BR112016006113B1 - Proteína de fusão e seu uso, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão replicável, uso da molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica e kit - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA DE FUSÃO E SEU USO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO REPLICÁVEL, CÉLULA HOSPEDEIRA, USO DA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E KIT. A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão da proteína de ligação de neurotrofina (NBP) p75NTR-Fc que compreende uma porção p75NTR(NBP) e uma porção de imunoglobulina. Em certas concretizações, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc é para utilização no tratamento da dor e/ou um sintoma de dor.

Description

Estado da Técnica

[0001] As neurotrofinas, fator de crescimento neurotrófico (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina 3 (NT-3), e neurotrofina 4/5 (NT-4/5) atuam através de quatro receptores: o receptor neutrófico p75 de baixa afinidade (p75NTR), e os receptores de tirosina-quinase de alta afinidade; TrkA, TrkB, e TrkC. O receptor de baixa afinidade p75NTR se liga e é ativado por todas as quatro neurotrofinas e tem sido relatado a funcionar de forma independente dos outros receptores. No entanto, os receptores Trk são ativados de forma mais seletiva isto é, o NGF é o ligante seletivo para TrkA, BDNF o ligante para o TrkB e NT-3, 4/5 os ligantes para o TrkC. Além disso, tem sido relatado que, quando as proteínas p75NTR e Trk são co-expressas, elas formam complexos, que alteram a sinalização de ambos os receptores (Huang e Reichardt, 2003, Annu Rev Biochem. 72:609-42). De fato, tem sido sugerido que p75NTR facilita a seletividade de cada uma das neutrofinas para o seu respectivo receptor Trk.

[0002] O p75NTR é um membro da superfamília de receptores do fator da necrose tumoral (TNFR-SF) e foi o primeiro membro desta superfamília a ser completamente caracterizado. A superfamília (codificada por cerca de 30 genes em humanos) é definida por domínios de ligação de ligantes constituídos por uma ou mais (geralmente quatro) repetições de um domínio rico em cisteína de 40 aminoácidos (CRD) que foi identificado pela primeira vez em p75NTR (Johnson et al, 1986 Cell 47:545-554; Radeke et al, 1987 Nature 325:593-597). Em contraste, nenhum motivo de sequência é compartilhado pelos domínios intracelulares de todos os membros da família TNFR-SF. Por conseguinte, os mecanismos de sinalização de proteínas TNFR-SF variam significativamente.

[0003] Uma característica não comum da estrutura de p75NTR é a existência de um dímero de p75NTR ligado por dissulfureto, formado através de resíduos de cisteinila dentro dos domínios de transmembrana. Esta ligação de dissulfureto é necessária para a sinalização dependente de neurotrofina eficaz por p75NTR e desempenha um papel importante na formação de um domínio intracelular e extracelular (Vilar et al, 2009 Neuron 62:72-83). Neurotrofinas existem fisiologicamente como dímeros não covalentemente associados (Bothwell e Shooter, 1977 J Biol Chem. 252(23):8532-6), com uma distribuição de meia-vida de cerca de 5 min (Tria et al, Exp Neurol 1994 127 (2):178-83). A ativação de p75NTR dependente de neurotrofina envolve a associação de um dímero de neurotrofina com CRDs 2-4 dos dois domínios extracelulares de um dímero p75NTR (He e Garcia, 2004 Science 304:870-875). Estudos recentes suportam um modelo no qual a ligação da neurotrofina faz com que os dois domínios extracelulares de dímeros de p75NTR se movam mais próximos juntos, forçando os domínios intracelulares a afunilarem em um movimento-caracol centrado na ligação de dissulfureto e permitindo a associação dos domínios intracelulares com as proteínas adaptadoras de sinalização, NRIF e TRAF6 (Vilar et al, 2009 J Cell Sci 122: 3351-3357, Vilar et al, 2009 Neuron 62: 7283). Ligações dissulfureto de domínio intra-transmembrana, tais como estão presentes em p75NTR, não foram previamente descritos em outros membros da família TNFR-SF, ou em qualquer outra proteína de membrana.

[0004] p75NTR sofre uma clivagem proteolítica sequencial pelas atividades de a-secretase e Y—secretase e as metaloproteinases de matriz (MMPs), liberando o seu domínio intracelular (ICD) para o citoplasma, de uma maneira análoga à da via de sinalização dependente de clivagem de Notch e proteína precursora da ß-amiloide (Jung et al, 2003 J Biol Chem 278:4216142169; Kanning et al, 2003 J Neuro Sci 23:5425-5436). A liberação citoplasmática da p75NTR ICD por esta via promove a sinalização por NRIF associado (Kenchappa et al, 2006 Neuron 50:219-232). O papel do domínio extracelular de p75NTR após a clivagem proteolítica pelas atividades de a-secretase e y-secretase e as MMPs não é totalmente compreendido.

[0005] Tem sido documentado que o NGF e outras neurotrofinas (BDNF, NT-3 e NT-4/5) desempenham um papel significativo em patologia, por exemplo, dor devido à osteoartrite, pancreatite, artrite reumatoide, psoríase, prurido e esclerose múltipla (Watanabe et al, 2008 J Neurosci Res 86 (16):3566-74; Raychaudhuri et al, 2011, Arthritis Rheum 63 (11):3243-52; Barthel et al, 2009 Arthritis Res Ther 11 (3):R82; Truzzi et al, 2011 Cell Death Differ L8:948-58; McDonald et al, 2011 Curr Med Chem 18:234-44; Yamaoka et al, 2007 J Dermatol Sci 46 (l):41- 51) . Foi demonstrado que anticorpos seletivos para qualquer uma das neutrofinas; seja NGF ou BDNF, NT-3 e NT-4/5 reduz significativamente a dor. Além disso, anticorpos dirigidos contra os receptores da neurotrofina p75NTR Trk A, Trk B ou Trk C também demonstraram ser eficazes em modelos de dor (Orita S et al, 2010 J Orthop Res. 28:1614-1620; Svensson P et al, Pain 2010 148: 473-80; Iwakura et al, 2010 J Hand Surg Am. 35: 267-73; Cirilio et al, 2010 Cell Mol Neurobiol 30:51-62; Pezet et al, 2010 Pain 90: 113-25; Hayashi et al, 2011 J Pain. 12:1059-1068; Chu et al, 2011 Pain. 152:1832-7; Ueda et al, 2010 J Pharmacol Sci; 112:438-43; Ghilardi et al, 2010 Bone 48:389-98; Fukui et al, 2010 J Orthop Res 2010; 28:279-83). Fukui et al, (2010) em um modelo de dor (alodinia mecânica seguida por esmagamento do nervo ciático) demonstraram uma eficácia significativa em terminais relacionados com a dor após o tratamento com um anticorpo anti-p75NTR. Concluiu-se deste estudo que o tratamento com um anticorpo inibidor de p75NTR reduziu a expressão de CGRP e p75NTR resultando em uma redução significativa da dor.

[0006] A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão da proteína de ligação (NBP) de neurotrofina p75NTR-Fc. Descreve-se a afinidade e a cinética in vivo de uma tal molécula, bem como a eficácia no tratamento da dor em um modelo animal. A proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc encontra uso no tratamento da dor e outras patologias relacionadas com o fator neurotrófico, tais como a psoríase, eczema, artrite reumatoide, cistite, endometriose e osteoartrite.

Breve descrição da invenção

[0007] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se uma proteína de fusão da proteína de ligação de neurotrofina (NBP) p75NTR-Fc, compreendendo: (a) uma porção p75NTR(NBP); e (b) uma porção Fc de imunoglobulina.

[0008] Preferencialmente, as porções p75NTR(NBP) e Fc estão ligadas através de um ligante. Mais preferencialmente, o ligante compreende um peptídeo de fórmula GX, em que x é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[0009] Numa concretização particularmente preferida da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a invenção, a p75NTR(NBP) é uma p75NTR(NBP) humana. Numa outra concretização particularmente preferida da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a invenção, a Fc é uma Fc humana.

[0010] Em ainda outra concretização preferida, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO. 3. Em outra concretização preferida, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 15.

[0011] Numa concretização preferida, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a invenção liga-se a qualquer um de NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação (Kd) de entre cerca de 0,01 nM a cerca de 50 nm, como medido pela ressonância de plasma de superfície a 20° C.

[0012] No segundo aspecto da presente invenção, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc como descrita de acordo com qualquer outro aspecto da invenção é fornecida para utilização no tratamento da dor ou de um sintoma de dor.

[0013] Num terceiro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com os primeiro ou segundo aspectos da invenção, que compreende ainda, opcionalmente, codificar uma sequência de sinal.

[0014] Num quarto aspecto da presente invenção, é proporcionado um vetor de expressão replicável para transfecção de uma célula, opcionalmente, uma célula de mamífero, o vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção.

[0015] De um modo preferido, o vetor de expressão replicável é um vetor viral.

[0016] Num quinto aspecto da presente invenção, proporciona-se uma célula hospedeira que abriga a molécula de ácido nucleico do terceiro aspecto da invenção.

[0017] Num sexto aspecto da presente invenção, a molécula de ácido nucleico de acordo com o terceiro aspecto da invenção ou o vetor de acordo com o quarto aspecto da presente invenção é para utilização no tratamento da dor ou de um sintoma de dor.

[0018] Dor ou sintomas de dor incluem, mas não estão limitados a: dor aguda; dor crônica; dor inflamatória; dor nociceptiva; dor neuropática; hiperalgesia; alodinia; dor central; dor do câncer; dor pós-operatória; dor visceral; dor músculo- esquelética; dor cardíaca ou vascular; dor de cabeça, incluindo enxaqueca; dor orofacial, incluindo dor de dente; e dor nas costas. O tratamento da dor inclui, mas não está limitado a, prevenir, melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor e/ou um sintoma de dor.

[0019] Num sétimo aspecto, é proporcionada a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com os primeiro ou segundo aspectos, ou o ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro ou quarto aspecto, em que a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc ou molécula de ácido nucleico ou vetor é para utilização separada, sequencial ou simultânea em uma combinação combinada com um segundo composto farmacologicamente ativo.

[0020] Num oitavo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica, que compreende a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com qualquer aspecto da presente invenção ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente.

[0021] De preferência, a composição farmacêutica é para o uso em qualquer um ou mais de prevenir, melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor e/ou um sintoma de dor.

[0022] Num outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um kit compreendendo: (a) A proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, ou a composição farmacêutica de acordo com o oitavo aspecto; e (b) instruções para a administração de uma quantidade eficaz da referida proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc, molécula de ácido nucleico, vetor ou composição farmacêutica a um indivíduo para qualquer um ou mais de prevenção ou tratamento da dor e/ou um sintoma de dor ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor e/ou um sintoma de dor.

[0023] Em ainda um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para tratar e ou prevenir a dor e ou um sintoma de dor num indivíduo, compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com qualquer aspecto da presente invenção, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com qualquer aspecto da invenção, compreendendo ainda opcionalmente um transportador farmaceuticamente aceitável, ou a composição farmacêutica de acordo com o oitavo aspecto da invenção. Descrição das figuras

[0024] Figura 1. Sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a presente invenção (SEQ ID N° 1). Os locais de clivagem de alfa e gama secretase são mostrados em negrito. A porção Fc da IgGl é mostrada em itálico.

[0025] Figura 2. Produto de tradução (SEQ ID N° 2), a partir do códon de início ao de parada, da sequência de ácido nucleico apresentada na Figura 4 (SEQ ID N° 4).

[0026] Figura 3. Sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão preferida p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a presente invenção (SEQ ID No. 3). A porção Fc da IgGl é mostrada em itálico. A sequência ligante entre as porções p75NTR(NBP) e Fc é mostrada sublinhada.

[0027] Figura 4. Sequência de ácido nucleico do gene de produto inteiro a partir do sítio de clonagem 5' para o sítio de clonagem 3' (SEQ ID N° 4).

[0028] Figura 5. variantes da proteína de fusão p75-NTR (NBP)- Fc: 1: p75_NTR - A sequência p75-NTR (SEQ ID No. 6); 2: proteína de fusão p75-NTR-Fc comercialmente disponível (SEQ ID No. 7); 3: p75_Fc - A proteína de fusão p75-NTR-Fc comercialmente disponível, com a sequência Fc alterada em relação à da região constante da Lonza de IgG1za (SEQ ID No. 8); 4: p75_Fc_C222S - A proteína de fusão p75-NTR-Fc comercialmente disponível com a sequência de Fc alterada em relação à da região constante de Lonza IgG1za e uma cisteína adicional para mutação de serina na posição 222 (SEQ ID NO: 9); 5: p75_Fc_G4xl - Variante 1, uma proteína de fusão p75-NTR-Fc proposta com um ligante de glicina de quatro resíduos (SEQ ID N° 10); 6: p75_Fc_G4Sxl - variante 2, uma proteína de fusão p75-NTR-Fc proposta com um único ligante de serina tetra-glicina (SEQ ID N° 11); 7: p75_Fc_G4Sx2 - variante 3, uma proteína de fusão p75-NTR-Fc proposta com dois ligantes de serina tetra-glicina (Seq ID No. 12); 8: região constante de Lonza de IgG1za (SEQ ID No. 13).

[0029] Neste alinhamento um esquema de formatação é usado para destacar as regiões de semelhança entre os receptores putativos, a proteína de fusão Fc e a região constante de Fc: o tipo em caixas é usado para indicar as regiões de sequência idêntica entre as proteínas variantes e a p75-NTR; o sublinhado único é utilizado para indicar as regiões de sequência idêntica entre todas as proteínas de fusão Fc e a Lonza IgG1za Fc; Itálicos são usados para indicar as regiões ligantes na junção da p75-NTR e região constante Fc; Duplo-sublinhado e negrito são utilizados para indicar a posição de uma sequência não-idêntica fora da região ligante, na posição equivalente a 222 na proteína de fusão p75-NTR Fc parental.

[0030] Figura 6: p75NTR-Fc reduz significativamente a dor no modelo de roedores induzido por MIA de OA. *P <0,1 e **P<0,05.

[0031] Figura 7: Sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão preferida p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a presente invenção (SEQ ID No. 15). A porção Fc da IgG1 é mostrada em itálico. A sequência ligante entre as porções p75NTR(NBP) e Fc é mostrada sublinhada.

Descrição detalhada da invenção

[0032] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se uma proteína de fusão da proteína de ligação a neurotrofina p75NTR(NBP)-Fc, compreendendo: (a) uma porção p75NTR(NBP); e (b) uma porção Fc de imunoglobulina.

[0033] De um modo preferido, as porções p75NTR(NBP) e Fc estão ligadas através de um ligante. Mais preferencialmente, o ligante compreende um peptídeo de fórmula GX, em que x é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[0034] Numa concretização particularmente preferida da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a invenção, a p75NTR(NBP) é uma p75NTR(NBP) humana. Numa outra concretização particularmente preferida da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a invenção, a Fc é uma Fc humana.

[0035] Em ainda outra concretização preferida, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO. 3. Em outra concretização preferida, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 15.

[0036] De preferência, a proteína de ligação da neurotrofina p75NTR, p75NTR(NBP), é peguilhada, ainda mais preferencialmente é glicosilada.

[0037] A proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da presente invenção liga-se de preferência a qualquer um ou mais de NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação (Kd) de entre cerca de 0,01 nM a cerca de 50 nM. Em algumas concretizações preferidas, a afinidade de ligação (Kd) é entre cerca de 0,01 nM e de cerca de qualquer um de 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM, 1,5 nM, 2 nM, 2,5 nM, 3 nM, 3,5 nM, 4 nM , 4,5 nM, 5 nM, 5,5 nM, 6 nM, 6,5 nM, 7 nM, 7,5 nM, 8 nM, 8,5 nM, 9 nM, 9,5 nM, 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 35 nM, 40 nM, 45 nM ou 50 nM, como medido por um ensaio de ligação in vitro para NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5, tal como aqui descrito, de preferência, tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 20° C. Em algumas outras concretizações preferidas, a afinidade de ligação (Kd) é, ou é inferior a, qualquer um de aproximadamente 250 pM, 300 pM, 350 pM, 400 pM, 450 pM, 500 pM, 550 pM, 600 pM, 650 pM, 700 pM, 750 pM, 800 pM, 850 pM, 950 pM ou 1 nm tal como medido por um ensaio de ligação in vitro para a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc com as neurotrofinas tais como aqui descritas, de preferência, tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 20° C. Numa concretização mais preferida a afinidade de ligação (Kd) é de cerca de 0,3 nM ou cerca de 1 nM, tal como medida num ensaio de ligação in vitro para a proteína de fusão p75NTR(NBP)- Fc com as neurotrofinas, tais como aqui descritas, de preferência, tal como medida pela ressonância de plasma de superfície a 20° C.

[0038] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da invenção é para utilização no tratamento da dor ou de um sintoma de dor. Sem desejar estarem limitados por qualquer teoria particular, os inventores acreditam que a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc atinge a eficácia no tratamento da dor ou de um sintoma de dor efetuando a atividade funcional das neurotrofinas acima mencionadas, (definida como modulando ou regulando para cima ou para baixo a atividade funcional das neurotrofinas) NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5, por exemplo, a atividade funcional das neurotrofinas acima mencionadas resultantes da sua interação com os seus respectivos receptores.

[0039] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc efetua a atividade funcional de BDNF tal como avaliado por ensaio funcional de qualquer um de crescimento e diferenciação de neurônios e sinapses, sobrevivência e diferenciação de células neuronais em cultura, a sinalização de Trk, a estimulação da excrescência axonal in vitro ou in vivo.

[0040] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc efetua a atividade funcional de NGF tal como determinado por medição da ligação de NGF a e a ativação de TrkA, como demonstrado em ensaios de sobrevivência de neurônios clássicos (tal como fornecidos em Cowan et al., Annu. Rev. Neurosci. 2001; 24:551-600).

[0041] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc efetua a atividade funcional de NT3, tal como avaliado pela medição da ligação de NT3 a e ativação da atividade endógena do receptor Trk, como demonstrado na fosforilação do receptor Trk, ensaios de repórter de fosforilação da proteína quinase ativada por mitogênio ou sobrevivência das células e ensaios de extensão de neurite.

[0042] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc efetua a atividade funcional de NT4/5, tal como avaliada pela medição da fosforilação de NT4/5 in vitro ou in vivo e ensaios de ativação, por exemplo, ensaios de fosforilação de proteína básica de mielina (MBP) ou, alternativamente, ensaios de angiogênese de Matrigel in vivo do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)/angiogênese induzida pelo fator de crescimento básico de fibroblastos.

[0043] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc liga-se aos resíduos de contato de uma ou mais das neurotrofinas NGF, NT3, BDNF e NT4/5 como se mostra em He e Garcia (2001) Science, 301, páginas 870-805.

[0044] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc é solúvel, de preferência solúvel em solução aquosa, de preferência solúvel num fluido biológico tal como soro, plasma, sangue.

[0045] Tal como aqui utilizado, o termo, "Fc" ou "Fc de imunoglobulina" ou "Fc de Ig" é entendida para significar a porção carboxil-terminal de uma região constante de cadeia de imunoglobulina, de preferência uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, ou uma porção sua. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende 1) um domínio CH1, um domínio CH2 e um domínio CH3, opcionalmente com uma região de imunoglobulina de dobradiça, 2) um domínio CH1 e um domínio CH2, opcionalmente com uma região de imunoglobulina de dobradiça, 3) um domínio CH1 e um domínio CH3, opcionalmente com uma região de imunoglobulina de dobradiça, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3, opcionalmente com uma região de imunoglobulina de dobradiça ou 5) uma combinação de dois ou mais domínios selecionados a partir de, mas não se limitando a CH1, CH2 e CH3, opcionalmente combinado com uma região de imunoglobulina de dobradiça. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende pelo menos uma região de dobradiça de imunoglobulina, um domínio CH2 e um domínio CH3, e, opcionalmente, um domínio CH1. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste em uma Fc ou uma porção de uma Fc de uma imunoglobulina de isotipo, incluindo, mas não limitada a IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, ainda mais preferencialmente, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 , sIgA, mais preferencialmente IgGl, IgG2 ou IgG4, mais preferivelmente IgGl. Opcionalmente, a Fc de imunoglobulina compreende também mutações de aminoácidos, deleções, substituições ou modificações químicas, que servem para minimizar a fixação de complemento ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo ou que melhoram a afinidade de ligação ao receptor Fc.

[0046] Mais preferivelmente, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste em qualquer um de: (a) um domínio CH2 ou porção da mesma e um domínio CH3 ou porção da mesma, (b) um domínio CH2 ou uma porção sua, ou (c) um domínio CH3 ou uma porção sua, em que a Fc de imunoglobulina ou porção sua é de isotipo incluindo, mas não limitada a IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, ainda mais preferencialmente, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, slgA, mais preferencialmente, IgG, IgG2 ou IgG4, mais preferivelmente IgGl.

[0047] De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste na região de terminal carboxila de uma cadeia pesada de imunoglobulina e pode compreender os domínios CH2 e/ou CH3, ou partes suas, a partir de isotipos de anticorpos IgG, IgA ou IgD, ou os domínios CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, ou suas partes a partir de IgM ou IgE. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste em um fragmento da Fc, compreendendo, principalmente, CH3 e uma pequena porção de CH2, como pode ser derivado por digestão com pepsina da imunoglobulina. De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste na região total de Fc, compreendendo CH2 e CH3, adicionalmente conectada à região de dobradiça que é um segmento curto de cadeia pesada que conecta as regiões CH1 e CH2 na imunoglobulina intacta, como pode ser produzido por digestão com papaína da imunoglobulina. De preferência, a região de dobradiça da imunoglobulina compreende ou consiste em uma região de dobradiça ou parte de uma região de dobradiça derivada de uma IgG, de preferência IgG humana, mais preferencialmente selecionada a partir de, mas não se limitando a IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4, mais preferivelmente IgG1 ou é, alternativamente, uma espécie ou variante alélica das concretizações anteriores de região da dobradiça. A região de dobrdaica ou uma parte de uma região de dobradiça de imunoglobulina pode estar localizada na extremidade C ou N- terminal da região Fc, de preferência, na extremidade N- terminal.

[0048] De acordo com uma concretização preferida da presente invenção, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste em uma Fc ou uma porção de uma Fc de uma imunoglobulina que compreende uma ou mais mutações de aminoácidos da sequência de tipo selvagem na região CH2 que reduzem a função efetora de Fc. De preferência, estas mutações são A330, P331 a S330, S331 (numeração de aminoácidos com referência à sequência do tipo selvagem IgG1, em que a região CH2 está na região constante de IgG1 de cadeia pesada humana: [Eur, J. Immunol (1999) 29:2613 -2624]. De preferência, a Fc de imunoglobulina é glicosilada e altamente carregada a pH fisiológico, portanto, ajudando a solubilizar a p75NTR(NBP). A região Fc permite também a detecção da p75NTR(NBP) por ELISA anti-Fc, por exemplo, em efeitos de diagnóstico. A p75NTR(NBP) da invenção é de preferência sintetizada em uma célula que glicosila a Fc de Ig de preferência em locais de glicosilação normais.

[0049] De preferência, a Fc de imunoglobulina compreende ou consiste em uma região Fc de imunoglobulina humana.

[0050] De acordo com a presente invenção, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc preferencialmente demonstra propriedades biológicas vantajosas da solubilidade melhorada da p75NTR(NBP) e/ou estabilidade de p75NTR(NBP) e/ou meia-vida melhorada no soro de p75NTR(NBP). A solubilidade melhorada é desejável a fim de que a biodisponibilidade da p75NTR(NBP) seja maximizada na administração e a dosagem precisa da p75NTR(NBP) pode ser determinada e realizada. A solubilidade melhorada é vantajosa para superar o problema dos agregados que são indesejáveis que causam a dor na distribuição in vivo e que conduzem a inflamação potencial. A melhoria da meia vida no soro tem a vantagem de facilitar níveis reduzidos ou redução da frequência de dose necessária durante a sua utilização para o tratamento a fim de alcançar o efeito terapêutico equivalente ou mantido da p75NTR(NBP) entregue. Uma meia-vida prolongada e maior estabilidade no sangue ou soro tem a vantagem de permitir um regime de dosagem de dosagem menos frequente e/ou níveis de dosagem mais baixos, consequentemente, reduzindo os potenciais efeitos tóxicos ou secundários in vivo. Neste caso, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc é mais potente nos seus efeitos terapêuticos e/ou mais estável na circulação. As doses mais baixas ou menos frequentes resultantes são vantajosas para minimizar eventuais efeitos tóxicos ou efeitos secundários potencialmente associados com a administração de p75NTR(NBP). O peso molecular da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc também é aumentado ao longo p75NTR(NBP) sozinho, isto tem a vantagem de que a molécula será bem retida na circulação sanguínea quando administrada por via intravenosa, reduzindo o risco de penetração para locais não desejados, por exemplo, o sistema nervoso central, e tornando a molécula adequada para a retenção ou concentração nos tecidos alvo.

[0051] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc demonstra solubilidade melhorada da p75NTR(NBP) e/ou estabilidade melhorada da p75NTR(NBP) e/ou meia-vida no soro melhorada em comparação com a p75NTR(NBP) sozinha. De preferência, a solubilidade melhorada é a solubilidade numa solução aquosa tal como a água de preferência com excipientes tais como tampões e/ou sais preferencialmente a um pH fisiológico, de preferência a entre pH 5 a pH 8, preferivelmente cerca de pH 7, ou é a solubilidade em um fluido biológico, tal como soro ou sangue. De preferência, a estabilidade melhorada é a estabilidade da atividade ou a integridade estrutural da proteína p75NTR(NBP) devido aos efeitos de desnaturação, oxidação, fragmentação ou agregação durante um período de tempo, durante um período de armazenamento ou após congelamento e descongelamento. A estabilidade estrutural pode ser avaliada por medidas convencionais de desnaturação, oxidação, ou agregação, a estabilidade de atividade pode ser medida por ensaios de ligação e funcionais aqui descritos, métodos de medição da meia- vida no soro da proteína são conhecidos.

[0052] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc pode ser expressa em níveis elevados a partir de grande variedade de células hospedeiras de mamíferos para fornecer uma única espécie e pode ser eficientemente purificada por cromatografia de afinidade, por exemplo, por ligação a proteína A de Staphylococcus aureus. De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc pode dimerizar e preferencialmente o dímero tem uma maior afinidade para as neurotrofinas NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5, em comparação com a p75NTR(NBP) sozinha. A ligação mais estreita tem a vantagem de maior potência e uma eficácia terapêutica mais elevada, tal como avaliado pelos efeitos da p75NTR(NBP), por exemplo, como determinado por ensaios funcionais da neurotrofina aqui descritos. A potência mais elevada tem a vantagem de que a proteína de fusão p75NTR(NBP)- Fc pode ser utilizada em quantidades de dosagem mais baixas para atingir o mesmo efeito terapêutico, reduzindo assim os potenciais efeitos tóxicos ou colaterais in vivo.

[0053] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da invenção tem uma meia vida in vivo de cerca de ou mais de qualquer um de 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 62, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 ou 210 horas +/- 1 hora, ainda mais preferivelmente a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da presente invenção tem uma meia vida in vivo de cerca de ou mais de 24 horas.

[0054] Ainda de preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)- Fc da invenção tem uma meia vida in vitro de cerca de ou mais de qualquer um de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 , 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122 , 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152,154, 156, 158, 160, 62, 164, 166, 168, 170, 172, 174 , 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 e 210 dias de +/- 1 dia, mais de preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da presente invenção tem uma meia vida in vitro de cerca de ou mais de 6 dias. De preferência, a estabilidade é medida a cerca de pH fisiológico, numa solução aquosa tamponada, de preferência a 20° C ou 37° C.

[0055] De acordo com as concretizações preferidas anteriores, preferencialmente a meia vida in vivo é uma meia vida em ratos ou meia vida em humanos, mais preferencialmente em humanos. De preferência, a meia vida é determinada a partir de medições no soro dos níveis da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da invenção após a administração in vivo, por exemplo, por injeção intravenosa ou subcutânea.

[0056] As porções p75NTR(NBP) e Fc de imunoglobulina da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc podem ser conectadas através de um ligante. O ligante preferencialmente compreende ou consiste em um ou uma pluralidade de aminoácidos ou compreende ou consiste em uma sequência de polipeptídeo de aminoácidos, de preferência cerca de 1 a cerca de 25 aminoácidos, de preferência, qualquer um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos ainda mais preferencialmente qualquer um de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21 22, 23 ou 24 aminoácidos, mais preferivelmente 13 aminoácidos.

[0057] De preferência, o ligante compreende ou consiste em uma sequência polipeptídica de aminoácidos que não tem qualquer estrutura secundária estável, tal como alfa-hélice, cadeia beta, hélice 310 e hélice PI, hélice de poliprolina, folha alfa. De preferência a região ligante compreende ou consiste em uma sequência polipeptídica de aminoácidos que define um polipeptídeo flexível ou dinâmico ou polipeptídeo não estruturado, tal como, por exemplo, uma alça flexível, espiral aleatória ou volta flexível, tais polipeptídeos não estruturados são muitas vezes utilizados para conectar as regiões de estrutura secundária em grandes moléculas de proteína.

[0058] De preferência, o ligante é uma sequência polipeptídica de aminoácidos que compreende mais do que ou cerca de 50% de glicina e/ou alanina e/ou serina na p75NTR(NBP), ainda mais preferivelmente mais do que ou cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de glicina e/ou alanina e/ou serina na p75NTR(NBP). De preferência a região ligante compreende ou consiste em uma sequência polipeptídica de aminoácidos que compreende tanto glicina e serina, de preferência com uma proporção maior de glicina do que de serina, de preferência a região ligante compreende ou consiste em ligantes flexíveis.

[0059] Sem desejar estarem limitados por qualquer teoria particular, os inventores acreditam que os ligantes flexíveis superam ou previnem o impedimento estérico que poderia interferir com a capacidade de ligação da neurotrofina acima mencionada ou atividade biológica da fusão p75NTR(NBP)-Fc quando comparada com a p75NTR(NBP) sozinha. Assim a região ligante preferencialmente permite a flexibilidade entre a porção p75NTR(NBP) e a porção Fc de imunoglobulina e permite a retenção da ou melhoria da atividade biológica acima mencionada da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc em comparação com a p75NTR(NBP) livre ou nativa sozinha como determinado por ligação a neurotrofinas usando ensaios de ligação tais como aqui descritos.

[0060] Mais preferivelmente o ligante é imunologicamente inerte, tal que não provoca a lise mediada por complemento, não estimula a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), não ativa microglia ou células-T. De preferência, a região ligante é reduzida em uma ou mais destas atividades.

[0061] Mais preferencialmente, o ligante compreende ou consiste num polipeptídeo conhecido ou previsto a partir da análise estrutural ou previsão estrutural para ser um polipeptídeo flexível ou dinâmico ou não estruturado ou para não ter uma estrutura secundária estável.

[0062] Mais preferencialmente, o ligante compreende ou consiste em um peptídeo de fórmula GX, em que x é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[0063] A proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da invenção pode também compreender um local de clivagem proteolítica, opcionalmente interposto entre a porção p75NTR(NBP) e a porção de Fc de imunoglobulina. O local de clivagem proteolítica pode ser localizado no ligante ou na junção do ligante com tanto a porção p75NTR(NBP) ou/e a porção Fc de imunoglobulina. A p75NTR(NBP) pode opcionalmente ser clivada a partir da porção Fc de imunoglobulina antes da formulação e ou administração para fins terapêuticos.

[0064] Alternativamente, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc da invenção pode ser manipulada para remover locais de clivagem proteolítica. Numa concretização preferida, os locais de clivagem de secretase alfa e gama podem ser removidos. Numa concretização particularmente preferida, a sequência de GSSQPVVTRGTTDNDIEGRMD (SEQ ID No. 5) é removida.

[0065] De acordo com outras concretizações preferenciais, determinados aminoácidos na proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc podem ser alterados a fim de melhorar as propriedades tais como o rendimento ou a solubilidade. Uma concretização particularmente preferida é a alteração do resíduo de cisteína na posição 222 para um resíduo de serina, que foi descoberto reduzir a agregação da proteína, uma vez que é expressa a partir de células CHO durante a fabricação da proteína.

[0066] De preferência, o ligante e/ou a porção Fc de imunoglobulina não danificam ou significativamente danificam a porção p75NTR(NBP): (a) efeito sobre a atividade funcional das neurotrofinas (definida como modulando ou regulando para cima ou para baixo a atividade funcional das neurotrofinas) NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5, (b) afinidade de ligação por qualquer um de NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação de entre cerca de 0,1 nM a cerca de 50 nM (c) capacidade de se ligar a cada uma das neurotrofinas NGF, NT3, BDNF e NT4/5, de preferência NGF, NT3, BDNF e NT4/5 humana.

[0067] De acordo com outro aspecto da invenção, proporciona-se uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com os primeiro ou segundo aspectos. De preferência, a molécula de ácido nucleico é para utilização no tratamento da dor.

[0068] De acordo com uma concretização preferida da presente invenção, a molécula de ácido nucleico pode ainda compreender uma região que codifica para uma sequência de sinal, preferencialmente uma sequência de sinal de p75NTR, por exemplo, uma sequência de DNA ou RNA.

[0069] De acordo com outro aspecto da invenção é proporcionado um vetor de expressão replicável para transfecção de uma célula, o vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico do terceiro aspecto, de preferência, o vetor é um vetor viral. De preferência, o vetor é para ser utilizado no tratamento da dor.

[0070] Ainda de acordo com os aspectos acima mencionados da invenção, é proporcionado um método de expressão da molécula de ácido nucleico ou o vetor da presente invenção para produzir ou secretar a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc. De preferência, o método compreende a introdução da molécula de ácido nucleico ou vetor numa célula e expressão do ácido nucleico na mesma para produzir ou secretar a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc. De preferência, a molécula de ácido nucleico ou vetor é introduzido na célula in vitro, alternativamente, in vivo. De preferência, a proteína de fusão expressa p75NTR(NBP)-Fc é expressa in vitro, adicionalmente opcionalmente isolada e purificada, alternativamente de um modo preferido a proteína de fusão expressa p75NTR(NBP)-Fc é expressa in vivo, de preferência a expressão in vivo constitui terapia genética. De preferência, o vetor é um vetor de expressão replicável, opcionalmente, para a transfecção de uma célula de mamífero, de preferência o vetor é um vetor viral.

[0071] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada uma célula hospedeira que abriga a molécula de ácido nucleico ou vetor tanto do terceiro ou quarto aspecto, de um modo preferido, a célula é uma célula de mamífero.

[0072] De acordo com outro aspecto da invenção, proporciona-se a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc para uso no tratamento da dor ou de um sintoma de dor, ou um ácido nucleico ou um vetor para utilização no tratamento da dor ou dos sintomas de dor. Dor ou sintomas de dor podem incluir, mas não estão limitados a: (a) dor aguda e/ou dor espontânea, (b) dor crônica e ou dor em curso, (c) dor inflamatória incluindo qualquer uma de dor artrítica, dor resultante de osteoartrite ou artrite reumatoide, resultante de doenças inflamatórias do intestino, psoríase e eczema (d) dor nociceptiva, (e) dor neuropática, incluindo neuropatia diabética dolorosa ou dor associada a nevralgia pós-herpética, (f) a hiperalgesia, (g) alodinia, (h) dor central, dor pós-acidente vascular cerebral central, dor resultante de esclerose múltipla, dor resultante de lesão da medula espinhal, ou dor resultante de doença de Parkinson ou epilepsia, (i) dor do câncer, (j) dor pós-operatória, (k) dor visceral, incluindo dor digestiva visceral e dor visceral não digestiva, dor devido a desordens gastrointestinais (GI), dor resultante de distúrbios funcionais do intestino (FBD), dor resultante de doenças inflamatórias do intestino (IBD), dor resultante de dismenorreia, dor pélvica, cistite, cistite intersticial ou pancreatite, (l) dor musculoesquelética, mialgia, fibromialgia, espondilite, artropatias seronegativas (não-reumatoide), reumatismo não articular, distrofinopatia, Glicogenólise, polimiosite, piomiosite, (m) dor cardíaca ou vascular, dor devido à angina, infarto do miocárdio, estenose mitral, pericardite, fenômeno de Raynaud, escleredoma, isquemia do músculo esquelético ou escleredoma, (n) dor de cabeça, incluindo enxaqueca, enxaqueca com aura, enxaqueca sem aura, cefaleia em salvas, cefaleia do tipo tensional. (o) dor orofacial, incluindo dor dental, dor miofascial temporomandibular ou zumbido, ou (p) dor nas costas, bursite, dores menstruais, enxaqueca, dor referida, neuralgia trigeminal, hipersensibilização, dor resultante de trauma espinhal e/ou degeneração ou acidente vascular cerebral.

[0073] O tratamento da dor inclui, mas não está limitado a, prevenir, melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor e/ou um sintoma de dor.

[0074] De acordo com outro aspecto da invenção, proporciona-se a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com os primeiro ou segundo aspectos ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos, em que a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc ou a molécula de ácido nucleico ou vetor é para utilização separada, sequencial ou simultânea em uma combinação combinada com um segundo composto farmacologicamente ativo. De preferência, o segundo composto farmacologicamente ativo da combinação pode incluir, mas não está limitada a; • um analgésico opióide, por exemplo, morfina, heroína, a hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanilo, cocaína, codeína, dihidrocodeína, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina e pentazocina; • uma droga anti-inflamatória não esteroide (NSAID), por exemplo, aspirina, diclofenac, diflusinal, etodolac, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolac, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, nimesulida, nitroflurbiprofen, olsalazina, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulfasalazina, sulindac, tolmetina ou zomepirac; • um sedativo barbitúrico, por exemplo, amobarbital, aprobarbital, butabarbital, butalbital, mefobarbital, metarbital, metohexital, pentobarbital, fenobartital, secobarbital, talbutal, teamilal ou tiopental; • uma benzodiazepina possuindo uma ação sedativa, por exemplo, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam ou triazolam; • um antagonista de H1 possuindo uma ação sedativa, por exemplo, difenidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina ou clorciclizina; • um sedativo, tal como glutetimida, meprobamato, metaqualona, dicloralfenazona ou; • um relaxante do músculo esquelético, por exemplo, baclofen, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol ou orfrenadina; • um antagonista do receptor de NMDA, e.g. dextrometorfano ((+)- 3-hidroxi-N-metilmorfinano), ou o seu metabolito dextrorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano), ketamina, memantina, pirroloquinolina quinina, ácido cis-4-(fosfonometil)-2- piperidinocarboxílico, budipina, EN-3231 (MorphiDex®, uma formulação de combinação de morfina e dextrometorfano), topiramato, neramexano ou perzinfotel incluindo um antagonista de NR2B, por exemplo, ifenprodil, traxoprodil ou (-)-(R)-6-{2- [4-(3-fluorofenil)-4-hidroxi-1-piperidinil]-l-hidroxietil-3,4- di-hidro-2(1H)-quinolinona; • um alfa-adrenérgicos, por exemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina, guanfacina, dexmetatomidina, modafinil, ou 4-amino- 6,7-dimetoxi-2-(5-metano-sulfonamido-l,2,3,4- tetrahidroisoquinol-2-il)-5-(2-piridil)-quinazolina; • um antidepressivo tricíclico, por exemplo, desipramina, imipramina, amitriptilina ou nortriptilina; • um anticonvulsivo, por exemplo, carbamazepina, lamotrigina, topiratmato ou valproato; • um antagonista de taquicinina (NK), particularmente um antagonista NK-3, NK-2 ou NK-1, por exemplo, (aR, 9R)-7- [3,5- bis(trifluorometil)benzil]-8,9,10,11-tetrahidro-9-metil-5-(4- metilfenil)-7H- [l,4]diazocino [2,1-g] [l,7]naftiridina-6-13- diona (TAK-637), 5- [ [(2R,3S)-2- [(1R)-1- [3,5- bis(trifluorometil)fenil]etoxi-3-(4-fluorofenil)-4- morfolinil]-metil]-l,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (MK-869), aprepitant, lanepitant, dapitant e 3- [ [2-metoxi-5- (trifluorometoxi)fenil]metilamino]-2-fenilpiperidina (2S, 3S); • um antagonista muscarínico, por exemplo, oxibutinina, tolterodina, propiverina, cloreto de tropsium, darifenacina, solifenacina, temiverina e ipratrópio; • um inibidor seletivo de COX-2, por exemplo, celecoxib, rofecoxib, parecoxib, valdecoxib, deracoxib, etoricoxib, ou lumiracoxib; • um analgésico de alcatrão de carvão, em particular paracetamol; • um dos neurolépticos tais como droperidol, clorpromazina, haloperidol, perfenazina, tioridazina, mesoridazina, trifluoperazina, flufenazina, clozapina, olanzapina, risperidona, ziprasidona, quetiapina, sertindol, aripiprazol, sonepiprazole, blonanserina, iloperidona, perospirona, raclopride, zotepina, bifeprunox, asenapina, lurasidona, amisulprida, balaperidona, palindore, eplivanserina, osanetant, rimonabant, meclinertant, Miraxion® ou sarizotan; • um agonista do receptor vaniloide (por exemplo, resiniferatoxina) ou antagonista (por exemplo, capsazepina); • um beta-adrenérgico tal como propranolol; • um anestésico local tal como mexiletina; • um corticosteroide, como a dexametasona; • um agonista do receptor 5-HT ou antagonista, particularmente um agonista 5-HT1B/1D tais como eletriptano, sumatriptano, naratriptano, zolmitriptano ou rizatriptano; • um antagonista do receptor de 5-HT2A tal como R(+)-alfa- (2,3- dimetoxi-fenil)-l- [2-(4-fluorofeniletil)]-4-piperidinametanol (MDL-100907); • um analgésico colinérgico (nicotínico), tal como isproniclina (TC-1734), (E)-N-metil-4-(3-piridinil)-3-buten-1-amina (RJR- 2403), (R)-5-(metoxi-2-azetidinona)-2-cloropiridina (ABT-594) ou nicotina; • Tramadol®; • um inibidor de PDEV, tal como 5- [2-etoxi-5-(4-metil-1- piperazinil-sulfonil)fenil]-1-metil-3-n-propil-l,6-dihidro-7H- pirazolo [4,3-d]pirimidin-7-ona (Sildenafil), (6R,12aR)- 2,3,6,7,12,12a-hexahidro-2-metil-6-(3,4-metilenodioxifenil)- pirazino [2',1':6,1]pirido [3,4-b]indol-1,4-diona (IC-351 ou tadalafil), 2- [2-etoxi-5-(4-etil-piperazin-1-il-1-sulfonil)- fenil]-5-metil-7-propil-3H-imidazo [5,1-f] [1,2,4]triazin-4-ona (vardenafil), 5-(5-acetil-2-butoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1- etil-3-azetidinil)-2,6-di-hidro-7H-pirazolo [4,3-d]pirimidin-7- ona, 5-(5-acetil-2-propoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1-isopropil- 3-azetidinil)-2,6-di-hidro-7H-pirazolo [4,3-d]pirimidin-7-ona, 5- [2-etoxi-5-(4-etilpiperazin-1-ilsulfonil)piridin-3-il]-3- etil-2- [2-metoxietil]-2,6-di-hidro-7H-pirazolo [4,3-d]pirimidin 7-ona, 4- [(3-cloro-4-metoxibenzil)amino]-2- [(2S)-2- (hidroximetil)pirrolidin-1-il]-N-(pirimidin-2- ilmetil)pirimidina-5-carboxamida, 3-(1-metil-7-oxo-3-propil- 6,7-dihidro-lH-pirazolo [4,3-d]pirimidin-5-il)-N- [2-(l- metilpirrolidin-2-il)etil]-4-propoxibenzenosulfonamida; • um canabinoide; • antagonista do receptor de subtipo 1 de glutamato metabotrópico (mGluR1); • um inibidor da reabsorção de serotonina tal como a sertralina, demetilsertralina metabólito de sertralina, fluoxetina, norfluoxetina (metabólito fluoxetina desmetil), fluvoxamina, paroxetina, citalopram, desmetilcitalopram metabólito de citalopram, escitalopram, d,1-fenfluramina, femoxetina, ifoxetina, cianodotiepina, litoxetina, dapoxetina, nefazodona, cericlamina e trazodona; • um inibidor de reabsorção de noradrenalina (norepinefrina), tal como a maprotilina, lofepramina, mirtazepina, oxaprotilina, fezolamina, tomoxetina, mianserina, bupropiona, hidroxibupropriona metabólito de bupropiona, nomifensina e viloxazina (Vivalan®), especialmente um inibidor da reabsorção de noradrenalina, tal como reboxetina, em particular (S,S)- reboxetina; • um inibidor dual da reabsorção da serotonina-noradrenalina, tal como venlafaxina, O-desmetil-venlafaxina metabólito de venlafaxina, clomipramina, desmetilclomipramina metabólito de clomipramina, duloxetina, milnaciprano e imipramina; • um inibidor de óxido nítrico sintetase (iNOS) indutível tal como S- [2- [(l-iminoetil)amino]etil]-L-homocisteína, S- [2- [(1- iminoetil)amino]etil]-4,4-dioxo-L-cisteína, S- [2- [(1- iminoetil)amino]etil]-2-metil-L-cisteína, (2S,5Z)-2-amino-2- metil-7- [(1-iminoetil)amino]-5-heptenoico, 2- [ [(lR,3S)-3-amino- 4-hidroxi-1-(5-tiazolilo)-butil]-tio]-5-cloro-3- piridinocarbonitrila; 2- [ [(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5- tiazolilo)butil]tio]-4-clorobenzonitrila, (2S,4R)-2-amino-4- [ [2-cloro-5-(trifluorometil)fenil]tio]-5-tiazolebutanol, 2- [ [(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolilo)-butil]-tio]-6- (trifluorometil)-3-piridinacarbonitrila, 2- [ [(1R,3S)-3-amino-4- hidroxi-1-(5-tiazolil)-butil]-tio]-5-clorobenzonitrila, N- [4- [2-(3-clorobenzilamino)etil]fenil]tiofeno-2-carboxamidina, ou guanidinoetildissulfeto; • um inibidor da acetilcolinesterase tal como donepezil; • um antagonista de prostaglandina E2 subtipo 4 (EP4), tal como N- [({2- [4-(2-etil-4,6-dimetil-lH-imidazo [4,5-c]piridin-1- il)fenil]etil}amino)carbonil]-4-metilbenzeno-sulfonamida ou 4- [(1S)-1-({ [5-cloro-2-(3-fluorofenoxi)piridin-3- il]carbonil}amino)etil]benzoico; • um antagonista de leucotrieno B4; tal como ácido 1-(3-bifenil- 4-ilmetil-4-hidroxi-croman-7-il)ciclopentanocarboxílico (CP- 105696), ácido 5- [2-(2-carboxietil)-3- [6-(4-metoxifenil)-5E- hexenilo]oxifenoxi]-valérico (ONO-4057) ou DPC-11870, • um inibidor de 5-lipoxigenase, tal como zileuton, 6- [(3- fluoro-5- [4-metoxi-3,4,5,6-tetra-hidro-2H-piran-4-il])fenoxi- metil]-l-metil-2-quinolona (ZD-2138), ou 2,3,5-trimetil-6-(3- piridilmetil), 1,4-benzoquinona (CV-6504); • um bloqueador do canal de sódio, tal como lidocaína; ou • um antagonista de 5-HT3, tal como ondansetron; e os seus sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis.

[0075] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um método para tratar, prevenir, melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor ou qualquer dor e/ou sintomas de dor precedentes num indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos.

[0076] A presente invenção é aplicável em ambos os campos da medicina humana e veterinária. De preferência o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um animal de companhia, tal como um cavalo, um gato ou cão ou um animal de criação, tal como uma ovelha, vaca ou porco. Mais preferencialmente, o indivíduo é um ser humano.

[0077] De acordo com um oitavo aspecto da presente invenção, proporciona-se uma composição farmacêutica para qualquer um ou mais de tratar, prevenir, melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor ou qualquer dor/ou sintomas precedentes, compreendendo a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos e um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente.

[0078] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com os primeiro ou segundo aspectos ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos ou a farmacêutica do oitavo aspecto é preparada para ou adequada para administração por via oral, sublingual, bucal, tópica, retal, inalação, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intra-óssea, intradérmica, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravítrea, intraarticular, peri-articular, local ou epicutânea.

[0079] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do oitavo aspecto é preparada para ou adequada para administração antes e/ou durante e/ou após o aparecimento da dor ou para tal utilização.

[0080] De preferência, a p75NTR(NBP)-Fc de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do oitavo aspecto é para ou preparada para administração entre uma vez a sete vezes por semana, mais preferivelmente entre uma a quatro vezes por mês, mais preferivelmente entre uma vez a seis vezes por período de 6 meses, ainda mais preferencialmente uma vez a doze vezes por ano. De preferência, o medicamento é para ser ou preparado para ser administrado perifericamente em um período incluindo, mas não se limitando a: uma vez por dia, uma vez a cada dois, três, quatro, cinco ou seis dias, semanalmente, de duas em duas semanas, uma vez a cada três semanas, mensalmente, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada sete meses, uma vez a cada oito meses, uma vez a cada nove meses, uma vez a cada dez meses, uma vez a cada onze meses ou anualmente.

[0081] Ainda de preferência a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do oitavo aspecto é para ser ou preparada para ser administrada perifericamente por meio de um percurso incluindo, mas não limitado a um ou mais de; oralmente, sublingualmente, bucalmente, topicamente, retalmente, via inalação, transdermicamente, subcutaneamente, intravenosamente, intra-arterialmente ou intramuscularmente, via administração intracardíaca, intraosseamente, intradermicamente, intraperitonealmente, transmucosamente, vaginalmente, intravitreamente, epicutaneamente, intra-articularmente, peri- articularmente ou localmente.

[0082] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com o terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do oitavo aspecto é para ou é preparada para administração a uma concentração de entre cerca de 0,05 a cerca de 200 mg/ml; preferencialmente, em qualquer uma de cerca de 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 mg/mL +/- cerca de 10% de erro, mais preferencialmente a cerca de 3 mg/ml em aplicações veterinárias e 0,1 em seres humanos.

[0083] De preferência, a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do oitavo aspecto é para ou é preparada para administração a uma concentração de entre cerca de 0,1 a cerca de 200 mg/kg de peso corporal; preferencialmente, em qualquer uma de cerca de 0,5, 1, 5, 10,15 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110 , 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou cerca de 200 mg/kg de peso corporal +/- cerca de 10% de erro, mais preferencialmente a cerca de 10 mg/kg em aplicações veterinárias e 0,3 em humanos.

[0084] De acordo com um nono aspecto da presente invenção, é proporcionado um kit compreendendo: (a) a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do oitavo aspecto; e (b) instruções para a administração de uma quantidade eficaz da referida proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc, molécula de ácido nucleico, vetor ou composição farmacêutica a um indivíduo para qualquer um ou mais de prevenção ou tratamento da dor e/ou sintomas de dor ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor e/ou sintomas de dor.

[0085] O kit pode incluir um ou mais recipientes que contêm a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc, ácido nucleico, vetor ou composição farmacêutica aqui descrita e instruções para utilização de acordo com qualquer um dos métodos e utilizações da presente invenção. O kit pode ainda compreender uma descrição para selecionar um indivíduo adequado para tratamento com base em identificar se esse indivíduo tem uma dor ou um sintoma de dor ou se está em risco de ter tais. As instruções para a administração da composição farmacêutica podem incluir informações como a dosagem, programa de dosagem e vias de administração para o tratamento pretendido.

[0086] De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção proporciona-se a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com o primeiro ou segundo aspecto, ou as concretizações preferidas da mesma, ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com os terceiro e quarto aspectos ou a composição farmacêutica do oitavo aspecto para utilização em qualquer um ou mais de prevenção ou tratamento ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou progressão de uma condição ou os sintomas de uma condição associada com qualquer uma ou mais das neurotrofinas NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5.

[0087] - NGF (fator de crescimento do nervo) liga-se com pelo menos duas classes de receptores: a p75NTR e TrkA, uma tirosina quinase transmembranar, que está envolvida no crescimento axonal, ramificação e elongação. Condições e sintomas associados com o NGF são conhecidos. O NGF é expresso e associado com condições inflamatórias e dor [Sequência da Proteína NP_002497.2, NP_038637]. Além disso, o NGF tem sido demonstrado desempenhar um papel em numerosas doenças cardiovasculares, tais como a aterosclerose coronária, obesidade, diabetes tipo 2, e síndrome metabólica, bem como esclerose múltipla. Níveis plasmáticos reduzidos de NGF (e também de BDNF) têm sido associados com síndromes coronárias agudas e síndromes metabólicas. NGF também é relativa a vários distúrbios psiquiátricos, tais como demência, depressão, esquizofrenia, autismo, síndrome de Rett, anorexia nervosa e bulimia nervosa e também tem sido implicado no desenvolvimento da doença de Alzheimer e desordens neurodegenerativas. NGF também foi demonstrado acelerar a cicatrização de feridas e há evidências de que ele poderia ser útil no tratamento de úlceras de pele e úlceras da córnea, ele tem sido demonstrado reduzir a degeneração neural e para promover a regeneração do nervo periférico em ratos.

[0088] - BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro) é uma neurotrofina que suporta a sobrevivência neuronal e crescimento durante o desenvolvimento do sistema nervoso [Sequência de Proteína NP_001137277.1, NP_001041604]. BDNF se liga a TrkB e p75NTR receptores da superfície celular e também modula a atividade de receptor nicotínico alfa-7. Condições e sintomas associados com o BDNF são conhecidos. O BDNF foi demonstrado desempenhar um papel importante na transmissão da dor fisiológica e patológica, em particular em modelos de dor aguda, dor inflamatória e dor neuropática, em que a síntese de BDNF é descoberta ser significativamente aumentada; BDNF também demonstrou ser regulado positivamente em condições de dor crônica, bem como outras condições tais como eczema e psoríase. A regulação negativa do BDNF é vista em depressão, esquizofrenia, transtorno obsessivo-compulsivo, doença de Alzheimer, doença de Huntington, síndrome de Rett, e demência, bem como a anorexia nervosa e bulimia nervosa.

[0089] - Neurotrofina-4 (NT-4), também conhecida como neurotrofina-5 (NT-5), é um fator neurotrófico que sinaliza predominantemente através de receptores p75NTR e TrkB e promove a sobrevivência dos neurônios simpáticos sensoriais periféricos. O peptídeo maduro desta proteína é idêntico em todos os mamíferos examinados, incluindo humanos, porco, rato e ratinho. [Sequência de proteína NP_006170, NP_937833]. NT-4 é sintetizada pela maioria dos neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) e aqueles nos gânglios simpáticos paravertebrais e pré-vertebrais, dorsal da medula e corno ventral e é expresso em muitos tecidos incluindo a próstata, timo, placenta e músculo esquelético. Condições e sintomas associados com NT-4/5 são conhecidos. Defeitos em NT4/5 estão associados com a susceptibilidade ao glaucoma primário de ângulo aberto. A Neurotrofina 4 também foi demonstrada contribuir para a sobrevivência de células do câncer de mama e é um alvo para inibir o crescimento do tumor. NT-4/5 é conhecida por estar envolvida em sistemas de sinalização de dor tal como a dor nociceptiva, a regulação positiva de NT-4/5 também é vista em condições inflamatórias crônicas da pele, tais como dermatite, eczema, lesões de prurigo de dermatite atópica. A regulação negativa de NT-4/5 é vista na doença de Alzheimer, doença de Huntington.

[0090] - Neurotrofina-3 (NT-3) é uma neurotrofina que está estruturalmente relacionada com a beta-NGF, BDNF, e NT-4, e que controla a sobrevivência e diferenciação de neurônios de mamíferos e a manutenção do sistema nervoso adulto, e pode afetar o desenvolvimento de neurônios no embrião quando é expressa na placenta humana. Condições e sintomas associados com NT3 são conhecidos. Camundongos deficientes de NTF3 gerados por alvejamento de genes exibem defeitos de movimento graves dos membros. NT-3 sinaliza através dos receptores Trk e promove o crescimento e a sobrevivência do nervo e células gliais [Protein Sequence NP_001096124.1 e NP_032768]. As sequências de aminoácidos de NT-3 humana, de ratinho e de rato são idênticas. NT3 e o seu receptor cognato, tirosina-quinase C (TrkC), são conhecidos por modular a dor neuropática e a dor nociceptiva e o mecanismo de nocicepção e proporiocepção, por exemplo, a expressão de NT3 é aumentada em pequenas células de DRG de animais neuropáticos. A expressão de NT3 também está associada a neuropatias tais como a polineuropatia diabética e neuropatia relacionada com o HIV, grande neuropatia de fibra, incluindo a atrofia, está ainda envolvida no desenvolvimento de hiperalgesia (uma diminuição do limiar de um estímulo normalmente nocivo), alodinia (um estímulo não nocivo se torna nocivo), e dor espontânea (dor nos estímulos de ausência aparente) e é um modulador de dor muscular conhecido.

[0091] A invenção será agora descrita por referência aos exemplos seguintes que são fornecidos para ilustrar, mas não limitar, a invenção.

Exemplos

[0092] Testes de imunogenicidade in silico para sequências de p75NTR-Fc.

[0093] A tecnologia de DNA recombinante é atualmente utilizada para produzir uma ampla gama de produtos biofarmacêuticos, incluindo a nova classe de proteínas de fusão terapêuticas multifuncionais com base no Fc (fragmento cristalizável) de anticorpos monoclonais (mAbs) (Huang, 2009, Curr Opin Biotechnol, 20(6),692-9). A fusão de uma proteína terapêutica a um domínio de Fc aumenta o efeito terapêutico global do biofarmacêutico, estendendo a meia vida no soro da molécula de duas maneiras distintas. Em primeiro lugar, reciclar a fusão Fc por ligação dependente de pH ao receptor de Fc neonatal (FcRn) reduz a degradação da proteína terapêutica em endossomos. Em segundo lugar, o aumento no tamanho molecular tanto por meio de adição de domínios Fc e pela dimerização mediada por Fc para a proteína terapêutica ajuda a limitar a depuração renal em relação à molécula terapêutica.

[0094] As proteínas de fusão podem ser criadas ao unir diretamente dois ou mais domínios em conjunto. No entanto, isto pode levar a propriedades moleculares indesejáveis na proteína de fusão resultante, tais como bio-atividade diminuída (Bai et al., 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. 102 7292-7296), o enrolamento incorreto da proteína (Zhao et al. 2008 Protein expr. Purif. 61, 73-77) ou rendimentos baixos de produção (Amet et al. 2009 Pharm. Res. 26, 523-528). Uma sequência do ligante pode ser inserida entre os domínios para resolver estes problemas potenciais, mas vários fatores devem ser levados em consideração na escolha do ligante apropriado. Em primeiro lugar, o ligante deve refletir a função global a que se destina dos domínios no interior da proteína de fusão. Em algumas situações, os domínios devem operar de forma independente, então a flexibilidade do ligante é desejável. Por outro lado, um ligante rígido pode ser necessário se os domínios devem ser amarrados. Em segundo lugar, o ligante não deve apresentar qualquer funcionalidade indesejada na proteína de fusão, através de modificações de pós-tradução (PTMs). Por último, a imunogenicidade potencial do ligante e as regiões que flanqueiam o ligante devem ser consideradas, já que o ligante pode ser uma sequência concebida de novo que não ocorre naturalmente no corpo humano.

[0095] A maioria das proteínas terapêuticas são, em grau variável, imunogênicas (Van de Walle et al 2007 Expert Opin Biol Ther 7 (3):405-18, Stas et al 2009 Immunogenicity assessment of antibody therapeutics. Cambridge University Press, Cambridge) e mesmo os chamados anticorpos terapêuticos totalmente humanos podem conter regiões imunogênicas (Harding et al. 2010 MAbs. 2, 256-265). A imunogenicidade é a capacidade para induzir uma resposta Th (T-auxiliar), que é acionada quando um receptor de células T único reconhece um peptídeo ligado a moléculas HLA de classe II indicadas em células apresentadoras de antígeno. Os peptídeos são gerados a partir de proteínas internalizadas pelas células apresentadoras de antígenos, que são então processados através da via de clivagem endossomal. Apenas os peptídeos com afinidade suficiente para as moléculas HLA de classe II serão apresentados na superfície da célula, e podem, possivelmente, provocar uma resposta Th.

[0096] Consequentemente, é possível diminuir a imunogenicidade potencial através da remoção de epitopos Th, um processo conhecido como de-imunização (Chamberlain de 2002, The Regulatory Review 5, 4-9, Baker e Jones 2007 Curr. Opin Drug Discov. Devel. 10, 219-227). Isto é conseguido através da previsão de quais peptídeos na proteína terapêutica podem se ligar a moléculas HLA de classe II, e, subsequentemente, introduzir substituições que eliminam ou reduzem a afinidade de ligação de peptídeos para as moléculas HLA de classe II.

[0097] Existem vários genes HLA de classe II e quase todos são altamente polimórficos. Além disso, as moléculas de HLA de classe II consistem em uma cadeia alfa e beta, cada uma derivada de um gene diferente que, com o polimorfismo inerente, aumenta ainda mais a variação. Especificamente, cada indivíduo expressa os genes: DRA/DRB, DQA/DQB e DPA/DPB. Destes, apenas DRA é não- polimórfico. Além disso, um "segundo" gene DRB (DRB3, DRB4 ou DRB5) também pode estar presente associa com a cadeia de DRA.

[0098] O foco durante uma de-imunização está sobre os alótipos DR, que são conhecidos por expressar a um nível mais elevado do que DQ e DP (Laupeze et al., 1999 Hum. Immunol. 60, 591-597, 1988 Gansbacher e Zier celular Immunol 117, 22-34, Berdoz et al. 1987 J. Immunol. 139, 1336-1341, Stunz et al., 1989 J. Immunol. 143, 3081-3086). Alótipos DR são geralmente referidos pelo gene DRB à medida que o gene DRA permanece constante, por exemplo, DRB1*01:01, em que os dígitos são específicos para o alelo.

[0099] A avaliação da severidade para epitopos individuais baseia-se nos critérios de promiscuidade, isto é, o número de alótipos de HLA a que um epitopo específico se liga, bem como a importância (frequência) dos alótipos na população e uma avaliação qualitativa da força de ligação do complexo HLA:peptídeo. À medida que a população de células T de um indivíduo tiver sido selecionada para não reconhecer "auto- peptídeos" é possível triar a proteína que está sendo de- imunizada para peptídeos que correspondem a auto-peptídeos (conhecidos) que não devem normalmente induzir uma resposta Th. Embora não seja conhecido em detalhes quais proteínas endógenas são internalizadas durante a maturação de células T e, como tal, dão origem a auto-peptídeos, os anticorpos encontram-se dentre elas (Kirschmann et al., 1995 J. Immunol. 155, 5655-5662, Verreck et ai. 1996 Immunogenetics 43, 392-397, Harding et al. 2010 MAbs. 2, 256-265). Concepção da Proteína de Fusão p75-NTR-Fc

[0100] O alótipo específico da porção Fc da proteína de fusão p75-NTR-Fc foi o vetor pCon de IgG IgGza (ver acima).

[0101] A concepção de uma proteína de fusão p75-NTR-Fc procedeu em várias etapas: • A construção exata da sequência de p75-NTR para ser utilizada na proteína de fusão Fc foi definida. Vários fatores foram considerados, incluindo: o A fusão p75-NTR-Fc deveria ser capaz de se ligar a várias neurotrofinas, incluindo pelo menos NGF, BDNF, NT-3 e NT-4; a flexibilidade deve ser mantida na proteína de fusão p75-NTR Fc. o locais de clivagem indesejados de alfa-secretase estão presentes no domínio extracelular na p75-NTR-Fc (SEQ ID No. 1), estes devem ser removidos a partir da sequência já que irão ser submetidos a clivagem e, consequentemente, reduzirão a atividade biológica e perfil PK do produto p75-Fc in vivo. O produto original p75-Fc (ver SEQ ID N° 1) conteve os locais de clivagem de alfa-secretase e, consequentemente, a meia vida e a atividade biológica (PK/PD) foi significativamente reduzida em comparação com a SEQ ID No. 3 (ver abaixo).

[0102] Ligantes empíricos apropriados, adequados para utilização para unir o domínio p75-NTR extracelular e o Fc em uma proteína de fusão p75-NTR-Fc, foram identificados. Sequências ligantes contendo locais que podem potencialmente participar na Modificação Pós-Traducional (PTMs) foram excluídas.

[0103] Diversas variantes da proteína de fusão Fc-p75-NTR foram construídas in silico utilizando a construção de p75-NTR definida com a porção apropriada da região Fc utilizando diferentes sequências de ligantes potenciais. A modelagem estrutural e análise do C-terminal do domínio extracelular de p75-NTR, a região de dobradiça de Fc e ligante potencial foi tentada (ver Tabela 1).

[0104] As variantes com sequências de ligantes diferentes foram rastreadas utilizando Epibase™ para potenciais epítopos Th.

[0105] A proteína de fusão p75-NTR-Fc de Sequência 3 expressa (SEQ ID No. 3) foi proposta a base do risco de imunogenicidade previsto.

Análise da Sequência da Proteína de Fusão de Fc

[0106] As sequências proteicas para treze das proteínas de fusão de Fc terapêuticas atualmente disponíveis foram obtidas a partir do website de Nomes Adotados dos Estados Unidos (USAN) (http://www.ama-assn.org/ama/pub/physician-resources/medical- science/). Sempre que possível, as sequências proteicas foram cruzadas em referências e comparadas com outros recursos online, como sites de informação de patentes on-line. As sequências proteicas para proteínas de fusão de Fc de grau de pesquisa foram obtidas a partir de outros fornecedores comerciais utilizando recursos on-line.

[0107] Para identificar a sequência parental putativa a partir das quais diferentes proteínas de fusão de Fc foram derivadas, as sequências da proteína de fusão de Fc foram alinhadas com os produtos proteicos traduzidos de vetores Lonza IgG PCON interno usando MAFFT (Katoh et al., 2002 Nucleic Acids Res. 30, 3059-3066). As sequências de proteína de fusão de Fc alinhadas foram então truncadas na posição onde a fusão de Fc começou a corresponder à sequência de IgG. A fim de determinar o local que a sequência de IgG começou, um critério de três resíduos consecutivos de IgG foi usado.

[0108] Uma pesquisa BLAST (Altschul et al 1997 Nucleic Acids Res 25 3389-3402) de uma cópia interna do banco de dados UniProt (The UniProt Consortium, UniProt release 2012-09 - 03 de outubro de 2012) foi realizada utilizando sequências de proteínas de fusão de Fc truncadas sem a sua sequência IgG, para identificar as sequências de proteína mais próximas correspondentes. Cada sequência de proteína de fusão de Fc foi então manualmente realinhada contra ambas as sequências correspondentes mais próximas encontrados na base de dados UniProt e a sequência Lonza IgG pCon correspondente mais próxima. As junções entre os parceiros de fusão e as regiões de Fc foram, em seguida, extraídas e dois conjuntos foram criados, um para as 13 proteínas de fusão de Fc terapêuticas e um para as proteínas de fusão de Fc comercialmente disponíveis. A partir destes dois conjuntos, as regiões de ligante foram então definidas.

[0109] O conjunto de sequências de proteínas de fusão de Fc comercialmente disponíveis foi então truncado na posição N-terminal onde a identidade de sequência com a sequência correspondente Lonza IgG pCon mais próxima foi descoberta. As sequências truncadas foram então classificadas e um conjunto não redundante de sequências foi gerado.

Criando perfil imune de Epibase™

[0110] A criação do perfil imune de Epibase™ foi realizada em variantes da proteína de fusão de Fc usando alótipos de HLA 85 de classe II no conjunto global.

[0111] Uma comparação entre as variantes de proteína de fusão de Fc no que diz respeito ao seu risco imunogênico utilizando apenas previsões de ligação a HLA é muito difícil. Isto é devido a vários fatores importantes que não são considerados: • O peptídeo de ligação pode não ser gerado pela máquina de processamento e, portanto, nunca seria exposto como um complexo peptídeo-HLA para células Th por células apresentadoras de antígeno. • O complexo peptídeo-HLA pode não ser reconhecido por uma célula Th.

[0112] Tendo em conta estas considerações, três tipos de comparações quantitativas podem ser feitas usando Criação de Perfil Imune de Epibase™ entre sequências variantes. Em primeiro lugar, o número de epitopos importantes para cada um dos conjuntos de alótipo DRB1, DRB3/4/5, DQ e DP pode ser comparado, com peptídeos que se ligam a múltiplos alótipos do mesmo grupo contado como um. Tal contagem de epítopo mostra o número de epítopos únicos dentro de cada conjunto e a diferença entre as variantes revela a completa remoção ou adição de potenciais epítopos Th.

[0113] Como muitos epítopos, especialmente epitopos promíscuos, alótipos múltiplos de ligação, a alteração na contagem de epitopo Th única pode obscurecer a redução ou aumento real do potencial de imunogenicidade entre as variantes. Por conseguinte, a segunda comparação quantitativa está ao nível de cada alótipo HLA sobre todos os epitopos Th, onde uma contagem dos peptídeos de ligação por alótipo para variantes, tomada em conjunto com o serotipo e a frequência da população permite uma comparação tanto no serotipo ou nível do alótipo. Em terceiro lugar, uma pontuação aproximada expressando um risco imunogênico de pior caso pode ser calculada como se segue:

[0114] O produto multiplicativo para cada alótipo afetados é calculado a partir do número de epitopos previstos para ligar a um determinado alótipo, e a frequência do alelo do alótipo afetado. Os produtos são adicionados a todos os alótipos afetados DRB1, DRB3/4/5, DQ e DP utilizados no estudo. Deve notar-se que as pontuações de alótipo individuais não são a métrica absoluta para medir o risco de imunogenicidade, já que todos os alótipos de HLA escolhidos (DRB1, DRB3/4/5, DQ e DP) devem ser levados em consideração.

[0115] Sequências da linha germinativa de anticorpos humanos, tais como aquelas derivadas a partir da Lonza pCon IgG Fc, não foram consideradas como sendo imunogênicas, já que elas são encontradas no banco de anticorpos circulantes apresentados ao sistema imunitário humano e podem ser consideradas como auto- peptídeos. De modo semelhante, p75-NTR não é considerada intrinsecamente imunogênica, uma vez que é expressa de forma natural no corpo humano. Como resultado, os epitopos importantes resultantes de peptídeos totalmente derivados tanto de sequências da linha germinativa de anticorpo humano como de p75- NTR são excluídos das contagens e pontuações de imunogenicidade apresentadas.

Modelagem estrutural

[0116] Os modelos estruturais da proteína de fusão p75-NTR- Fc proposta foram gerados utilizando a plataforma de modelagem de Lonza. Fragmentos de modelo estrutural candidato para a p75- NTR e a porção Fc foram pontuados, classificados e selecionados a partir de tanto uma base de dados de anticorpo interna e o Banco de Dados de Proteína (Protein Data Bank) (PDB), na sua identidade de sequência, bem como medidas de cristalografia qualitativa da estrutura do molde, tal como a resolução (em Angstrom(Â)).

[0117] Um alinhamento de sequência dos fragmentos de modelo estrutural para a proteína de fusão p75-NTR-Fc foi gerado. Os fragmentos de modelo, juntamente com o alinhamento da sequência foram processados por MODELLER (Sali et al., 1993 J. Mol. Biol 234, 779-815). Este protocolo cria restrições conformacionais derivadas do conjunto de modelos estruturais alinhados. Um conjunto de estruturas que satisfazem as restrições é criado por gradiente conjugado e procedimentos de otimização de anelamento simulados. Uma ou mais estruturas de modelos são selecionadas a partir deste conjunto, com base em uma pontuação de energia, derivada da pontuação da estrutura da proteína e satisfação das restrições de conformação. Os modelos foram inspecionados e as cadeias laterais das posições que diferem entre o alvo e o modelo foram otimizadas usando um algoritmo de otimização da cadeia lateral e energia minimizada. Um conjunto de ferramentas de visualização e computacionais foi usado para avaliar a variabilidade conformacional das estruturas, bem como o núcleo e local de empacotamento dos domínios para selecionar um ou mais modelos preferenciais.

Concepção da Proteína de Fusão p75-NTR-Fc

[0118] Três variantes ligantes das proteínas de fusão p75- NTR-Fc foram concebidas. Dadas as limitações de concepção de tentar manter a flexibilidade nas regiões de p75-NTR nas proteínas de fusão Fc finais e o desejo de evitar locais de clivagem indesejados para alfa e gama secretase, a sequência de p75-NTR extracelular foi truncada na posição G237. A Sequência 1 original de p75NTR-Fc (SEQ ID N° 1) foi truncada na posição A250. Os locais de clivagem de alfa secretase foram identificados na porção extracelular da p75-NTR entre as posições 241-242 e posições 244-245 (Zampieri et al., 2005 J Biol Chem. 280, 1456371) e um local de clivagem putativo de gama secretase foi inferido por homologia de sequência nas regiões de posição 282. É evidente a partir da PK/PD da Sequência 1 que a PK e a atividade biológica da Sequência 1 (SEQ ID N° 1) é significativamente reduzida em comparação com a Sequência 3 (SEQ ID No. 3). Concluiu-se destas experiências que os sítios de alfa e gama secretase contribuíram para a redução da atividade in vivo.

[0119] Os principais requisitos dos ligantes escolhidos para as variantes são para permitir a flexibilidade do parceiro de fusão na proteína de fusão de Fc, para evitar a introdução de quaisquer resíduos capazes de suportar PTMs e para manter a um baixo risco de imunogenicidade.

[0120] Existem duas classes de ligantes disponíveis para se juntar a p75-NTR à região constante de Fc, ligantes empíricos e ligantes derivados de proteínas naturais. Os ligantes derivados de proteínas naturais podem introduzir locais capazes de PTM indesejado e, devido à sua natureza, potencialmente têm um maior risco de introdução de imunogenicidade. Os ligantes empíricos foram levados para a frente para uma investigação mais aprofundada por estas razões e podem ser amplamente categorizados como flexíveis ou rígidos. As sequências de ligantes empíricos de unidades repetentes estão listadas abaixo, juntamente com a sua classificação de flexibilidade: • (G4S)x- flexível • GX- flexível • A(EAAAK)XA- rígida (ID SEQ N° 14) • (PA)X- rígida

[0121] Dada a necessidade de flexibilidade para assegurar a ligação a vários ligantes neurotróficos incluindo, pelo menos, NGF, BDNF, NT3 e NT4 na proteína de fusão de Fc final, apenas ligantes flexíveis foram considerados.

[0122] Com base nestas considerações, três variantes foram construídas, uma variante utilizando um ligante de poli-glicina e duas variantes usando o ligante de serina tetra-glicina. Todas as variantes consideram G209 (proteína expressa ver Sequência 3 (SEQ ID N° 3)) na sequência original de p75-NTR como parte da sequência de ligante. Além disso, as variantes contêm a mutação de cisteína para serina no local equivalente à posição 222 na sequência 1 original da proteína de fusão p75-NTR-Fc (SEQ ID N° 1). As regiões ligantes das variantes estão apresentadas na Figura 5.

[0123] Uma análise do potencial de imunogenicidade para cada uma das variantes e as outras sequências indicadas na Figura 1 foi realizada utilizando Epibase™. As pontuações de imunogenicidade previstas para epitopos críticos que afetam os 85 alótipos de classe II de HLA no conjunto Global são mostradas abaixo na Tabela 1. Além disso, as informações sobre o número de alótipos afetados por epitopos não críticos também é mostrado na Tabela 1. Tabela 1: Resumo das pontuações de epitopo crítico calculadas

[0124] Com base na imunogenicidade prevista e falta de quaisquer sítios susceptíveis de PTM, a Variante 1 (p75_Fc_G4xl) tem as melhores características das três variantes e foi produzida para os ensaios in vivo.

Afinidade de p75NTR-Fc de Sequência 1 (SEQ ID N° 1) e Sequência 3 (SEQ ID N° 3) para NGF

[0125] Um chip de Biacore foi preparado numa experiência na qual a proteína A foi acoplada por amina a células de fluxo 1 e 2. A cinética de um único ciclo de NGF se ligando a p75-Fc capturada foi medida.

[0126] A capacidade de ligação (Rmax) de uma superfície do chip depende do nível imobilizado do ligante (proteína de fusão). Para um estudo de cinética, um Rmax de 50-100 RU é aconselhado. Ao utilizar os pesos moleculares de p75-Fc e NGF, um nível desejado de imobilização para a proteína de fusão pode ser calculado.

[0127] Assim, o nível de imobilização necessário = (102000/13500) x 50 = 378 RU. p75NTR-Fc e NTR-Fc de Sequência 1 (SEQ ID N° 1) e Sequência 3 (SEQ ID N° 3) foram imobilizados sobre o chip de Proteína A antes da cinética do ciclo simples.

[0128] Usando um funcionamento manual, p75-Fc de Sequência 3 (SEQ ID No. 3) foi capturada na célula de fluxo 2 do chip da proteína A até que o nível desejado de aprox. 380 RU foi alcançado. Isto foi realizado com uma injeção de 22 segundos a uma vazão de 10 µl/min e concentração de p75-Fc de Sequência 3 (SEQ ID No. 3) de 10 µg/ml, o que resultou em 418 RU da proteína de fusão capturada sobre a superfície da proteína A.

[0129] No primeiro exemplo, concentrações de NGF de 10, 5, 2,5, 1,25 e 0,625 nM foram testadas. Estas concentrações foram testadas à medida que KD para a proteína de fusão foi aproximada a estar dentro desta faixa de concentrações de NGF.

[0130] O método de cinética de ciclo único envolveu: - injeção de 0,625 nM de NGF na p75-Fc capturada durante 120 segundos a 30 µl/min - este processo foi então repetido com uma injeção de NGF a 1,25 nM, seguido de 2,5, 5 e 10 nM - após a concentração final de NGF ter sido injetada, uma fase de dissociação de 600 segundos foi realizada ao fazer fluir o tampão de corrida (HBS-EP) sobre o chip.

[0131] Uma vez completado, o chip foi regenerado de volta para a sua superfície de Proteína A por injeção de 10 mM de glicina HC1, a pH 2 durante 60 segundos a 30 µl/min.

[0132] A p75-Fc de Sequência 1 (SEQ ID N° 1) foi depois capturada no chip através da realização de uma injeção de 38 segundos com uma vazão de 10µl/min a uma concentração de 10 µg/ml. Isto alcançou o nível desejado de 430 RU. O procedimento de cinética de ciclo único descrito acima foi então repetido.

Análise de dados

[0133] Os dados de ligação da proteína de fusão-NGF foram analisados da maneira seguinte utilizando o software de avaliação Biacore T200 v1: - Os dados são registrados para a ligação de NGF à proteína de fusão na célula de fluxo 2 (FC = 2) e para o NGF fluindo através da célula de fluxo de controle 1 (Fc = l; proteína A sozinha). - Os dados de Fc = l são então subtraídos de Fc = 2 para dar dados de ligação "2-1". - Os dados de ligação 2-1 para uma injeção de 0 nM (HBS-EP tampão de corrida sozinho) são então subtraídos de todos os dados de ligação 2-1 para controlar quaisquer desvios da linha de base durante todo o experimento. - Finalmente, esses dados são então ajustados a um modelo de ligação 1:1 para calcular características de ligação, incluindo taxas de associação (ka), taxas de dissociação (kd) e afinidades (KD).

Dados de cinética de ciclo único de NGF se ligando a proteínas de fusão capturadas de p75-Fc de Sequência 1 (SEQ ID No. 1) e 3 (SEQ ID No. 3)

[0134] Os perfis de ligação para ambas as proteínas de fusão para o NGF foram 400 pM (SEQ ID N° 1) e 360pM (SEQ ID No. 3). Era evidente a partir destes estudos que a Sequência 3 (SEQ ID No: 3) teve uma maior afinidade para o NGF do que a Sequência 1 (SEQ ID N° 1).

Farmacocinética in vivo de p75NTR-Fc de Sequência 1 (SEQ ID N° 1) e 3 (SEQ ID N° 3)

[0135] Ratos machos Wistar (de Charles River, Reino Unido, pesando 120-150g) em chegada foram usados neste estudo. Cada animal foi verificado na chegada e pareceu aparentemente saudável. Eles foram aleatoriamente designados para uma gaiola de dois e a cada rato foi atribuído um número de identificação único por uma tatuagem impressa na cauda. Os animais foram aclimatados à unidade de animais durante pelo menos 10 dias anteriores ao início do estudo no dia 0.

[0136] Uma vez que os ratos foram aclimatados ao ambiente, em que todos os procedimentos in vivo foram realizados. Os animais foram mantidos iluminados por luzes fluorescentes definidas para dar um ciclo claro-escuro de 12 horas (ligada às 07.00 desligada às 19.00) tal como recomendado no Ato de 1986 de Home Office Animals (Scientific Procedures). Os quartos tinham ar-condicionados e a temperatura do ar (21° C +/- 2° C) e a umidade relativa foram rotineiramente medidas.

[0137] Os ratos foram alimentados com uma dieta irradiada (Scientific Animal Food and Engineering, Augy, França) e água autoclavada estava disponível ad libitum durante todo o estudo. Cada lote de dieta foi verificado e selecionado rotineiramente para composição e contaminantes. A nidificação e gaiolas foram autoclavadas e cada gaiola foi individualmente ventilada (sistema de IVC).

[0138] A concepção do estudo foi tal que havia 5 grupos de tratamento como indicado na Tabela 2. Tabela 2: Grupos de Tratamento

[0139] Uma amostra de sangue foi colhida da veia da cauda de ratos a aproximadamente o mesmo tempo (10:00-11:30) nos dias 2, 4, 6, 8, 12 e 15 e preparado o plasma.

Amostragem de sangue a partir da veia da cauda

[0140] Os ratos foram colocados numa caixa de aquecimento fixada em 38° C durante um mínimo de cinco minutos, mas por não mais do que 10 minutos para induzir a vasodilatação da veia da cauda e facilitar o sangramento. Os ratos foram confinados em um limitador de tamanho adequado, a veia da cauda foi perfurada usando uma agulha estéril 23 G e o sangue permitido a fluir dentro de um tubo CB300 de microvette (Sarstedt 16.444). Um mínimo de 100 µl e um máximo de 300 µl de sangue foram coletados a partir de cada um dos ratos em todos os pontos de tempo. Um local diferente foi escolhido para repetição da amostra e os ratos foram acalmados ao longo do procedimento. Os ratos toleraram a coleta de sangue repetente bem sem evidência de contusões. O sangue coletado foi utilizado para preparar o plasma.

Amostra de sangue terminal do coração

[0141] Amostras de sangue terminais foram tomadas por punção cardíaca sob anestesia de isoflurano com uma seringa de 1 ml Terumo e agulha 23 G. Os animais foram então mortos por deslocação cervical. O sangue coletado foi usado para preparar o soro.

Preparação do plasma

[0142] A microvette contendo sangue a partir da veia da cauda foi invertida suavemente por várias vezes para assegurar uma boa mistura com o anticoagulante (Potássio-EDTA). Os tubos foram, em seguida, colocados em gelo antes de serem centrifugados a 2700 x g durante 10 minutos e o plasma aliquotado para tubos de polipropileno (duas alíquotas por animal por ponto de tempo, exceto no dia 2, quando apenas uma alíquota foi preparada). Todas as amostras de plasma foram imediatamente congeladas e armazenadas a -80° C até serem necessárias.

Preparação de soro

[0143] O sangue coletado por punção cardíaca no dia 15 foi deixado coagular em tubos de polipropileno à temperatura ambiente por entre 2 e 3 horas (3 horas no máximo). Coágulos de sangue foram então centrifugados a 4000 x g durante 5 minutos e o soro aliquotado para tubos de polipropileno (duas alíquotas por animal). As amostras de soro foram imediatamente congeladas e armazenadas a -80° C.

Determinação de p75NTR-Fc do plasma

[0144] A p75NTR-Fc do plasma foi medida utilizando um ELISA modificado para p75NTR (sistemas R e D) e ELISA de Fc de IgG1 (sistemas R e D) como um meio de determinar as concentrações plasmáticas totais intactas de p75NTR-Fc.

[0145] A farmacocinética de p75NTR-Fc de Sequência 1 (SEQ ID N° 1) e Sequência 3 (SEQ ID N° 3) foi determinada.

Conclusão

[0146] Através da remoção dos locais de clivagem de alfa e gama secretase da p75NTR-Fc de Sequência 1 (SEQ ID N° 1) em comparação com a Sequência 3 (SEQ ID N° 3), isto melhorou significativamente o PK da p75NTR-Fc e subsequentemente a eficácia como avaliada pela pontuações de dor após o tratamento crônico. Os locais de clivagem de secretase alfa e gama da p75NTR-Fc de Sequência 1 (SEQ ID N° 1) tornaram este composto inadequado como uma droga in vivo para o tratamento da dor e outras patologias relacionadas com a biologia de neurotrofina, por exemplo, doenças respiratórias.

[0147] A Sequência 3 (SEQ ID N° 3) é estável e tem um perfil PK/PD melhorado em comparação com a Sequência 1 (SEQ ID N° 1) e uma maior afinidade para neurotrofinas.

p75NTR-Fc (SEQ ID N° 3) é analgésico

[0148] O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da exposição crônica de p75NTR-Fc (SEQ ID No. 3) sobre a eficácia da dor em osteoartrite induzida (OA) por iodoacetato monossódico (MIA) em ratos.

[0149] Anteriormente, também demonstramos que uma avaliação da dor espontânea poderia ser feita através da medição de suporte de peso estático usando um testador de incapacitância e que isto se correlacionou com a histopatologia do joelho. Estudos pré- clínicos utilizando novas terapias para dor têm sido criticados por sua capacidade de induzir viés nos dados. Para resolver isso, ambos os joelhos direito e esquerdo foram escolhidos aleatoriamente para a indução de OA, e todos os operadores das tarefas cotidianas in vivo foram cegos para o status de cada joelho. Normalmente a partir literatura, a indução da OA é realizada apenas no joelho direito, mas em estudos anteriores não foram encontradas diferenças consistentes entre a indução da OA no joelho esquerdo versus o direito, independentemente do ponto de tempo ou dose de MIA usado.

Preparação de MIA

[0150] MIA foi preparado a 0,3 mg/50 µl de ETF-PBS (o volume utilizado para cada injeção intra-articular), que é equivalente a 6 mg/ml da solução mãe. 302 mg de MIA foram pesados e dissolvidos em 50,3 ml de ETF-PBS. MIA foi preparado um dia antes e foi armazenado a 4° C no escuro até ser necessário.

[0151]Animais

[0152] 44 ratos machos Wistar (de Charles River, Reino Unido) pesando 110-130 g à chegada foram usados neste estudo. Cada animal foi verificado na chegada e pareceu aparentemente saudável. Eles foram aleatoriamente designados para uma gaiola de dois e a cada rato foi atribuído um número de identificação único por uma tatuagem na cauda. Os animais foram aclimatados à unidade de animais durante pelo menos 10 dias anteriores ao início do estudo no dia 0. Uma vez que os ratos foram aclimatados ao ambiente, eles foram transferidos para uma sala de estoque/procedimento, em que todos os procedimentos in vivo foram realizados. Os animais foram mantidos iluminados por luzes fluorescentes configuradas para dar um ciclo claro-escuro de 12 horas (liga às 07.00 desliga às 19.00) Tal como recomendado no Ato de 1986 de Home Office Animals (Scientific Procedures). Os quartos tinham ar-condicionado e a temperatura do ar (21° C +/2° C) e a umidade relativa foram rotineiramente medidas.

[0153] Os ratos foram alimentados com uma dieta irradiada (Scientific Animal Food and Engineering, Augy, França) e água autoclavada estava disponível ad libitum. Cada lote de dieta foi verificado e selecionado rotineiramente para composição e contaminantes. A nidificação e gaiolas foram autoclavadas e cada gaiola foi individualmente ventilada (sistema de IVC).

Concepção experimental

[0154] A concepção do estudo foi tal que existiam cinco grupos de animais: anticorpo humano de controle (n = 6), 0,3 mg/kg de p75NTR-Fc (SEQ ID No. 3), 1 mg/kg de p75NTR-Fc (SEQ ID N° 3), 3 mg/kg de p75NTR-Fc (SEQ ID No. 3) e 3 mg/kg de PG007 (anticorpo anti-NGF biológico similar da Pfizer Tanezumab).

[0155] Os anticorpos e p75NTR-Fc (SEQ ID N° 3) foram administrados por injeção subcutânea a cada 5 dias durante 25 dias.

[0156] O peso corporal foi medido e uma amostra de sangue de linha de base foi tomada a partir da veia da cauda na manhã do dia -2. A aproximadamente o mesmo tempo no dia -1, o suporte de peso estático da linha de base foi medido. No dia 0, de novo a aproximadamente a mesma hora do dia, todos os ratos foram tratados com o respectivo anticorpo ou proteína de fusão de Fc- p75NTR. Três horas mais tarde todos os animais receberam uma injeção intra-articular de 0,3 mg de MIA em um joelho (ETF-PBS foi injetado no joelho contralateral).

Randomização do tratamento

[0157] Antes do início do estudo, os ratos foram pesados e cada gaiola de dois ratos foi aleatoriamente atribuída a um grupo de tratamento de modo que o peso corporal médio dos animais em cada grupo foi aproximadamente igual. Em adição a cada rato sendo atribuído a um determinado grupo de tratamento, a randomização adicional também foi realizada de modo que ou o joelho esquerdo ou direito de cada rato foi injetado com MIA (com o joelho contralateral de cada rato injetado com ETFPBS). A atribuição do grupo de tratamento e qual joelho recebeu o tratamento para cada rato foi produzida usando um gerador de números aleatórios no Microsoft Excel para Mac (versão 14.1.1). O pessoal que não teve contato com os animais realizaram o procedimento de randomização e alocação.

[0158] Dois frascos de 7 mL de polipropileno foram marcados para cada animal para denotar o joelho esquerdo ou direito (total de 88 frascos). Duas pessoas (uma pontuando e verificando a folha de randomização mestre e uma aliquotando a solução para a injeção intra-articular) prepararam os 88 frascos. O aliquotamento foi realizado em sequência de modo que os frascos de MIA foram preenchidos primeiro seguidos com os frascos remanescentes sendo cheios com ETF-PBS (este foi o frasco de joelho contralateral de cada animal). Ao longo do estudo in vivo, cientistas foram cegos para o status de tratamento de todos os animais.

Procedimentos animais Injeção intra-articular do joelho

[0159] Todos os ratos foram anestesiados por inalação de isoflurano utilizando um Aparelho de Boyles. Os cabelos em ambos os joelhos de cada animal foram cortados e os joelhos limpos com etanol. Cada joelho foi injetado através do ligamento infra- patelar com 50 µl de ou 0,3 mg de MIA na ETF-PBS ou ETF-PBS sozinho usando uma seringa de insulina estéril de 0,5 ml Becton Dickinson Micro-Fina com uma agulha 27G anexada.

Avaliação da dor espontânea

[0160] A dor espontânea foi determinada para cada animal através da medição do suporte de peso das patas traseiras direita e esquerda utilizando um testador de incapacitância (Linton Instruments, Reino Unido). Os ratos foram colocados em uma caixa de perspex animais de tamanho adequado no testador de incapacitância de modo que suas patas traseiras repousaram em sensores separados. O tamanho da caixa permitiu que o rato se sentasse confortavelmente sem esmagar, mas da mesma forma não lhe permitiu espaço suficiente para virar. Uma vez que o rato estava firme e calmo, o suporte de peso de cada membro foi registrado durante 5 segundos e a força média em gramas exercida por ambos os membros posteriores foi registrada. A distribuição de peso das patas traseiras foi determinada cinco vezes (a validade à qual demonstramos anteriormente) para cada rato em cada ponto temporal, e a média das cinco leituras calculada. Os dados de suporte de peso individual foram convertidos para uma distribuição de peso ao dividir o peso do membro direito pelo peso total de ambos os membros posteriores.

Medições de dor espontânea seguintes a OA induzida por MIA

[0161] A dor espontânea foi avaliada usando um testador de incapacitância para medir a distribuição de peso através dos membros traseiros. As avaliações foram realizadas na linha de base e em 3 semanas pós-tratamento com MIA.

[0162] Os dados são mostrados na Figura 6 e ilustrados como a proporção do peso total ao longo dos membros traseiros.

[0163] Para os animais não expostos, não houve diferença estatisticamente significativa entre a proporção de peso nos membros traseiros e a expectativa teórica de 0,5.

[0164] Para os animais tratados com anticorpos de controle, houve estatisticamente significativamente menos peso sendo colocado no membro tratado do que no membro não tratado (39% vs 61%). Em animais tratados com o anticorpo anti-NGF (PG-007 Tanezumab biológico similar 3mg/kg) e aqueles tratados com p75NTR-Fc (SEQ ID No. 3) a 0,3 e 1 mg/kg não houve diferença estatisticamente significativa (P<01) entre a proporção de peso no membro posterior tratado e a expectativa teórica de 0,5 (distribuição uniforme através de ambos os membros traseiros) em qualquer um dos pontos de tempo medidos. O efeito analgésico da p75NTR-Fc (SEQ ID No. 3) a 3 mg/kg foi ainda mais estatisticamente significativo (P<0,05) em comparação com os controles correspondentes.

[0165] É evidente a partir destes estudos que p75NTR-Fc (SEQ ID No. 3) é analgésico no modelo de rato de MIA da OA. Os efeitos analgésicos de p75NTR-Fc (SEQ ID No. 3) foram maiores do que os observados para os anticorpos anti-NGF (PG-007:anticorpo biológico similar Pfizer anti-NGF Tanezumab) em doses semelhantes: 3 mg/kg por via subcutânea.

Melhoria inesperada na afinidade da molécula p75NTR-Fc de Sequência 3 e Sequência 15 contra neurotrofinas individuais

[0166] É geralmente aceito na literatura e no estado da técnica que o receptor de neurotrofina p75 de baixa afinidade tem uma afinidade semelhante para todas as neurotrofinas de cerca de 1 nM (Ichim et al, 2012 Exp Cell Res 318 (11):1221-8). Além disso, o estado da técnica de Apollo Life Sciences (Molecules and chimeric molecules thereof US 20090232808 Al) exemplifica ainda mais a semelhança entre a afinidade do receptor de neurotrofina p75 para as neurotrofinas individuais. "NGFR é uma proteína de membrana do tipo I que é sintetizada na forma de uma glicoproteína de 427 aminoácidos consistindo em um peptídeo de sinal de 28 aminoácidos. NGFR se liga com igual afinidade a todas as neurotrofinas".

[0167] A partir de estudos de ressonância de plasma de Biacore, nós demonstramos alterações significativas nas afinidades de ligação das Sequências 3 e 15 acopladas com Fc de IgG1 humano utilizando o espaçador de ligante GGG. Tabela 3: Afinidade de Biacore de Sequência 3 e 15 para cada neurotrofina

Redução do ponto isoelétrico (pI):

[0168] O ponto isoelétrico das Sequências 3 e os revelados no estado da técnica em Apollo Life Science possuem pI teórico de 4,11, no entanto, ambas as moléculas são significativamente glicosiladas levando a realmente um pI na faixa de 3-4.

[0169] A Sequência 15 tem um pI teórico de 4,23 e é menos glicosilada do que outras p75NTRs. Subsequentemente, o pI está na faixa de 4-5. Isto proporciona uma vantagem significativa (formulação melhorada e menos variabilidade na estrutura molecular devido à variação em sítios de glicosilação e quantidade de glicosilação) sobre a Sequência 3 e as sequências descritas anteriormente no estado da técnica de Apollo Life Science.

[0170] A presente invenção não deve ser limitada no seu âmbito pelas concretizações específicas aqui descritas. De fato, várias modificações da invenção em adição àquelas descritas aqui serão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior e figuras anexas. Tais modificações destinam-se a cair dentro do âmbito das reivindicações anexas. Além disso, todas as concretizações aqui descritas são consideradas como sendo amplamente aplicáveis e combináveis com qualquer e todas as outras concretizações consistentes, conforme apropriado.

[0171] Várias publicações são aqui citadas, cujas divulgações são incorporadas por referência na sua totalidade.

Claims (12)

1. Proteína de fusão da proteína de ligação de neurotrofina (NBP) p75NTR-Fc, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO. 3 ou na SEQ ID NO. 15.

2. Proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO. 3.

3. Proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO. 15.

4. Proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a p75NTR(NBP) se liga a qualquer um de NGF, BDNF, NT3 ou NT4/5 com uma afinidade de ligação (Kd) de entre cerca de 0,01 nM a cerca de 50 nM, tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 20° C.

5. Uso da proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc conforme definida em qualquer das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a proteína é para preparar um medicamento para o tratamento da dor.

6. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que é como apresentada na SEQ ID NO: 4 e que codifica a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc conforme definida em qualquer das reivindicações 1 a 4, compreendendo ainda opcionalmente codificar uma sequência de sinal.

7. Vetor de expressão replicável para transfecção de uma célula, opcionalmente uma célula de mamífero, o vetor caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 6.

8. Vetor de expressão replicável de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o vetor é um vetor viral.

9. Uso da molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 6 ou o vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que é para preparar um medicamento para o tratamento da dor.

10. Proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou o ácido nucleico ou vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc ou molécula de ácido nucleico ou vetor são para utilização separada, sequencial ou simultânea em uma combinação combinada com um segundo composto farmacologicamente ativo.

11. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com as reivindicações 6 a 8, e um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente.

12. Kit caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou a molécula de ácido nucleico ou vetor de acordo com as reivindicações 6 a 9; e (b) instruções para a administração de uma quantidade eficaz da referida proteína de fusão p75NTR(NBP)-Fc, molécula de ácido nucleico, vetor ou composição farmacêutica a um indivíduo para qualquer um ou mais de prevenção ou tratamento da dor e/ou um sintoma de dor ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência de, ou atrasar o desenvolvimento ou a progressão da dor.