KR20230004967A - P75ntr 뉴로트로핀 결합 단백질의 치료학적 용도 - Google Patents

P75ntr 뉴로트로핀 결합 단백질의 치료학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골관절염의 치료에서의 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질 및 관련된 분자의 새로운 치료학적 용도에 관한 것이다.

Description

P75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질의 치료학적 용도{THERAPEUTIC USE OF P75NTR NEUROTROPHIN BINDING PROTEIN}
본 발명은 골관절염 치료에 있어서 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질 및 관련된 분자들의 새로운 치료학적 용도에 관한 것이다.
골관절염은 관절이 퇴화되어 관절의 통증, 압통, 강직 및 잠금을 야기하는 일련의 상태이다. 골관절염은 전 세계 수백만의 사람들에게 영향을 미치는 관절염의 가장 일반적인 형태이다.
이 상태는 일반적으로 자가 회복이 불충분한 관절에서 연골에 대한 기계적 손상의 결과인 것으로 받아들여진다. 염증, 통증 및 부기(swelling)를 초래하고 또한, 연골의 손실은 증상을 악화시키는 뼈의 돌출(outgrowths)(골증식체(osteophytes))의 형성을 초래할 수 있고 관절의 협착 및 왜곡을 초래할 수 있다. 연골 손상 및 손실의 정확한 메커니즘은 정확하게는 이해되어 있지 않으며 여러 요소가 조합된 결과일 수 있다.
골관절염의 치료는 상태의 관리에 국한되며, 이용할 수 있는 치유적 치료 옵션은 없다. 이 퇴행성 질환의 진행을 멈추게 하는 치료법도 또한 보고된 바가 없다. 관리 옵션에는 물리치료, 진통제 투여 및/또는 항염증약의 투여, 경우에 따라 수술에 의한 관절 치환술이 포함된다.
뉴로트로핀, 신경영양성 성장 인자(neurotrophic growth factor)(NGF), 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor)(BDNF), 뉴로트로핀 3(NT-3) 및 뉴로트로핀 4/5(NT-4/5)는 4개의 수용체를 통해 작용한다: 저 친화성 p75 뉴로트로핀 수용체(p75NTR), 및 고 친화성 티로신 키나아제 수용체; TrkA, TrkB 및 TrkC. 저 친화성 수용체 p75NTR은 4개의 뉴로트로핀 전부에 의해 결합하고 활성화되며 다른 수용체로부터 독립적으로 기능하는 것이 보고되어 있다. 그렇지만, Trk 수용체는 더 선택적으로 활성화된다. 즉 NGF는 TrkA에 대한 선택적 리간드이고, BDNF는 TrkB에 대한 리간드이고, NT-3, 4/5는 TrkC에 대한 리간드이다. 또한 p75NTR과 Trk 단백질이 공동발현되었을 때, 그들은 복합체를 형성하고, 이는 양 수용체의 시그널링(signaling)을 변경하는 것이 보고되어 있다(Huang and Reichardt, 2003). 사실, p75NTR은 그들 각각의 Trk 수용체에 대해 각각의 뉴로트로핀의 선택성을 촉진하는 것이 제시되어 있다.
p75NTR은 종양괴사인자 수용체 수퍼패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily(TNFR-SF))의 구성원이고, 완전하게 특징지어진 이 수퍼패밀리의 첫 번째 구성원이다. 수퍼패밀리(인간의 일부 30개 유전자에 의해 엔코드된)는 p75NTR에서 첫 번째로 동정된 40 아미노산 시스테인-풍부 도메인(CRD)의 반복체가 하나 이상(전형적으로 4개)으로 구성된 리간드-결합 도메인으로 규정된다(Johnson et al., 1986; Radeke et al., 1987). 대조적으로, 시퀀스 모티프(sequence motif)는 모든 TNFR-SF 패밀리 멤버의 세포내 도메인에 의해 공유되지 않는다. 결론적으로, TNFR-SF 단백질의 시그널링 메카니즘은 상당히 다양하다.
트랜스멤브레인 도메인 내에서 시스테인 잔기(cysteinyl residues)를 통해 형성된, p75NTR 구조의 특이한 특징은 디설파이드-연결된 p75NTR 다이머의 존재이다. 이 디설파이드 결합은 p75NTR에 의해 효과적인 뉴로트로핀-의존 시그널링을 위해 요구되며 세포내 및 세포외 도메인의 형성에서 중요한 역할을 한다(Vilar et al., 2009b). 뉴로트로핀은 대략 5분의 분포 반감기(distribution half-life)로 비공유결합으로 연결된 다이머로서 생리학적으로 존재한다(Tria et al., 1994). 뉴로트로핀-의존 p75NTR 활성화는 p75NTR 다이머의 두 개의 세포외 도메인의 CRDs 2-4와 뉴로트로핀 다이머의 연계(association)를 수반한다(He and Garcia, 2004). 세포내 도메인을 디설파이드 결합 중심에서 달패이용 집게 같은 동작으로 서로 벌어지게 강제하고 시그널링 어댑터 단백질, NRIF 및 TRAF6로 세포내 도메인의 연계를 허용하는 최근 연구는 뉴로트로핀 결합이 p75NTR 다이머의 두 개의 세포외 도메인이 서로 더 가깝게 이동하게 한다는 모델을 지지한다(Vilar et al., 2009a, 2009b). 예를 들어 p75NTR에 존재하는 것과 같은, 인트라-트랜스맴브레인 도메인 디설파이드 결합은 다른 TNFR-SF 패밀리 구성원에서 또는 어떠한 다른 멤브레인 단백질에서 이전에 언급된 적이 없다.
p75NTR은 α-세크레타아제와 γ-세크레타아제 활성과 기질 메탈로단백질분해효소(matrix metalloproteinases(MMPs))에 의해, 노치와 β-아밀로이드 전구체 단백질의 절단-의존성 시그널링 경로와 유사한 방식으로, 그것의 세포내 도메인(intracellular domain(ICD))을 세포질 내로 방출하는 연속적 단백질분해 절단(sequential proteolytic cleavage)을 수행한다(Jung et al., 2003; Kanning et al., 2003). 이 경로에 의한 p75NTR ICD의 세포질 방출은 연결된 NRIF에 의해 시그널링을 촉진한다(Kenchappa et al., 2006). α-세크레타아제와 γ-세크레타아제 활성과 MMPs에 의한 단백질 분해 절단 후, p75NTR의 세포외 도메인의 역할은 완전하게 이해되어 있지 않다.
NGF와 다른 뉴로트로핀(BDNF, NT-3 및 NT-4/5)은 예를 들어 골관절염, 췌장염, 류마티스 관절염, 건선, 소양증 및 다발성 경화증에 기인하는 통증 병리학에서 매우 중요한 역할을 한다(Watanabe et al., 2010; Raychaudhuri et al., 2011; Barthel et al., 2009; Truzzi et al., 2011; McDonald et al., 2011; Yamaoka et al., 2007). 뉴로트로핀 중 어느 것이나 선택적 항체가 입증되었다; NGF 또는 BDNF, NT-3 및 NT-4/5는 통증을 현저하게 감소시킨다. 게다가, 뉴로트로핀 수용체 p75NTR, TrkA, TrkB 또는 TrkC에 직결된 항체는 또한 통증 모델에서 효과적인 것으로 입증되었다(Orita S et al., 2010; Svensson P et al., 2010; Iwakura et al., 2010; Cirilio et al., 2010; Pezet et al., 2010; Hayashi et al., 2011; Chu et al., 2011; Ueda et al., 2010; Ghilardi et al., 2010; Fukui et al., 2010). 통증 모델(좌골 신경 크러쉬 후에 나타나는 기계적 이질통)에서 후쿠이 등(Fukui et al.,)(2010)은 항-p75NTR 항체로 치료 후 통증 관련 종점에서 상당한 효능을 입증하였다. 이 연구로부터 p75NTR 저해 항체로 하는 치료가 통증의 상당한 감소를 가져오게 하는 CGRP와 p75NTR 발현을 감소시켰다고 결론지었다.
본 발명은 골관절염 치료에 있어서 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질 및 관련된 분자들의 새로운 치료학적 용도를 제공하려고 한다.
본 발명은 p75NTR의 세포외 도메인이 골관절염 치료에 유용하다는 것을 입증한다. p75NTR의 세포외 도메인은 질환의 진행을 멈추고 역전까지 시키는 것으로 나타났다.
따라서, 제1 태양으로, 골관절염 치료에 사용하기 위한 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(p75NTR neurotrophin binding protein)(p75NTR(NBP))이 제공된다.
바람직한 구현예에서, 골관절염의 치료는 골관절염 증상의 경감을 포함한다. 바람직하게, 골관절염 증상의 경감은 통증, 염증, 부기, 압통, 관절 강직의 감소 또는 관절 가동성의 증가 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특히 바람직한 구현예에서, 골관절염의 치료는 질환 진행의 둔화 또는 억제 및/또는 연골 손실의 감소를 포함한다. 바람직하게 골관절염의 치료는 질환 진행의 역전, 연골의 재성장 및/또는 치유적 치료를 포함한다. 바람직하게는 질병 진행은 연골 손실률 또는 재성장률에 의해 결정된다. 다른 바람직한 구현예에서, 질환 진행은 관절 내에 존재하는 연골세포(chondrocyte)의 수를 측정하는 것에 의해 모니터될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 골관절염의 치료는 예방을 위한 치료를 포함한다.
바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 인간 p75NTR(NBP)이다.
다른 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 하나 이상의 보조 분자에 연결된 p75NTR(NBP)를 포함한다. 바람직하게, 하나 이상의 보조 분자는 (a) 트랜스페린 또는 그것의 부분(portion); (b) 알부민 또는 그것의 부분; (c) 면역글로불린 Fc 또는 그것의 부분; 또는 (d) 폴리에틸렌글리콜 폴리머 사슬로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 하나 이상의 링커를 통해서 하나 이상의 보조 분자에 연결된다.
특히 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 SEQ ID No. 3에 따른 아미노산 서열을 가진다.
특히 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 20℃에서 표면플라즈몬공명에 의해 측정된 약 5pM에서 약 5nM 사이의 결합 친화도(Kd)로 NGF, BDNF, NT3 또는 NT4/5 중 어느 것에 결합한다.
바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 제2의 약학적으로 활성인 화합물과 결합되는 조합에서 개별, 연속 또는 동시 사용을 위한 것이다. 바람직하게 상기 조합에서 제2의 약학적으로 활성인 화합물은, 오피오이드 진통제, 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 바비츄레이트 진정제(barbiturate sedative), 진정 작용을 갖는 벤조디아제핀, 진정 작용을 갖는 H1 길항체, 글루테티미드, 메프로바메이트, 메타쿠알론 또는 디클로랄페나존과 같은 진정제; 골격근 이완제; NMDA 수용체 길항제, 알파-아드레날린성 약, 삼환계 항우울제, 항경련제, 타치키닌(NK) 길항제, 특히 NK-3, NK-2 또는 NK-1 길항제, 무스카린성 길항제, COX-2 선택적 저해제, 콜타르 진통제, 특히 파라세타몰; 신경이완성 바닐로이드 수용체 작용제 또는 길항제; 베타-아드레날린성 약; 국소 마취제; 코르티코스테로이드; 5-HT 수용체 작용제 또는 길항제; 5-HT2A 수용체 길항제; 콜린성(니코틴성) 진통제; 트라마돌(Tramadol®); PDEV 저해제; 카나비노이드; 대사형 글루타메이트 아형 1 수용체(metabotropic glutamate subtype 1 receptor)(mGluR1) 길항제; 세로토닌 재흡수 저해제; 노르아드레날린(노르에피네프린) 재흡수 저해제; 듀얼 세로토닌-노르아드레날린 재흡수 저해제; 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase)(iNOS) 저해제; 아세틸콜린에스테라아제 저해제; 프로스타글란딘 E2 아형 4(EP4) 길항제; 류코트리엔 B4 길항제; 5-리폭시게나아제 저해제; 나트륨 채널 차단제; 또는 5-HT3 길항제, 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로부터 선택된다.
바람직하게, p75NTR(NBP)는 경구, 설하, 구강(buccal), 국소적(topical), 직장, 흡입, 경피, 피하, 정맥주사, 동맥내, 근육내, 심장내, 골수내, 활액막내, 피내(intradermal), 복강내, 경점막(transmucosal), 질, 유리체내(intravitreal), 관절내, 관절 주위(peri-articular), 로컬(local) 또는 에피큐테니어스(epicutaneous) 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 다른 태양에서, 상기 규정된 바와 같은 골관절염의 치료에서 사용하기 위한 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(p75NTR(NBP))을 엔코딩하는 핵산이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 규정된 바와 같은 골관절염의 치료에서 사용하기 위한 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(p75NTR(NBP))을 엔코딩하는 핵산을 포함하는, 세포를 트랜스팩션하기 위한 복제가능한 발현 벡터가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 규정된 바와 같은 골관절염의 치료에서 사용하기 위한 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(p75NTR(NBP))을 발현하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 상기한 p75NTR(NBP), 핵산 분자, 복제가능한 발현 벡터, 또는 숙주 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양은 a. 상기한 p75NTR(NBP), 핵산 분자, 복제가능한 발현 벡터, 숙주 세포, 또는 약학적 조성물; 및 b. 개체에게 골관절염 및/또는 골관절염 증상의 예방 또는 치료 중 어느 하나 이상을 위한 또는 골관절염 및/또는 골관절염 증상의 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진행의 지연 또는 역전을 위한 p75NTR(NBP), 핵산 분자, 복제가능한 발현 벡터 또는 약학적 조성물의 유효량 투여에 관한 지시서를 포함하는 키트와 관련된다.
본 발명의 다른 태양에서, 상기한 p75NTR(NBP), 핵산 분자, 복제가능한 발현 벡터, 숙주 세포, 또는 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체의 골관절염 및/또는 골관절염 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 골관절염 치료에 있어서 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질 및 관련된 분자들의 치료학적 용도가 제공된다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고하여 더 이해될 수 있다.
도 1: MIA 또는 ETF-PBS의 주입 후 연골 면적의 손실 진행. 데이터 포인트는 평균±SEM, n=6이다.
도 2: 대조 항체(A, B) 또는 p75NTR 0.3 mg/kg(C, D), 1 mg/kg(E, F), 3 mg/kg(G, H)로 처치된 동물의 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 래트 무릎의 내측면(medial aspect). MIA의 관절 내 주입에 의해 각 동물의 왼쪽 무릎(A, C, E, G)에 실험적 골관절염이 유발되었다. 오른쪽 무릎에 ETF-PBS(대조군: B, D, F, H)를 주입하였다. (X4 배율) 왼쪽 및 오른쪽 무릎 이미지의 각 세트는 대측성 대조를 보여주기 위해 개별 동물로부터 찍은 것이다.
도 3: 대조 항체(A, B) 또는 p75NTR 3 mg/kg(C, D)로 처치된 동물의 사프라닌 O로 염색된 래트 무릎의 내측면. MIA의 관절 내 주입에 의해 각 동물의 왼쪽 무릎(A 및 C)에 실험적 골관절염이 유발되었다. 오른쪽 무릎에 ETF-PBS(대조군; B 및 D)를 주입하였다. (X4 배율) 왼쪽 및 오른쪽 무릎 이미지의 각 세트는 대측성 대조를 보여주기 위해 개별 동물로부터 찍은 것이다.
도 4: 26일째에 뒤쪽 무릎 관절의 총 연골 면적(연골 표면에서부터 석회화된 연골과 연골하골 사이의 경계까지). 대조 항체와 비교되는 유의차는, 따라서 *P<0.1 및 **P<0.05로 표시된다.
도 5: 처치 26일 후 뒤쪽 무릎 관절에서 역치 흡수 파장(threshold absorption wavelength) 130nm에서 사프라닌 O로 염색된 연골 면적. 데이터는 평균±SEM, n=6이고, 대조 항체와 비교되는 유의 차는 따라서 **P<0.05로 나타내어진다.
도 6: p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 1)의 아미노산 서열. 알파 및 감마 세크레타제 절단 부위는 굵은 글씨체로 나타내어져 있다. IgG1 Fc 부분은 이탤릭체로 나타내어져 있다.
도 7: 도 9에서 제시된 핵산 서열(SEQ ID No. 4)의, 개시 코돈에서 정지 코돈까지, 번역 산물(SEQ ID No. 2).
도 8: 바람직한 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 3)의 아미노산 서열. IgG1 Fc 부분은 이탤릭체로 나타내어져 있다. p75NTR(NBP)와 Fc 부분 사이의 링커 서열은 밑줄이 그어져 있다.
도 9: 5' 클로닝 부위에서 3' 클로닝 부위까지 전체 생산 유전자의 핵산 서열(SEQ ID No. 4)
도 10: p75-NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 변이체(variants): 1: p75_NTR - p75-NTR 서열(SEQ ID No. 6); 2: 시판 중인 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 7); 3: p75_Fc - IgG1za의 론자(Lonza) 불변 영역의 Fc 서열로 변형된 Fc 서열을 갖는 시판 중인 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 8); 4: p75_Fc_C222S - IgG1za의 론자 불변 영역의 Fc 서열로 변형된 Fc 서열 및 222번 위치에 부가적인 시스테인에서 세린으로의 변이가 있는 시판 중인 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 9); 5: p75_Fc_G4x1 - 변이체 1, 네 개의 잔기 글리신 링커를 갖는, 제안된 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 10); 6: p75_Fc_G4Sx1 - 변이체 2, 단일 테트라-글리신 세린 링커를 갖는, 제안된 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 11); 7: p75_Fc_G4Sx2 - 변이체 3, 두 개의 테트라-글리신 세린 링커를 갖는, 제안된 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 12); 8: IgG1za의 론자 불변 영역(SEQ ID No. 13).
이 배열에서, 포맷 스킴은 추정 수용체, Fc-융합 단백질 및 Fc 불변 영역 사이의 유사 영역(regions of similarity)을 강조하는데 사용된다: 상자형은 변이체 단백질과 p75-NTR 사이의 동일한 서열의 영역을 나타내기 위해 사용되며; 단선의 밑줄은 모든 Fc-융합 단백질과 론자 IgG1za Fc 사이의 동일한 서열의 영역을 나타내기 위해 사용되며; 이탤릭체는 p75-NTR과 Fc 불변 영역의 접합부에서 링커 영역을 나타내는 데 사용되고; 이중 밑줄 및 굵은 글자체는, 부모 p75-NTR Fc 융합 단백질의 222와 동등한 위치에서, 링커 영역 외부의 동일하지 않은 서열의 위치를 나타내기 위해 사용된다.
도 11: SEQ ID No. 14, 인간 p75NTR 전체 아미노산 서열
도 12: SEQ ID No. 15, 신호 서열을 포함하는 인간 p75NTR 세포외 도메인
도 13: SEQ ID No. 16, 신호 서열이 없는 인간 p75NTR 세포외 도메인
도 14: SEQ ID No. 17, 인간 p75NTR(NBP) 뉴로트로핀 결합 도메인 1
도 15: SEQ ID No. 18, 인간 p75NTR(NBP) 뉴로트로핀 결합 도메인 2
도 16: SEQ ID No. 19, 인간 p75NTR(NBP) 뉴로트로핀 결합 도메인 3
도 17: SEQ ID No. 20, 인간 p75NTR(NBP) 뉴로트로핀 결합 도메인 4
도 18: SEQ ID No. 21, 인간 p75NTR(NBP) 뉴로트로핀 결합 도메인 5
도 19: SEQ ID No. 22, 인간 트랜스페린
도 20: SEQ ID No. 23, 인간 알부민
도 21: SEQ ID No. 24, 인간 Fc IgG1
도 22: SEQ ID No. 25, 인간 Fc IgG2
도 23: SEQ ID No. 26, 인간 Fc IgG3
도 24: SEQ ID No. 27, 인간 Fc IgG4
도 25: SEQ ID No. 28, 연장된 혈청 반감기를 위해 설계된 인간 Fc 단편(Fragment)
도 26: SEQ ID No. 29, 이펙터 기능(Effector Functions)의 결여를 위해 설계된 인간 Fc 단편
도 27: SEQ ID No. 30, p75NTR(NBP)-Fc 링커
도 28: SEQ ID No. 31, p75NTR(NBP)-Fc 링커
도 29: SEQ ID No. 32, p75NTR(NBP)-Fc 링커
도 30: 0일째 평균 체중. 그램 중량은 평균±표준 편차로 나타내었다. 그룹 1의 동물은 1 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 2는 3 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 3은 0.3 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 4는 3 mg/kg PG-007로, 그리고 그룹 5는 3 mg/kg 대조군 IgG Fc로 처치되었다.
도 31: 실시예 3에 기재된 8주 연구 동안 래트의 평균 체중. 그램 중량은 평균±표준 편차로 나타내었다. 그룹 1의 동물은 1 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 2는 3 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 3은 0.3 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 4는 3 mg/kg PG-007로, 그리고 그룹 5는 3 mg/kg 대조군 IgG Fc로 처치되었다.
도 32: 테스트 제제로 처치한 후 시간 경과에 따라 결정된 자발통 측정. 데이터는 각 시점(35일에서 56일까지)에서 각 동물에 대해 나타낸다. 그룹 1의 동물은 1 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 2는 3 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 3은 0.3 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 4는 3 mg/kg PG-007로, 그룹 5는 3 mg/kg 대조군 IgG Fc로, 그룹 6은 ETF-PBS로 처치하고, 그리고 그룹 7은 처치하지 않았다(naive). 0.5의 이론적 평균에 대한 1 샘플 t-검정에 대해 *p<0.05 및 **p<0.01.
도 33: 테스트 제제로 처치한 후 시간 경과에 따라 결정된 자발통 측정. 데이터는 각 시점(35일에서 56일까지)에서 각 동물에 대해 나타낸다. 그룹 1의 동물은 1 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 2는 3 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 3은 0.3 mg/kg p75NTR-Fc로, 그룹 4는 3 mg/kg PG-007로, 그룹 5는 3 mg/kg 대조 IgG Fc로, 그룹 6은 ETF-PBS로 처치하고, 그룹 7은 처치하지 않았다. 0.5의 이론적 평균에 대한 1 샘플 t-검정에 대해 *p<0.05 및 **p<0.01.
도 34: 0일째에 무릎 내로 저(low) MIA 또는 ETF-PBS 주입 후 28일째부터 56일째까지 3 mg/kg 대조 IgG-Fc로 처치된 동물의 사프라닌 O 패스트(fast) 그린으로 염색된 래트 무릎의 내측면(X4 배율). 대표적인 이미지는 3 mg/kg 대조 IgG-Fc로 처치된 동물로부터 촬영한 것이다. 왼쪽과 오른쪽 무릎 이미지의 각 세트는 대측성 대조를 보여주기 위해 하나의 개별 동물에서 촬영한 것이다.
도 35: 0일째에 무릎 내로 저 MIA 또는 ETF-PBS 주입 후 28일째부터 56일째까지 3 mg/kg PG-007로 처치된 동물의 사프라닌 O 패스트 그린으로 염색된 래트 무릎의 내측면(X4 배율). 대표적인 이미지는 3 mg/kg PC-007로 처치된 동물로부터 촬영한 것이다. 왼쪽과 오른쪽 무릎 이미지의 각 세트는 대측성 대조를 보여주기 위해 하나의 개별 동물에서 촬영한 것이다.
도 36: 0일째에 무릎 내로 저 MIA 또는 ETF-PBS 주입 후 28일째부터 56일째까지 3 mg/kg p75NTR-Fc로 처치된 동물의 사프라닌 O 패스트 그린으로 염색된 래트 무릎의 내측면(X4 배율). 대표적인 이미지는 3 mg/kg p75NTR-Fc로 처치된 동물로부터 촬영한 것이다. 왼쪽과 오른쪽 무릎 이미지의 각 세트는 대측성 대조를 보여주기 위해 하나의 개별 동물에서 촬영한 것이다.
도 37: 0일째에 무릎 내로 저 MIA 또는 ETF-PBS 주입 후 28일째부터 56일째까지 1 mg/kg p75NTR-Fc로 처치된 동물의 사프라닌 O 패스트 그린으로 염색된 래트 무릎의 내측면(X4 배율). 대표적인 이미지는 1 mg/kg p75NTR-Fc로 처치된 동물로부터 촬영한 것이다. 왼쪽과 오른쪽 무릎 이미지의 각 세트는 대측성 대조를 보여주기 위해 하나의 개별 동물에서 촬영한 것이다.
도 38: 0일째에 무릎 내로 저 MIA 또는 ETF-PBS 주입 후 28일째부터 56일째까지 0.3 mg/kg p75NTR-Fc로 처치된 동물의 사프라닌 O 패스트 그린으로 염색된 래트 무릎의 내측면(X4 배율). 대표적인 이미지는 0.3 mg/kg p75NTR-Fc로 처치된 동물로부터 촬영한 것이다. 왼쪽과 오른쪽 무릎 이미지의 각 세트는 대측성 대조를 보여주기 위해 하나의 개별 동물에서 촬영한 것이다.
도 39: 연골 병리 등급(grades). PG007의 투여는 조직학적으로 유의한 효능 효과를 나타내지 않았다. P75NTR-Fc는 0.3 및 1.0 mg/kg에서 연골 보호chondroprotection)에 현저한 효능을 보였다. 3.0 mg/kg에서의 효능 프로파일은 더 가변적이었으며, 그룹의 50%가 대조군과 오버레이를 보였다.
도 40: 연골하골 등급. PG007의 투여는 3.0 mg/kg P75NTRFc로 관찰된 프로파일과 유사하게 대조군에 비해 연골하골 병리에서 조직학적으로 유의한 증가와 관련되었다. 대조적으로, 0.3 및 1.0 mg/kg에서 P75NTR-Fc의 투여는 연골하골 조직학에서 현저한 개선과 관련되었다.
도 41: 기질 공동(stromal cavity) 등급. PG007의 투여는 조직학적으로 유의한 효능 효과와 관련이 없었다. 대조적으로, P75NTR-Fc의 투여는 0.3 및 1.0 mg/kg에서의 효과가 가장 두드러졌으며, 두 그룹 모두 거의 정상 수준으로 병리를 감소시키긴 했지만, 모든 투여량의 P75NTR-Fc의 투여는 골용해성 병리의 감소 및 기질 공동의 확장(expansion)과 관련이 있었다.
도 42: 해면골(cancellous bone) 등급. PG007의 투여는 두 개의 샘플이 대조 범위를 초과하면서, 대조군과 비슷하게 해면골 병리와 관련되었다. 대조적으로, P75NTR-Fc는 0.3 및 1.0 mg/kg 투여량 수준에서 해면골 병리를 현저하게 감소시켰다. 3.0 mg/kg에서 P75NTF-Fc는 더 가변적인 프로파일을 나타내었고, 다수의 샘플은 대조군과 오버레이를 보였다.
도 43: 골수세포 과다(bone marrow hyper-cellularity). PG007의 투여는 골수에서 골수 세포의 확장과 관련이 있으며, 네 개의 셈플이 최상단 또는 대조군을 초과하였다. P75NTR-Fc는 0.3 및 1.0 mg/kg 투여량에서 골수 세포질(marrow cellularity)을 감소시켰고 두드러진 특징인 골수의 확장은 감소되었다. 3.0 mg/kg 투여량은 억제 경향을 보이긴 했으나, 대조군에서 낮은 수준의 반응자(responder)와 오버레이를 보였다.
도 44: 다발성 뼈 경화증(multi-focal bone sclerosis). P75NTR-Fc 샘플은 대조 범위의 최상단을 향해 군집(clustering)을 보이긴 했지만, 연구 그룹 간에는 조직학적으로 유의한 차이가 없었다.
도 45: 골아세포 과형성(Osteoblast hyperplasia). 0.3 및 1.0 mg/kg의 P75NTR-Fc의 투여는, 골단 부위(epiphyseal zone)에서 특히 두드러지는 사열식상배열(palisading) 및 골아세포판(osteoblastic plate) 형성이 있는, 연골하골/연골 부위(zone)에서 조직학적으로 유의한 골아세포 증식과 관련이 있었다. 또한, 등급이 부여되지는 않았지만, 이 부위에는 눈에 띄는 '섬유아세포-유사(fibroblast-like)' 세포가 있었다. PG007과 P75NTR-Fc(3.0 mg/kg)는 조직학적으로 대조군과 유사하였다(도 45).
골관절염 증상은 염증, 통증 및 부기를 포함한다. 또한, 연골의 손실은 증상을 악화시키는 뼈의 돌출(골증식체)의 형성을 야기할 수 있고 관절의 협착 및 왜곡(distortion)을 야기할 수 있다. 치료 옵션은 현재 물리 치료, 진통제 투여 및/또는 항염증제 투여 및 경우에 따라 수술을 통한 관절 치환술을 포함한 질병 관리 옵션으로 제한된다. 지금까지 골관절염에 대한 치유적 치료 옵션이 보고된 바는 없다. 이 퇴행성 질환의 진행을 멈추게 하는 치료법도 보고된 바 없다. 따라서, 본 발명은 치유적 골관절염 치료에 대한 요구를 다루거나, 또는 적어도 골관절염의 퇴행을 막을 수 있는 치료법을 제공하려고 한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 골관절염의 허용된 동물 모델에서 p75NTR 뉴로트로 핀 결합 단백질(p75NTR(NBP))의 투여가 질병 진행을 중지시킬 뿐만 아니라 골관절염 진행에 기인하는 상당한 손상의 역전을 가져온다는 것을 알아내었다.
따라서, 첫 번째 태양에서, 골관절염 치료에서의 사용을 위한 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(p75NTR(NBP))이 제공된다.
바람직한 구현예에서, 골관절염의 치료는 골관절염 증상의 완화(relief)를 포함한다. 바람직하게 골관절염 증상의 완화는 통증, 염증, 부기, 압통, 관절 경직 또는 관절 이동성의 증가 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
특히 바람직한 구현예에서, 골관절염의 치료는 질병 진행의 지연 또는 억제 및/또는 연골 손실의 감소를 포함한다. 바람직하게는, 골관절염의 치료는 질병 진행의 역전, 연골 재성장 및/또는 치유적 치료를 포함한다. 바람직하게는 질병 진행은 연골 손실률 또는 재성장률에 의해 결정된다. 연골 손상의 비율은 MRI (Magnetic Resonance Imaging) 또는 X-레이 컴퓨터 단층 촬영(X-ray CT)을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 방법으로 모니터할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 질병 진행은 관절에 존재하는 연골 세포의 수를 측정함으로써 모니터할 수 있다.
여기서 사용된 용어 "치유적 치료(curative treatment)"는 환자를 질병 전 상태로 회복시키는 치료를 포함하는 것을 의도하고 있다. 이러한 치료는 질환 전 상태를 유지하기 위해 활성 화합물의 지속적인 투여를 요구할 수 있다. 또는 질병 전 상태에 도달하면 치유적 치료는 중지할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 치료는 일차 또는 이차 골관절염 중 하나이다. 일차 골관절염의 치료는 일차적으로 일반화된 결절성 골관절염과 침식성 골관절염 (EOA, 염증성 골관절염이라고도 함)의 치료를 포함한다.
골관절염의 치료는 또한 WOMAC 등급 분류 체계 또는 아우터브리지(Outerbridge) 분류 체계에 따라 분류된 질병 증상의 개선을 포함하는 것을 의도하고 있다. 바람직한 구현예에서, 골관절염의 치료는 질병 진행의 역전을 초래하여, 질병 단계(WOMAC 등급) 또는 등급(아우터브리지 분류)의 변화를 야기한다.
다른 바람직한 구현예에서, 골관절염의 치료는 예방적 치료를 포함한다.
특정의 바람직한 구현예서, p75NTR(NBP)는 인간 p75NTR(NBP)이다.
다른 바람직한 실시 양태에서, p75NTR(NBP)는 하나 이상의 보조 분자에 연결된 p75NTR(NBP)를 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 보조 분자는 (a) 트랜스페린 또는 그의 부분; (b) 알부민 또는 그의 부분; (c) 면역 글로불린 Fc 또는 그의 부분; 또는 (d) 폴리에틸렌 글리콜 중합체 사슬로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 하나 이상의 링커를 통해 하나 이상의 보조 분자에 연결된다. 바람직하게 링커는 (a) 공유 결합; (b) 비공유 결합; (c) 펩티드 결합; 또는 (d) 펩티드를 포함하는 하나의 아미노산 또는 복수의 아미노산으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 면역 글로불린 Fc 또는 그의 부분에, 선택적으로 링커를 통해, 연결된 p75NTR(NBP)를 포함한다.
p75NTR(NBP)가 하나보다 많은 보조 분자에 연결되는 경우, 선택적으로 각각의 보조 분자는 동일하거나 상이하거나 또는 동일 및 상이한 것의 혼합물이다. 유사하게, p75NTR(NBP)가 하나 이상의 링커를 통해 둘 이상의 보조 분자에 연결되는 경우, 선택적으로 각 링커는 동일하거나 상이하거나 또는 동일 및 상이한 것의 혼합물이다.
특히 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 SEQ ID No.3에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
특히 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 20℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 약 5 pM 내지 약 5 nM의 결합 친화도(Kd)로 NGF, BDNF, NT3 또는 NT4/5 중 어느 하나에 결합한다.
바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 제2의 약리학적 활성 화합물과 조합된 조합에서 별개의, 순차적인 또는 동시 사용을 위한 것이다. 바람직하게는 조합의 제2의 약리학적 활성 화합물은 오피오이드 진통제, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 바비츄레이트 진정제(barbiturate sedative), 진정 작용을 갖는 벤조디아제핀, 진정 작용을 갖는 H1 길항제, 글루테티미드, 메프로바메이트, 메타쿠알론 또는 디클로랄페나존과 같은 진정제; 골격근 이완제; NMDA 수용체 길항제, 알파-아드레날린성 약, 삼환계 항우울제, 항경련제, 타치키닌(NK) 길항제, 특히 NK-3, NK-2 또는 NK-1 길항제, 무스카린성 길항제, COX-2 선택적 저해제, 콜타르 진통제, 특히 파라세타몰; 신경이완성 바닐로이드 수용체 작용제 또는 길항제; 베타-아드레날린성 약; 국소 마취제; 코르티코스테로이드; 5-HT 수용체 작용제 또는 길항제; 5-HT2A 수용체 길항제, 콜린성(니코틴성) 진통제; 트라마돌(Tramadol®); PDEV 저해제; 카나비노이드; 대사형 글루타메이트 아형 1 수용체(metabotropic glutamate subtype 1 receptor)(mGluR1) 길항제; 세로토닌 재흡수 저해제; 노르아드레날린(노르에피네프린) 재흡수 저해제; 듀얼 세로토닌-노르아드레날린 재흡수 저해제; 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase)(iNOS) 저해제; 아세틸콜린에스테라아제 저해제; 프로스타글란딘 E2 아형 4(EP4) 길항제; 류코트리엔 B4 길항제; 5-리폭시게나아제 저해제; 나트륨 채널 차단제; 또는 5-HT3 길항제, 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로부터 선택된다.
바람직한 오피오이드 진통제는 모르핀, 헤로인, 하이드로모르폰, 옥시모르폰, 레보파놀, 레발로르판, 메타돈, 메페리딘, 펜타닐, 코카인, 코데인, 디하드로코데인, 옥시코돈, 하이드로코돈, 프로폭시펜, 날메펜, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프렌노르핀, 부토르파놀, 날부핀 또는 펜타조신을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
바람직한 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)는 아스피린, 디클로페낙, 디플루시날, 에토도락, 펜부펜, 페노프로펜, 플루페니살, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페남산, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 니메술리드, 니트로플루비프로펜, 올살라진, 옥사프로진, 페닐부타존, 피록시캄, 설파살라진, 설린닥, 톨메틴 또는 조메피락을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 바비츄레이트 진정제는 아모바르비탈, 아프로바르비탈, 부타바르비탈, 부타비탈, 메포바르비탈, 메타르비탈, 메토헥시탈, 펜토바르비탈, 페노바르티탈, 세코바르비탈, 탈부탈, 테아밀랄 또는 티오펜탈을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
진정 작용을 가지는 바람직한 벤조디아제핀은 클로르디아제폭시드, 클로라제페이트, 디아제팜, 플루라제팜, 로라제팜, 옥사제팜, 테마제팜 또는 트리아졸람을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
진정 작용을 가지는 바람직한 H1 길항제는 디펜히드라민, 피릴라민, 프로메타진, 클로르페니라민 또는 클로르사이클리진을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 진정제는 글루테티미드, 메프로바메이트, 메타쿠알론 또는 디클로랄페나존을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
바람직한 골격근이완제는 바클로펜, 카리소프로돌, 클로르족사존, 사이클로 벤자프린, 메토카르바몰 또는 오르프레나딘(orphrenadine)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
바람직한 NMDA 수용체 길항제는 덱스트로메토르판 ((+)-3-하이드록시-N-메틸모르피난) 또는 그의 대사 산물 덱스트로르판 ((+)-3-하이드록시-N-메틸모르피난), 케타민, 메만틴, 피롤로퀴놀린 퀸닌, 시스-4-(포스포노메틸)-2-피페리딘카르복실산, 부디핀, EN-3231(MorphiDex®, 모르핀과 덱스트로메토르판의 조합 제형(combination formulation)), 토피라메이트, 예를 들어 이펜프로딜, 트라소프로딜 또는 (-)-(R)-6-{2-[4-(3-플루오로페닐)-4-하이드록시-1-피페리디닐]-1-하이드록시에틸-3,4-디하이드로-2(1H)-퀴놀린과 같은 NR2B 길항제를 포함하는 네라멕산 또는 페르진포텔(perzinfotel)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 알파-아드레날린성 약은 독사조신, 탐설로신, 클로니딘, 구안파신, 텍스메타토미딘, 모다피닐, 또는 4-아미노-6,7-디메톡시-2(5-메탄-설폰아미도-1,2,3,4-테트라하이드록이소퀴놀-2-일)-5-(2-피리딜) 퀴나졸린을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
바람직한 삼환계 항우울제는 데시프라민, 이미프라민, 아미트립틸린 또는 노르트립틸린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 항경련제는 카르바메제핀, 라모트리진, 토피라메이트 또는 발프로에이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 타치키닌(NK) 길항제는 (αR,9R)-7-[3,5-비스(트리플루오로메틸)벤질]-8,9,10,11-테트라하이드로-9-메틸-5-(4-메틸페닐)-7H-[1,4]디아조시노[2,1-g][1,7]나프티리딘-6-13-디온(TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에톡시-3-(4-플로오로페닐)-4-모르폴리닐]-메틸]-1,2-디하이드로-3H-1,2,4-트리아졸-3-온(MK-869), 아프레피탄트, 라네피탄트, 다피탄트 또는 3-[[2-메톡시-5-(트리플루오로메톡시)페닐]-메틸아미노]2-페닐피페리딘(2S,3S)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 무스카린 길항제는 옥시부티닌, 톨테로딘, 프로피베린, 트롭시움 클로라이드, 다리페나신, 솔리페나신, 테미베린 및 이프라트로피움을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 COX-2 선택적 저해제는 셀레콕시브, 로페콕시브, 파레콕시브, 발데콕시브, 데라콕시브, 에토리콕시브 또는 루미라콕시브를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 콜-타르 진통제는 파라세타몰을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 신경이완제는 드로페리돌, 클로르프로마진, 할로페리돌, 페르페나진, 티오리다진, 메소리다진, 트리플루오페라진, 플루페나진, 클로자핀, 올란자핀, 리스페리돈, 지프라시돈, 퀘티아핀, 세르틴돌, 아리피프라졸, 소네피프라졸, 블로난세린, 일로페리돈, 페로스피론, 라클로프라이드, 조테핀, 비페프루녹스, 아세나핀, 루라시돈, 아미설프리드, 발라페리돈(balaperidone), 팔린도르(palindore), 에플리반세린, 오사네탄트(osanetant), 리모나반트, 메클리네르탄트(meclinertant), 미락시온(Miraxion®) 또는 사리조탄을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 바닐로이드 수용체 작용제(agonist)는 레신페라톡신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 바닐로이드 수용체 길항제는 캅사제핀을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 베타-아드레날린성 약은 프로프라놀롤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 국소 마취제는 멕실레틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 코르티코스테로이드는 덱사메타손을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 5-HT 수용체 작용제 또는 길항제는 특히 5-HT1B/1D 작용제는 엘레트립탄, 수마트립탄, 나라트립탄, 졸미트립탄 또는 리자트립탄을 포함하나, 이에 한정되지 않는다; 바람직한 5HT2A 수용체 길항제는 R(+)-알파-(2,3-디메톡시-페닐)-1-[2-(4-플루오로페닐에틸)]-4-피페리딘메탄올(MDL-100907)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 콜린성(니코틴성) 진통제는 이스프로니클린(TC-1734), (E)-N-메틸-4-(3-피리디닐)-3-부텐-1-아민(RJR-2403), (R)-5-(2-아제티디닐메톡시)-2-클로로피리딘(ABT-594) 또는 니코틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 PDEV 저해제는 5-[2-에톡시-5-(4-메틸-1-피페라지닐-설포닐)페닐]-1-메틸-3-n-프로필-1,6-디하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(실데나필), (6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-헥사하이드로-2-메틸-6-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-피라지노[2',1':6,1]-피리도[3,4-b]인돌-1,4-디온(IC-351 또는 타달라필), 2-[2-에톡시-5-(4-에틸-피페라진-1-일-1-설포닐)-페닐]-5-메틸-7-프로필-3H-이미다조[5,1-f][1,2,4]트라아진-4-온(바르데나필), 5-(5-아세틸-2-부톡시-3-피리디닐)-3-에틸-2-(1-에틸-3-아제티디닐)-2,6-디하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온, 5-(5-아세틸-2-프로폭시-3-피리디닐)-3-에틸-2-(1-이소프로필-3-아제티디닐)-2,6-디하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온, 5-[2-에톡시-5-(4-에틸피페라진-1-일설포닐)피리딘-3-일]-3-에틸-2-[2-메톡시에틸]-2,6-디하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온, 4-[(3-클로로-4-메톡시벤질)아미노]-2-[(2S)-2-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-일]-N-(피리미딘-2-일메틸)피리미딘-5-카르복스아미드, 3-(1-메틸-7-옥소-3-프로필-6,7-디하이드로-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)-N-[2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸]-4-프로폭시벤젠설폰아미드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 카나비노이드는 테트라하이드로카나비놀, 카나비놀, 카나비디올, 카나비제롤, 테트라하이드로카나비바린, 카나비디바린 및 카나비크로멘(cannabichromene)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 세로토닌 재흡수 저해제는 설트랄린, 설트랄린 대사 물질 데메틸설트랄린, 플루옥세틴, 노르플루옥세틴(플루옥세틴 데스메틸 대사 물질), 플루복사민, 파록세틴, 시탈로프람, 시탈로프람 대사 물질 데스메틸시탈로프람, 에스시탈로프람, d,l-펜플루라민, 페목세틴, 이폭세틴, 시아노도티에핀, 리톡세틴, 다폭세틴, 네파조돈, 세리클라민 및 트라조돈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 노르아드레날린(노르에피네프린) 재흡수 저해제는 마프로틸린, 로페프라민, 미르타제핀, 옥사프로틸린, 페졸라민, 토목세틴, 미안세린, 부플로프리온, 부프로프리온 대사 물질 하이드록시부프로프리온, 노미펜신 및 빌록사진(비발란(Vivalan®)), 특히 리복세틴, 특히 (S,S)-리복세틴과 같은 선택적 노르아드레날린 재흡수 저해제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 듀얼 세로토닌-노르아드레날린 재흡수 저해제는 벤라팍신, 벤라팍신 대사 물질 O-데스메틸벤라팍신, 클로미프라민, 클로미프라민 대사 물질 데스메틸클로미프라민, 듀록세틴, 밀나시프란 및 이미프라민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 저해제는 S-[2-[(1-이미노에틸)아미노]에틸]-L-호모시스테인, S-[2-[(1-이미노에틸)-아미노]에틸]-4,4-디옥소-L-시스테인, S-[2-[(1-이미노에틸)아미노]에틸]-2-메틸-L-시스테인, (2S,5Z)-2-아미노-2-메틸-7-[(1-이미노에틸)아미노]-5-헵텐산, 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴)-부틸]티오]-5-클로로-3-피리딘카르보니트릴, 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴)부틸]티오]-4-클로로벤조니트릴, (2S,4R)-2-아미노-4-[[2-클로로-5-(트리플루오로메틸)페닐]티오]-5-티아졸부탄올, 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴)부틸]티오]-6-(트리플루오로메틸)-3-피리딘카르보니트릴, 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴)부틸]티오]-5-클로로벤조니트릴, N-[4-[2-(3-클로로벤질아미노)에틸]페닐]티오펜-2-카르복스아미딘, 또는 글루아니디노에틸디설파이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 아세틸콜린에스테라아제 저해제는 도네페질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 프로스타글란딘 E2 아형 4(EP4) 길항제는 N-[({2-[4-(2-에틸-4,6-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-1-일)페닐]에틸}아미노)-카르보닐]-4-메틸벤젠설폰아미드 또는 4-[(1S)-1-({[5-클로로-2-(3-플루오로페녹시)피리딘-3-일]카르보닐}아미노)에틸]벤조산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 류코트리엔 B4 길항제는 1-(3-비페닐-4-일메틸-4-하이드록시-크로만-7-일)-시클로펜탄 카르복실산(CP-105696), 5-[2-(2-카르복시에틸)-3-[6-(4-메톡시페닐)-5E-헥세닐]옥시페녹시]발레르산(ONO-4057) 또는 DPC-11870을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 5-리폭시게나아제 저해제는 질류톤, 6-[(3-플루오로-5-[4-메톡시-3,4,5,6-테트라하이드로-2H-피란-4-일])페녹시-메틸]-1-메틸-2-퀴놀론(ZD-2138), 또는 2,3,5-트리메틸-6-(3-피리딜메틸)-1,4-벤조퀴놀론(CV-6504)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 나트륨 채널 차단제는 리도카인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 5-HT3 길항제는 온단세트론을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게 p75NTR(NBP)는 경구, 설하, 구강(buccal), 국소적(topical), 직장, 흡입, 경피, 피하, 정맥주사, 동맥내, 근육내, 심장내, 골수내, 활액막내, 피내, 복강내, 경점막(transmucosal), 질, 유리체내(intravitreal), 관절내, 관절주위, 로컬(local) 또는 에피큐테니어스(epicutaneous) 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 다른 태양에서, 상기 규정된 바와 같은 골관절염의 치료에서 사용하기 위한 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(p75NTR(NBP))을 엔코딩하는 핵산이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 규정된 바와 같은 골관절염의 치료에서 사용하기 위한 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(p75NTR(NBP))을 엔코딩하는 핵산을 포함하는, 세포를 트랜스팩션하기 위한 복제가능한 발현 벡터가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 규정된 바와 같은 골관절염의 치료에서 사용하기 위한 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(p75NTR(NBP))을 발현하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 상기한 p75NTR(NBP), 핵산 분자, 복제가능한 발현 벡터, 또는 숙주 세포, 및 약학적으로 허용 가능하는 담체 및/또는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
바람직한 약학적으로 허용가능한 담체는 [...]를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 태양은 a. 상기한 p75NTR(NBP), 핵산 분자, 복제가능한 발현 벡터, 숙주 세포, 또는 약학적 조성물; 및 b. 개체에게 골관절염 및/또는 골관절염 증상의 예방 또는 치료 중 어느 하나 이상을 위한 또는 골관절염 및/또는 골관절염 증상의 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진행의 지연 또는 역전을 위한 p75NTR(NBP), 핵산 분자, 복제가능한 발현 벡터 또는 약학적 조성물의 유효량 투여에 관한 지시서를 포함하는 키트와 관련된다.
본 발명의 다른 태양에서, 상기한 p75NTR(NBP), 핵산 분자, 복제가능한 발현 벡터, 숙주 세포, 또는 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체의 골관절염 및/또는 골관절염 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
실시예
실시예 1 - 비아코어(biacore)를 사용한 p75NTR의 친화도 측정
방법
p75NTR의 동력학 및 친화도는 Biacore T200(GE 헬스케어, 스웨덴)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 측정된다. 비아코어 방법은 Abdiche 및 동료들이 권장한 방법을 기반으로 한다(Abdiche, et al., 2008). 아민 커플링 키트에서 제공된 바와 같이 단백질 A(10mM 나트륨 아세테이트 버퍼 중 10㎍/mL)가 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드)(EDC) 및 N-하이드록시-석신이미드(NHS) 및 에탄올 아민을 사용하는 아민 커플링 방법에 의해 CM5 바이오센서 칩의 표면에 고정된다.
간략하게, 비아코어 기구의 아민-커플링 고정화 프로세스에 수반되는 단계는 하기와 같다:
· EDC 및 NHS를 1:1로 혼합한다.
· EDC/VHS 혼합물을 10μL/min으로 420초 동안 CM5 칩의 각각의 플로우 셀(flow cell)에 주입한다.
· 10mM 아세트산나트륨 버퍼 중의 단백질 A[10㎍/mL], pH 4.5를 10μL/min으로 420초 동안 같은 플로우 셀에 주입한다.
· 에탄올아민을 10μL/min으로 420초 동안 같은 플로우 셀에 주입한다.
대략 2200-2900 반응 유닛(response units(RU))이 고정된다. 하나의 플로우 셀이 블랭크(blank) 대조군으로 설정된다. 원하는 p75NTR RU 레벨(~400 RU; p75NTR의 분자량, 관련 뉴로트로핀 및 화학양론비를 이용하여 계산됨)을 달성하기 위해 10μL/min의 플로우 레이트로, p75NTR-Fc를 p75NTR(HBS-Ep 중 10μg/mL[0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M Nacl, 3mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20])의 30초 주입을 이용하여 15℃의 바이오 센서 칩의 다른 플로우 셀 위로 캡처한다. 리간드보다는 p75NTR을 고정화하는 것은 뉴로트로핀이 그들 본래의 상태에 있게 보장되도록 지원한다.
단일-사이클 동력학 연구를 뉴로트로핀 농도당 30μL/min으로 120초 동안 플로우 셀에 HBS-EP 버퍼 중의 뉴로트로핀의 농도를 증가시키면서 주입하여 수행한다. 마지막 뉴로트로핀 주입 후 해리 속도를 결정하기 위해 600초 동안 HBS-EP를 칩 위로 흘린다. 칩 센서 표면을 모든 새로운 주입 사이클에 앞서 30μL/min으로 60초 동안 10mM 글리신 HCl, pH 2를 주입하여 그들의 단백질 A 표면으로 다시 재생한다.
멀티-사이클 동력학 연구를 30μL/min으로 300초 동안 플로우 셀을 통해 가장 낮은 뉴로트로핀 농도를, 뒤이어 30μL/min으로 300초 동안 HBS-Ep 버퍼를 주입하여 수행한다. 그런 후 칩을 10mM 글리신 HCl, pH 2의 2×60초 주입으로 재생하고 뉴로트로핀 농도를 각각 증가하면서 사이클을 반복한다.
결과
p75NTR은 가역적으로 뉴로트로핀 NGF, BDNF, NT-3 및 NT-4에 결합한다. 비아코어를 이용하여 측정된 친화도가 표 1에 나타나 있다.
표 1: 네 개의 뉴로트로핀에 대한 p75NTR의 친화도
[표 1]
Figure pat00001
실시예 2 - 모노요오드아세테이트-유발 골관절염 연구
래트의 뒤쪽 무릎에 모노요오드아세테이트(monoiodoactetate(MIA))의 관절-내 주입에 의해 유발된 실험적인 골관절염은 골관절염의 잘 알려진 모델이다. 질환의 병리학적 진행 및 통증 거동이 보고되어 있다(Guzman, et al., 2003)(Fernihough, et al., 2004). 연골세포 사멸을 야기하는 MIA는 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소의 저해에 의해 당분해 작용(glycolysis)을 방해한다. 연골의 구조적 완전성(integrity)은 연골세포의 정상적인 기능에 의존하기 때문에, MIA-유발된 연골세포의 손실은 OA의 임상 조직병리학과 일치하는 연골 퇴화 및 연골하골의 변화를 야기한다(Janusz, et al., 2001; Kobayashi, et al., 2003; Naveen, et al., 2014). 0.3mg MIA의 주입은 10주의 기간에 걸쳐 연골의 손실을 유발한다. 연골 손실은 3주와 6주 사이에 가장 컸다(도 1).
쌍으로 수용되고 데이-2(Day-2)일에 200-250g의 체중이 나가는 44마리의 수컷 위스타(Wistar) 래트(Charles River, UK)를 각 처치군의 평균 체중이 비슷하도록 무작위로 한 쌍씩 처치하기 위해 배정했다. 0일째에 래트를 표 2에 나타낸 바와 같이 처치했다. 신선하게 준비된 인간 IgG(엔도톡신 프리 포스페이트 완충 식염수(endotoxin free phosphate buffered saline)[ETF-PBS] 중 3.25mg/mL) 및 p75NTR(EF-PBS 중 3.25mg/mL)를 피하로 투여했다. 실험실 인원은 연구 동안 동물들의 처치를 보지 못했다.
표 2: 처치군. MIA, 모노요오드아세테이트; IgG, 면역글로불린 G
[표 2]
Figure pat00002
세 시간 후 모든 동물을 이소플루오레인(isofluorane)으로 마취시킨다. 각각의 마취된 동물에게, 임의 스케줄에 따라, 오른쪽 무릎이나 왼쪽 무릎에 0.3mg MIA를 함유하는 50μL EF-PBS를 관절내 주입한다. 마취된 각 동물의 반대쪽 무릎에 50μL EF-PBS를 주입한다. 각각의 항체 또는 p75NTR 처치가 5일째 및 15일째에 더 투여된다.
연골 손실이 명백하고 활성적인, 데이 26일에 연구를 종료한다(도 1). 동물들을 이소플루오레인을 사용하여 마취시키고, 최종(terminal) 혈액 샘플을 심장 천자로 채취하여 혈장 샘플을 준비한다. 아래쪽 뒷다리 피부를 제거하고 근섬유 다발을 뼈로부터 분리하되 무릎에 그대로 두었다. 대퇴골, 비골과 경골을 절단하고 근육이 부착된 무릎을 10% 중성 완충 포르말린에 두었다. 조직 샘플을 조직학적 분석을 위한 처리 전에 48-72시간 동안 완충 포르말린에 보관했다.
조직 샘플을 포르말린 고정으로 야기되는 손상을 최소화하기 위해 수집 후 가능한한 빨리 표준 절차를 사용하여 광학 현미경용으로 준비했다. 샘플을 10일 동안 8% 포름산에서 석회질을 제거하고, 샨돈 시타델(Shandon Citadel) 조직 프로세서를 사용하여 처리하고 녹은 파라핀 왁스 내로 박아넣었다. 각각의 래트 무릎 조직 블록에서 얻은 최소 네 개의 절편(section)(10㎛)을, 자동화된 선형 염색 기계(Leica ST4040)를 이용하여 표준 해마톡실린 및 이오신(Haematoxylin and Eosin(H&E)) 염색하기 위해 처리한다. 절편들을 사프라닌 O를 이용하여 더 염색한다. 슬라이드를 4배 또는 10배 배율로 관찰하고 이미지 분석은 컴퓨터화된 시스템을 이용하여 수행한다. 연골 표면에서부터 석회질화된 연골과 연골하골 사이의 경계까지, 전체 연골 면적을 측정한다. 조직 절편에 결합된 염색(stain)의 광흡수를 디지탈 농도계(digital densitometry)로 단색광하에서 정량화한다. 사프라닌 O에 의한 글리코사미노글리칸의 적색 염색의 강도를, 흡수 역치가 130nm로 설정되었을 때 염색된 연골 면적을 측정하여 정량화한다.
혈장에서 대조군 항체 및 외인성 p75NTR의 농도를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하여 인간 IgG를 측정하여 추산한다.
결과 - MIA 유발 OA 후의 무릎의 조직학적 변화에 대한 p75NTR의 효과
모든 처치군의 동물에서 ETF-PBS를 주입한 무릎에서는 조직 퇴화나 OA의 특징이 관찰되지 않았다(도 2B, D, F, H, 도 3B, D, F, H). 대조적으로, 대조 항체로 처치된 동물의 MIA 주입 무릎은, 종종 관절 연골의 전체 두께에 수반되는, 경한 연골 세포 퇴화 영역이 보였다(도 2A). 일부 영역에서, 백혈구 축적으로 표시되는 최근 염증 반응의 증거가 있었다. p75NTR 처치는 OA 진행을 가속화하지 않았다(도 2C, E, G). 대조 항체로 처치된 동물들과 비교해서 p75NTR로 처치된 낮은(low) MIA 처치된 무릎의 구조에서, 상해로부터의 보호 또는 손상의 복구(repair)를 나타내는, 더 작은 조직학적 변화가 있었다. 이것은 시험된 모든 p75NTR 농도(0.3~3.0 mg/kg)에서 분명했다. 실제로, p75NTR-Fc의 최대 투여량으로 처치된 동물은 연골 면적의 유의한(P<0.05) 증가가 있었다(OA에서 p75NTR-Fc 유발된 복구의 증거. 도 4참조).
MIA 유발 OA 후 무릎 내 프로테오글리칸(proteoglycan) 밀도에 대한 p75NTR의 영향
MIA-처치된 무릎의 전체 연골 면적은 p75NTR-Fc로 처치한 동물들에서 개선되었다: 이것은 관절 내(intra-articular) 주입 후 26일째에 상응하는 대조군 동물에 비교해서 p75NTR-Fc 3.0mg/kg으로 처치한 동물에 대해 유의하게 달랐다(P<0.05)(도 4).
연골의 글리코사미노글리칸 함량에 비례하는, 이미지 분석으로 평가된, 사프라닌 O 염색의 강도는 처치군들 사이에 현저한 차이(P<0.05)를 나타내었다(도 5). 130nm의 흡수 역치를 이용하여, MIA-처치 무릎에서의 연골의 20%만이 반대측 무릎과 비교되는 대조군 항체로 처치된 동물에서 130nm 역치를 초과하는 적색-염색되었으며, 이는 글리코사미노글리칸의 실질적인 손실을 나타낸다. 대조적으로, p75NTR-Fc를 수용한 동물들의 MAI-처치된 무릎에서의 연골의 대략 50%가 130nm 역치를 넘었다(도 5). 이것은 p75NTR-Fc가 MIA 주입 후 연골의 구조적 완전성의 계속 진행 중인 손실을 방지하고, 게다가 OA에서 질병 변형(modification)을 방지한다는 것을 나타낸다.
실시예 3 - PG-007에 비교되는 래트의 골관절염 퇴행에 대한 p75NTR-Fc의 효과
이 연구의 목적은 p75NTR-Fc의 오름차순 투여량(dose)이, 질병이 확립된 후 OA의 퇴행을 일으킬 수 있는지를 평가하는 것이다. 또한 래트의 MIA 유발성 관절염과 관련된 통증에 대한 치료의 효능을 평가하고, 항-뉴로트로핀 성장 인자(NGF) 항체인 PG-007과 같은 타네즈마브(Tanezumab)로 한 처치와 비교하였다.
프로토콜
시약
표 3: 실시예 3에서 사용한 시약의 상세
[표 3]
Figure pat00003
MIA의 제조
MIA를 6mg/ml MIA 스톡 용액과 등가인 농도 0.3mg/50㎕의 ETF-PBS(각 관절 내 주입을 위해 준비된 용량)에서 준비했다. MIA 68mg을 재어 11.3ml의 ETF-PBS에 용해시켰다. MIA를 하루 전에 준비하고 필요할 때까지 4℃ 암실에 저장했다. 모든 동물들은 동일 배치(batch)에서 제조된 MIA를 받아들였다.
테스트 제제
표 4: 실시예 3에서 사용된 테스트 제제의 상세
[표 4]
Figure pat00004
테스테 제제의 제조
이 연구에서 사용된 테스트 제제를 동물들에 투여된 특정된 날에 신선하게 제조했다(표 4 참조). 가능하면 항체를 주입하는 인비보 과학자가 각 바이알에 어떤 처치가 있었는지 알지 못하도록 준비된 각 항체의 용량이 같았다(표 5 참조).
표 5: 실시예 3에서 사용된 테스트 제제의 전형적 제조
[표 5]
Figure pat00005
동물들
도착시 체중이 120-150g인 39마리의 수컷 위스타 래트(영국, 찰스강에서)를 실시예 3에서 사용하였다. 각각의 동물을 도착시 체크하였으며 외관상 건강하게 보였다. 그들을 3개의 우리에 무작위로 배정하고, 각 래트의 꼬리에 문신을 하여 고유한 식별 번호를 할당했다. 0일째 연구를 시작하기 전에 최소한 10일 동안 동물들을 동물 유닛에 익숙해지게 했다.
일단 래트가 그들의 환경에 익숙해지면, 스톡/절차 룸으로 옮기고, 그곳에서 모든 인비보 절차를 수행했다. 동물들은 홈 오피스 애니멀즈(과학적 절차)법 1986에서 권장한 바와 같이 12시간의 명암주기(07.00 온 19.00 오프)를 부여하게 설정된 형광등에 의해 환하게 유지되었다. 룸은 공조되고(air-conditioned), 공기 온도(21℃ +/- 2℃) 및 상대 습도를 일상적으로 측정했다.
래트에게 래트용 R105-25 조사된 완전 사료(Scientific Animal Food and Engineering, Augy, France)를 급여하였으며 오토클레이브된 물은 자유롭게 이용할 수 있었다. 각 배치의 사료(diet)를 구성성분들(composition) 및 오염물에 대해 일상적으로 체크하고 스크린했다. 둥지 및 우리를 오토클레이브하고 각 우리를 개별적으로 환기시켰다(IVC 시스템).
실험 디자인
한쪽 무릎에 MIA의 관절 내 주입에 의한 관절염 유도 후 MIA로 처치된 다리의 체중 부하(bearing)(무능력 측정)를 ETF-PBS로 처치된 반대측 대조군 다리와 비교하여 관찰하고, 유의한 차이가 있으면, 동물들을 동등한 통각수용(nociceptive) 거동을 하는 다섯 개의 처치군(군당 동물 n = 6)과 하나의 비히클 대조군(n = 3)으로 무작위로 나누었다. 6마리의 나이브(naive) 동물을 음성 대조군에 포함시켰다.
표 6: 실시예 3을 위한 실험 디자인의 개요
[표 6]
Figure pat00006
체중을 연구 동안 정기적으로 기록했으며 주당 간격으로 자발적 통증 평가를 측정했다.
항 NGF 항-뉴로트로핀이 래트가 얼굴과 목 주위로 긁게 하는 것으로 나타났기 때문에, 이전 연구에서 결정된 바와 같은 인간적인 임상 종말점에 도달하지 않도록(전체 피부 병변의 최대 면적이 10cm2를 초과하거나 어느 한 병변이 크기에서 2cm × 3cm보다 크고 더 깊어지고 젖으면 24시간 내에 치유의 징후 없이 동물은 사망하게 된다.), 동물들을 피부 병변의 징후(sign)를 정기적으로, 특히 6일 후에 관찰하고 모든 병변 점수를 기록하였다.
종료일에 혈액 샘플을 심장 천자(cardiac puncture)로 채취하고 혈장을 준비했다. 무릎을 제거하고 10% 중성 완충 식염수(formal saline)에 넣고 조직학적 처리를 하였다.
처치의 무작위화
MIA의 주입
각 래트의 왼쪽 또는 오른쪽 무릎에 MIA가 주입되도록 무작위로 수행했다(ETF-PBS를 주입한 각 쥐의 반대쪽 무릎). 각 래트에 대해 MIA 또는 식염수를 수용하는 무릎의 할당은 맥(Mac)용 마이크로소프트 엑셀(버전 14.1.1)의 난수 생성기를 이용하여 생성했다. 동물과 접촉하지 않은 인원이 무작위 배정 절차 및 할당을 수행했다(일정은 부록 1 참조). 왼쪽 또는 오른쪽 무릎을 나타내기 위해 각 동물에 대해 2개의 7ml 폴리프로필렌 바이알을 표지했다(총 66개의 바이알). 두 명(한 명은 마스터 무작위 배정 시트에 점수를 매기고 체크하고 한 명은 관절 내 주입을 위해 용액을 소분함)이 66개의 바이알을 준비했다. MIA 바이알을 먼저 채우고 나머지 바이알은 ETF-PBS(이것은 각 동물에 대해 반대쪽 무릎 바이알이었다)로 채워지도록 소분을 연속하여 수행하였다. 나이브 동물을 위한 바이알은 빈 채로 두었다.
테스트 제제의 투여(dosing)
동물들을 비히클 대조군으로 처치된 무릎과 비교하여 MIA로 처치된 무릎의 통각수용 거동에서 동일한 차이를 보이는 처치군으로 무작위 분리하였다. 이는 OA 유도 후 28일째에 수행되었다.
동물 절차
무릎의 관절 내 주입
래트를 보일스 기구(Boyles Apparatus)를 사용하여 이소플루레인을 흡입하게 하여 마취시켰다. 각 동물의 양 무릎의 털은 깎고 무릎은 에탄올로 닦았다. 각각의 무릎은 ETF-PBS 단독 또는 ETF-PBS 중 0.3mg MIA 50μl를 27G 바늘이 부착된 0.5ml 멸균 Becton Dickinson Micro-Fine 인슐린 주사기를 이용하여 슬개하 인대(infra-patellar ligament)를 통해 주입하였다. 여섯 마리의 나이브 동물을 마취시키고 양 무릎의 털만 깎아내었다. 연구 동안 인비보 과학자들은 모든 동물의 처치 상태에 대해 알지 못했다.
테스트 제제의 투여(dosing)
테스트 제제는 5ml/kg의 투여 용량으로 목덜미 또는 옆구리의 피하 경로에 의해 투여되었다.
자발적 통증의 평가
무능력(Incapacitance) 시험기(린톤 인스트루먼트(Linton Instruments), U.K.)를 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 뒷다리의 체중 부하를 측정하여 주당 간격으로 각 동물에 대한 자발적 통증을 측정하였다. 래트를 무능력 시험기에 적절한 크기의 퍼스펙스 동물 상자에 넣어 뒷발이 별도의 센서에 놓이게 했다. 선택된 상자의 크기는 래트의 몸무게에 기반하였으며(450g까지의 래트를 위한 소형 래트 홀더 및450g을 넘는 대형 래트/기니피그를 위한 홀더), 래트가 짓눌리지 않고 편안하게 앉을 수 있도록 하였으나, 유사하게 래트가 돌 수 있도록 너무 많은 공간을 제공하지는 않았다. 래트가 안정되고 차분해지면 각 다리의 체중 부하를 5초 이상 기록하고 두 뒷다리에 의해 가해진 평균 힘을 그램으로 기록했다. 뒷발의 체중 분포를 각 시점에서 각 래트에 대해 5회 측정하고, 5회 판독의 평균을 계산하였다. 양 뒷다리에 대한 전체 체중으로 오른쪽 다리의 무게를 나누어 개별 체중 부하 데이터를 체중 분포로 변환시켰다.
최종(terminal) 혈액 샘플
최종 혈액 샘플을 밀리큐(MilliQ) 물 중 1% 칼륨 EDTA로 플러시된 테루모(Terumo) 2ml 주사기 및 21G 바늘로 이소플루오레인 마취하에 심장 천자에 의해 채취하였다. 수집된 혈액을 2ml 폴리프로필렌 튜브에 넣었다. 자궁 전위로 동물을 죽게 했다.
혈장 제조
최종 혈액 샘플을 2700 x g에서 10분간 원심 분리하고 혈장을 폴리프로필렌 튜브(동물당 4 개의 분취량)로 소분하고 -80℃에서 동결시켰다.
래트 무릎의 제거
아래쪽 다리의 피부를 제거하고 근섬유 다발을 뼈에서 분리했으나 무릎과 함께 그대로 두었다. 대퇴골, 비골과 경골을 절단하고 근육이 부착된 무릎을 제거하고 125ml 스크류 캡 용기 내의 약 80ml의 10% 중성 완충 포르말린에 두었다. 조직학적 분석을 위한 처리 전에 무릎을 48시간에서 72시간까지 완충 포르말린에 보관하였다.
조직학 처리
조직 샘플을 표준 절차를 사용하여 광학 현미경용으로 준비하고 케임브리지 대학 수의과 대학에서 외부적으로 수행했다. 간략하게, 무릎 관절이 고정된 후, 조직을 PBS로 헹구고 이어서 8% 포름산에서 10일 동안 탈회시켰다. 석회질 제거 후에 조직을 일련의 등급화된 에탄올 농도(75%에서 100% 범위의 에탄올을 4시간 동안 6회 변경)를 통해 탈수된 조직을 샨돈 시타델(Shandon Citadel) 조직 처리기를 이용하여 처리하고, 100% 클로로포름으로 헹구고(4시간 동안 3회 변경), 마지막으로 녹은 파라핀 왁스에 박아 넣어 조직 블록을 형성하였다(4시간 동안 2회 변경). 조직을 녹은 파라핀 왁스와 함께 Surgipath PEC 3001 장치를 이용하여 카세트에 박아 넣었다. 포르말린 고정으로 인한 손상을 최소화되도록 조직을 수집 후 가능한 한 빨리 처리하여, 조직 절편이 면역 조직 화학을 위해 잠재적으로 사용될 수 있게 하였다.
레이카 RM2135 왁스 마이크로톰을 이용하여 각 래트의 무릎 조직 블록에서 최소 4개의 10μm 절편을 잘라내었다. 2개의 절편을 유리 슬라이드에 놓고 슬라이드를 자동화된 선형 염색기(Leica ST4040)를 이용하여 표준 헤마톡실린 및 이오신(H&E), 그리고 사프라닌 O 패스트 그린(Safranin O F/G) 염색을 위해 처리했다.
간략히, 선형 염색기는 슬라이드를 염색하기 위한 구조 내에 배치된 23개의 시약 스테이션과 4개의 워터 스테이션을 가지며, 이는 표준 H&E 또는 사프라닌 O F/G 프로토콜을 따른다. H&E 슬라이드는 각각 1분 후에 27개의 스테이션 사이에서 교환되었으며 자일렌, 에탄올, 물, 헤마톡실린, 물, 산성 알코올, 물, 에오신, 물, 에탄올 및 자일렌 시리즈를 따른다. (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)의 모든 용매 및 Leica의 H&E). 절편을 공기 건조시키고, 현미경으로 볼 수 있게 장착하고 준비된 커버 슬립으로 덮었다.
이미지 분석
이미지-프로 플러스(Image-Pro Plus) 이미지 분석 소프트웨어(Suite v7.0, Media Cybernetics, UK)를 이용하고 올림푸스 AX70 현미경을 사용하여 슬라이드를 2배, 4배 또는 10배 배율로 관찰했다. 각 래트의 내측 무릎 관절의 전체적인 총 변화를 보기 위해, OA-유사 특징에 대해 염색된 조직 절편의 초기 비공식 분석을 수행하였다.
모든 래트 무릎(MIA 및 ETF-PBS 처치된 무릎)에 대해 측정된 총 연골 면적(mm2)에서의 이미지 분석을 X2 대물 렌즈를 이용하여 SO/FG 슬라이드에서 수행했다. 연골 층의 깊이(내측 무릎 관절당 최소 6회 측정하고), 이것을 동일한 무릎 관절에서의 연골하골의 깊이와 비교했다.
데이터 분석
고전적인 통계를 사용하여 각 동물에 대해 이미지 분석(연골 영역과 같은) 및 통증 평가 데이터(예를 들면, 체중 분포 불균형)를 분석했다. 복수의 측정값을 p75-NTR-Fc(상이한 투여량으로) 또는 PG-007으로 처치된 동물로부터 수집하여 평균을 구하고 값을 적합한 고전 통계 테스트를 사용하여 대조 동물과 비교하였다. 모든 분석에서 p<0.05를 통계적 유의성을 나타내기 위해 취했다.
결과
체중
동물의 크기 차이를 검사하기 위해 다른 군의 래트의 체중을 비교하였다. 0일째에, 상이한 처치군에서 동물의 체중간에 통계적으로 유의한 차이는 없었다(p = 0.76 n.s., 원-웨이 ANOVA, 도 30 참조).
6개의 처치군(대조 항체로 처치된 래트와 비교하여 p75NTR-Fc 또는 PG-007으로 처치된 래트) 사이의 평균 체중은 연구 과정 동안 서로 통계적으로 유의하지 않았다(p = ns, 투 웨이 ANOVA, 도 31 참조).
자발적 통증 측정
OA에 의해 유발된 자발적 통증에 대한 p75NTR-Fc 및 PG-007의 효과
자발적 통증은 무능력 검사기를 사용하여 뒷다리를 통한 체중 분포를 측정하여 평가했다. MIA를 한쪽 무릎에 주입(반대측 무릎에는 ETF-PBS를 주입)한 후 기준선(그룹 7, naive 동물 제외)에서 평가하고 다시 15일, 21일 및 28일째에 평가하였다. 데이터는 도 32에 나와 있으며 MIA로 처치된 뒷다리에 의해 지지되는 뒷다리에 대한 전체 중량의 비율(proportion)로 도시된다. 나이브 동물의 경우 왼쪽 뒷다리를 통과하는 중량의 비율을 나타낸다.
모든 동물에 대해 처치된 뒷다리의 중량 비율과 이론적 기대치 0.5 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다(0일째 기준선에서 두 뒷다리에 걸쳐 균등하게 분포(p = 0.379, Kruskal Wallis 테스트; 도 32 참조)). 28일까지 5개 처치군 모두 이론적 평균인 0.5와 유의하게 달랐으며 본질적으로 MIA 주입 무릎의 중량을 가지고 있었다(도 32 참조). 이전 연구를 토대로, 이것은 OA 병리의 정도가 래트에게 투여를 시작하기에 충분히 유의하다는 것을 가리킨다.
투약은 30일 이후부터 연구가 끝나는 56일째까지(피하 경로를 통해 5일마다 처치) 각각의 처치 요법으로 래트에게 개시했다. 연구 과정 동안 자발적인 통증에 대한 평가를 더 측정하였다(35, 42, 49 및 56일에 함, 도 4 참조). 연구 49일째까지 내내, 대조 IgG Fc로 처치된 동물은 처치된 뒷다리의 중량 비율과 이론적 기대치 0.5 사이에서 유의미하게 차이가 유지되었으며, 이는 MIA 처치된 무릎이 동물에게 통증을 유발한다는 것을 나타낸다(도 33 참조). 대조적으로, 항-NGF PG-007로 처치된 동물 및 p75NTR-Fc(0.3 내지 3 mg/kg)로 처치된 동물에서는, 시간이 감에 따라 MIA 처치된 뒷다리의 중량 비율과 이론적 기대치 0.5 사이에는 유의한 차이가 없었다(즉, 뒷다리의 중량 분포가 균일함).
MIA 유발 OA 후 무릎에서의 조직학적 변화
OA의 퇴행에 대한 p75NTR-Fc 및 PG007의 효과
대조군 항체로 처치된 동물의 MIA를 주입한 무릎은 연골 세포 퇴행의 영역을 보였으며, 일부 영역에서는 완전한 연골 손상이 야기되었다(도 34). 이것은 연골에서의 사프라닌 O 패스트 그린 염색의 관련된 손실에 의해 강조된다. 또한, 연골 손상이 가장 큰 영역의 아래에 있는 연골하골에서 유의한 병리학적 변화가 있었다(도 34). 연골하골에서의 변화의 스펙트럼이 있으며, 이는 반응성 변화와 리모델링에서 경화성 변화까지 이끄는 진행을 반영한다(도 34).
유의한 병리가 확립된 후 28일 동안 3mg/kg PG-007로 처치된 동물(처치된 뒷다리의 중량 비율과 이론적 기대치 0.5가 유의하게 다른 통증 평가로 확인되는)은 래트 무릎의 전체적인 완전성의 상실이 있고 효능에 대한 조직학적 증거가 없는 대조 항체로 처치된 동물과 비교하여, 조직학적으로 유의한 변화를 보였다(도 35). 이 병리는 연골 및 골수의 관련된 손실 및 뼈 괴사의 증거와 일치하며, 대체로 전체적으로 급속한 진행으로 이어지며, 일부 동물에서는 대조 항체로 처치된 동물과 비교하여 OA가 악화된다(도 35). 대조적으로, p75NTR-Fc(0.3 내지 3 ㎎/㎏)로 처치 된 동물은 매우 상이한 조직 병리학을 나타내며 대조 항체로 처치된 동물과 비교하여 유의미한 연골보호 및 연골하골 병리에서 관련된 유의한 증가의 증거가 있으며, 뼈 병리 및 OA의 전반적인 감소된 심각성으로 이어진다(도 36-38). 이것은, 염증 매개성 골 용해 추진을 감소시키는, 골수 내의 감소된 골수 확장에 의해 표현형으로(phenotypically) 나타내어진다.
낮은 투여량의 p75NTR-Fc(0.3 및 1 mg/kg)로 처치된 동물은 조직병리에서 가장 현저한 변화를 나타내었고(도 37 및 도 38 참조), 두 처치군에서 병리는 거의 정상 수준이었다. 3mg/kg p75NTR-Fc에서의 조직학적 결과를 고려하면, 전체적인 프로파일은 p75NTR-Fc가 "종 모양" 용량 반응 곡선을 나타냄을 시사한다.
조직병리 평가
조직병리를 탈회된 무릎의 사프라닌 O 패스트 그린 염색 절편에 대해 수행하였다. 일반적으로 조직 처리 및 염색의 품질은 우수했으며, 품질면에서 3개의 슬라이드 만 거부되었다. 그 슬라이드를 처치군으로 편성하여, 초기 병리 평가는 맹검화하지 않았다. 그러나 등급을 매기기 위해, 모든 군(비히클 제외)을 관찰자 편향과 진단 표류(drift)를 줄이기 위해 간단한 난수 시퀀스를 사용하여 랜덤화하였다.
기술적 연골 조직병리학적 표현형(Descriptive cartilage histopathology phenotypes)
대조군
쌍을 이루는 슬라이드 사이에 명확한 구분이 있었다. 가장 뚜렷한 연골 병리가 있는 슬라이드는 4RA, 5LA, 6LB, 10RA, 11LB(슬라이드 11RA 등급으로 불충분한 연골) 및 12RB이다. 다수의 연골 변화는 명백한 말초 연골세포 괴사가 있는 전체 두께의 침식이었다.
그룹 4 - PG007, 3mg/kg
쌍을 이루는 슬라이드 사이에 명확한 구분이 있었다. 가장 뚜렷한 연골 병리가 있는 슬라이드는 1RA, 2RB, 3LB, 34LA, 35LA, 36RB이다. 전반적으로, 연골 병리는 대조군과 조직학적으로 유사했다.
그룹 3 - P75NTR-Fc, 0.3mg/kg
쌍을 이루는 슬라이드 사이의 구별은 대조군에 비해 현저하지 않았다. P75NTR-Fc의 투여는 MIA-유발된 연골 병리의 두드러진 저해와 관련되었으며 - 실제로 두 경우는 정상에 가까웠다. 품질면에서 3개의 슬라이드가 이 그룹에서 거부되었다.
그룹 1 - P75NTR-Fc, 1.0 mg/kg
쌍을 이루는 슬라이드 사이의 구별은 대조군에 비해 현저하지 않았다. 가장 뚜렷한 연골 병리가 있는 슬라이드(대조 병변에 비해 그다지 뚜렷하지는 않지만)는 7LA, 8LA, 13RB, 15RA, 31RB, 33LB이다. P75NTR-Fc의 투여는 MIA-유발된 연골 병리의 현저한 저해와 관련되었다.
그룹 2 - P75NTR-Fc, 3.0 mg/kg
이 그룹은, 대조-타입 병변에서부터 그룹 1과 유사한 병변(50%)까지의 효과의 스펙트럼을 가지는, 연골 병리에 대한 효능 효과의 관점에서 현저한 가변성을 나타냈다. 가장 뚜렷한 연골 병리가 있는 슬라이드는 16LB, 17RA, 18RB, 22RB, 23LA 및 24LA이다. 최고 투여량에서의 P75NTR-Fc의 투여는 0.3 및 1.0 mg/kg과 관련된 명백한 효과를 나타내지 않았다.
조직병리학 등급 기준(Histopathology grade criteria)
등급의 할당은 각 해부학적 영역 내에서 관찰되는 가장 빈번한 병변을 기준으로 한다. 초기 평가에 기초하여, 주요 조직학적 특징이 대조군에서 확인되었으며, 이는 1.0mg/kg P75NTR-Fc 투여 후 명백한 변화를 보였다. 등급 기준은 이전의 MIA 연구 병리학 평가(MLF)에서 채용된 기준이었다.
연골 병리(Cartilage pathology)
많은 출판물에서 인간의 연골 병리의 등급을 분류하기 위한 맨킨 스코어(Mankin Score)의 용도를 자세히 설명한다. 오리지날 맨킨 스코어(또는 HHGS 스코어)는 0(정상)에서 14(심각한 병리)까지의 범위이며 현저한 관찰자 간의 편향으로 곤란하다. 또한, 이 점수 시스템은 판누스(pannus) 병리의 관여를 과소 평가하고 종종 초기 변화를 정상적인 변화와 융합시킨다. 중요하게, 맨킨 스코어는 중등도(moderate)의 병리를 심각한 병리로 등급의 범위를 확대하고 경도(mild)에서 중등도까지의 변화를 뚜렷하게 융합한다. 따라서, 직접적으로 적용되는 맨킨 스코어는 약물력학적(pharmacodynamic) 범위를 거의 기술하지(describe) 않고, 설치류와 사람 사이의 세포 턴오버(turnover)에서의 차이에 둔감하기 때문에, 전임상 연구에서 의심스러운 유용성을 가진다. 이 연구에서 사용된 등급화 시스템은 펠레타이어(Pelletier)의 기술 체계(descriptive scheme)를 사용하는 OARSI 시스템의 수정시스템이다.
0 - 중대한 이상 없음; 1 - 최소의 표재성 소섬유 형성(fibrillation); 2 - 표재성 침식; 표면 영역 연골 세포의 손실; 3 - 심층 영역 침식; 4 - 전체 두께 침식; 연골하골의 다발성 노출, < 50% 영역; 5 - 연골판의 상실; 관절강(articular space)에서의 쇄설성 형태(detritic forms), > 50% 영역
연골하골
연골하골판(sub-chondral bone plate)은, 본질적으로 골용해가 개재되는, 퇴행성 변화를 겪기 전에 연골 등급의 스펙트럼 전반에 걸쳐 연골 완전성(cartilage integrity)의 상실에 대해 반응한다. 0 - 중대한 이상 없음; 1 - 표면 영역 해체(disorganization)(불규칙한 뼈 모양의(osteoid) 영역); 2 - 전체 두께 해체; 3- 다발성 골용해(multi-focal osteopenia); 4 - 다발성 골연화증; 5 - 융합성 골감소증 영역(confluent osteopaenic zones)
기질 공동
기질 공동은 연골하골판 내에 있는 골수강이고 가까운 연골하골판 원위부이다. 0 - 중대한 이상 없음; 1 - 최소의 골용해; 2 - 중등도 골 용해; 3 - 다수의 공동에서 복수의 용해성 구멍이 있는 두드러진 골용해; 4 - 공동의 골용해 후 융합(post-osteolytic fusion); 5 - 용융된 공동 파괴(breach) 연골하골 및/또는 골막
해면골
해면골 시스템은 관절 생체역학에서의 변화로 인해 최소의 연골 병리에서 반응성 변화를 겪는다 - 염증에 뒤따르는 더 퇴행성인 표현형으로 진행된다.
0 - 중대한 이상 없음; 1 - 표재성 뼈 흡수/골용해의 복수의 병소 영역; 2 - 현저한 골용해의 복수의 영역; 3 - 정상적인 타이드-마크 대상 분포(tide-mark zonation)의 손실이 있는 골용해의 복수의 영역; 4 - 명백한 골세포 손실이 있는 골용해의 복수의 병소 영역(multi-focal zone); 5 - 골 융합이 있는/없는 해면골 파괴
골수세포 과다
0 - 중대한 이상 없음; 1 - 골수 기질(marrow stroma) 내의 세포의 복수 병소의 응축 병소(multiple focal condensed foci); 2 - 골수 기질 및 골막 구멍(periosteal pits) 내의 세포의 복수 병소의 응축 병소; 3 - 골수세포 과다 확산 - 지역의(zonal); 4 - 기질 공동으로의 골수세포의 확장; 5 - 판누스 혼합이 있는/없는 연골하골판 또는 골막으로의 골수 구획의 파괴
뼈 경화증
뼈 경화증은 대개 기질 공동으로부터 섬유 조직 형성 확장의 영역으로 보인다. 0 - 중대한 이상 없음; 1 - 가끔, 작은, 병소(foci); 2 - 복수의 병소; 3 - 복수의 융합 병소; 4 - 뼈 퇴행과 관련되는 복수의 융합 병소; 5 - 뼈 낭종이 있는 복수의 융합 병소
골아세포 과형성
0 - 중대한 이상 없음; 1 - 다수의 골아세포판; 2 - 다수의 비대성 골아세포판; 3 - 명백한 골아세포 사열식상배열(palisading); 4 - 비대성 골아세포판 - 지역의 (zonal); 5 - 비대성 골아세포판 - 다지역의(multi-zonal).
조직학 등급 결과(플롯된 쌍으로 된 세트에서의 가장 심각한 연골 병리 샘플)
연골 병리
PG007의 투여는 조직학적으로 유의한 효능 효과를 나타내지 않았다. P75NTR-Fc는 0.3 및 1.0 mg/kg에서 연골 보호에 현저한 효능을 나타내었다. 3.0 mg/kg에서의 효능 프로파일은 더 가변적이었으며, 그룹의 50%가 대조군과 오버레이를 보였다(도 39).
연골하골
PG007의 투여는, 3.0 mg/kg P75NTR-Fc로 관찰된 프로파일과 유사하게, 대조군과 비교하여 연골하골 병리에서 조직학적으로 유의한 증가와 관련되었다. 대조적으로, 0.3 및 1.0 mg/kg에서의 P75NTR-Fc의 투여는 연골하골 조직학에서 현저한 개선과 관련되었다(도 40).
기질 공동
PG007의 투여는 조직학적으로 유의한 효능 효과와 관련이 없었다. 대조적으로, 모든 투여량에서의 P75NTR-Fc의 투여는 골용해성 병리에서의 감소 및 기질 공동의 확장과 관련되었으나, 0.3 및 1.0 mg/kg에서의 효과가 가장 두드러지게 나타났으며, 두 그룹은 병리를 거의 정상 수준으로 감소시켰다(도 41).
해면골
PG007의 투여는, 두 개의 샘플이 대조 범위를 초과하면서, 대조군과 비슷한 해면골 병리와 관련되었다. 대조적으로, P75NTR-Fc는 0.3 및 1.0 mg/kg 투여량 수준에서 두드러지게 해면골 병리를 감소시켰다. 3.0 mg/kg에서 P75NTF-Fc는 대다수의 샘플이 대조군과 오버레이를 보이면서, 보다 가변적인 프로파일을 나타내었다(도 42).
골수세포 과다
PG007의 투여는 골수에서 골수 세포의 확장과 관련되며, 4개의 샘플이 대조범위의 상단에 또는 초과하는 범위에 있었다. P75NTR-Fc는 0.3 및 1.0 mg/kg 투여량에서, 두드러진 특징인 골수 세포 확장을 감소시키면서 골수 세포질을 감소시켰다. 3.0 mg/kg 투여량은 억제 경향을 보였음에도 불구하고, 대조군에서의 낮은 수준의 반응자와 오버레이를 보였다(도 43).
골 경화증
P75NTR-Fc 샘플이 대조 범위의 최상단을 향한 군집을 보였지만, 연구 그룹 간에는 조직학적으로 유의한 차이가 없었다(도 44).
골아세포 과형성
0.3 및 1.0 mg/kg에서의 P75NTR-Fc의 투여는, 골단 영역에서 특히 두드러지는 책상배열(palisading) 및 골아세포 형성이 있는, 연골하골/연골 부위에 조직학적으로 유의한 골아세포 증식과 관련이 있었다. 또한, 등급이 부여되지는 않았지만, 이 영역에는 눈에 띄는 '섬유아세포-유사' 세포가 있었다. PG007과 P75NTR-Fc(3.0 mg/kg)는 조직학적으로 대조군과 유사하였다(도 45).
부작용
3 mg/kg PG-007으로 처치된 2마리의 래트가 피부 병변을 나타냈다. 아주 작은 피부 병변이 45일(처치 후 15일)까지 일부 래트에서 얼굴, 목 및 어깨 부위 주위에 나타나기 시작했지만 49일(처치 후 19일) 이후부터는 한 마리의 래트에서 더욱 분명해졌다. 이 병변은 주입 부위와 관련이 없었다. 래트를 정기적으로 검사하여 각 병소의 수, 크기 및 정도를 정량화하여, 우리가 연구의 인간적인 임상 엔드 포인트 내에 남아 있게 했다. 모든 농도에서 p75NTR-Fc로 처치된 래트는 피부 병변을 나타내지 않았다.
토의
조직병리학
PG007은 효능의 조직학적 증거와 관련이 없었다. 대조적으로, 0.3 및 1.0 mg/kg에서의 P75NTR-Fc는 조직학적으로 유의한 연골 보호와 관련이 있었으며, 감소된 뼈 병리의 심각성 및 골용해-매개 뼈 침식과 관련이 있었다. 감소된 골수세포 과다(특히 골수 확장)의 발견은 이 표현형을 지지하며, 염증 매개 골용해 추진(drive)의 제한이 효능 반응에 포함됨을 시사한다. 중요하게, 이들 투여량은 골아세포 풀의 확장과 관련되며 - P75NTR-Fc의 효능 기전은 골아세포가 확장하는(따라서 간엽 세포 풀을 증대시킴) 동안 골용해를 제한하는(따라서 골수 세포 활성화의 제한) 이중 메카니즘이라는 것을 시시한다. 3.0 mg/kg P75NTR-Fc 그룹의 조직학적 프로파일은 P75NTR-Fc가 '종 모양(bellshaped)'의 용량 반응 곡선을 나타냄을 시사한다. 많은 측면에서 3.0 mg/kg P75NTR-Fc와 PG007의 조직학적 프로파일이 유사함에도, 정확한 표현형은 용량 등가 기준(dose equivalency basis)에서 P75NTR-Fc의 골용해 추진이 PG007의 경우보다 적다는 것을 시사한다. 고전적으로, MIA 모델의 조직병리학적 평가는 반응성 뼈의 변화를 초래하는 일차 연골 병리학에서의 선형 관계에 기초하고 있다. 골수 변화는 종종 연골 손상으로 인한 생체역학적인 변화로 인해 발생하는 반응성 활액막염에 뒤따르는, 그 결과로 여겨진다. 이 선형 관계가 나이브하고, 뼈 구획이 연골 반응의 일시적인 발달 및 표현형을 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있다고 시사하는 골면역학에서의 축적 자료가 있다. 사실, 이 연구는 최소 등급의 연골 병변에서조차 뼈 리모델링을 보여주는 인간 연구로부터의 이미지 데이터를 지지한다. 따라서 연골 및 연골하골은, 연골세포 증식 및 생존을 지원하기 위한 조건을 제공하고 그 결과 골관절염에서의 구조적 결과에 영향을 주는, 통합된 기능 단위로서 보아야 할 가능성이 있다. 현재 연구의 데이터는, NGF 경로의 조작이 골 용해를 감소시키는 가능성을 제공하고, 또한, 간엽 세포 매개 골 보호를 증대시킬 수도 있다는 가설에 대한 지지를 제공하고, 따라서 표재성 연골괴사로부터 심층 영역 병변으로의 추진을 억제하여 전체 두께 연골 침식 및 연골 손상을 억제한다.
결론
이 연구에서, MIA 주입 후 OA 병리학의 퇴행(regression)이 관찰되는지 여부를 결정하기 위해, p75NTR-Fc(0.3 내지 3 mg/kg)를 사용하는 치료학적 투여 요법의 효과를 조사하였다. OA는 투약이 시작되기 전에 30일 동안 발전되게 두었으며, 이는 통증 측정에 의해 이론적 평균인 0.5와 현저히 다른 것으로 확인되었다.
더 낮은 용량의 p75NTR-Fc(0.3 및 1 mg/kg)로 처치된 동물은 진통 효과 및 효능이 있었으며 대조 항체로 처치된 동물에 비해 유의하게 적은 OA 병리를 나타내었다. 대조적으로, 3 mg/kg PG-007으로 처치된 래트는 통각상실증(analgesia)을 보임에도 불구하고, OA 병리에서의 효능 및 개선의 조직학적 증거와는 관련이 없었다. 그러나 더 높은 농도의 p75NTR-Fc(3 mg/kg)로 처치된 동물은 진통 효과가 있었으나; 3 mg/kg PG-007으로 처치된 동물과 약간 조직병리학적 유사성이 있었다.
본 발명은 여기에 설명된 특정 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 여기서 설명된 발명에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 앞선 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해 질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속한다. 또한, 여기에 기술된 모든 구현예는 광범위하게 적용될 수 있으며, 적합하게, 임의의 및 모든 다른 일관된 구현예와 결합 가능하다고 생각된다.
본 명세서에는 다양한 출판물이 인용되어 있으며, 이들의 개시 내용은 전체적으로 참고 문헌으로 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> Levicept Ltd. <120> THERAPEUTIC USE OF P75NTR NEUROTROPHIN BINDING PROTEIN <130> LEV01176WO <150> GB1412748.4 <151> 2014-07-17 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Protein <400> 1 Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys 1 5 10 15 Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn 20 25 30 Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val 35 40 45 Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu 50 55 60 Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg 65 70 75 80 Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala 85 90 95 Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp 100 105 110 Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp 115 120 125 Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp 130 135 140 Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala 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