (2×20 µL), adicionar RNase (20 μL de 50 μg/mL) (Sigma) e diluir o iodo de propídio em 1:1000 em PBS por cavidade. Selar como placas e incubar 1 hora em tempetratura ambiente no banco (protegido da luz). Digitalizar como placas com ACUMEN EXPLORER™ [citômetro de microplaca fluorescente de varredura a laser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir receptor de progesterona alfa. Análise de imagem é com base em sinais fluorescentes celulares para identificar células positivas. Identificar células positivas de receptor de progesterona por intensidade média. Usar a intensidade total em 575-640 nm a partir do iodeto de propídio/DNA para identificar células individuais. A saída do ensaio é uma % de células positivas de recepor de progesterona. Determinar o IC50 por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE DATA™.

[0042] Usar este ensaio, o IC50 Relativo (µM) do composto de exemplo 1 é > 2 µM. Os resultados deste ensaio não demonstram nenhuma atividade agonística significante de exemplo 1 em células de câncer de mama de MCF7. Etses resultados também demonstram que o composto de exemplo 1 é um antagonista puro de ERα em células de câncer de mama de MCF7. Inibição de ensaio de célula de PRα (antagonismo funcional de ERα) em células MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR

[0043] O propósito da inibição do seguinte ensaio de célula de inibição de PRα (antagonismo funcional de ERα) é determinar a atividade antagonística de um composto de teste contra o receptor de ERα mutante de Y537N. Um antagonista no ensaio é esperado bloquear a função do receptor de ERα. PRα (PGR) é um alvo transcricional a jusante de ERα e, em consequência, um antagonista de ERα é esperado inibir a expressão de PRα.

[0044] Cultura MCF7-ESR1 Y537N-682 (gerado por edição do gene de CRISPR/Cas9 de gene de ESR1 em células de MCF7, clone#682) em meios de DMEM suplementados com 10% de FBS e 1% de antibióticos de penicilina/estreptomicina e semear as células (antes de se tornarem 70% confluentes) em placas de fundo plano de 384 cavidades em uma densidade de 4.000 células por cavidade em meios livres de vermelho de fenol de DMEM 10% de FBS (20 μL em volume) (removido com carvão vegetal). Incubar as células durante a noite em uma incubadora de cultura celular (5% de CO2, 95% de umidade relativa e 37 °C) e deixar as células se ligarem à placa. No dia seguinte, dosar as células com o composto de teste. Usar um dispensador acústico Echo 555 para preparar as diluições em série do composto (1:3) em uma faixa de 6 μM a 0,0003 μM. Dosar as células com a adição de 5 μL a partir da placa de diluição em série à placa de células produzindo uma concentração de DMSO final de 0,2% com uma faixa de dose de concentração de composto de teste final entre 2 e 0,0001 μM. Para o ponto máximo, usar meios contendo 0,2% de DMSO e, para o ponto mínimo, usar fluvestranto diluído em concentrações finais a 2 μM nos meios de crescimento contendo 0,2% de DMSO. Após dosagem composto de teste, incubar como placas celulares a 37 °C e 5% de CO2 durante 72 horas. Fixar as células adicionando-se 14% de para-formaldeído (10 μL) durante 30 minutos em tempratura ambiente. Lavar as células com PBS (1×20 µL) e incubar com PBS (20 µL) contendo 0,5% (v/v) de TWEEN® 20 durante 1 hora. Lavar as células com PBS (2×20 µL), 0,05% de TWEEN® 20, e bloqueio com 3% de BSA/PBS 0,05% de TWEEN® 20, 0,1% de TRITON™ X-100 (20 μL/cavidade) durante 1 hora em tempratura ambiente. Adicionar diluição de anticorpo primário em 1:500 (20 μL) (Anticorpo antiumano de camundongo monoclonal receptor de progesterona, clone PgR 636 Dako, M3569) em 1% de BSA/PBS 0,05 % de TWEEN® 20 por cavidade, selar como placas e incubar durante a noite a 4 ºC.

[0045] No dia seguinte, lavar as células com PBS 0,05% ® (2×20 µL) e incubar com anticorpo secundário (20 μL/cavidade) (1:1000 de diluição, anti-coelho de cabra IgM ALEXA FLUOR™ 488) em PBS a 1% de BSA durante 105 minutos em tempratura ambiente. Após lavagem com PBS (2×20 µL), adicionar RNase (20 μL de 50 μg/mL) (Sigma) e diluição de iodo de propídio em 1:1000 em PBS por cavidade. Selar como placas e incubar 1 hora em tempetratura ambiente no banco (protegido da luz). Digitalizar como placas com ACUMEN EXPLORER™ [Citômetro de microplaca fluorescente de varredura a laser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir receptor de progesterona alfa. Análise de imagem é com base em sinais fluorescentes celulares para identificar células positivas. Identificar células positivas de receptor de progesterona por intensidade média. Usar a intensidade total em 575-640 nm a partir do iodeto de propídio/DNA para identificar células individuais. A saída do ensaio é uma % de células positivas de recepor de progesterona. Determinar o IC50 por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE DATA™.

[0046] Usar este ensaio, o IC50 Relativo (nM) do composto de exemplo 1 é 7,602 + 4,804 nM (n=14). Estes resultados demonstram inibição potente de antagonismo funcional de PRαe por células de câncer de mama de MCF7, pelo Exemplo 1, em células de câncer de mama de MCF7 (ESR1 Y537N, mutante heterogênio). Como tal, o composto de exemplo 1 é um antagonista potennte de mutante de ERα (Y537N) e um inibidor de potente de transcrição mediada por ERα. PRα (PGR) é também um alvo transcricional de ERα e os resultados de seu ensaio demonstram inibição potente de transcrição mediada por ERα de PRα. Emsaio de inibição de célula de PRα (antagonismo funcional de ERα) em células de MCF7

[0047] O propósito do seguinte ensaio de inibição de célula de PRα (antagonismo funcional de ERα) é determinar a atividade antagonística de um composto de teste contra o receptor de ERα. Um antagonista no ensaio é esperado bloquear a função do receptor de ERα. PRα é um alvo transcricional a jusante de ERα e, em consequência, um antagonista de ERα é esperado inibir a expressão de PRα.

[0048] Realizar as condições como detalhadas no ensaio de Acumen de Base Celular de Degradação de ERα, usando a linhagem de célula MCF7, exceto que, antes da dispersão de composto de teste, remover os meios da placa celular e pré-tratar todas as cavidades, exceto as cavidades de controle negativo (coluna 24 da placa) com meios de ensaio contendo estradiol a 0,47 nM durante 30 minutos. Neste ensaio, realizar imunocoloração para a detecção de PRα e digitalizar como placas com ACUMEN EXPLORER™ [Citômetro de microplaca fluorescente de varredura a laser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir PRα. Análise de imagem é com base em sinais fluorescentes celulares para identificar células positivas. Identificar células positivas de PRα por intensidade média. Usar a intensidade total em 575-640 a partir do iodeto de propídio/DNA para identificar células individuais. A saída do ensaio é uma % de células positivas de PRα. Determinar o IC50 por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE

DATA™.

[0049] Usar este ensaio, o IC50 Relativo (nM) do composto de exemplo 1 neste ensaio é 15,75 + 9,037 nM (n=15). Os resultados deste ensaio demonstram inibição potente de antagonismo funcional de PRαe por Exemplo 1 em células de câncer de mama de MCF7. Como tal, o composto de exemplo 1 é um antagonista potente de proteína do tipo selvagem de ERα e um inibidor de potente de transcrição mediada por ERα. PRα (PGR) é também um alvo transcricional de ERα e os resultados de seu ensaio demonstram inibição potente de transcrição mediada por ERα de PRα. Ensaio de Proliferação de Célula em MCF7 e MCF7-ESR1 Y537N- 682

[0050] O propósito dos ensaios de proliferação de células seguintes geralmente é detectar se um composto de teste tem efeitos sobre proliferação celular, viabilidade celular, e citotoxicidade em resposta ao tratamento em experimentos de cultura celular. A proliferação celular é monitorada monitorando-se o número de células durante o tempo e o ensaio de iodeto de propodeum usado permite a medição contínua de viabilidade celular durante o tempo.

[0051] Semear as células MCF7 (comprada de ATCC HTB-22) em uma densidade de 2.000 células por cavidade de em meios livres de vermelho de fenol de DMEM 10% de FBS (20 μL em volume) (removido com carvão vegetal) em uma placa de cultura de célula de 384 cavidades de fundo claro. Semear MCF7-ESRY537N-682 (gerado por edição de gene de CRISPR/Cas9 de gene de ESR1 em células de MCF7, clone#682) em meios de DMEM suplementados com 10% de FBS, e 1% de antibióticos de penicilina/estreptomicina em uma densidade de 1000 células por cavidade. Incubar os placas a 37 °C e 5% de CO2. No dia seguinte dosar as células com o composto de teste. Usar um dispensador acústico Echo 555 para preparar as diluições em série de composto de teste (1:3) em uma faixa de 60 μM a 0,003 μM. Dosar as células com a adição de 5 μL a partir da placa de diluição em série à placa celular, produzindo uma concentração de DMSO final de 0,2% com uma faixa de dose de concentração de composto de teste final entre 20 e 0,001 μM. Para o ponto máximo usar meios contendo 0,2% de DMSO e para o ponto mínimo use fluvestranto diluído em concentrações finais a 2 μM nos meios de crescimento contendo 0,2% de DMSO. Após dosagem com composto de teste, incubar como placas celulares a 37 °C e 5% de CO2. Sete dias após a adição do composto de teste, remover as placas da incubadora e adicionar etanol frio a 96% (65 μL) para cada cavidade. Após 30 minutos, remover os meios e adicionar RNase (20 μL de 50 μg/mL) (Sigma) e diluição de iodo de propídio em 1:1000 em PBS por cavidade. selar como placas e incubar 1 hora em tempetratura ambiente no banco (protegido da luz). Digitalizar como placas com ACUMEN EXPLORER™ [Citômetro de microplaca fluorescente de varredura a laser fabricado por TTP LABTECH LTD]. A linhagem de células MCF-7 desenvolve formação de agregados, o número de células como número de objetos não pode ser capaz de ser usado como leitura; desse modo o número de células pode ser valiado por meio de número estimado de células (calculado por meio do parâmetro de área (relação da área total da população de células totais (uma faixa designada de intensidade de pico de FL-1 (PI) e da área média da população de células únicas (definida por perímetro)). Determinar o IC50 por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE DATA™.

[0052] Usar este ensaio, o IC50 Relativo (nM) do composto de exemplo 1 em MCF7 ESR1 tipo selvagem é 9,243 + 1,741 nM (n=2) e em células mutantes MCF7-ESR1 Y537N é 7,960 + 3,691 nM (n=6). Estes resultados demonstram atividade antiproliferativa potente e inibição de crescimento pelo Exemplo 1 em células de câncer de mama de MCF7 (ESR1 tipo selvagem) e MCF7 (mutante ESR1 Y537N). Ensaio (ensaio PGR RT-qPCR) de Inibição de Alvo In Vivo (IVTI) em tumores de MCF7

[0053] O propósito deste ensaio de IVTI é medir a capacidade de um composto de teste (SERD) inibir expressão de gente (transcrição) de PGR (Receptor de Progesterona alfa) a jusante de ERα em tumores xenoenxertados em camundongos.

[0054] Implantar em camundongos NOD SCID fêmeas (22-25 g) de Envigo RMS, Inc., Madison, Wisconsin com 5×10e6 de células de câncer de mama de MCF7 ER+ve (ATCC, # HTB-22) subcutaneamente na região do flanco direito em solução de 1:1 de HBSS + MATRIGEL™ (200 µL). Implantar uma pélete de estradiol de 17-β (0,18 mg/pélete, liberação de 90 dias, de Innovative Research) subcutaneamente 1 dia antes da implantação de células de tumor. Medir o crescimento de tumor e o peso corporal duas vezes por semana começando no sétimo dia após a implantação. Quando os tamanhos de tumor alcançarem 250-350 mm3, randomizar e agrupar em grupos de cinco os animais. Dosar os animais com o composto de teste em um veículo específico (1% de hidroxietilcelulose/0,25% de TWEEN® 80/0,05% de antiespumante em água purificada) ou veículo sozinho oralmente durante 3 dias e coletar os tumores e o sangue em intervalos de tempo desejados após a última dose. Sacrificar os animais usando anestesia de isoflurano mais deslocamento cervical. Congelar os tumores e armazená-los a -80 °C até o processamento para o isolamento do RNA e o ensaio de RT-qPCR. Coletar o sangue em tubos de EDTA, centrifugar para plasma, e congelar a -80 °C em um placa de 96 cavidades. Determiner as exposições do composto de teste usando espectrometria de massa.

[0055] Pulverizar tumores em nitrogênio líquido e lisá-los em tampão de lise de 1×RNA (a partir de kits de isolamento de RNA) usando contas da Matriz D (MP Biomedical, #6913-500) em uma máquina de Desruptor Celular FASTPREP-24TM (MP Biomedical). Transformer os lisados de tumor para tubos frescos após a centrifugaçãoa 14000 rpm durante 20 minutos a 4 °C.

Isolar o RNA dos lisados de tumor usando PURELINK® RNA Mini Kit (Invitrogen #12183018A) ou RNeasy Mini Kit (Qiagen #74104 and #74106). Remover os contaminantes do DNA usando PURELINK® DNase Set (Invitrogen #12185010) ou RNase-Free DNase Set (Qiagen #79254). Medir a concentração de RNA isolado diluindo-se as amostras em água livre de RNase e medindo a absorvência a 260 nm em uma leitora de placa (SpectraMax190). Subtrair a medição de absorvência média de 260 nm do blank (água livre de RNase apenas) das medições de 260 nm das outras amostras de RNA.

Diluir as amostras de RNA em concentrações iguaisem água livre de RNase.

Sintetizar o cDNA a partir de RNA diluído usando Sistema de Síntese de Primeira Filamento para RT-PCR (Invitrogen, #18080-051). Para realizar a RT- qPCR, primeiramente diluir o cDNA em água livre de RNase.

Combinar 2× Absolute Blue qPCR ROX Mix (Thermo, #AB-4139/A), iniciador de PGR (Thermo, Hs01556702_m1), e cDNA diluído para cada reação em uma placa de PCR (Applied Biosystems, #4309849). Amplificar o cDNA incubando-se as amostras durante 2 minutos a 50 °C, seguidos por 15 minutos a 95 °C no termociclador (Sistema de Detecção de Sequência ABI Prism 7900HT). Continuar a incubar a 95 °C durante durante 15 segundos seguidos por 50 °C durante 60 segundos para um total de 40 ciclos.

Os ciclos são normalizados para o gene de manutenção e usados para calcular % de inibição de PGR em comparação com veículo apenas.

Analisar cada amostra em duplicata e usar os números médios para cálculos.

Calcular a porcentagem da inibição alvo (PGR) usando Excel e XL Fit.

[0056] Os resultados deste ensaio demonstram que o composto de exemplo 1 inibe a expressão de PRα (PGR) no modelo de xenoenxerto de tumor. Além disso, o composto de exemplo 1 inibe a expressão de PRα (PGR) em 57% no modelo de xenoenxerto de tumordurante 24 horas com dose de 30 mg/kg quando administrado oralmente. Estes resultados demonstram inibição significative e substantial da atividade antagonística de ERα e da atividade transcricional mediada por ERα in vivo em um modelo de xenoenxerto de tumor. Estudo de inibição de crescimento de tumor in vivo em tumor de xenoenxerto de MCF7 implantado em camundongos

[0057] O propósito do seguintes ensaio de inibição de crescimento de tumor de xenoenxerto é medir a redução no volume tumoral em resposta à adminnistração de composto de teste.

[0058] Expandir as célçulas de cancer de mama humanas MCF7 (ATCC # HTB-22) em cultura, colher e injetar 5×10e6 de células em 1:1 de solução HBSS+MATRIGEL™ (200 µL) subcutaneamente no flanco direito traseiro dos camundongos NOD SCID fêmeas (22-25 g, Envigo RMS, Inc). Vinte e quatro horas antes da implantação de células de MCF7, péletes de estrogênio de implante (0,18 mg/pélete, 17β estradiol, liberação de 90 dias, Innovative Research) subcutaneamente. Medir o crescimento do tumor e o peso corporal duas vezes por semana começando no dia sete após a implantação. Quando os tamanhos de tumor alcaçarem 250 a 350 mm3, randomizar os animais e agrupar em grupos de 5 animais. Preparar o composto de teste em um veículo apropriado (1% de hidroxietilcelulose/0,25% de TWEEN® 80/0,05% de antiespumante em água purificada) e administrar por gavagem oral durante 42 dias. Determinar a resposta de tumor por medição de volume de tumorduas vezes por semana durante o decorrer do tratamento. Adotar o peso corporal como uma medida geral de toxicidade sempre que o volume for medido.

[0059] Quando usado neste ensaio, descobriu-se que o composto de exemplo 1 tem valores de % de T/C delta como fornecido na Tabela 6 abaixo. Estes resultados indicam que o composto de exemplo 1 demonstram boa biodisponibilidade oral em camundongos e atividade antitumor ou regressões de tumor significativas em um modelo de xenoenxerto de cancer de mama humano de MCF7. Estudo de inibição de grascimento tumoral in vivo em tumor de xenoenxerto de MCF7 implantados nos camundongos Tabela 6 Delta % de Modelo de Dose Cronograma T/C ou % de p-valor Tumor (mg/kg) Regressão MCF7 (Xenoenxerto 30 QD -36 <0,001* de Câncer de Mama)

[0060] A análise quanto ao volume de tumor é com base em estrutura de covariância SpatialPower e Log 10. *: significante (p<0,05) em comparação com controle de veículo.

[0061] A % de T/C Delta é calculada quando o volume final do tumor em um grupo tratado é no ou acima do volume do tumor de referência. A fórmula é 100*(T-T0)/(C-C0), em que T e C são os volumes médios finais do tumor no grupo tratado ou de controle, respectivamente. T0 e C0 são volumes tumor médios de referência naqueles grupos.

[0062] A % de regressão é calculada quando o volume final é abaixo da referência. A formula é 100*(T-T0)/T0, em que T0 é o volume médio de tumor de referência para o grupo tratado.

[0063] A grande média de todos os grupos de referência

(randomização) no dia 32 é usada para computar a % de mudança de T/C. Ensaio Oral de Biodisponibilidade em Rato

[0064] O propósito dos ensaio seguinte é demonstrar se um composto de teste é oralmente biodisponível.

[0065] Administrar o composto de teste aos ratos Sprague-Dawley IV em 1 mg/kg (usando veículos de: 20% CAPTISOL® em tampão de fosfato de sódio a 25 mM, pH2 quantum satis; ou 25% de DMA, 15% de EtOH, 10% de propileno glicol, 25% de 2-pirrolidona, e 25% de água purificada) e PO em 10 mg/kg (usando um veículo de 1% de hidroxietil celulose, 0,25% de polissorbato 80, 0,05% de antiespumante 1510-US, e água purificada quantum satis). Coletar as amostras de sangue em série em 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, e 12 horas pós dose para Bolus IV e em 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, e 12 horas pós dose após adminnistração oral. Após o tratamento com um coagulante de EDTA, obter plasma por centrifugação e armazenamento a -70 °C até a análise por LC-MS/MS. Determinar a concentração de composto de teste em plasma e carregar no sistema Watson LIMSTM, onde a análise não comportamental é usada para calcular Área sob a Curva (AUC) para ambas as ramificações IV e PO. Calcular a biodisponibilidade oral (%F) por meio da equação seguinte, %F = (AUCPO X DoseIV) / (AUCIV X DosePO) X 100.

[0066] Usando este ensaio, o composto de exemplo 1 exibe um valor %F de 27%. Este ensaio demonstra que o Exemplo 1 tem boa biodisponibilidade oral.

Claims (18)

REVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um ou mais excipientes, veículos, ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etóxi}fenil)-8- (trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol

6. Uso de um composto, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento de câncer de mama, câncer ovariano, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico ou câncer de pulmão em um paciente em necessidade de tal tratamento.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreendendo o composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado oralmente.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer de mama é câncer de mama positivo de ER.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer gástrico é câncer gástrico positivo de ER.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o câncer de pulmão é câncer de pulmão positivo de ER.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreendendo o composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é para ser administrado oralmente.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer de mama, câncer ovariano, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, ou câncer de pulmão.

14. Composto, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para ser administrado oralmente.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 14, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o câncer de mama é câncer de mama positivo de ER.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 14, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o câncer gástrico é câncer gástrico positivo de ER.

17. Composto, de acordo com a reivindicação 14, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o câncer de pulmão é câncer de pulmão positivo de ER.

18. Método para preparação de 5-(4-{2-[3- (fluorometil)azetidin-1-il]etóxi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-

[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, caracterizado pelo fato de que compreende: resfriar uma solução de (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1- il]etóxi}fenil){3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4- il}metanona em 1,4-dioxano a cerca de 5°C, e, em seguida, adicionar trietilboroidreto de lítio.