BR112017000833A2 - proteína de ligação de neurotrofina, ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, kit e método de tratamento e/ou prevenção da osteoartrite e/ou de um sintoma de osteoartrite - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a um novo uso terapêutico de uma proteína de ligação a neurotrofina p75NTR e moléculas relacionadas no tratamento da osteoartrite.

Description

USO DE UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE NEUROTROFINA, USO DE UM ÁCIDO NUCLÉICO, USO DE UM VETOR DE EXPRESSÃO, USO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT, MÉTODO DE TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DA OSTEOARTRITE, PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE NEUROTROFINA CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se à um novo uso terapêutico de uma proteína ligadora de neurotrofina p75NTR e moléculas relacionadas no tratamento da osteoartrite.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Osteoartrite é um grupo de condições em que as articulações são degradadas, levando a dor, sensibilidade, rigidez e bloqueio das articulações. É a forma mais comum de artrite, afetando milhões de pessoas em todo o mundo.
[0003] A condição é geralmente aceita como o resultado de danos mecânicos à cartilagen em articulações com auto-reparação inadequada. Além de levar à inflamação, dor e inchaço, a perda de cartilagem pode levar à formação de protuberâncias óÓsseas (osteófitos), que exacerbam os sintomas e podem levar ao estreitamento e distorção da articulação. Os mecanismos precisos de danos e perda da cartilagem não são precisamente compreendidos e podem ser o resultado de uma combinação de fatores.
[0004] O tratamento da osteoartrite é limitado ao tratamento da doença, sem opções curativas disponíveis. Também não existem tratamentos relatados que interrompam a progressão desta doença degenerativa. As opções de tratamento incluem fisioterapia, administração de analgésicos e/ou de fármacos anti-inflamatórios e, em alguns casos, substituição das articulações por meio de cirurgia.
[0005] As neurotrofinas, o fator de crescimento neurotrófico (NGF), o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), a neurotrofina 3 (NT-3) e a neurotrofina 4/5 (NT-4/5) atuam através de quatro receptores: o receptor de neurotrofina p75 de baixa afinidade (P7S5SNTR), e os receptores de tirosina quinase de alta afinidade; TrkA, TrkB e TrkC. O receptor de baixa afinidade p75NTR liga-se e é ativado por todas as quatro neurotrofinas e foi descrito funcionar independentemente dos outros receptores. No entanto, os receptores Trk são mais seletivamente ativados, isto é, o NGF é o ligante seletivo para TrkA, BDNF o ligante para TrkB e NT-3, 4/5 os ligantes para TrkC. Além disso, foi reportado que, quando as proteínas p75NTR e Trk são co-expressas, formam complexos, que alteram a sinalização de ambos os receptores (Huang e Reichardt, 2003). De fato, foi sugerido que p75NTR facilita a seletividade de cada uma das neurotrofinas para o seu respectivo receptor Trk.
[0006]O p75NTR é um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR-SF) e foi o primeiro membro desta superfamília a ser caracterizado completamente. A superfamília (codificada por cerca de 30 genes em seres humanos) é definida por domínios de ligação-ligante consistindo de uma ou mais repetições (tipicamente quatro) de um domínio rico em cisteína de 40 aminoácidos (CRD) que foi identificado pela primeira vez em p75NTR (Johnson et al, 1986, Radeke et al., 1987). Em contraste, nenhum motivo de sequência é partilhado pelos domínios intracelulares de todos os membros da família TNFR-SF. Consequentemente, os mecanismos de sinalização das proteínas TNFR-SF variam significativamente.
[0007] Uma característica incomum da estrutura de p7/5NTR é a existência de um dímero p75NTR ligado por dissulfureto, formado por resíduos de cisteinil nos domínios transmembranares. Esta ligação dissulfureto é requerida para a sinalização dependente de neurotrofina efetiva por p75NTR e desempenha um papel importante na formação de um domínio intracelular e extracelular (Vilar et al., 2009b). As neurotrofinas existem fisiologicamente como dímeros associados não covalentemente (Bothwell e Shooter, 1977) com uma meia vida de distribuição de aproximadamente 5 min (Tria et al., 1994). A activação de p75NTR dependente de neurotrofina envolve a associação de um dímero de neurotrofina com CRDs 2-4 dos dois domínios extracelulares de um dímero de p75NTR (He e Garcia, 2004). Estudos recentes suportam um modelo em que a ligação a neurotrofina faz com que os dois domínios extracelulares de dímeros de p75NTR se aproximem uns dos outros, forçando os domínios intracelulares a se separarem num movimento tipo caracol centrado na ligação dissulfureto e permitindo a associação dos domínios intracelulares com as proteínas adaptadoras de sinalização, NRIF e TRAF6 (Vilar et al., 2009a, 2009b). As ligações dissulfureto no domínio intra- transmembranar, tais como as que estão presentes em p75NTR, não foram descritas previamente em outros membros da família TNFR-SF, ou em qualquer outra proteína de membrana.
[0008] A p75NTR sofre clivagem proteolítica sequencial por atividades de alfa-secretase e gama-secretase e metaloproteinases de matriz (MMPs), libertando o seu domínio intracelular (CID) no citoplasma, de uma maneira análoga à via de sinalização dependente de clivagem de Notch e proteína precursora de beta-amiloide (Jung et al., 2003, Kanning et al., 2003). A liberação citoplasmática do ICD p75NTR por esta via promove a sinalização pelo NRIF associado (Kenchappa et al., 2006). O papel do domínio extracelular de p75NTR, seguido pela clivagem proteolítica por atividades de alfa-secretase e gama- secretase e MWPs não é totalmente compreendido.
[0009] Tem sido documentado que o NGF e outras neurotrofinas (BDNF, NT-3 e NT-4/5) desempenham um papel significativo na patologia, por exemplo, dor devida a osteoartrite, pancreatite, artrite reumatóide, psoríase, prurido e esclerose múltipla (Watanabe et al., 2010; Raychaudhuri et al., 2011; Barthel et al., 2009; Truzzi et al., 2011; McDonald et al., 2011; Yamaoka et al., 2007). Foi demonstrado que anticorpos seletivos para qualquer uma das neurotrofinas; quer o NGF quer o BDNF, NT-3 e NT-4/5 reduzem significativamente a dor. Além disso, anticorpos dirigidos aos receptores de neurotrofina p75NTR Trk A, Trk B ou Trk C também foram demonstrados como sendo eficazes em modelos de dor (Orita S et al., 2010, Svensson P et al., 2010, Iwakura et al. 2010, Cirilio et al., 2010, Pezet et al., 2010, Hayashi et al., 2011, Chu et al., 2011, Ueda et al., 2010, Ghilardi et al., 2010, Fukui et al. 2010). Fukui et al., (2010) num modelo de dor (alodinia mecânica após esmagamento do nervo ciático) demonstraram eficácia significativa em pontos de extremidade relacionados com a dor após tratamento com um anticorpo anti-p75NTR. Concluiu-se, a partir deste estudo, que o tratamento com um anticorpo inibidor de p75NTR reduziu a expressão de CGRP e p'75NTR, resultando em uma redução significativa na dor.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0010] A presente invenção demonstra que o domínio extracelular de p75NTR é útil no tratamento da osteoartrite. O domínio extracelular de p75NTR demonstrou interromper e mesmo inverter a progressão da doença.
[0011] Em conformidade, é fornecido num primeiro aspecto uma proteína de ligação a neurotrofina p75NTR (p7S5NTR(NBP)) para utilização no tratamento de osteoartrite.
[0012] Em formas de realização preferidas, o tratamento da osteoartrite inclui alívio dos sintomas da osteoartrite. De preferência, o alívio dos sintomas da osteoartrite inclui, mas não está limitado a redução da dor, inflamação, inchaço, sensibilidade, rigidez articular ou aumento da mobilidade articular ou qualquer combinação destes.
[0013] Numa forma de realização particularmente preferida, o tratamento da osteoartrite inclui retardar ou deter a progressão da doença e/ou reduzir a perda de cartilagem. De preferência, o tratamento da osteoartrite inclui a reversão da progressão da doença, oO recrescimento da cartilagem e/ou tratamento curativo. De preferência, a progressão da doença é determinada pela taxa de perda ou recrescimento da cartilagem. Em outras formas preferidas, a progressão da doença pode ser monitorizada por determinação do número de condrócitos presentes numa articulação.
[0014] Em outras formas de realização preferidas, o tratamento da osteoartrite inclui o tratamento profilático.
[0015] Em certas formas de realização preferidas, o p75NTR(NBP) é um p75NTR humano (NBP).
[0016] Em outras formas de realização preferidas, o p75NTR(NBP) compreende uma Pp75NTR(NBP) ligada a uma ou mais moléculas auxiliares. De preferência, uma ou mais moléculas auxiliares são selecionadas de: (a) transferrina ou uma porção da mesma; (B) albumina ou uma porção da mesma; (C) um Fc de imunoglobulina ou uma porção da mesma; ou (d) uma cadeia polimérica de polietilenoglicol. Ainda em outras formas de realização preferidas, a p75NTR(NBP) está ligada à uma ou mais moléculas auxiliares através de um ou mais ligantes.
[0017] Numa forma de realização especialmente preferida, O P7SNTR(NBP) tem a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO 3.
[0018] Numa forma de realização particularmente preferida, o Pp7SNTR(NBP) liga-se a qualquer um de NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação (Kg) entre cerca de 5 pM a cerca de 5 nM, medida por ressonância plasmonica de superfície a ºC.
[0019] Numa forma de realização preferida, a p75NTR(NBP) é para utilização separada, sequencial ou simultânea numa combinação com um segundo composto farmacologicamente ativo. Preferencialmente, o segundo composto farmacologicamente ativo da combinação é selecionado a partir de um analgésico opióide, um fármaco anti-inflamatório não esteróide (AINE), um barbitúrico sedativo, um benzodiazepínico com ação sedativa, um antagonista Hl com ação sedativa, um sedativo tal como glutetimida , meprobamato, metaqualona ou dicloralfenazona; um relaxante do músculo esquelético; um antagonista do receptor de NMDA, um alfa-adrenérgico, um antidepressivo tricíclico, um anticonvulsivo, um antagonista de taquiquinina (NK), particularmente um antagonista de NK-3, NK-2 ou NK-l, um antagonista muscarínico, um inibidor seletivo de COX-2, um analgésico do alcatrão de carvão, em particular paracetamol; um neuroléptico, um agonista ou antagonista do receptor vaniloide; um beta-adrenérgico; um anestésico local; um corticosteroide; um agonista ou antagonista do receptor 5-HT; um antagonista do receptor 5-HT2A; um analgésico colinérgico (nicotínico); Tramadol6; um inibidor de PDEV; um canabinoide; um antagonista metabotrópico do receptor glutamato (mMGluR1) do subtipo 1; um inibidor da recaptação de serotonina; um inibidor da recaptação de noradrenalina (norepinefrina); um inibidor duplo da recaptação de serotonina e noradrenalina; um inibidor indutível de óxido nítrico sintase (iNOS); um inibidor de acetilcolinesterase; um antagonista de prostaglandina E2 subtipo 4 (EP4); um antagonista de leucotrieno B4; um inibidor de 5-lipoxigenase; um bloqueador de canais de sódio; ou um antagonista de 5-HT3, e seus sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis.
[0020] Preferencialmente, a P75NTR(NBP) é formulada para administração oral, sublingual, bucal, tópica, retal, inalatória, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intra- arterial, intramuscular, intracardíaca, intra-óssea, intra- sinovial, intradérmica, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravítrea intra-articular, peri-articular, local ou epicutânea.
[0021] Num outro aspecto da presente invenção é proporcionado um ácido nucleico que codifica um p75NTR(NBP), para utilização no tratamento de osteoartrite tal como definido acima.
[0022] Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um vetor de expressão replicável para transfectar uma célula, compreendendo um ácido nucleico que codifica um p75NTR(NBP), para utilização no tratamento de osteoartrite tal como definido acima.
[0023] Ainda noutro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma célula hospedeira que expressa um P7SNTR(NBP), para utilização no tratamento da osteoartrite tal como definida acima.
[0024] Ainda noutro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica, compreendendo a PpP75NTR(NBP), a molécula de ácido nucleico, o vetor de expressão replicável ou a célula hospedeira descrita acima, e um veículo e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0025] Outro aspecto da invenção refere-se a um kit compreendendo: a. a p75NTR(NBP), a molécula de ácido nucleico, o vetor de expressão replicável, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica descrita acima; e b. instruções para a administração de uma quantidade eficaz de p75NTR(NBP), molécula de ácido nucleico, vetor de expressão replicável ou composição farmacêutica a um indivíduo para qualquer um ou mais de prevenção ou tratamento de osteoartrite e/ou um sintoma de osteoartrite ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar ou reverter o desenvolvimento ou a progressão da osteoartrite e/ou um sintoma de osteoartrite.
[0026] Em outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método para tratar e/ou prevenir a osteoartrite e/ou um sintoma de osteoartrite num indivíduo compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da p75NTR(NBP), a molécula de ácido nucleico, o vetor de expressão repliccáel, a célula hospedeira
/ 65 ou a composição farmacêutica descrita acima, opcionalmente compreendendo ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0027] A presente invenção será ainda melhor compreendida por referência às figuras anexas, nas quais:
[0028] Figura 1: Progressão da perda da área de cartilagem após injeção de MIA ou ETF-PBS. Os pontos são a média + DP, n= 6
[0029] Figura 2: Aspecto medial do joelho de rato corado com hematoxilina e eosina de animais tratados com anticorpo controle (A, B) ou p75NTR 0,3 mg/kg (C, D), 1 mg/kg (E, E), 3 mg/Kg (G, H). A osteoartrite experimental foi induzida no joelho esquerdo (A, C, E, G) de cada animal por injeção intra- articular de MIA. O joelho direito foi injetado com ETF-PBS (controle, B, D, F, H). (Aumento de 4x) cada conjunto de imagens do joelho esquerdo e direito é retirado de um animal individual para mostrar o controle contralateral.
[0030] Figura 3: Aspecto medial do joelho de rato corado com safranina O a partir de animais tratados com anticorpo controle (A, B) ou p75NTR 3 mg/kg (C, D). A osteoartrite experimental foi induzida no joelho esquerdo (A e C) de cada animal por injeção intra-articular de MIA. O joelho direito foi injetado com ETF-PBS (controle, B e D). (Aumento de 4x) cada conjunto de imagens do joelho esquerdo e direito é tirado de um animal individual para mostrar o controle contralateral.
[0031] Figura 4: Área total da cartilagem (da superfície da cartilagem até a borda entre a cartilagem calcificada e o osso subcondral) nas articulações do joelho traseiro no dia 26. A diferença significativa em relação ao anticorpo controle é designada por * P<0,1 e ** P<0,05.
[0032] Figura 5: Área de cartilagem corada pela safranina O no comprimento de onda de absorção de 130 nm nas articulações do joelho traseiro após 26 dias de tratamento. Os dados são média + DP, n= 6. A diferença significativa comparada com o anticorpo controle é designada por ** P <0,05.
[0033] Figura 6: Sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc (SEQ ID No. 1). Os locais de clivagem de alfa e gama secretases são apresentados em negrito. A porção Fc de IgGl é apresentada em itálico.
[0034] Figura 7: Produto de tradução (SEQ ID No. 2), dos códons de início e de terminação, da sequência do ácido nucleico apresentada no quarto set da Figura 9 (SEQ ID No. 4).
[0035] Figura 8: Sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc preferida (SEQ ID No. 3). A porção Fc de IgGl é apresentada em itálico. A sequência de ligação entre as porções p75NTR(NBP) e Fc é mostrada sublinhada.
[0036]Figura 9: Sequência de ácido nucleico do produto do gene completo do local de clonagem 5' até o local de clonagem 3" (SEQ ID No. 4)
[0037] Figura 10: Variantes da proteína de fusão p75-NTR(NBP)-Fc: 1: p75 NTR - A sequência p75-NTR (SEQ ID No. 6); 2: Proteína de fusão p75-NTR-Fc disponível comercialmente (SEQ ID No. 7); 3: pPp75 Fc - A Proteína de fusão pPp75-NTR-Fc disponível comercialmente com a sequência Fc modificada para a da região constante de Lonza de IgGlza (SEQ ID No. 8); 4: p75 Fc C2228S - A proteína de fusão p75-NTR-Fc disponível comercialmente com a sequência Fc modificada a da região constante de Lonza de Igelza e uma mutação adicional de cisteína para serina na posição 222 (SEQ ID No. 9); 5: p75 Fc G4xl - Variante 1, uma proteína de fusão p75-NTR-Fc proposta com um ligante com quatro resíduos de glicina (SEQ ID No. 10); 6: p75 Fc G4Sxl - variante 2, uma proteína de fusão p75-NTR-Fc proposta com um único ligador de serina tetra-glicina (SEQ ID No. 11); 7: p75 Fc G4S5x2 - variante 3, uma proteína de fusão p75-NTR-Fc proposta com dois ligadores de serina tetra-glicina (SEQ ID No. 12); 8: Região constante de Lonza de IgGlza (SEQ ID No. 13).
[0038] Neste alinhamento um esquema de formatação é utilizado para destacar regiões de semelhança entre os receptores putativos, a proteína de fusão Fc e a região constante Fc: A fonte em caixa é utilizada para indicar regiões de sequência idêntica entre as proteínas variantes e a p75-NTR; o sublinhado simples é utilizado para indicar regiões de sequência idêntica entre todas as proteínas de fusão Fc e a Fc de Lonza da IgGlza; itálicos são utilizados para indicar as regiões de ligação na junção da p75-NTR e da região constante de Fc; O sublinhado duplo e o negrito são utilizados para indicar a posição de sequência não idêntica fora da região de
13 / 65 ligação, na posição equivalente a 222 na proteína de fusão Fc- p75-NTR parental.
[0039] Figura 11: SEQ ID NO. 14 Sequência de aminoácidos completa de p75NTR humana.
[0040] Figura 12: SEQ ID NO. 15 Domínio extracelular de p75NTR humano incluíndo sequência de sinal.
[0041] Figura 13: SEQ ID NO. 16 Domínio extracelular de p75NTR humano sem sequência de sinal.
[0042] Figura 14: SEQ ID NO. 17 Domínio de ligação 1 de neurotrofina P75NTR(NBP) humana.
[0043] Figura 15: SEQ ID NO. 18 Domínio de ligação 2 de neurotrofina P75NTR(NBP) humana.
[0044] Figura 16: SEQ ID NO. 19 Domínio de ligação 3 de neurotrofina P75NTR(NBP) humana.
[0045] Figura 17: SEQ ID NO. 20 Domínio de ligação 4 de neurotrofina P75NTR(NBP) humana.
[0046] Figura 18: SEQ ID NO. 21 Domínio de ligação 5 de neurotrofina P75NTR(NBP) humana.
[0047] Figura 19: SEQ ID NO. 22 Transferrina humana.
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[0048] Figura 20: SEQ ID NO. 23 Albumina humana.
[0049] Figura 21: SEQ ID NO. 24 Fc de IgGl humana.
[0050] Figura 22: SEQ ID NO. 25 Fc de IgG2 humana.
[0051] Figura 23: SEQ ID NO. 26 Fc de IgG3 humana.
[0052] Figura 24: SEQ ID NO. 27 Fc de IgG4 humana.
[0053] Figura 25: SEQ ID NO. 28 Fragmento Fc Humano Projetado Para Meia-Vida Sérica Estendida.
[0054] Figura 26: SEQ ID NO. 29 Fragmento Fc Humano Projetado Para ausência De Função Efetora.
[0055] Figura 27: SEQ ID NO. 30 Ligante Fc-p75NTR(NBP).
[0056] Figura 28: SEQ ID NO. 31 Ligante Fc-p75NTR(NBP).
[0057] Figura 29: SEQ ID NO. 32 Ligante Fc-p75NTR(NBP).
[0058] Figura 30: Peso corporal médio no dia 0. O peso em gramas é representado como a média + desvio padrão. Os animais do Grupo 1 foram tratados com pg5NTR-Fc a 1 mg/kg, Grupo 2 com 3 mg/kg de p75NTR-Fc, Grupo 3 com p75NTR-Fc a 0,3 mg / kg, Grupo 4 com 3 mg/kg de PG-007 e Grupo 5 com 3 mg/kg de Fc de IgG controle.
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[0059] Figura 31: Peso corporal médio de ratos durante o estudo de oito semanas descrito no Exemplo 3. O peso em gramas é representado como a média + desvio padrão. Os animais do Grupo 1 foram tratados com pg5NTR-Fc a 1 mg/kg, Grupo 2 a 3 mg/kg de p7SNTR-Fc, Grupo 3 com p75NTR-Fc a 0,3 mg/kg, Grupo 4 com 3 mg/kg de PG-007 e Grupo 5 com 3 mg/kg de Fc de IgG controle.
[0060] Figura 32: Medidas de dor espontânea determinadas com o tempo após o tratamento com os agentes de teste. Os dados são apresentados para cada animal em cada ponto temporal (desde o dia 35 até ao dia 56). Os animais do Grupo 1 foram tratados com p75NTR-Fc a 1 mg/kg, Grupo 2 com 3 mg/kg de p75NTR-Fc, Grupo 3 com p75NTR-Fc a 0,3 mg/kg, Grupo 4 com 3 mg/kg de PG- 007, Grupo 5 Com 3 mg/kg de Fc de IgG controle, Grupo 6 com ETF-PBS e Grupo 7 sem tratamento. *P <0,05 e **<0,01 para o teste t de uma amostra contra a média teórica de 0,5.
[0061] Figura 33: Medidas de dor espontânea determinadas com o tempo após tratamento com os agentes de teste. Os dados são apresentados para cada animal em cada ponto temporal (desde o dia 35 até ao dia 56). Os animais do Grupo 1 foram tratados com p75NTR-Fc a 1 mg/kg, Grupo 2 com 3 mg/kg de p75NTR-Fc, Grupo 3 com p75NTR-Fc a 0,3 mg/kg, Grupo 4 com 3 mg/kg de PG- 007, Grupo 5 com 3 mg/kg de Fc de IgG controle, Grupo 6 com ETF-PBS e Grupo 7 sem tratamento. *P <0,05 e **<0,01 para o teste t de uma amostra contra a média teórica de 0,5.
[0062] Figura 34: Aspecto Medial do joelho de rato corado com Safranin O Fast Green de animais tratados com IgG-Fc controle
16 / 65 de 3 mg/kg do dia 28 ao dia 56 após uma injeção no joelho de MIA ou ETF-PBS no dia O (Aumento de 4X). Foram tiradas imagens representativas de animais tratados com 3 mg/kg de IgG-Fc controle. Cada conjunto de imagem do joelho esquerdo e direito é tirado de um animal individual para mostrar o controle contralateral.
[0063] Figura 35: Aspecto Medial do joelho de rato corado com Safranin O Fast Green de animais tratados com 3 mg/kg de PG-007 do dia 28 ao dia 56 após uma injeção de MIA ou ETF-PBS no joelho no dia O (Aumento de 4X). Foram tiradas imagens representativas de animais tratados com 3 mg/kg de PG-007. Cada conjunto de imagem do joelho esquerdo e direito é tirado de um animal individual para mostrar o controle contralateral.
[0064] Figura 36: Aspecto Medial do joelho de rato corado com Safranin O Fast Green de animais tratados com 3 mg/kg de Pp7SNTR-Fc do dia 28 ao dia 56 após uma injeção de MIA ou ETF-PBS no dia O no joelho (Aumento de 4X). São tiradas imagens representativas de animais tratados com 3 mg/kg de p7SNTR-Fc. Cada conjunto de imagem do joelho esquerdo e direito é tirado de um animal individual para mostrar o controle contralateral.
[0065] Figura 37: Aspecto Medial do joelho de rato corado com Safranin O Fast Green de animais tratados com 1 mg/kg p75NTR- Fc a partir do dia 28 ao dia 56 após uma injecção de MIA ou ETF-PBS no dia O no joelho (Aumento de 4X). São tiradas imagens representativas de animais tratados com 1 mg/kg de
17 / 65 p7SNTR-Fc. Cada conjunto de imagem do joelho esquerdo e direito é tirado de um animal individual para mostrar o controle contralateral.
[0066] Figura 38: Aspecto Medial do joelho de rato corado com Safranin O Fast Green de animais tratados com 0,3 mg/kg de p7SNTR-Fc do dia 28 ao dia 56 após uma injecção de MIA ou ETF-PBS no dia O no joelho (Aumento de 4X). São tiradas imagens representativas de animais tratados com 0,3 mg/kg de p75NTR-Fc. Cada conjunto de imagem do joelho esquerdo e direito é tirado de um animal individual para mostrar o controle contralateral.
[0067] Figura 39: Graus de patologia da cartilagem. A administração de PG00O7 não mostrou efeitos de eficácia histologicamente significativos. A PT7SNTR-Fc mostrou marcada eficácia na condroprotecção a 0,3 e 1,0 mg/kg. O perfil de eficácia com 3,0 mg/kg foi mais variável - com 50% do grupo mostrando sobreposição com o grupo de controle.
[0068] Figura 40: Graus do osso subcondral. A administração de PGO0O07 foi associada com aumento histologicamente significativo na patologia óssea sub-condral em comparação com o grupo controle - semelhante ao perfil observado com 3,0 mg/kg de P7SNTRFc. Em contraste, a administração de P75NTR-Fc a 0,3 e 1,0 mg/kg esteve associada a uma melhora acentuada na histologia do osso subcondral.
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[0069] Figura 41: Graus da cavidade estromal. A administração de PGO00O7 não foi associada a quaisquer efeitos de eficácia histologicamente significativos. Em contraste, a administração de P7SNTR-Fc foi associada à redução da patologia osteolítica e à expansão das cavidades estromais, embora os efeitos em 0,3 e 1,0 mg/kg tenham sido os mais marcantes - ambos os grupos reduziram a patologia a níveis quase normais.
[0070] Figura 42: Graus de ósseos esponjosos. A administração de PG007 foi associada com patologia do osso esponjoso similar aos controles - com duas amostras excedendo os intervalos de controle. Em contraste, a P75NTR-Fc reduziu acentuadamente a patologia do osso esponjoso nos níveis de dose de 0,3 e 1,0 mg/kg. O P75NTF-Fc a 3,0 mg/kg apresentou um perfil mais variável, com a maioria das amostras apresentando sobreposição com o grupo controle.
[0071] Figura 43: Hipercelularidade da medula Óssea. A administração de PGO0O7 foi associada com a expansão das células mieloides na medula óssea, com quatro amostras no limite ou excedendo o intervalo de controle. P7S5NTR-Fc reduziu a celularidade da medula óssea - com redução da expansão mieloide sendo uma característica proeminente - nas doses de 0,3 e 1,0 mg/kg. A dose de 3,0 mg/kg, embora mostrando uma tendência para a inibição, mostrou sobreposição em animais de baixa resposta no grupo de controle.
[0072] Figura 44: Esclerose óssea —multifocal. Não houve diferenças histologicamente significativas entre os grupos de
19 / 65 estudo - embora as amostras de P75NTR-Fc apresentassem uma junção na extremidade superior da faixa de controle.
[0073] Figura 45: Hiperplasia de osteoblastos. A administração de P7SNTR-Fc a 0,3 e 1,0 mg/kg foi associada a uma proliferação de osteoblastos histologicamente significativa - com a formação de placas osteoblástica em paliçada sendo especialmente proeminente na zona epifisária, na zona de osso sub-condral /cartilagem. Além disso, embora não classificado, havia proeminentes células similares a fibroblastos nesta zona. PGO0O07 e P7SNTR-Fc (3,0 mg/kg) foram histologicamente semelhantes aos controles (Figura 45).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0074] Os sintomas de osteoartrite incluem inflamação, dor e inchaço. Além disso, a perda de cartilagem pode levar à formação de protuberâncias ósseas (osteófitos), que exacerbam os sintomas e podem levar ao estreitamento e distorção da articulação. As opções de tratamento são atualmente limitadas às opções de gerenciamento da doença incluindo fisioterapia, administração de analgésicos e/ou administração de anti- inflamatórios e, em alguns casos, substituição das articulações por meio de cirurgia. Até agora, não foram relatadas opções de tratamento curativo para osteoartrite. Também não existem relatos de tratamentos que interrompam a progressão desta doença degenerativa. Em conformidade, a presente invenção procura abordar a necessidade de um tratamento de osteoartrite curativa, ou pelo menos fornecer um tratamento capaz de interromper a degeneração na osteoartrite.
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[0075] Surpreendentemente, os presentes inventores descobriram que a administração de uma proteína de ligação a neurotrofina p75NTR (p7S5NTR(NBP)) num modelo animal aceitável para osteoartrite não apenas impediu a progressão da doença, mas também — resultou numa reversão significativa dos danos atribuíveis à progressão da osteoartrite.
[0076] Em conformidade, é fornecido num primeiro aspecto uma proteína de ligação a neurotrofina p75NTR (p7S5NTR(NBP)) para utilização no tratamento de osteoartrite.
[0077] Em formas de realização preferidas, o tratamento da osteoartrite inclui alívio dos sintomas da osteoartrite. De preferência, o alívio dos sintomas da osteoartrite incluem, mas não está limitado a, redução da dor, inflamação, inchaço, sensibilidade, rigidez articular ou aumento da mobilidade articular ou qualquer combinação destes.
[0078] Numa forma de realização particularmente preferida, o tratamento da osteoartrite inclui retardar ou deter a progressão da doença e/ou reduzir a perda de cartilagem. De preferência, o tratamento da osteoartrite inclui a reversão da progressão da doença, o crescimento da cartilagem e/ou tratamento curativo. De preferência, a progressão da doença é determinada pela taxa de perda ou reposição da cartilagem. A taxa de perda de cartilagem pode ser monitorizada por uma variedade de métodos, incluindo, mas não se limitando a, Ressonância Magnética (RMN) ou tomografia computadorizada de raios-X (TC de raios-X). Noutras formas preferidas, a progressão da doença pode ser monitorizada por determinação do número de condrócitos presentes numa articulação.
[0079] O termo "tratamento curativo" tal como aqui utilizado pretende abranger tratamentos que restaurem um paciente para o seu estado de pré-doença. Tais tratamentos podem requerer a administração contínua do composto ativo de modo a manter um estado de pré-doença. Alternativamente, os tratamentos curativos podem ser interrompidos uma vez atingido o estado de pré-doença.
[0080] Em outras formas preferidas, o tratamento de osteoartrite primária ou secundária. o tratamento da osteoartrite primária inclui o tratamento tanto da osteoartrite nodal generalizada primária como da osteoartrite erosiva (EOA, também chamada osteoartrite inflamatória).
[0081] O tratamento da osteoartrite também se destina a incluir a melhoria dos sintomas da doença como classificados nos sistemas de classificação WOMAC ou de Outerbridge. Em formas de realização preferidas, o tratamento da osteoartrite resulta em reversão da progressão da doença, conduzindo a uma mudança no estágio da doença (classificação WOMAC ) ou grau (classificação de Outerbridge).
[0082] Em outras formas preferidas, o tratamento da osteoartrite inclui o tratamento profilático.
[0083] Em certas formas de realização preferidas, o p75NTR(NBP) é um p75NTR(NBP) humano.
[0084] Em outras formas preferidas, a p75NTR(NBP) compreende uma P7SNTR(NBP) ligada a uma ou mais moléculas auxiliares. De preferência, uma ou mais moléculas auxiliares são selecionadas de: (a) transferrina ou uma porção da mesma; (B) albumina ou uma porção da mesma; (C) uma Fc de imunoglobulina ou uma porção da mesma; ou (d) uma cadeia polimérica de polietilenoglicol. Ainda em outras formas de realização preferidas, a p75NTR(NBP) está ligada à uma ou mais moléculas auxiliares através de um ou mais ligantes. De preferência, o ligante é selecionado a partir de: (a) uma ligação covalente; (b) uma ligação não covalente; (c) uma ligação peptídica; Ou (d) um aminoácido ou uma pluralidade de aminoácidos compreendendo um peptídeo. Em uma forma particularmente preferida, a p75NTR(NBP) compreende uma p75NTR(NBP) ligada a um Fc de imunoglobulina ou uma porção da mesma, opcionalmente através de um ligante.
[0085] Onde a p75NTR(NBP) está ligada a mais de uma molécula auxiliar, opcionalmente cada molécula auxiliar é igual ou diferente ou uma mistura da mesma e a diferente. De modo semelhante, quando a p75NTR(NBP) está ligada a mais de uma molécula auxiliar através de um ou mais ligantes, opcionalmente cada ligante é o mesmo ou diferente ou uma mistura do mesmo e do diferente
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[0086] Em uma forma especialmente preferida, a p75NTR(NBP) tem a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO 3.
[0087] Em uma forma particularmente preferida, a p75NTR(NBP) liga-se a qualquer um de NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação (Kg) entre cerca de 5 pM até cerca de 5 nM medida por ressonância plasmônica de superfície a 20 ºC.
[0088] Em uma forma de realização preferida, a p75NTR(NBP) é para utilização separada, sequencial ou simultânea numa combinação com um segundo composto farmacologicamente ativo. Preferencialmente, o segundo composto farmacologicamente ativo da combinação é selecionado a partir de um analgésico opioide, um fármaco anti-inflamatório não esteróide (AINE), um sedativo barbitúrico, um benzodiazepínico com ação sedativa, um antagonista H1 com ação sedativa, um sedativo como glutetimida , meprobamato, metaqualona ou dicloralfenazona; um relaxante do músculo esquelético; um antagonista de receptor de NMDA, um alfa-adrenérgico, um antidepressivo tricíclico, um anticonvulsivante, um antagonista de taquicinina (NK), particularmente um antagonista de NK-3, NK-2 ou NK-l, um antagonista muscarínico, um inibidor seletivo de COX-2, um analgésico do alcatrão de carvão, em particular paracetamol; um neuroléptico, um agonista ou antagonista do receptor vaniloide; um beta-adrenérgico; um anestésico local; um corticosteroide; um agonista ou antagonista do receptor 5-HT; um antagonista do receptor 5-HT2A; um analgésico colinérgico (nicotínico); Tramadol6; um inibidor de PDEV; um canabinoide; antagonista metabotrópico do receptor de glutamato subtipo 1
24 / 65 (MGluR1); um inibidor da recaptação de serotonina; um inibidor da recaptação de noradrenalina (norepinefrina); um inibidor duplo da recaptação de serotonina-noradrenalina; um inibidor indutível de óxido nítrico sintase (iNOS); um inibidor de acetilcolinesterase; um antagonista de prostaglandina E2 subtipo 4 (EP4); um antagonista de leucotrieno B4; um inibidor de 5-lipoxigenase; um bloqueador de canais de sódio; ou um antagonista 5-HT3, e seus sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis.
[0089] Os analgésicos opióides preferidos incluem, mas não estão limitados a, morfina, heroína, hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanil, cocaína, codeína, dihidrocodeína, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina , butorfanol, nalbufina ou pentazocina.
[0090] Os fármacos anti-inflamatórios não esteróides preferidos (AINEs) incluem, mas não estão limitados a, aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, nimesulida, nitroflurbiprofeno, olsalazina, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulfasalazina, sulindaco, tolmetina ou zomepirac.
[0091] Os barbitúricos sedativos preferidos incluem, mas não estão limitados a, amobarbital, aprobarbital, butabarbital,
/ 65 butabital, mefobarbital, metarbital, metoexital, pentobarbital, fenobarbital, secobarbital, talbutal, temilal ou tiopental.
[0092] Os benzodiazepínicos preferidos com ação sedativa incluem, mas não estão limitados a, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam ou triazolam.
[0093] Os antagonistas Hl preferidos com ação sedativa incluem, mas não estão limitados a, difenidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina ou clorciclizina.
[0094] Os sedativos preferidos incluem, mas não estão limitados a glutetimida, meprobamato, metaqualona ou dicloralfenazona.
[0095] Os relaxantes de músculo esquelético preferidos incluem, mas não estão limitados a, baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol ou orfrenadina.
[0096] Os antagonistas dos receptores NMDA preferidos incluem, mas não estão limitados a, dextrometorfano ((+)-3-hidroxi-N- metilmorfinano) ou o seu metabolito dextrorfano ( (+) -3-hidroxi-N-metilmorfinano), cetamina, memantina, pirroloquinolina quinina, ácido cis-4- (fosfonometil)-2- piperidinacarboxílico, budipina, EN-3231 (MorphiDexO, uma formulação combinada de morfina e dextrometorfano), topiramato, neramexano ou perzinfotel incluindo um antagonista de NR2B, por exemplo, ifenprodil, traxoprodil ou (-)-(R)-6-(2-[4-(3-
26 / 65 fluorofenil)-4 hidroxi-l-piperidinil]-l-hidroxietil-3,4- dihidro-2(1H) quinolinona.
[0097] Os alfa-adrenérgicos preferidos incluem, mas não estão limitados a, doxazosina, tamsulosina, clonidina, guanfacina, dexmetatomidina, modafinil ou 4-amino-6,7- dimetoxi-2-(5-metano-sulfonamida-1,2,3,4-tetrahidroisoquinol- 2-il)-5-(2 piridil) quinazolina.
[0098] Os antidepressivos tricíclicos preferidos incluem, mas não estão limitados a, desipramina, imipramina, amitriptilina ou nortriptilina.
[0099] Os anticonvulsivos preferidos incluem, mas não estão limitados a, carbamazepina, lamotrigina, topiramato ou valproato.
[0100] Os antagonistas de taquicinina (NK) preferidos incluem, mas não estão limitados a, (alfaR, 9R) -7-[3,5- bis(trifluorometil) benzil]-8,9,10,l11-tetrahidro-9-metil-5-(4- metilfenil)-7H-[1,4] diazocino[2,1-g9] [1,7] -naftiridina-6-13- diona (TAK-637), 5-[[(2R,38S)-2-[(1R)-1-[3,5- bis(trifluorometil)fenil]etoxi-3-(4-fluorofenil)-4- morfolinil]-metil]-1,2-dihidro-3H-1,2,4 triazol-3-ona (MK-869), aprepitanto, lanepitanto, dapitanto ou 3-[[2-metoxi-5- (trifluorometoxi)fenil]-metilamino]-2 fenilpiperidina (2S,3S).
[0101] Os antagonistas muscarínicos preferidos incluem, mas não estão limitados a, oxibutinina, tolterodina, propiverina,
cloreto de tropsio, darifenacina, solifenacina, temiverina e ipratrópio.
[0102] Os inibidores seletivos de COX-2 preferidos incluem, mas não estão limitados a, celecoxib, rofecoxib, parecoxib, valdecoxib, deracoxib, etoricoxib ou lumiracoxib.
[0103] Os analgésicos do alcatrão de carvão preferidos incluem, mas não estão limitados a, paracetamol.
[0104] Os neurolépticos preferidos incluemy mas não estão limitados a, droperidol, clorpromazina, haloperidol, perfenazina, tioridazina, mesoridazina, trifluoperazina, flufenazina, clozapina, olanzapina, risperidona, ziprasidona, quetiapina, sertindol, aripiprazol, sonepiprazol, blonanserina, iloperidona, perospirona, racloprida, zotepina, bifeprunox, asenapina, lurasidona, amisulprida, balaperidona, palindor, eplivanserina, osanetant, rimonabant, meclinertant, MiraxionGO ou sarizotano.
[0105] Os agonistas dos receptores vaniloides preferidos incluemy mas não estão limitados a, resinferatoxina. Os antagonistas preferidos dos receptores vaniloides incluem, mas não estão limitados a capsazepina.
[0106] Os beta-adrenérgicos preferidos incluem, mas não estão limitados a, propranolol. Os anestésicos locais preferidos incluem, mas não estão limitados a mexiletina. os
28 / 65 corticosteroides preferidos incluem, mas não estão limitados a dexametasona.
[0107] Os agonistas ou antagonistas dos receptores 5-HT preferidos, particularmente os agonistas 5-HTIB/1D incluem, mas não estão limitados a, eletriptano, sumatriptano, naratriptano, zolmitriptano ou rizatriptano; os antagonistas de receptores 5-HT2A preferidos incluem, mas não estão limitados a, R(+)-alfa-(2,3-dimetoxifenil)-1-[2-(4 fluorofeniletil)]-4-piperidinametanol (MDL-100907).
[0108] Os analgésicos colinérgicos (nicotínicos) preferidos incluem, mas não estão limitados a, ispronicline (TC-1734), (E)-N-metil 4-(3-piridinil)-3-buten-l-amina (RJIR-2403) (R)-5- (2-azetidinilmetoxi)-2-cloropiridina (ABT-594) ou nicotina.
[0109] Os inibidores de PDEV preferidos incluem, mas não estão limitados a, 5-[2-etoxi-5- (4-metil-l-piperazinil-sulfonil) fenil]-l-metil-3-n-propil-1l,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d] pirimidin-7-ona (sildenafil), (6R, 12aR)-2,3,6,7,12,12a-hexa- hidro-2-metil- 6- (3, 4-metilenodioxifenil)-pirazino[2',1':6,1] -pirido[3,4-b] indol-1,4-diona (IC-351 ou tadalafil), 2-[2-etoxi-5-(4-etil-piperazin-l1-il-l-sulfonil)-fenil]-5- metil-7 propil-3H-imidazo[5,1-f] [1,2,4]triazin-4-ona (vardenafil), 5- (5-acetil-2-butoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1- etil-3-azetidinil) —2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidina- T-ona, 5-(5-acetil-2-propoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1- isopropil-3-azetidinil) 2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3- d]pirimidin-7-ona, 5-[2-etoxi-5- (4-etilpiperazin-l1-il-
29 / 65 sulfonil)piridin-3-il]-3-etil-2-[2-metoxietil]-2,6-dihidro-7H- pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona, 4- [(3-cloro-4- metoxibenzil)amino]-2-[(2S)-2-(hidroximetil) pirrolidin-l1-il]- N-(pirimidin-2-il-metil)pirimidina-5 carboxamida, 3-(1-metil- 7T-oxo-3-propil-6,7-dihidro-l1H- pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)- N- [2- (1-metilpirrolidin-2-il) etil])-4- propoxibenzenossulfonamida.
[0110] Os canabinoides preferidos incluemy mas não estão limitados a, tetrahidrocanabinol, canabinol, canabidiol, canabigerol, tetrahidrocanabivarina, canabidivarina e canabicromeno.
[0111] Os inibidores da recaptação de serotonina preferidos incluem, mas não estão limitados a, sertralina, o metabólito de sertralina desmetilsertralina, fluoxetina, norfluoxetina (o metabólito de fluoxetina desmetil), fluvoxamina, paroxetina, citalopramy o metabólito de citalopram desmetilcitalopram, escitalopram, d, l-fenfluramina, femoxetina, ifoxetina, cianodotiepina, litoxetina, dapoxetina, nefazodona, cericlamina e trazodona.
[0112] Os inibidores da recaptação de noradrenalina (norepinefrina) preferidos incluem, mas não estão limitados a, maprotilina, lofepramina, mirtazepina, oxaprotilina, fezolamina, tomoxetina, mianserina, bupropiona, o metabólito de bupropiona hidroxibupropriona, nomifensina e viloxazina (VivalanO), especialmente um inibidor seletivo de recaptação
/ 65 de noradrenalina tal como reboxetina, em particular (S,S)- reboxetina.
[0113] Os inibidores duplos da recaptação de serotonina- noradrenalina preferidos incluem, mas não estão limitados a, venlafaxina, o metabólito de venlafaxina O-desmetilvenlafaxina, clomipramina, o metabólito de clomipramina desmetilclomipramina, duloxetina, milnaciprano e imipramina.
[0114] Os inibidores de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) preferidos incluem, mas não estão limitados a, S-[2-[ (1-iminoetil)amino]etil]-L-homocisteína, Ss-[2-[(1- iminoetil) amino]letil]-4,4-dioxo-L-cisteína, s-[2-[(1- iminoetil)amino]etil]-2-metil-L-cisteína, ácido (28,52) -2- amino-2-metil-7-[(1-iminoetil)amino]-5-heptenoico, 2-[[(1R,3S) —3-amino-4-hidroxi-l-(5-tiazolil)-butil]tio]-5-cloro-3- piridinacarbonitrila; 2-[[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5- tiazolil)butil]tio] -4-clorobenzonitrila, (28, 4R) -2-amino-4- [[2-cloro-5- (trifluorometil)fenil]tio]-5-tiazolebutanol, 2- [[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-l-(5-tiazolil)butil]tio]-6- (trifluorometil)-3-piridinacarbonitrila, 2-[[(1R,3S)-3-amino- 4—-hidroxi-l-(5-tiazolil)butil]tio]-5-clorobenzonitrila, N-[4- [2- (3-clorobenzilamino)etil] fenil]tiofeno-2-carboxamidina, ou guanidinoetildissulfeto.
[0115] Os inibidores de acetilcolinesterase preferidos incluem, mas não estão limitados a, donepezil.
31 / 65
[0116] Os antagonistas de prostaglandina E2 subtipo 4 (EP4) preferidos incluem, mas não estão limitados a, N-[((2-[4-(2- etil-4,6-dimetil-lH-imidazo[4,5-c]piridin-1-il)fenil]etil) amino) carbonil]-4-metilbenzenossulfonamida ou ácido 4-[(18S)-1- (t5-cloro-2- (3-fluorofenoxi)piridin-3-il]carbonil)amino)etil] benzoico.
[0117] Os antagonistas de leucotrieno B4 preferidos incluem, mas não estão limitados a, ácido 1-(3-bifenil-4-il-metil-4- hidroxi-croman-T7-il)-ciclopentanocarboxilico (CP-105696), ácido 5-(2- carboxietil-3-[6- (4-metoxifenil)-5E- hexenil]oxifenoxi] valérico (ONO-4057) ou DPC-11870.
[0118] Os inibidores de 5-lipoxigenase preferidos incluem, mas não estão limitados a zileuton, 6-[(3-fluoro-5-[4-metoxi- 3,4,5,6-tetrahidro-2H-piran-4-il] fenoxi-metil]-l-metil-2- quinolona (ZD-2138), ou 2,3,5-trimetil-6-(3-piridilmetil),1,4- benzoquinona (CV-6504).
[0119] Os bloqueadores de canais de sódio preferidos incluem, mas não estão limitados a, lidocaína. Os antagonistas 5-HT3 preferidos incluem, mas não estão limitados a ondansetrona.
[0120] Preferencialmente, a p7S5NTR(NBP) é formulada para administração oral, sublingual, bucal, tópica, retal, inalatória, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intra-óssea, intra-sinovial, intradérmica, intraperitoneal, transmucosa,
32 / 65 vaginal, intravítrea intra-articular, peri-articular, local ou epicutânea.
[0121] Em um outro aspecto da presente invenção é fornecido um ácido nucleico que codifica uma p75NTR(NBP), para utilização no tratamento de osteoartrite tal como definido acima.
[0122] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão replicável para transfectar uma célula, compreendendo um ácido nucleico que codifica um p75NTR(NBP), para utilização no tratamento de osteoartrite tal como definido acima.
[0123] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma célula hospedeira que expressa uma Pp75NTR(NBP), para utilização no tratamento da osteoartrite tal como definida acima.
[0124] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica, compreendendo a p75NTR(NBP), a molécula de ácido nucleico, o vetor de expressão replicável ou a célula hospedeira descrita acima, e um veículo e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0125] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis preferidos incluem, mas não estão limitados a, [...]
[0126] Outro aspecto da invenção refere-se a um kit compreendendo:
33 / 65 a. a p75NTR(NBP), a molécula de ácido nucleico, o vetor de expressão replicável, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica descrita acima; e b. instruções para a administração de uma quantidade eficaz de p75NTR(NBP), molécula de ácido nucleico, vetor de expressão replicável ou composição farmacêutica a um indivíduo para qualquer uma ou mais da prevenção ou tratamento de osteoartrite e/ou um sintoma de osteoartrite ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência, ou atrasar ou reverter o desenvolvimento ou progressão da osteoartrite e/ou um sintoma de osteoartrite.
[0127] Em outro aspecto da presente invenção é fornecido um método para tratar e/ou prevenir a osteoartrite e/ou um sintoma de osteoartrite num indivíduo compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da p75NTR(NBP), a molécula de ácido nucleico, o vetor de expressão replicável, a célula hospedeira ou a composição farmacêutica descrita acima, opcionalmente compreendendo ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 — Medições de afinidade de p75NTR utilizando biacore Métodos
[0128] A cinética e afinidade de p75NTR são determinadas por tecnologia de ressonância plasmônica de superfície utilizando um Biacore T200 (GE Healthcare, Suécia). Os métodos Biacore
34 / 65 são baseados naqueles recomendados por Abdiche e colegas. (Abdiche, et al., 2008) A proteína A (10 pg/ml em tampão acetato de sódio 10 mM) é imobilizada na superfície de um chip biossensor CM5 pelo método de acoplamento de amina usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilcarbodiimida) (EDC) e N-hidroxi- succinimida (NHS) e etanolamina como fornecido no kit de acoplamento de amina.
[0129] Resumidamente, as etapas envolvidas no assistente de imobilização de acoplamento de amina no instrumento Biacore são: * EDC e NHS são misturados 1:1 * Mistura EDC/NHS é injetada sobre cada célula de fluxo de um chip CM5 durante 420 segundos a 10 pL/min * A proteína A [10 ug/mL] em tampão de acetato de sódio 10 mM, pH 4,5 é injetada sobre a mesma célula de fluxo durante 420 segundos a 10 pL/min * A etanolamina é injetada sobre a mesma célula de fluxo durante 420 segundos a 10 pL/min
[0130] Aproximadamente 2200-2900 unidades de resposta (RU) são imobilizadas. Uma célula de fluxo é definida como o controle em branco. P7SNTR-Fc é capturado na outra célula de fluxo do chip biossensor a 15 ºC utilizando uma injeção de 30 segundos de p75NTR (10 pg/ml em HBS-EP [HEPES 0,01 M a pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, surfactante P20 a 0,005% v/v]l) a uma taxa de 10 pL/min para atingir o nível desejado de p75NTR RU (-400 RU, calculado utilizando os pesos moleculares do p75NTR,
/ 65 a neurotrofina relevante e a razão estequiométrica). A imobilização do p75NTR em vez do ligante ajuda a garantir que as neurotrofinas estejam em seus estados nativos.
[0131] Um estudo de cinética de ciclo único é realizado por injeção de concentrações crescentes de neurotrofina em tampão HBS-EP sobre as células de fluxo por 120 segundos a 30 upL/min para cada concentração de neurotrofina. Após a injeção final de neurotrofina, o HBS-EP é passado sobre o chip por 600 segundos para determinar as taxas de dissociação. As superfícies dos sensores do chip são regeneradas para a sua superfície de Proteína A por injeção de Glicina 10 mM, HCl pH 2, durante 60 segundos a 30 puL/min antes de cada novo ciclo de injeção.
[0132] Os estudos de cinética de múltiplos ciclos são realizados injetando a concentração de neurotrofina mais baixa sobre as células de fluxo durante 300 segundos a 30 pL/min, seguido por tampão HBS-EP durante 300 segundos a 30 pL/min. O chip é então regenerado por injeções de 2 x 60 segundos de Glicina 10 mM, HCl pH 2 e o ciclo repetido para cada concentração crescente de neurotrofina. Resultados
[0133] p75SNTR liga-se reversivelmente às neurotrofinas NGF, BDNF, NT-3 e NT-4. As afinidades medidas utilizando Biacore são dadas na Tabela 1.
36 / 65 Tabela 1: Afinidade de p75NTR para as quatro neurotrofinas EXEMPLO 2 - Estudo de osteoartrite induzida por iodoacetato monossódico
[0134] A osteoartrite experimental induzida por injeção intra-articular de iodoacetato monossódico (MIA) no joelho traseiro de ratos é um modelo bem reconhecido de osteoartrite. A progressão patológica da doença e o comportamento da dor têm sido relatados (Guzman, et al., 2003) (Fernihough, et al., 2004). A MIA interronphe a glicólise por inibição da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, conduzindo à morte de condrócitos (Harvey & Dickenson, 2009). A integridade estrutural da cartilagem depende do funcionamento normal dos condrócitos, assim a perda de condrócitos induzida por MIA leva à degeneração da cartilagem e a alterações do osso subcondral compatíveis com a histopatologia clínica da OA (Janusz et al., 2001; Kobayashi et al, 2003, Naveen et al., 2014). A injeção de 0,3 mg de MIA induz a perda de cartilagem ao longo de um período de 10 semanas. A perda de cartilagem é maior entre a Semana 3 e a Semana 6 (Figura 1).
[0135] 44 ratos Wistar machos (Charles River, UK) alojados em pares e pesando 200-250g no Dia 2, são alocados aleatoriamente para tratamento de modo que o peso corporal médio de cada grupo de tratamento seja semelhante. No Dia 0, os ratos recebem tratamento conforme indicado na Tabela l1. IgG humana recentemente preparada (3,25 mg/ml em solução salina tamponada de fosfato livre de endotoxina [ETF-PBS]) e p75NTR (3,25 mag/mL em EF-PBS) são administrados por via subcutânea. A equipe do laboratório está “cega” com relação ao tratamento dos animais ao longo do estudo. Tabela 2: Grupos de tratamento. MIA, iodoacetato monossódico; IgG, imunoglobulina G mete (n)
[0136] Três horas depois, todos os animais são anestesiados com isofluorano. Cada animal anestesiado recebe uma injeção intra- articular de 50 ul de EF-PBS contendo 0,3 mg de MIA quer no joelho direito quer no joelho esquerdo, de acordo com o esquema de randomização. O joelho contralateral de cada animal anestesiado é injetado com 50 uL de EF-PBS. Um outro anticorpo respectivo ou o tratamento com p75NTR é administrado nos dias e1l5.
[0137] O estudo termina no dia 26, quando a perda de cartilagem é evidente e ativa (Figura 1). Os animais são anestesiados utilizando isoflourano, as amostras de sangue são retiradas
38 / 65 por punção cardíaca e as amostras de plasma são preparadas. A pele nas pernas traseiras inferiores é removida e os feixes musculares separados dos ossos, mas deixados intactos com o joelho. O fêmur, a fíbula e a tíbia são cortados e o joelho com o músculo ligado é colocado em formalina tamponada neutra a 10%. As amostras de tecidos são mantidas em formalina tamponada durante 48-72 horas antes do processamento para análise histológica.
[0138] As amostras de tecidos são preparadas para microscopia de luz utilizando procedimentos padronizados o mais rapidamente possível após a coleta para minimizar os danos causados pela fixação em formalina. As amostras são descalcificadas em ácido fórmico a 8% por 10 dias, processadas utilizando um processador de tecidos Shandon Citadel e incorporadas em parafina fundida. São processadas pelo menos quatro seções (10 um) de cada bloco de tecido de joelho de rato para a coloração com Haematoxilina e Eosina (HE) padrão utilizando uma máquina de coloração linear automatizada (Leica ST4040). Outras seções são coradas utilizando Safranin O. As lâminas são visualizadas em um aumento de quarto vezes ou dez vezes e a análise da imagem é realizada utilizando um sistema computadorizado. Mede-se a área total da cartilagem, desde a superfície da cartilagem até o limite entre a cartilagem calcificada e o osso subcondral. A absorção de luz do corante ligado às seções de tecido é quantificada sob luz monocromática com densitometria digital. A intensidade da coloração vermelha dos glicosaminoglicanos dada pelo safranin
39 / 65 O é quantificada medindo a área de cartilagem corada quando o limite de absorção é ajustado a 130 nm.
[0139] À concentração de anticorpo de controle e p75NTR exógeno no plasma é estimada medindo a IgG humana utilizando um ensaio imunoenzimático (ELISA). Resultados - Efeito de p75NTR sobre as alterações histológicas no joelho após OA induzida por MIA
[0140] Nenhuma degeneração de tecido nem características de OA foram observadas em joelhos que tinham sido injectados com ETF-PBS em animais de todos os grupos de tratamento (Figura 2B, D, F, H, Figura 3B, D, F, H). Em contraste, os joelhos injetados com MIA em animais tratados com anticorpo de controle mostraram áreas de degeneração moderada dos condrócitos, que frequentemente envolvem toda a espessura da cartilagem articular (Figura 2A). Houve evidência de uma resposta inflamatória recente em algumas áreas, marcada pela acumulação de leucócitos. O tratamento com p75NTR não acelerou a progressão da OA (Figura 2C, E, G). Houve menos alterações histológicas na arquitetura de joelhos tratados com MIA baixo tratados com p75NTR em comparação com animais tratados com anticorpos de controle, indicando proteção contra lesões ou reparação de danos. Isto foi evidente em todas as concentrações de p75NTR testadas (0,3 - 3,0 mg/kg). De fato, os animais tratados com a dose mais elevada de p75NTR-Fc tiveram um aumento significativo (P<0,05) na área da cartilagem (evidência de reparação induzida por p75NTR-Fc em OA ver Fig. 4).
40 / 65 Efeito de p75NTR na densidade de proteoglicanos no joelho após OA induzida por MIA
[0141] A área total da cartilagem nos joelhos tratados com MIA foi melhorada em animais tratados com pPp75NTR-Fc: isto foi significativamente diferente (P<0,05) para animais tratados com p75NTR-Fc a 3,0 mg/kg em comparação com animais controle correspondentes no Dia 26 pós intra-articular (Figura 4).
[0142] À intensidade da coloração com safranin O, avaliada por análise de imagem, que é proporcional ao conteúdo de glicosaminoglicano da cartilagem, mostrou diferenças marcantes (P<0,05) entre os grupos de tratamento (ver Figura 5). Utilizando um limite de absorção de 130 nm, apenas 20% da cartilagem do joelho tratado com MIA foi corada em vermelho acima do limite de 130 nm em animais tratados com anticorpos de controle em comparação com os joelhos contralaterais, indicando uma perda substancial de glicosaminoglicanos. Em contraste, aproximadamente 50% da cartilagen nos joelhos tratados com MIA dos animais que receberam p75NTR-Fc estava acima do limite de 130 nm (Figura 5). Isto indica que p75NTR- Fc está prevenindo a perda contínua da integridade estrutural da cartilagem após injeção de MIA e também da modificação da doença para OA. EXEMPLO 3 - Efeitos de p75NTR-Fc na regressão da osteoartrite em ratos em comparação com PG-007
[0143] O objetivo deste estudo é avaliar se as doses crescentes de p75NTR-Fc podem causar regressão de OA uma vez que a doença tenha sido estabelecida. Adicionalmente, a eficácia do
41 / 65 tratamento em termos da dor associada à artrite induzida por MIA no rato foi avaliada e comparada com o tratamento com o anticorpo anti-neurotrofina de fator de crescimento (NGF) Tanezumab, PG-007. Protocolo Reagentes catálogo monossódico (MIA) PBS livre de | Promocell C-40240 359P109 endotoxina (ETF- PBS) Solução de | Sigma HT501320 090M4370 formalina tamponada neutra a 10% EDTA (Sal | Sigma ED2P BCBF9021V dipotássico dihidratado) Tabela 3. Detalhes dos reagentes usados no Exemplo 3 Preparação de MIA
[0144] MIA foi preparado a uma concentração de 0,3 mg/50 ul de ETF-PBS (volume utilizado para cada injeção intra-articular) que é equivalente a 6 mg/mL de solução de MIA. Pesou-se 68 mg de MIA e dissolveu-se em 11,3 ml de ETF-PBS. MIA foi preparado com um dia de antecedência e foi armazenado a 4ºC no escuro
42 / 65 até ser requerido. Todos os animais receberam MIA preparado a partir do mesmo lote. Agentes de teste catálogo [essoor fone a semana | Es ET por Levicept) |ersmracro — festogue 2,00 ma/m | Proteína completa | AbDCam AB90285 | GRI 96868-1 do fragmento Fc de |preparada a 2,15 IgG humano mg/ml em ETF-PBS Tabela 4. Detalhes dos agentes de teste usados no Exemplo 3 Preparação dos agentes de teste
[0145] Os agentes de teste utilizados neste estudo foram preparados frescos no dia específico em que os animais receberam as doses (ver Tabela 4). Sempre que possível, os volumes de cada anticorpo preparado foram iguais, de modo que o cientista que injeta o anticorpo in vivo desconhecia o tratamento em cada frasco (ver Tabela 5). Anticor | Dose(mg/k | Concentraç | volum |Volum | Volume Concentraç | volum po g) ão estoque | e e de|finalim |ão e de (mg/ml) estoq veícu 1) final (mg/m | dose ue lo 1) (ml /k (ml) (ml) g)
43 / 65 [eso [5 fas — [330 [am 1 — foco — 5 | me rei Fc Fc
FE FF Fc [5aese o fais — [5100 lan00 as Joso —|s | Tabela 5. Preparação típica dos agentes de teste usados no Exemplo 3 Animais
[0146] Foram utilizados 39 ratos Wistar machos (de Charles River, RU) com um peso de 120-150g no Exemplo 3. Cada animal foi checado na chegada e parecia saudável. Eles foram aleatoriamente alocados para uma gaiola com três e a cada rato foi atribuído um número único de identificação por uma tatuagem na cauda. Os animais foram aclimatados à unidade animal durante pelo menos dez dias antes do início do estudo no dia O.
[0147] Uma vez aclimatados ao seu ambiente os ratos foram transferidos para uma sala de guarda/procedimento, onde todos os procedimentos in vivo foram realizados. Os animais foram mantidos iluminados por luzes fluorescentes configuradas para dar um ciclo de claro-escuro de 12 horas (ligada às 07:00 desligada às 19:00), como recomendado no Home Office Animals (Procedimentos Científicos) Ato de 1986. Os ambientes foram
44 / 65 climatizados e a temperatura do ar (21 ºC +/- 2 ºC) e umidade relativa foram rotineiramente medidas.
[0148] Os ratos foram alimentados com dieta completa irradiada R105-25 para ratos (Scientific Animal Food and Engineering, Augy, France) e água autoclavada estava disponível à vontade. Cada lote de dieta foi verificado e rastreado rotineiramente quanto à composição e contaminantes. Os ninhos e as gaiolas foram autoclavados e cada gaiola foi ventilada individualmente (sistema IVC). Desenho experimental
[0149] Após a indução da artrite pela injeção intra-articular de MIA em um joelho e uma vez que foram observadas diferenças significativas no peso (medidas de incapacidade) dos membros tratados com MIA em comparação com seu membro de controle contralateral tratado com ETF-PBS, os animais foram randomizados em cinco grupos de tratamento de comportamento nociceptivo equivalente (n = 6 animais por grupo) e um grupo de controle do veículo (n = 3). Seis animais sem tratamento foram incluídos como controles negativos. Injeção intra- | Tratamento Dias de |Dia final articular em | (grupo) por | tratamento um joelho (n) via subcutânea e 50 mg/kg e 50
45 / 65 mg/kg e 50 mg/kg e 50 MIA 0,3 mg (6) |Proteína 30, 35, 39, 45|58 completa do |e 50 fragmento FC IgG humano e 50 (6) Tabela 6. Descrição geral do desenho experimental do Exemplo 3
[0150] O peso corporal foi regularmente registrado através do estudo e a avaliação da dor espontânea foi medida em intervalos semanais.
[0151] Como as anti-neurotrofinas anti-NGF demonstraram causar nos ratos auto-arranhões ao redor da face e do pescoço, oS animais foram regularmente observados quanto aos sinais de lesões cutâneas e quaisquer pontos de lesões registadas, particularmente após o sexto dia, para garantir que não estávamos a atingir o ponto final da clínica humana. (Os animais serão mortos se a área máxima de lesões cutâneas totais exceder 10 cm” ou se uma lesão tiver um tamanho maior do que 2 cm x 3 cm e ficar mais profunda e úmida sem sinais de cicatrização dentro de um período de 24 horas).
46 / 65
[0152] No dia final uma amostra de sangue foi retirada por punção cardíaca e o plasma preparado. Os joelhos foram removidos e colocados em solução de formalina tamponada neutra a 10% e processados para histologia. Randomização do(s) tratamento(s) Injecção de MIA
[0153] A randomização foi realizada de modo que o joelho esquerdo ou direito de cada rato fosse injetado com MIA (com o joelho contralateral de cada rato injetado com ETF-PBS). A alocação de qual joelho recebeu MIA ou solução salina para cada rato foi produzida utilizando um gerador de números aleatórios no Microsoft Excel para Mac (Versão 14.1.1). O pessoal que não teve contato com os animais realizou o procedimento de aleatorização e alocação (ver apêndice 1 para o calendário). Dois frascos de polipropileno de 7 ml foram marcados para cada animal para denotar o joelho esquerdo ou direito (total de 66 frascos). Duas pessoas (uma registrando e verificando a folha de randomização e uma aliquotando a solução para a injeção intra-articular) prepararam os 66 frascos. A aliquotagem foi realizada em sequência de modo que os frascos de MIA foram cheios primeiro seguido pelo restante dos frascos sendo cheios com ETF-PBS (este era o frasco de joelho contralateral para cada animal). Os frascos para os animais sem tratamento foram deixados vazios. Dosagem dos agentes de teste
[0154] Os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento com diferenças iguais no comportamento nociceptivo
47 / 65 do joelho que tinha sido tratado com MIA em comparação com o joelho tratado com veículo de controle. Isto foi realizado no dia 28 após a indução da OA.
Procedimentos com Animais Injeção intra-articular do joelho
[0155] Os ratos foram anestesiados por inalação de Isoflurano utilizando um aparelho de Boyle. Os pêlos em ambos os joelhos de cada animal foram cortados e os joelhos limpos com etanol.
Cada joelho foi injetado através do ligamento infra-patelar com 50 pl de 0,3 mg de MIA em ETF-PBS ou ETF-PBS sozinho utilizando uma seringa de insulina Becton Dickinson Micro-Fina estéril de 0,5 ml com uma agulha 27 G anexa. Os seis animais sem tratamento foram anestesiados e os pêlos em ambos os joelhos foram cortados apenas. Ao longo do estudo, os cientistas estavam “cegos” com relação ao tratamento de todos os animais.
Dosagem de agentes de teste
[0156] Os agentes de teste foram administrados por via subcutânea na nuca do pescoço ou no lado utilizando um volume de dose de 5 ml/kg.
Avaliação da dor espontânea
[0157] A dor espontânea foi determinada para cada animal em intervalos semanais medindo o apoio de peso dos membros posteriores esquerdo e direito usando um testador de Incapacitância (Linton Instruments, U.K.). Os ratos foram colocados numa caixa para animal perspex de tamanho apropriado
48 / 65 no testador de incapacitância de modo que os seus pés traseiros se apoiassem em sensores separados. O tamanho da caixa escolhida baseou-se no peso corporal do rato (suporte de rato pequeno para ratos até 450 g e suporte grande de ratazana/cobaia para ratos com mais de 450 g), o que permitiu ao rato sentar-se confortavelmente sem ser espremido, mas da mesma forma, não oferecia muito espaço para que o rato pudesse se virar. Uma vez que o rato estivesse estável e calmo, o apoio de peso de cada membro era registrado ao longo de 5 segundos e a força média em gramas exercida por ambos os membros traseiros era registada. A distribuição de peso das patas traseiras foi determinada cinco vezes para cada rato em cada tempo, e calculada a média das cinco leituras. Os dados do apoio de peso foram convertidos numa distribuição de peso dividindo o peso do membro direito pelo peso total para ambos os membros posteriores. Amostra de sangue final
[0158] As amostras de sangue finais foram colhidas por punção cardíaca sob anestesia de Isoflurano com uma seringa Terumo de 2 ml e uma agulha de 21 G que tinha sido enxagada com EDTA potássico a 1% em água MilliQ. O sangue coletado foi colocado em tubos de polipropileno de 2 ml. Os animais foram então sacrificados por deslocamento cervical. Preparação do plasma
[0159] As amostras de sangue finais foram centrifugadas a 2700 x g durante 10 minutos e o plasma foi alíquotado em tubos
49 / 65 de polipropileno (quatro alíquotas por animal) e congelados a —80 ºC. Remoção dos joelhos dos ratos
[0160] A pele da perna foi removida e os feixes musculares separados dos ossos, mas deixados intactos com o joelho. O fêmur, a fíbula e a tíbia foram cortados e o joelho com o músculo ligado foi removido e colocado em aproximadamente 80 ml de formalina tamponada neutra a 10% num recipiente com tampa de rosca de 125 ml. Os joelhos foram mantidos em formalina tamponada de 48 a 72 horas antes de serem processados para análise histológica. Processamento para histologia
[0161] As amostras de tecido foram preparadas para microscopia de luz utilizando procedimentos padrão e realizadas externamente na Universidade de Cambridge. Resumidamente, após a fixação das articulações do joelho, os tecidos foram enxaguados com PBS e subsequentemente descalcificados em ácido fórmico a 8% durante 10 dias. Após descalcificação, o tecido foi processado utilizando um processador de tecidos Shandon Citadel que desidratou o tecido através de uma série de concentrações de etanol (seis mudanças de 4 horas variando de 75% a 100% de etanol), lavadas com 100% de clorofórmio (três mudanças de 4 horas) e finalmente incorporado em parafina fundida para formar um bloco de tecido (duas mudanças de 4 horas). Os tecidos foram incorporados em cassetes utilizando um equipamento Surgipath PEC 3001 parafina fundida. O tecido foi processado o mais rápido possível após a coleta para
50 / 65 minimizar os danos causados pela fixação de formalina de modo que as secções de tecido pudessem ser potencialmente utilizadas para imuno-histoquímica.
[0162] Pelo menos quatro secções de 10 um foram cortadas de cada bloco de tecido de joelho de rato utilizando um micrótomo de parafina Leica RM2135. Duas secções foram colocadas numa lâmina de vidro e as lâminas foram processadas para coloração padrão de Haematoxilina e Eosina (H&E) e Safranin O Fast Green (Safranin O F/G) utilizando uma máquina de coloração linear automática (Leica ST4040). Resumidamente, a máquina de coloração linear possui 23 estações de reagentes e quatro estações de água dispostas numa configuração para corar as lâminas, que seguem um protocolo padrão H&E ou Safranin O F/G. Para H&E, as lâminas foram trocadas entre as 27 estações após um minuto em cada uma, seguindo uma série de xileno, etanol, água, hematoxilina, água, álcool ácido, água, eosina, água, etanol e xileno. (Todos os solventes de Fisher Scientific e H&E de Leica). As secções foram secas ao ar, foram montadas e cobertas com uma lamínula prontas para serem vistas sob um microscópio. Análise das Imagens
[0163] As lâminas foram visualizadas num aumento de 2, 4 ou 10X, usando um microscópio Olympus AX70 usando o software de análise de imagem Image-Pro Plus (suite v7.0, Media Cybernetics, U.K.). Uma análise inicial informal das secções de tecido coradas para características semelhantes à OA foi
51 / 65 realizada para mostrar as alterações gerais da articulação medial do joelho de cada rato.
[0164] A análise da imagem foi realizada nas lâminas de SO/FG usando a objetiva 2X, onde foi determinada a área total da cartilagem (em mm?) para todos os joelhos de rato (joelhos tratados com MIA e ETF-PBS). A profundidade da camada de cartilagem (um mínimo de 6 medições foi feita por articulação do joelho medial) e isso foi comparado com a profundidade do osso subcondral da mesma articulação do joelho. Análise dos dados
[0165] Análise das imagens (tal como área de cartilagem) e dados de avaliação de dor (por exemplo, desequilíbrio da distribuição de peso) foram analisados para cada animal utilizando estatística clássica. Múltiplas medições foram feitas e calculadas as médias de animais tratados com p75-NTR- Fc (em diferentes doses) ou PG-007 e os valores foram comparados com animais de controle utilizando os testes estatísticos clássicos apropriados. Para todas as análises, p<0,05 foi usado para indicar significância estatística. Resultados Peso corporal
[0166] Os pesos corporais dos ratos nos diferentes grupos foram comparados para testar as diferenças de tamanhos entre os animais. No dia 0, não houve diferença estatisticamente significativa entre os pesos corporais dos animais nos
52 / 65 diferentes grupos de tratamento (p=0,76 n.s., ANOVA unidirecional, ver Figura 30).
[0167] O peso corporal médio entre os seis grupos de tratamento (ratos tratados com p75NTR-Fc ou PG-007 em comparação com ratos tratados com anticorpo de controle) não foi estatisticamente significativo entre si durante o curso do estudo (p = n.s., ANOVA bidirecional, ver Figura 31). Medidas de dor espontânea Efeitos de p75NTR-Fc e PG-007 na dor espontânea provocada por
OA
[0168] A dor espontânea foi avaliada por meio de um testador de incapacidade para medir a distribuição do peso através dos membros traseiros. As avaliações foram feitas na linha de base (exceto para o grupo 7, animais sem tratamento) e novamente nos dias 15, 21 e 28 após a injeção de MIA num joelho (os joelhos contralaterais foram injetados com ETF-PBS). Os dados são mostrados na Figura 32 e são ilustrados como a proporção do peso total sobre os membros traseiros que estão sendo suportados pelo membro traseiro tratado com MIA. Para animais sem tratamento, a proporção de peso que está passando através do membro traseiro esquerdo é mostrada.
[0169] Para todos os animais não houve diferença estatisticamente significativa entre a proporção de peso no membro traseiro tratado e a expectativa teórica de 0,5 (distribuição uniforme nos dois membros traseiros na linha de base do dia O (p=0,379, teste de Kruskal Wallis; ver Figura
53 / 65 32). No dia 28, todos os cinco grupos de tratamento foram significativamente diferentes da média teórica de 0,5 e estavam essencialmente tirados do peso do seu joelho injetado com MIA (ver Figura 32). Com base em estudos anteriores, isto indicou que a extensão da patologia de OA era significativa o suficiente para começar as doses nos ratos.
[0170] A dosagem foi iniciada em ratos com o respectivo regime de tratamento a partir do dia 30 até ao final do estudo no dia 56 (tratamento a cada 5 dias por via subcutânea). Durante o curso do estudo foi avaliada a dor espontânea (feita nos dias 35, 42, 49 e 56, ver Figura 4). Ao longo do estudo até o dia 49, os animais tratados com Fc IgG de controle permaneceram significativamente diferentes entre a proporção de peso no membro traseiro tratado e a expectativa teórica de 0,5, indicando que o joelho tratado com MIA causou dor ao animal (ver Figura 33). Em contraste, nos animais tratados com anti- NGF PG-007 e aqueles tratados com p75NTR-Fc (de 0,3 a 3 mg/kg) não houve diferença significativa entre a proporção de peso no membro traseiro tratado com MIA e a expectativa teórica de 0,5 (ou seja, distribuição uniforme do peso nos membros traseiros) à medida que o tempo avançava. Alterações Histológicas no joelho após OA induzida por Mia Efeitos de p75NTR-Fc e PG007 na regressão de OA
[0171] Os joelhos injetados com MIA de animais tratados com anticorpos de controle mostraram áreas de degeneração de condrócitos, o que em algumas áreas levou à perda completa de cartilagem (Figura 34). Isto é realçado pela perda associada
54 / 65 da coloração de Safranin O Fast Green na cartilagem. Além disso, houve alterações patológicas significativas no osso subcondral subjacente às áreas de maior dano cartilaginoso (Figura 34). Há um espectro de alterações no osso subcondral, que refletem tanto as mudanças reativas quanto a progressão direcionada do remodelamento às alterações escleróticas (Figura 34).
[0172] Os animais tratados com 3 mg/kg de PG-007 durante 28 dias após patologia significativa foram estabelecidos (identificados por uma avaliação de dor onde a proporção de peso no membro traseiro tratado e a expectativa teórica de 0,5 foram significativamente diferentes) mostraram alterações histológicas significativas em relação aos animais tratados com anticorpo de controle com perda da integridade global do joelho do rato e sem evidência histológica de eficácia (Figura 35). Esta patologia é consistente com perda associada de cartilagem e medula óssea e evidência de necrose óssea, o que, em geral, leva a uma progressão geral rápida e em alguns animais um agravamento da OA em comparação com animais tratados com anticorpos de controle. Em contraste, os animais tratados com p7SNTR-Fc (0,3 a 3 mg/kg) exibem uma histopatologia muito diferente e há evidência de condroproteção significativa e um aumento significativo associado na patologia óssea subcondral em comparação com os animais tratados com anticorpos de controle, o que leva a uma gravidade geral reduzida da patologia óssea e OA (Figuras 36- 38). Isto é fenotípicamente representado por uma expansão
55 / 65 mieloide reduzida na medula óssea, o que diminui o impulso osteolítico mediado pela inflamação.
[0173] Os animais tratados com as doses mais baixas de p75NTR-Fc (0,3 e 1 mg/kg) mostram as alterações mais acentuadas na histopatologia (ver Figuras 37 e 38), e em ambos os grupos de tratamento a patologia estava quase a níveis normais. Tendo em consideração os resultados histológicos a 3 mg/kg de p75NTR-Fc (ver Figura 36), o perfil global sugere que p75NTR-Fc exibe uma curva resposta-dose "sinusoide". Avaliação histopatológica
[0174] A histopatologia foi realizada em cortes corados com safranin O Fast Green de joelhos descalcificados. Em geral, a qualidade do processamento e da coloração dos tecidos foi excelente, com apenas três lâminas rejeitadas por razões de qualidade. As lâminas foram organizadas em grupos de tratamento e, portanto, a avaliação patológica inicial não foi “cega”. No entanto, para fins de classificação, todos os grupos (com exceção do veículo) foram randomizados - usando uma sequência simples de números aleatórios - a fim de reduzir o viés do observador e tendência diagnóstica. Fenotipos histopatológicos descritivos da cartilagem Grupo Controle
[0175] Houve uma distinção clara entre as lâminas pareadas. As lâminas com patologia de cartilagem mais marcante são: 4RA, 5LA, 6LB, 10RA, 11LB (cartilagem insuficiente para classificação na lâmina 11RA) e 12RB. A maioria das alterações
56 / 65 da cartilagem foram erosões de espessura total com necrose evidente de condrócitos periféricos.
Grupo 4 - PG007, 3 mg/kg
[0176] Houve uma distinção clara entre as lâminas pareadas.
As lâminas com patologia de cartilagem mais marcante são: I1RA, 2RB, 3LB, 34LA, 35LA, 36RB. No geral, a patologia da cartilagem foi histologicamente semelhante ao grupo controle.
Grupo 3 - P7S5NTR-Fc, 0,3 mg/kg
[0177] À distinção entre as lâminas pareadas não foi tão marcante em comparação com o grupo controle. A administração de P7SNTR-Fc foi associada a uma marcada inibição da patologia da cartilagem induzida por MIA - de fato, quase normal em dois casos. Três lâminas foram rejeitadas deste grupo por questões de qualidade.
Grupo 1 - P7SNTR-Fc, 1,0 mg/kg
[0178] A distinção entre as lâminas pareadas não foi tão marcante em comparação com o grupo controle. As lâminas com patologia de cartilagem mais marcada (embora modestas em comparação com as lesões do controle) são: 7LA, 8SLA, 13RB, 15RA, 31RB, 33LB. A administração de P75NTR-Fc foi associada com uma marcada inibição da patologia de cartilagem induzida por MIA.
Grupo 2 - P7SNTR-Fc, 3,0 mg/kg
[0179] Este grupo apresentou variabilidade acentuada em termos de efeitos de eficácia na patologia da cartilagem - com um
57 / 65 espectro de efeitos que variam de lesões similares ao controle até àquelas semelhantes ao Grupo 1 (50%). As lâminas com a patologia de cartilagem mais marcada são: 16LB, 17RA, 18RB, 22RB, 23LA e 24LA. A administração de P75NTR-Fc na dose máxima não mostrou efeitos inequívocos associados a 0,3 e 1,0 mg/kg. Critérios de grau histopatológico
[0180] A alocação do grau é baseada na lesão mais frequente observada dentro de cada zona anatômica. Com base na avaliação inicial, identificou-se características histológicas chaves no grupo de controle e que mostraram alterações evidentes após administração de P75NTR-Fc a 1,0 mg/kg. Os critérios de classificação foram aqueles que foram utilizados na avaliação de patologia do estudo MIA anterior (MLF). Patologia da cartilagem
[0181] Muitas publicações detalham o uso da Pontuação de Mankin para classificação da patologia da cartilagem humana. A Pontuação de Mankin original (ou pontuação HHGS) varia de O (normal) a 14 (patologia grave) e sofre marcado viés inter-observador. Além disso, este sistema de pontuação subestima o envolvimento da patologia “pannus” e, muitas vezes, confunde as mudanças iniciais com a variação normal. Importante, Pontuação de Mankin expande a faixa de grau das alterações da patologia de moderada para grave, e acentua de leve a moderada. Assim, a Pontiação de Mankin, aplicado diretamente, tem utilidade questionável em estudos pré-clínicos, uma vez que raramente descreve um intervalo farmacodinâmico e é insensível às diferenças na renovação
58 / 65 celular entre roedores e homem. O sistema de classificação utilizado neste estudo é uma modificação do sistema OARSI utilizando o esquema descritivo de Pelletier: O - ausência de anormalidades significativas; 1 - fibrilação superficial “mínima; 2 - erosão superficial; perda de condrócitos da zona superficial; 3 - erosão em zonas profundas; 4 - erosão de espessura total; exposição multi-focal de osso subcondral, área <50%; 5 - perda da placa da cartilagem; Formas detriticas no espaço articular >50% da área Osso Subcondral
[0182] A placa de osso subcondral reage à perda de integridade da cartilagem através do espectro de graus de cartilagem antes de sofrer alterações degenerativas - essencialmente mediada por osteólise. O - ausência de anormalidades significativas; 1 - desorganização da zona superficial (zonas osteóides irregulares); 2 - desorganização de espessura total; 3- osteólise multifocal; 4 - osteopenia multi-focal; 5 - zonas osteopênicas confluentes Cavidades Estromais
[0183] As cavidades do estroma são as cavidades dentro da medula e imediatamente distal à placa subcondral. O - ausência de anormalidades significativas; 1 - osteólise mínima; 2 - osteólise moderada; 3 - osteólise marcada com evidência de múltiplos poços líticos na maioria das cavidades; 4 - fusão pós-osteolítica de cavidades; 5 - Quebra de cavidades fundidas do osso subcondral e/ou o periósteo
59 / 65 Osso esponjoso
[0184] O sistema ósseo esponjoso sofre alterações reativas na patologia de cartilagem mínima devido a alterações na biomecânica da articulação - progredindo para um fenótipo mais degenerativo secundário à inflamação. O - ausência de anormalidades significativas; 1 - áreas multi- focais de reabsorção óssea superficial /osteólise; 2 - múltiplas áreas de marcada osteólise; 3 - múltiplas áreas de osteólise com perda de marca de zona normal; 4 - zonas multi-focais de osteólise com evidente perda de osteócitos; - ruptura óssea esponjosa com/sem fusão óssea Hiper-celularidade da medula óssea O - ausência de anormalidades significativas; 1 - múltiplos focos concentrados de células dentro do estroma da medula; 2 - múltiplos focos concentrados de células dentro do estroma da medula e dos poços periósticos; 3 - hiper-celularidade difusa da medula - zonal; 4 - expansão da medula óssea em cavidades estromais; 5 - ruptura do compartimento medular em placa subcondral ou periosteal com/sem mistura de “pannus” Esclerose óssea
[0185] A esclerose óssea é usualmente vista como áreas de expansão fibroplástica das cavidades do estroma. O - ausência de anormalidades significativas; 1 - ocasionais, pequenos, focos; 2 - múltiplos focos; 3 - múltiplos focos confluentes; 4 - múltiplos focos confluentes com degeneração Óssea associada; 5 - múltiplos focos confluentes com cistos ósseos
60 / 65 Hiperplasia dos osteoblastos O - ausência de anormalidades significativas; 1 - múltiplas placas de osteoblastos; 2- placas de osteoblastos hipertróficos múltiplos; 3 - paliçada osteoblásticas evidentes; 4 - placas de osteoblastos hipertróficas - zonal; 5 - placas de osteoblastos hipertróficos - multizonal.
Os resultados de histologia (a maioria das amostras pareadas de patologia de cartilagem grave de conjuntos plotados) Patologia da cartilagem
[0186] A administração de PGO00O7 não mostrou efeitos de eficácia histologicamente significativos. PT75NTR-Fc mostrou uma eficácia marcada na condroproteção a 0,3 e 1,0 mg/kg. O perfil de eficácia a 3,0mg/kg foi mais variável - com 50% do grupo mostrando sobreposição com o grupo de controle (Figura 39).
Osso Subcondral
[0187] À administração de PGO007 foi associada com aumento histologicamente significativo na patologia óssea subcondral em comparação com o grupo controle - similar ao perfil observado com 3,0 mg/kg de PT7S5NTR-Fc. Em contraste, a administração de P75NTR-Fc a 0,3 e 1,0 mg/kg esteve associada a uma melhoria significativa na histologia do osso subcondral (Figura 40).
Cavidades Estromais
[0188] A administração de PGO007 não foi associada a quaisquer efeitos de eficácia histologicamente significativos. Em
61 / 65 contraste, a administração de PT7S5NTR-Fc está associada à redução da patologia osteolítica e à expansão das cavidades do estroma, embora os efeitos a 0,3 e 1,0 mg/kg tenham sido mais marcantes - ambos os grupos reduziram a patologia para níveis quase normais (Figura 41). Osso esponjoso
[0189] A administração de PG007 foi associada com patologia óssea esponjosa similar aos controles - com duas amostras excedendo os intervalos de controle. Em contraste, a P75NTR-Fc reduziu acentuadamente a patologia do osso esponjoso aos níveis de dose de 0,3 e 1,0 mg/kg. O P75NTF-Fc a 3,0 mg/kg apresentou um perfil mais variável, com a maioria das amostras apresentando sobreposição com o grupo controle (Figura 42). Hiper-celularidade da medula óssea
[0190] A administração de PGO0O07 foi associada com a expansão das células mieloides na medula óssea, com quatro amostras no máximo ou excedendo o intervalo de controle. P75NTR-Fc reduziu a celularidade da medula óssea - com redução da expansão mieloide sendo uma característica proeminente - nas doses de 0,3 e 1,0 mg/kg. A dose de 3,0 mg/kg, embora mostrando uma tendência para a inibição, mostrou sobreposição com respondedores de baixo nível no grupo de controle (Figura 43). Esclerose óssea
[0191] Não houve diferenças histologicamente significativas entre os grupos de estudo - embora as amostras de P75NTR-Fc
62 / 65 apresentassem um agrupamento para a extremidade superior da faixa de controle (Figura 44). Hiperplasia dos osteoblastos
[0192] A administração de P75NTR-Fc a 0,3 e 1,0 mg/kg foi associada à proliferação de osteoblastos histologicamente significativa - com paliçada e formação de placas osteoblásticas sendo especialmente proeminente na zona epifisária, na zona de osso subcondral/cartilagem. Além disso, embora não classificados, havia proeminência de células tipo fibroblastos nesta zona. PG007 e P7S5NTR-Fc (3,0 mg/kg) foram histologicamente semelhantes aos controles (Figura 45). Efeitos Adversos
[0193] Dois ratos tratados com 3 mg/kg de PG-007 desenvolveram lesões cutâneas. Algumas lesões cutâneas muito pequenas começaram a aparecer ao redor da região do focinho, pescoço e ombro em alguns ratos no dia 45 (15 dias após o tratamento), mas tornaram-se mais aparentes a partir do dia 49 (19 dias após o tratamento) em um rato. Estas lesões não foram associadas ao local da injeção. Os ratos foram verificados regularmente e o número, tamanho e extensão de cada lesão foram quantificados para assegurar que permaneceríamos dentro do desfecho clínico humano do estudo. Nenhum rato tratado com p7SNTR-Fc em qualquer concentração desenvolveu lesões cutâneas. Discussão Histopatologia
63 / 65
[0194] O PGO007 não foi associado a evidências histológicas de eficácia. Em contraste, o P7SNTR-Fc a 0,3 e 1,0 mg/kg foi associado com condroproteção histologicamente significativa, com reduzida gravidade da patologia Óssea e erosão Óssea mediada pela osteólise. A descoberta de hiper-celularidade reduzida da medula óssea (notavelmente a expansão mieloide) suporta este fenótipo, e sugere que a limitação de uma inflamação mediada por osteócitos está envolvida na resposta de eficácia. Importante, estas doses também foram associadas a uma expansão do “pool” de osteoblastos - sugestivo de que o mecanismo de eficácia de P75NTR-Fc é um mecanismo duplo, limitando a osteólise (limitando assim a ativação de células mieloides) enquanto se amplia o “pool” de osteoblastos (aumentando assim o “pool” de células mesênquimais). O perfil histológico do grupo P7S5NTR-Fc a 3,0 mg/kg sugere que a P7SNTR-Fc exibe uma curva dose-resposta "sinusoide". Embora, em muitos aspectos, o perfil histológico de 3,0 mg/kg de P7SNTR-Fc e PGO0O07 sejam semelhantes, o fenótipo exato sugere que a condução osteolítica de P75NTRFc é inferior à do PGO007 numa base de equivalência de dose. Classicamente, a avaliação histopatológica dos modelos de MIA baseia-se numa relação linear da patologia da cartilagem primária, resultando em alterações ósseas reativas. As alterações da medula Óssea são muitas vezes consideradas consequenciais, secundárias a uma sinovite reativa, decorrente de alterações biomecânicas devido à perda de cartilagem. Há um acúmulo de dados de osteoimunologia sugerindo que essa relação linear é natural e que o compartimento ósseo pode exercer um papel importante no condicionamento tanto do desenvolvimento temporal quanto do
64 / 65 fenótipo da resposta da cartilagem. De fato, esta pesquisa apoia dados de imagem de estudos humanos que mostram remodelação óssea mesmo em lesões de cartilagem de grau mínimo. Assim, é provável que a cartilagem e o osso subcondral sejam considerados como uma unidade funcional integrada - com esta última proporcionando condicionamento para apoiar a proliferação e sobrevivência dos condrócitos e influenciando assim os resultados estruturais na osteoartrite. Os dados do presente estudo oferecem suporte à hipótese de que a manipulação da via de NGF, embora oferecendo possibilidades para reduzir a osteólise, também pode aumentar a osteoproteção mediada por células mesenquimais - e assim suprimir a condução da condronecrose superficial para lesões em zonas profundas e, erosões e perda de cartilagem.
[0195] Conclusões
[0196] Neste estudo foi investigado o efeito de um regime terapêutico de dose utilizando p75NTR-Fc (de 0,3 a 3 mg/kg) para determinar se a regressão da patologia de OA após injeção de MIA poderia ser observada. OA se desenvolveu durante 30 dias antes do início das doses, o que foi identificado por medições de dor significativamente diferentes da média teórica de 0,5.
[0197] Os animais tratados com doses mais baixas de p75NTR-Fc (0,3 e 1 mg/kg) tiveram efeitos analgésicos e eficazes e mostraram significativamente menos patologia de OA em comparação com animais tratados com anticorpos de controle. Em contraste, apesar dos ratos tratados com 3 mg/kg de PG-007
65 / 65 mostrando analgesia isto não foi associado com evidência histológica de eficácia e qualquer melhoria na patologia de OA. Os animais tratados com a dose mais elevada de p75NTR-Fc (3 mg/kg) tiveram efeito analgésico entretanto; existiram algumas semelhanças histopatológicas com animais tratados com 3 mg/kg de PG-007.
[0198] A presente invenção não deve ser limitada ao âmbito das formas específicas aqui descritas. De fato, várias modificações da invenção, para além das aqui descritas, tornar-se-ão evidentes para os especialistas na arte a partir da descrição anterior e das figuras que a acompanham. Tais modificações pretendem cair dentro do âmbito das reivindicações anexas. Além disso, todas as formas aqui descritas são consideradas como amplamente aplicáveis e combináveis com qualquer e com todas as outras formas consistentes, conforme apropriado.
[0199] São aqui citadas várias publicações, cujas descrições são incorporadas por referência em sua totalidade.

Claims (24)

REINVINDICAÇÕES
1. Uso de uma proteína de ligação de neurotrofina p75NTR (p75NTR(NBP)) CARACTERIZADO por ser para o preparo de um medicamento para o tratamento da osteoartrite.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o tratamento da osteoartrite incluir alívio dos sintomas da osteoartrite.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o alívio dos sintomas da osteoartrite inclui redução na dor, inflamação, inchaço, sensibilidade, rigidez articular ou aumento da mobilidade articular ou qualquer combinação destes.
4, Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento da osteoartrite inclui retardar ou deter a progressão da doença.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo tratamento da osteoartrite incluir reversão da progressão da doença, recrescimento da cartilagem e/ou tratamento curativo.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, CARACTERIZADO por a progressão da doença ser determinada pela taxa de perda ou recrescimento da cartilagem.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por o tratamento da osteoartrite incluir tratamento profilático.
8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO por a p7/5NTR(NBP) compreender uma Pp75NTR(NBP) ligada a uma ou mais moléculas auxiliares.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO por uma ou mais moléculas auxiliares serem selecionadas de: (a) transferrina ou uma porção sua; (B) albumina ou uma porção Sua; (C) uma Fc de imunoglobulina ou uma porção sua; ou (d) uma cadeia polimérica de polietilenoglicol.
10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, CARACTERIZADO por a p75NTR(NBP) estar ligada a uma ou mais moléculas auxiliares através de um ou mais ligantes.
11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de l a 10, CARACTERIZADO por a p75NTR(NBP) compreender uma p75NTR(NBP) ligada a uma imunoglobulina Fc ou uma porção sua.
12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de l a 11, CARACTERIZADO por a p7/75NTR(NBP) ter a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO 3.
13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de l a 12, CARACTERIZADO por a p75NTR(NBP) se ligar a qualquer um dos NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação (Ka) de cerca de 5 pM a cerca de 5 nM, medido por ressonância plasmônica de superfície a 20 ºC.
14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de l a 13, CARACTERIZADO por a p75NTR(NBP) ser para utilização separada, sequencial ou simultânea numa combinação com um segundo composto farmacologicamente ativo.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO por o segundo composto farmacologicamente ativo da combinação ser selecionado a partir de um analgésico opioide, um fármaco anti-inflamatório não esteróide (AINE), um sedativo barbitúrico, uma benzodiazepínico com ação sedativa, um antagonista de Hl com ação sedativa, um sedativo como glutetimida, meprobamato, metaqualona ou dicloralfenazona; um relaxante do músculo esquelético; um antagonista do receptor de NMDA, um alfa-adrenérgico, um antidepressivo tricíclico, um anticonvulsivo, um antagonista de taquiquinina (NK), particularmente um antagonista de NK-3, NK-2 ou NK-l, um antagonista muscarínico, um inibidor seletivo de COX-2, um analgésico do alcatrão de carvão, em particular paracetamol; um neuroléptico, um agonista ou antagonista do receptor vaniloide; um beta-adrenérgico; um anestésico local; um corticosteróide; um agonista ou antagonista do receptor 5-HT; um antagonista do receptor 5-HT2A; um analgésico colinérgico (nicotínico); Tramadol6; um inibidor de PDEV; um canabinoide; antagonista metabotrópico do receptor do glutamato subtipo 1 (MGluR1); um inibidor da recaptação de serotonina; um inibidor da recaptação de noradrenalina (norepinefrina); um inibidor duplo da recaptação de serotonina-noradrenalina; um inibidor indutível de óxido nítrico sintase (iNOS); um inibidor de acetilcolinesterase; um antagonista de prostaglandina E2 subtipo 4 (EP4); um antagonista de leucotrieno B4; um inibidor de 5-lipoxigenase; um bloqueador de canais de sódio; ou um antagonista 5-HT3, e os seus sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, CARACTERIZADO pelo medicamento ser formulado para administração oral, sublingual, bucal, tópica, retal, por inalação, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intra- arterial, intramuscular, Intra-óssea, intra-sinovial, intradérmica, intraperitoneal, transmucosa, vaginal,
intravítrea, intra-articular, peri-articular, local ou epicutânea.
17. Uso de um ácido nucléico que codifica uma p75NTR(NBP), CARACTERIZADO por ser para o preparo de um medicamento para o tratamento de osteoartrite, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. Uso de um vetor de expressão replicável para transfectar uma célula compreendendo um ácido nucléico codificando um Pp7S5NTR(NBP), CARACTERIZADO por ser para o preparo de um medicamento para o tratamento de osteoartrite, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
19. Uso de uma célula hospedeira que expressa uma p75NTR(NBP), CARACTERIZADO por ser para o preparo de um medicamento para o tratamento de osteoartrite, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
20. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA por compreender a Pp7S5NTR(NBP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou a molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 17, ou o vetor de expressão replicável de acordo com a reivindicação 18, ou a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 19, e um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente.
21. Kit CARACTERIZADO por compreender: a. a p75NTR(NBP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou a molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 17, ou o vetor de expressão replicável de acordo com a reivindicação 18, ou a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 19, Ou a composição farmacêutica da reivindicação 20 ; e b. instruções para a administração de uma quantidade efetiva de p75NTR(NBP), molécula de ácido nucléico, vetor de expressão replicável ou composição farmacêutica a um indivíduo para qualquer um ou mais da prevenção Ou tratamento de osteoartrite e/ou um sintoma de osteoartrite ou para melhorar, controlar, reduzir àa incidência, ou atrasar ou reverter o desenvolvimento ou progressão da osteoartrite e/ou um sintoma de osteoartrite.
22. Método de tratamento e/ou prevenção da osteoartrite e/ou de um sintoma de osteoartrite num indivíduo CARACTERIZADO por compreender a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da pPp75NTR(NBP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou a molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 17, ou o vetor de expressão replicável de acordo com a reivindicação 18, ou a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 19, ou a composição farmacêutica da reivindicação 20, opcionalmente compreendendo ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO por a p75NTR(NBP) compreender uma pPp75NTR(NBP) ligada a uma imunoglobulina Fc ou uma porção sua.
24. Proteína de ligação de neurotrofina p75NTR (p75NTR(NBP)) CARACTERIZADA por ser para o uso no tratamento da osteoartrite conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
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