BR112015012568A2

BR112015012568A2 - extrato purificado isolado de pseudolysimachion rotundum var. subintegrum contendo quantidade abundante de princípio ativo, preparação do mesmo, e composição compreendendo o mesmo como um princípio ativo para prevenir ou tratar a inflamação, alergia e asma

Info

Publication number: BR112015012568A2
Application number: BR112015012568A
Authority: BR
Inventors: Ryoo Byung-Hwan; Shin Dae-Hee; Kim Doo-Young; LEE Hyeongkyu; Song Hyuk-Hwan; Yoo Ji-Seok; Kim Jung-Hee; Ahn Kyung-Seop; Kwon Okkyoung; Oh Sei-Ryang; Lee Yongnam
Original assignee: Korea Res Inst Bioscience & Biotechnology; Yungjin Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2017-07-11
Also published as: JP5923222B2; BR122019025952B1; US9592263B2; US20160199430A1; AU2013371216B2; BR112015012568B1; EP3498287A1; RU2682653C1; CN104822386A; EP2941263B1; JP2016166183A; CA2951501C; CN105963312A; CN105963312B; CA2951501A1; EP2941263A4; RU2674757C1; RU2606768C1; JP6132942B2; EP2941263A1

Abstract

resumo extrato purificado isolado de pseudolysimachion rotundum var. subintegrum contendo quantidade abundante de princêpio ativo, preparaìo do mesmo, e composiìo compreendendo o mesmo como um princêpio ativo para prevenir ou tratar a inflamaìo, alergia e asma, refere-se aos novos mtodos inventivos industrializados para a preparao de extratos purificados industrializados contendo princpios ativos mais abundantes, como derivados catalpol de extrato de pseudolysimachion rotundum var subintegrum do que o preparado pelo mtodo convencional de preparao revelado na tcnica anterior e os alimentos de sade teraputicos ou funcionais compreendendo o extrato purificado para tratar e prevenir doena inflamatria, alrgica ou asmtica. o extrato purificado mostrou atividade anti-inflamatria, antialrgica e antiasmtica mais potente do que o preparado pelo mtodo de preparao convencional revelado na tcnica anterior por meio de vrios testes in vivo como o teste de inibio sobre a reproduo de eosinfilos, a liberao de imunoglobulinas e quimiocinas inflamatrias no plasma e fluido broncoalveolar, bem como a supresso da hiperreatividade das vias areas e hiperplasia das clulas caliciformes em um modelo murino sensibilizado/desafiado por ova. 1/1

Description

EXTRATO PURIFICADO ISOLADO DE PSEUDOLYSIMACHION ROTUNDUM VAR. SUBINTEGRUM CONTENDO QUANTIDADE ABUNDANTE DE PRINCÍPIO ATIVO, PREPARAÇÃO DO MESMO, E COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO O MESMO COMO UM PRINCÍPIO ATIVO PARA PREVENIR OU TRATAR A INFLAMAÇÃO, ALERGIA E ASMA

CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção refere-se a um extrato purificado isolado de Pseudolysímachíon rotundum var. subíntegrum contendo quantidade abundante de principio ativo, a preparação do mesmo, e a composição compreendendo o mesmo como um principio ativo para prevenir ou tratar inflamação, alergia e asma.

ESTADO DA TÉCNICA [002] De um modo geral, uma resposta inflamatória é uma resposta normal de corpo humano associada a um edema, uma dor etc. em caso de um tecido ou uma célula receber qualquer invasão causando alguma mudança orgânica no tecido ou célula. Recentemente, verificou-se que vários tipos de citocinas estavam envolvidos na doença inflamatória.

[003] Reação alérgica pode ser classificada em quatro categorias, isto é, tipo I, II, III e IV de acordo com os tipos de resposta ou duas categorias, isto é, reações alérgicas de tipo imediato, como tipo I, II ou III, e reação alérgica do tipo retardada, como tipo IV de acordo com os tipos de periodo do tempo de res-sensibilização causada por alergeno para o tempo de inicio da reação.

2/63 [004] Entre eles, alergia tipo I, estando envolvida em anticorpos IgE e chamada como alergia tipo anafilaxia, provoca asma brônquica, doenças atópicas como dermatite ou gastroenterite etc, rinite alérgica, como polinose, conjuntivite alérgica, alergia alimentar e semelhantes.

[005] A asma é considerada uma sindrome complexa das vias aéreas que é caracterizada por vários sintomas clínicos, por exemplo, tosse, dispnéia provocada por obstrução das vias aéreas, inflamação aguda ou crônica das vias aéreas, hiperresponsividade das vias aéreas (HR) e remodelação estrutural e pode ser reversível ou irreversivelmente recuperável. A maioria das asmas é doença alérgica e é caracterizada pela inflamação crônica das vias aéreas e hiperresponsividade brônquica (Mínoguchí K e M. Adachi, Mínoguchí K and Adachí M. , Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I. editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp97-104) .

[006] A asma pode ser classificada em dois tipos, isto é, asma extrínseca e asma intrínseca. A asma extrínseca é causada pela exposição ao antígeno e mostra reação positiva no teste cutâneo ou teste de provocação brônquica contra o antígeno. Normalmente, as idades afetadas estão ficando cada vez menores. Ela é causada principalmente por ácaros Dermatophagoides do pó caseiro e pólen, epitélio de animal, fungos e assim por diante. A asma intrínseca é causada por infecções das vias respiratórias superiores, exercício, instabilidade emocional, mudança de clima de umidade e é comum no paciente adulto. Também, o antígeno IgE

3/63 da asma extrinseca pode ser detectado por teste cutâneo devido ao aumento de IgE no soro.

[007] No que diz respeito à fisiopatologia, a asma é reconhecida por inflamação crônica dirigida por célula T2helper (Th2), e uma variedade de mediadores inflamatórios, tais como citocinas, quimiocinas, moléculas de sinalização, moléculas de adesão e fatores de crescimento, de células imunes e células estruturais nas vias respiratórias estão envolvidas em vários estágios da asma (Elias JA et al. , J Clin Invest., Ill, pp 291-7, 2003) . As células inflamatórias ativadas, como eosinófilos, mastócitos, macrófagos alveolares, etc. no brônquio de pacientes sofrendo de asma, liberam vários mediadores inflamatórios, tais como cisteina leucotrienos, prostaglandinas, etc, e estão envolvidas na constrição brônquica potente (Maggi, E., Immunotechnology 3, pp233 -244, 1998; Pawankar R. Curr. Opin. Allergy Clin.

Immunol., 1, pp3-6,	2 0 01;	Barnes PJ et al.,	Pharmacol.	Rev.	50,
pp515-596, 1998).

[008] Por conseguinte, uma vez que a reprodução de diversas citocinas envolvidas na ativação de células inflamatórias, como IL-4, IL-5, IL-13, etc, e IgE e reprodução de cisteina leucotrienos liberadas das células inflamatórias são as principais causas de inflamação, reação alérgica e asma, tem sido muito estudadas para desenvolver os agentes que inibem a reprodução destas até o momento.

[009] Os presentes inventores têm-se concentrado em desenvolver agentes potentes de tratamento derivados de recursos naturais

4/63 com segurança e eficácia como plantas, animais, etc possuindo atividade inibidora potente da reprodução das células inflamatórias e, finalmente, descobriram que o extrato de Pseudolysimachion longifolium mostrou potente atividade antiinflamatória, antialérgica e antiasmática (Patente Coreana N° 10-860080) e vários compostos isolados a partir dos mesmos, tais como, verprosideo (6-0-3,4-Di-hidroxibenzoil catalpol), picrosideo II (6-0-4-Hidroxi-3-metoxibenzoil catalpol), verminosideo (6-0-3,4-Di-hidroxi cinamoil catalpol), 6-0veratroil catalpol (6-0-3,4-Dimetoxi benzoil catalpol), minecosideo (6-0-3-hidroxi-4-metoxicinamoil catalpol), catalpol e semelhantes, também apresentaram uma potente atividade antiinflamatória, antialérgica e antiasmática (Publicação da Patente Coreana No. 10-2006-125499).

[010] No entanto, tem havido dificuldades na produção em massa e industrialização usando extrato de Pseudolysimachion longifolium uma vez que o extrato de planta contém muito poucos princípios ativos, como derivados de catalopol.

[011] Pseudolysimachion rotundum var subintegrum é uma erva perene distribuída na Coréia, China, Japão, Ostrov Sakhalin, e na Rússia.

[012] Com base nos estudos anteriores sobre a atividade antiinflamatória, antialérgica e antiasmática do extrato de Pseudolysimachion longifolium revelado na Patente Coreana No. 10-860080, os presentes inventores tentaram desenvolver métodos mais eficientes para preparar princípios mais potentes e mais

5/63 abundantes que mostram atividade anti-inflamatória, antialérgica e antiasmática isolados do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.

[013] No entanto, não foi relatado ou revelado sobre o método eficiente para preparar princípios mais potentes e mais abundantes que mostram atividade anti-inflamatória, antialérgica e antiasmática isolados do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum do que aqueles na literatura acima citados, cujas revelações são aqui incorporadas como referência.

[014] Consequentemente, os presentes inventores encontraram o novo método para preparar extrato purificado industrializado contendo princípios ativos mais abundantes, como derivados de catalpol do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum e o extrato purificado mostrou atividade antiinf lamatória, antialérgica e antiasmática mais potente do que o preparado pelo método de preparo convencional revelado na técnica anterior por meio de vários testes in vivo como o Teste de inibição na reprodução de eosinófilos, a liberação de imunoglobulinas e quimiocinas inflamatórias no plasma e fluido broncoalveolar, bem como a supressão da hiperreatividade das vias aéreas e hiperplasia de células caliciformes em um modelo de camundongo sensibilizados/ desafiados com OVA.

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO

O Problema Técnico

6/63 [015] A presente invenção fornece um novo método para preparar extrato purificado contendo os princípios ativos abundantes como derivados catalpol de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum e o extrato preparado deste modo.

[016] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica e um alimento saudável compreendendo o extrato purificado contendo os princípios ativos abundantes, como derivados catalpol de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum como um princípio ativo em uma quantidade eficaz para tratar e prevenir doença inflamatória, alérgica ou asmática.

[017] A presente invenção também fornece o uso de um extrato purificado contendo os princípios ativos abundantes, como derivados catalpol de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum que mostram atividade anti-inflamatória, antialérgica e antiasmática.

[018] A presente invenção também fornece um método para tratar ou prevenir doença inflamatória, alérgica ou asmática em um mamífero compreendendo a administração ao dito mamífero de uma quantidade eficaz de extrato purificado contendo os princípios ativos abundantes, como derivados catalpol de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7/63

A Solução Técnica [019] Por conseguinte, é um objeto da presente invenção fornecer novos derivados de extrato purificado contendo derivados catalpol abundantes do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.

[020] Os termos derivados catalpol revelados aqui compreendem verprosideo, catalposideo, picrosideo Π, isovaniloil catalpol e 6-0-veratroil catalpol etc.

[021] 0 termo Pseudolysimachion rotundum var subintegrum revelado aqui compreende a planta cultivada artificialmente ou naturalmente e a planta comercialmente disponível, mas não tem o intuito de se limitar aos mesmos aqui.

[022] 0 termo novo extrato purificado revelado aqui compreende (a) o extrato purificado fracionado com butanol (doravante designado como ATC1) e (b) o extrato purificado com o fracionamento secundário (doravante designado como ATC2).

[023] Especificamente, o termo o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) é caracterizado por conter 15-50% (p/p) verprosideo, 0,3-10% (p/p) ácido verátrico, 0,5-10% (p/p) catalposideo, 0,3-10% (p/p) picrosideo II, 0,3-10% (p/p) isovaniloil catalpol e 0,3-10% (p/p) 6-0- veratroil catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; preferencialmente, 20-25% (p/p) verprosideo, 0,5-5% (p/p) ácido verátrico, 1-5% (p/p) catalposideo, 0,5-5% (p/p) picrosideo II, 0,5-5% (p/p)

8/63 isovaniloil catalpol e 1-5% (p/p) 6-0-veratroil catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; ou caracterizado por conter 12,3-47% (p/p) em derivados catalposideo no extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum e tendo a proporção relativa mista (p/p) entre o peso de cada derivado catalposideo, de 15,0-18,0 (p/p) verprosideo, 2,10-2,60 (p/p) catalposideo, 1 (p/p) picrosideo II, 1,00-1,30 (p/p) isovaniloil catalpol e

2,00-2,30 (p/p) 6-O-veratroil catalpol; de um modo preferencial, 16,0-17,0 (p/p) verprosideo, 2,20-2,50 (p/p) catalposideo, 1 (p/p) picrosideo II, 1,10-1,20 (p/p) isovaniloil catalpol e

2.10- 2,20 (p/p) 6-O-veratroil-catalpol; mais preferencialmente,

16,20-16,99 (p/p) verprosideo, 2,40-2,45 (p/p) catalposideo, 1 (p/p) picrosideo II, 1,10-1,19 (p/p) isovaniloil catalpol e

2.10- 2,19 (p/p) 6-O-veratroil-catalpol.

[024] Mais especificamente, o termo o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) é caracterizado por ser preparado pelo processo de; adicionar pelo menos um solvente de extração selecionado de água, álcool C1-C4 inferior, como metanol, etanol, butanol, etc. ou misturas dos mesmos, preferencialmente, mistura de água e etanol, mais preferencialmente, 30-80 (p/p) etanol em água para Pseudolysimachion rotundum var subintegrum seca na primeira etapa; submeter a pelo menos um método de extração selecionado de extração de refluxo com água quente, extração com água fria, ultrassonicação ou extração convencional preferencialmente extração com água fria seguido de extração de refluxo com água quente a uma temperatura variando de 10 a 100°C, preferencialmente de 20 a 90°C, para o periodo variando de 30

9/63 minutos até 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas, mais preferencialmente, a extração com água fria a uma temperatura variando de 10 a 60°C, preferencialmente de 20 a 50°C, para o periodo variando de 30 minutos a 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas e, em seguida, extração de refluxo com água quente a uma temperatura variando de 40 a 120°C, preferencialmente de 60 a 90°C, para o periodo variando de 30 minutos até 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas, repetidamente, para se obter o primeiro extrato na segunda etapa; suspender o primeiro extrato em cerca de 0,5-10 vezes o volume (v/v), preferencialmente, cerca de 1-5 vezes o volume (v/v) de água para se obter extrato em suspensão na terceira etapa; e adicionar cerca de 0,5-20 vezes o volume (v/v), preferencialmente, cerca de 1-10 vezes o volume (v/v) de butanol, o fracionamento em fase aquosa e a fase de butanol e coletar a camada de butanol para se obter o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) contendo 15-50% (p/p) verprosideo, 0,3-10% (p/p) ácido verátrico, 0,5-10% (p/p) catalposideo, 0,3-10% (p/p) picrosideo II, 0,3-10% (p/p) isovaniloil catalpol e 0,3-10% (p/p) 6-O-veratroil- catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum para tratar e prevenir doenças inflamatórias, alérgicas ou asmáticas.

[025] Por conseguinte, em outra modalidade da presente invenção, a presente invenção também fornece um método para a preparação do extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) isolado de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum que compreende as etapas adicionar pelo menos um solvente de extração selecionado de água, álcool C1-C4 inferior, como metanol, etanol, butanol,

10/63 etc. ou misturas dos mesmos, preferencialmente mistura de água e etanol, mais preferencialmente, 30-80 (p/p) etanol em água a

Pseudolysimachion rotundum var subintegrum seca na primeira etapa; submeter a pelo menos um método de extração selecionado de extração de refluxo com água quente, extração com água fria, ultrassonicação ou extração convencional, preferencialmente a extração com água fria, seguido por extração de refluxo a uma temperatura variando de 10 a 100°C, preferencialmente de 20 a 90°C, para o periodo variando de 30 minutos até 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas, mais preferencialmente, a extração com água fria a uma temperatura variando de 10 a 60°C, preferencialmente de 20 a 50°C, para o periodo que varia de 30 minutos a 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas e, em seguida, extração de refluxo a uma temperatura variando de 40 a 120°C, refluxo de 60 a 90°C, para o periodo variando de 30 minutos até 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas, repetidamente, para se obter o primeiro extrato na segunda

etapa;	suspender	o primeiro extrato em	cerca de	0,	5-10 vezes	o
volume	(v/v) de	um preferencialmente	, cerca	de	1-5 vezes	o
volume	(v/v) de	água para se obter	extrato	em	suspensão	na
terceiro etapa;	e adicionar cerca de	0, 5-20	ve	zes o volume

(v/v), preferencialmente, cerca de 1-10 vezes o volume (v/v) de butanol, fracionando em fase aquosa e fase de butanol e coletar a camada de butanol para se obter o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) contendo 15-50% (p/p) verprosideo, 0,3-10% (p/p) ácido verátrico, 0, 5-10% (p/p) catalposideo, 0,310% (p/p) picrosideo II, 0,3-10% (p/p) isovaniloil catalpol e 0,3-10% (p/p) 6-O-veratroil-catalpol com base no peso de extrato

11/63 total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum para tratar e prevenir doenças inflamatórias, alérgicas ou asmáticas.

[026] Especificamente, o termo o extrato purificado com o fracionamento secundário (ATC2) é caracterizado por conter 3060% (p/p) verprosideo, 0,5-10% (p/p) ácido verátrico, 2-20% (p/p) catalposideo, 1-10% (p/p) picrosideo II, 1-10% (p/p) isovaniloil catalpol e 2-20% (p/p) 6-O-veratroil-catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; preferencialmente, 40-50% (p/p) verprosideo, 1-5% (p/p) ácido verátrico, 3-10% (p/p) catalposideo, 2-5% (p/p) picrosideo II, 2-8% (p/p) isovaniloil catalpol e 3-8% (p/p) 6-O-veratroil-catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; ou caracterizado por conter 36,5-91% (p/p) derivados catalposideo no extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum e tendo uma proporção relativa mista (p/p) entre o peso de cada derivado catalposideo, de 13,0-16,0 (p/p) verprosideo, 2,20-2, 50 catalposideo (p/p), 1 (p/p) picrosideo II, 1, 10-1,40 (p/p) isovaniloil catalpol e 2,00-2,20 (p/p) 6-O-catalpol -veratroil; mais preferencialmente, 14,0-15, 0 (p/p) verprosideo, 2, 30-2,45 (p/p) catalposideo, 1 (p/p) picrosideo II, 1, 20-1,35 (p/ p) isovaniloil catalpol e 2,00-2,10 (p/p) 6-O-catalpol veratroil; mais preferencialmente,14, 50-14,99 (p/p) verprosideo, 2,35-2,43 (p/p) catalposideo,1 (p/p) picrosideo 11,1, 25-1,34 (p/p) isovaniloil catalpol e 2,01-2,09 (p/p) 6-O-catalpol veratroil.

12/63 [027] Mais especificamente, o termo ο extrato purificado com ο fracionamento secundário (ATC2) é caracterizado por ser preparado pelo processo de adicionar pelo menos um solvente de extração selecionado de água, álcool C1-C4 inferior, tal como metanol, etanol, butanol, etc., ou misturas dos mesmos, preferencialmente, mistura de água e etanol, mais preferencialmente, 30-80 (p/p) etanol em água a Pseudolysimachion rotundum var subintegrum seca na primeira etapa; submeter a pelo menos um método de extração selecionado de extração refluxo com água quente, extração com água fria, ultrassonicação ou extração convencional, preferencialmente a extração com água fria, seguida por extração de refluxo a uma temperatura variando de 10 a 100°C, preferencialmente de 20 a 90°C , para o periodo variando de 30 minutos até 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas, mais preferencialmente, a extração com água fria a uma temperatura variando de 10 a 60°C, preferencialmente de 20 a 50°C, para o periodo variando de 30 minutos a 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas e, em seguida, extração de refluxo a uma temperatura variando de 40 a 120°C, preferencialmente de 60 a 90°C, para o periodo variando de 30 minutos até 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas, repetidamente, para se obter o primeiro extrato na segunda etapa; suspender o primeiro extrato em cerca de 0,5-10 vezes o volume (v/v) preferencialmente, cerca de 1-5 vezes o volume (v/v) de água para se obter extrato em suspensão na terceira etapa; adicionar cerca de 0,5-20 vezes o volume (v/v) preferencialmente, cerca de 1-10 vezes o volume (v/v) de butanol, fracionando em fase aquosa e a fase de butanol e

13/63 coletar a camada de butanol para se obter o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) na terceira etapa; e submeter o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) a pelo menos um processo de purificação selecionado do grupo que consiste em cromatografia de partição de fase reversa, cromatografia de partição de fase normal, cromatografia de troca iônica, e cromatografia por exclusão de tamanho, para se obter o extrato purificado com o fracionamento secundário (ATC2) contendo 30-60% (p/p) verprosideo, 0,5-10% (p/p) ácido verátrico, 2-20% (p/p) catalposideo,1-10% (p/p) picrosideo 11,1-10% (p/p) isovaniloil catalpol e 2-20% (p/p) catalpol 6-O-veratroil com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum para tratar e prevenir doença inflamatória, alérgica ou asmática.

[028] Por conseguinte, em outra modalidade da presente invenção, a presente invenção também fornece um método para preparar o extrato purificado com o fracionamento secundário (ATC2) isolado de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum que compreende as etapas de; adicionar pelo menos um solvente de extração selecionado de água, álcool C1-C4 inferior, como metanol, etanol, butanol, etc. misturas dos mesmos preferencialmente, mistura de água e etanol, mais preferencialmente, 30-80 (p/p) etanol em água a Pseudolysimachion rotundum var subintegrum seca na primeira etapa; submeter a pelo menos um método de extração selecionado de extração de refluxo com água quente, extração com água fria, ultrassonicação ou extração convencional, preferencialmente a extração com água fria, seguido por extração de refluxo a uma temperatura variando de 10 a 100°C,

14/63 preferencialmente de 20 a 90°C , para o periodo que varia de 30 minutos até 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas, mais preferencialmente, a extração com água fria a uma temperatura que varia de 10 a 60°C , preferencialmente de 20 a 50°C , para o periodo variando de 30 minutos a 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas e, em seguida, a extração de refluxo a uma temperatura variando de 40 a 120°C , preferencialmente de 60 a 90°C , para o periodo variando de 30 minutos até 72 horas, preferencialmente, 6 a 48 horas, repetidamente, para se obter o primeiro extrato na segunda etapa; suspender o primeiro extrato em cerca de 0,5-10 vezes o volume (v/v) preferencialmente, cerca de 1-5 vezes o volume (v/v) de água para se obter extrato em suspensão na terceira etapa; adicionar cerca de 0,5-20 vezes o volume (v/v) preferencialmente, cerca de 1-10 vezes o volume (v/v) de butanol, fracionando em fase aquosa e a fase de butanol e coletar a camada de butanol para se obter o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) na terceira etapa; e submeter o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) a pelo menos um processo adicional de purificação selecionado do grupo que consiste em cromatografia de partição de fase reversa, cromatografia de partição de fase normal, cromatografia de troca iônica, e cromatografia por exclusão de tamanho, para se obter o extrato purificado com o fracionamento secundário (ATC2) contendo 30-60% (p/p) verprosideo, 0,5-10% (p/p) ácido verátrico, 2-20% (p/p) catalposideo, 1-10% (p/p) picrosideo 11,1-10% (p/p) isovaniloil catalpol e 2-20% (p/p) catalpol 6-0veratroil com base no peso de extrato total (100%) de

15/63

Pseudolysimachion rotundum var subintegrum para tratar e prevenir doença inflamatória, alérgica ou asmática.

[029] Especificamente, o termo processo de purificação adicional é selecionado de (i) cromatografia de partição de fase reversa, (ii) cromatografia de partição de fase normal, (iii) cromatografia de troca iônica ou (iv) cromatografia por exclusão de tamanho, preferencialmente, cromatografia de partição de fase reversa ou qualquer cromatografia usando qualquer resina como uma fase estacionária que pode reter a substância apoiar enquanto elui a substância polar, por exemplo, resina Sephadex como Sephadex, Sephadex LH20, Sephadex G-25, Sephadex G-10, Sepharose, Superdex, resina de acrilato de metila, Carboximetilcelulose, sulfopropil celulose, carboximetil Sephadex, sulfopropil Sephadex, carboximetil Sepharose, sulfopropil Sepharose e semelhantes; resina de polímero reverso usando copolímero estireno divinilbenzeno como polímero X, HP20, polímero de PRP-hl e semelhantes ou resina de suporte metacrilato etc.; silica gel normal como produto de cromatografia de fase ligada (BPC), produto de silica adquiridos de YMC Co. Ltd, produto de silica adquirido de DAISO Co. Ltd, produto de silica adquirido de ASAHI Co. Ltd, produto de silica obtido de COSMOSYL Co. Ltd e semelhantes; produto ODS usado para o enchimento de HPLC como produtos ODS adquiridos de YMC Co. Ltd, produtos ODS adquiridos de DAISO Co. Ltd, produtos ODS adquiridos de ASAHI Co. Ltd, produto ODS adquirido de CHEMCO Co. Ltd, produto ODS adquirido de Merck Co. Ltd produto ODS obtido a partir de COSMOSYL Co. Ltd produtos ODS adquiridos de FUJI Co. Ltd e semelhantes.

16/63 [030] Em uma modalidade preferencial adotando (i) cromatografia de partição de fase reversa como um novo processo de purificação da presente invenção, a fase estacionária em cromatografia de partição de fase reversa acima descrita pode ser qualquer fase estacionária como a substância de fase reversa como fase estacionária que pode reter substância não polar, enquanto elui substância polar, preferencialmente fase estacionária baseada em silica gel, fase estacionária baseada em polímero, tais como poliestireno, etc, e semelhantes, mais preferencialmente os derivados de silica gel como C2, C4, C6, C8, CIO, C12, C14, C16, C18 e semelhantes; ou uma fase estacionária à base de polímero, como PS-2, Oasis HLB e semelhantes, mais e mais preferencialmente, silica gel de fase reversa (C18 (IV) -D), produto ODS-A/ ODS-AQ de YMC Co. Ltd., produto SP-C-ODS de CHEMCO Co. Ltd., produto SP-ODS-RPS de DAISO Co., Ltd., produto 5C18 de COSMOSYL Co. Ltd., produto Chromatorex da FUJI Co. Ltd., e semelhantes.

[031] Em uma modalidade preferencial adotando (i) cromatografia de partição de fase reversa como um novo processo de purificação da presente invenção, a fase móvel na (i) cromatografia de partição de fase reversa descrita acima pode ser, pelo menos, um solvente selecionado de água, acetonitrila, álcool inferior como metanol, etanol, butanol, etc, tetrahidrofurano (THE) ou mistura dos mesmos, preferencialmente, água, álcool inferior como metanol, etanol, butanol, etc, ou mistura dos mesmos, mais preferencialmente, a mistura solvente de água e metanol, mais e mais preferencialmente, a mistura solvente de metanol e água a

17/63 partir de 90:10 (v/ v) a 60:40 (v/ v) para eluir substância polar.

[032] Em uma modalidade preferencial adotar (ii) cromatografia de partição de fase normal como um novo processo de purificação da presente invenção, a fase estacionária na cromatografia de partição em fase normal acima descrita pode ser qualquer fase estacionária como a substância de fase normal como uma fase estacionária que pode reter substância polar enquanto elui substância não polar, preferencialmente, silica gel, Fluorosil, ou fase estacionária à base de alumínio, CN, Diol, ou fase estacionária à base de fração de polímero NH2 e similares, mais preferencialmente, silica gel, Fluorosil, ou fase estacionária à base de alumínio, etc.

[033] Em uma modalidade preferencial adotando (ii) cromatografia de partição de fase normal como um novo processo de purificação da presente invenção, a fase móvel da cromatografia de partição de fase normal (ii) acima descrito pode ser, pelo menos, um solvente selecionado a partir de hexano, heptano, acetato de etila, etanol, éter dietílico, 2-propanol ou uma mistura dos mesmos, preferencialmente, hexano, heptano, acetato de etila ou a mistura dos mesmos para eluir substância não polar.

[034] Em uma modalidade preferencial adotando a cromatografia de troca iônica (iii) como um novo processo de purificação da presente invenção, a fase estacionária em cromatografia de troca iônica acima descrita (iii) pode ser qualquer fase estacionária molecular alta como uma fase estacionária que

18/63 carrega a fração reticulada, preferencialmente, resina de troca catiônica, resina de troca aniônica, ou adsorvente sintético e semelhante, mais preferencialmente, resina de troca catiônica fortemente ácida como AG 50W-x8, Amberlite IR-120,Dowex 60W-x8, SKIB, etc; resina de troca catiônica fracamente ácida como Amberlite IRA-67, Dowex 3-x4A etc.; resina catiônica fortemente básica como DIAION SKIB, DIAION PK216, DIAION CR20, DIAION UBK555 (Mitsubishi Chemical Co.), TRILITE SRC 160H, TRILITE SPC 180 H, TRILITE SPC 400JH (Samyang co. Ltd.), AMBERLITE 200C Na, AMBERLITE CG50, AMBERLITE CR1310 Na, AMBERJET 200H, AMBERLYST 131 WET, ALBERLYST 232 WET (ROHM e HAAS co. Ltd.), Lewatit VP OC 1800, Lewatit VP OC 1812, Lewatit MDS1368 Na, Lewaitit K1221 (Bayer co. Ltd.), PUROLITE PCR833CA, PUROLITE C145 (Purolite Co. Ltd.), MFG210, MEG 250 (Finex Co. Ltd.) etc.; resina de troca aniônica fortemente básica como SAHA, SA20A, SA21A, etc; ou CaptoQ (GE Healthcare co. Ltd.), ou a resina tendo propriedade semelhante à mesma como Toyopearl QEA (Tosoh Co. Ltd.), Q Sepharose FE (GE Healthcare Co. Ltd.), Fractogel EMD, Fractogel TMAE, Fractogel HICAP (Merck KGaA Co. Ltd ou Darmstadt Co. Ltd.); mais e mais, preferencialmente, SA21A; adsorvente como SP207, HP20SS, HP20 etc, mais, preferencialmente, HP 20.

[035] Em uma modalidade preferencial adotando (iv) a cromatografia por exclusão de tamanho como um novo processo de purificação da presente invenção, a fase estacionária em cromatografia por exclusão de tamanho acima descrita (iv) pode ser qualquer fase estacionária tipo gel como fase estacionária que pode separar por tamanho da amostra, preferencialmente, o gel à base de dextrano, como sephadex (por exemplo, sephadex G

19/63

25) gel à base de poliacrilamida, como Sephacryl (por exemplo, Sephacryl-S400), gel com base em agarose ou como Superose ou Sepharose (por exemplo, Sepharose CL-4B) ou combinações das mesmas, como combinação de dextrano Superdex 200 (por exemplo, Sephadex™) , ou em gel de Agarose reticulado (Superose™) e semelhantes, no entanto, não deve ser limitada aos mesmos aqui.

[036] A fase móvel na cromatografia por exclusão de tamanho acima descrita (iv) pode ser uma solução tampão selecionada do grupo que consiste em tampão de acetato de sódio, tampão fosfato de sódio, tampão de acetato de amônio, MES (ácido 2- (Nmorfolino)etanossulfônico), Bis-Tris[2-bis(2-hidroxietil)amino2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol], ADA[N-(2acetamido)iminodiacetato), PIPES [piperaxina-N,N'-Bis(ácido 2etanossulfônico)], BES [N, Ν'-Bis (2-hidroxietil) -2aminoetanossulfônico) , MOPS [ácido 3- (Nmorfolino)propanossulfônico)], TES (ácido N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoetanossulfônico], HEPES [ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico), e semelhantes; preferencialmente, tampão acetato de sódio, tampão fosfato de sódio ou tampão de acetato de amônio.

[037] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a presente invenção também pode executar (v) a cromatografia de permeação em gel ou cromatograf ia de filtração em gel adicionalmente à (i) cromatografia de partição de fase reversa, (ii) cromatografia de partição de fase normal, (iii) cromatografia de troca iônica, (iv) a cromatografia por exclusão

20/63 de tamanho ou a combinação dos mesmos, como um processo adicional de purificação revelado aqui.

[038] A presente invenção também fornece novo extrato purificado, tais como (a) o extrato purificado fracionado com butanol (doravante designado como ATC1) ou (b) o extrato purificado com o fracionamento secundário (doravante designado como ATC2) preparado pelos métodos de preparo acima descritos.

[039] A presente invenção também fornece novo extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, preparado pelos métodos anteriormente descritos de preparo, que contém 12,3-47% (p/p) em derivados catalposideo no extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum em que os referidos derivados catalposideo consistem de 15-50% (p/p) verprosídeo, 0,3-10% (p/p) ácido verátrico, 0,5-10% (p/p) catalposideo, 0,3-10% (p/p) picrosídeo II, 0,3-10% (p/p) isovaniloil catalpol e 0,3-10% (p/p) 6-O-veratroil catalpol, preferencialmente, de 20-25% (p/p) verprosídeo, 0,5-5% (p/p) ácido verátrico,1-5% (p/p) catalposideo, 0,5-5% (p/p) picrosídeo II, 0,5-5% (p/p) isovaniloil catalpol e 1-5% (p/p) 6-O-veratroil-catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.

[040] A presente invenção também fornece novo extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, preparado pelos métodos anteriormente descritos de preparo, que mostra a proporção relativa misto

21/63 (p/p) entre o peso de cada derivado catalposideo 15, 0-18, 0 (p/p) verprosideo, 2,10-2,60 catalposideo (p/p), 1 (p/ p) picrosideo II, 1,00-1,30 (p/p) isovaniloil catalpol e 2,00-2,30 (p/p) 6-O-veratroil-catalpol; preferencialmente, 16,0-17,0 (p/p) verprosideo, 2,20-2,50 (p/p) catalposideo,1 (p/p) picrosideo II,

1.10- 1,20 (p/p) isovaniloil catalpol e 2,10-2,20 (p/p) 6-Overatroil-catalpol; mais preferencialmente, 16,20-16,99 (p/p) verprosideo, 2,40-2,45 (p/p) catalposideo,1 (p/p) picrosideo II,

1.10- 1,19 (p/p) isovaniloil catalpol e 2,10-2,19 (p/p) 6-Overatroil-catalpol .

[041] A presente invenção fornece também novo extrato purificado com o fracionamento secundário (ATC2) do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, preparado pelos métodos de preparo acima descritos, que contém 36,5-91% (p/p) derivados de catalposideo no extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, no qual ditos catalposideo derivados consistem em 30-60%(p/p) verprosideo, 0,5-10%(p/p) ácido verátrico, 2-20 % (p/p) catalposideo, 110% (p/p) picrosideo II, 1-10% (p/p) isovaniloil catalpol e 220%(p/p) 6-O-veratroil catalpol, com base no peso do total (100%) de extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; preferencialmente, 40-50%(p/p) verprosideo, 1-5% (p/p) ácido verátrico, 3-10 % (p/p) catalposideo, 2-5% (p/p) picrosideo II, 28% (p/p) isovaniloil catalpol e 3-8%(p/p) 6-O-veratroil catalpol, com base no peso do total de extrato (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.

[042] A presente invenção também fornece novo extrato purificado com o fracionamento secundário (ATC2) a partir do extrato de

22/63

Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, preparada pelos métodos de preparo acima descritos, que mostram a relação relativa mista (p/p) entre o peso de cada derivado catalposideo, 13,0-16,0 (p/p) verprosideo, 2,20-2,50 (p/p) catalposideo,1 (p/p) picrosideo II, 1,10-1,40 (p/p) isovaniloil catalpol e 2,00-2,20 (p/p) 6-O-veratroil-catalpol; preferencialmente, 14,015,0 (p/p) verprosideo, 2,30-2,45 (p/p) catalposideo, 1 (p/p) picrosideo II, 1,20-1,35 (p/p) isovaniloil catalpol e 2,00-2,10 (p/p) 6-O-veratroil-catalpol; mais preferencialmente, 14,5014,99 (p/p) verprosideo, 2,35-2,43 (p/p) catalposideo, 1 (p/p) picrosideo II, 1,15-1,24 (p/p) isovaniloil catalpol e 2,01-2,09 (p/p) 6-O-veratroil-catalpol.

[043] O termo extrato purificado revelado aqui pode ser utilizado como uma forma seca preparada pelo método da evaporação a vácuo, método por congelamento a seco ou método de secagem por ar quente, etc.

[044] O termo doença inflamatória revelado aqui compreende eczema, dermatite atópica, conjuntivite, doença periodontal, rinite, otite média, laringofaringite, amigdalite, pneumonia, úlcera gástrica, gastrite, doença de Crohn, colite, hemorroidas, gota, espondilite anquilosante, febre reumática, lúpus eritematoso sistêmico, fibromialgia, artrite psoriática, osteoartrite, artrite reumática, periartrite do ombro, tendinite, tenossinovite, peritendinite, miosite, hepatite, cistite, nefrite, sindrome de Sjogren, esclerose múltipla, doença inflamatória crônica, doença inflamatória aguda, etc, entre outros, preferencialmente, eczema, dermatite atópica,

23/63 artrite reumática, doença inflamatória crônica, doença inflamatória aguda, etc.

[045] 0 termo doença alérgica revelado aqui compreende rinite alérgica, dermatite alérgica, dermatite de contato, urticária, alergia a insetos, alergia alimentar, alergia a drogas, conjuntivite alérgica, hipersensibilidade, etc., entre outros, preferencialmente, rinite alérgica, dermatite alérgica, dermatite de contato, urticária, alergia a insetos, alergia alimentar, alergia a drogas, mais preferencialmente, dermatite alérgica, dermatite de contato.

[046] 0 termo doença asmática revelado aqui compreende qualquer asma causada por vários fatores externos, mas que não se destinam a se limitar aos mesmos, como ácaros, pelos ou caspa de animais, baratas, alimentos, drogas, tosse, fumaça de cigarro, poluição do ar, comida aditivo, atividade física, como exercício etc., mudança de tempo, areia amarela, estresse etc.

[047] 0 termo prevenir revelado aqui compreende qualquer ato de inibir ou atrasar a ocorrência de certas doenças ou distúrbios aqui divulgados por meio de administração da composição da invenção; e o termo tratar revelado aqui compreende qualquer ato de aliviar ou alterar favoravelmente o sintoma associado com determinada doença ou distúrbio aqui divulgado por meio de administração da composição da invenção.

[048] Os inventores presentes descobriram que o novo método industrializado para preparar o extrato purificado pode fornecer princípios ativos mais abundantes, ou seja, 36,5% para 91,0%

24/63 (p/p) como extrato de derivados catalpol a partir do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, comparando com o petróleo bruto elaborado pelo método convencional, divulgado na técnica anterior em que o conteúdo de derivados catalpol em 8,49% (p/p) somente através de várias análises HPLC, por exemplo, o extrato purificado da invenção (ATC1) contém 17,60% (p/p) verprosídeo, 0,72% (p/p) ácido verátrico, 2,62% (p/p) catalposideo, 1,08% (p/p) picrosídeo II, 1,26% (p/p) isovaniloil catalpol e 2,36% (p/p) 6-O-veratroil catalpol (Ver exemplo 2) e o extrato purificado da invenção (ATC2) contém 43,83% (p/p) verprosídeo, 1,80% (p/p) ácido verátrico, 7,07% (p/p) catalposideo, 2,93% (p/p) picrosídeo II, 3,85% (p/p) isovaniloil catalpol e 6,15% (p/p) 6-O-veratroil catalpol, enquanto o extrato bruto (CX), preparado pelo método convencional divulgado na técnica anterior contém apenas 5,9% (p/p) verprosídeo, 0,21% (p/p) ácido verátrico, 0,82% (p/p) catalposideo, 0,40% (p/p) picrosídeo II, 0,42% (p/p) isovaniloil catalpol e 0,74% (p/p) 6O-veratroil catalpol, com base no peso do extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; extrato bruto; bem como o extrato da invenção purificado mostrou atividade anti-inflamatória, antialérgica e anti-asma mais potentes do que o preparado pelo método de preparação convencional através de vários testes in vivo como o teste de inibição de reprodução de eosinófilos, a liberação de imunoglobulina quimiocinas inflamatórias no plasma e fluido broncoalveolar de hiperresponsividade das vias aéreas e hiperplasia de célula caliciformes em um modelo de camundongo sensibilizado/desafiado por OVA.

25/63 [049] Por conseguinte, de acordo com outro aspecto da presente invenção, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o extrato purificado contendo princípios ativos abundantes preparados pelos métodos acima descritos a partir de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum como um princípio ativo para o tratamento e prevenção de doença inflamatória, alérgica ou asmática.

[050] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o extrato purificado contendo princípios ativos abundantes preparados pelos métodos acima descritos a partir de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum como um princípio ativo e os veículos farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes, para o tratamento e prevenção de doença inflamatória, alérgica ou asmática.

[051] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecida também uma utilização do extrato purificado contendo princípios ativos abundantes preparados pelos métodos acima descritos a partir de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum para a fabricação de medicamentos utilizados para o tratamento ou prevenção de doença inflamatória, alérgica ou asmática.

[052] 0 termo veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis definido aqui compreende aditivos farmacêuticos, princípios inativos utilizados para preparar uma medicação. Estes incluem corantes, aromatizantes, aglutinantes, emolientes, agentes de enchimento, lubrificantes, conservantes, e muitas mais classificações. Os excipientes comuns incluem amido de

26/63 milho, lactose, talco, estearato de magnésio, sacarose, gelatina, estearato de cálcio, dióxido de silício, goma-laca e esmalte, que são bem conhecidos na técnica (Ver, Home-page da Food and Drug Administration: www.fda.gov ou informação sobre drogas on-line: www.drugs.com) ou literatura prévia (por exemplo, Rowe, Raymond C et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, 7th Edition, 2012) .

[053] De acordo com outro aspecto da presente invenção, fornecese também um método de tratamento ou prevenção de doença inflamatória, alérgica ou asmática em mamíferos, em que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do extrato purificado contendo abundantes princípios ativos preparados pelos métodos anteriormente descritos para Pseudolysimachion rotundum var subintegrum ao mamífero que sofra de doenças inflamatórias, alérgicas ou asmáticas.

[054] A composição da invenção para o tratamento e prevenção de doença inflamatória, alérgica ou asmática pode compreender os extratos acima como 0,1 ~ 99%, preferencialmente, 0,1 ~ 50% em peso com base no peso total da composição.

[055] A composição de acordo com a presente invenção pode ser fornecida como uma composição farmacêutica contendo veículos farmaceuticamente, aceitáveis, adjuvantes ou diluentes, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amidos, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil celulose, polivinilpirrolidona, água, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de

27/63 magnésio e óleo mineral. As formulações podem incluir, adicionalmente, agentes de enchimento, agentes antiaglutinantes, agentes lubrificantes, agentes umectantes, agentes emulsionantes, aromatizantes, conservantes e semelhantes. As composições da invenção podem ser formuladas de modo a fornecer uma liberação rápida, sustentada ou retardada do principio ativo após a sua administração a um paciente através do emprego de qualquer um dos procedimentos bem conhecidos na técnica.

[056] Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser dissolvidas em óleos, propileno glicol ou outros solventes que são comumente utilizados para produzir uma injeção. Os exemplos adequados de veículos incluem solução salina fisiológica, polietileno glicol, etanol, óleos vegetais, miristato de isopropila, etc, entre outros. Para administração tópica, o extrato da presente invenção pode ser formulado sob a forma de pomadas e cremes.

[057] As formulações farmacêuticas contendo a presente composição podem ser preparadas em qualquer forma, como a forma de dosagem oral (em pó, comprimidos, cápsulas, cápsulas moles, medicamento aquoso, xarope, elixires, pílulas, pó, saches, grânulos), ou preparo tópico (creme, unguento, loção, gel, bálsamo, emplastro, pasta, solução spray, aerossol e similares), ou preparo injetável (solução, suspensão, emulsão).

[058] A composição da presente invenção em formas de dosagem farmacêuticas pode ser utilizada sob a forma dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e também pode ser utilizada

28/63 sozinha ou em associação adequada, bem como em combinação com outros compostos farmaceuticamente ativos.

[059] A dose desejável do extrato da invenção varia dependendo da condição e do peso do sujeito, gravidade, forma da droga, via e periodo de administração, e pode ser escolhida pelos especialistas na técnica. No entanto, a fim de obter efeitos desejáveis, é geralmente recomendada a administração na quantidade que varia de 0,0001 a 1000 mg/ kg, preferencialmente, de 0,001 a 100 mg/ kg de peso/ dia do extrato da invenção da presente invenção. A dose pode ser administrada em única dose ou dividida em várias vezes por dia.

[060] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada a um sujeito animal, como mamíferos (ratos, camundongo, animais domésticos ou humano) através de várias vias. Todos os modos de administração são contemplados, por exemplo, a administração pode ser feita por via oral, retal ou por injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intratecal, epidural ou injeção intracerebroventricular.

[061] O extrato da invenção da presente invenção também pode ser usado como um componente principal ou aditivo e agente auxiliar na preparação de vários alimentos de saúde funcionais e alimentos de cuidados de saúde.

[062] Por conseguinte, é outro objeto da presente invenção fornecer um alimento de saúde funcional compreendendo do extrato purificado contendo princípios ativos abundantes preparados

29/63 pelos métodos acima descritos a partir de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum para a prevenção ou alivio de uma doença inflamatória, alérgica ou asmática.

[063] 0 termo um alimento de saúde funcional aqui definido inclui o alimento funcional tendo uma funcionalidade melhorada, tal como a funcionalidade física ou funcionalidade fisiológica por adição de extrato da presente invenção ao alimento convencional para prevenir ou melhorar doenças objetivada no humano ou mamífero.

[064] É outro objeto da presente invenção fornecer um alimento de cuidados de saúde que compreende o extrato purificado contendo princípios ativos abundantes preparados pelos métodos acima descritos a partir de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, em conjunto com um aditivo alimentar aceitável para prevenir ou atenuar uma doença inflamatória, alérgica ou asmática.

[065] 0 termo um alimento de cuidados da saúde definido aqui significa o alimento contendo o extrato da presente invenção, que não mostra efeito específico a que se destina, mas efeito pretendido geral em uma pequena quantidade como uma forma de aditivo ou uma quantidade total em forma de pó, grânulo, cápsula, pílula, comprimido, etc.

[066] 0 termo um aditivo aceitável de modo alimentar definido aqui compreende qualquer substância que se pretenda usar que resulta ou pode ser razoavelmente esperado como resultado, diretamente ou indiretamente, de tornar-se um componente ou

30/63 outra forma que afeta as características de qualquer alimento e pode ser classificado em três grupos de acordo com sua origem, ou seja, (1) aditivos quimicamente sintéticos como cetonas, glicina, citrato de potássio, ácido nicotínico, etc.; (2) aditivo natural como corante de caqui, extrato de alcaçuz, celulose microcristalina, goma guar, etc.; (3) o aditivo misturado como L-glutamato de sódio, conservantes, corantes de alcatrão etc ou várias categorias de acordo com sua função no alimento, por exemplo, agente espessante, agente de maturação, agente branqueador, sequestrante, agente umectante, antiespumante, agente clarificante, agente de cura, emulsificante, estabilizante, espessante, bases e ácidos, agentes espumantes, nutrientes, corantes, agente aromatizante, adoçante, agente conservante, antioxidante, etc., que é bem conhecido na técnica ou literatura anterior (ver Codex General Standard for Food Additives (GSFA, Codex STAN 192-1995) (GSFA, Codex STAN 192-1995) na Home-page do GSFA online: www.codexalimentarius. net/gsfaonline/index.html) .

[067] Se uma substância é adicionada a um alimento para um propósito específico naquele alimento, este é referido como um aditivo direto e aditivos alimentares indiretos são aqueles que se tornam parte dos alimentos em quantidades vestigiais, devido à sua embalagem, armazenamento, ou outras manipulações.

[068] 0 termo alimentos para cuidado da saúde ou alimentos funcionais de saúde revelado aqui pode estar contido em alimento, bebida de saúde, suplementos dietéticos etc., e podem ser formulados em uma forma de dosagem farmacêutica como um pó,

31/63 grânulo, comprimido, suspensão, emulsão, xarope, comprimido mastigável, cápsula, bebidas etc.; ou em forma de alimento, por exemplo, pão, bolo de arroz, frutas secas, doces, chocolate, goma de mascar, sorvete, leite, como leite desnatado, leite lactose-hidrolisado, leite de cabra, leite processado, produtos lácteos como leite fermentado, manteiga, leite concentrado, creme de leite, óleo de manteiga, queijo natural, queijo processado, leite seco, soro de leite, etc, produtos de carne processada, como hambúrguer, presunto, salsicha, bacon, etc., produtos de ovo processados, produto de peixe como o bolo de peixe, etc, produtos de massa como macarrão instantâneo, macarrão seco, macarrão fresco, macarrão frito, macarrão não frito, macarrão seco gelatinizado, macarrão cozido, macarrão,

congelado,	massas etc,	produto de	chá	como o	saco de	chá, chá
lixiviado	etc, bebidas	saudáveis,	como	sucos	de fruta,	bebidas
vegetais,	refrigerantes	, bebidas	de	leite	de soja,	bebidas

mistas de bebidas lácteas, etc, tempero de alimentos como molho de soja, pasta de soja, pasta de pimentão vermelho, chunjang (um tipo de produto de soja fermentada colorido por caramelo), cheonggukjang (soja natural fermentada por B. subtillis), massa mista, vinagre, molho, ketchup, curry, molhos etc, margarina, gordura, pizza etc, entre outros, para prevenir ou melhorar a doença em objetivada.

[069] Al ém disso, o extrato acima descrito pode ser adicionado a um alimento ou bebida para a prevenção e melhoria do distúrbio objetivado. A quantidade de extrato acima descrita no alimento ou bebida como um alimento saudável ou alimento funcional para cuidados da saúde em geral, pode variar de cerca de 0,01 a 100

32/63 p/p% do peso total de alimentos para a composição alimentar funcional de saúde. Em particular, embora a quantidade preferencial do extrato da presente invenção no alimento funcional de saúde, alimentos para cuidados da saúde ou alimento com nutriente especial pode ser variada de acordo com o objetivo pretendido de cada alimento, esta é preferencialmente utilizada em geral para se usar como um aditivo na quantidade do extrato da presente invenção variando de cerca de 0,01 a 5% em alimentos, como massas e semelhantes, de 40 a 100% em alimentos saudáveis na proporção de 100% da composição alimentar.

[070] Prevendo que a composição da bebida saudável da presente invenção contém extrato ou composto acima descrito como um componente essencial na proporção indicada, não há nenhuma limitação particular sobre o outro componente liquido, em que o outro componente pode ser uma variedade de carboidratos naturais ou desodorizantes, etc., como bebida convencional. Exemplos de carboidratos naturais acima mencionados são monossacarideos como glicose, frutose, etc; dissacarideos tais como a maltose, sacarose, etc; açúcar convencional, tal como dextrina, ciclodextrina; e açúcar de álcool como xilitol, e eritritol, etc. Como outro desodorizante dos que os acima mencionados, desodorizante natural tal como taumatina, extrato de Stevia como levaudiosideo A, glicirrizina et al, e desodorizante sintético, como a sacarina, aspartame et al, pode ser útil favoravelmente. A quantidade de carboidratos naturais acima descritos é geralmente na faixa de cerca de 1 a 20 g, preferencialmente 5 a 12 g, na proporção de 100 ml da presente composição de bebida.

33/63 [071] Os outros componentes da composição acima mencionada são vários nutrientes, uma vitamina, um mineral ou um eletrólito, agente sintético aromatizante, um agente corante e agente de melhoria no caso de queijo, chocolate etc., ácido péctico e o sal do mesmo, ácido alginico e o sal do mesmo, ácido orgânico, adesivo coloidal de proteção, agente de controle do pH, estabilizante, um conservante, glicerina, álcool, agente de carbonização utilizado em bebidas gasosas. 0 outro componente além dos acima mencionados pode ser suco de fruta para a preparação de suco natural de fruta, bebida de suco de frutas e bebida vegetal, em que o componente pode ser utilizado independentemente ou em combinação. A proporção dos componentes não é tão importante, mas é geralmente na faixa de cerca de 0 a 20 p/p % por 100 p/p % da presente composição. Exemplos de alimentos comestíveis compreendendo extrato ou composto acima mencionado são vários alimentos, bebidas, gomas, complexo de vitaminas, alimentos para melhora da saúde e similares.

[072] Extrato da invenção da presente invenção não tem nenhuma toxicidade e efeitos adversos, por conseguinte; podem ser utilizados com segurança.

[073] Será evidente para os especialistas na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nas composições, uso e preparações da presente invenção sem nos afastarmos do espírito ou escopo da invenção.

[074] A presente invenção é explicada mais especificamente pelos exemplos seguintes. No entanto, deve ser entendido que a

34/63 presente invenção não é limitada a estes exemplos de forma alguma.

[075] Como descrito na presente invenção, novo método da invenção industrializado para preparar extrato purificado contendo princípios ativos mais abundantes, como derivados catalpol do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum e o extrato purificado mostraram atividade antiinf lamatória, antialérgica e antiasmática mais potente do que o preparado pelo método de preparo convencional revelado na técnica anterior por meio de vários testes in vivo como o Teste de inibição sobre a reprodução de eosinófilos, a liberação de imunoglobulinas e quimiocinas inflamatórias no plasma e fluido broncoalveolar, bem como a supressão da hiperreatividade das vias aéreas e hiperplasia de células caliciformes em um modelo de camundongo sensibilizado/desafiado por OVA. Portanto, ele pode ser usado como terapêutica ou alimento funcional de saúde para tratar e prevenir doença inflamatória, alérgica ou asmática.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [076] Os objetivos acima referidos e outros, características e outras vantagens da presente invenção serão mais claramente compreendidos a partir da seguinte descrição detalhada tomada em conjunto com os desenhos anexos, em que;

[077] A Fig. 1 mostra a análise por HPLC do extrato bruto de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum preparado no Exemplo comparativo 1;

35/63 [078] A Fig. 2 mostra a análise por HPLC do extrato purificado da invenção (ATC1) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum preparado no Exemplo 1;

[079] A Fig. 3 mostra a análise por HPLC do extrato purificado da invenção (ATC2) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum preparado no Exemplo 2;

[080] A Fig. 4 mostra o efeito supressor do extrato purificado da invenção em hiperresponsividade de vias aéreas em um modelo de camundongo desafiado/sensibilizado por OVA;

[081] A Fig. 5 mostra o efeito inibidor do extrato purificado da invenção sobre o recrutamento de células inflamatórias no fluido de lavagem broncoalveolar;

[082] A Fig. 6 mostra o efeito inibidor do extrato purificado da invenção sobre a liberação de imunoglobulinas (IgE total) no soro sanguíneo;

[083] A Fig. 7 mostra o efeito inibidor do extrato purificado da invenção sobre a liberação de IgE OVA específica no soro sanguíneo;

[084] A Fig. 8 representa o efeito inibidor do extrato purificado da invenção sobre a liberação de IL-lbeta;

[085] A Fig. 9 apresenta o efeito inibidor do extrato purificado da invenção sobre a liberação de quimiocinas inflamatórias;

36/63 [086] A Fig. 10 representa o efeito inibidor do extrato purificado da invenção sobre o recrutamento de células inflamatórias no tecido pulmonar de células utilizando exame histológico da lavagem broncoalveolar;

[087] A Fig. 11 representa o efeito inibidor do extrato purificado da invenção na secreção de muco em células de tecido pulmonar utilizando exame histológico da lavagem broncoalveolar.

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO [088] Será evidente para os especialistas na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nas composições, utilização e preparações da presente invenção sem se desviar do espirito ou escopo da invenção.

[089] A presente invenção é explicada mais especificamente pelos exemplos seguintes. No entanto, deve ser entendido que a presente invenção não é limitada a estes exemplos de qualquer modo.

EXEMPLOS [090] Os seguintes Exemplos de Referência, Exemplos e Exemplos Experimentais destinam-se a ilustrar adicionalmente a presente invenção sem limitar o seu escopo.

Exemplo Comparativo 1. Preparo do extrato bruto de PseudolYsimachion rotundum var subintegrum

1-1. Preparo do extrato bruto (ATE)

37/63 [091] 1kg de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum seca (cultivada em 244, Soi-myeon Eumseong-gun Chungcheongbuk-do na Coréia de acordo com GAP) cortada em pequenos pedaços e misturada com 10 L de etanol a 40%. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas e extraída com extração sob refluxo a 78°C durante 12 horas para coletar o filtrado, três vezes. O extrato foi filtrado com papel de filtro para remover os debris. O filtrado coletado foi concentrado em um evaporador rotatório (EYELA, N-2100, Japão) a 55 65°C sob pressão reduzida e seco com liofilização para gerar 202 g de extrato bruto seco (designado como ACE a seguir) para ser utilizado como um exemplo comparativo.

1-2. Preparo de extrato em bruto (ATM) [092] 1,1 kg de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum seca (Cultivada em 244, Soi-myeon Eumseong-gun Chungcheongbuk-do na Coréia de acordo com GAP) cortada em pequenos pedaços e misturada com 5 L de metanol. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas e extraída com extração sob refluxo a 78°C durante 12 horas para coletar o filtrado, três vezes. O extrato foi filtrado com papel de filtro para remover os debris. O filtrado coletado foi concentrado em um evaporador rotatório (EYELA, N-2100, Japão) a 55 65°C sob pressão reduzida e seco com liofilização para se obter 100,5g de extrato bruto seco (designado como ACM a seguir) para ser utilizado como um exemplo comparativo.

1-3. Análise de componentes

38/63 [093] A análise de componentes foi realizada usando HPLC (Agilent modelo 1260, EUA) de acordo com a condição na Tabela 1 e o resultado foi apresentado na Fig. 1.

[094] Como pode parecer na Fig. 1, foi confirmado que cada principio foi detectado em 9,548 min (Verprosideo), 10,817 minutos (ácido verátrico), 16,728 minutos (Catalposideo), 20,346 minutos (Picrosideo II), 21,853 minutos (Isovaniloil catalpol) e

30,462 minutos (6-O-veratrolil-catalpol) respectivamente.

[095] O teor de cada ingrediente (%) da amostra foi calculado com base no padrão de HPLC (tempo de retenção) de acordo com fórmula matemática 1.

[Fórmula matemática 1] [096] Teor de cada ingrediente = conc. de padrão (mg/ml)/concentração da amostra de teste (mg/mL) x At/As x pureza de padrão (%).

[097] Em que At indica a área de principio na amostra de teste e As indica que no padrão fornecido o volume de amostra da amostra de teste e padrão são idênticos uns aos outros.

[Tabela 1] Condições de HPLC

Condições de HPLC
Bomba	Agilent Seriesl260, 1260 bomba quaternária
Sensor	Agilent Seriesl260, 1260 DAD
Coluna	Agilent Eclipse XOB C18,4,6 x 50cm, 5pm
Vazão	1,5 ml/min
Absorbância em UV	2 66nm

39/63

Fase móvel	Fase móvel A: tampão fosfato (pH = 3, 5) Fase móvel B: metanol
Hora	Fase móvel A (%)	Fase móvel B(%)
0 ~ 5	80	20
5 ~ 20	75	25
20 ~ 25	75	25
25 ~ 30	55	45
30 ~ 35	55	45
35 ~ 36	80	20
36 ~ 40	80	20
Volume de injeção	10 μΐ

[098] No resultado, foi confirmado que o extrato bruto de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum contém apenas 8,49% (p/p) derivados catalposideo, ou seja, 5,9% (p/p) verprosideo, 0,21% (p/p) ácido verátrico, 0,82% (p/p) catalposideo, 0,40% (p/p) picrosideo II, 0,42% (p/p) isovanilil catalpol, e 0,74% (p/p) 6-0-veratroil catalpol, respectivamente, como pode ser visto na Tabela 2.

[Tabela 2] Resultado HPLC (extrato bruto:ACE)

Princípio ativo	Exemplo Comparativo 1
Tempo de retenção (min)	Conteúdo (p/p%)
Verprosideo	9, 548	5,90
Ácido Verátrico	10,817	0,21
Catalposideo	16,728	0,82
Picrosideo II	20,346	0,40
Insovaniloil catalpol	21, 853	0,42
6-O-veratroil-catalpol	30,462	0,74
Total		8,49

40/63

Exemplo 1. Preparo do extrato purificado (ATC1) de

Pseudolysimachion rotundum var subintegrum [099] 0 extrato bruto (ACE) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum preparado pelo método convencional de acordo com o Exemplo comparativo 1, foi suspenso em 2 L de água destilada e a suspensão foi adicionada com 2 L de butanol para fracionar em fração solúvel em butanol e fração solúvel aquosa. A fração solúvel em butanol foi coletada, concentrada sob pressão reduzida e secada para se obter 82 g do extrato purificado da invenção fracionado com butanol (ATC1) usado como um exemplo de teste.

[0100] A análise do componente foi realizada usando HPLC (Agilent modelo 1260, EUA) de acordo com a condição na Tabela 1 e o resultado foi mostrado na Fig. 2.

[0101] Como pode parecer na Fig. 2, foi confirmado que cada principio foi detectado em 9,545 min (Verprosideo), 10,821 minutos (ácido verátrico), 16,727 minutos (Catalposideo), 20,345 minutos (Picrosideo II), 21,853 minutos (Isovaniloil catalpol) e

30,462 min (6-0- veratroil catalpol) respectivamente.

[0102] 0 teor de cada ingrediente (%) na amostra foi calculado com base no padrão de HPLC (tempo de retenção) de acordo com fórmulas matemáticas 1.

[0103] No resultado, foi confirmado que o extrato purificado da invenção fracionado com butanol (ATC1) de Pseudolysimachion

41/63 rotundum var subintegrum contém 25,64% (p/p) derivados catalposideo, ou seja, 17,60% (p/p) verprosideo, 0,72% (p/p) ácido verátrico, 2,62% (p/p) catalposideo, 1,08% (p/p) picrosideo II, 1,26% (p/p) isovanilil catalpol, e 2,36% (p/p) 6O-veratroil catalpol, respectivamente, como pode ser visto na

Tabela 3.

[Tabela 3] Resultado de HPLC (extrato purificado: ATC1)

Princípio ativo	Exemplo 1
Tempo de retenção (min)	Conteúdo (p/p%)
Verprosideo	9,545	17,60
Ácido Verátrico	10,821	0,72
Catalposideo	16,727	2,62
Picrosideo II	20,345	1,08
Insovaniloil catalpol	21,853	1,26
6- 0--veratroil catalpol	30,462	2,36
Total		25,64

Exemplo 2. Preparo do extrato purificado (ATC2) de

PseudolYsimachion rotundum var subintegrum [0104] 0 extrato purificado da invenção fracionado com butanol (ATC1) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum de acordo com o Exemplo 1, foi dissolvido em 75 mL de mistura de solventes (água destilada: metanol = 1: 0, 003) e 75 g da solução foi carregado em uma coluna de cromatografia de fase reversa (C18 (IV) -D-75-120nm, AGC Si-Tech Co. Ltd., Japão, 450 g) eluindo a suspensão utilizando solvente de eluição (água destilada: metanol = 90: 10 60:40) . 8,4L da solução eluída correndo no sistema solvente de eluição inicial (água destilada: metanol =

42/63

90: 10) foi coletada e concentrada sob pressão reduzida. 5,6 L da solução eluída correndo no sistema solvente de eluição tardia (água destilada: metanol = 60:40) foi coletada, concentrada sob pressão reduzida e seca para se obter 33 g do extrato purificado da invenção com o fracionamento secundário (ATC2) usado como um exemplo de teste.

[0105] A análise do componente foi realizada usando HPLC (Agilent modelol260, EUA) de acordo com a condição na Tabela 1 e o resultado foi mostrado na Fig. 3.

[0106] Como pode ser observado na Fig. 3, foi confirmado que cada ingrediente foi detectado em 9,525 min (Verprosideo), 10,818 minutos (ácido verátrico), 16,721 minutos (Catalposideo) , 20,346 minutos (Picrosideo II), 21,857 minutos (Isovaniloil catalpol) e

30,462 min (6-0 -veratroil catalpol) respectivamente.

[0107] 0 teor de cada ingrediente (%) na amostra foi calculado com base no padrão de HPLC (tempo de retenção) de acordo com fórmula matemática 1.

[0108] No resultado, foi confirmado que o extrato purificado da invenção com o fracionamento secundário (ATC2) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum contém 65,63% (p/p) derivados catalposideo, ou seja, 43,83% (p/p) verprosideo, 1,80% (p/p) ácido verátrico, 7,07% (p/p) catalposideo, 2,93% (p/p) picrosideo II, 3,85% (p/p) isovanilil catalpol, e 6,15% (p/p) 6O-veratroil-catalpol, respectivamente, como pode ser visto na Tabela 4.

43/63 [Tabela 4] Resultado do HPLC (extrato purificado: ATC2)

Princípio ativo	Exemplo 2
Tempo de retenção (min)	Conteúdo (p/p%)
Verprosídeo	9,524	43,83
Ácido Verátrico	10,818	1,80
Catalposídeo	16,721	7,07
Picrosídeo II	20,346	2,93
Insovaniloil catalpol	21,857	3,85
6- 0 -veratroil catalpol	30,462	6, 15
Total		65,63

Exemplo Experimental 1. Determinação preliminar do nível sérico de IgE total em modelo de camundongo desafiado/sensibilizado com OVA [0109] Para encontrar o extrato purificado mostrando atividade farmacologicamente mais potente do que o extrato bruto preparado no exemplo comparativo, o seguinte teste preliminar foi realizado pelo método revelado na literatura (Elias, JA et al., J. Clin. Invest.,111, pp297-297, 2003).

1-1. Sensibilização do animal e desafio das vias aéreas [0110] Camundongos fêmeas BALB/c específicos isentos de agentes patogênicos (cerca de 20g) , com idade de 6 semanas, que foram rotineiramente triados sorologicamente para patógenos respiratórios relevantes, foram adquiridos de ORIENT Co. (Seul, Coréia) e aclimatados ao ambiente experimental por 1 semana.

44/63 [0111] Re sumidamente, os camundongos foram sensibilizados por injeção intraperitoneal de 20yg de OVA (Ovalbumina; A5503, Sigma, St. Louis, MO), o qual foi emulsionado em 2 mg de hidróxido de alumínio em 200 pL de tampão PBS (pH 7,4), a cada duas semanas. Os camundongos foram desafiados através das vias aéreas com OVA (1% em PBS) durante 30 min, utilizando um nebulizador ultrassônico (NE-U12; Omron Corp, Tóquio, Japão) a partir do 28° dia ao 34° dia após a sensibilização inicial. 24 horas após o tratamento com o antígeno, a hiperresponsividade das vias aéreas foi determinada e os camundongos foram sacrificados 48 horas após o último desafio. Os camundongos foram sacrificados com uma overdose de pentobarbital (Entobal®, Hanrim Pharm. Co. Ltd.) 24 h após o último desafio, e foi realizada uma traqueostomia. Depois 1,2 ml de solução salina fisiológica (PBS) foi instilada nos pulmões, fluido de lavagem broncoalveolar (LBA) foi obtido por aspiração três vezes (1,5 ml total) através de canulação da traqueia.

[0112] Os grupos foram divididos em vários grupos, ou seja, (a) grupo de controle normal (NC): os grupos tratados ou não tratados com OVA; (b) grupo induzido por asma (OVA) : os grupos tratados com OVA para induzir asma; e (c) grupo comparativo: os grupos tratados com grupo de controle positivo (M30, montelucaste; 30 mg/kg, PO, Sigma-Aldrich Co. Ltd., SML-0101) Ihr antes da inalação de OVA.

[0113] Os grupos de teste consistem em 6 camundongos para cada grupo e 1 hora antes da inalação de OVA, várias concentrações da

45/63 amostra de teste,

ATC1 (30mg/kg e 100 mg/kg) e ATM (30 e 100 mg/kg) foram administrados oralmente aos camundongos.

[0114] Como mostrado na Tabela 5, o nivel total de IgE no soro sanguíneo no grupo induzido por asma (OVA) foi significativamente aumentado enquanto aqueles no grupo de amostra de teste administrado por via oral com várias concentrações de amostras de teste (ATC1,3O mg/kg e 100 mg/kg) foram mais reduzidos do que no grupo tratado com o extrato bruto de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum (ATM,30 e 100 mg/kg). (Ver Tabela 5) [Tabela 5] O nivel de IgE total no soro sanguíneo

	IgE total (mg/ml)
NC	0,57 ± 0,02
OVA	5, 23 ± 0,34
ATC1	30 mg/kg	2,05 ± 0,12
100 mg/kg	2,14 ± 0,25
ATM	30 mg/kg	3,09 ± 0,54
100 mg/kg	2,49 ± 0,35
Monte30	1,82 ± 0,40

Exemplo Experimental 2. Efeito antiasmático usando o teste de hiperresponsividade brônquica em um modelo de camundongo/sensibilizado/desafiado com OVA.

[0115] A fim de confirmar o efeito antiasmático de amostras de teste preparadas nos Exemplos usando o teste de hiperresponsividade das vias áreas em um modelo de camundongo sensibilizado/desafiado por OVA, o seguinte teste foi realizado

46/63 pelo método revelado na literatura (Elias, JA et al., J. Clin.

Invest. ,111, pp297-297, 2003).

1-1. Sensibilização do Animal e desafio das vias aéreas [0116] Camundongos fêmeas BALB/c específicos isentos de agentes patogênicos (cerca de 20g) , com idade de 6 semanas, que foram rotineiramente triados sorologicamente para patógenos respiratórios relevantes, foram adquiridos de ORIENT Co. (Seul, Coréia) e aclimatados ao ambiente experimental por 1 semana.

[0117] Resumidamente, os camundongos foram sensibilizados por injeção intraperitoneal de 20pg de OVA (Ovalbumina; A5503, Sigma, St. Louis, MO), o qual foi emulsionado em 2 mg de hidróxido de alumínio em 200 pL de tampão PBS (pH 7,4), a cada duas semanas. Os camundongos foram desafiados através das vias aéreas com OVA (1% em PBS) durante 30 min, utilizando um nebulizador ultrassônico (NE-U12; Omron Corp, Tóquio, Japão) a partir do 28° dia ao 34° dia após a sensibilização inicial. 24 horas após o tratamento com o antígeno, a hiperresponsividade das vias aéreas foi determinada e os camundongos foram sacrificados 48 horas após o último desafio. Os camundongos foram sacrificados com uma overdose de pentobarbital (Entobal®, Hanrim Pharm. Co. Ltd.) 24 h após o último desafio, e foi realizada uma traqueotomia. Depois 1,2 ml de solução salina fisiológica (PBS) foi instilada nos pulmões, fluido de lavagem broncoalveolar (LBA) foi obtido por aspiração três vezes (1, 5 ml total) através de canulação da traqueia.

47/63 [0118] Grupos de camundongos (η = 6) foram estudados; eles receberam o seguinte tratamento: (1) 0 grupo do não tratamento com OVA como um grupo de controle normal (NC) ; (2) 0 grupo de controle tratado e inalado com OVA como um grupo induzido para asma (OVA); (3) 0 grupo controle positivo tratado com terapêutica de asma conhecida (montelucaste; 30mg/kg, PO, SigmaAldrich Coréia, SML-0101, M30) 1 hora antes da inalação de OVA;

(4) 0 grupo de amostra de teste administrado por via oral com várias concentrações de amostras de teste, isto é, 5 mg/kg,10 mg/kg, 25 mg/kg e 50 mg/kg de extrato purificado (ATC2) 1 hora antes da inalação de OVA.

1-2. Avaliação da hiperresponsividade das vias aéreas [0119] A f im de avaliar a hiperresponsividade das vias aéreas dos camundongos, a resistência das vias aéreas foi determinada utilizando aparelho (Uma câmara de pletismografia de corpo inteiro, OCP3000, All Medicus, Seul, Coréia) e o valor determinado foi estatisticamente calculado pelo valor Pehn (Enhance Pause) refletindo no grau de obstrução das vias aéreas. O valor Penh foi determinado durante 3 minutos pelo processo de determinação do valor basal na fase eupneica e a determinação do valor Penh após a inalação de PBS com nebulizador ultrassônico (NE-U12, IMRON Corp., Tóquio, Japão) durante 3 minutos.

[0120] Em seguida, várias concentrações de metacolina (A2251, Sigma, St. Louis, MO), 12,25 e 50 mg/ml, foram inaladas com o aumento da concentração para determinar os valores Pehn. O aumento do valor Penh foi expresso como percentagem (%) após a

48/63 inalação de metacolina e o valor Penh de linha basal foi definido como 100%. O valor de Pehn foi calculado de acordo com fórmula matemática 2 e o resultado foi mostrado na Fig. 4.

[Fórmula Matemática 2]

Pehn = (Te/RT-1) x PEF/PIF

Te: Tempo de expiração (O período de uma inalação até a próxima inalação);

RT: Tempo de relaxamento (O período em que o volume expirado é alcançado, a uma extensão de 30% de um volume de expiração durante a expiração)

PEF: Fluxo de pico de Expiração

PIE: Fluxo de pico de Inspiração [0121] No resultado, foi confirmado que o valor Penh no grupo de controle tratado e inalado com OVA como um grupo induzida para asma (OVA) foi aumentado acentuadamente, enquanto que no grupo sem tratamento com OVA como um grupo de controle normal (NC) foi aumentado gradualmente com o aumento da concentração de metanocolina.

[0122] Por algum tempo, o valor Penh no grupo de controle positivo tratado com montelucaste (MO), bem como o grupo de amostra de teste administrado por via oral com várias concentrações de amostras de teste (ATC-10, ATC-25, e ATC-50) foram significativamente reduzidos independentemente da concentração de metanocolina. (Ver Tabela 6)

49/63 [Tabela 6] Valor Penh

Metacolina (Cone. mg/L)	0	12,5	25	50
NC	0,3710,03	0,39 1 0,04	0,69 1 0,14	1, 07 1 0,18
OVA	0,8510,10	2, 79 1 0,25	5,99 1 0,92	7, 24 1 0,74
ATC2 (mg/kg)	5	0,52 1 0,05	1, 69 1 0,27	2,68 1 0,52	5,19 1 0,74
10	0,63 1 0,06	1, 54 1 0,18	2,01 1 0,52	3,08 1 0,40
25	0,64 1 0,08	1,311 0,17	1, 64 1 0,31	2,43 1 0,33
50	0,51 1 0,06	1, 02 1 0,17	1,36 1 0,09/	1, 82 1 0,28
M3 0	0,4910,04	1, 54 1 0,20	1,98 1 0,37	2,51 1 0,36

[0123] Foi confirmado que as alterações em valor Penh foram proeminentes no caso de uma maior dose de metacolina no grupo de tratamento, em vez do grupo de tratamento de metacolina em dose inferior e o valor Penh na amostra de teste para a mesma concentração de metacolina, foi notavelmente diminuído em uma forma dependente da dose.

[0124] Consequentemente, foi confirmado que o extrato purificado da invenção eficazmente suprimiu a hiperresponsividade das vias respiratórias e, por conseguinte, são úteis para tratar ou prevenir a doença asmática, uma doença alérgica nas vias respiratórias.

Exemplo Experimental 3. Efeito sobre o nível de células inflamatórias e de eosinófilos no LBA

50/63 [0125] A f im de confirmar o efeito de inibição de amostras de teste preparadas nos Exemplos no nivel de células inflamatórias e de eosinófilos no fluido broncoalveolar (BALE), na sequência o teste foi realizado pelo método revelado na literatura (M. Chen et al., Immunolgy, pp376-384, 2011).

[0126] O fluido de lavagem broncoalveolar (BALE), preparado no Exemplo Experimental 1 foi recuperado para determinar o nivel de células inflamatórias.

[0127] O número total de células inflamatórias foi avaliado por contagem das células em, pelo menos, cinco quadrados de um hemocitômetro após a exclusão de células mortas por coloração com azul de tripan (Daigle I. et al. , Swiss Med Wkly, 131, pp

231-7, 2001) . 100 μΐ de BALE foram carregados em uma lâmina e centrifugados (200 χ g, 4°C, lOmin) para fixar as células na lâmina usando uma máquina CellSpin (Cytol2,5+clip5, Hanil Science Industrial, Coréia). As células foram coradas por reagentes de coloração Diff-Quick ™ (Sysmex, Cat No. 38721, Suiça) de acordo com as instruções do fabricante. A significância estatística foi determinada por teste de Student de duas caudas por meios independentes e o nível crítico para significância foi estabelecido em P<0,05.

[0128] Como mostrado na Fig. 5, o número total de eosinófilos e células inflamatórias no grupo de controle tratado e inalado com OVA como um grupo de asma induzida (OVA) foi significativamente aumentado em comparação com os do grupo sem tratamento com OVA como um grupo de controle normal (NC).

51/63 [0129] O número total de eosinófilos e células inflamatórias no grupo de controle positivo tratados com montelucaste (MO), bem como o grupo de amostra de teste administrado por via oral com várias concentrações de amostras de teste (ATC-5, ATC-10, ATC25, e ATC- 50) foram significativamente reduzidos (Ver Tabela 7) .

[Tabela 7] Número total de eosinófilos e células inflamatórias em BALF

Número de células inflamatórias (103 células/camundongo)	Número de eosinófilos	Número de células inflamatórias
NC	0,00±0,00	8,2811,46
OVA	135,4414,54	260,48110,39
ATC2 (mg/kg)	5	72,2319,45	158, 2 1 15,38
10	55,4013,46	131, 67 1 9, 03
25	40,812,34	98, 614, 57
50	36,5714,02	88,1 1 7, 04
M3 0	52,0314,06	106,6716,48

Exemplo Experimental 4. Efeito em nível de IgE e de IgE especifica de OVA no soro sanguíneo [0130] A fim de confirmar o efeito de inibição de amostras de teste preparadas nos Exemplos no nível de IgE e IgE específica de OVA no soro sanguíneo, o seguinte teste foi realizado pelo método revelado na literatura (Kay, A.B., The New England Journal of Medicine, 344, pp30-37, 2001).

52/63 [0131] O soro sanguíneo e fluido de lavagem broncoalveolar (BALE), preparados no Exemplo Experimental 1 foram recuperados para determinar o nível de IgE e IgE específica para OVA em soro sanguíneo.

[0132] 0 soro sanguíneo e fluido de lavagem broncoalveolar (BALE) foram adicionados a placas de 96 poços (placa de ELISA) e revestidos com 0,1 M solução tampão de NaHCOs (pH 8,3) contendo 20 pg/ml de OVA (Sigma, MO, EUA) a 4°C durante a noite. Após inibir a reação não específica utilizando PBS contendo 1% de albumina de soro bovino, o soro para teste foi diluído a 1: 400 e reagido em conjunto por 2 horas em temperatura ambiente. Após a lavagem, o soro diluído reagiu com anticorpo monoclonal antiIgE de camundongo diluído (x300) (MCA419, Serotec, Oxford, Reino Unido) durante 2 horas e policlonal A de cabra anti-IgG de rato conjugado com HRP diluído (x4000) (STAR110P, Serotec, UK) durante 1 hora em temperatura ambiente. Depois da lavagem, a solução foi corada com substrato de 3,3',5,5'tetrametilbenzidina (52-00-02, KPL) e a reação foi interrompida por 2 N H2SO4 para determinar a absorção usando espectroscopia (Versamax, Molecular Devices, US) a 450 nm.

[0133] Como mostrado nas Fig. 6 e Fig. 7, o nível de IgE e IgE específica para OVA no soro sanguíneo no grupo de controle tratado e inalado com OVA como um grupo induzido para asma (OVA) foi significativamente aumentado enquanto que aqueles do grupo de controle positivo tratados com montelucaste (MO), bem como o grupo de amostra de teste administrado por via oral com várias

53/63 concentrações de amostras de teste (ATC-5, ATC-10, ATC-25, e

ATC-50) foram significativamente reduzidos [Tabela 8] O nível de IgE e IgE especifica para OVA e no soro sanguíneo

Concentração (pg/ml)	nível de IgE no soro	nível de IgE específica de OVA
NC	0,92 ± 0,17	0,05 ± 0,00
OVA	7, 68 ± 0,42	0,17 ± 0,02
ATC2 (mg/kg)	5	6,51 ± 0,72	0,13 ± 0,01
10	4,97 ± 0,91	0,10 ± 0,01
25	4, 56 ± 0,73	0,09 ± 0,02
50	4,01 ± 0,67	0,08 ± 0,01
M3 0	4, 76 ± 0,73	0,09 ± 0,02

[0134] Consequentemente, foi confirmado que o extrato purificado da invenção inibiu eficazmente o nível de IgE e IgE específica para OVA no soro sanguíneo e, por conseguinte, eles são úteis para tratar ou prevenir doença alérgica e doença asmática.

Exemplo Experimental 5. Efeito do nível de citocinas inflamatórias em BALE [0135] A fim de confirmar o efeito de inibição de amostras de ensaio preparadas nos Exemplos no nível de citocinas do tipo Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) e IL-Ιβ no fluido de lavagem broncoalveolar (BALE), na sequência de teste foi realizado pelo método de ensaio de enzima sanduíche imunoabsorvente divulgado na

54/63 literatura (Renz H. et al.,

J. Exp . Med.,

1777, PP11751180,1993).

[0136] O soro sanguíneo e fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) foram adicionados a placas de 96 poços (placa de ELISA) revestidas com anticorpos de citocinas para induzir reação antigeno-anticorpo durante 2 horas em temperatura ambiente. Ο nível de citocinas do tipo Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) e IL-Ιβ no fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) foram determinados

utilizando kit de especificamente com manual de fabricação.	ELISA cada	(Biosource Int. uma das citocinas	CA, de	EUA) reagindo acordo com o
[0137] Como mostrado	nas	Fig.	8 e Fig. 9,	48	horas após o

tratamento com OVA, o nível de citocinas do tipo Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) e IL-Ιβ no grupo de controle tratado e inalado com OVA como um grupo induzida para asma (OVA) foi significativamente aumentado em comparação com os do grupo sem tratamento com OVA como um grupo de controle normal (NC).

[0138] O nível aumentado de citocinas do tipo Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) e IL-Ιβ no grupo de controle positivo tratados com montelucaste (MO, 30mg/kg), bem como o grupo de amostra de teste administrado via oral com várias concentrações de amostras de teste (ATC-10, ATC-25, e ATC-50) foram significativamente reduzidos. (Ver Tabela 9)

55/63 [Tabela 9] Nivel de citocinas Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) e IL-Ιβ

conc. (pg/ml)	IL-Ιβ	IL-4	IL-5	IL-13
NC	94,12±65,24	20,94±1,76	57,51±3,15	22,25±3,04
OVA	281,78±26,15	/48,7616,96	109,48±2,87	44,76±4,85
ATC2 (mg/kg)	5	243,93±27,58	35,2715,26	90,77±12,78	34,2917,55
10	226,33114,21	35,18±4,45	79,26±9,60	29,50±2,76
25	190,30±17,82	29,94±2,32	73,74±9,54	27,2714,42
50	170,70±25,43	25,2615,55	57,92±19,99	23,53±4,10
M3 0	187,03±47,17	32,60±4,53	69,74±7,17	25,93±4,13

[0139] Consequentemente, foi confirmado que o extrato purificado da invenção inibiu eficazmente o nivel de nivel de citocinas Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) e IL-Ιβ em BALF e, portanto, é útil para tratar ou prevenir doença alérgica e doença asmática.

Exemplo Experimental 6. Histologia do pulmão [0140] A fim de confirmar o efeito antiasmático de amostras de teste preparadas nos Exemplos, após análise histopatológica em tecidos broncoalveolares foi realizada pelo método descrito na literatura (Kwak YG. Et al., J. Clin. Invest., Ill, ppl0831092,2003).

[0141] Os tecidos pulmonares liberados de camundongos BALB/c que não realizaram lavagens broncoalveolares foram fixados por 24h em 10% de formalina neutra tamponada. Depois de ter sido embebido em parafina, então foram feitas secções de espessura de 4pm, o tecido foi corado com uma solução de Η & E (hematoxilina; Sigma MHS-16 e eosina, Sigma HT110-I-32) e o escore de inflamação de cinco regiões de cada secção escolhida de um modo

56/63 randomizado, foi determinado (escore de Inflamação 0: células inflamadas não são encontradas no entorno brônquico, Escore de Inflamação 1: células inflamadas são encontradas esporadicamente no entorno brônquico, Escore de Inflamação 2: camada fina de células inflamadas é encontrada na maioria dos entornos brônquicos, Escore de Inflamação 3: camada espessa de células inflamadas é encontrada na maioria dos entornos brônquicos).

[0142] Como mostrado na Fig. 10, muitas células inflamatórias, incluindo eosinófilos foram encontrados em um entorno bronquiolar e hiperplasia de células epiteliais, bem como hipertrofia do músculo traqueal também foram encontrados no grupo de controle tratado com OVA como um grupo induzido por asma (OVA) enquanto que a invasão de células inflamadas foi significativamente reduzida no grupo de controle positivo tratado com montelucaste (MO, 30mg/kg), assim como o grupo de amostra de teste administrado via oral com várias concentrações de amostras de ensaio (ATC-10,ATC-25, e ATC-50). (Ver Tabela 10) [Tabela 10] Escore de inflamação e a proporção de células caliciformes no epitélio celular bronquiolar

análise histopatológica	Escore da inflamação	PAS 1 células/bronquiolo (%)
NC	0,06 ± 0,05	2,1910,54
OVA	2,1110,07	52,7511,42
ATC2 (mg/kg)	5	1,7510,17	48,0711,15
10	1,3310,14	44,5911,60
25	1,1710,11	38,6111,74
50	1,0810,18	35,7111,14

57/63

M3 Ο

1,25±0,13

39,21±2,34

Exemplo Experimental 7. Avaliação da hiperplasia das células caliciformes [0143] A fim de confirmar o efeito antiasmático de amostras de teste preparadas nos Exemplos, análise de hiperplasia das células caliciformes no tecido broncoalveolar foi realizada pelo método revelado na literatura (Lee KS. et al., FASEB J., 20,Pp455-465, 2006).

[0144] Os tecidos pulmonares liberados de camundongos BALB/c que não realizaram lavados broncoalveolares foram fixados por 24 h em 10% de formalina neutra tamponada. Depois de ter sido embebido em parafina, então foram feitas secções de espessura de 4pm, o tecido foi corado com ácido Periódico de Schiff (kit PAS stain, T-K7308, IMEB, CA, USA) para determinar a proporção de células caliciformes no epitélio celular bronquiolar.

[0145] Como mostrado na Fig. 11, a proporção de células caliciformes no epitélio celular bronquiolar foi significativamente aumentada no grupo de controle tratado com OVA e inalado como um grupo induzido para asma (OVA), comparando com o grupo de controle normal (Nc), enquanto que a proporção de células caliciformes no epitélio celular bronquiolar era significativamente reduzida no grupo de controle positivo tratado com montelucaste (MO, 30mg/kg), assim como o grupo de amostra de teste administrado via oral com várias concentrações de amostras de ensaio (ATC-10,ATC-25, e ATC-50). (Ver Tabela 9)

58/63

Exemplo Experimental 8. Teste de toxicidade aguda de administração oral em camundongos [0146] 0 teste de toxicidade aguda foi realizado por meio da administração do extrato da invenção a camundongos SpragueDawley SPF de 6 semanas de idade.

[0147] 250 mg/kg, 500 mg/kg, 1000 mg/kg, 5000 mg/kg do extrato da invenção foram administrados por via oral a cada grupo consistindo em 2 camundongos e os sintomas dos camundongos foram observados durante 14 dias. Após administrar o extrato ou compostos, todas as alterações clínicas, ou seja, mortalidade, sinais clínicos, alterações do peso corporal foram observadas e exames de sangue, como testes hematológicos e testes hematológicos bioquímicos foram realizados. Foram observadas as alterações anormais dos órgãos abdominal e torácico após autópsia.

[0148] Não foram apresentadas quaisquer alterações nas taxas de mortalidade, sinais clínicos, alterações do peso corporal e os resultados brutos em qualquer grupo ou qualquer gênero. Além disso, não foi apresentada qualquer toxicidade no grupo de teste tratado com 5000 mg/kg de extrato da invenção ou compostos.

[0149] Consequentemente, foi confirmado que o extrato da invenção preparado na presente invenção foi substância potente e segura mostrando LD50 (mais de 5000 mg/kg) em administração oral.

59/63

Descrição Detalhada de uma Realização da Invenção [0150] Doravante, os métodos de formulação e tipos de excipientes serão descritos, mas a presente invenção não está limitada a estes. Os exemplos representativos de preparo são descritos como se segue.

Preparo de injeção

Extrato ATC1 lOOmg

Metabissulfito de sódio 3,0 mg

Metilparabeno

Propil-parabeno 0,1 mg

Água destilada para injeção quantidade ideal [0151] A preparação da injeção foi preparada dissolvendo os componentes ativos, controlando o pH em cerca de 7,5 e, em seguida, preenchendo todos os componentes em 2mL de amostra e esterilizando pelo método convencional de preparo de injeção.

Preparo de pó

Extrato ATC2 500mg

Amido de milho 100 mg

Lactose lOOmg

Talco 10 mg [0152] Preparação em pó foi preparada por mistura dos componentes acima e preenchendo a embalagem vedada.

Preparo do comprimido

Extrato ATC1 200mg

60/63

Amido de milho 100 mg

Lactose lOOmg

Estearato de magnésio quantidade ideal [0153] Preparação de comprimidos foi preparada por mistura dos componentes acima e comprimindo.

Preparação de cápsula

Extrato ATC2 lOOmg

Lactose 50mg

Amido de milho 50 mg

Talco 2mg

Estearato de magnésio quantidade ideal [0154] Preparação de comprimidos foi preparada por mistura dos componentes acima e preenchimento de cápsulas gelatinosas pelo método convencional de preparação de gelatina.

Preparação do liquido

Extrato ATC1 lOOOmg

Açúcar 20g

Polissacarideo 20g

Saborizante de limão 20g [0155] Preparação de líquido foi preparada dissolvendo o componente ativo e em seguida, preenchendo todos os componentes em 1000 mL de amostra e esterilizando pelo método convencional de preparação de líquido.

Preparação de alimento de saúde

61/63

Extrato ATC2 lOOOmg

Mistura de Vitaminas quantidade ideal

Acetato de Vitamina A 70g

Vitamina E l,0mg

Vitamina B10. 13mg

Vitamina B2 0,15mg

Vitamina B6 0,5mg

Vitamina BI 20,2g

Vitamina C lOmg

Biotina 10g

Ácido amido nicotinico l,7mg

Ácido fólico 50g

Pantetonato de Cálcio 0,5mg

Mistura de Minerais quantidade ideal

Sulfato de Ferro l,75mg

Óxido de Zinco 0,82mg

Carbonato de Magnésio 25,3mg

Monopotássio de Fosfato 15mg

Fosfato Di-cálcio 55mg

Citrato de Potássio 90mg

Carbonato de Cálcio lOOmg

Cloreto de Magnésio 24,8mg [0156] A mistura de vitaminas e minerais acima mencionada pode ser variada de muitas maneiras. Tais variações não devem ser consideradas como um desvio do espirito e do escopo da presente invenção.

Preparação de bebida de saúde

62/63

Extrato ATC1 lOOOmg

Ácido cítrico lOOOmg

Oligossacarídeo 100g

Concentrado de damasco 2g

Taurina Ig

Água destilada 900mL [0157] Preparação de bebidas de saúde foi preparada dissolvendo o componente ativo, misturando, agitado a 85o C durante 1 hora, filtrado e, em seguida, preenchendo todos os componentes em 1000 mL de amostra e esterilizando pelo método convencional de preparação de bebidas de saúde.

[0158] A invenção sendo assim descrita, será óbvio que a mesma pode ser variada de muitas maneiras. Tais variações não devem ser consideradas como um desvio do espírito e do escopo da presente invenção, e todas as modificações, como será óbvio para um especialista na técnica, destinam-se a ser incluídas dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Aplicabilidade Industrial [0159] Como descrito na presente invenção, a presente invenção fornece novos métodos industrializados da invenção para preparar extratos purificados contendo princípios ativos mais abundantes, como derivados catalpol do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum e o extrato purificado mostrou atividade antiinflamatória, antialérgica e antiasmática mais potente do que o preparado pelo método de preparação convencional revelado na

63/63 técnica anterior por meio de vários testes in vivo como o teste de inibição sobre a reprodução de eosinófilos, a liberação de imunoglobulina e quimiocinas inflamatórias no plasma e fluido broncoalveolar, bem como a supressão da hiperrreatividade das vias aéreas e hiperplasia das células caliciformes em um modelo murino sensibilizado/desafiado por OVA. Portanto, pode ser usado como terapêutica ou alimento funcional de saúde para tratar e prevenir doenças inflamatórias, alérgicas ou asmáticas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. EXTRATO PURIFICADO FRACIONADO COM BUTANOL (ATC1) de extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, caracterizado por conter 12,3-47%(p/p) de derivados catalposideo em extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, em que ditos derivados catalposideo consistem em 15-50%(p/p) de verprosídeo, 0,3-10%(p/p) de ácido verátrico, 0,5-10%(p/p) de catalposideo, 0,3-10%(p/p) de picrosídeo II, 0,3-10%(p/p) de isovaniloil catalpol e 0,3-10%(p/p) de 6-0veratroil catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.
2. EXTRATO PURIFICADO FRACIONADO COM BUTANOL (ATC1) de extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, caracterizado por conter a proporção relativa mista(p/p) entre o peso de cada derivado catalposideo, de 15,0-18,0(p/p) de verprosídeo, 2,10-2,60(p/p) de catalposideo, 1(p/p) de picrosídeo II, 1, 00-1,30(p/p) de isovaniloil catalpol e 2,002,30(p/p) de 6-O-veratroil catalpol.
3. MÉTODO PARA PREPARAR EXTRATO PURIFICADO FRACIONADO COM

BUTANOL (ATC1) isolado de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum caracterizado por compreender as etapas de:

- adicionar pelo menos um solvente de extração selecionado de água, metanol, etanol, butanol ou a misturas dos mesmos para Pseudolysimachion rotundum var subintegrum seco na primeira etapa;

2/8

- submeter a pelo menos um método de extração selecionado de extração sob refluxo com água quente, extração com água fria, ultrassonicação ou extração convencional, a uma temperatura variando de 10 a 100°C, por um periodo variando de 30 minutos até 72 horas repetidamente, para se obter o primeiro extrato na segunda etapa;

- suspender o primeiro extrato em cerca de 0,5-10 vezes o volume (v/v) de água para se obter extrato em suspensão na terceira etapa; e adicionar 0,5-20 vezes o volume (v/v) de butanol, fracionando em fase aquosa e fase de butanol e coletar a fase de butanol para se obter o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) contendo 15-50% (p/p) de verprosideo, 0,3-10%(p/p) de ácido verátrico, 0,5-10%(p/p) de catalposideo, 0,3-10%(p/p) de picrosideo II, 0,310% (p/p) de isovaniloil catalpol e 0,3-10%(p/p) de 6-0veratroil catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum para tratar e prevenir doença inflamatória, alérgica ou asmática.
4. EXTRATO PURIFICADO FRACIONADO COM BUTANOL (ATC1) do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, preparado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por conter 12,347%(p/p) de derivados catalposideo no extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, em que os referidos derivados catalposideo consistem em 15-50%(p/p) de verprosideo, 0,3-10% (p/p) de ácido verátrico, 0,5-10%(p/p) de catalposideo, 0,3-10%(p/p) de picrosideo II, 0,3-10%(p/p) de isovaniloil catalpol e 0,3-10%(p/p) de 6-O-veratroil catalpol com base no

3/8 peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.
5. EXTRATO PURIFICADO COM O FRACIONAMENTO SECUNDÁRIO (ATC2) do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, caracterizado por conter 36,5-91%(p/p) em derivados catalposideo em extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, em que ditos derivados catalposideo consistem em 30-60%(p/p) de verprosídeo, 0,5-10%(p/p) de ácido verátrico, 220%(p/p) de catalposideo, 1-10% (p/p) de picrosídeo II, 110%(p/p) de isovaniloil catalpol e 2-20%(p/p) de 6-O-veratroil catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.
6. EXTRATO PURIFICADO COM FRACIONAMENTO SECUNDÁRIO (ATC2) do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, caracterizado por ser a proporção relativa mista(p/p) entre o peso de cada derivado catalposideo, de 13,0-16,0(p/p) de verprosídeo, 2,20-2,50(p/p) de catalposideo, 1(p/p) de picrosídeo II, 1, 10-1,40(p/p) de isovaniloil catalpol e 2,002,20(p/p) de 6-O-veratroil catalpol.
7. MÉTODO PARA PREPARAR O EXTRATO PURIFICADO COM O FRACIONAMENTO SECUNDÁRIO (ATC2) caracterizado por compreender as etapas de:

- adicionar pelo menos um solvente de extração selecionado de água, metanol, etanol, butanol ou as misturas dos mesmos para Pseudolysimachion rotundum var subintegrum seco na primeira etapa;

4/8

- submeter a pelo menos um método de extração selecionado de extração de refluxo com água quente, extração com água fria, ultrassonicação ou extração convencional em temperatura variando de 10 a 100°C, para o período que varia de 30 minutos até 72 horas, repetidamente, para se obter o primeiro extrato na segunda etapa;

- suspender o primeiro extrato em cerca de 0,5-10 vezes o volume (v/v) de água para se obter extrato em suspensão na terceira etapa;

adicionar de 0,5-20 vezes o volume (v/v) de butanol, fracionar em camada aquosa e camada de butanol e coletar a camada de butanol para se obter o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) na terceira etapa; e submeter o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) a pelo menos um processo adicional de purificação selecionado do grupo consistindo em cromatografia de partição de fase reversa, cromatografia de partição de fase normal, cromatografia de troca iônica, e cromatografia de exclusão por tamanho, para se obter o extrato purificado com o fracionamento secundário (ATC2) contendo 30-60%(p/p) verprosideo, 0,5-10%(p/p) ácido verátrico, 2-20%(p/p) catalposideo, 1-10%(p/p) picrosideo II, 1-10%(p/p) isovaniloil catalpol e 2-20% (p/p) 6-O-veratroil catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum para tratar e prevenir doença inflamatória, alérgica ou asmática.

5/8
8. MÉTODO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela etapa adicional de purificação ser uma cromatografia de partição de fase reversa ou qualquer cromatografia utilizando qualquer resina como uma fase estacionária que pode reter substância não polar, enquanto elui a substância polar.
9. MÉTODO de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por dita resina ser selecionada do grupo consistindo em resina Sephadex como Sephadex, Sephadex LH20, Sephadex G-25, Sephadex G10, Sefarose, Superdex, resina de metilacrilato, carboximetil celulose, sulfopropil celulose, carboximetil Sephadex, sulfopropil Sephadex, carboximetil Sefarose, sulfopropil Sepharose e semelhantes; resina de polímero reversa usando copolímero estireno-divinilbenzeno, como Polímero X, HP20, Polímero PRP-hl e semelhantes ou resina de suporte metacrilato etc; silica gel normal como produto BPC (produto de cromatografia de fase ligada), silica adquirida de YMC Co. Ltd, produto de silica adquirido de DAISO Co. Ltd, produto de silica adquirido de ASAHI Co. Ltd, produto de silica obtido de COSMOSYL Co. Ltd e semelhantes; produto ODS usado para o enchimento de HPLC como produto ODS adquirido de YMC Co. Ltd, produto ODS adquirido de DAISO Co. Ltd, produto ODS adquirido de ASAHI Co. Ltd, produto ODS adquirido de CHEMCO Co. Ltd, produto ODS adquirido de Merck Co. Ltd produto ODS obtido a partir de COSMOSYL Co. Ltd produto ODS adquirido de FUJI Co. Ltd e semelhantes.
10. MÉTODO de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por dita partição de fase reversa ser realizada utilizando pelo menos um solvente como uma fase móvel selecionada de água, acetonitrila, álcool inferior como metanol, etanol, butanol,

6/8 etc, tetrahidrofurano (THF) ou a mistura dos mesmos, para eluir substância polar.
11. EXTRATO PURIFICADO COM O FRACIONAMENTO SECUNDÁRIO (ATC2) do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, preparado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por conter 36,5-91%(p/p) de derivados catalposideo no extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, em que ditos derivados catalposideo consistem em 30-60%(p/p) de verprosideo, 0,5-10%(p/p) de ácido verátrico, 2-20%(p/p) de catalposideo, 1-10 % (p/p) de picrosideo II, 1-10%(p/p) de isovaniloil catalpol e 2-20%(p/p) de 6-O-veratroil catalpol com base no peso de extrato total (100%) de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.
12. EXTRATO PURIFICADO COM O FRACIONAMENTO SECUNDÁRIO (ATC2) do extrato de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, preparado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser a proporção relativa mista(p/p) entre o peso de cada derivado catalposideo, de 13,0-16,0 (p/p) de verprosideo, 2,20-2,50 (p/p) de catalposideo, 1(p/p) de picrosideo II, 1, 10-1,40(p/p) de isovaniloil catalpol e 2,00-2,20(p/p) de 6-O-veratroil catalpol.
13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender (a) o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) como estabelecido na reivindicação 1 ou 2; ou (b) o extrato purificado com o fracionamento secundário (ATC2), como estabelecido na reivindicação 5 ou 6, isolado a partir de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum como um principio ativo e os veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis,

7/8 para o tratamento e prevenção de doença inflamatória, alérgica ou asmática.
14. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que dita doença inflamatória é selecionada de eczema, dermatite atópica, conjuntivite, doença periodontal, rinite, otite média, laringofaringite, amigdalite, pneumonia, úlcera gástrica, gastrite, doença de Crohn, colite, hemorroidas, gota, espondilite anquilosante, febre reumática, lúpus eritematoso sistêmico, fibromialgia, artrite psoriática, osteoartrite, artrite reumática, periartrite do ombro, tendinite, tenossinovite, peritendinite, miosite, hepatite, cistite, nefrite, sindrome de Sjogren, esclerose múltipla, doença inflamatória crônica, doença inflamatória aguda, etc.
15. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que dita doença alérgica é selecionada de rinite alérgica, dermatite alérgica, dermatite de contato, urticária, alergia a insetos, alergia alimentar, alergia a drogas, conjuntivite alérgica, hipersensibilidade, etc.
16. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que dita doença asmática é selecionada de qualquer asma causada por vários fatores externos selecionados de ácaros de poeira, pelos de animal ou caspa, baratas, alimentos, drogas, tosse, fumo de cigarro, poluição do ar, aditivo alimentar, atividade física, como exercício, mudança de clima, areia amarela, estresse, etc.

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17. ALIMENTO FUNCIONAL DE SAÚDE caracterizado por compreender o extrato purificado de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum contendo princípios ativos abundantes preparado pelos métodos como estabelecido nas reivindicações 3 ou 7 para prevenir ou atenuar doença inflamatória, alérgica ou asmática.
18. ALIMENTO FUNCIONAL DE SAÚDE, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por dito alimento saudável funcional ser uma forma de alimentos, bebida de saúde, suplemento dietético etc.
19. ALIMENTO DE CUIDADOS DE SAÚDE, caracterizado por compreender o extrato purificado de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum contendo princípios ativos abundantes preparado pelos métodos como estabelecido nas reivindicações 3 ou 7, em conjunto com um aditivo alimentar aceitável para prevenir ou atenuar doença inflamatória, alérgica ou asmática.
20. ALIMENTO DE CUIDADOS DE SAÚDE, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado dito alimento de cuidados de saúde ser uma forma de alimento, bebida de saúde, suplemento dietético etc.
21. USO DE EXTRATO PURIFICADO, caracterizado por conter (a) o extrato purificado fracionado com butanol (ATC1) como estabelecido na reivindicação 1 ou 2; ou (b) o extrato purificado com o fracionamento secundário (ATC2), como estabelecido na reivindicação 5 ou 6, isolado de Pseudolysimachion rotundum var subintegrum para fabricação de medicamentos utilizados para tratar ou prevenir doença inflamatória, alérgica ou asmática.