WO2007026567A1 - ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤 - Google Patents

ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2007026567A1
WO2007026567A1 PCT/JP2006/316365 JP2006316365W WO2007026567A1 WO 2007026567 A1 WO2007026567 A1 WO 2007026567A1 JP 2006316365 W JP2006316365 W JP 2006316365W WO 2007026567 A1 WO2007026567 A1 WO 2007026567A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ntr
antibody
ngf
prongf
cfa
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/316365
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshihide Yamashita
Tomoko Watanabe
Original Assignee
National University Corporation Chiba University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National University Corporation Chiba University filed Critical National University Corporation Chiba University
Priority to JP2007533186A priority Critical patent/JPWO2007026567A1/ja
Publication of WO2007026567A1 publication Critical patent/WO2007026567A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/48—Nerve growth factor [NGF]

Definitions

  • the present invention relates to an analgesic. More particularly, the present invention relates to a medicament for treating inflammatory pain.
  • DRG dorsal root ganglion
  • NGF nerve growth factor
  • o NGF plays an important role in inflammatory pain by promoting peripheral sensitization, acting directly on the peripheral endings and producing thermal hyperalgesia in a short time.
  • NGF is found in a wide range of inflammatory animal models, such as Freund's adjuvant-induced inflammation (Woolf, CJ et al., Neuroscience 62, 327-331 (1994)), carrageenan-induced inflammation (Sammons, MJ et al. al, Brain Res. 876, 48-54 (2000); McMahon, SB et al, Nat. Med. 1, 774-780 (1995)), and human arthritis patients (Aloe, L. Turveri, MA & Carca ssi ,
  • NGF is retrogradely transported to the DRG-euron cell body, where gene expression is increased (Woolf, C. J. et al., Neuroscience).
  • NGF exerts its hyperalgesic effect by acting indirectly or directly through adipocyte degranulation at the peripheral end of the primary sensory-euron (Woolf, C. J. et al., Neuroscience).
  • NGF has been suggested to be a major contributor to the generation of inflammatory hyperalgesia.
  • Adipocytes express trkA receptors and degranulate their contents in response to NGF stimulation (Mazurek, N. et al, FEBS
  • NGF-induced hyperalgesia is reduced at 30 minutes and 3 hours after NGF stimulation (Lewin, G.R. et al, Eur. J. Neurosci. 6, 1903-12 (1994)).
  • TrkA which is a single transmembrane receptor tyrosin kinase
  • p75 NTR the all-eurotrophin receptor p75
  • NGF is known to play an important role in the mechanism of inflammatory hyperalgesia. Whether NGF acts on two receptors on neurons, TrkA and p75 NTR. It was completely unknown.
  • NGF is synthesized as a precursor or pro-protein, and it is known that proteolytic cleavage is required to produce mature NGF (Lee, R. et al., Science 294, 1945-1948). (2001)), it has been suggested that proNGF may be involved in the mechanism of inflammatory hyperalgesia.
  • Non-Patent Document 1 Woolf, C. J. et al., Neuroscience 62, 327-331 (1994)
  • Non-Patent Document 2 McMahon, S. B. et al "Nat. Med. 1, 774-780 (1995)
  • An object of the present invention is to provide a novel analgesic.
  • the present inventors have found that neutralizing antibodies specific for p75 NTR are perceptual-sensitized to NGF We found that it could block the action and that the binding of proNGF and p75 NTR is involved in NGF-induced hyperalgesia. Based on this finding, the present invention was completed by finding that a p75 NTR inhibitor can be used as an analgesic with a novel mechanism.
  • the present invention provides an analgesic containing a p75 NTR inhibitor as an active ingredient.
  • the p75 NTR inhibitor is an anti-p75 NTR antibody.
  • the p75 NTR inhibitor is a substance that inhibits the binding of pro NGF and p75 NTR .
  • the present invention provides a method for identifying a candidate substance for an analgesic.
  • This method involves contacting a test substance with P 75 NTR and determining whether the test substance inhibits the function of p75 NTR .
  • a test substance is contacted with p75 NTR, include determining mosquitoes ⁇ not to inhibit the binding of the test substance force 3 ⁇ 4roNGF and p75 NTR.
  • analgesic of the present invention is provided.
  • the analgesic of the present invention is particularly effective for the treatment of inflammatory pain.
  • Inflammatory pain is characterized by a reduced nociceptive threshold and is caused by the use of inflammatory mediators.
  • One of the key molecules is nerve growth factor (NGF).
  • NGF nerve growth factor
  • p75 NTR neurotrophin receptor p75
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • proNGF is the dominant ligand of p75 NTR in vivo. Rukoto has been shown. Treatment with plasmin to degrade proNGF improved CFA-induced hyperalgesia. Endogenous proNGF is overproduced during inflammation, resulting in a functional secretion that can bind to and activate the p75 NTR , which may induce thermal hypersensitivity in vivo .
  • proNGF force 3 ⁇ 475 higher than mature NGF against NTO, consistent with that indicating the Afinite I over, proNGF is may also force a stronger induction substance of p75 NTR -mediated cellular response.
  • the biological action of NGF is controlled by proteolytic cleavage, and the pro form preferentially activates P 75 NTR and mediates perception-euron hypersensitivity! /, It might be the power of ru! ,.
  • the p75 NTR has various roles in the nervous system, including control of ancestral cell number, regulation of axon outgrowth, and survival and death of neurons and oligodendrocytes. Includes control.
  • the data presented in the examples below show that proNGF, as well as mature NGF, may play a role in transmitting hypersensitivity via the p75 NTR . Therefore, disruption of the binding between endogenous proNGF and p75 NTR could provide a novel treatment for the treatment of inflammation-related pain.
  • the analgesic according to the present invention contains a p75 NTR inhibitor as an active ingredient.
  • p75 NTR inhibitor means a substance that eliminates or at least significantly reduces the activity of p75 NTR binding to a ligand and transmitting its signal downstream. The activity of p75 NTR can be examined as described in Examples below.
  • anti-p75 NTR antibody means an antibody that can bind to p75 NTR by an antigen-antibody reaction.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Polyclonal antibodies which bind to p75 NTR according to how well known in the art, to immunize an animal with a p75 NTR as a sensitizing antigen, it is possible to obtain from the serum.
  • Monoclonal antibodies that bind to p75 NTR is immune to according to methods well is known in the art, to immunize an animal with a p75 NTR as a sensitizing antigen to obtain It can be obtained by removing epidemic cells, fusing them with myeloma cells, cloning the hyperprideoma producing the antibody, and culturing the hyperprideoma.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes a gene recombinant antibody, a chimeric antibody, and a CDR graft produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene in addition to an antibody produced by a hyperidoma. Antibodies, and fragments of these antibodies are included.
  • a chimeric antibody is an antibody composed of a heavy chain variable region and a light chain variable region of an antibody derived from one animal, and a heavy chain constant region and a light chain constant region of an antibody derived from another animal.
  • antibody fragments that can bind to p75 NTR include Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, scFv, and diabody.
  • p75 NTR is produced as an antigen.
  • Human p75 NTR can be produced recombinantly by conventional methods according to the nucleotide sequence of the gene described in GenBank accession number AAB59544 and the amino acid sequence encoded by it. The amino acid sequence of human p75 NTR is as follows.
  • p75 NTR produced in this manner is administered as an antigen subcutaneously, intravenously or intraperitoneally in animals.
  • mammals such as mice, rats, hamsters, rabbits and goats can be used.
  • the antigen is administered together with an appropriate adjuvant such as the ability to bind the antigen to the carrier protein and Freund's complete adjuvant.
  • an appropriate adjuvant such as the ability to bind the antigen to the carrier protein and Freund's complete adjuvant.
  • a partial peptide of p75 NTR may be used as an antigen.
  • the antigen is administered several times every 13 weeks.
  • the antibody titer is monitored by measuring the amount of immunoglobulin in the serum by ELISA. After the antibody titer has risen sufficiently, immune cells are removed from the animal. Spleen cells are preferably used as immune cells.
  • a hybridoma is produced by fusing antibody-producing immune cells with myeloma cells derived from a mammal of the same species. Various myeloma cell lines suitable for producing hybridomas are commercially available. Fusion is performed according to methods well known in the art, eg, in the presence of PEG, and the fused cells are selected in HAT medium.
  • the culture supernatant is assayed by ELISA, etc., and a hyperidoma producing an antibody that binds to the antigen is selected.
  • the hybridoma producing the target antibody can be cloned by limiting dilution.
  • Monoclonal antibodies can be obtained from the supernatant of a culture solution obtained by culturing monoclonal antibody-producing cells, or from a mouse pretreated with 2, 4, 10, 14-tetramethylpentadecane. It can be prepared by collecting the ascites of the mouse 7 to 10 days after inoculation, centrifuging, and collecting the supernatant. Monoclonal antibodies can be purified using conventional protein purification methods such as salting out, ultrafiltration, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and HPLC. Preferably, affinity chromatography on a protein A column is performed. The subclass of the purified monoclonal antibody can be determined by typing using a commercially available mouse monoclonal antibody isotyping kit.
  • the nucleotide sequence of the antibody gene encoding the monoclonal antibody of the present invention is the It can be obtained by analyzing the gene of a clonal antibody-producing cell. Extract the total RNA from the monoclonal antibody-producing cell strength, and use this as a cage to prepare a cDNA fragment using reverse transcriptase. Next, the V region of the antibody gene is amplified by PCR using appropriately designed primers, and the base sequence of the cDNA in this region is determined.
  • the specificity of the binding of the monoclonal antibody of the present invention can be confirmed using methods known in the art such as ELISA, RIA, immunothin layer chromatography, BIAcore, and fluorescent antibody method.
  • ELISA ELISA
  • RIA immunothin layer chromatography
  • BIAcore fluorescent antibody method
  • adding a 2-fold dilution series of the monoclonal antibody of the present invention to a microplate to which p75 NTR is immobilized add an enzyme-labeled secondary antibody, add a substrate, develop color, and use a microplate reader. Measure absorbance.
  • a recombinant antibody can be produced using a gene recombination technique.
  • the gene encoding the antibody of the present invention is incorporated into an appropriate expression vector and introduced into a host cell.
  • host cells Escherichia coli, yeast, mammalian cells, insect cells, plant cells, and the like can be used.
  • mammalian cells such as CHO, COS, and BHK are preferably used.
  • Vectors can be introduced into host cells by, for example, the salt calcium method, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the method using the cationic ribosome DOT AP (Boehringer Mannheim), the electopore method, the ribofusion method, etc. It can be carried out.
  • Recombinant antibodies can be produced by culturing the resulting transformed host cells and expressing the antibodies.
  • a chimeric antibody is composed of the heavy and light chain variable regions of an antibody derived from one animal (eg, mouse) and the heavy chain constant region and light chain constant region force of an antibody derived from another animal (eg, human).
  • Chimeric antibodies are obtained by cloning cDNA encoding the heavy and light chain variable regions of an antibody from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that binds to the p75 NTR , while determining the heavy chain of an antibody from another animal. Clone the cDNAs encoding the normal and light chain constant regions and combine them to It can be produced recombinantly by inserting it into an appropriate expression vector and expressing it in a host cell.
  • a CDR-grafted antibody is an antibody in which the complementarity determining region (CDR) of an antibody of one animal (eg, mouse) is transplanted to the complementarity determining region of an antibody of another animal (eg, human).
  • the gene encoding the CDR-grafted antibody is based on the gene sequences of the heavy and light chain variable regions of the hybridoma-cloned antibody that produces a monoclonal antibody that binds to p75 NTO , respectively. Design the gene sequence encoding 3 and replace it with the corresponding CDR1, 2, 3 sequence in the vector containing the genes encoding the heavy and light chain variable regions of antibodies from other animals. Can be obtained.
  • the CDR-grafted antibody can be produced recombinantly.
  • antibody fragments such as Fab, F (ab ') 2, Fab', scFv, and diabody that can bind to p75 NTR
  • an enzyme such as papain or trypsin
  • it can be produced by introducing an expression vector incorporating a gene encoding them into a host cell to obtain a transformant.
  • p75 NTR inhibitors include peptides that inhibit the binding of NGF to p75 NTR , such as peptides having a partial sequence of NGF.
  • the analgesic agent of the present invention as p75 NTR inhibitors, those containing antisense oligonucleotides, Ribozaimu, molecules that cause RNA interference (RNAi) (e.g., dsRNA, siRNA, shR NA, miRNA) etc. There may be.
  • RNAi RNA interference
  • These nucleic acids can bind to and inhibit the expression of p75 NTO gene or mRNA encoding p75 NTR .
  • General methods for controlling gene expression using antisense, ribozyme technology and RNAi technology, or gene therapy methods for expressing exogenous genes in this manner are known in the art. Well known.
  • Antisense oligonucleotide refers to a nucleic acid molecule having a sequence complementary to mRNA encoding p75 NTR or a derivative thereof. Antisense oligonucleotides specifically bind to mRNA and inhibit protein expression by inhibiting transcription and Z or translation. Coupling may be by Watson's Click or Houdsteen-type base pair complementarity, or by triplex formation.
  • a ribozyme refers to the RNA structure of one or more RNAs that have catalytic properties. Ribozymes generally exhibit endonuclease, ligase or polymerase activity. Various secondary structure ribozymes are known, such as hammerhead and hairpin type ribozymes.
  • RNA interference is a method of silencing target genes using double-stranded RNA molecules.
  • a p75 NTR inhibitor can be administered as is, but is usually formulated using a pharmaceutical carrier. Any carrier commonly used in the pharmaceutical field can be used as the carrier for the formulation, for example, sterile water, physiological saline, excipients, stabilizers, antioxidants, buffers, surface active agents. Agents, binders and the like are preferably used.
  • a p75 NTR inhibitor can be encapsulated in microcapsules or polymer gels to provide a sustained-release preparation.
  • the administration route of the analgesic of the present invention includes oral administration, intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intracavity administration, and the like. Preferably, it may be administered directly or percutaneously to the inflamed site, or may be directly injected using a catheter or the like.
  • the dose is appropriately selected according to the type of p75 NTR inhibitor, the route of administration, the degree of nerve damage, etc., but when administered directly to the inflamed site, it is usually 0.1 mg to 10 mg, preferably lmg to 5mg. For parenteral administration other than direct administration, such as intravenous injection, it is usually about 10 times the above dose.
  • the present invention provides a method of identifying an analgesic candidate substance.
  • This method involves contacting the test substance with P 75 NTR and determining whether the test substance inhibits the function of p75 NTR .
  • Inhibition of p75 NTR function includes binding to p75 NTR and inhibiting the normal functioning of p75 5 NTR , and p75 NTR and its ligand (NGF or Includes inhibition of binding to proNGF).
  • Ability of the test substance inhibits binding of the ability to bind to p75 NTR, or p75 NTR and its ligand binding Atsusi well known to those skilled in the art, such as, but not limited to, gel-shift Atsu Si, radiolabeled competition Atsusi, This can be determined by chromatographic fractionation. Substances identified as inhibiting the function of p75 NTR by these accessories are considered to be candidates for analgesics.
  • mice 25-35 g
  • Wister rats 150-200 g
  • All animals were housed in animal units on a 12 hour light / dark cycle (08: 30–20: 30h) at 21 ° C, with free access to pellet food and tap water.
  • Experiments were conducted in accordance with the University Code of Ethics and NIH guidelines.
  • nerve growth factor beta (NGF- ⁇ , Sigma, MO, USA) was diluted in normal saline containing sushi serum albumin to a final concentration of 0. lugZml.
  • mice were placed in a test box and placed on a window glass floor maintained at 27-29 ° C.
  • Thermal stimulation 150 millicalories Zsec per lcm 2
  • the first stimulating limb was randomly selected. Initiation force of stimulation
  • the time to limb escape was measured to the nearest 0.1 second, and an absolute cut-off time of 20.0 seconds was used to prevent tissue damage.
  • Both hind limbs were tested in random order and three measurements were taken to determine the average for each hind limb.
  • Nociceptive thresholds were measured before intraplantar injection of NGF- ⁇ (as a basal control) and after 1, 2, 3, 6 and 24 hours. In another series of experiments, measurements were taken before intraplantar injection of CF heel and after 1, 2, 3, 6, 24, and 48 hours.
  • the degree of inflammation was assessed by changes in limb depth using the Benje Calipas. Limb depth was measured immediately before injection and 3, 6, 24 and 48 hours after the application of harmful thermal stimulation.
  • Sections were incubated at 4 ° C with Usagi polyclonal anti-CGRP antibody (1: 1000; Chemicon). After washing with PBS, the sections were incubated for 2 hours with Alexa Fluor546-Conduit Igono-anti-rabbit IgG antibody (5 gZml; Molecular Probes, Eugene, OR). Stained sections were air-dried, dehydrated and embedded in Permaflu or (Shandon, Pittsburgh, PA, USA). [0049] To examine the distribution of p75 NTR , sections of normal skin were obtained at room temperature in a blocking solution containing 1% BSA and 5% skim milk in PBS and 0.3% Ding 1: ⁇ 01 ⁇ -100. Incubated for 1 hour.
  • the MC192 is an anti-p75 NTR antibody used in immune-end site one Shisuatsusi was visualized p 75 NTR ligand-induced uptake.
  • MC192 100 ng; 50 1, Chemicon
  • Rats were sacrificed under deep anesthesia (40 mg Zkg pentobarbital sodium, ip Sanofi Sante Inc) 18 hours after MC192 injection, in 0.9% saline, then in 0.1M phosphate buffer solution (PBS) Perfusion was performed through the heart with 4% paraformaldehyde fixative, and then L5 DRG was excised.
  • PBS phosphate buffer solution
  • lysis buffer l% Nonidet P—40, 20 mM Tris (pH 8.0), 137 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10% glycerol, lOmM sodium fluoride, ImM Na Vo, ImM PMSF and protease inhibitor cocktail ) Homogenized in .
  • the homogenate was centrifuged at 500g for 15 minutes and the pellet was discarded. The supernatant aliquot (total 500 / zg protein) was removed and diluted with lysis buffer. Lysates were incubated with anti- P 75 NTR antibody (Promega, WI, USA) at 4 ° C. The lysate was then incubated with protein A sepharose for 3 hours and washed thoroughly.
  • Protein samples were separated on an SDS-PAGE gradient gel (12%; Bio-Rad) and transferred to a PVDF filter.
  • the plot was then incubated with HRP Conjugate TM secondary antibody (1: 2000) for 1 hour at room temperature, developed for 1 minute in ECL solution (NEN), and exposed to X-ray film (superfilm; Amersham) for 2-10 minutes . Each experiment was repeated at least three times.
  • CFA paw withdraw late latency
  • Limb depth represents the severity of inflammation. 3 hours after intraplantar CFA injection, there was a significant increase in limb depth S (3.35 ⁇ 0.21mm, p ⁇ 0.01), which lasted up to 48 hours (3.6 ⁇ 0.08 mm) ) ( Figure lb). The vertical axis shows the depth (mm). Base, control (saline injection); pre, before injection. However, no significant decrease in limb depth was observed with anti-p75 NTR antibody treatment in any observation period from 3 to 48 hours. This suggests that the effect of anti-p75 NTR antibody does not depend on the suppression of inflammation.
  • NGF has been suggested to be a major contributor to the generation of inflammatory hyperalgesia (4), and intraplantar injection of NGF into the hind limb of mice produces a time-dependent effect on thermal hyperalgesia (7).
  • NGF 1.0 gZ limb; 10 1
  • PWL limb escape response latency
  • CGRP calcitonin gene-related peptide
  • MC192 an antibody against the extracellular domain of p75 NTR , was used to monitor the p75 NTR incorporated inside. Since this antibody is specific for rat p75 NTR , rats were used in this experiment. L5 levels of DRG were examined 18 hours after MC192 injection with or without NGF treatment. In DRG-Euron without NGF treatment, MC192 incorporated was not found. This suggests that basal levels of -eurotrophin may not induce p75 NTR internalization. Interestingly, MC192 was found in the cell body of DRG-euron 18 hours after NGF treatment (Figure 4).
  • proNGF plays a role in CFA-induced hyperalgesia.
  • ProNGF secreted extracellularly is degraded by plasmin, a serine protease, and matrix metalloproteinase 7 (17).
  • Plasmin treatment should decrease the amount of proNGF and increase the amount of mature NGF. That is, if proNGF is a stronger hyperalgesia inducer than mature NGP, CFA-induced hyperalgesia may be reduced by plasmin treatment.
  • the analgesic of the present invention is useful as a therapeutic agent for inflammatory pain.
  • FIG. 1 shows the prevention of CFA-induced hyperalgesia by neutralizing antibodies to p75 NTR .
  • Figure 2 shows the prevention of NGF-mediated hyperalgesia by neutralizing antibodies to p75 NTR .
  • FIG. 3 shows decreased expression of pain-related genes by neutralizing antibodies against p75 NTR
  • FIG. 4 shows ligand-induced retrograde transport of the p75-eurotrophin receptor.
  • Figure 5 shows the binding of ProNGF to p75 NTR .
  • Figure 6 shows the effects of proNGF degradation by plasmin.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

　ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤が開示される。ｐ７５ＮＴＲ阻害剤には，抗ｐ７５ＮＴＲ抗体，およびｐ７５ＮＴＲの転写または翻訳を阻害しうるアンチセンス核酸，二本鎖ＲＮＡ等が含まれる。本発明の鎮痛剤は，炎症性の痛みの治療剤として有用である。

Description

p75NTR阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤
技術分野
[0001] 本発明は鎮痛剤に関する。より詳細には，本発明は，炎症性疼痛を治療するため の薬剤に関する。
背景技術
[0002] 強度の有害刺激および組織炎症は，末梢および中枢感作の両方に起因する痛み 過敏性を生じさせる（Woolf, C. J. Nature 306, 686-688 (1983) ;Woolf, C. J., & Salter, M. W., Science 288,
1765-1769 (2000))。末梢の炎症により，後根神経節（DRG)ニューロンの細胞体に おいて神経ペプチド，イオンチャネル，およびレセプターのレベルが変化する（Noguc hi, K. et al, Brain
Res. 464, 31-35 (1988); Woolf, C. J.
et al" Neuroscience 62,
327-331 (1994); Ji, R. R. et al" J. Neurosci. 15, 8156-8166 (1995); Voilley, N. et al
J. Neurosci. 21, 8026-8033 (2001))。したがって，これは高閾値レセプターの感度を 増加させ，したがって正常より低い強度の刺激がこれらを活性ィ匕することができる（Sa mmons, M. J. et al., Brain
Res. 876, 48-54 (2000))。炎症の結果，多数の異なるサイト力インに応答して， NGF レベルが上昇する。 NGFはそれ自体サイト力イン様の機能を有し，肥満細胞，マクロ ファージおよび好中球を変化させる（Woolf, C. J. et al., Neuroscience
62, 327-331 (1994); Andreev,
N. Yu. et al" Pain 63,
109-115 (1995)) o NGFは，末梢の感作を推進し，末梢終末に直接作用して短時間 のうちに熱痛覚過敏を生ずることにより，炎症性の痛みにおいて重要な役割を果た す (し huang, H. H. et al., Nature 411, 957-962 (2001))。
[0003] NGFは，広範な範囲の炎症動物モデル，例えば，フロインドアジュバント誘導性炎 症（Woolf, C. J. et al.， Neuroscience 62, 327-331 (1994)) ,カラギーナン誘導性炎症 (Sammons, M. J. et al, Brain Res. 876, 48-54 (2000); McMahon, S. B. et al, Nat. Med. 1, 774-780 (1995)) ,およびヒトの関節炎患者（Aloe, L. Turveri, M. A. & Carca ssi,
U., Artnntis Rheumat. 35,
351-355 (1992))においてアップレギュレートされている。実験的炎症において，抗 N GF¾n.体 (Woolf, C. J. et al., Neuroscience
62, 327-331 (1994))または NGF特異的免疫接着分子 trkA— IgG (McMahon, S. B. et al" Nat.
Med. 1, 774-780 (1995))を用いて NGFの増加を妨害すると，痛覚過敏が消失する。 このことは NGFが炎症性痛覚過敏の生成に必要であることを示す。また， NGFの局 所または全身の投与は熱および機械的痛覚過敏を誘導するため， NGFは成人ネズ ミ動物において痛覚過敏を生成するのに十分であることが示されている（Sammons, M. J. et al, Brain
Res. 876, 48—54 (2000); Andreev, N.
Yu. et al., Pain 63, 109—115 (1995); Lewin, G.
R. et al., J. Neurosci. 13,
2136-2148 (1993))。さらに， NGFは DRG-ユーロンの細胞体に逆行的に輸送され， ここで遺伝子発現が増加する（Woolf, C. J. et al., Neuroscience
62, 327-331 (1994); Lindsay,
R. M. & Harmar, A. J., Nature 337, 362-364 (1989))。 NGFは，一次知覚-ユーロン の末梢終末で，脂肪細胞の脱顆粒を通して間接的に，または直接的に，作用するこ とにより，その痛覚過敏効果を生ずる（Woolf, C. J. et al., Neuroscience
62, 327-331 (1994))。すなわち， NGFは炎症痛覚過敏の生成に対する主要な寄与 因子であることが示唆されて 、る。
[0004] 皮膚における多くの細胞タイプ，例えば脂肪細胞，交感神経節後細胞および好中 球が， NGFにより引き出される急速に起こる末梢感作に寄与する。脂肪細胞は trkA レセプターを発現しており， NGF刺激に応答してその内容物を脱顆粒する（Mazurek , N. et al, FEBS
Lett. 198, 315-20 (1986))。脂肪細胞が涸渴すると， NGF刺激から 30分および 3時 間の時点において NGF誘導性痛覚過敏が低下する（Lewin, G.R. et al, Eur. J. Neurosci. 6, 1903—12 (1994))。
[0005] しかし，インビボでィ匕合物 48Z80で処理して脂肪細胞を脱顆粒させた調製物にお いては，感作は生じなかった（Rueff, A. et al" Pain 66, 359-372 (1996))。さらに， N GF誘導性痛覚過敏は，処置の第 1日には防止されたが，毎日脱顆粒処置を行って も，翌日以降は防止されな力つた。これらのデータを一緒にすると，外因性 NGFが脂 肪細胞由来 NGFの放出を引き起こすトリガーとして作用すること，および NGFがー 次求心性終末を直接感作し，痛み関連遺伝子の発現を制御して ヽることが示唆され る。
[0006] NGFのレセプターには， 1回貫膜レセプターチ口シンキナーゼである TrkAと，全- ユーロトロフィンレセプター p75 (p75NTR)の 2種類がある。上述のように、 NGFは炎症 性痛覚過敏のメカニズムに関して重要な役割を果たすことが知られている力 NGF が神経細胞上の二つの受容体、 TrkAおよび p75NTRのどちらに働いているのかにつ いては全く不明であった。また、 NGFは前駆体または pro—蛋白質として合成され， 成熟 NGFの生成には蛋白質分解的切断が必要であることが知られているが（Lee, R . et al., Science 294, 1945-1948 (2001))、 proNGFが炎症性痛覚過敏のメカニズム に関与して 、る可能性はこれまでに示唆されて 、な 、。
[0007] 非特許文献 1： Woolf, C. J. et al., Neuroscience 62, 327-331 (1994)
非特許文献 2 :McMahon, S. B. et al" Nat. Med. 1, 774-780 (1995)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の目的は，新規な鎮痛剤を提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは， p75NTRに特異的な中和抗体が知覚-ユーロンにおいて NGFの感 作作用をブロックしうること，ならびに proNGFと p75NTRとの結合が NGF誘導性痛覚 過敏に関与していることを見いだした。この知見に基づいて， p75NTRの阻害剤が新 規なメカニズムの鎮痛剤として利用しうることを見 ヽだして，本発明を完成した。
[0010] 本発明は， p75NTR阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤を提供する。好ましく は， p75NTR阻害剤は，抗 p75NTR抗体である。また好ましくは， p75NTR阻害剤は， pro NGFと p75NTRとの結合を阻害する物質である。
[0011] 別の観点においては，本発明は，鎮痛剤の候補物質を同定する方法を提供する。
この方法は，試験物質を P75NTRと接触させ，前記試験物質が p75NTRの機能を阻害 するか否かを判定することを含む。特に好ましい態様においては，本発明の方法は， 試験物質を p75NTRと接触させ，前記試験物質力 ¾roNGFと p75NTRとの結合を阻害 するカゝ否かを判定することを含む。
発明の効果
[0012] 本発明によれば，新規な鎮痛剤が提供される。本発明の鎮痛剤は，特に炎症性痛 覚の治療に有効である。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 炎症性の痛みは，侵害受容閾値の低下により特徴づけられ，炎症メディエータの作 用により生ずる。鍵となる分子の 1つは神経成長因子 (NGF)である。本発明におい ては，下記の実施例に示されるように，ニューロトロフィンレセプター p75 (p75NTR)に 対する中和抗体を投与することにより，完全フロインドアジュバント (CFA)誘導性炎 症または NGFの足底内注射により発生させた痛覚過敏をブロックすることが見いださ れた。また， CFAの注射により一次知覚-ユーロンにおける CGRPレベルがアップレ ギュレートされるが， p75NTRのブロックはこの効果を破壊すること，神経終末で標識さ れた p75NTRは， CFA誘導性炎症の後，逆行的に知覚-ユーロンの細胞体に輸送さ れることが明らかになった。
[0014] すなわち，本発明においては， p75NTRを阻害することにより CFA誘導性および NG F誘導性痛覚過敏が減少することが示された。 p75NTRに対する中和抗体は，炎症に 関連する痛みを治療するのに有用であろう。
[0015] さらに，本発明においては， proNGFがインビボで p75NTRの支配的なリガンドであ ることが示された。 proNGFを分解する目的でプラスミン処置を行うと， CFA誘導性 痛覚過敏が改善された。炎症の間に内因性 proNGFが過剰産生され， p75NTRに結 合してこれを活性ィ匕することができる機能型の分泌が生じ，このことによりインビボで 熱過敏性が誘導されると考えられる。
[0016] 下記の実施例に示されるように，足底内 CFA注射後にプラスミンで処置すると，熱 過敏性が有意に低下した。 proNGF力 ¾75NTOに対して成熟 NGFより高 、ァフィニテ ィーを示すことと一致して， proNGFは， p75NTR媒介性細胞応答のより強い誘導物 質である力もしれない。すなわち， NGFの生物学的作用は，蛋白質分解性切断によ り制御されており，プロ型が優先的に P75NTRを活性ィ匕して，知覚-ユーロン過敏性を 媒介して!/、るの力もしれな！、。
[0017] p75NTRは神経系にお 、て種々の役割を有しており，これには，先祖細胞数の制御 ,軸索伸長の調節，およびニューロンおよび稀突起神経膠細胞の生存および死の制 御が含まれる。下記の実施例に示されるデータは， proNGF,ならびに成熟 NGFが , p75NTRを介して知覚過敏性を伝達するのに役割を果たして 、る力もしれな 、ことを 示す。したがって，内因性 proNGFと p75NTRとの結合を破壊することにより，炎症関 連痛みの治療の新規な治療方法を提供しうると考えられる。
[0018]
すなわち，本発明にしたがう鎮痛剤は， p75NTR阻害剤を有効成分として含有する。 ここで， 「p75NTR阻害剤」とは， p75NTRがリガンドと結合してそのシグナルを下流に伝 達する活性を消失又は少なくとも有意に減少させる物質を意味する。 p75NTRの活性 は，後述する実施例に記載の通りに調べることができる。
[0019] 本発明の p75NTR阻害剤として特に好ましいものは抗 p75NTR抗体である。本明細書 において， 「抗 P75NTR抗体」とは， p75NTRと抗原抗体反応により結合しうる抗体を意 味する。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよ 、。
[0020] p75NTRに結合するポリクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方 法にしたがって， p75NTRを感作抗原として用いて動物を免疫し，その血清から得るこ とができる。 p75NTRに結合するモノクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知 られる方法にしたがって， p75NTRを感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免 疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイプリドーマをクロー ユングし，このハイプリドーマを培養することにより得ることができる。
[0021] 本発明のモノクローナル抗体には，ハイプリドーマにより産生される抗体にカ卩えて， 抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子 組換え抗体，キメラ抗体， CDR移植抗体，およびこれらの抗体の断片等が含まれる。
[0022] 遺伝子組み換え抗体は，抗 p75NTR抗体を生産するハイプリドーマ力も抗体をコー ドする cDNAをクローユングし，これを発現ベクター中に挿入して，動物細胞，植物 細胞などを形質転換し，この形質転換体を培養することにより製造することができる。 キメラ抗体とは，ある動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と， 他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体 である。 p75NTRに結合しうる抗体断片としては， Fab, F(ab')2, Fab', scFv,ディアボ ディー等があげられる。
[0023] 杭 ： 田 の 製
p75NTRに結合する抗体を産生する細胞は，当該技術分野においてよく知られる方 法により取得することができる。 p75NTRを感作抗原として用いて動物を免疫し，得ら れる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマを クロー-ングする。より詳細には，まず，抗原となる p75NTRを製造する。ヒトの p75NTR は， GenBank受託番号 AAB59544に記載される遺伝子の塩基配列及びそれがコ ードするアミノ酸配列にしたがって，通常の方法により組換え的に生成することができ る。ヒトの p75NTRのアミノ酸配列は以下のとおりである。
[0024] 次に，このようにして製造した p75NTRを抗原として，動物の皮下，静脈内または腹 腔内に投与する。免疫動物としては，マウス，ラット，ハムスター，ゥサギ，ャギ等の哺 乳動物を用いることができる。好ましくは，抗原をキャリアタンパク質に結合させる力， フロインド完全アジュバント等の適当なアジュバントとともに抗原を投与する。あるいは ,抗原として p75NTRの部分ペプチドを用いてもよい。
[0025] 抗原の投与は， 1 3週間毎に数回行う。血清中の免疫グロブリンの量を ELISA法 などにより測定することにより，抗体価をモニターする。十分に抗体価が上昇した後， この動物から免疫細胞を取り出す。免疫細胞としては好ましくは脾臓細胞を用いる。 抗体産生免疫細胞と，同種の哺乳動物に由来する骨髄腫細胞とを融合させてハイ プリドーマを作製する。ノ、イブリドーマを作製するのに適した各種の骨髄腫細胞株が 市販されている。融合は， 当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，例 えば PEGの存在下で行い， HAT培地で融合細胞を選択する。培養上清を ELISA 法などによりアツセィして，抗原と結合する抗体を産生するハイプリドーマを選択する 。次に，限界希釈法により目的とする抗体を産生するハイブリドーマをクローユングす ることがでさる。
[0026] モノクローナル杭体の調製
モノクローナル抗体は，モノクローナル抗体産生細胞を培養して得られる培養液の 上清から，またはあら力じめ 2, 4, 10, 14ーテトラメチルペンタデカンで前処理したマ ウスにモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内投与し，接種後 7日から 10日目にマウ スの腹水を採取し，遠心分離し，上清を分取することにより製造することができる。モ ノクローナル抗体の精製は，通常のタンパク質精製方法，例えば，塩析，限外濾過， ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，ァフィ-ティークロマトグラフィー， HPLC等 の方法を用いて行うことができる。好ましくは，プロテイン Aカラムによるァフィユティー クロマトグラフィーを行う。精製したモノクローナル抗体のサブクラスは，市販のマウス モノクローナル抗体ァイソタイピングキットを用いてタイピングすることにより決定するこ とがでさる。
[0027] 杭体遺伝子の塩某配列の解析
本発明のモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子の塩基配列は，得られたモノ クローナル抗体産生細胞の遺伝子を解析することにより得ることができる。モノクロ一 ナル抗体産生細胞力ゝら全 RNAを抽出し，これを铸型としてリバーストランスクリプター ゼを用いて cDNA断片を調整する。次に，適切に設計されたプライマーを用いて PC Rにより抗体遺伝子の V領域を増幅し，この領域の cDNAの塩基配列を決定する。
[0028] 抗体の特異性の確認
本発明のモノクローナル抗体の結合の特異性は， ELISA, RIA,免疫薄層クロマト グラフィー， BIAcore,蛍光抗体法等の当該技術分野において知られる方法を用いて 確認することができる。例えば， p75NTRを固定ィ匕したマイクロプレートに， 2倍希釈系 列の本発明のモノクローナル抗体を加えてインキュベートした後，酵素標識二次抗体 を加え，基質を加えて発色させ，マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。
[0029] 組橼 杭体
本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して，遺伝子組換え技術を 用いて組換え型の抗体を製造することができる。組換え型の抗 P75NTRモノクローナ ル抗体を製造するためには，本発明の抗体をコードする遺伝子を適当な発現べクタ 一に組み込み，宿主細胞に導入する。宿主細胞としては，大腸菌，酵母，哺乳動物 細胞，昆虫細胞，植物細胞などを用いることができ，特に哺乳類細胞，例えば， CHO , COS, BHKを用いることが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は，例えば塩ィ匕 カルシウム法，リン酸カルシウム法， DEAEデキストラン法，カチオン性リボソーム DOT AP (ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法，エレクト口ポーレーシヨン法，リボフ ェクシヨンなどの方法により行うことができる。得られた形質転換宿主細胞を培養し， 抗体を発現させることにより，組換え型の抗体を製造することができる。
[0030] キメラ抗体
キメラ抗体とは，ある動物 (例えばマウス）に由来する抗体の重鎖可変領域および軽 鎖可変領域と，他の動物 (例えばヒト）に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定 常領域力も構成される抗体である。キメラ抗体は， p75NTRに結合するモノクローナル 抗体を生産するハイブリドーマから，抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコ ードする cDNAをクローニングし，一方，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域 および軽鎖定常領域をコードする cDNAをクローユングし，これらを組み合わせて適 当な発現ベクター中に挿入して，宿主細胞中で発現させることにより，組換え的に製 造することができる。
[0031] CDR移植抗体
CDR移植抗体は，ある動物（例えばマウス）の抗体の相補性決定領域 (CDR)を別 の動物（例えばヒト）の抗体の相補性決定領域に移植した抗体である。 CDR移植抗 体をコードする遺伝子は， p75NTOに結合するモノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマ力 クローユングされた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配 列に基づいて，それぞれ CDR1, 2, 3をコードする遺伝子配列を設計し，他の動物 に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベ クタ一中の対応する CDR1, 2, 3の配列と置き換えることにより得ることができる。例 えば，マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計した 数個のプライマーを用いて， PCR法により合成することができる。あるいは，合成 DN Aを用いて全配列を構築してもよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞中で発現さ せることにより， CDR移植抗体を組換え的に製造することができる。
[0032] 杭鎌
p75NTRに結合しうる Fab, F(ab')2, Fab', scFv,ディアボディー等の抗体断片は，上 述の本発明の抗 p75NTOモノクローナル抗体をパパイン，トリプシン等の酵素で処理 するか，またはこれらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導 入して形質転換体を得ることにより，製造することができる。
[0033] 抗体以外の Ό75皿阻害剤
p75NTR阻害剤の他の例としては， NGFと p75NTRの結合を阻害するペプチド、例え ば NGFの部分配列を有するペプチドを挙げることができる。
[0034] さらに，本発明の鎮痛剤は， p75NTR阻害剤として，アンチセンスオリゴヌクレオチド ,リボザィム， RNA干渉 (RNAi)を引き起こす分子（例えば， dsRNA, siRNA, shR NA, miRNA)等を含むものであってもよい。これらの核酸は， p75NTO遺伝子または p75NTRをコードする mRNAに結合しその発現を阻害することができる。アンチセンス ,リボザィム技術および RNAi技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，ま たはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野にお いてよく知られている。
[0035] アンチセンスオリゴヌクレオチドとは， p75NTRをコードする mRNAと相補的な配列を 有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは， mRN Aと特異的に結合し，転写および Zまたは翻訳を阻害することによりタンパク質の発 現を阻害する。結合はワトソン 'クリックまたはフーダスティーン型の塩基対相補性に よるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよ ヽ。
[0036] リボザィムとは，触媒的特性を有する 1またはそれ以上の RNAの RNA構造を表す 。リボザィムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す 。種々の二次構造のリボザィム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプの リボザィムが知られている。 RNA干渉 (RNAi)とは，二本鎖 RN A分子を用いて標的 遺伝子をサイレンシングする手法を 、う。
[0037] mm
p75NTR阻害剤は，そのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で用いられる 担体を用いて製剤される。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用されるいず れのものをも用いることができ，例えば，滅菌水，生理食塩水，賦形剤，安定剤，酸 化防止剤，緩衝剤，界面活性剤，結合剤等が好ましく用いられる。さらに， p75NTR阻 害剤をマイクロカプセルや高分子ゲル中に封入して，徐放性製剤としてもょ ヽ。
[0038] 本発明の鎮痛剤の投与経路は，経口投与，静脈内投与，皮内投与，皮下投与，筋 肉内投与，体腔内投与等が挙げられる。好ましくは，炎症を起こしている部位に直接 または経皮的に投与するか，あるいは，カテーテル等を用いて直接注入してもよい。
[0039] 投与量は， p75NTR阻害剤の種類や投与経路，神経損傷の程度等に応じて適宜選 択されるが，炎症部位に直接投与する場合，通常， 0.1mg〜10mg,好ましくは， lmg 〜5mgである。直接投与以外の非経口投与，例えば静脈注射等では，通常，上記投 与量の 10倍程度である。
[0040] 別の観点においては，本発明は，鎮痛剤の候補物質を同定する方法を提供する。
この方法は，試験物質を P75NTRと接触させ，この試験物質が p75NTRの機能を阻害 するか否かを判定することを含む。 p75NTRの機能の阻害には， p75NTRに結合して p7 5NTRの正常な機能の発揮を阻害すること，ならびに p75NTRとそのリガンド (NGFまた は proNGF)との結合を阻害することが含まれる。試験物質が p75NTRと結合する能力 ,あるいは p75NTRとそのリガンドとの結合を阻害する能力は，当業者によく知られる結 合アツセィ，例えば，限定されないが，ゲルシフトアツセィ，放射性標識競合アツセィ ,クロマトグラフィーによる分画などにより判定することができる。これらのアツセィによ り， p75NTRの機能を阻害するものとして同定された物質は，鎮痛剤の候補物質であ ると考免られる。
[0041] 以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の 範囲を制限するものではな 、。
実施例
[0042] 動物
雄 ICRマウス（25— 35g)および Wisterラット（150— 200g)を用いた。すべての動 物は，動物ユニットで 21°Cで 12時間の明暗サイクル（08 : 30- 20 : 30h)で飼育し， ペレット餌および水道水を自由に摂取させた。実験は，大学の倫理規定および NIH のガイドラインにしたがって実施した。
[0043] 痛覚渦敏の動物モデル
すべての操作は 50%O中 3%ハロタン麻酔のもとで行った。 30G針を用いて CFA
2
(lOul, Calbiochem, La Jolla, CA)をマウス後肢の足底表面の皮下に注射した（ n= 19)。 19匹のうちの 7匹マウスには， CF A処置の 30分前に， 5ulの抗 p75NTR抗 体（Advanced Targeting System, CA, USA)をマウス左後肢の足底表面に注 射した。 4匹のマウスで，プラスミンの影響を試験した。 CFA注射の 1時間後， 10ug のプラスミン（Sigma, MO, USA)を足底表面の同じ部位に注射した。
[0044] 別の組の実験においては，神経成長因子ベータ（NGF— β , Sigma, MO, USA )をゥシ血清アルブミンを含む通常の食塩水中で希釈して最終濃度 0. lugZmlとし た。 NGF— β (1. OugZ肢； 10 1)をマウス左後肢の足底表面に注射した (η= 16) 。 NGF注射の 30分前， 5ulの抗 p75NTR抗体を足底表面の同じ部位に注射した (n= 8)。対照実験として，マウス (n=4)にゥシ血清アルブミンを含む通常の食塩水を注 射した。次にマウスを麻酔から回復させた。マウスは 5分以内に完全に動けるようにな つた o [0045] 纖籠
後肢の熱侵害受容閾値は， Hargreaves装置（Ugo Basile, Varese, Italy)を用 いて評価した。簡単には，マウスを試験箱に入れ， 27— 29°Cに維持した窓ガラスの 床に置いた。試験すべき肢の足底表面の下に配置した直径 0. 5cmの放射熱源を用 いることにより，熱刺激（lcm2あたり 150ミリカロリー Zsec)を与えた。熱源を各後肢 の下に交互に配置し，動物による予想を回避するために，最初に刺激する肢は無作 為に選択した。刺激の開始力 肢逃避までの時間を最も近い 0. 1秒まで測定し， 20 . 0秒の絶対カットオフ時間を用いて組織障害を防止した。両方の後肢を無作為の順 番で試験し， 3回の測定を行って，各後肢についての平均を求めた。
[0046] 侵害受容閾値は NGF— βの足底内注射の前 (基底対照として）および 1, 2, 3, 6 および 24時間後に測定した。また，別の一連の実験においては， CF Αの足底内注 射の前および 1, 2, 3, 6, 24および 48時間後に測定した。
[0047] 月 深度測定
炎症の程度は，ベニェカリパスを用いて肢深度の変化により評価した。肢深度は， 注射の直前，および有害な熱刺激を適用した 3, 6, 24および 48時間後に測定した
[0048] 免痔組織化学
CFAで 18時間処置したマウス (n=4)または抗 p75NTR抗体プラス CFAで処置した マウス（n=4) ,またはナイーブ対照マウス（n=4)を， 0. 9%食塩水で，次に 0. 1M リン酸バッファー溶液 (PBS)中 4%パラホルムアルデヒド（PFA)で，心臓経由で灌流 した。次に，同側の L5 DRGを切除した。標本を同じ固定液に 4°Cで一晚浸漬し，そ の後，これを 20%ショ糖に移し， 4°Cでー晚インキュベートした。低温槽を用いて DR Gから連続切片（12 m厚）を作製し，ポリ L—リジンでコーティングしたスライドに マウントした。切片をゥサギポリクローナル抗 CGRP抗体（1： 1000 ;Chemicon)とと もに 4°Cでー晚インキュベートした。 PBSで洗浄した後，切片を Alexa Fluor546— コンジユゲートイ匕ロノく抗ゥサギ IgG抗体 (5 gZml; Molecular Probes, Eugene , OR)とともに 2時間インキュベートした。染色した切片を風乾し，脱水し， Permaflu or (Shandon, Pittsburgh, PA, USA)中に包埋した。 [0049] p75NTRの分布を調べるために，正常皮膚の切片を， PBS中に 1%BSAおよび 5% スキムミルク，および 0. 3%丁1：辻01^—100を含むブロッキング溶液中で室温で1時 間インキュベートした。 p75NTRおよび神経線維を二重に検出するために，切片を PB S中 1%BSAおよび 5%スキムミルク，および 0. 3% TritonX— 100中の抗 p75NTR 抗体（Promega, WI, U. S. A. )および T i— 1 (Covance, Ca, U. S. A. )ととも に 4°Cでー晚同時にインキュベートした。次に，切片を， Alexa Fluor488標識ャギ 抗ゥサギ抗体（1 :400 ; Molecular Probes, Eugene, OA, USA)および Alexa Fluor546標識ャギ抗マウス抗体（1 :400 ; Molecular Probes, Eugene, OA, U SA)とともに室温で 2時間インキュベートした。染色した切片を風乾し，脱水し， Perm afluor (Shandon, Pittsburgh, PA, USA)に包埋した。
[0050] 免疫エンドサイト一シスアツセィ
抗 p75NTR抗体である MC192を免疫エンドサイト一シスアツセィにおいて用いて， p 75NTRのリガンド誘導性取り込みを可視化した。ラット p75NTRの細胞外ドメインを認識 する MC192 (100ng ; 50 1, Chemicon)をラットの足底内に注射し， 30分後に CF A処置を行うかまたは行わなかった（各 n=4)。 MC192の注射の 18時間後にラット を深い麻酔下で（40mgZkgペントバルビタールナトリウム， i. p. Sanofi Sante In c)犠牲死させ， 0. 9%食塩水で，次に 0. 1Mリン酸バッファー溶液（PBS)中 4%パ ラホルムアルデヒド固定液で心臓経由で灌流し，次に L5 DRGを切除した。
[0051] 標本を同じ固定液に 4°Cで一晚浸漬し，次に 20%ショ糖に移し， 4°Cでー晚インキ ュペートした。低温槽を用いて DRG力も連続切片（12 m厚）を作製し，ポリ一 L—リ ジンでコーティングしたスライド上にマウントした。切片は Alexa Fluor546標識ャギ 抗マウス抗体（1 :400 ; Molecular Probes, Eugene, OA, USA)とともに室温で 2時間インキュベートした。染色した切片を風乾し，脱水し， Permafluor (Shandon , Pittsburgh, PA, USA)に包埋した。
[0052] 。roNGFアツセィ
足底皮膚を溶解バッファー（l%Nonidet P— 40, 20mMTris (pH8. 0) , 137m M NaCl, 0. 5mM EDTA, 10%グリセロール， lOmMフッ化ナトリウム， ImM Na Vo , ImM PMSFおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中でホモジナイズした 。ホモジネートを 500gで 15分間遠心分離し，ペレットを廃棄した。上清のァリコート（ 合計 500 /z gの蛋白質)を取り出し，溶解バッファーで希釈した。溶解物を抗 P75NTR 抗体（Promega, WI, U. S. A. )とともに 4°Cでー晚インキュベートした。次に，溶解 物をプロテイン Aセファロースとともに 3時間インキュベートし，よく洗浄した。
[0053] 蛋白質サンプルを SDS— PAGE勾配ゲル（ 12%； Bio-Rad)で分離し， PVDFフ ィルターに移した。ブロットを 5%ゥシ血清アルブミン（BSA)で 1時間ブロッキングし， 抗 NGF抗体（1 : 10000 ; Sigma, MO, USA)または抗 proNGF抗体（1 : 500 ;Α1ο monelabs, Jerusalem, Israel)とともに 4°Cでー晚インキュベートした。次にプロット を HRPコンジユゲートイ匕二次抗体（1： 2000)とともに室温で 1時間インキュベートし， ECL溶液（NEN)中で 1分間発色させ， X線フィルム（superfilm;Amersham)に 2 —10分間露光した。各実験は，少なくとも 3回繰り返した。
[0054] プラスミン処置
10 1の足底内 CFA注射によりマウスに痛覚過敏を誘導し， CFA注射の 1, 2, 3, 6, 24,および 48時間後に PWLを測定した。 CFAの足底内注射の 1時間後， 10 /z g のプラスミン（Sigma, Missouri, USA)を同じ部位に注射した。
[0055] 統 t学的分析
免疫染色切片の画像を CCDカメラで取り込み，免疫反応性細胞の数のプロフアイ ルを盲検様式で計数した。対照および処置切片を同じスライド上にマウントし，同じ条 件下で加工した。一連の連続切片から 5つごとに切片を取り出し， 4つの切片を計数 した。ウェスタンブロット用には，フィルムをスキャンし，特定のバンドの密度を測定し， 対照バンドに対して標準化させた。すべてのデータは片側 t検定により分析し， < 0. 05の p値を統計学的〖こ有意として，平均士 SEMとして示した。
[0056]
Figure imgf000016_0001
最初に，免疫組織ィ匕学によりマウス足底皮膚における p75NTRの発現を調べた。 p7 5NTRおよび Tujlに対する抗体を用いて免疫組織ィ匕学染色を行ったところ，表皮内 および表皮下の Tuj - 1—免疫反応性神経線維が p75NTRを発現して ヽることが確認 された。このことは， p75NTRが足底皮膚の皮下組織の遊離神経終末で発現されてい ることを示す。 [0057] 次に，局在化した末梢炎症が末梢神経中の p75NTOと関連するか否かを試験するた め，マウス左後肢の足底表面に CFAを注射して実験的炎症を起こし，局所的知覚過 敏性を生じさせた。 CFAは局所的炎症を誘導し，これは数分間かけて発症して，一 週間以上持続し，腫脹および紅斑，ならびに熱および機械的痛み過敏性を伴う（28 ) o CFA注射の 48時間後までの観察期間の間，肢逃避反応潜時 (paw withdraw latencie, PWL)の有意な低下がみられた（図 la)。縦軸は， PWL値マイナス対照 PWLを示す。このことは， CFAが熱痛覚過敏を誘導したことを示す。 CFA誘導性炎 症は，末梢神経および炎症を起こした皮膚において NGFの上昇を引き起こすことが 示されている（4, 29, 30)。
[0058] p75NTR力 SCFA誘導性痛覚過敏に関与している力否かを調べるために，マウス p75 NTRに対する中和抗体を使用して， NGFの p75NTRへの結合を阻害した。 CFAの注 射の 30分前に抗 p75NTR抗体（lOulZ肢)を足底内注射により投与すると， CFA誘 導性痛覚過敏が有意に減少した（図 la)。抗 p75NTR抗体処置群においては，足底 内 CFA注射の 3時間後力 熱過敏性の低下が認められた（一 3. 21 ± 1. 67s, CF A注射単独— 5. 95± 1. l isと比較して， p< 0. 05)。この低下は，観察期間中， 48 時間まで持続した（— 0. 96± 2. 34〜― 2. 68±0. 88s, p< 0. 05)。p75證に対 する中和抗体は NGFの p75NTRへの結合を阻害するため，これらの結果は， NGFの P75NTRへの結合が炎症誘導性痛覚過敏に関与していることを示唆する。
[0059] 肢深度は炎症の重篤度を表す。足底内 CFA注射の 3時間後に肢深度の有意な増 カロ力 Sみられ（3. 35±0. 21mm, p< 0. 01) , 48時間まで持続した（3. 6±0. 08m m) (図 lb)。縦軸は深さ (mm)を示す。 Base,対照 (食塩水注射）； pre,注射前。し かし， 3時間から 48時間までの観察期間のいずれにおいても，抗 p75NTR抗体処置に よる肢深度の有意な減少はみられなカゝつた。このことは，抗 p75NTR抗体の効果は炎 症の抑制には依存して 、な 、ことを示唆する。
[0060] 075^に対する中和抗体による NGF媒介性痛覚渦敏の防止
NGFは炎症痛覚過敏の生成に対する主要な寄与因子であると示唆されており（4) , NGFのマウス後肢への足底内注射は，熱痛覚過敏に対する時間依存的効果を生 ずる（7)。NGF (1. 0 gZ肢； 10 1)を左後肢の足底内に注射すると，注射後 1, 2 および 6時間において，べヒクル対照（生理食塩水溶液 10 1)群（白四角，破線; n =4)と比較して，統計学的に有意の熱痛覚過敏がみられた (n= 8)。 NGF注射の 1 時間後に肢逃避反応潜時 (PWL)の有意な低下がみられ， 2時間で最大に達した（ — 0. 31 ±0. 70s (ベースライン）力も— 5. 82± 1. 19s (2時間）への PWLの低下， pく 0. 01) (図 2)。この NGF誘導性痛覚過敏は， 6時間では持続していたが， 24時 間では持続していな力つた。予測されたように，抗 p75NTR抗体（10 lZpaw)を予め 足底内投与すると， 1, 2および 6時間において， NGFにより誘導された熱痛覚過敏 がブロックされた（* p< 0. 01) (n=8)。抗 P75NTR抗体それ自体の注射によっては， PWL (1. 08±0. 99s)の変化はなかった。縦軸は PWLマイナス対照 PWLの値を 示す。食塩水処置動物と反対側の肢では肢逃避反応潜時の有意な相違はなかった 。これらの結果は， NGFの p75NTOへの結合の阻害が NGF誘導性痛覚過敏を有効 に低下させることを示す。
[0061] 75皿に針する中禾ロ杭体による痛み斷車遣伝早の 現の低下
次に，挙動試験における所見を実証するために， CGRPの発現を調べた。 CFAの 足底内注射により生じさせた実験的炎症は，炎症を起こした組織に分布する一次知 覚ニューロンにおいて，神経ペプチド，サブスタンス Pおよびカルシトニン遺伝子関連 ペプチド (CGRP)をアップレギュレートする（4)。抗 NGF中和抗体の全身投与は， C GRPのアップレギュレーションを妨害するが，腫脹および紅斑は変化しない (4)。 CG RPの発現は小から中サイズの DRG-ユーロンにおいて見出された力 発現レベル は足底内 CFA注射の 18時間後にアップレギュレートされた。
[0062] CFA注射後の DRG中の CGRP—ポジティブ-ユーロンの数（52. 92± 9. 30細胞 /0. 1mm2)は，対照（33. 71 ± 7. 51細胞 ZO. 1mm2)と比較して優位に増加して いた (Pく 0. 01) (図 3)。しかし，抗 p75NTR抗体（10/z lZ肢）により前処置を行うと， CGRP—ポジティブ-ユーロンの数に及ぼす CF Aの影響は完全になくなった（32. 5 4±4. 72) ( * * p< 0. 01,各群 n= 5)。これらの結果は，挙動試験から得られた結 果と一致する。
[0063] Ό75ニューロトロフィンレセプターのリガンド誘導性逆行性輸送
p75NTRに対する中和抗体が CFA誘導性ならびに NGF誘導性痛覚過敏を低下さ せたため，リガンドーレセプター複合体がシグナリング複合体としての役割を果たす の力もしれないと考えられた。したがって，次に， NGF注射の後に p75NTRが逆行的 に輸送されるか否かを調べた。
[0064] 内部に取り込まれた p75NTRをモニターするために， p75NTRの細胞外ドメインに対す る抗体である MC192を用いた。この抗体はラット p75NTRに特異的であるため，この 実験ではラットを使用した。 NGF処置ありまたはなしで， MC192を注射した 18時間 後に， L5のレベルの DRGを調べた。 NGF処置をしていない DRGの-ユーロンにお いては，内部に取り込まれた MC192はみられなかった。このことは，基底レベルの- ユーロトロフィンは p75NTRの内部取り込みを誘導しないであろうことを示唆する。興味 深いことに， NGF処置の 18時間後， DRG-ユーロンの細胞体において MC192が みられた（図 4)。このことは，リガンドによる刺激が末梢終末で p75NTRの内部取り込 みおよび DRG軸索を介する p75NTRの輸送を促進したことを示す。 NGFが結合する と， p75NTRは内部に取り込まれ，おそらくは NGFおよび Zまたは TrkAとともに逆行 的に輸送されたと考えられる。
[0065] ProNGF Ό75腿 の結合
上述の結果は， CFA誘導性熱痛覚過敏には p75NTRへのリガンドの結合が必要で あることを強く示唆する。したがって，次に， NGFが実際にインビボで p75NTRに結合 するか否かを調べた。足底内 CFA注射の 18時間後に，炎症を起こしたマウス足底 皮膚を回収し， NGF発現のプロファイルを調べた。抗 NGF抗体を用いるウェスタン 分析を行ったところ， CFA注射の後に末梢組織で 14kDaのバンドとして検出される NGF発現が強く誘導されていた（図 5a)。また，分子量 24— 32kDaの多数のバンド が明確に見られた。 26kDaのバンドは proNGFに対応し，これは抗 proNGF抗体で 確認された。 14kDaのバンドは成熟 NGFに対応する。 ProNGFは，炎症を起こした 皮膚でアップレギュレートされて 、た。
[0066] 抗 NGF抗体で検出された蛋白質の分子量（14kDa, 24— 32kDa)は，末梢炎症 の間に成熟 NGFおよび proNGFの両方ともアップレギュレートされたことを示唆する 。すなわち，この結果は， proNGFが CFA誘導性痛覚過敏において役割を果たして いる可能性を示唆する。 [0067] ただし，溶解物中の proNGFが分泌されたものである力，細胞の内部で合成され残 留したものであるかという疑問が残った。このため， proNGFが CFA誘導性炎症状態 における p75NTRのリガンドである力否かをさらに調べた。 proNGFがインビボで産生 され分泌されているカゝ否かを調べるために， CFA注射後の皮膚を回収した。次に， 皮膚の溶解物を抗 p75NTR抗体を用いて免疫沈殿させ，次に抗 NGF抗体を用いて p 75NTR免疫複合体における proNGFまたは成熟 NGFの存在を調べた。結果を図 5b に示す。 CFA注射後に 26kDaの NGF免疫反応性生成物が p75NTRとともに沈殿し たが，対照組織では共沈殿はみられな力つた。 14kDaの生成物も免疫沈殿したが， その量は 26kDaの生成物と比較してはるかに少なかった。 26kDaの生成物は，特 異的抗 proNGF抗体を用いるィムノブロットにより proNGFであることが示された（図 5 c)。これらの結果は， CFA誘導性痛覚過敏モデルにおいては， P75NTRに結合す る proNGFが大量に増加しており， proNGF力 ¾75NTRの支配的なリガンドであること を示す。
[0068] プラスミンによる nroNGFの分解
上述の結果は， proNGFが CFA誘導性痛覚過敏にぉ 、て役割を果たすことを示 唆する。細胞外に分泌された proNGFは，セリンプロテアーゼであるプラスミンおよび マトリクスメタ口プロティナーゼ 7により分解される（17)。 proNGFが炎症過敏性に必 要であるか否かを調べるために，次に， CFA誘導性炎症モデルにおいて， CFA処 置の後にプラスミンを足底内注射して proNGFを分解した。プラスミン処理により， pr oNGFの量は減少し，成熟 NGFの量は増加するはずである。すなわち， proNGFが 成熟 NGPより強力な痛覚過敏の誘導剤であれば， CFA誘導性痛覚過敏はプラスミ ン処置により軽減すると考えられる。
[0069] 予測されたように，プラスミン処置（10 gZ肢)の後では，熱過敏性は，足底内 CF A注射の 6時間後に，プラスミン処置なしの足底内 CFA注射（—4. 69± 1. 89s, p < 0. 01)と比較して有意に低下した（一 1. 63±0. 96s) (図 6)。これらの知見は， pr oNGFが p75NTRの支配的なリガンドであり，リガンドの結合をブロックすると，炎症誘 導性熱過敏性が低下すると!、う概念を裏付ける。
産業上の利用可能性 [0070] 本発明の鎮痛剤は，炎症性の痛みの治療剤として有用である。
図面の簡単な説明
[0071] [図 1]図 1は， p75NTRに対する中和抗体による CFA誘導性痛覚過敏の防止を示す。
[図 2]図 2は， p75NTRに対する中和抗体による NGF媒介性痛覚過敏の防止を示す。
[図 3]図 3は， p75NTRに対する中和抗体による痛み関連遺伝子の発現の低下を示す
[図 4]図 4は， p75-ユーロトロフィンレセプターのリガンド誘導性逆行性輸送を示す。
[図 5]図 5は， ProNGFと p75NTRとの結合を示す。
[図 6]図 6は，プラスミンによる proNGFの分解の影響を示す。

Claims

請求の範囲
[1] p75NTR阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤。
[2] 前記 p75NTR阻害剤が，抗 p75NTR抗体である請求項 1記載の鎮痛剤。
[3] 前記 p75NTR阻害剤が， proNGFと p75NTRとの結合を阻害する物質である請求項 1 記載の鎮痛剤。
[4] 鎮痛剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質を P75NTRと接触させ，前記 試験物質が p75NTRの機能を阻害する力否かを判定することを含む方法。
[5] 鎮痛剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質を P75NTRと接触させ，前記 試験物質が proNGFと p75NTRとの結合を阻害する力否かを判定することを含む方法
PCT/JP2006/316365 2005-08-30 2006-08-22 ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤 WO2007026567A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007533186A JPWO2007026567A1 (ja) 2005-08-30 2006-08-22 ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-249465 2005-08-30
JP2005249465 2005-08-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007026567A1 true WO2007026567A1 (ja) 2007-03-08

Family

ID=37808666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/316365 WO2007026567A1 (ja) 2005-08-30 2006-08-22 ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2007026567A1 (ja)
WO (1) WO2007026567A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013136078A1 (en) * 2012-03-14 2013-09-19 Levicept Ltd Therapeutic use of p75ntr neurotrophin binding protein
US10683339B2 (en) 2015-03-19 2020-06-16 Levicept Limited P75NTR binding protein-Fc fusion protein and methods of treating pain
US10988526B2 (en) 2013-09-18 2021-04-27 Levicept Limited DNA molecule encoding a p75NTR(NBP)-Fc fusion protein
US11339202B2 (en) 2014-07-17 2022-05-24 Levicept Limited Therapeutic use of p75NTR neurotrophin binding protein

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE R. ET AL.: "Regulation of Cell Survival by Secreted Proneurotrophins", SCIENCE, vol. 294, 2001, pages 1945 - 1948, XP003002960 *
PETERSEN M. ET AL.: "Nerve growth factor regulates the expression of bradykinin binding sites on adult sensory neurons via the neurotrophin receptor p75", NEUROSCIENCE, vol. 83, no. 1, 1998, pages 161 - 168, XP003002959 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013136078A1 (en) * 2012-03-14 2013-09-19 Levicept Ltd Therapeutic use of p75ntr neurotrophin binding protein
CN104302326A (zh) * 2012-03-14 2015-01-21 利维塞普特有限公司 P75ntr神经营养因子结合蛋白的治疗性用途
JP2015511490A (ja) * 2012-03-14 2015-04-20 レヴィセプト エルティーディーＬｅｖｉｃｅｐｔ Ｌｔｄ Ｐ７５ｎｔｒニューロトロフィン結合タンパク質の治療用途
AU2013234083B2 (en) * 2012-03-14 2017-05-11 Levicept Ltd Therapeutic use of p75NTR neurotrophin binding protein
US9764000B2 (en) 2012-03-14 2017-09-19 Levicept Ltd Therapeutic use of p75NTR neurotrophin binding protein
KR101808020B1 (ko) * 2012-03-14 2018-01-19 르비셉트 리미티드 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질의 치료학적 용도
CN104302326B (zh) * 2012-03-14 2018-03-30 利维塞普特有限公司 P75ntr神经营养因子结合蛋白的治疗性用途
US10751389B2 (en) 2012-03-14 2020-08-25 Levicept LLD Therapeutic use of p75NTR neurotrophin binding protein
US10988526B2 (en) 2013-09-18 2021-04-27 Levicept Limited DNA molecule encoding a p75NTR(NBP)-Fc fusion protein
US11339202B2 (en) 2014-07-17 2022-05-24 Levicept Limited Therapeutic use of p75NTR neurotrophin binding protein
US10683339B2 (en) 2015-03-19 2020-06-16 Levicept Limited P75NTR binding protein-Fc fusion protein and methods of treating pain

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2007026567A1 (ja) 2009-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020260440B2 (en) Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (GDF-15), and uses thereof for treating cancer cachexia and cancer
Webster et al. Brain penetration, target engagement, and disposition of the blood‐brain barrier‐crossing bispecific antibody antagonist of metabotropic glutamate receptor type 1
KR101004353B1 (ko) 다양한 질환의 치료에 유용한 항-엔지에프 항체
BR112019014694A2 (pt) anticorpos anti-cd47 e usos dos mesmos
US20190119373A1 (en) Antibody recognizing human leukemia inhibitory factor (lif) and use of anti-lif antibodies in the treatment of diseases associated with unwanted cell proliferation
KR101999872B1 (ko) 혈뇌 장벽 투과성의 조정에 있어서의 세마포린-4d 결합 분자의 용도
US8334274B2 (en) Immunomodulation of inflammatory conditions utilizing Follistatin-like Protein-1 and agents that bind thereto
JP3981148B2 (ja) 軸索再生促進剤
KR20160104727A (ko) 암의 치료 및 검출을 위한 조성물 및 방법
WO2017147742A1 (en) Gfral receptor therapies
KR20170098954A (ko) 암의 치료 및 검출을 위한 조성물 및 방법
JP2014169295A (ja) マクロファージ阻害性サイトカイン（ｍｉｃ−１）活性を調節するための作用物質及び方法
CN109369808A (zh) 用于治疗ror1癌症并抑制转移的抗体和疫苗
KR20150018555A (ko) 뇌졸중 후 신경발생을 촉진시키는 세마포린-４d 결합 분자의 용도
CN110099694A (zh) 低体温改善剂
US10221235B2 (en) Endotrophin neutralization and use thereof
BR112021003093A2 (pt) tratamento de câncer de mama triplo negativo que visa a inibição de tgf-beta
WO2007026567A1 (ja) ｐ７５ＮＴＲ阻害剤を有効成分として含有する鎮痛剤
Salazar‐Degracia et al. Reduced lung cancer burden by selective immunomodulators elicits improvements in muscle proteolysis and strength in cachectic mice
CN105085679B (zh) 全人源抗rankl抗体
JP2021535078A (ja) 骨の疾患の治療に用いるためのトランスフェリン受容体２のアンタゴニスト及びアゴニスト
KR102096509B1 (ko) 항-Tspan12 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 그의 용도
TWI769150B (zh) 糖尿病之治療、類鐸受體第四型調節劑及其使用方法
US20190315848A1 (en) Anti-secretogranin iii (scg3) antibodies and uses thereof
TW201945026A (zh) 結合erfe之抗體及使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007533186

Country of ref document: JP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06782869

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)