KR102577142B1

KR102577142B1 - 선택적 에스트로겐 수용체 분해제

Info

Publication number: KR102577142B1
Application number: KR1020217000473A
Authority: KR
Inventors: 제프리 대니얼 코헨; 대니얼 존 솔
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2023-09-12
Also published as: JOP20210004A1; CA3105491A1; CN112424205B; KR20210018460A; JP7085056B2; HUE061032T2; ECSP21001786A; IL279990B2; NZ771719A; MD3820874T2; PT3820874T; AU2019299952A1; DK3820874T3; IL279990A; IL279990B1; HRP20230080T1; JP2021530486A; AU2019299952B2; CA3105491C; SI3820874T1

Abstract

하기 화학식에 따른 신규 선택적 에스트로겐 수용체 분해제 (SERD):

그의 제약상 허용되는 염, 제약 조성물, 용도, 및 사용 방법이 제공된다.

Description

선택적 에스트로겐 수용체 분해제

선택적 에스트로겐 수용체 분해제 (SERD)는 에스트로겐 수용체 (ER)에 결합하여 ER-매개 전사 활성을 하향조절한다. SERD에 기인한 이러한 분해 및 하향조절은 암과 같은 세포 증식 장애의 치료에서 유용할 수 있다. SERD의 일부 소분자 예가 문헌에 개시되어 있다 (예를 들어, WO2005073204, WO2014205136, 및 WO2016097071 참조). 그러나, 공지된 SERD는 암을 효과적으로 치료하는 데 필요한 바와 같이 아직 유용하지 않았다. 예를 들어, 더 양호한 약물동태학 (PK) 및 약력학 (PD) 특성, 임상에서 더 높은 효율성, 및 양호한 경구 생체이용률을 가진 SERD를 찾는 것은 암 치료에서 매우 도움이 될 것이다. ER-매개 전사의 강력한 억제를 가진 순수한 길항제 SERD는 암 치료에서 분명히 유익할 것이다. 암 예컨대 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 및 폐암 뿐만 아니라 신생 내성으로 인한 돌연변이를 치료하기 위한 신규 SERD가 필요하다. 특히 ER 양성 유방암, 위암, 및/또는 폐암을 치료하기 위한 신규 SERD가 필요하다

하기 화학식의 화합물:

,

및 그의 제약상 허용되는 염, 및 그의 제약 조성물이 본원에 제공된다.

유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암을 치료하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 그의 제약상 허용되는 염, 및 그의 제약 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을, 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

요법에서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염이 추가로 제공된다. 본원에 기재된 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염은, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암의 치료에서 사용될 수 있다.

유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염의 용도가 추가로 제공된다.

SERD로서 작용하는 신규 테트라시클릭 화합물 및 그의 제약 염이 본원에 개시되어 있다. SERD는 단일 작용제로서 또는 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM) 아로마타제 억제제, CDK4 억제제, CDK6 억제제, PI3K 억제제, 및 mTOR 억제제를 포함한 다른 부류의 약물과 조합하여 사용되어 호르몬 수용체-양성 유방암을 치료할 수 있다.

본원에 기재된 신규 화합물은 하기 화학식의 화합물이다:

.

상기 화합물의 제약상 허용되는 염이 또한 기재된다. 상기 화합물은 IUPAC 명명법을 사용하여 (4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐){3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시퀴놀린-4-일}메탄온으로서 명명될 수 있다.

또한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을, 제약상 허용되는 부형제, 담체, 또는 희석제와 조합하여 포함하는 제약 조성물이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 제약 조성물은 제약상 허용되는 첨가제를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 첨가제(들)"는 조성물 또는 제제의 다른 첨가제와 상용성이고 환자에게 해롭지 않은 1종 이상의 담체, 희석제, 및 부형제를 지칭한다. 본원에 기재된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 여러 가지의 경로, 예컨대 경구 또는 IV에 투여되는 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. 생체이용률은 종종 암 치료의 요인이며 활성 성분의 생체이용률을 제어하거나 최적화하기 위해 투여 방법 및 제약 조성물을 맞춤화하는 능력이 유용하다. 경구로 생체이용가능한 SERD 조성물이 특히 유용할 것이다. 본원에 기재된 바와 같은, 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 경구 생체이용률을 갖는 것으로 여겨진다. 제약 조성물 및 그의 제조 방법의 예는 문헌 ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy", L. V. Allen Jr, Editor, 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012]에서 찾을 수 있다. 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 식염수, 물, 전분, 당류, 만니톨, 및 실리카 유도체; 결합제 예컨대 카르복시메틸 셀룰로스 및 기타 셀룰로스 유도체, 알기네이트, 젤라틴, 및 폴리비닐-피롤리돈; 카올린 및 벤토나이트; 폴리에틸 글리콜.

암을 치료하는 방법이 본원에 추가로 설명된다. 본원에 기재된 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 투여 방법은, 경구 투여일 수 있다. 암은 에스트로겐 반응성 암일 수 있다. 게다가, 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암일 수 있다. 예를 들어, 암은 ER 양성 유방암, ER 양성 위암, 또는 ER 양성 폐암일 수 있다.

또한, 요법에서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암의 치료에서 사용될 수 있다. 특히, 암은 ER 양성 유방암, ER 양성 위암, 또는 ER 양성 폐암일 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 경구 투여될 수 있다.

게다가, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 경우, 암 치료를 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 의약은 경구 투여될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 의약이 치료에 사용될 수 있는 암의 유형은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암을 포함한다. 특히 암은 ER 양성 유방암, ER 양성 위암, 또는 ER 양성 폐암일 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염은, 암 예컨대 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 및 폐암의 치료를 위한, 단일 작용제로서 또는 다른 항암제와 조합하여 임상적 유용성을 가질 수 있다. 다른 항암제와 조합하여 사용되는 경우, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 다른 항암제와 동시에, 순차적으로, 또는 별도로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 화합물과 조합될 수 있는 다른 항암제의 예는 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은, 환자에게 단일 또는 다수회 용량 투여 직후, 진단 또는 치료 중인 환자에서 원하는 효과를 제공하는, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다. 바람직하게는, 원하는 효과는 종양 세포 증식, 종양 세포 사멸, 또는 둘 다의 억제이다. 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 그의 제약상 허용되는 염은, 일반적으로 광범위한 투여량 범위에서 효과적이다. 예를 들어, 일일 투여량은 통상 약 100 mg 내지 약 2000 mg의 일일 범위에 속한다.

본원에 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 규제, 둔화, 중지, 또는 반전시키는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자"는 특정한 질환, 장애, 또는 병태를 앓고 있는 인간을 지칭한다.

본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 관련 기술분야에 공지된 여러 가지의 절차에 의해 제조될 수 있으며, 이들 중 일부는 하기 제조예 및 실시예에 예시되어 있다. 기재된 경로 각각에 대한 구체적 합성 단계는 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조하기 위해, 상이한 방식으로, 또는 상이한 절차로부터의 단계와 함께 조합될 수 있다. 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리, 및 결정화를 포함한 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 쉽게 이용할 수 있다.

임의적 단계에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 제약상 허용되는 염은 본 발명의 적절한 유리 염기를 표준 조건 하에 적합한 용매에서 적절한 제약상 허용되는 산과 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 게다가, 이러한 염의 형성은 질소-보호기의 탈보호 직후 동시에 발생할 수 있다. 제약상 허용되는 염의 가능한 형성은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)]; [ Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)]; 및 [Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)]을 참조한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 바와 같은 화합물이 제약상 허용되는 염으로서 용이하게 전환되고 단리될 수 있음을 인식할 것이다.

구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 약어는 문헌 [Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984]에 따라, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상 허용된 의미에 의해 정의된다. 기타 약어는 다음과 같이 정의된다: "AUC"는 곡선 아래 면적을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄 또는 메틸렌 클로라이드를 지칭하고; "DMA"는 디메틸아민을 지칭하고; "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지를 지칭하고; "DMF"는 N,N-디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "DNA"는 데옥시리보핵산을 지칭하고; "cDNA"는 상보적 DNA를 지칭하고; "DNase"는 데옥시리보뉴클레아제를 지칭하고; "DTT"는 디티오트레이톨을 지칭하고; "EC₅₀"은 미리 정의된 양성 대조군 화합물과 비교하여 표적 활성의 50% 반응을 생성하는 작용제의 농도 (절대 EC₅₀)를 지칭하고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 지칭하고; "ERα"는 에스트로겐 수용체 알파를 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "EtOH"는 에탄올을 지칭하고; "FBS"는 소 태아 혈청을 지칭하고; "HBSS"는 행크 평형 염(Hank's Balanced Salt) 용액을 지칭하고; "HEPES"는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산을 지칭하고; "IC₅₀"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 생성하는 그 작용제의 농도, (상대 IC₅₀), 또는 위약 대조군과 비교하여 표적 효소 활성의 50% 억제를 생성하는 작용제의 농도 (절대 IC₅₀)를 지칭하고; "iPrOH"는 이소프로판올 또는 이소프로필 알콜을 지칭하고; "IV"는 정맥내 투여를 지칭하고; "K_i"는 억제 상수를 지칭하고; "MeOH"는 메틸 알콜 또는 메탄올을 지칭하고; "MTBE"는 메틸 t-부틸 에테르를 지칭하고; "PBS"는 인산염 완충 식염수를 지칭하고; "PO"는 경구 투여를 지칭하고; "PRα"는 프로게스테론 수용체 알파를 지칭하고; "QD"는 1일 1회 투여를 지칭하고; "RNA"는 리보핵산을 지칭하고; "RNase"는 리보뉴클레아제를 지칭하고; "RT-PCR"은 역전사 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭하고; "RT-qPCR"은 역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "XPhos Pd G2"는 클로로(2-디시클로헥실포스피노-2',4',6'-트리이소프로필-1,1'-비페닐)[2-(2'-아미노-1,1'-비페닐)]팔라듐(II)을 지칭한다.

하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다.

제조예 및 실시예

제조예 1

2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에탄-1-올

소듐 트리아세톡시보로히드리드 (405 g, 1.91 mol)를 N₂하에 DCM (2.4 L) 중 3-(플루오로메틸)아제티딘 히드로클로라이드 (160 g, 1.28 mol)의 교반된 0℃ 용액에 15분의 기간에 걸쳐 나누어 첨가하고 0℃에서 10분 동안 교반하였다. 1,4-디옥산-2,5-디올 (99 g, 0.83 mol)을 0℃에서 1시간의 기간에 걸쳐 6회 분량으로 첨가한 다음에 0-5℃에서 15분 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 가온하고 N₂하에 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 20분의 기간에 걸쳐 10-15℃로 냉각하였다. 10-15℃에서 25-30분의 기간에 걸쳐 물 (800 mL)을 첨가하고, 5-10분 동안 실온으로 가온한 다음에 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM (800 mL)으로 세척하고, 층을 분리한 다음에 합한 수성 층을 10-15℃로 냉각하고 50% 수산화나트륨 용액 (~540 mL)을 사용하여 pH를 13-14로 조정하였다. 수성 층을 실온으로 가온하고, DCM (4 X 800 mL)으로 추출하고, 황산나트륨 (80 g)으로 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 이 제조예에 따라 139 g (82%)의 표제 화합물을 134.1(M+H)의 ES/MS (m/z)를 가진 농후한 황색 오일로서 제공하였다.

제조예 2

2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에탄-1-올 히드로클로라이드

2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에탄-1-올 (529 g, 4 mol)을 MTBE (2.6 L)에 용해시키고 0℃로 냉각하였다. HCl/EtOH 용액 (492 mL, 30 wt%)을 30분에 걸쳐 적가한 다음에 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 여과 케이크를 MTBE (2 X 200 mL)로 세척하였다. N₂ 하에 8시간 동안 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 이 제조예에 따라 580 g (86%)의 표제 화합물을 134.0 (M+H)의 ES/MS (m/z)를 가진 백색 고체로서 제공하였다.

제조예 3

(3-클로로-7-메톡시퀴놀린-4-일)-(4-플루오로페닐)메탄온

4-브로모-3-클로로-7-메톡시퀴놀린 (70 g, 254 mmol)과 THF (1 L)의 혼합물을 N₂ 하에 -40℃로 냉각하여 물질의 침전을 발생시켰다. 이소프로필마그네슘 클로라이드 (THF 중 2 M, 254 mL, 509 mmol)를 20분에 걸쳐 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서 THF (140 mL) 중 4-플루오로벤조일 클로라이드 (66 mL, 559 mmol)의 용액을 적가하고 실온으로 가온하였다. 반응물을 포화 염화암모늄 용액 (300 mL) 및 물 (200 mL)로 켄칭하고 층을 분리하였다. 유기 층을 포화 염화암모늄 용액 (300 mL)으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 오일상 잔류물을 제공하였다. MTBE/헥산 (1:1)의 혼합물로 용리하면서 조 갈색 오일을 실리카겔을 통해 여과하여 조 생성물을 황색 고체 (84 g)로서 수득하였다. 고체를 10% 메틸아세테이트/헵탄 (800 mL)으로 처리하고 실온에서 밤새 교반하였다. 여과하여 고체를 수집하고 따로 남겨두었다. 여액을 농축하고 10-40% EtOAc/헥산으로 용리하면서 실리카 상에서 정제한 다음에 생성물을 10% 메틸아세테이트/헵탄 (200 mL)으로 처리하고 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고, 이전 여과로부터 수득한 고체와 합하고 밤새 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 이 제조예에 따라 31 g (38%)의 표제 화합물을 316.0 (M+H)의 ES/MS (m/z)를 가진 황색 고체로서 제공하였다.

제조예 4

(3-클로로-7-히드록시퀴놀린-4-일)-(4-플루오로페닐)메탄온

삼브로민화붕소 (DCM 중 1 M, 295 mL, 295 mmol)를 DCM (217 ml) 중 (3-클로로-7-메톡시퀴놀린-4-일)-(4-플루오로페닐)메탄온 (31 g, 98 mmol)의 혼합물에 첨가하고 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 혼합물을 이염기성 인산칼륨 (물 중 2 M, 700 mL) 및 물 (200 mL)의 0℃ 용액 내로 서서히 부었다. 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하였다. 용액을 진공 중에 농축하여 유기 용매를 제거하고, 여과하고, 여액을 수집하고 여액을 진공 하에 45℃에서 밤새 건조시켰다. 고체를 DCM/헵탄 (1:1, 450 mL)으로 처리하고 밤새 교반하였다. 고체를 수집하고 진공 하에 밤새 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 이 제조예에 따라 32 g (정량적 수율)의 표제 화합물을 302.0 (M+H)의 ES/MS (m/z)를 가진 담갈색 고체로서 제공하였다.

제조예 5

(3-클로로-7-히드록시퀴놀린-4-일)-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)메탄온

2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에탄-1-올 히드로클로라이드 (3.90 g, 23.0 mmol)를 DMF (75 ml) 중 (3-클로로-7-히드록시퀴놀린-4-일)-(4-플루오로페닐)메탄온 (5.00 g, 15.3 mmol)의 교반된 용액에 이어서 수소화나트륨 (광유 중 60%, 3.07 g, 76.6 mmol)에 첨가하였다. N₂ 하에 교반하고 45분 동안 40℃로 가온하였다. 용액을 물로 켄칭하고 농축하였다. 잔류물을 20% iPrOH/CHCl₃와 포화 중탄산나트륨 수용액에 분배하고 분리하고, 상기 수용액을 2 X 20% iPrOH/CHCl₃으로 추출하고, 유기 추출물을 합하고, 합한 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 여액을 농축하여 조 생성물을 암적색 오일로서 수득하였다. 조 물질을 MeOH/DCM 중 5-10% 7 N NH₃의 구배로 용리하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 이 제조예에 따라 5.31 g (84%)의 표제 화합물을 415.0 (M+H)의 ES/MS (m/z)를 가진 황색 고체로서 제공하였다.

제조예 6

(4-플루오로페닐)-[3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시-4-퀴놀릴]메탄온

(3-클로로-7-히드록시-4-퀴놀릴)-(4-플루오로페닐)메탄온 (140 g, 440.8 mmol), 2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐보론산 (183.3 g, 881.7 mmol), 탄산칼륨 (184.6 g, 1.3 mol), 2-메틸-2-부탄올 (1.7 L) 및 물 (0.56 L)의 5 X N₂ 혼합물로 탈기/퍼지하였다. XPhos Pd G2 (7.1 g, 8.82 mmol)를 첨가하고 80℃에서 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 유기 용매를 증발시켰다. EtOAc (1 L) 및 물 (0.2 L)을 첨가하였다. 유기 층을 분리하고 이를 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 이 물질을 실리카겔을 통해 여과하고 농축 건조시켰다. 조 물질을 헥산 (1.25 L)과 MTBE (0.25 L)의 혼합물로 연화처리하여 고체를 수득하였다. 고체를 여과하고 진공 하에 건조시켰다. 고체를 THF (1.5 L)에 용해시키고 실리아메트(SiliaMet)S^® 티올의 스캐빈저 (150 g)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 스캐빈저를 여과하고 여액을 증발 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 이 제조예에 따라 185.5 g (96%)의 표제 화합물을 430.0 (M+H)의 ES/MS (m/z)를 가진 백색 고체로서 제공하였다.

실시예 1

(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐){3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시퀴놀린-4-일}메탄온

N₂ 주입구가 장착된 용기에, THF (2.8 L), 포타슘 tert-부톡시드 (274.5 g, 2.45 mol) 및 2-(3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일)에탄-1-올 (168 g, 1.22 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하였다. THF (0.7 L) 중 (4-플루오로페닐)-[3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시-4-퀴놀릴]메탄온 (350 g, 0.81 mol)의 용액을 적가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 pH 8이 될 때까지 1 N HCl로 켄칭하고 EtOAc (4 L)로 희석하였다. 유기 층을 분리하고 이를 염수 (2 L)로 세척하였다. 용액을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용액을 여과하고, 농축 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 이 제조예에 따라 415 g (93.8%)의 표제 화합물을 543.2 (M+H)의 ES/MS (m/z)를 가진 담갈색 고체로서 제공하였다.

대안적 실시예 1

혼합물 (3-클로로-7-히드록시퀴놀린-4-일)-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)메탄온 (200 mg, 0.48 mmol), 2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐보론산 (158 mg, 0.72 mmol), 탄산칼륨 (202 mg, 1.45 mmol), 2-메틸-2-부탄올 (3 ml), 및 물 (1 ml)을 마이크로파 바이알에서 N₂ x 5로 탈기/퍼지하였다. XPhos Pd G2 (12 mg, 0.015 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 밀봉하고 80℃에서 2시간 동안 마이크로파처리하였다. 잔류물을 MTBE와 포화 염화암모늄 용액에 분배하였다. 층을 분리하고 수성 층을 MTBE로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 이들을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하여 오렌지색 잔류물을 수득하였다. 조 물질을 5% MeOH/DCM으로 용리하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 이 제조예에 따라 205 mg (78%)의 표제 화합물을 543.2 (M+H)의 ES/MS (m/z)를 가진 황색 고체로서 제공하였다.

실시예 2

라세미 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올

1,4-디옥산 (100 mL) 중 (4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐){3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시퀴놀린-4-일}메탄온 (5.27 g, 9.71 mmol)의 용액을 5℃로 냉각하였다. 리튬 트리에틸보로히드리드 (THF 중 1 M, 30.0 mL, 30.0 mmol)를 첨가하였다. 냉각 조를 제거하고 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 물로 켄칭하였다. 포화 NH₄Cl 용액 및 EtOAc를 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 무수 MgSO₄상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하였다. 조 잔류물을 THF (100 mL)에 용해시켰다. 수소화나트륨 (광유 중 60%, 1.94 g, 48.5 mmol)을 첨가하였다. 용액을 1.5시간 동안 가열 환류시켰다. 추가의 수소화나트륨 (광유 중 60%, 1.94 g, 48.5 mmol)을 첨가한 다음에, 추가 30분 동안 환류시켰다. 용액을 실온으로 냉각하고 물로 켄칭하였다. EtOAc 및 포화 NH₄Cl 용액을 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 무수 MgSO₄상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하였다. DCM 중 5-7% MeOH의 구배로 용리하면서 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (3.70 g, 72%)을 담황색 발포체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 525.2 (M+H).

생물학적 검정

에스트로겐 수용체 발현과 특정 암과의 관계가 문헌에 보고되어 있다, (유방암의 경우, 예를 들어, 문헌 [Puhalla S, Bhattacharya S, Davidson N., Hormonal therapy in breast cancer: A model disease for the personalization of cancer care, Molecular Oncology, 2012, 6:222-236; Kennecke H, Yerushalmi R, Woods R, Cheang MCU, Voduc D, Speers CH, Nielsen TO, Gelmon K, Metastatic behavior of breast cancer subtypes, J Clin Oncol, 2010, 28(20):3271-3277] 참조; 난소암의 경우, 예를 들어, 문헌 [O'Donnell AJ, Macleod KG, Burns DJ, Smyth JF, Langdon SP, Estrogen receptor-alpha mediates gene expression changes and growth response in ovarian cancer cells exposed to estrogen, Endocr Relat Cancer, 2005;12(4):851-66; Walker G, MacLeod K, Williams AR, Cameron DA, Smyth JF, Langdon SP, Estrogen regulated gene expression predicts response to endocrine therapy in patients with ovarian cancer, Gynecol Oncol, 2007, 106(3):461-8; Smyth JF, Gourley C, Walker G, MacKean MJ, Stevenson A, Williams AR, et al., Antiestrogen therapy is active in selected ovarian cancer cases: The use of letrozole in estrogen receptor-positive patients, Clin Cancer Res, 2007, 13(12):3617-22] 참조; 전립선암의 경우, 예를 들어, 문헌 [Bonkohoff H, Fixemer T, Hunsicker I and Remberger K, Estrogen receptor expression in prostate cancer and premalignant prostate lesions, Am J Pathol, 1999, 155:641-647] 참조; 자궁내막 및 자궁암의 경우, 예를 들어, 문헌 [Krasner C, Aromatase inhibitors in gynecologic cancer, J Steroid Biochem Mol Biol, 2007, Aug-Sep;106(1-5):76-80; Boisen MM, Andersen CL, Sreekumar S, et al., Treating gynecologic malignancies with selective estrogen receptor downregulators (SERDs): Promise and challenges, Mol Cell Endocrinol, 2015, 418:322-3330] 참조; 폐암의 경우, 예를 들어, 문헌 [Baik CS, Eaton KD et al., Estrogen signaling in lung cancer: An opportunity for novel therapy, Cancer, 2012, 4:969-988; Marquez-Garban DC, Chen H-W, Goodglick L, Fishbein MC and Pietras RJ, Targeting aromatase and estrogen signaling in human non-small cell lung cancer. Steroid enzymes and cancer, Ann. N. Y. Acad Sci, 2009, 1155:194-205; Hamilton DH, Griner LM, Keller JM, Hu X, Southall N, Marugan J, David JM, Ferrer M and Palena C, Targeting estrogen receptor signaling with fulvestrant enhances immune and chemotherapy mediated cytotoxicity of human lung cancer, Clin Cancer Res, 2016, 22(24):6204-16; Rodriguez-Lara V, Hernandez-Martinez JM, Arrieta O, Influence of estrogen in non-small cell lung cancer and its clinical implications, J Thoracic Disease, 2018, 10(1):482-497] 참조; 위암의 경우, 예를 들어, 문헌 [Tang W, Liu R, Yan Y, Pan X, Wang M, Han X, Ren H, and Zhang Z, Expression of estrogen receptors and androgen receptor and their clinical significance in gastric cancer, Oncotarget, 2017, 8(25) 40765-777] 참조).

하기 검정은 예시된 화합물이 ERα 야생형 및 돌연변이체 단백질의 강력한 분해제임을 입증한다. 검정의 결과는 또한 예시된 화합물이 ERα 야생형 및 돌연변이체 수용체의 강력한 길항제이며 ER-매개 전사 활성을 억제함을 입증한다. 게다가, 검정은 실시예 1의 화합물이 ER-양성 유방암 이종이식 모델에서 ERα 신호전달 및 종양 성장 억제, 및 ER+ 유방암 세포주의 증식을 억제함을 입증한다.

ERα (야생형) 및 ERα (Y537S 돌연변이체) 경쟁 결합 검정

하기 ER 경쟁 결합 검정의 목적은 ERα (야생형) 및 ERα (Y537S 돌연변이체)에 대한 시험 화합물의 결합 친화도를 결정하는 것이다 (문헌 [Fanning et al., "Estrogen receptor alpha somatic mutations Y537S and D538G confer breast cancer endocrine resistance by stabilizing the activating function-2 binding conformation," eLife 2016;5:e12792] 참조).

웰당 0.025 μCi ³H-에스트라디올 (118 Ci/mmol, 1 mCi/mL), 7.2 ng/웰 ERα (야생형), 또는 7.2 ng/웰 ERα (Y537S 돌연변이체)를 사용하여, 50 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1 mg/mL 오브알부민, 및 5 mM DTT를 함유하는 완충제 중에서 경쟁 결합 검정을 시행하였다. 시험 화합물을 10,000 nM 내지 0.5 nM 범위의 10 가지 상이한 농도로 첨가하고, 1 μM의 17-β 에스트라디올의 존재 하에 비특이적 결합을 결정하였다. 결합 반응 (140 μL)을 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음에, 냉 덱스트란-목탄 완충제 (70 μL) (50 mL의 검정 완충제당, 0.75 g의 목탄 및 0.25 g의 덱스트란함유)를 각각의 반응물에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 오비탈 진탕기에서 8분 동안 혼합한 다음에 3000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 혼합물의 분취액 (120 μL)을 또 다른 96-웰, 백색 평저 플레이트 (코스타르(Costar))로 옮기고 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 옵티상 슈퍼믹스(Optiphase Supermix) 섬광 유체 (175 μL)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 오비탈 진탕기에서 격렬하게 진탕시켰다. 2.5시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 왈락 마이크로베타(Wallac Microbeta) 카운터에서 판독하였다. 4-파라미터 로지스틱 곡선 피트를 사용하여 IC₅₀을 계산하고 10 μM에서 % 억제를 계산하였다. 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 식을 사용하여 화합물의 IC₅₀ 값을 K_i로 전환시켰다. 이 검정의 결과는 실시예 1의 화합물이 3.78 ± 0.74 (n=3)의 K_i (nM)로 재조합 ERα 야생형에 결합하고 21.24 ± 2.12 (n=3)의 K_i (nM)로 ERα 돌연변이체 (Y537S)에 결합하는 것을 입증한다.

이 검정의 결과는 ERα 야생형 및 돌연변이체 (ESR1 Y537S) 단백질에 대한 예시된 화합물의 결합 친화도 및 효능을 입증한다.

MCF7 세포에서의 ERα 분해 검정

하기 ERα 분해 검정의 목적은 MCF7과 같은 ERα 양성 유방암 세포주에서의 시험 화합물에 의한 ERα의 분해를 측정하는 것이다.

10% FBS, 0.01 mg/mL 인간 인슐린 1 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 MCF7 (ATCC HTB-22로부터 구입) 세포를 배양하고 10% 목탄 스트립핑된 FBS를 함유하는 페놀 레드 미함유 DMEM 배지 (20 μL)에서 웰당 4,000개 세포의 밀도로 384-웰 평저 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 세포 배양 인큐베이터 (5% CO₂, 95% 상대 습도 및 37℃)에서 밤새 인큐베이션하고 세포가 플레이트에 부착되도록 하였다. 다음 날 세포에 시험 화합물을 투여하였다. 에코(Echo) 555 어쿠스틱 디스펜서를 사용하여 6 μM 내지 0.0003 μM 범위의 시험 화합물 연속 희석액 (1:3)을 제조하였다. 연속 희석액 플레이트로부터 5 μL를 세포 플레이트에 첨가하여 세포에 투여하여, 2 내지 0.0001 μM의 최종 시험 화합물 농도 용량 범위와 0.2%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 최대 지점의 경우, 0.2%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하고 최소 지점의 경우, 0.2% DMSO를 함유하는 성장 배지 중 2 μM 최종 농도로 희석된 풀베스트란트를 사용하였다. 시험 화합물을 투여한 후, 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 30분 동안 14% 파라-포름알데히드 (10 μL)를 첨가함으로써 세포를 고정하였다. 세포를 PBS (20 μL)로 1회 세척하고 0.5% (v/v) 트윈(TWEEN)® 20을 함유하는 PBS (20 μL)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 0.05% 트윈® 20을 함유하는 PBS로 세척하고 (2×) 실온에서 1시간 동안 0.05% 트윈® 20 및 0.1% 트리톤(TRITON)™ X-100 (20 μL/웰)을 함유하는 PBS 중 3% BSA로 차단하였다. 웰당 0.05% 트윈® 20을 함유하는 PBS 중 1% BSA에 1:500 1차 항체 (20 μL) (ERα (클론 SP1) 모노클로날 토끼 항체 #RM-9101-S, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 희석액을 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 세포를 0.05% 트윈® 20을 함유하는 PBS로 세척하고 (2×) PBS 1% BSA 중에서 2차 항체 (20 μL/웰) (1:1000 희석액, 염소 항-토끼 IgM 알렉사 플루오르(ALEXA FLUOR)™ 488)와 함께 실온에서 105분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS (2×20 μL)로 세척한 후, RNase (시그마(Sigma)) (50 μg/mL의 20 μL) 및 웰당 PBS 중 1:1000 프로피듐 아이오다이드 희석액 (20 μL)을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 벤치 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (빛으로부터 보존). 플레이트를 아큐멘 익스플로러(ACUMEN EXPLORER)™ [티티피 랩테크 리미티드(TTP LABTECH LTD)에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하여 ERα를 측정하였다. 영상 분석은 양성 세포를 식별하기 위한 세포 형광 신호를 기반으로 하였다. 평균 강도에 의해 에스트로겐 수용체 양성 세포를 식별하였다. 프로피듐 아이오다이드/DNA로부터 575-640 nm의 총 강도를 사용하여 개별 세포를 식별하였다. 검정 결과는 % 에스트로겐 수용체 양성 세포였다. 진 데이터(GENE DATA)™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC₅₀을 결정하였다.

이 검정의 결과는 화학식 (I)의 화합물이 세포에서 강력한 ERα 분해 활성을 가진 SERD임을 입증한다. 구체적으로, 결과는 MCF7 유방암 세포에서 실시예 1의 화합물에 의한 ERα의 강력한 분해를 나타낸다. 이 검정을 사용하여, 실시예 1의 화합물의 상대 IC₅₀ (μM) 값은 2.16 ± 0.96 nM (n=15)이었다.

MCF7 세포에서 PRα 유도 검정

하기 PRα 유도 검정의 목적은 시험 화합물이 ERα 수용체에 대해 효능작용 활성을 갖는지 여부를 결정하는 것이다 (효능제가 수용체를 활성화할 것으로 예상될 것이다.)

10% FBS, 0.01 mg/mL 인간 인슐린 1 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 MCF7 (ATCC HTB-22로부터 구입)를 배양하고 세포 (70% 전면생장되기 전에)를 10% (목탄 스트립핑된) FBS를 함유하는 DMEM 페놀 레드 미함유 배지의 20 μL 부피에서 웰당 4,000개 세포의 밀도로 384-웰 평저 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 세포 배양 인큐베이터 (5% CO₂, 37℃에서 95% 상대 습도)에서 밤새 인큐베이션하고 세포가 플레이트에 부착되도록 하였다. 다음 날, 세포에 시험 화합물을 투여하였다. 에코 555 어쿠스틱 디스펜서를 사용하여 6 μM 내지 0.0003 μM 범위의 화합물 연속 희석액 (1:3)을 제조하였다. 연속 희석액 플레이트로부터 시험 화합물 (5 μL)을 세포 플레이트에 첨가하여 세포에 투여하여, 2 내지 0.0001 μM의 시험 화합물 용량 범위의 최종 농도와 0.2%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 최대 지점의 경우, 0.2%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하고 최소 지점의 경우, 0.2% DMSO를 함유하는 성장 배지 중 2 μM 최종 농도로 희석된 풀베스트란트를 사용하였다. 시험 화합물을 투여한 후, 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 30분 동안 14% 파라-포름알데히드 (10 μL)를 첨가함으로써 세포를 고정하였다. 세포를 PBS (20 μL)로 1회 세척하고 0.5% (v/v) 트윈® 20을 함유하는 PBS (20 μL)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 0.05% 트윈® 20을 함유하는 PBS (20 μL)로 2회 세척하고 실온에서 1시간 동안 0.05% 트윈® 20 및 0.1% 트리톤™ X-100 (20 μL/웰)을 함유하는 PBS 중 3% BSA로 차단하였다. 웰당 0.05% 트윈® 20을 가진 1% BSA/PBS 중 1:500 1차 항체 (20 μL) (프로게스테론 수용체 모노클로날 마우스 항-인간 항체, 클론 PgR 636 다코(Dako), M3569) 희석액을 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

다음 날, 세포를 PBS 0.05% 트윈® 20 (2×20 μL)으로 세척하고 PBS 1% BSA 중에서 2차 항체 (20 μL/웰) (1:1000 희석액, 염소 항-토끼 IgM 알렉사 플루오르™ 488)와 함께 실온에서 105분 동안 인큐베이션하였다. PBS (2×20 μL)로 세척한 후, RNase (50 μg/mL의 20 μL) (시그마) 및 웰당 PBS 중 1:1000 프로피듐 아이오다이드 희석액을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 벤치 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (빛으로부터 보존). 플레이트를 아큐멘 익스플로러™ [티티피 랩테크 리미티드에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하여 프로게스테론 수용체 알파를 측정하였다. 영상 분석은 양성 세포를 식별하기 위한 세포 형광 신호를 기반으로 하였다. 평균 강도에 의해 프로게스테론 수용체 양성 세포를 식별하였다. 프로피듐 아이오다이드/DNA로부터 575-640 nm의 총 강도를 사용하여 개별 세포를 식별하였다. 검정 결과는 % 프로게스테론 수용체 양성 세포였다. 진 데이터™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC₅₀을 결정하였다.

이 검정을 사용하여, 실시예 1의 화합물의 상대 IC₅₀(μM)은 > 2 μM이었다. 이 검정의 결과는 MCF7 유방암 세포에서 실시예 1의 어떤 유의한 효능작용 활성도 입증하지 않는다. 이들 결과는 또한 실시예 1의 화합물이 MCF7 유방암 세포에서 ERα의 순수한 길항제임을 입증한다.

MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR 세포에서의 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정

하기 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정의 목적은 Y537N 돌연변이체 ERα 수용체에 대한 시험 화합물의 길항작용 활성을 결정하는 것이다. 이 검정에서의 길항제는 ERα 수용체의 기능을 차단할 것으로 예상된다. PRα (PGR)는 ERα의 하류 전사 표적이므로 ERα의 길항제는 PRα의 발현을 억제할 것으로 예상된다.

10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 MCF7-ESR1 Y537N-682 (MCF7 세포에서 ESR1 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 생성됨, 클론#682)를 배양하고 세포 (70% 전면생장되기 전에)를 DMEM 페놀 레드 미함유 배지 10% FBS (20 μL 부피) (목탄 스트립핑된)에서 웰당 4,000개 세포의 밀도로 384-웰 평저 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 세포 배양 인큐베이터 (5% CO₂, 95% 상대 습도 및 37℃)에서 밤새 인큐베이션하고 세포가 플레이트에 부착되도록 하였다. 다음 날 세포에 시험 화합물을 투여하였다. 에코 555 어쿠스틱 디스펜서를 사용하여 6 μM 내지 0.0003 μM 범위의 화합물 연속 희석액 (1:3)을 제조하였다. 연속 희석액 플레이트로부터의 5 μL를 세포 플레이트에 첨가하여 세포에 투여하여, 2 내지 0.0001 μM의 최종 시험 화합물 농도 용량 범위와 0.2%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 최대 지점의 경우, 0.2%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하고 최소 지점의 경우, 0.2% DMSO를 함유하는 성장 배지 중 2 μM 최종 농도로 희석된 풀베스트란트를 사용하였다. 시험 화합물을 투여한 후, 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 30분 동안 14% 파라-포름알데히드 (10 μL)를 첨가함으로써 세포를 고정하였다. 세포를 PBS (1×20 μL)로 세척하고 0.5% (v/v) 트윈® 20을 함유하는 PBS (20 μL)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS (2×20 μL), 0.05% 트윈® 20으로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 3% BSA/PBS 0.05% 트윈® 20, 0.1% 트리톤™ X-100 (20 μL/웰)로 차단하였다. 웰당 1% BSA/PBS 0.05 트윈® 20 중 1:500 1차 항체 (20 μL) (프로게스테론 수용체 모노클로날 마우스 항-인간 항체, 클론 PgR 636 다코, M3569) 희석액을 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

다음 날, 세포를 PBS 0.05% ® (2×20 μL)로 세척하고 PBS 1% BSA 중에서 2차 항체 (20 μL/웰) (1:1000 희석액, 염소 항-토끼 IgM 알렉사 플루오르™ 488)와 함께 실온에서 105분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS (2×20 μL)로 세척한 후, RNase (50 μg/mL의 20 μL) (시그마) 및 웰당 PBS 중 1:1000 프로피듐 아이오다이드 희석액을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 벤치 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (빛으로부터 보존). 플레이트를 아큐멘 익스플로러™ [티티피 랩테크 리미티드에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하여 프로게스테론 수용체 알파를 측정하였다. 영상 분석은 양성 세포를 식별하기 위한 세포 형광 신호를 기반으로 하였다. 평균 강도에 의해 프로게스테론 수용체 양성 세포를 식별하였다. 프로피듐 아이오다이드/DNA로부터 575-640 nm의 총 강도를 사용하여 개별 세포를 식별하였다. 검정 결과는 % 프로게스테론 수용체 양성 세포였다. 진 데이터™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC₅₀을 결정하였다.

이 검정을 사용하여, 실시예 1의 화합물의 상대 IC₅₀ (nM)은 7.602 ± 4.804 nM (n=14)이었다. 이들 결과는 MCF7 (ESR1 Y537N, 이형접합 돌연변이체) 유방암 세포에서 실시예 1에 의한 기능적 길항작용 및 PRα의 강력한 억제를 입증한다. 이와 같이, 실시예 1의 화합물은 ERα 매개 전사의 강력한 억제제 및 ERα 돌연변이체 (Y537N)의 강력한 길항제이다. PRα (PGR)는 또한 ERα의 전사 표적이며 이 검정으로부터의 결과는 PRα의 ERα-매개 전사의 강력한 억제를 입증한다.

MCF7 세포에서의 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정

하기 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정의 목적은 ERα 수용체에 대한 시험 화합물의 길항작용 활성을 결정하는 것이다. 이 검정에서의 길항제는 ERα 수용체의 기능을 차단할 것으로 예상된다. PRα는 ERα의 하류 전사 표적이므로 ERα의 길항제는 PRα의 발현을 억제할 것으로 예상된다.

시험 화합물 분배 전에, 세포 플레이트로부터 배지를 제거하고 음성 대조군 웰 (플레이트의 컬럼 24)을 제외한 모든 웰을 30분 동안 0.47 nM 에스트라디올을 함유하는 검정 배지로 전처리하는 것을 제외하고는, MCF7 세포주를 사용하여, 상기 ERα 분해 세포 기반 아큐멘 검정에서 상세히 설명된 바와 같은 검정 조건을 수행하였다. 이 검정에서, PRα의 검출을 위한 면역염색을 수행하고 플레이트를 아큐멘 익스플로러™ [티티피 랩테크 리미티드에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하여 PRα를 측정하였다. 영상 분석은 양성 세포를 식별하기 위한 세포 형광 신호를 기반으로 하였다. 평균 강도에 의해 PRα 양성 세포를 식별하였다. 프로피듐 아이오다이드/DNA로부터 575-640 nm의 총 강도를 사용하여 개별 세포를 식별하였다. 검정 결과는 % PRα 양성 세포였다. 진 데이터™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC₅₀을 결정하였다.

이 검정을 사용하여, 이 검정에서 실시예 1의 화합물의 상대 IC₅₀ (nM)은 15.75 ± 9.037 nM (n=15)이었다. 이 검정의 결과는 MCF7 유방암 세포에서 실시예 1에 의한 기능적 길항작용 및 PRα의 강력한 억제를 입증한다. 이와 같이, 실시예 1의 화합물은 ERα 매개 전사의 강력한 억제제 및 ERα 야생형 단백질의 강력한 길항제이다. PRα (PGR)는 또한 ERα의 전사 표적이며 이 검정으로부터의 결과는 PRα의 ERα-매개 전사의 강력한 억제를 입증한다.

MCF7 및 MCF7-ESR1 Y537N-682에서의 세포 증식 검정

하기 세포 증식 검정의 목적은 일반적으로 시험 화합물이 세포 배양 실험에서 처리에 반응하여 세포 증식, 세포 생존력, 및 세포독성에 영향을 미치는지 여부를 검출하는 것이다. 세포 증식은 시간이 지남에 따라 세포 수를 모니터링함으로써 모니터링하고 사용된 프로포데움 아이오다이드 검정은 시간이 지남에 따라 세포 생존력을 지속적으로 측정가능하게 하였다.

MCF7 (ATCC HTB-22로부터 구입) 세포를 DMEM 페놀 레드 미함유 배지 10% FBS (20 μL 부피) (목탄 스트립핑된)에서 웰당 2,000개 세포의 밀도로 투명 바닥 384-웰 세포 배양 플레이트로 시딩하였다. 10% FBS, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 MCF7-ESRY537N-682 (MCF7 세포에서 ESR1 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 생성됨, 클론#682)를 웰당 1000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 다음 날 세포에 시험 화합물을 투여하였다. 에코 555 어쿠스틱 디스펜서를 사용하여 60 μM 내지 0.003 μM 범위의 시험 화합물 연속 희석액 (1:3)을 제조하였다. 연속 희석액 플레이트로부터의 5 μL를 세포 플레이트에 첨가하여 세포에 투여하여, 20 내지 0.001 μM의 최종 시험 화합물 농도 용량 범위와 0.2%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 최대 지점의 경우, 0.2%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하고 최소 지점의 경우, 0.2% DMSO를 함유하는 성장 배지 중 2 μM 최종 농도로 희석된 풀베스트란트를 사용하였다. 시험 화합물을 투여한 후, 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 시험 화합물 첨가 7일 후, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고 냉 에탄올 96% (65 μL)를 각각의 웰에 첨가하였다. 30분 후, 배지를 제거하고 RNase (50 μg/mL의 20 μL) (시그마) 및 웰당 PBS 중 1:1000 프로피듐 아이오다이드 희석액을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 벤치 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (빛으로부터 보존). 플레이트를 아큐멘 익스플로러™ [티티피 랩테크 리미티드에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하였다. MCF-7 세포주는 성장하여 응집체를 형성하며, 개체 수로서의 세포 수는 판독치로서 사용가능하지 않을 수 있으며; 따라서 세포 수는 추산된 세포 수를 통해 평가될 수 있다 (면적 파라미터 (전체 세포 집단의 총 면적 (FL-1의 피크 강도 (PI)의 지정된 범위 및 단일 세포 집단의 평균 면적 (둘레에 의해 정의됨)의 비)를 통해 계산된다). 진 데이터™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC₅₀을 결정하였다.

이 검정을 사용하여, MCF7 ESR1 야생형에서 실시예 1의 화합물의 상대 IC₅₀ (nM)은 9.243 ± 1.741 nM (n=2)이고 MCF7-ESR1 Y537N 돌연변이체 세포에서는 7.960 ± 3.691 nM (n=6)이었다. 이들 결과는 MCF7 (ESR1 야생형) 및 MCF7 (ESR1 Y537N 돌연변이체) 유방암 세포에서 실시예 1에 의한 강력한 항증식 활성 및 세포 성장 억제를 입증한다.

MCF7 종양에서 생체내 표적 억제 (IVTI) 검정 (PGR RT-qPCR 검정)

이 IVTI 검정의 목적은 마우스에서 이식된 이종이식 종양에서 ERα의 하류의 PGR (프로게스테론 수용체 알파) 유전자 발현 (전사)을 억제하는 시험 화합물 (SERD)의 능력을 측정하는 것이다.

엔비고 알엠에스, 인크.(Envigo RMS, Inc.) (위스콘신주 메디슨)로부터의 암컷 NOD SCID 마우스 (22-25 g)에 1:1 HBSS + 매트리겔(MATRIGEL)™ 용액 (200 μL) 중 5×10e⁶ MCF7 ER+ve 유방암 세포 (ATCC, # HTB-22)를 우측 옆구리 영역에 피하로 이식하였다. 종양 세포 이식 1일 전에 17-β 에스트라디올 펠릿 (0.18 mg/펠릿, 90일 방출, 이노베이티브 리서치(Innovative research)로부터)을 피하로 이식하였다. 이식 후 제7일부터 시작하여 주 2회 종양 성장 및 체중을 측정하였다. 종양 크기가 250-350 mm³에 도달한 경우, 동물을 무작위화하고 5 마리의 동물 군으로 그룹화하였다. 시험 화합물을 구체적 비히클 (1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 트윈® 80/0.05% 소포제, 정제수 중) 또는 비히클 단독으로 3일 동안 경구로 투여하고 마지막 용량 후 원하는 시간 간격으로 종양과 혈액을 수집하였다. 이소플루란 마취에 더하여 경추 탈구를 사용하여 동물을 희생시켰다. 종양을 플래시 동결시키고 RNA 단리 및 RT-qPCR 검정을 위해 프로세싱 때까지 -80℃에서 보관하였다. EDTA 튜브에 혈액을 수집하고, 혈장을 위해 스핀다운하고, 96-웰 플레이트에서 -80℃에서 동결시켰다. 시험 화합물 노출을 질량 분석법을 사용하여 결정하였다.

패스트프렙(FASTPREP)-24™ 세포 파쇄기(Cell Disrupter machine) (엠피 바이오메디컬(MP Biomedical))에서 매트릭스 D 비드 (엠피 바이오메디컬, #6913-500)를 사용하여, 액체 질소 중에서 종양을 분쇄하고 1×RNA 용해 완충제 (RNA 단리 키트로부터)에서 용해시켰다. 4℃에서 20분 동안 14000 rpm으로 회전시킨 후 종양 용해물을 새로운 튜브로 옮겼다. 퓨어링크(PURELINK)® RNA 미니 키트 (인비트로겐(Invitrogen) #12183018A) 또는 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen) #74104 및 #74106)를 사용하여 종양 용해물로부터 RNA를 단리하였다. 퓨어링크® DNase 세트(Set) (인비트로겐 #12185010) 또는 RNase-미함유 DNase 세트 (퀴아젠 #79254)를 사용하여 DNA 오염물질을 제거하였다. 샘플을 RNase 미함유 물에 희석하고 플레이트 판독기 (스펙트라맥스(SpectraMax)190) 상에서 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 단리된 RNA 농도를 측정하였다. 모든 다른 RNA 샘플의 260 nm 측정치로부터 블랭크 (단지 RNase 미함유 물)의 평균 260 nm 흡광도 측정치를 감산하였다. RNase 미함유 물에서 동일한 농도로 RNA 샘플을 희석하였다. RT-PCR용 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템(First-Strand Synthesis System) (인비트로겐, #18080-051)을 사용하여 희석된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. RT-qPCR을 수행하기 위해, 먼저 RNase 미함유 물에 cDNA를 희석하였다. 2× 무수(Absolute) 블루 qPCR ROX 믹스 (써모, #AB-4139/A), PGR 프라이머 (써모, Hs01556702_m1), 및 PCR 플레이트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), #4309849)에서의 각각 반응에 대해 희석된 cDNA를 조합하였다. 써모사이클러 (ABI 프리즘(Prism) 7900HT 시퀀스 검출 시스템)에서 샘플을 50℃에서 2분 동안에 이어서 95℃에서 15분 인큐베이션함으로써 cDNA를 증폭시켰다. 95℃에서 15초 동안에 이어서 50℃에서 60초 동안 총 40 사이클 동안 인큐베이션을 계속하였다. 사이클은 하우스키핑 유전자로 정규화되고 비히클 단독과 비교하여 % PGR 억제를 계산하는 데 사용된다. 각각의 샘플을 이중으로 분석하고 평균 수치를 사용하여 계산하였다. 엑셀(Excel) 및 XL 피트(Fit)를 사용하여 퍼센트 표적 (PGR) 억제를 계산하였다.

이 검정의 결과는 실시예 1의 화합물이 종양 이종이식 모델에서 PRα (PGR) 발현을 억제함을 입증한다. 게다가, 실시예 1의 화합물은 경구 투여시 30 mg/kg 용량으로 24시간 동안 종양 이종이식 모델에서 57%까지 PRα (PGR) 발현을 억제하였다. 이들 결과는 종양 이종이식 모델에서 생체내에서 ERα 길항작용 활성 및 ERα-매개 전사 활성의 유의하고 지속된 억제를 입증한다.

마우스에서 이식된 MCF7 이종이식 종양에서의 생체내 종양 성장 억제 연구

하기 이종이식 종양 성장 억제 검정의 목적은 시험 화합물 투여에 대한 반응으로 종양 부피의 감소를 측정하는 것이다.

인간 유방암 세포 MCF7 (ATCC # HTB-22)을 배양액에서 확장시키고, 수확하고 1:1 HBSS+매트리겔™ 용액 (200 μL) 중 5×10e⁶세포를 암컷 NOD SCID 마우스 (22-25 g, 엔비고 알엠에스, 인크)의 뒤쪽 우측 옆구리로 피하 주사하였다. MCF7 세포 이식 24시간 전에, 에스트로겐 펠릿 (0.18 mg/펠릿, 17β 에스트라디올, 90일 방출, 이노베이티브 리서치)을 피하로 이식하였다. 이식 후 제7일부터 시작하여 주 2회 종양 성장 및 체중을 측정하였다. 종양 크기가 250-350 mm³에 도달한 경우, 동물을 무작위화하고 5 마리의 동물 군으로 그룹화하였다. 시험 화합물을 적절한 비히클 (1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 트윈® 80/0.05% 소포제, 정제수 중) 중에서 제조하고 42일 동안 경구 위관영양법으로 투여하였다. 치료 과정 동안에 1주 2회 수행된 종양 부피 측정에 의해 종양 반응을 결정하였다. 종양 부피를 측정할 때마다 체중을 독성의 일반적인 척도로서 취하였다.

이 검정에서 사용된 경우, 실시예 1의 화합물은 하기 표 6에 제공된 바와 같은 델타 T/C% 값을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 실시예 1의 화합물이 마우스에서 양호한 경구 생체이용률 및 MCF7 인간 유방암 이종이식 모델에서 유의한 항종양 활성 또는 종양 퇴행을 입증함을 나타낸다.

마우스에서 이식된 MCF7 이종이식 종양에서의 생체내 종양 성장 억제 연구

<표 6>

종양 부피 분석은 Log 10 및 공간적파워 공분산 구조를 기반으로 하였다.

*: 비히클 대조군과 비교하여 유의하다 (p<0.05).

델타 T/C%는 처리군에서의 종점 종양 부피가 기준선 종양 부피 이상일 때 계산하였다. 식은 100*(T-T₀)/(C-C₀)이며, 여기서 T 및 C는 각각 처리군 또는 대조군에서의 평균 종점 종양 부피이다. T₀ 및 C₀은 그러한 군에서의 평균 기준선 종양 부피이다.

퇴행%는 종점 부피가 기준선 미만일 때 계산하였다. 식은 100*(T-T₀)/T₀이며, 여기서 T₀은 처리군에 대한 평균 기준선 종양 부피이다.

제32일에 기준선 (무작위화)으로부터의 모든 군의 전체 평균을 사용하여 T/C의 % 변화를 계산하였다.

래트 경구 생체이용률 검정

하기 검정의 목적은 시험 화합물이 경구로 생체이용가능한지 여부를 입증하는 것이다.

시험 화합물을 스프라그-다우리(Sprague-Dawley) 래트에 1 mg/kg으로 IV (25 mM 인산나트륨 완충제 중 20% 캡티솔(CAPTISOL)^®, pH2 적당량; 또는 25% DMA, 15% EtOH, 10% 프로필렌 글리콜, 25% 2-피롤리돈, 및 25% 정제수의 비히클 사용) 그리고 10 mg/kg으로 PO (1% 히드록시에틸 셀룰로스, 0.25% 폴리소르베이트 80, 0.05% 소포제 1510-US, 및 정제수 적당량의 비히클 사용) 투여하였다. 연속 혈액 샘플을 IV 볼루스의 경우에는 투여 후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 12시간에 및 경구 투여 후에는 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 12시간에 수집하였다. EDTA 응고제로 처리한 후, 원심분리에 의해 혈장을 수득하고 LC-MS/MS에 의한 분석 때까지 -70℃에서 보관하였다. 혈장 중 시험 화합물 농도를 결정하고 IV 및 PO 아암 둘 다에 대한 곡선 아래 면적 (AUC)을 계산하는 데 비구획 분석이 사용되는 왓슨(Watson) LIMS™ 시스템에 업로드하였다. 하기 식을 통해 경구 생체이용률 (%F)을 계산하였다:

%F = (AUC _PO X 용량_IV)/(AUC _IV X 용량_PO) X 100.

이 검정을 사용하여, 실시예 1의 화합물은 27%의 %F 값을 나타냈다. 이 검정은 실시예 1이 양호한 경구 생체이용률을 가짐을 입증한다.

Claims

하기 화학식의 화합물

또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항에 있어서,

인 화합물.
제1항 또는 제2항의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 담체, 또는 희석제와 조합하여 포함하는, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암을 치료하기 위한 제약 조성물.
제3항에 있어서, 1종 이상의 추가 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제3항에 있어서, 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 경구 투여되는 것인 제약 조성물.
제3항에 있어서, 유방암이 에스트로겐 수용체 양성 유방암인 제약 조성물.
제3항에 있어서, 위암이 에스트로겐 수용체 양성 위암인 제약 조성물.
제3항에 있어서, 폐암이 에스트로겐 수용체 양성 폐암인 제약 조성물.
1,4-디옥산 중 (4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐){3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시퀴놀린-4-일}메탄온의 용액을 약 5℃로 냉각한 다음에 리튬 트리에틸보로히드리드를 첨가하는 것을 포함하는, 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올의 제조 방법.
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올인 화합물.
제4항에 있어서, 추가 치료제가 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올인 제약 조성물.
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