ES2932867T3

ES2932867T3 - Degradadores selectivos de los receptores de estrógenos

Info

Publication number: ES2932867T3
Application number: ES19746252T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey Daniel Cohen; Daniel Jon Sall
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2023-01-27
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: HRP20230080T1; LT3820874T; WO2020014440A1; IL279990B2; PL3820874T3; MX2021000377A; AU2019299952A1; MD3820874T2; KR20210018460A; SG11202100145YA; KR102577142B1; PH12021550048A1; JP7085056B2; CO2021000041A2; ECSP21001786A; CL2021000046A1; PT3820874T; IL279990A; EP3820874A1; SA521421006B1

Abstract

Se proporcionan nuevos degradadores selectivos de receptores de estrógenos (SERD) según la fórmula: sales farmacéuticamente aceptables, composiciones farmacéuticas, usos y métodos de uso de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Degradadores selectivos de los receptores de estrógenos

Antecedentes

Los degradadores selectivos de receptores de estrógeno ("selective estrogen receptor degraders", SERD) se unen al receptor de estrógeno ("estrogen receptor", ER) y reducen la actividad transcripcional mediada por el ER. Esta degradación y regulación negativa causada por los SERD puede ser útil en el tratamiento de trastornos de la proliferación celular, como el cáncer. Algunos ejemplos de moléculas pequeñas de SERD han sido divulgados en la bibliografía (véanse, por ejemplo, los documentos WO2005073204, WO2014205136y WO2016097071). Sin embargo, los SERD conocidos aún no han sido tan útiles como es necesario para tratar con eficacia el cáncer. Por ejemplo, el descubrimiento de SERD con mejores propiedades farmacocinéticas (PK) y farmacodinámicas (PD), mayor eficacia en la clínica y buena biodisponibilidad oral sería muy útil en el tratamiento del cáncer. Un antagonista puro del SERD con una potente inhibición de la transcripción mediada por ER sería expresamente beneficioso en el tratamiento del cáncer. Se necesitan nuevos SERD para tratar cánceres como el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de endometrio, el cáncer de próstata, el cáncer de útero, el cáncer gástrico y el cáncer de pulmón, así como mutaciones debidas a la aparición de resistencias. En concreto, se necesitan nuevos SERD para tratar el cáncer de mama, el cáncer gástrico y/o el cáncer de pulmón positivos a ER.

Sumario

En la presente se proporciona un compuesto de la fórmula:

y sus sales farmacéuticamente aceptables, y composiciones farmacéuticas de los mismos.

Además, se proporciona el compuesto descrito en el presente documento y una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su uso en terapias. El compuesto descrito en el presente documento, y sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden utilizarse en el tratamiento del cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de endometrio, el cáncer de próstata, el cáncer de útero, el cáncer gástrico o el cáncer de pulmón.

Descripción

En el presente documento se describe un nuevo compuesto tetracíclico y sus sales farmacéuticas que actúan como SERD. Los SERD pueden utilizarse como agentes únicos o en combinación con otras clases de fármacos, como los moduladores selectivos de los receptores de estrógenos ("selective estrogen receptor modulators", SERM), los inhibidores de la aromatasa, los inhibidores de la CDK4, los inhibidores de la CDK6, los inhibidores de la PI3K y los inhibidores de la mTOR, para tratar el cáncer de mama positivos a receptores de hormonas.

El nuevo compuesto descrito en el presente documento es un compuesto de fórmula:

También se describen sales farmacéuticamente aceptables del compuesto. El compuesto puede denominarse utilizando la nomenclatura IUPAC como (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoxi}fenil)-{3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4-il}metanona.

También se describe en el presente documento una composición farmacéutica que incluye un compuesto como se describe en el presente documento, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en combinación con un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden prepararse utilizando aditivos farmacéuticamente aceptables. La expresión "aditivos farmacéuticamente aceptables", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más vehículos, diluyentes y excipientes que son compatibles con los otros aditivos de las composiciones o formulaciones y no son perjudiciales para el paciente. El compuesto, o sus sales farmacéuticamente aceptables, descritos en el presente documento pueden formularse como composiciones farmacéuticas administradas por diversas vías, como la vía oral o la vía intravenosa. La biodisponibilidad es a menudo un factor en el tratamiento del cáncer, y la capacidad de adaptar los métodos de administración y las composiciones farmacéuticas para controlar u optimizar la biodisponibilidad de un ingrediente activo es útil. Una composición de SERD biodisponible por vía oral sería especialmente útil. Se cree que el compuesto, o sus sales farmacéuticamente aceptables, tal como se describen en el presente documento, tiene biodisponibilidad oral. Se pueden encontrar ejemplos de composiciones farmacéuticas y procesos para su preparación en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 22a ed., Mack Publishing Co., 2012)). Los ejemplos no limitantes de vehículos, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen los siguientes: solución salina, agua, almidón, azúcares, manitol y derivados de sílice; agentes aglutinantes, como carboximetilcelulosa y otros derivados de la celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona; caolín y bentonita; polietilglicoles.

También se describe en el presente documento un compuesto como se describe en el presente documento, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su uso en terapias. El compuesto descrito en el presente documento, o sus sales farmacéuticamente aceptables, como se describe en el presente documento, puede utilizarse en el tratamiento del cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de endometrio, el cáncer de próstata, el cáncer de útero, el cáncer gástrico o el cáncer de pulmón. En concreto, el cáncer puede ser un cáncer de mama positivo a ER, un cáncer gástrico positivo a ER o un cáncer de pulmón positivo a ER. Por ejemplo, el compuesto, o su sal farmacéuticamente aceptable, puede administrarse por vía oral.

El compuesto tal como se describe en el presente documento, y sus sales farmacéuticamente aceptables, puede tener utilidad clínica como agente único o en combinación con otros agentes anticancerígenos, para el tratamiento de cánceres como el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de endometrio, el cáncer de próstata, el cáncer de útero, el cáncer gástrico y el cáncer de pulmón. Cuando se utiliza en combinación con otros agentes anticancerígenos, el compuesto descrito en el presente documento, o sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden utilizarse simultáneamente, de forma secuencial o por separado con los otros agentes anticancerígenos. Un ejemplo de otro agente anticancerígeno que puede combinarse con el compuesto descrito en el presente documento es el 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoxi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o la dosis del compuesto descrito en el presente documento, o sus sales farmacéuticamente aceptables, que, tras la administración de una sola dosis o de dosis múltiples al paciente, proporciona el efecto deseado en el paciente que está siendo diagnosticado o tratado. Preferentemente, un efecto deseado es la inhibición de la proliferación de células tumorales, la muerte de células tumorales o ambas. El compuesto descrito en el presente documento, o sus sales farmacéuticamente aceptables, como se describen en el presente documento, son en general eficaces en un amplio intervalo de dosis. Por ejemplo, las dosis por día normalmente están dentro del intervalo diario de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 200 mg.

Tal como se utilizan en el presente documento, "tratamiento" o "tratar" incluyen frenar, ralentizar, detener o revertir la progresión o la gravedad de un síntoma o trastorno existente.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "paciente" se refiere a un ser humano que padece una enfermedad, un trastorno o una afección concretos.

Los compuestos de la presente invención, como se describe en el presente documento, o sus sales farmacéuticamente aceptables, como se describen en el presente documento, pueden prepararse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, algunos de los cuales se ilustran en las preparaciones y los ejemplos siguientes. Las etapas sintéticas específicas de cada una de las vías descritas pueden combinarse de diferentes maneras o junto con etapas de diferentes procedimientos, para preparar el compuesto descrito en el presente documento, o sus sales farmacéuticamente aceptables. Los productos pueden recuperarse mediante métodos convencionales bien conocidos en la técnica, que incluyen la extracción, la evaporación, la precipitación, la cromatografía, la filtración, la trituración y la cristalización. Los reactivos y los materiales de partida están fácilmente disponibles para los expertos en la materia.

En una etapa opcional, se puede formar una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto como se describe en el presente documento mediante la reacción de una base libre apropiada de la presente invención con un ácido farmacéuticamente aceptable apropiado en un disolvente adecuado en condiciones convencionales. Además, la formación de dichas sales puede producirse simultáneamente a la desprotección de un grupo protector de nitrógeno. La posible formación de sales farmacéuticamente aceptables es bien conocida. Véase, por ejemplo, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs", International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al., "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities", Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); y Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977). Los expertos en la materia apreciarán que un compuesto como se describe en el presente documento se convierte fácilmente en una sal farmacéuticamente aceptable y puede aislarse como tal.

A menos que se indique específicamente, las abreviaturas utilizadas en el presente documento se definen según Aldrichimica Acta, vol. 17, n.° 1, 1984, o el significado comúnmente aceptado por los expertos en la materia. Otras abreviaturas se definen como sigue: "AUC" se refiere al área bajo la curva; "BSA" se refiere a la albúmina de suero bovino; "DCM" se refiere al diclorometano o cloruro de metileno; "DMA" se refiere a la dimetilamina; "DMEM" se refiere al medio de Eagle modificado de Dulbecco; "DMF" se refiere a la N,N-dimetilformamida; "DMSO" se refiere al dimetilsulfóxido; "ADN" se refiere al ácido desoxirribonucleico; "ADNc" se refiere al ADN complementario; "ADNasa" se refiere a la desoxirribonucleasa; "DTT" se refiere al ditiotreitol; "EC50" se refiere a la concentración de un agente que produce una respuesta del 50 % de la actividad diana en comparación con un compuesto de control positivo predefinido (EC50 absoluto); "EDTA" se refiere al ácido etilendiaminotetraacético; "ERa" se refiere al receptor de estrógeno alfa; "EtOAc" se refiere al acetato de etilo; "EtOH" se refiere al etanol; "FBS" se refiere al suero bovino fetal; "HBSS" se refiere a la solución salina equilibrada de Hank; "HEPES" se refiere al ácido 4-(2-hidroxietil)-1-pipazinetanosulfónico; "IC50" se refiere a la concentración de un agente que produce el 50 % de la respuesta inhibitoria máxima posible para ese agente (IC50 relativo), o la concentración de un agente que produce el 50 % de inhibición de la actividad de la enzima diana en comparación con el control de placebo (1C50 absoluto); "iPrOH" se refiere al isopropanol o alcohol isopropílico; "IV" se refiere a la administración intravenosa; "Ki" se refiere a la constante de inhibición; "MeOH" se refiere al alcohol metílico o metanol; "MTBE" se refiere al metil f-butil éter; "PBS" se refiere a la solución salina tamponada con fosfato; "PO" se refiere a la administración oral; "PRa" se refiere al receptor de progesterona alfa; "QD" se refiere a la dosis de una vez al día; "ARN" se refiere al ácido ribonucleico; "ARNasa" se refiere a la ribonucleasa; "RT-PCR" se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa; "RT-qPCR" se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa; "THF" se refiere al tetrahidrofurano; y "XPhos Pd G2" se refiere al cloro(2-diclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropil-1,1'-bifenil)[2-(2'-amino-1,1'-bifenilo)]paladio(II).

Las siguientes preparaciones y ejemplos ilustran más a fondo más la invención.

Preparaciones y ejemplos

Preparación 1: 2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol

Se añade triacetoxiborohidruro de sodio (405 g, 1,91 mol) en porciones durante 15 minutos a una solución agitada a 0 °C de clorhidrato de 3-(fluorometil)azetidina (160 g, 1,28 mol) en DCM (2,4 L) bajo una atmósfera de N2 y se agita a 0 °C durante 10 minutos. Se añade 1,4-dioxano-2,5-diol (99 g, 0,83 mol) a 0 °C en 6 porciones durante un período de 1 hora y luego se agita a 0-5 °C durante 15 minutos. Se deja que la reacción se caliente hasta la temperatura ambiente y agita durante 2 horas bajo una atmósfera de N2. Se enfría la reacción hasta 10-15 °C durante 20 minutos. Se añade agua (800 ml) durante 25-30 minutos a 10-15 °C, se deja calentar hasta la temperatura ambiente durante 5-10 minutos y luego se separan las capas. Se lava la capa acuosa con DCM (800 ml), se separan las capas y luego se enfrían las capas acuosas reunidas hasta 10-15 °C y se ajusta el pH a 13-14 utilizando una solución de hidróxido de sodio al 50 % (aproximadamente 540 ml). Se deja que la capa acuosa se caliente hasta la temperatura ambiente, se extrae con DCM (4 X 800 ml), se seca con sulfato sódico (80 g), se filtra y se concentra hasta la sequedad para obtener el compuesto del título. Tras esta preparación se obtuvieron 139 g (82 %) del compuesto del título como un aceite amarillo espeso con un ES/MS (m/z) de 134,1 (M+H).

Preparación 2: Clorhidrato de 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol

Se disuelve 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol (529 g, 4 mol) en MTBE (2,6 L) y se enfría hasta 0 °C. Se añade una solución de HCl/EtOH (492 ml, al 30 % en peso) gota a gota durante 30 minutos y se agita a 0 °C durante 30 minutos. Se filtran los sólidos y se lava la torta de filtración con MTBE (2 X 200 ml). Se seca bajo una atmósfera de N2 durante 8 horas para obtener el compuesto del título. Tras esta preparación se obtuvieron 580 g (86%) del compuesto del título como un sólido blanco con un ES/MS (m/z) de 134,0 (M+H).

Preparación 3: (3-Cloro-7-metoquinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanona

Se enfría una mezcla de 4-bromo-3-cloro-7-metoxiquinoleína (70 g, 254 mmol) y THF (1 L) hasta -40 °C bajo una atmósfera de N2 lo cual produjo la precipitación del material. Se añade cloruro de isopropilmagnesio (2 M en THF, 254 ml, 509 mmol) durante 20 minutos y se agita la mezcla durante 1 hora. Se añade una solución de cloruro de 4 fluorobenzoílo (66 ml, 559 mmol) en THF (140 ml) gota a gota y se deja calentar hasta la temperatura ambiente. Se enfría la reacción con una solución saturada de cloruro de amonio (300 ml) y agua (200 ml) y se separan las capas. Se lava la capa orgánica con solución saturada de cloruro amónico (300 ml), se seca sobre MgSO4, se filtra y se concentra para obtener un residuo oleoso. Se filtra el aceite marrón bruto a través de gel de sílice eluyendo con una mezcla de MTBE/hexano (1:1) para obtener el producto bruto como un sólido amarillo (84 g). Se trata el sólido con acetato de metilo al 10 %/heptano (800 ml) y se agita a temperatura ambiente durante la noche. Se filtra para recoger los sólidos y se guarda. Se concentra el filtrado y se purifica sobre sílice eluyendo con EtOAc al 10-40 %/hexanos y luego se trata el producto con acetato de metilo al 10 %/heptano (200 ml) y se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. Se filtran los sólidos resultantes, se reúnen con los sólidos de la filtración anterior y se secan al vacío durante la noche para obtener el compuesto del título. Tras esta preparación se obtuvieron 31 g (38 %) del compuesto del título como un sólido amarillo con un ES/MS (m/z) de 316,0 (M+H).

Preparación 4: (3-Cloro-7-hidroxiquinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanona

Se añade tribromuro de boro (1 M en DCM, 295 ml, 295 mmol) a una mezcla de (3-cloro-7-metoquinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanona (31 g, 98 mmol) en DCM (217 ml) y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 3 días. Se vierte la mezcla lentamente en una solución a 0 °C de fosfato de potasio dibásico (2 M en agua, 700 ml) y agua (200 ml). Se deja que la mezcla se caliente hasta la temperatura ambiente y se agita durante 1 hora. Se concentra la solución al vacío para eliminar los disolventes orgánicos, se filtra, se recoge el filtrado y se seca el filtrado al vacío a 45 °C durante la noche. Se tratan los sólidos con DCM/heptano (1:1,450 ml) y se agita durante la noche. Se recogen los sólidos y se secan al vacío durante la noche para obtener el compuesto del título. Tras esta preparación se obtuvieron 32 g (rendimiento cuantitativo) del compuesto del título como un sólido marrón claro con un ES/MS (m/z) de 302,0 (M+H).

Preparación 5: (3-Cloro-7-hidroxiquinolin-4-il)-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoxi}fenil)metanona

Se añade clorhidrato de 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etan-1-ol (3,90 g, 23,0 mmol) a una solución agitada de (3-cloro-7-hidroxiquinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanona (5,00 g, 15,3 mmol) en DMF (75 ml), seguida de hidruro de sodio (al 60 % en aceite mineral, 3,07 g, 76,6 mmol). Se agita bajo una atmósfera de N2 y se calienta hasta 40 °C durante 45 minutos. Se extingue la solución con agua y se concentra. Se reparte el residuo entre iPrOH al 20 %/CHCh y una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico y se separa, se extrae la fase acuosa con 2 X iPrOH al 30 %/CHCl3, se reúnen combinan los extractos orgánicos, se secan las capas orgánicas combinadas sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra el filtrado para obtener el producto bruto como un aceite rojo oscuro. Se purifica el material bruto mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con un gradiente de NH37 N al 5-10 % en MeOH/DCM para dar el compuesto del título. Tras esta preparación se obtuvieron 5,31 g (84 %) del compuesto del título como un sólido amarillo con un ES/MS (m/z) de 415,0 (M+H).

Preparación 6: (4-Fluorofenil)-[3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxi-4-quinolil]metanona

Se desgasifica/purga con 5 X N 2 una mezcla de (3-doro-7-hidroxi-4-quinolil)-(4-fluorofenil)metanona (140 g, 440,8 mmol), ácido 2-fluoro-4-(trifluorometil)fenilborónico (183,3 g, 881,7 mmol), carbonato potásico (184,6 g, 1,3 mol), 2 metil-2-butanol (1,7 L) y agua (0,56 L). Se añade XPhos Pd G2 (7,1 g, 8,82 mmol) y se calienta a 80 °C durante 2 horas. Se enfría la mezcla hasta la temperatura ambiente y se evapora el disolvente orgánico. Se añade EtOAc (1 L) y agua (0,2 L). Se separa la capa orgánica y se secar sobre sulfato de magnesio. Se filtra este material a través de gel de sílice y se concentra hasta la sequedad. Se tritura el material bruto con una mezcla de hexanos (1,25 L) y MTBE (0,25 L) para obtener un sólido. Se filtra el sólido y se seca al vacío. Se disuelve el sólido en THF (1,5 L) y añada un depurador de SiliaMetS® Thiol (150 g). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se filtra el depurador y se evapora el filtrado hasta la sequedad para obtener el compuesto del título. Tras esta preparación se obtuvieron 185,5 g (96%) del compuesto del título como un sólido blanco con un ES/MS (m/z) de 430,0 (M+H).

Ejemplo 1: (4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-il]etoxi}fenil)-{3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4-il}metanona

En un recipiente equipado con una entrada de N2 se añade THF (2,8 L), ferc-butóxido de potasio (274,5 g, 2,45 mol) y 2-(3-(fluorometil)azetidin-1-il)etan-1-ol (168 g, 1,22 mol). Se agita la mezcla durante 10 minutos. Se añade gota a gota una solución de (4-fluorofenil)-[3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxi-4-quinolil]metanona (350 g, 0,81 mol) en THF (0,7 L). Se agita a temperatura ambiente durante una hora. Se extingue la reacción con HCl 1 N hasta pH 8 y se diluye con EtOAc (4 L). Se separa la capa orgánica y se lavar con salmuera (2 L). Se seca la solución sobre sulfato de magnesio, se filtra la solución y se concentra hasta la sequedad para obtener el compuesto del título. Tras esta preparación se obtuvieron 415 g (93,8 %) del compuesto del título como un sólido marrón pálido con un ES/MS (m/z) de 543,2 (M+H).

Ejemplo alternativo 1

Se desgasifica/purga con N2 x 5 una mezcla de (3-cloro-7-hidroxiquinolin-4-il)-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoxi}fenil)metanona (200 mg, 0.48 mmol), ácido 2-fluoro-4-(trifluorometil)fenilborónico (158 mg, 0,72 mmol), carbonato potásico (202 mg, 1,45 mmol), 2-metil-2-butanol (3 ml) y agua (1 ml) en un vial para microondas. Se añade XPhos Pd G2 (12 mg, 0,015 mmol), se sella la mezcla y se calienta en el microondas a 80 °C durante 2 horas. Se reparte el residuo entre MTBE y una solución saturada de cloruro de amonio. Se separan las capas y se extrae la capa acuosa con MTBE. Se reúnen los extractos orgánicos, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentra el filtrado para obtener un residuo naranja. Se purifica el material bruto mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con MeOH al 5 %/DCM para obtener el compuesto del título. Tras esta preparación se obtuvieron 205 mg (78 %) del compuesto del título como un sólido amarillo con ES/MS (m/z) de 543,2 (M+H).

Ejemplo 2: 5-(4-{2-[3-(Fluorometil)azetidin-1 -il]etoxi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3 -c]quinolin-2-ol racémico

Se enfría una solución de (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoxi}fenil)-{3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4-il}metanona (5,27 g, 9,71 mmol) en 1,4-dioxano (100 ml) hasta 5 °C. Se añade trietilborohidruro de litio (1 M en THF, 30,0 ml, 30,0 mmol). Se retira el baño de enfriamiento y se agita durante 1,5 minutos a temperatura ambiente. Se extingue la mezcla con agua. Se añade una solución saturada de NH4Cl y EtOAc. Se separan las capas y se extrae la capa acuosa con EtOAc. Se reúnen los extractos orgánicos, se secan sobre MgSO4 anhidro, se filtran y se concentra el filtrado. Se disuelve el residuo bruto en THF (100 ml). Se añade hidruro de sodio (al 60 % en aceite mineral, 1,94 g, 48,5 mmol). Se calienta la solución a reflujo durante 1,5 horas. Se añade más hidruro de sodio (al 60 % en aceite mineral, 1,94 g, 48,5 mmol) y se agita a reflujo durante 30 minutos más. Se enfría la solución hasta la temperatura ambiente y se extingue con agua. Se añade EtOAc y una solución saturada de NH4Cl. Se separan las capas y se extrae la capa acuosa con EtOAc. Se reúne el extracto orgánico, se seca sobre MgSO4 anhidro, se filtra y se concentra el filtrado. El residuo se purifica por cromatografía de resolución rápida en gel de sílice eluyendo con un gradiente de MeOH al 5-7 % en DCM para obtener el compuesto del título (3,70 g, 72 %) como una espuma amarilla clara. ES/MS (m/z): 525,2 (M+H).

Ensayos biológicos

La relación entre la expresión del receptor de estrógeno y ciertos tipos de cáncer ha sido notificada en la bibliografía (para el cáncer de mama véase, por ejemplo, Puhalla S., Bhattacharya S., Davidson N., Hormonal therapy in breast cancer: A model disease for the personalization of cancer care, Molecular Oncology, 2012, 6:222-236; Kennecke H., Yerushalmi R., Woods R., Cheang M.C.U., Voduc D., Speers C.H., Nielsen T.O., Gelmon K., Metastatic behavior of breast cancer subtypes, J. Clin. Oncol., 2010, 28(20):3271-3277; para el cáncer de ovario véase, por ejemplo, O'Donnell A.J., Macleod K.G., Burns D.J., Smyth J.F., Langdon S.P., Estrogen receptor-alpha mediates gene expression changes and growth response in ovarian cancer cells exposed to estrogen, Endocr. Relat. Cancer, 2005;12(4):851-866; Walker G., MacLeod K., Williams A.R., Cameron D.A., Smyth J.F., Langdon S.P., Estrogen regulated gene expression predicts response to endocrine therapy in patients with ovarian cancer, Gynecol. Oncol., 2007, 106(3):461-468; Smyth J.F., Gourley C., Walker G., MacKean M.J., Stevenson A., Williams A.R., et al., Antiestrogen therapy is active in selected ovarian cancer cases: The use of letrozole in estrogen receptor-positive patients, Clin. Cancer Res., 2007, 13(12):3617-3622; para el cáncer de próstata véase, por ejemplo, Bonkohoff H., Fixemer T., Hunsicker I. y Remberger K., Estrogen receptor expression in prostate cancer and premalignant prostate lesions, Am. J. Pathol., 1999, 155:641-647; para el cáncer de endometrio y uterino véase, por ejemplo, Krasner C., Aromatase inhibitors in gynecologic cancer, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2007, agosto-septiembre, 106(1-5):76-80; Boisen M.M., Andersen C.L., Sreekumar S., et al., Treating gynecologic malignancies with selective estrogen receptor downregulators (SERDs): Promise and challenges, Mol. Cell Endocrinol., 2015, 418:322-3330; para el cáncer de pulmón véase, por ejemplo, Baik C.S., Eaton K.D. et al., Estrogen signaling in lung cancer: An opportunity for novel therapy, Cancer, 2012, 4:969-988; Márquez-Garban D.C., Chen H.-W., Goodglick L., Fishbein M.C. y Pietras R.J., Targeting aromatase and estrogen signaling in human non-small cell lung cancer. Steroid enzymes and cancer, Ann. N. Y. Acad Sci, 2009, 1155:194-205 Hamilton D.H., Griner L.M., Keller J.M., Hu X., Southall N., Marugán J., David J.M., Ferrer M. y Palena C., Targeting estrogen receptor signaling with fulvestrant enhances immune and chemotherapy mediated cytotoxicity of human lung cancer, Clin. Cancer Res., 2016, 22(24):6204-6216 Rodríguez-Lara V., Hernández-Martínez J.M., Arrieta O., IInfluence of estrogen in non-small cell lung cancer and its clinical implications, J. Thoracic Disease, 2018, 10(1):482-497; para el cáncer gástrico véase, por ejemplo, Tang W., Liu R., Yan Y., Pan X., Wang M., Han X., Ren H. y Zhang Z., Expression of estrogen receptors and androgen receptor and their clinical significance in gastric cancer, Oncotarget, 2017, 8(25) 40765-40777).

Los siguientes ensayos demuestran que los compuestos ejemplificados son potentes degradadores de las proteínas de ERa de tipo salvaje y mutante. Los resultados de los ensayos también demuestran que los compuestos ejemplificados son potentes antagonistas de los receptores ERa de tipo salvaje y mutante e inhiben la actividad transcripcional mediada por ER. Además, los ensayos demuestran que el compuesto del ejemplo 1 inhibe la proliferación de líneas celulares de cáncer de mama ER+, y la transducción de señales de ERa y la inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama positivo a ER.

Ensayo de unión de competencia de ERa (de tipo salvaje) y ERa (mutante Y537S)

El propósito de los siguientes ensayos de unión de competencia de ER es determinar la afinidad de unión de un compuesto de ensayo contra ERa (de tipo salvaje) y ERa (mutante Y537S). Véase Fanning et al., "Estrogen receptor alpha somatic mutations Y537S and D538G confer breast cancer endocrine resistance by stabilizing the activating function-2 binding conformation", eLife 2016;5:e12792.

Se realiza el ensayo de unión de competencia en un tampón que contiene HEPES 50 mM, pH 7,5, EDTA 1,5 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, ovoalbúmina 1 mg/ml y DTT 5 mM, utilizando 0,025 pCi por pocillo de 3H-estradiol (118 Ci/mmol, 1 mCi/ml), 7,2 ng/pocillo de ERa (de tipo salvaje) o 7,2 ng/pocillo de ERa (mutante Y537S). Se añade el compuesto de ensayo a 10 concentraciones diferentes que varían de 10000 nM a 0,5 nM, y se determina la unión no específica en presencia de 1 pM de 17-p estradiol. Se incuba la reacción de unión (140 pL) durante 4 horas a temperatura ambiente y, a continuación, se añade el tampón dextrano-carbón frío (70 pL) (que contiene por cada 50 ml de tampón de ensayo, 0,75 g de carbón vegetal y 0,25 g de dextrano) a cada reacción. Se mezclan las placas durante 8 minutos en un agitador orbital a 4 °C y luego se centrifuga a 3000 rpm a 4 °C durante 10 minutos. Se transfiere una parte alícuota (120 pL) de la mezcla a otra placa de fondo plano blanca de 96 pocillos (Costar) y se añade líquido de centelleo Perkin Elmer Optiphase Supermix (175 j L) a cada pocilio. Se sellan las placas y se agitan enérgicamente en un agitador orbital. Tras una incubación de 2,5 horas, se leen las placas en un contador Wallac Microbeta. Se calcula la IC50 utilizando un ajuste de curva logística de 4 parámetros y calcular el porcentaje de inhibición a 10 j M. Se convierten los valores de IC50 del compuesto en Ki mediante la ecuación de Cheng-Prusoff. Los resultados de este ensayo demuestran que el compuesto del ejemplo 1 se une al ERa recombinante de tipo salvaje con una Ki (nM) de 3,78 0,74 (n = 3) y se une al ERa mutante (Y537S) con una Ki (nM) de 21,24 ± 2,12 (n = 3).

Los resultados de este ensayo demuestran la afinidad de unión y la potencia del compuesto ejemplificado contra las proteínas de ERa de tipo salvaje y mutante (ESR1 Y537S).

Ensayo de degradación de ERa en células MCF7

El propósito del siguiente ensayo de degradación de ERa es medir la degradación de ERa por un compuesto de ensayo en una línea celular de cáncer de mama positivo a ERa como MCF7.

Se cultivan células MCF7 (adquiridas de ATCC HTB-22) en medio DMEM suplementado con FBS al 10 %, insulina humana 10,01 mg/ml y antibióticos de penicilina/estreptomicina al 1 % y se colocan en placas de fondo plano de 384 pocillos a una densidad de 4000 células por pocillo en medio DMEM sin rojo de fenol (20 j L) que contenía FBS con extracción de carbón al 10 %. Las células se incuban durante la noche en un incubador de cultivos celulares (5% de CO2, 95 % de humedad relativa (HR) y 37 °C) y se deja que se adhieran a la placa. Al día siguiente, se administra a las células el compuesto de ensayo. Se utiliza un dispensador acústico Echo 555 para preparar diluciones en serie del compuesto de ensayo (1:3) en un intervalo de 6 j M a 0,0003 j M. Las células reciben la dosis mediante la adición de 5 j l procedentes de la placa de dilución en serie a la placa de células para producir una concentración final de DMSO del 0,2 % con un intervalo de dosis de concentración final del compuesto de ensayo entre 2 y 0,0001 j M. Para el punto máximo se utiliza un medio que contiene un 0,2 % de DMSO y para el punto mínimo se utiliza fulvestrant diluido a una concentración final de 2 j M en el medio de crecimiento que contiene DMSO al 0,2 %. Tras la administración del compuesto de ensayo, las placas de células se incuban a 37 °C y 5 % de CO2 durante 24 horas. Se fijan las células añadiendo paraformaldehído al 14 % (10 j l) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavan las células una vez con PBS (20 j l ) y se incuban con PBS (20 j l ) que contenía TWEEN® 20 al 0,5 % (v/v) durante 1 hora. Se lavan las células con PBS que contenía TWEEN® 20 al 0,05 % (2*) y se bloquean con BSA al 3 % en PBS que contenía TWEEN® 20 al 0,05 % y TRITON™ X-100 al 0,1 % (20 jl/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añade una dilución 1:500 de anticuerpo primario (20 j l ) (anticuerpo monoclonal de conejo de ERa (clon SP1) n.° RM-9101-S, Thermo Scientific) en BSA al 1 % en PBS que contenía TWEEN® 20 al 0,05 % por pocillo, se sellan las placas y se incuban durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se lavan las células con PBS que contenía TWEEN® 20 al 0,05 % (2*) y se incuban con anticuerpo secundario (20 jl/pocillo) (dilución 1:1000, IgM de cabra anticonejo ALEXA FLUOR™ 488) en PBS, BSA al 1 % durante 105 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces con PBS (20 jl/pocillo), se añade ARNasa (20 j l de 50 jg/m l) y una dilución de yoduro de propidio 1:1000 en PBS por pocillo (20 jl). Las placas se sellan y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en la mesa de laboratorio (protegidas de la luz). Se escanean las placas con ACUMEN EXPLORER™ [citómetro de microplacas de fluorescencia de barrido láser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir ERa. El análisis de las imágenes se basa en las señales fluorescentes celulares para identificar las células positivas. Se identifican las células positivas al receptor de estrógeno por la intensidad media. La intensidad total a 575-640 del yoduro de propidio/ADN se utiliza para identificar células individuales. El resultado del ensayo es el porcentaje de células positivas al receptor de estrógeno. La IC50 se determina mediante el ajuste de la curva a una logística de cuatro parámetros para cada resultado utilizando GENE DATA™.

Los resultados de este ensayo demuestran que el compuesto de fórmula (I) es un SERD con una potente actividad de degradación del ERa en las células. En concreto, los resultados demuestran una potente degradación del ERa por el compuesto del ejemplo 1 en las células de cáncer de mama MCF7. Utilizando este ensayo, el valor de IC50 relativo (j M) para el compuesto del ejemplo 1 es de 2,16 ± 0,96 nM (n = 15).

Ensayo de inducción de PRa en células MCF7

El propósito del siguiente ensayo de inducción de PRa es determinar si un compuesto de ensayo tiene actividad agonista contra el receptor ERa (se esperaría que un agonista activara el receptor).

Se cultivan MCF7 (adquiridas en ATCC HTB-22) en medio DMEM complementado con FBS al 10 %, insulina humana 1 0,01 mg/ml y antibióticos de penicilina/estreptomicina al 1 % y se colocan las células (antes de alcanzar la confluencia del 70 %) en placas de fondo plano de 384 pocillos a una densidad de 4000 células por pocillo en un volumen de 20 j L de medio DMEM sin rojo de fenol que contenía FBS (con extracción de carbón) al 10 %. Las células se incuban durante la noche en un incubador de cultivos celulares (5% de CO2, 95 % de humedad relativa a 37 °C) y se deja que las células se adhieran a la placa. Al día siguiente, se administra a las células el compuesto de ensayo. Se utiliza un dispensador acústico Echo 555 para preparar diluciones en serie del compuesto (1:3) en un intervalo de 6 j M a 0,0003 j M. Las células reciben la dosis mediante la adición del compuesto de ensayo (5 j L) procedente de la placa de dilución en serie a la placa de células produciendo una concentración final de DMSO del 0,2 % con una concentración final del intervalo de dosis del compuesto de ensayo entre 2 y 0,0001 j M. Para el punto máximo se utiliza un medio que contiene un 0,2 % de DMSO y para el punto mínimo se utiliza fulvestrant diluido a una concentración final de 2 j M en el medio de crecimiento que contenía DMSO al 0,2 %. Tras la administración del compuesto de ensayo, las placas de células se incuban a 37 °C y 5 % de CO2 durante 24 horas. Se fijan las células añadiendo paraformaldehído al 14 % (10 |jl) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavan las células una vez con PBS (20 j l ) y se incuban con PBS (20 j l ) que contenía TWEe N® 20 al 0,5 % (v/v) durante 1 hora. Se lavan las células dos veces con PBS (20 j l) que contenía TWEEN® 20 al 0,05 % y se bloquean con BSA al 3 % en PBS que contenía TWEEN® 20 al 0,05 % y TRITON™ X-100 al 0,1 % (20 jl/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añade una dilución 1:500 del anticuerpo primario (20 jL ) (anticuerpo monoclonal de ratón antihumano del receptor de progesterona, clon PgR 636 Dako, M3569) en BSA al 1 %/PBS con 0,05 TWEEN® 20 por pocillo, se sellan las placas y se incuban durante la noche a 4 °C.

Al día siguiente, se lavan las células con PBS, TWEEN® 20 al 0,05 % (2*20 j l) y se incuban con anticuerpo secundario (20 jl/pocillo) (dilución 1:1000, IgM de cabra anticonejo ALEXA FLUOR™ 488) en PBS, BSA al 1 % durante 105 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS (2*20 jl), se añaden ARNasa (20 j l de 50 jg/m l) y una dilución 1:1000 de yoduro de propidio en PBS por pocillo. Las placas se sellan y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en la mesa de laboratorio (protegidas de la luz). Se escanean las placas con ACUMEN EXPLORER™ [citómetro de microplacas de fluorescencia de barrido láser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir el receptor de progesterona alfa. El análisis de las imágenes se basa en las señales fluorescentes celulares para identificar las células positivas. Se identifican las células positivas al receptor de progesterona por la intensidad media. La intensidad total a 575-640 del yoduro de propidio/ADN se utiliza para identificar células individuales. El resultado del ensayo es el porcentaje de células positivas al receptor de progesterona. La IC50 se determina mediante el ajuste de la curva a una logística de cuatro parámetros para cada resultado utilizando GENE DATA™.

Utilizando este ensayo, la IC50 relativa (jM ) del compuesto del ejemplo 1 es >2 jM . Los resultados de este ensayo demuestran que no hay una actividad agonista significativa del ejemplo 1 en las células de cáncer de mama MCF7. Estos resultados también demuestran que el compuesto del ejemplo 1 es un antagonista puro del ERa en las células de cáncer de mama MCF7.

Ensayo celular de inhibición de PRa (antagonismo funcional de ERa) en células MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR

El propósito del siguiente ensayo celular de inhibición de PRa (antagonismo funcional de ERa) es determinar la actividad antagonista de un compuesto de ensayo contra el receptor ERa mutante Y537N. Se espera que un antagonista en este ensayo bloquee la función del receptor ERa. El PRa (PGR) es una diana transcripcional en una etapa posterior del ERa y, por tanto, se espera que un antagonista del ERa inhiba la expresión del PRa.

Se cultivan MCF7-ESR1 Y537N-682 (generadas por la edición genética con CRISPR/Cas9 del gen ESR1 en células MCF7, clon n.° 682) en medio DMEM complementado con FBS al 10 % y antibióticos de penicilina/estreptomicina al 1 %, y se cultivan las células en placan (antes de que alcancen el 70 % de confluencia) en placas de fondo plano de 384 pocillos a una densidad de 4000 células por pocillo en medio DMEM sin rojo de fenol y FBS (con extracción de carbón) al 10 % (volumen de 20 jl). Las células se incuban durante la noche en un incubador de cultivos celulares (5% de CO2, 95 % de humedad relativa (HR) y 37 °C) y se deja que se adhieran a la placa. Al día siguiente, se administra a las células el compuesto de ensayo. Utilice un dispensador acústico Echo 555 para preparar diluciones en serie del compuesto (1:3) en un intervalo de 6 jM a 0,0003 jM . Las células reciben la dosis mediante la adición de 5 j l procedentes de la placa de dilución en serie a la placa de células para producir una concentración final de DMSO del 0,2 % con un intervalo de dosis de concentración final del compuesto de ensayo entre 2 y 0,0001 jM . Para el punto máximo se utiliza un medio que contiene un 0,2 % de DMSO y para el punto mínimo se utiliza fulvestrant diluido a una concentración final de 2 jM en el medio de crecimiento que contenía DMSO al 0,2 %. Tras la administración del compuesto de ensayo, las placas de células se incuban a 37 °C y 5 % de CO2 durante 72 horas. Se fijan las células añadiendo paraformaldehído al 14 % (10 j l ) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavan las células con PBS (1* 20 jL ) y se incuban con PBS (20 jL ) que contenía TWEEN® 20 al 0,5 % (v/v) durante 1 hora. Se lavan las células con PBS (2*20 jL), TWEEN® 20 al 0,05 %, y se bloquean con BSA al 3 %/PBS, TWEEN® 20 al 0,05%, TRITON™ X-100 al 0,1 % (20 jL/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añade una dilución 1:500 de anticuerpo primario (20 jL ) (anticuerpo monoclonal de ratón antihumano del receptor de progesterona, clon PgR 636 Dako, M3569) en b Sa al 1 %/PBS, 0,05 TWEEN® 20 por pocillo, se sellan las placas y se incuban durante la noche a 4 °C.

Al día siguiente, las células se lavan con PBS, TWEEN® 20 al 0,05 % (2*20 j l) y se incuban con anticuerpo secundario (20 jl/pocillo) (dilución 1:1000, IgM anticonejo de cabra ALEXA FLUOR™ 488) en PBS, BSA al 1 % durante 105 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS (2*20 jl), se añaden ARNasa (20 j l de 50 jg/m l) y una dilución 1:1000 de yoduro de propidio en PBS por pocillo. Las placas se sellan y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en la mesa de laboratorio (protegidas de la luz). Se escanean las placas con ACUMEN EXPLORER™ [citómetro de microplacas de fluorescencia de barrido láser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir el receptor de progesterona alfa. El análisis de las imágenes se basa en las señales fluorescentes celulares para identificar las células positivas. Se identifican las células positivas al receptor de progesterona por la intensidad media. La intensidad total a 575-640 del yoduro de propidio/ADN se utiliza para identificar células individuales. El resultado del ensayo es el porcentaje de células positivas al receptor de progesterona. La IC50 se determina mediante el ajuste de la curva a una logística de cuatro parámetros para cada resultado utilizando GENE DATA™.

Utilizando este ensayo, la IC50 relativa (nM) del compuesto del ejemplo 1 es 7,602 4,804 nM (n = 14). Estos resultados demuestran una potente inhibición del PRa y un antagonismo funcional por parte del ejemplo 1 en células de cáncer de mama MCF7 (ESR1 Y537N, mutante heterocigótico). Como tal, el compuesto del ejemplo 1 es un potente antagonista del mutante ERa (Y537N) y un potente inhibidor de la transcripción mediada por ERa. El PRa (PGR) es también una diana transcripcional de ERa y los resultados de este ensayo demuestran una potente inhibición de la transcripción de PRa mediada por ERa.

Ensayo celular de inhibición de PRa (antagonismo funcional de ERa) en células MCF7

El propósito del siguiente ensayo celular de inhibición de PRa (antagonismo funcional de ERa) es determinar la actividad antagonista de un compuesto de ensayo contra el receptor ERa. Se espera que un antagonista en este ensayo bloquee la función del receptor ERa. El PRa es una diana transcripcional en una etapa posterior del ERa y, por tanto, se espera que un antagonista del ERa inhiba la expresión del PRa.

Se utilizan las condiciones de ensayo como se detalla en el anterior ensayo celular de degradación de ERa de Acumen, utilizando la línea celular MCF7, excepto que, antes de la dispensación del compuesto de ensayo, se retira el medio de la placa celular y se pretratan todos los pocillos, excepto los pocillos de control negativo (columna 24 de la placa), con medio de ensayo que contenía estradiol 0,47 nM durante 30 minutos. En este ensayo, se realiza la inmunotinción para la detección de PRa y se escanean las placas con ACUMEN EXPLORER™ [citómetro de microplacas de fluorescencia de barrido láser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir el PRa. El análisis de las imágenes se basa en las señales fluorescentes celulares para identificar las células positivas. Se identifican las células positivas a PRa por la intensidad media. La intensidad total a 575-640 del yoduro de propidio/ADN se utiliza para identificar células individuales. El resultado del ensayo es el porcentaje de células positivas a PRa. La IC50 se determina mediante el ajuste de la curva a una logística de cuatro parámetros para cada resultado utilizando GENE DATA™.

Utilizando este ensayo, la IC50 relativa (nM) del compuesto del ejemplo 1 en este ensayo es de 15,75 ± 9,037 nM (n = 15). Los resultados de este ensayo demuestran una potente inhibición del PRa y un antagonismo funcional del ejemplo 1 en las células de cáncer de mama MCF7. Como tal, el compuesto del ejemplo 1 es un potente antagonista de la proteína ERa de tipo salvaje y un potente inhibidor de la transcripción mediada por ERa. El PRa (PGR) es también una diana transcripcional de ERa y los resultados de este ensayo demuestran una potente inhibición de la transcripción de PRa mediada por ERa.

Ensayo de proliferación celular en MCF7 y MCF7-ESR1 Y537N-682

El propósito de los siguientes ensayos de proliferación celular, en general, es detectar si un compuesto de ensayo tiene efectos sobre la proliferación celular, la viabilidad celular y la citotoxicidad en respuesta al tratamiento en experimentos de cultivo celular. La proliferación celular se controla mediante el seguimiento del número de células a lo largo del tiempo y el ensayo de yoduro de propidio utilizado permite la medición continua de la viabilidad celular a lo largo del tiempo.

Se siembran células MCF7 (adquiridas en ATCC HTB-22) a una densidad de 2000 células por pocillo en medio DMEM sin rojo de fenol y FBS al 10 % (volumen de 20 j l ) (con extracción de carbón) en una placa de cultivo celular de fondo transparente de 384 pocillos. Se cultivan MCF7-ESRY537N -682 (generadas por la edición genética de CRISPR/Cas9 del gen ESR1 en células MCF7, clon n.° 682) en medio DMEM complementado con FBS al 10 % y antibióticos de penicilina/estreptomicina al 1 % a una densidad de 1000 células por pocillo. Las placas se incuban a 37 °C y 5% de CO2. Al día siguiente, se administra a las células el compuesto de ensayo. Se utiliza un dispensador acústico Echo 555 para preparar diluciones en serie del compuesto de ensayo (1:3) en un intervalo de 60 jM a 0,003 jM . Las células reciben la dosis mediante la adición de 5 j l procedentes de la placa de dilución en serie a la placa de células para producir una concentración final de DMSO del 0,2 % con un intervalo de dosis de concentración final del compuesto entre 20 y 0,001 jM . Para el punto máximo utilice se utilizan un medio que contiene 0,2 % de DMSO y para el punto mínimo se utiliza fulvestrant diluido a una concentración final de 2 jM en el medio de crecimiento que contiene DMSO al 0,2 %. Después de la administración del compuesto de ensayo, se incuban las placas de células a 37 °C y 5% de CO2. Siete días después de la adición del compuesto de ensayo, se retiran las placas del incubador y se añade etanol frío al 96 % (65 j l ) a cada pocillo. Después de 30 minutos, se retira el medio y se añade ARNasa (20 j l de 50 jg/m l) (Sigma) y una dilución 1:1000 de yoduro de propidio en PBS por pocillo. Las placas se sellan y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en la mesa de laboratorio (protegidas de la luz). Se escanean las placas con ACUMEN EXPLORER™ [citómetro de microplacas de fluorescencia de barrido láser fabricado por TTP LABTECH LTD]. La línea celular MCF-7 crece formando agregados, y el número de células como número de objetos no puede ser utilizado como lectura por lo que el número de células puede ser evaluado a través del número calculado de células (calculado a través del parámetro de área (relación del área total de la población total de células (un intervalo designado de intensidad de pico de FL-1 (PI) y el área media de la población de células individuales (definida por el perímetro)). La IC50 se determina mediante el ajuste de la curva a una logística de cuatro parámetros para cada resultado utilizando GENE DATA™.

Utilizando este ensayo, la IC50 relativa (nM) del compuesto del ejemplo 1 en MCF7 ESR1 de tipo salvaje es de 9,243 ± 1,741 nM (n = 2) y en células MCf 7-e S r 1 Y537n mutantes es de 7,960 ± 3,691 nM (n = 6). Estos resultados demuestran una potente actividad antiproliferativa y una inhibición del crecimiento celular por parte del ejemplo 1 en células de cáncer de mama MCF7 (ESR1 de tipo salvaje) y MCF7 (ESR1 mutante Y537N).

Ensayo de inhibición de diana in vivo (IVTI) (ensayo RT-qPCR de PGR) en tumores MCF7

El propósito de este ensayo IVTI es medir la capacidad de un compuesto de ensayo (SERD) para inhibir la expresión génica (transcripción) del PGR (receptor de progesterona alfa) en una etapa posterior del ERa en tumores de xenoinjerto implantados en ratones.

Se implantan en ratones NOD SCID hembra (22-25 g) de Envigo RMS, Inc., Madison, Wisconsin 5*10e6 células de cáncer de mama MCF7 ER+ve (ATCC, n.° HTB-22) por vía subcutánea en la región del flanco derecho en solución 1:1 HBSS MATRIGEL™ (200 |jl). Se implanta un gránulo de 17-p estradiol (0,18 mg/gránulo, liberación de 90 días, de Innovative Research) por vía subcutánea 1 día antes de la implantación de las células tumorales. Se mide el crecimiento del tumor y el peso corporal dos veces por semana a partir del séptimo día después de la implantación. Cuando el tamaño de los tumores alcanza 250-350 mm3, se aleatorizan los animales y se agrupan en grupos de cinco animales. Se administra a los animales el compuesto de ensayo en un vehículo específico (hidroxietilcelulosa al 1 %/TWEEN® 80 al 0,25 %/antiespumante al 0,05 % en agua purificada) o con el vehículo solo por vía oral durante 3 días y se recogen los tumores y la sangre en los intervalos de tiempo deseados después de la última dosis. Se sacrifican los animales con anestesia de isoflurano y dislocación cervical. Se congelan los tumores y se conservan a -80 °C hasta su procesamiento para el aislamiento del ARN y el ensayo de RT-qPCR. Se recoge la sangre en tubos con EDTA, se centrifuga para obtener plasma y se congela a -80 °C en una placa de 96 pocillos. Se determina la exposición a los compuestos de prueba mediante espectrometría de masas.

Se pulverizan los tumores en nitrógeno líquido y se lisan en 1* tampón de lisis de ARN (de los kits de aislamiento de Ar N) utilizando esferas Matrix D (MP Biomedical, n.° 6913-500) en una máquina para lisar células FASTPREP-24™ (MP Biomedical). Se transfieren los lisados tumorales a tubos nuevos después de centrifugarlos a 14000 rpm durante 20 minutos a 4 °C. Se aísla el ARN de los lisados tumorales utilizando el minikit de ARN PURELINK® (Invitrogen n.° 12183018A) o el minikit RNeasy (Qiagen n.° 74104 y n.° 74106). Se eliminan los contaminantes del ADN utilizando el estuche de ADNasa PURELIn K® (Invitrogen n.° 12185010) o el estuche de ADNasa sin ARNasa (Qiagen n.° 79254). Se mide la concentración del ARN aislado diluyendo las muestras en agua sin ARNasa y midiendo la absorbancia a 260 nm en un lector de placas (SpectraMax190). Se resta la medición promedio de la absorbancia a 260 nm del blanco (solo agua sin ARNasa) de las mediciones a 260 nm de todas las demás muestras de ARN. Se diluyen las muestras de ARN a concentraciones iguales en agua sin ARNasa. Se sintetiza el ADNc a partir del ARN diluido utilizando el sistema de síntesis de primera hebra para RT-PCR (Invitrogen, n.° 118080-051). Para realizar la RT-qPCR, en primer lugar se diluye el ADNc en agua sin ARNasa. Se reúnen 2* mezcla Absolute Blue qPCR ROX (Thermo, n.° AB-4139/A), el cebador de PGR (Thermo, Hs01556702_m1) y el ADNc diluido para cada reacción en una placa de PCR (Applied Biosystems, n.° 4309849). Se amplifica el ADNc incubando las muestras durante 2 minutos a 50 °C y después durante 15 minutos a 95 °C en el termociclador (sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT). Se continúa la incubación a 95 °C durante 15 segundos, seguidos de 50 °C durante 60 segundos para un total de 40 ciclos. Los ciclos se normalizan con respecto al gen de mantenimiento y se utilizan para calcular el porcentaje de inhibición del PGR en comparación con el vehículo solo. Se analiza cada muestra por duplicado y se utilizan los números promedio para los cálculos. Se calcula el porcentaje de inhibición de la diana (PGR) utilizando Excel y XL Fit.

Los resultados de este ensayo demuestran que el compuesto del ejemplo 1 inhibe la expresión de PRa (PGR) en el modelo de xenoinjerto tumoral. Además, el compuesto del ejemplo 1 inhibe la expresión de PRa (PGR) en un 57 % en el modelo de xenoinjerto tumoral durante 24 horas con una dosis de 30 mg/kg cuando se administra por vía oral. Estos resultados demuestran una inhibición significativa y sostenida de la actividad antagonista del ERa y de la actividad transcripcional mediada por ERa in vivo en un modelo de xenoinjerto tumoral.

Estudio de inhibición del crecimiento tumoral in vivo en el tumor de xenoinjerto MCF7 implantado en ratones

El propósito del siguiente ensayo de inhibición del crecimiento tumoral en xenoinjertos es medir la reducción del volumen tumoral en respuesta a la administración del compuesto de ensayo.

Se expanden las células de cáncer de mama humano MCF7 (ATCC n.° HTB-22) en cultivo, se recolectan y se inyectan 5*10e6 células en solución HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 jL ) por vía subcutánea en el flanco posterior derecho de ratones NOD SCID hembra (22-25 g, Envigo RMS, Inc.). Veinticuatro horas antes de la implantación de las células MCF7, se implantan gránulos de estrógeno (0,18 mg/gránulo, 17p estradiol, liberación de 90 días, Innovative Research) por vía subcutánea. Se mide el crecimiento del tumor y el peso corporal dos veces por semana a partir del séptimo día después de la implantación. Cuando el tamaño de los tumores alcanza 250-350 mm3, se aleatorizan los animales y se agrupan en grupos de 5 animales. Se prepara el compuesto de ensayo en un vehículo apropiado (hidroxietilcelulosa al 1 %/TWEEN® 80 al 0,25 %/antiespumante al 0,05 % en agua purificada) y se administra por sonda oral durante 42 días. Se determina la respuesta del tumor mediante la medición del volumen tumoral realizada dos veces por semana durante el desarrollo del tratamiento. Se considera el peso corporal como medida general de toxicidad cuando se mide el volumen del tumor.

Se ha descubierto que, cuando se utiliza en este ensayo, el compuesto del ejemplo 1 tiene valores de porcentaje de delta T/C como se proporciona en la tabla 6 a continuación. Estos resultados indican que el compuesto del ejemplo 1 muestra una buena biodisponibilidad oral en ratones y una actividad antitumoral significativa o regresiones tumorales en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama humano MCF7.

Estudio de inhibición del crecimiento tumoral in vivo en tumores de xenoinjerto MCF7 implantados en ratones

Tabla 6

Ensayo de biodisponibilidad oral en ratas

El propósito del siguiente ensayo es demostrar si un compuesto de ensayo es biodisponible por vía oral.

Se administra el compuesto de ensayo a ratas Sprague-Dawley por vía intravenosa a 1 mg/kg (utilizando vehículos de: CAPTISOL® al 20 % en tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 2 quantum satis; o DMA al 25 %, EtOH al 15 %, propilenglicol al 10 %, 2-pirrolidona al 25 % y agua purificada al 25 %) y por vía oral a 10 mg/kg (utilizando un vehículo de hidroxietilcelulosa al 1 %, polisorbato 80 al 0,25 %, antiespumante 1510-US al 0,05 % y agua purificada quantum satis). Se recogen muestras de sangre en serie a las 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 y 12 horas después de la dosis intravenosa en embolada y a las 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 y 12 horas después de la administración oral de la dosis oral. Tras el tratamiento con un coagulante EDTA, se obtiene el plasma por centrifugación y se almacena a -70 °C hasta el análisis por LC-MS/MS. Se determina la concentración del compuesto de ensayo en el plasma y se carga en el sistema Watson LIMS™, donde se utiliza el análisis no compartimental para calcular el área bajo la curva (AUC) para los grupos de administración por vía intravenosa y oral. Se calcular la biodisponibilidad oral (% de F) mediante la siguiente ecuación,

% de F — (AUC^oral X Dosisintravenosa)/ (AUC^intravenosa X Dosisoral) X 100.

Utilizando este ensayo, el compuesto del ejemplo 1 muestra un valor de porcentaje de F del 27 %. Este ensayo demuestra que el ejemplo 1 tiene una buena biodisponibilidad oral.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de fórmula (I):

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

2.- El compuesto según la reivindicación 1, siendo dicho compuesto:

3. - Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y uno o más excipientes, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

4. - La composición farmacéutica según la reivindicación 3 que comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales.

5. - El compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su uso en terapia.

6. - Un compuesto de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su uso en el tratamiento del cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer gástrico o cáncer de pulmón.

7. - El compuesto, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para su uso según la reivindicación 6, en el que el compuesto debe administrarse por vía oral.

8. - El compuesto para su uso según la reivindicación 7, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que el cáncer de mama es un cáncer de mama positivo a ER.

9. - El compuesto para su uso según la reivindicación 7, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que el cáncer gástrico es un cáncer gástrico positivo a ER.

10. - El compuesto para su uso según la reivindicación 7, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón positivo a ER.

11. - Un método para preparar 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoxi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, que comprende el enfriamiento de una solución de (4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoxi}fenil)-{3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4-il}metanona en 1,4-dioxano hasta aproximadamente 5 °C y la adición de trietilborohidruro de litio.

12. - El producto del método de la reivindicación 11, en el que el producto es 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoxifenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol.

13. - La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el agente terapéutico adicional es 5-(4-{2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]etoxi}fenil)-8-(trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol.