BR112018008951B1

BR112018008951B1 - Composto de aminoácido, complexo, mistura, fertilizante, e, agente regulador de crescimento de plantas

Info

Publication number: BR112018008951B1
Application number: BR112018008951-6A
Authority: BR
Inventors: Kosuke Namba; Yoshiko Murata
Original assignee: Aichi Steel Corporation; Tokushima University
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2016-11-01
Publication date: 2022-04-05
Also published as: BR112018008951A8; EP3375772A1; AU2016351998A1; EP3375772B1; PL3375772T3; BR112018008951A2; AU2016351998B2; US20180303093A1; MX2018005853A; JP6347396B2; CA3003846A1; CA3003846C; EP3375772A4; CN108349886B; JPWO2017082111A1; ES2862201T3; WO2017082111A1; CN108349886A; US10638758B2

Abstract

COMPOSTO DE AMINOÁCIDO, COMPLEXO, MISTURA,FERTILIZANTE, E, AGENTE REGULADOR DE CRESCIMENTO DE PLANTAS É provido um novo composto de aminoácido contendo heterociclo que tem uma capacidade de absorção de metal equivalente à ácidos mugineicos e pode ser produzido menos dispendiosamente do que os ácidos mugineicos. Também são providos um fertilizante e um agente regulador de crescimento de plantas compreendendo cada um o novo composto de aminoácido contendo heterociclo. A presente invenção refere-se a um composto de aminoácido contendo heterociclo representado pela fórmula geral (1): (em que: R1, R2 e R3 são os mesmos ou diferentes e representam um átomo de hidrogênio ou um grupo protetor de carboxila; R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxila; R5 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo protetor de amino; e n é um inteiro de 1 a 3) ou um sal do mesmo e uso do mesmo.

Description

[Campo técnico]

[001] A presente invenção refere-se a um novo composto de aminoácido contendo heterociclo e ao uso do mesmo.

[Técnica relacionada]

[002] Vários elementos de metal menores estão envolvidos no crescimento das plantas e na manutenção de suas funções, e as plantas não podem crescer normalmente se esses elementos de metal menores forem deficientes. Por exemplo, o ferro é um elemento necessário para respiração, fotossíntese, síntese de DNA e similares, e, especialmente, é um metal central ativo de uma enzima essencial para a biossíntese de clorofila e, portanto, a deficiência de ferro causa clorose (clorose por deficiência de ferro) que envolve o amarelecimento das folhas.

[003] Por outro lado, o solo defeituoso, que é considerado como sendo inadequado para a agricultura, ocupa cerca de 67% da terra em todo o mundo, e uma metade do mesmo é solo alcalino defeituoso. Em tal solo alcalino, o ferro está presente na forma de hidróxido férrico trivalente insolúvel em água (Fe(OH)3), e assim as plantas não podem absorver satisfatoriamente este ferro a partir de suas raízes, causando desvantajosamente deste modo deficiência de ferro.

[004] Em contraste a isto, é conhecido que as plantas gramináceas tais como a cevada, o arroz, o trigo e o milho secretam a partir das suas raízes um agente quelante referido como um ácido mugineico representado pela seguinte fórmula (A):

ou como ácido 2'-deoximugineico (DMA) representado pela seguinte fórmula (B):

e que o agente quelante permite a formação de um complexo com ferro para dissolver o ferro de modo que um complexo de ácido mugineico-ferro seja tomado nos corpos das plantas através de um transportador específico (ver documento de patente 1).

[005] Assim, as plantas gramináceas podem absorver eficientemente íons de ferro a partir do solo alcalino em comparação com as outras plantas, mas geralmente tem uma baixa capacidade de secreção de ácido mugineico. Por exemplo, muitas plantas gramináceas, tais como arroz e milho, não podem crescer em solo alcalino.

[006] Por conseguinte, os presentes inventores visam desenvolver um agente quelante com capacidade de absorção de ferro que possa ser fornecido como um fertilizante, de modo a permitir a agricultura mesmo em solos alcalinos defeituosos.

[007] Os presentes inventores estabeleceram, até agora, um método prático para sintetizar um ácido mugineico (ver documento de não patente 1) e confirmaram um efeito dramático deste ácido mugineico no crescimento de plantas gramináceas sob condições alcalinas (ver documento de não patente 2).

[008] O ácido mugineico, no entanto, é sintetizado a partir de um ácido de azetidina dispendioso como uma matéria prima de partida, e assim o fornecimento do ácido mugineico como um fertilizante ainda envolve um problema do custo para a síntese do mesmo.

[009] É requerido um composto quelato que tenha uma capacidade de absorção de metal equivalente à dos ácidos mugineicos e que possa ser produzido a um custo mais baixo do que dos ácidos mugineicos. [Documento técnico anterior] [Documento de Patente] [Documento de patente 1] JP-B 4117009 [Documento de não patente 1] Proc. Japão. Acad., Ser. B, Vol. 54, 469-473 (1978) [Documento de não patente 2] Plant. J., 2015, 81, pp. 233-246

[Sumário da Invenção] [Problemas que a invenção está para solucionar]

[0010] Um objeto da presente invenção é prover um novo composto de aminoácido contendo heterociclo que tenha uma capacidade de absorção de metal equivalente à dos ácidos mugineicos e que possa ser produzido a um custo mais baixo do que dos ácidos mugineicos.

[0011] Um outro objeto da presente invenção é prover um fertilizante ou agente regulador de crescimento de plantas contendo um tal novo composto de aminoácido contendo heterociclo. [Meios para solucionar os problemas]

[0012] Como um resultado de estudos sérios à luz dos problemas acima mencionados, os presentes inventores verificaram um novo composto de aminoácido contendo heterociclo que tem uma capacidade de absorção de metal equivalente à do ácido mugineico e pode ser produzido a um custo mais baixo do que do ácido mugineico. Através de estudos adicionais com base em tal verificação, a presente invenção foi completada.

[0013] A presente invenção provê o seguinte composto de aminoácido contendo heterociclo e o uso do mesmo.

[0014] (Seção 1) Um composto de aminoácido contendo heterociclo representado por uma fórmula geral (1):

em que R1, R2 e R3 são idênticos a ou diferentes um do outro e representam átomos de hidrogênio ou grupos protetores de carboxila; R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxila; R5 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo protetor de amino; e n representa um inteiro de 1 a 3, ou um sal do mesmo.

[0015] (Seção 2) O composto ou sal do mesmo de acordo com a seção 1, em que o composto de aminoácido contendo heterociclo representado pela fórmula geral (1) é um composto representado por uma fórmula geral (1A):

em que R1, R2, R3, R4, R5 e n são como definidos acima.

[0016] (Seção 3) O composto ou sal do mesmo de acordo com a seção 1 ou 2, em que R1, R2, R3, R4 e R5 são, cada um, um átomo de hidrogênio.

[0017] (Seção 4) O composto ou sal do mesmo de acordo com qualquer uma das seções 1 a 3, em que n é 1.

[0018] (Seção 5) Um complexo que compreende o composto ou sal do mesmo de acordo com qualquer uma das seções 1 a 4 e um metal.

[0019] (Seção 6) O complexo de acordo com a seção 5, em que o metal é ferro.

[0020] (Seção 7) Uma mistura compreendendo o composto ou sal do mesmo de acordo com qualquer uma das seções 1 a 4 e um composto de metal.

[0021] (Seção 8) A mistura de acordo com a seção 7, em que o composto de metal é um composto de ferro.

[0022] (Seção 9) A mistura de acordo com a seção 7 ou 8, que é usada para um fertilizante ou um agente regulador de crescimento de plantas.

[0023] (Seção 10) Um fertilizante compreendendo o composto ou sal do mesmo de acordo com qualquer uma das seções 1 a 4, o complexo de metal de acordo com a seção 5 ou 6, ou a mistura de acordo com qualquer uma das seções 7 a 9.

[0024] (Seção 11) Um agente regulador de crescimento de plantas compreendendo o composto ou sal do mesmo de acordo com qualquer uma das seções 1 a 4, o complexo de metal de acordo com a seção 5 ou 6, ou a mistura de acordo com qualquer uma das seções 7 a 9.

[Efeito da invenção]

[0025] O novo composto de aminoácido contendo heterociclo ou um sal do mesmo na presente invenção tem capacidade de absorção de metal equivalente à dos ácidos mugineicos e pode ser produzido a um custo mais baixo do que dos ácidos mugineicos.

[0026] O novo composto de aminoácido contendo heterociclo ou um sal do mesmo na presente invenção pode ser utilizado como um fertilizante e um agente regulador de crescimento de plantas, e exerce um grande efeito no crescimento de plantas (tais como plantas gramináceas) também em solo alcalino. [Breve descrição de desenhos]

[0027] A Fig. 1 mostra um resultado do Exemplo de Teste 1.

[0028] A Fig. 2 mostra um resultado do Exemplo de Teste 2.

[0029] A Fig. 3 é uma fotografia que mostra um estado de crescimento de arroz na terceira semana após a semeadura no Exemplo de Teste 3.

[0030] A Fig. 4 é uma fotografia que mostra o crescimento de arroz na terceira semana após a semeadura cultivada utilizando cada um dos líquidos de teste no Exemplo de Teste 3.

[0031] A Fig. 5 é um gráfico que mostra as alturas das gramas de arroz na terceira semana após a semeadura cultivada utilizando cada um dos líquidos de teste no Exemplo de Teste 3.

[0032] A Fig. 6 é um gráfico mostrando os valores de SPAD das folhas de arroz na terceira semana após a semeadura cultivada utilizando cada um dos líquidos de teste no Exemplo de Teste 3. [Formas de realização para realizar a invenção]

[0033] O composto de aminoácido contendo heterociclo representado pela fórmula geral (1) ou um sal do mesmo de acordo com a presente invenção (daqui em diante, referido como “composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção” ou “composto (1) da presente invenção”), e o uso destinado dos mesmos serão descritos em detalhe abaixo.

[0034] No relatório descritivo, a expressão “conter” ou “compreender”, como usada aqui, inclui os conceitos de “conter”, “compreender”, “consistir substancialmente em” e “consistir apenas em”.

Composto de aminoácido contendo heterociclo (1)

[0035] No relatório descritivo, o “grupo protetor de carboxila” representado por R1, R2 e R3 não está particularmente limitado, e exemplo do mesmo inclui grupos alquila C1-6 lineares, ramificados ou cíclicos, tais como grupo metila, grupo etila, grupo n-propila, grupo iso-propila, grupo n-butila, grupo iso-butila, grupo terc-butila, grupo n-hexila e grupo ciclo-hexila; grupos aralquila que podem ter um substituinte, tais como grupo benzila, grupo p-nitrobenzila, grupo o-nitrobenzila, grupo m-nitrobenzila, grupo 2,4- dinitrobenzila, grupo p-clorobenzila, grupo p-bromobenzila e grupo p- metoxibenzila; grupos alquilcarboniloxi C1-6-alquila C1-6, tais como grupo acetoximetila, grupo acetoxietila, grupo propioniloximetila, grupo n- butiriloximetila, grupo iso-butiriloximetila e grupo pivaloiloximetila; e similares.

[0036] Entre outros, o grupo protetor de carboxila é, preferencialmente, um grupo alquila C1-6, mais preferencialmente, um grupo etila ou grupo terc-butila e, particularmente preferencialmente, um grupo etila.

[0037] No relatório descritivo, “n-” significa normal; “iso-” significa iso; “terc-” ou “t-” significa terciário; “o-” significa orto; “m-” significa meta; e “p-” significa para.

[0038] No relatório descritivo, o “grupo protetor de hidroxila” representado por R4 não está particularmente limitado, e exemplo do mesmo inclui grupos alquila C1-6 lineares ou ramificados, tais como grupo metila, grupo etila, grupo n-propila, grupo iso-propila, grupo n-butila, grupo iso- butila, grupo terc-butila e grupo n-hexila; grupos aralquila que podem ter 1 a 5 substituintes, tais como grupo benzila, grupo p-nitrobenzila, grupo o- nitrobenzila, grupo m-nitrobenzila, grupo 2,4-dinitrobenzila, grupo p- clorobenzila, grupo p-bromobenzila e grupo p-metoxibenzila; grupos trialquilsilila tais como grupo trimetilsilila, grupo trietileilila e grupo terc- butildimetilsilila; grupos protetores do tipo acetal, tais como grupo tetra- hidropiran-2-ila, grupo metoximetila e grupo metoxietoximetila; grupos alcoxicarbonila tais como grupo terc-butoxicarbonila; e similares.

[0039] Entre outros, o grupo protetor de hidroxila é, preferencialmente, um grupo alquila C1-6, mais preferencialmente, um grupo etila ou grupo terc-butila e, particularmente preferencialmente, um grupo terc- butila.

[0040] No relatório descritivo, exemplos do “grupo protetor de amino” representado por R5 incluem grupos alcoxicarbonila que podem ser substituídos por halogênio, tais como grupo metoxicarbonila, grupo etoxicarbonila, grupo 2,2,2-tricloroetoxicarbonila, e grupo terc- butoxicarbonila (BOC); grupos alqueniloxicarbonila tais como grupo viniloxucarbobila; grupos aralquiloxicarbonila tais como grupo benziloxicarbonila (Cbz) e grupo 9-fluorenilmetoxicarbonila; grupos aralquila que podem ter um substituinte, tais como grupo benzila, grupo p-nitrobenzila, grupo o-nitrobenzila, grupo m-nitrobenzila, grupo 2,4-dinitrobenzila, grupo p- clorobenzila, grupo p-bromobenzila e grupo p-metoxibenzila; grupos acila tais como grupo formila, grupo acetila, grupo trifluoroacetila e grupo benzoila; grupos arilsulfonila, tais como grupo p-toluenosulfonila e grupo benzenosulfonila; grupos alquilsulfonila tais como grupo metanosulfonila; e similares.

[0041] Entre estes, o grupo protetor de amino é preferencialmente um grupo alcoxicarbonila ou um grupo aralquiloxicarbonila, e mais preferencialmente um Boc ou Cbz.

[0042] O símbolo “n” é um número inteiro de 1 a 3. Especificamente, o composto onde n é 1, 2 ou 3 é o seguinte composto (1-1), (1-2) ou (1-3).

[0043] O composto é preferencialmente um em que n é 1 ou 2, e mais preferencialmente um em que n é 1.

[0044] Os sais do composto de aminoácido contendo heterociclo representado pela fórmula geral (1) incluem quaisquer tipos de sais, desde que eles sejam agricolamente aceitáveis. Exemplos de tais sais incluem sais de ácidos inorgânicos tais como cloridrato, sulfato e nitrato; sais de ácidos orgânicos, tais como acetato e metanosulfonato; sais de metais alcalinos, tais como sal de sódio e sal de potássio; sais de metais alcalino-terrosos, tais como sal de magnésio e sal de cálcio; e sais de amônio quaternário, tais como dimetilamônio e trietilamônio; e similares.

[0045] Entre os compostos de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção, um composto preferível é um composto no qual R1, R2 e R3 são idênticos a ou diferentes um do outro, e representam átomos de hidrogênio ou grupos alquila C1-6 lineares ou ramificados; R4 é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila C1-6 linear ou ramificado; e R5 é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila C1-6 linear ou ramificado, ou um sal do mesmo.

[0046] Um composto mais preferível é um composto no qual R1, R2 e R3 são idênticos a ou diferentes um do outro, e representam átomos de hidrogênio, grupos etila ou grupos t-butila; R4 é um átomo de hidrogênio ou um grupo terc-butila; e R5 é um átomo de hidrogênio, ou um sal do mesmo.

[0047] Um composto preferível adicional é o composto no qual R1 e R2 são idênticos a ou diferentes um do outro, e representam átomos de hidrogênio ou grupos etila; R3 é um átomo de hidrogênio ou um grupo terc- butila; R4 é um átomo de hidrogênio ou um grupo terc-butila; e R5 é um átomo de hidrogênio, ou um sal do mesmo.

[0048] Um composto particularmente preferível é um composto no qual R1, R2, R3, R4 e R5 são, cada um, um átomo de hidrogênio, ou um sal do mesmo.

[0049] É notado que um composto no qual R1, R2, R3, R4 e R5 são, cada um, um átomo de hidrogênio, representado pela fórmula (1B-1):

em que n é um número inteiro de 1 a 3 também pode ser indicado por um composto representado pelo seguinte composto (1B-2):

em que n representa um número inteiro de 1 a 3.

[0050] Quando o composto (1) da presente invenção tem isômeros, tais como isômeros óticos, estereoisômeros ou isômeros de posição, ou um dos isômeros e misturas dos isômeros estão também incluídos no composto (1). Quando isômeros óticos estão presentes no composto (1) da presente invenção, os isômeros óticos divididos a partir de um corpo racêmico também estão incluídos no composto (1). Estes isômeros podem cada um ser obtidos como um único produto por método de síntese e método de separação conhecidos (tais como concentração, extração por solvente, cromatografia em coluna e recristalização).

[0051] Os isômeros óticos que são preferíveis como o composto (1) da presente invenção são compostos da fórmula geral (1A):

em que R1, R2, R3, R4, R5 e n são como definidos acima, ou sais dos mesmos.

[0052] Como os compostos representados pela fórmula geral (1A), compostos nos quais R1, R2, R3, R4 e R5 são cada um deles um átomo de hidrogênio, e n é 1 ou 2 (mais preferível 1) são preferíveis.

Complexo contendo o composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção e metal

[0053] O composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção pode formar um complexo com um metal. Um complexo contendo o composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção e um metal (daqui em diante referido como “complexo da presente invenção” em alguns casos) pode ser produzido, por exemplo, por dissolução composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção e um composto de metal que será descrito abaixo em um solvente apropriado tal como água e tampão.

[0054] O composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção é idêntico ao composto (1) descrito acima.

[0055] O metal não está particularmente limitado desde que ele seja necessário em corpos de plantas, e exemplos do mesmo incluem elementos importantes tais como magnésio (magnésia, Mg) e cálcio (Ca); e elementos menores, tais como ferro (Fe), manganês (Mn), zinco (Zn), molibdênio (Mo) e cobre (Cu). Entre estes, o metal é preferencialmente um cobre ou ferro, e mais preferencialmente um ferro. Estes metais estão usualmente presentes no estado dos íons de metal (íons de metal tais como íons de metal monovalentes, divalentes e trivalentes), mas às vezes formam um complexo no estado dos metais de valência zero. O metal pode estar contido individualmente ou em combinação de dois ou mais tipos do mesmo.

[0056] Um teor do metal não está particularmente limitado e pode apropriadamente ser selecionado dependendo da finalidade. Entre outros, o teor do metal está usualmente em uma faixa de 0,1% a 100% em mol, e preferencialmente 100% em mol relativo ao composto (1).

Mistura contendo o composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção e metal

[0057] O composto de aminoácido contendo heterociclo da presente invenção pode conduzir mistura contendo adicionalmente um composto de metal. A mistura (daqui em diante, referida como “mistura da presente invenção” em alguns casos) contendo o composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção e um metal pode ser produzida meramente misturando um composto sólido (1) da presente invenção e um composto de metal sólido.

[0058] O composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção é idêntico ao composto (1) descrito acima.

[0059] O composto de metal a ser misturado não está particularmente limitado desde que ele tenha um metal que seja necessário em corpos de plantas, e exemplo do mesmo inclui compostos de magnésio, compostos de cálcio, compostos de ferro, compostos de manganês, compostos de boro, compostos de zinco, compostos de molibdênio, compostos de cobre, e similares.

[0060] Exemplos dos compostos de magnésio incluem hidróxido de magnésio, cloreto de magnésio, e similares.

[0061] Exemplos dos compostos de cálcio incluem hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, e similares.

[0062] Exemplos dos compostos de ferro incluem sulfato de ferro, nitrato de ferro, óxido de ferro (Fe2O3), cloreto férrico (FeCl3) ou hidratos dos mesmos, e similares.

[0063] Exemplos dos compostos de manganês incluem dióxido de manganês, penta-hidratos de sulfato de manganês, tetra-hidratos de cloreto de manganês, e similares.

[0064] Exemplos dos compostos de boro incluem deca-hidratos de tetraborato de sódio, ácido bórico, e similares.

[0065] Exemplos dos compostos de zinco incluem sulfato de zinco, corpos de zinco, e similares.

[0066] Exemplos dos compostos de molibdênio incluem molibdato de sódio, molibdato de amônio, e similares.

[0067] Exemplos dos compostos de cobre incluem sulfato de cobre, cobre, e similares.

[0068] Entre estes, o composto de metal é preferencialmente compostos de cobre ou compostos de ferro, mais preferencialmente cloreto férrico, e particularmente preferencialmente um hexa-hidrato de cloreto férrico.

[0069] O composto de metal pode estar contido individualmente ou em combinação de dois ou mais tipos dos mesmos.

[0070] Um teor do composto de metal não está particularmente limitado e pode apropriadamente ser selecionado dependendo da finalidade. O teor do composto de metal está usualmente em uma faixa de 0,1% a 100% em mol, e preferencialmente 100% em mol relativo ao composto (1).

Método de produção do composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção

[0071] Um método para produzir o composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção inclui as seguintes etapas 1 a 4.

em que R10, R20 e R30 são idênticos a ou diferentes uns dos outros, e representam grupos protetores de carboxila; R40 representa um grupo protetor de hidroxila; R50 representa um grupo protetor de amino; e R5 é como definido acima.

[0072] Os grupos protetores de carboxila, o grupo protetor de hidroxila e o grupo protetor de amino indicados nesta fórmula têm os mesmos significados que os respectivos grupos protetores representados por R1, R2, R3, R4 e R5 descritos acima.

[0073] A seguir, as respectivas etapas são descritas.

(86) Etapa 1

[0074] A etapa 1 é um processo para clivar oxidativamente um grupo vinila de um composto representado pela fórmula geral (5) (daqui em diante referido como composto (5)) para formar um aldeído, e fazer reagir o aldeído com um composto representado pela fórmula geral (6) (daqui em diante referido como composto (6)) (reação de aminação redutiva), produzindo deste modo um composto representado pela fórmula geral (4) (daqui em diante referido como composto (4)).

[0075] O composto (5) é alil glicina cujo grupo amino é protegido por um grupo protetor (R50) e exemplos do mesmo incluem Boc-L-alil glicina, Cbz-L-alil glicina e um composto cujo grupo carboxila é protegido por um grupo protetor.

[0076] Um produto comercial pode ser usado como o composto (5), ou, se não houver produto comercial, podem ser produzidos Boc-L-alil glicina e Cbz-L-alil glicina a partir de L-alil glicina comercial de acordo com o método descrito em PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS (autoria de T.W. Green; P. G. M. Wuts).

[0077] Exemplos do composto (6) incluem prolina, ácido pipecólico, ácido azepina-2a-carboxílico, e similares.

[0078] A etapa 1 inclui uma etapa de clivar oxidativamente um grupo vinila do composto (5) para produzir um aldeído, e uma etapa de submeter o aldeído a uma reação de aminação redutiva com o composto (6).

[0079] As proporções dos compostos (5) e (6) a serem utilizadas são particularmente limitadas e podem apropriadamente ser selecionadas a partir de uma ampla faixa. Usualmente, o composto (6) é utilizado em uma quantidade de cerca de 1 a 5 mol e, preferencialmente, cerca de 1 a 2 mol relativo a 1 mol do composto (5).

[0080] A reação para a etapa de clivagem oxidativa é conduzida na presença de um oxidante. Exemplos do oxidante incluem ozônio (O3), permanganatos, RuCl3, OsO4-NaIO4, e similares. O oxidante é preferencialmente um ozônio.

[0081] A quantidade do oxidante a ser utilizado não está particularmente limitada.

[0082] A reação de clivagem oxidativa utilizando ozônio pode ser realizada ao soprar gás ozônio em uma solução obtida por dissolução do composto (5) em um solvente (borbulhamento).

[0083] Exemplos do solvente incluem um solvente orgânico tal como solventes à base de álcool incluindo metanol e etanol; solventes à base de cloro incluindo diclorometano e clorofórmio; e acetato de etila. O solvente é preferencialmente um metanol.

[0084] A temperatura de reação para a etapa de clivagem oxidativa não está particularmente limitada, e o borbulhamento de gás ozônio é preferencialmente conduzido a uma baixa temperatura que varia entre cerca de -100 a -50 °C.

[0085] O tempo de reação para a etapa de clivagem oxidativa não está particularmente limitado, e o borbulhamento do gás ozônio é preferencialmente conduzido até a cor da solução ficar azul desde que a solução esteja colorida de azul quando o ozônio está saturado na solução após a conclusão da clivagem oxidativa por ozônio.

[0086] O gás ozônio pode ser gerado por meio de um gerador de gás ozônio ou similar. Após o borbulhamento do gás ozônio, oxigênio, nitrogênio, gás argônio ou similar é preferencialmente borbulhado na solução até a cor azul da solução desaparecer, de modo a remover o ozônio em excesso. Assim, um aldeído é obtido.

[0087] Em seguida, a reação de aminação redutiva entre o aldeído e o composto (4) é conduzida na presença de um agente redutor. Seguindo a reação de clivagem oxidativa, a reação de aminação redutiva pode ser realizada em um vaso. Alternativamente, a reação pode ser realizada em um outro sistema de reação após a obtenção de um aldeído após a reação de clivagem oxidativa.

[0088] Exemplos do agente redutor incluem compostos de boro tais como cianoboro-hidreto de sódio e triacetoxiboro-hidreto de sódio. O agente redutor é preferencialmente um cianoboro-hidreto de sódio.

[0089] Uma quantidade do agente redutor a ser utilizado não está particularmente limitada, e pode ser apropriadamente selecionada a partir de uma ampla faixa. O agente redutor é usualmente utilizado em uma quantidade de cerca de 1 a 5 mol e preferencialmente cerca de 1 a 2 mol relativo a 1 mol do composto (5).

[0090] Um pH utilizado na reação de aminação redutiva é usualmente de cerca de 4 a 7 e, preferencialmente, de cerca de 6 a 7.

[0091] A temperatura de reação para a reação de aminação redutiva não está particularmente limitada e, geralmente, a reação pode ser conduzida sob qualquer resfriamento, temperatura ambiente e aquecimento. A reação é preferencialmente conduzida sob uma condição de temperatura de cerca de 25°C a 50°C por 30 minutos a 24 horas.

[0092] O composto (4) obtido na etapa 1 pode ser isolado e purificado a partir da mistura de reação, separando um produto de reação grosseiro através de uma operação de isolamento, tal como filtração, concentração ou extração, após resfriamento da mistura de reação, e realizando uma operação de purificação comum tal como cromatografia em coluna, resinas de troca iônica ou recristalização. O composto (4) também pode ser usado para uma próxima reação sem ser isolado ou purificado.

(87) Etapa 2

[0093] A etapa 2 é um processo para proteger os grupos carboxila do composto (4) protegendo os grupos (R10 e R20) e desprotegendo o grupo protetor (R50) do grupo amino, produzindo desse modo um composto representado pela fórmula geral (3) (a seguir, referido como “composto (3)”) ou um sal do mesmo.

[0094] A reação para proteger os grupos carboxila com grupos protetores (R10 e R20) não está particularmente limitada, e métodos conhecidos publicamente podem ser utilizados. Por exemplo, um método que inclui a reação de condensação de desidratação entre o composto (4) e um álcool é utilizado. Exemplos do álcool usado para a reação incluem metanol, etanol, terc-butanol e similares.

[0095] A reação para desproteger o grupo protetor (R50) do grupo amino não está particularmente limitada, e um método de desproteção utilizando um ácido ou base, um método de desproteção através de redução catalítica ou similares pode ser empregado de acordo com o método conhecido descrito no documento (ver, Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. Greene, John Wiley & Sons (1981)).

[0096] Exemplos do ácido incluem ácidos inorgânicos, tais como cloreto de hidrogênio (ou ácido clorídrico), brometo de hidrogênio (ou ácido bromídrico), fluoreto de hidrogênio (ou ácido fluorídrico), iodeto de hidrogênio (ou ácido iodídrico), ácido trifluoroacético, cloreto de alumínio, brometo de alumínio, tricloreto de boro, tribrometo de boro, ácido sulfúrico e ácido fosfórico; ácidos orgânicos, tais como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiônico, ácido metanosulfônico, ácido p- toluenosulfônico e ácido trifluorometanosulfônico; resinas de troca iônica ácidas; e similares.

[0097] Exemplos da base incluem bases inorgânicas tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio e hidróxido de magnésio; bases orgânicas tais como alcóxidos de metal, aminas orgânicas e sais de amônio quaternário; resinas de troca iônica básicas; e similares.

[0098] Uma quantidade do ácido ou base a ser utilizada está usualmente em uma faixa de 1 a 50 mol e, preferencialmente, de 1 a 30 mol relativo a 1 mol do composto (4).

[0099] A reação de desproteção utilizando um ácido ou base pode ser conduzida de uma maneira isenta de solvente ou em um solvente. Quando é utilizado um solvente, o solvente não está particularmente limitado desde que ele não afete adversamente a reação. Exemplos do solvente incluem um solvente à base de álcool, tal como metanol e etanol; um solvente polar aprótico tal como acetonitrila, DMF e DMSO; um solvente à base de hidrocarboneto halogenado, tal como DCM e DCE; ou uma mistura de solventes dos mesmos.

[00100] Quando R50 do composto (4) é um grupo Boc ou similar, a reação para proteger os grupos carboxila por grupos protetores e a reação para desproteger o grupo protetor (R50) do grupo amino pode ser conduzida simultaneamente fazendo reagir o composto (4) e uma solução de ácido clorídrico/etanol. A solução de ácido clorídrico/etanol pode ser preparada, por exemplo, por um método de adição de cloreto de acetila (AcCl) a uma quantidade excessiva de etanol ou um método de borbulhar gás de ácido clorídrico em etanol.

[00101] Uma proporção de etanol para cloreto de acetila não está particularmente limitada e é cerca de 20 a 50 vezes o volume relativo a 1 volume de cloreto de acetila.

[00102] Quando gás de ácido clorídrico é borbulhado em etanol, a quantidade de ácido clorídrico dissolvido t pode ser determinada comparando o peso de etanol medido preliminarmente e o peso de etanol após o borbulhamento do gás de ácido clorídrico. Após a conclusão da reação na etapa 2, a mistura de reação é concentrada sob uma pressão reduzida; então tolueno ou similar é adicionado a este; e a mistura resultante é submetida à destilação azeotrópica, tornando deste modo possível destilar o solvente. Além disso, após a destilação azeotrópica, o produto da reação pode ser aspirado por uma bomba de vácuo ou similar para ser seco.

[00103] A temperatura de reação utilizada para a etapa 2 não está particularmente limitada, e a reação pode ser conduzida sob qualquer resfriamento, temperatura ambiente e aquecimento. A reação é preferencialmente conduzida sob uma condição de temperatura de cerca de 0 a 100°C por 1 a 30 horas.

[00104] O método de desproteção através de redução catalítica pode ser aplicado ao caso onde R50 do composto (4) é um grupo a ser hidrocraqueado. Por exemplo, um método a ser conduzido através de hidrocraqueamento por um catalisador de metal de transição tal como Pd, Pt, Ru ou Rh; um método a ser realizado através de hidrocraqueamento por um catalisador tendo nele transportado um metal de transição, tal como carbono- Pd, hidróxido de paládio-carbono (catalisador de Pearlman) ou similar; e um método de redução de Birch pode ser aplicado. Entre outros, um catalisador de metal de transição preferível é o carbono-Pd.

[00105] Uma quantidade do catalisador de metal de transição a ser utilizado está usualmente em uma faixa de 0,01 a 5 mol e, preferencialmente, de 0,05 a 2 mol relativo a 1 mol do composto (4).

[00106] A reação através de redução catalítica é conduzida em uma atmosfera de hidrogênio a uma pressão de usualmente 1 a 4 atm e, preferencialmente, de 1 a 2 atm.

[00107] A reação é usualmente realizada em um solvente. O solvente não está particularmente limitado desde que ele não esteja envolvido na reação. Exemplos do solvente incluem um solvente à base de álcool, tal como metanol e etanol; um solvente à base de éter, tal como THF, MTBE, dioxano, dietil éter, dimetoxietano e diglima; um solvente à base de éster, tal como acetato de metila e acetato de etila; um solvente à base de hidrocarboneto halogenado, tal como DCM e DCE; água; ou uma mistura de solventes dos mesmos. Um solvente à base de álcool, tal como metanol e etanol, é preferencialmente usado.

[00108] A temperatura de reação para o método de desproteção através de redução catalítica não está particularmente limitada, e a reação pode ser conduzida sob qualquer resfriamento, temperatura ambiente e aquecimento. A reação é preferencialmente conduzida sob uma condição de temperatura de cerca da temperatura ambiente a 40°C por 1 a 24 horas.

[00109] O composto (3) obtido na etapa 2 pode ser isolado e purificado a partir da mistura de reação, separando um produto de reação grosseiro através de uma operação de isolamento, tal como filtração, concentração ou extração, após resfriamento da mistura de reação, e realizando uma operação de purificação comum tal como cromatografia em coluna, resinas de troca iônica ou recristalização. O composto (3) também pode ser usado para uma próxima reação sem ser isolado ou purificado.

[00110] Enquanto o composto obtido (3) tem um grupo amino livre, o grupo amino pode ser convertido em um sal de um ácido tal como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico utilizando um método conhecido.

(88) Etapa 3

[00111] A etapa 3 é um processo para causar uma reação de aminação redutiva entre o composto (3) e um composto aldeído representado pela fórmula geral (2) (daqui em diante referido como “composto de aldeído (2)”), produzindo deste modo um composto representado pela fórmula geral (1') (daqui em diante referido como “composto (1')”).

[00112] A reação na etapa 3 pode usualmente ser conduzida na presença de um agente redutor que é utilizado na reação de aminação redutiva descrita para a etapa 1 acima, em um solvente.

[00113] Uma quantidade do agente redutor a ser utilizado está usualmente em uma faixa de 0,5 a 10 mol, e, preferencialmente, de 1 a 6 mol relativo a 1 mol do composto (3).

[00114] O composto de aldeído (2) pode ser facilmente produzido de acordo com, por exemplo, o método descrito em Nishimaru, T. et al. Peptide Science 2006, 42, 263-266.

[00115] Uma quantidade do composto de aldeído (2) a ser utilizado é usualmente pelo menos 1 mol, preferencialmente cerca de 1 a 5 mol relativo a 1 mol do composto (3).

[00116] Qualquer solvente pode ser usado desde que ele não afete adversamente a reação. Exemplos do solvente incluem um solvente à base de álcool, tal como metanol, etanol, isopropanol e etilenoglicol; um solvente polar aprótico tal como acetonitrila, DMF e dimetilsulfóxido; ou uma mistura de solventes dos mesmos.

[00117] A temperatura de reação não está particularmente limitada e, geralmente, a reação pode ser conduzida sob qualquer resfriamento, temperatura ambiente e aquecimento. A reação é preferencialmente conduzida sob uma condição de temperatura de cerca de 0 a 100°C por 1 a 30 horas.

[00118] Além disso, o grupo amino secundário do composto obtido pela reação de aminação redutiva pode ser protegido por um grupo protetor de amino (R50) utilizando um método conhecido.

[00119] O composto (1') obtido na etapa 3 pode ser isolado e purificado a partir da mistura de reação, separando um produto de reação grosseiro através de uma operação de isolamento, tal como filtração, concentração ou extração, após resfriamento da mistura de reação, e realizando uma operação de purificação comum tal como cromatografia em coluna, resinas de troca iônica ou recristalização. O composto (1’) também pode ser usado para uma próxima reação sem ser isolado ou purificado.

(89) Etapa 4

[00120] A etapa 4 é um processo para desproteger os grupos protetores de carboxila (R10, R20 e R30), grupo protetor de hidroxila (R40) e, como necessário, grupo protetor de amino (R50) no composto (1'), produzindo deste modo um composto representado pela fórmula geral (1B-1) (daqui em diante, referido como “composto (1B-1)”).

[00121] Exemplos do método de desproteção na etapa 4 incluem o método de desproteção utilizando um ácido ou base e método de desproteção através de redução catalítica como descrito para a etapa 2 acima e uma combinação dos mesmos. Métodos conhecidos podem ser usados como todos esses métodos de desproteção.

[00122] Quando todos os grupos protetores R10, R20, R30, R40 e R5 são grupos protetores que podem ser desprotegidos por um ácido, um método de desproteção utilizando um ácido pode ser usado. Quando todos os grupos protetores R10, R20, R30, R40 e R5 são grupos protetores que podem ser desprotegidos por uma base, um método de desproteção utilizando uma base pode ser usado. Quando todos os grupos protetores R10, R20, R30, R40 e R5 incluem ambos os grupos protetores que podem ser desprotegidos por uma base e grupos protetores que podem ser desprotegidos por um ácido, um método de desproteção utilizando um ácido e um método de desproteção utilizando uma base podem ser realizados em combinação.

[00123] Especificamente, quando os grupos protetores R10 e R20 são grupos etila, R30 e R40 são grupos t-butila, e R5 é um átomo de hidrogênio (ver Exemplo 2), o tratamento com um ácido e o tratamento com uma base podem ser usados em combinação para desproteção. Exemplos do ácido incluem ácido trifluoroacético e exemplos da base incluem hidróxido de sódio (solução de hidróxido de sódio aquosa 1N). A ordem de tratamento com ácido e tratamento com base não está particularmente limitada, e um método compreendendo tratamento com base seguido por tratamento com ácido ou um método compreendendo tratamento com ácido seguido por tratamento com base podem ser usados.

[00124] O método de desproteção utilizando um ácido ou base pode usualmente ser conduzido em um solvente. Exemplos do solvente incluem água; um solvente à base de álcool, tal como metanol, etanol e t-butanol; um solvente à base de hidrocarboneto halogenado, tal como cloreto de metileno (DCM), clorofórmio e 1,2-dicloroetano (DCE); um solvente à base de éter, tal como tetra-hidrofurano (THF), metil-t-butil éter (MTBE), dioxano, dietil éter, dimetoxietano e diglima; acetato de etila; um solvente à base de cetona, tal como acetona e metiletilcetona; ácido acético; ou misturas dos solventes dos mesmos.

[00125] Uma quantidade do ácido ou base a ser utilizada não está particularmente limitada e está usualmente em uma faixa de 1 a 20 mol, e, preferencialmente de 1 a 10 mol relativo a 1 mol do composto (1’).

[00126] No método de desproteção utilizando um ácido ou base, quando o ácido ou base em si é um líquido, ele também pode desempenhar um papel de solvente. Portanto, o ácido ou a base podem ser adicionados em uma quantidade excessiva.

[00127] A temperatura de reação não está particularmente limitada, mas a reação pode ser usualmente conduzida sob qualquer resfriamento, temperatura ambiente e aquecimento. A reação é preferencialmente conduzida sob uma condição de temperatura de cerca da temperatura ambiente a cerca de 85°C por 30 minutos a 30 horas.

[00128] O composto (1B-1) obtido na etapa 4 pode ser isolado e purificado a partir da mistura de reação, separando um produto de reação grosseiro através de uma operação de isolamento, tal como filtração, concentração ou extração, após resfriamento da mistura de reação, e realizando uma operação de purificação comum tal como cromatografia em coluna, resinas de troca iônica ou recristalização.

[00129] O composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção é um conceito que engloba o composto (1’) acima mencionado e o composto (1B-1).

Aplicações

[00130] O composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção, o complexo da presente invenção e a mistura da presente invenção, como descritos acima, podem ser utilizados em aplicações tais como um fertilizante, e um agente regulador de crescimento de plantas.

[00131] O termo “agente regulador de crescimento de plantas” significa tanto um de um supressor de crescimento de plantas (inibidor de crescimento de plantas) ou um promotor de crescimento de plantas. No relatório descritivo, o “agente regulador de crescimento de plantas”, como usado aqui, inclui o significado de “hormônio”.

[00132] O composto de aminoácido contendo heterociclo (1) no fertilizante ou agente regulador de crescimento de plantas da presente invenção pode estar contido individualmente ou em combinação de dois ou mais tipos dos mesmos.

[00133] O fertilizante ou agente regulador de crescimento de plantas da presente invenção pode incluir fertilizantes conhecidos, agentes reguladores do crescimento de plantas conhecidos, hormônios de plantas conhecidos e similares, em adição ao composto de aminoácido contendo heterociclo (1) da presente invenção, o complexo da presente invenção ou a mistura da presente invenção como descritos acima.

[00134] O fertilizante ou agente regulador de crescimento de plantas da presente invenção é preferencialmente um sólido tal como pó a partir do ponto de vista da conveniência de distribuição, armazenagem e similares e a estabilidade de armazenagem. Durante o uso, o fertilizante ou agente regulador de crescimento de plantas é preferencialmente utilizado em uma forma adequada para um método de cultivo. Nos métodos de cultura do solo convencionais, o pó pode ser aplicado, como é, ao solo. Em métodos de cultura do solo hidropônicos, o pó pode ser dissolvido em água para ser usado em uma forma de solução aquosa.

[00135] Na presente invenção, as culturas englobam todas as plantas agrícolas e hortícolas que foram convencionalmente cultivadas, e exemplos específicos das mesmas podem incluir plantas gramináceas tais como arroz, trigo e milho; legumes; frutas; plantas floríferas; e plantas de folhagem. [Exemplos]

[00136] O composto de aminoácido contendo heterociclo da presente invenção e o método para produzir o composto serão descritos em detalhe, mostrando Exemplos e Exemplos Comparativos. A presente invenção não está limitada aos Exemplos.

[00137] As seguintes abreviaturas são utilizadas em alguns casos nos Exemplos e Exemplos Comparativos. Et: grupo etila Bu: grupo butila MeOH: metanol EtOH: etanol NaBH3CN: cianoboro-hidreto de sódio TLC: cromatografia em camada fina CHCl3: clorofórmio TFA: ácido trifluoroacético NH3: amônia Boc: grupo terc-butoxicarbonila M: concentração molar, mol/L Exemplo de Referência 1: Produção do composto (4a-1)

[00138] Uma solução de metanol de Boc-L-alil glicina (5a-1) (197 mg, 0,91 mmol) foi resfriada a -78°C, e gás ozônio (O3) foi borbulhado até a solução ficar azul. N2 foi borbulhado até a cor azul desaparecer, e depois disso L-prolina (6a-1) (116 mg, 1,0 mmol) e NaBH3CN (62,8 mmol, 1,0 mmol) foram adicionados a esta solução, e a solução foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A conclusão da reação foi confirmada por TLC, e depois disso esta solução foi concentrada sob uma pressão reduzida. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia em coluna flash (CHCI3 : MeOH = 2:1 ^ 1:1), produzindo deste modo um composto oleoso incolor (4a-1) (326,2 mg, 0,91 mmol).

[00139] Composto (4a-1): 1H RMN (400 MHz, CD3OD): d = 4,08 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 3,86 (dd, J = 9,2, 5,6 Hz, 1H), 3,73 (ddd, J = 10,8, 7,2, 4,0 Hz, 1H), 3,48-3,38 (m, 1H), 3,183,05 (m, 2H), 2,47-2,37 (m, 1H), 2,25-2,03 (m, 4H), 2,00-1,88 (m, 1H), 1,44 (s, 9H) Exemplo 1: Produção do composto (1a-1)

[00140] HCl/EtOH anidro resfriado (HCl/EtOH preparado a partir de cloreto de acetila (2 mL) e etanol (25 mL)) foi adicionado ao composto (4a-1) (326,2 mg, 0,91 mmol) e a solução foi agitada à temperatura ambiente por 21 horas. A conclusão da reação foi confirmada por TLC, e depois disso esta solução foi concentrada sob uma pressão reduzida. O resíduo obtido foi desidratado por azeotropia com tolueno, e seco in vacuo por várias horas. Um composto de aldeído (2a-1) (635 mg, 2,76 mmol) e NaBH3CN (180 mg, 2,86 mmol) foram adicionados a uma solução de metanol (15 mL) do resíduo obtido, e a solução foi agitada à temperatura ambiente por 10 horas. A conclusão da reação foi confirmada por TLC, e depois disso uma solução de hidrogenocarbonato de sódio aquosa saturada (30 mL) foi adicionada a esta solução de reação. Esta solução foi extraída com acetato de etila, e a camada orgânica recolhida foi seca com sulfato de magnésio. Depois disso, a filtração foi conduzida, e o filtrado foi concentrado sob uma pressão reduzida. O resíduo obtido foi purificado por cromatografia em coluna flash (n-hexano / acetato de etila (2:1) ^ acetato de etila), produzindo deste modo um composto oleoso incolor (1a-1) (38,6 mg, 0,079 mmol, 9%).

[00141] Composto (1a-1): 1H RMN (400 MHz, CD3OD): d = 4,17 (dq, J = 10,4, 3,2 Hz, 4H), 4,02 (dd, J = 6,8, 4,8 Hz, 1H), 3,35 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 3,20-3,11 (m, 2H), 2,83-2,76 (m, 1H), 2,72-2,65 (m, 1H), 2,60-2,47 (m, 2H), 2,37 (dd, J = 16,4, 8,4 Hz, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,93-1,74 (m, 7H), 1,47 (s, 9H), 1,27 (dt, J = 7,6, 4,4 Hz, 6H), 1,18 (s, 9H) Exemplo 2: Produção do composto (1b-1)

[00142] TFA (0,3 mL) foi adicionado a uma solução de CH2Cl2 (0,6 mL) do composto (1a-1) (38,6 mg, 0,079 mmol) e a solução foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas. A conclusão da reação foi confirmada por TLC, e depois disso esta solução foi concentrada sob uma pressão reduzida. Ao resíduo obtido, solução de hidróxido de sódio aquosa 1 M (0,42 mL) foi adicionada, e foi agitada a 0°C por 3 horas. Depois disso, a temperatura da solução de reação foi aumentada para a temperatura ambiente, e a solução foi adicionalmente agitada por 18 horas. A conclusão da reação foi confirmada por TLC, e depois disso esta solução foi concentrada sob uma pressão reduzida. O resíduo obtido foi purificado por uma resina de troca iônica (nome do produto: Dowex 50W (marca registrada) x 8, nome do fabricante: fabricada pela The Dow Chemical Company) (H2O ^ 5% NH3), produzindo deste modo um composto sólido branco (1b-1) (27,5 mg, 99%).

[00143] Composto (1b-1): 1H RMN (500 MHz, D2O): δ = 3,89 (dd, J = 8,0, 4,0 Hz, 1H), 2,97 (td, J = 8,0, 4,0 Hz, 1H), 2,90 (dt, J = 10,3, 8,0), 2,56 (td, J = 12,0, 5,7 Hz, 1H), 2,52 (td, J = 9,7, 5,7 Hz, 1H), 2,38 (td, J = 10,3, 5,7 Hz, 1H), 2,29 (td, J = 11,5, 4,6 Hz, 1H), 2,22 (q, J = 8,6 Hz, 1H), 1,99 (dtd, J = 12,0, 9,2, 2,9 Hz, 1H), 1,781,55 ppm (m, 7H) Exemplo de Teste 1: Atividade eletrofisiológica em oócitos de xenopus nos quais o transportador do complexo de ferro do ácido mugineico HvYSl foi expresso

[00144] O cDNA de HvYS1 (DNA do Banco de Dados do Japão: N ° de adesão DDBJ AB214183) foi inserido nos sítios de enzima de restrição XbaI e BamHI de um vetor pSP64Poly(A) (fabricado pela Promega) e este vetor foi utilizado para preparar cRNA por meio de um Kit mMESSAGE mMACHINE fabricado pela Ambion.

[00145] O abdômen da fêmea adulta Xenopus laevis (comprada de Hamamatsu Seibutsu Kyozai Kabushiki Kaisha) foi incisado para remover oócitos de xenopus. Os oócitos foram transferidos para um tubo de centrífuga no qual uma solução de OR-2 (82,5 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 5 mM de HEPES (pH 7,6)) contendo colagenase tipo IA (fabricado pela Sigma) em uma concentração de 2 mg/mL foi colocada, incubados à temperatura ambiente por cerca de 2 horas, depois disso lavados com a solução de OR-2 três vezes, e lavados adicionalmente com uma solução de ND-96 (96 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de HEPES (pH 7,6)) três vezes. Por meio de um microdispensador digital (Drummond SCIENTIFIC), cRNA (500 ng/μL, 50 nL) foi injetado nos oócitos de xenopus. Os oócitos foram cultivados na solução de ND-96 a 17°C por 72 horas.

[00146] Depois, um complexo de ferro (líquido de teste 1) de ácido deoximugineico (DMA) como o substrato da proteína HvYS1 e um complexo de ferro (líquido de teste 2) do composto de aminoácido contendo heterociclo (1b-1) (prolina-ácido deoximugineico, Pro-DMA) da presente invenção foram cada um preparados da seguinte maneira. DMA e Pro-DMA foram cada um dissolvidos em 10 mM de tampão MES/Tris (pH 6,0), de modo que as concentrações dos mesmos foram de 200 mM cada um, e 10 μL de uma solução aquosa de 100 mM de cloreto férrico (FeCl3-6H2O) foi misturada com as respectivas soluções. Além disso, 113,3 μL de tampão MES/Tris (pH 6,0) foram adicionados, e as soluções foram agitadas à temperatura ambiente em um compartimento escuro por 2 horas para preparar os respectivos complexos de ferro (7,5 mM). Os respectivos complexos de ferro foram submetidos a filtração centrífuga (Merk, Ultrafree-MC-GV (UFC30GVNB)) a 14.000 rpm por 15 minutos para formar substratos de reação. Os oócitos nos quais HvYS1 foi expressa foram ajustados em uma câmara preenchida com a solução de ND-96, e 10 μL dos respectivos substratos preparados (7,5 mM) foram aplicados (concentração final: 50 μM) para medir a atividade eletrofisiológica. Dois microeletrodos preenchidos com KCl 3 M (resistência interna: 0,5 a 2 MQ) foram inseridos nos oócitos, e o potencial foi fixado, em um modo no qual o potencial de um tanque experimental foi fixado em 0 mV, usando um amplificador de fixação de potencial de dois eletrodos tipo Axoclamp-2 (fabricado pela Axon). A corrente foi permitida passar através de um filtro passa-baixa de 1 kHz (-3 dB, filtro Bessel de 8 polos/amplificador cibernético, fabricado pela Axon), amostrada a 10 kHz usando a interface Degidata 1200 (fabricada pela Axon), e digitalizada e armazenada. O software ORIGIN 6.1 (Microcal Software) foi utilizado para programação e registro do potencial e análise dos dados armazenados. A medição foi feita a um potencial fixo de -60 mV. O resultado é mostrado na Fig. 1. DDW na Fig. 1 significa oócitos de controle negativo nos quais a mesma quantidade de água superpura foi injetada. O número (n) de medições é 3 para DDW e 4 para HvYS1.

[00147] O complexo de ferro do composto de aminoácido contendo heterociclo (1b-1) da presente invenção [Pro-DMA-Fe (III)] (líquido de teste 2) foi observado tendo atividade transportadora como o complexo de ferro do ácido deoximugineico [DMA-Fe(III)] (líquido de teste 1). A partir desse resultado, verificou-se que o Pro-DMA tem a capacidade de transportar íons de ferro para corpos de plantas como o DMA.

[00148] Foi reportado até agora que, quando o complexo de DMA- ferro é tomado em corpos de plantas, o arroz cresce significativamente mesmo sob condições alcalinas (Documento não-patente 2). Assim, a partir do resultado do Exemplo de Teste 1, é considerado que o complexo de metal do composto de aminoácido contendo heterociclo (1b-1) da presente invenção [Pro-DMA-Fe(III)] provê excelentes efeitos como um fertilizante ou agente regulador de crescimento de plantas devido ao fato dos íons de ferro serem tomados em corpos de plantas. Exemplo de Teste 2: Atividade de absorção do complexo de isótopo de ferro em células de inseto nas quais o transportador do complexo de ferro do ácido mugineico HvYSl foi expresso

[00149] Um sistema de expressão de células de inseto (expressão de baculovírus/Sistema Bac-to-Bac (marca registrada)) (Invitrogen Life Technologies) foi aplicado a células de inseto Sf9 (Invitrogen Life Technologies) para introduzir um gene marcado com HvYS1-HIS em um vetor pFast-Bac. Um bacmid do vetor introduzido HvYS1-HIS e um bacmid do vetor sozinho foram preparados; 2 ml de cada um dos bacmidas foram adicionados a 50 ml (2 x 106 células) cultivados em um meio obtido pela adição de soro bovino a 4% e uma solução mista de penicilina-estreptomicina (NACALAI TESQUE) a um meio isento de soro SF900 II (Invitrogen Life Technologies); e as células foram cultivadas a 28°C e 120 rpm por 3 dias. O número de células na solução de cultura de células foi contado, e a solução foi dispensada para tubos de centrífuga de 15 ml, de modo que a quantidade da mesma em cada um dos tubos fosse de 5 ml (2 x 106 células).

[00150] Depois, um complexo de isótopo de ferro (líquido de teste 3) de ácido deoximugineico (DMA) e um complexo de isótopo de ferro (líquido de teste 4) do composto de aminoácido contendo heterociclo (1b-1) (prolina- ácido deoximugineico, Pro-DMA) da presente invenção foram cada um preparados da seguinte maneira. DMA e Pro-DMA foram cada um dissolvidos em 10 mM de tampão MES/Tris (pH 6,0), de modo que as concentrações dos mesmos fossem cada uma 200 mM. Cento e oitenta (180) mM de cloreto férrico (FeCl3-6H2O) e 20,4 mM de isótopo de ferro Fe-55 (NEZ043 Lot 031114B 37,0 MBq (PerkinElmer)) (frio 1/5) foram cada um misturados em uma quantidade de 22 μL para preparar soluções de ferro cada uma tendo uma concentração total de 100 mM. Dez (10) μL de DMA/Pro- DMA (200 mM) e 10 μL de ferro (100 mM) foram misturados entre si; 113,3 μL de tampão MES/Tris (pH 6,0) foram adicionados às misturas; as soluções resultantes foram rodadas à temperatura ambiente por 2 horas em um compartimento escuro para preparar os respectivos complexos de ferro (7,5 mM). Os respectivos complexos de ferro preparados foram submetidos a filtração centrífuga (Merk, Ultrafree-MC-GV (UFC30GVNB)) a 14.000 rpm por 15 minutos para formar substratos de reação.

[00151] Cinco (5) ml da solução de cultura de células Sf9 contendo o vetor sozinho e 5 ml da solução de cultura de células Sf9 na qual HvYS1-HIS foi expressa foram centrifugadas a 1700 x g 5 min para recolher os sobrenadantes; 1 ml do meio para Sf9 foi adicionado às células precipitadas; as células foram transferidas para tubos de centrífuga de 2 mL; e 7 μL de complexos de Fe(III) 7,5 mM foram adicionados aos respectivos tubos (concentração final: 50 μM). Os tubos foram levemente balançados à temperatura ambiente por 1 hora para causar a reação, e os sobrenadantes foram recolhidos a 1700 x g 5 min. Após lavagem com 1,0 ml de PBS três vezes, o PBS foi finalmente removido suficientemente. Trezentos (300) μl de NaOH 1M e 200 μl de PBS foram adicionados aos respectivos tubos, e dissolvidos em vórtex. A um frasco de contagem (WHEATON No. 986492), 3 ml de um coquetel (ULTIMA GOLD (marca registada) PerkinElmer) foram colocados, e a quantidade total foi transferida a mesma para contagem com um contador de cintilações. O resultado é mostrado na Fig. 2.

[00152] O complexo de metal do composto de aminoácido contendo heterociclo (1b-1) da presente invenção [Pro-DMA-Fe(III)] (líquido de teste 4) foi observado tendo atividade transportadora quase semelhante a do complexo de metal do ácido deoximugineico [DMA-Fe(III)] (líquido de teste 3).

[00153] A partir deste resultado, foi verificado que o transportador do complexo de ferro do ácido mugineico 1HvYS1 transporta complexos de ferro de Pro-DMA, bem como DMA. Exemplo de Teste 3: Teste de crescimento de arroz em hidroponia

[00154] Sementes de arroz (Nipponbare) foram esterilizadas com solução de peróxido de hidrogênio a 10% por 30 minutos, então suficientemente enxaguadas com água destilada (água dessalinizada), e incubadas em água destilada à temperatura ambiente durante a noite. As sementes foram semeadas em uma placa de 96 poços com o fundo sendo cortado, e o cultivo foi iniciado em 250 ml de água destilada. A água destilada foi substituída todos os dias, e as sementes foram cultivadas em uma câmara de crescimento TOMY CFH-415 (um fotoperíodo de 16 horas de luz, 8 horas de escuridão a 28°C, uma intensidade de luz de 5.700 lux) por uma semana.

[00155] Por outro lado, a diluição foi realizada com água destilada de modo que os respectivos ingredientes indicados na Tabela 1 seguinte chegassem às concentrações finais indicadas no mesmo. O pH foi ajustado para 8,0 utilizando K2HPO4 0,5 M e KH2PO4 0,5 M, e os líquidos foram adicionados ao meio, preparando deste modo meio hidropônico de líquidos de teste 5 a 8 de modo que os líquidos servissem como soluções tampão de fosfato tendo uma concentração final de 5 mM.

[00156] Estes quatro tipos de líquidos de teste foram cada um colocados, em uma quantidade de 100 ml, em três tubos de cultivo para cultivar uma muda de arroz em cada um dos tubos por duas semanas. Os líquidos de teste foram substituídos a cada dois ou três dias. Na terceira semana após a semeadura, os estados das respectivas gramas de arroz foram fotografados (Figs. 3 e 4), e as alturas das gramas de arroz foram medidas (Fig. 5). Para as folhas de arroz na terceira semana após a semeadura cultivada utilizando os respectivos líquidos de teste, o valor de SPAD (Fig. 6) foi medido utilizando SPAD-502 Plus fabricado pela KONICA MINOLTA. O valor SPAD é um valor que indica o teor de clorofila.

[00157] Como mostrado nas Figs. 3 a 6, o líquido de teste 8 contendo o composto da presente invenção [Pro-DMA-Fe] (ProDMAFe +) proveu bom crescimento de arroz mesmo em meio alcalino tendo um pH de 8,0 ao mesmo nível que o líquido de teste 7 [DMA-Fe] (DMAFe +).

[Aplicabilidade Industrial]

[00158] O composto de aminoácido contendo heterociclo ou um sal do mesmo na presente invenção pode ser utilizado como um fertilizante e um agente regulador de crescimento de plantas. O composto exerce um grande efeito no crescimento de plantas (tais como plantas gramináceas) também em solos particularmente alcalinos.

Claims

1. Composto de aminoácido contendo heterociclo, caracterizado pelo fato de ser representado por uma fórmula (1):

em que R1, R2 e R3 são idênticos a ou diferentes um do outro, e representam átomo de hidrogênio ou um grupo alquila C1-6 linear, ramificado ou cíclico; R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila C1-6 linear ou ramificado; R5 representa um átomo de hidrogênio; e n representa um inteiro de 1 ou 2, ou um sal do mesmo.

2. Composto ou sal do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto de aminoácido contendo heterociclo representado pela fórmula (1) é um composto representado por uma fórmula (1A):

em que R1, R2, R3, R4, R5 e n são como definidos acima.

3. Composto ou sal do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que R1, R2, R3, R4 e R5 são, cada um, um átomo de hidrogênio.

4. Composto ou sal do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 são, cada um, um grupo etila R3 e R4 são, cada um, um grupo terc-butila, e R5 é um átomo de hidrogênio.

5. Composto ou sal do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que n é 1.

6. Complexo, caracterizado pelo fato de que compreende o composto ou sal do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 5 e um metal.

7. Complexo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o metal é ferro.

8. Mistura, caracterizada pelo fato de que compreende o composto ou sal do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 5 e um composto de metal.

9. Mistura de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o composto de metal é um composto de ferro.

10. Mistura de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que é usada para um fertilizante ou um agente regulador de crescimento de plantas.

11. Fertilizante, caracterizado pelo fato de que compreende o composto ou sal do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 5, o complexo de metal como definido na reivindicação 6 ou 7, ou a mistura como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 10.

12. Agente regulador de crescimento de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende o composto ou sal do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 5, o complexo de metal como definido na reivindicação 6 ou 7, ou a mistura como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 10.