CN106353433B - 一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法 - Google Patents

一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106353433B
CN106353433B CN201610893252.0A CN201610893252A CN106353433B CN 106353433 B CN106353433 B CN 106353433B CN 201610893252 A CN201610893252 A CN 201610893252A CN 106353433 B CN106353433 B CN 106353433B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cockroach
american
extract
hepatitis
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610893252.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106353433A (zh
Inventor
郝振平
徐溧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming Cinorch Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Original Assignee
Kunming Cinorch Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming Cinorch Pharmaceutical Ltd By Share Ltd filed Critical Kunming Cinorch Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Priority to CN201610893252.0A priority Critical patent/CN106353433B/zh
Publication of CN106353433A publication Critical patent/CN106353433A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106353433B publication Critical patent/CN106353433B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明涉及一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，包括以下步骤：(1)取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品加水溶解、离心，取上清液加于层析柱上，洗脱液洗脱，收集暗红色带组分；(2)取暗红色带组分，然后加入人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液，然后上HPLC色谱检测，记录色谱图；(3)如果治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰位于人胰岛素和肌苷的色谱峰之间，呈近似正态分布，且其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt，之间的相对偏差不得过±8％，则乙型肝炎美洲大蠊提取物成品是合格的，本发明通过制定了科学合理、可行性高的成分鉴别方法，能够应用于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的生产和质量控制工程中，保证了该提取物的临床疗效。

Description

一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体来讲涉及一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法。
背景技术
美洲大蠊为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称蟑螂，是蜚蠊科中体积最大的昆虫，原产于南美洲。美洲大蠊是传统的中药材入药始载于《神农本草经》,谓“味咸,寒。主血瘀、症坚、寒热，破积聚，喉咽搏，内寒，无子”，用以治疗小儿疳积、疔疮、痈肿、喉蛾、无名肿毒、梅毒以及毒蛇、蜈松咬伤等疾病。
随着现代科学的不断发展，美洲大蠊的化学成分和药理作用的研究愈加深入。据文献报道，美洲大蠊中含有蛋白质、肽类、氨基酸、甲壳素、粘糖氨酸、核苷、脂肪酸、烯醇、烯酸、烷烃、多元醇、大环内酯类，酶类以及丰富的矿物质和微量元素。通过国内已有产品及相关药理活性研究情况看，美洲大蠊体内药效成分的生物活性主要包括：对各种外伤创面及机体溃疡具有良好的肌肉组织修复活性；具有强心升压，改善血液循环的活性；具有抗菌抗病毒的活性；具有抗肿瘤，增强免疫功能活性。
我们前期从美洲大蠊提取分离得到治疗乙型肝炎有效成分，并申请了发明专利(201210446628.5)。但是该提取物成分十分复杂，目前尚没有一套完善的检测方法对其进行有效的检测。鉴于选取其中某一标志性成分作为检测对象并采用高效液相色谱法或薄层色谱法进行检测的难度较大，目前急需探索出一种新的简便有效的检测方法，以对该提取物进行质量控制。
发明内容
本发明提供了一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，为治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物提供了一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物提供了一种行之有效的质量控制方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，包括以下步骤：
(1)取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品加水溶解，离心弃去沉淀，取上清液加于层析柱上，洗脱液洗脱，收集样品前端的暗红色带组分；
(2)取暗红色带组分，然后加入人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液，然后取混合液上HPLC色谱检测，记录色谱图；
(3)人胰岛素和肌苷的色谱峰的保留时间测定值各为Rt1和Rt2，治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰的保留时间测定值为Rt，如果治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰位于人胰岛素和肌苷的色谱峰之间，呈近似正态分布，且其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt’之间的相对偏差不得过±8％，则乙型肝炎美洲大蠊提取物成品是合格的，
所述计算值的计算式：Rt’＝0.95×(Rt1+Rt2)/2
所述相对偏差＝(Rt-Rt’)/Rt’×100％。
优选地：所述的美洲大蠊提取物成品与水的比例为美洲大蠊提取物成品0.3g，加水5～10ml。
优选地：所述的层析柱为Sephadex G25或G10层析柱。
优选地：所述的洗脱液中包括pH4～8的0.05～0.20mol/L氯化钾或氯化钠的0.005～0.030mol/L磷酸盐缓冲溶液。
优选地：所述的人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液为人胰岛素的溶液与肌苷溶液按照体积比1:4～4:1混合所得的溶液，所述的人胰岛素的溶液为分子量5800Da的人胰岛素溶解于0.005～0.020mol/LKOH或NaOH溶液，形成浓度0.5～4.0mg/ml的溶液；所述的肌苷溶液为分子量268Da溶解于纯净水形成的浓度为0.5～4.0mg/ml的溶液。
优选地：所述的色谱柱为Superdex peptide 10/300GL色谱柱。
优选地：所述的HPLC色谱检测包括：进样量为40μL，以0.05～0.20mol/L氯化钾或氯化钠的0.005～0.030mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH4～8)为流动相洗脱，流速0.5～1.5mL/min，紫外225nm检测，记录色谱图。
优选地：所述的治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物的制备方法，包括以下步骤：
A、灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用80℃～90℃的热水杀死，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过24目筛，制得美洲大蠊粗粉；
B、提取：将步骤A所得美洲大蠊粗粉在75～80℃温度下进行3～5次回流提取，第一次提取时，加粗粉重量5～8倍量浓度90％～95％的乙醇，提取时间为4～6小时；第二次以后每次加粗粉重量3～6倍量浓度90％～95％的乙醇，提取时间为3～5小时；提取过程中，乙醇温度均保持在75～80℃；提取完成后，合并提取液，过滤得乙醇提取液；
C、一级浓缩：将步骤B所得乙醇提取液在真空度-0.05～-0.06MPa、温度50～60℃的条件下减压浓缩，至比重为1.05～1.15时，得乙醇浓缩液；
D、脱脂吸附：将步骤C所得乙醇浓缩液加入乙醇浓缩液重量7～10倍量的蒸馏水，边搅拌边升温至80～90℃后，搅拌10～60分钟，搅拌速度为20～60转/分，然后保温静置1～5小时使油水分层；收集下层水液，经滤纸过滤后，在所得滤液中加入乙醇浓缩液0.5～1.0倍量药用活性炭在40～60℃温度下搅拌30～60分钟，使其充分吸附；
E、洗脱：将步骤D所得含活性炭药液装入层析柱中，放出药液，先用药用活性炭10～30倍量蒸馏水洗涤，水洗液弃去；再用药用活性炭30～60倍量的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，经滤纸过滤，得洗脱滤液；所用洗脱剂为浓度10％～20％、pH值2.0～3.0的醋酸乙醇液或浓度10％～20％醋酸的水饱和正丁醇溶液或苯酚浓度为10％～20％的苯酚乙醇液；
F、二级浓缩：将步骤E所得洗脱滤液在温度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa条件下减压浓缩，浓缩至比重为1.20～1.30时，得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏；
G、干燥粉碎：将步骤F所得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏在50℃～60℃温度、真空度-0.04～-0.07MPa的条件下真空干燥，粉碎为细粉，即得到用于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品。
本发明的有益效果：
由于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的成分十分复杂，目前尚没有一套完善的检测方法对其有效成份进行相应的检测。鉴于选取其中某一标志性成分作为HPLC检测对象的可能性较低，本发明选择Sephadex层析柱与HPLC相结合的方法，对治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的相对分子质量进行检测，，形成一种针对性强、可操作性高的检测方法，填补了该有效成分检测领域的空白，能够应用于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的生产控制方面。
本发明的方法针对性强，可操作性高，是一种准确有效的检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1的产品的HPLC图；
图2为实施例2的产品的HPLC图；
图3为实施例3的产品的HPLC图；
图4为实施例4的产品的HPLC图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，包括以下步骤：
取治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物0.3g，加水5.0ml使溶解，离心弃去沉淀，取上清液0.5ml加于Sephadex G10层析柱(10×80mm)上，用0.12mol/L氯化钾的0.030mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH5.8)洗脱，收集样品前端的暗红色带组分，约2ml。取该组分30μl，加入人胰岛素的0.012mol/L KOH溶液(分子量5800Da，浓度2mg/ml,对照品1)和肌苷溶液(分子量268Da，浓度2mg/ml,对照品2)的混合液(2:1)10μl，注入色谱柱Superdex peptide 10/300GL，以0.12mol/L氯化钾的0.030mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH5.8)为流动相洗脱，流速0.6ml/min，紫外225nm检测，记录色谱图(见附图1)。对照品1和2色谱峰的保留时间测定值各为Rt1和Rt2，供试品色谱峰的保留时间测定值为Rt。供试品色谱峰绝大部分应位于对照品色谱峰1和2之间，呈近似正态分布，其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt’之间的相对偏差不得过±8％。
计算式：Rt’＝0.95×(Rt1+Rt2)/2
＝0.95×(21.48+42.34)/2
＝30.31
相对偏差＝(Rt-Rt’)/Rt’×100％
＝(31.05-30.31)/30.31×100％
＝2.44％
因此，该份样品的分子量检测结果是合格的。
所述的治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物的制备方法，包括以下步骤：
A、灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用80℃的热水杀死，控温在60℃±5℃范围内烘干，取100Kg粉碎，过24目筛，制得美洲大蠊粗粉；
B、提取：将步骤A所得美洲大蠊粗粉投入提取罐内，在75～80℃温度下进行3次回流提取，第一次提取时，加500Kg浓度95％的乙醇，提取时间为4小时；第二次以后每次加300Kg浓度95％的乙醇，提取时间为3小时；提取过程中，乙醇温度均保持在75～80℃；提取完成后，合并提取液，过滤得乙醇提取液；
C、一级浓缩：将步骤B所得乙醇提取液放入单效浓缩器在真空度-0.05～-0.06MPa、温度50～60℃的条件下减压浓缩，至比重为1.07时，得乙醇浓缩液26.4Kg；
D、脱脂吸附：将步骤C所得乙醇浓缩液移入脱脂罐内，加入184.8Kg蒸馏水，边搅拌边升温至80～90℃后，搅拌10分钟，搅拌速度为60转/分，然后保温静置1小时使油水分层；收集下层水液，经滤纸过滤后，在所得滤液中加入13.2Kg药用活性炭在40℃温度下搅拌30分钟，使其充分吸附；
E、洗脱：将步骤D所得含活性炭药液装入层析柱中，放出药液，先用264Kg蒸馏水洗涤，水洗液弃去；再用792Kg的浓度20％、pH值2.23的醋酸乙醇液洗脱，收集洗脱液，经滤纸过滤，得洗脱滤液；
F、二级浓缩：将步骤E所得洗脱滤液放入单效浓缩器在温度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa条件下减压浓缩，浓缩至比重为1.23时，得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏4.8Kg；
G、干燥粉碎：将步骤F所得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物在50℃～60℃温度、真空度-0.04～-0.07MPa的条件下真空干燥，粉碎为细粉，即得到用于治疗乙型肝炎病的美洲大蠊提取物成品3.9Kg。
实施例2
一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，包括以下步骤：
取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物0.3g，加水7.0ml使溶解，离心弃去沉淀，取上清液0.5ml加于Sephadex G25层析柱(10×80mm)上，用0.09mol/L氯化钠的0.020mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)洗脱，收集样品前端的暗红色带组分，约2ml。取该组分30μl，加入人胰岛素的0.009mol/LNaOH溶液(分子量5800Da，浓度2mg/ml,对照品1)和肌苷溶液(分子量268Da，浓度2mg/ml,对照品2)的混合液(2:1)10μl，注入色谱柱Superdex peptide 10/300GL，以0.09mol/L氯化钠的0.020mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)为流动相洗脱，流速1.0ml/min，紫外225nm检测，记录色谱图(见附图2)。对照品1和2色谱峰的保留时间测定值各为Rt1和Rt2，供试品色谱峰的保留时间测定值为Rt。供试品色谱峰绝大部分应位于对照品色谱峰1和2之间，呈近似正态分布，其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt’之间的相对偏差不得过±8％。计算式：Rt’＝0.95×(Rt1+Rt2)/2
＝0.95×(18.73+35.52)/2
＝25.77
相对偏差＝(Rt-Rt’)/Rt’×100％
＝(26.34-25.77)/25.77×100％
＝2.21％
因此，该份样品的分子量检测结果是合格的。
所述的治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物的制备方法，包括以下步骤：
A、灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用85℃的热水杀死，控温在60℃±5℃范围内烘干，取100Kg粉碎，过24目筛，制得美洲大蠊粗粉；
B、提取：将步骤A所得美洲大蠊粗粉投入提取罐内，在75～80℃温度下进行4次回流提取，第一次提取时，加粗粉重量6倍量浓度92％的乙醇，提取时间为5小时；第二次以后每次加粗粉重量4倍量浓度92％的乙醇，提取时间为4小时；提取过程中，乙醇温度均保持在75～80℃；提取完成后，合并提取液，过滤得乙醇提取液；
C、一级浓缩：将步骤B所得乙醇提取液放入单效浓缩器在真空度-0.05～-0.06MPa、温度50～60℃的条件下减压浓缩，至比重为1.05～1.15时，得乙醇浓缩液27.8Kg；
D、脱脂吸附：将步骤C所得乙醇浓缩液移入脱脂罐内，加入乙醇浓缩液重量8倍量的蒸馏水，边搅拌边升温至80～90℃后，搅拌40分钟，搅拌速度为40转/分，然后保温静置3小时使油水分层；收集下层水液，经滤纸过滤后，在所得滤液中加入乙醇浓缩液0.8倍量药用活性炭在50℃温度下搅拌40分钟，使其充分吸附；
E、洗脱：将步骤D所得含活性炭药液装入层析柱中，放出药液，先用乙醇浓缩液20倍量蒸馏水洗涤，水洗液弃去；再用乙醇浓缩液50倍量的苯酚浓度为10％～20％的苯酚乙醇液洗脱，收集洗脱液，经滤纸过滤，得洗脱滤液；
F、二级浓缩：将步骤E所得洗脱滤液放入单效浓缩器在温度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa条件下减压浓缩，浓缩至比重为1.20～1.30时，得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏；
G、干燥粉碎：将步骤F所得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物在50℃～60℃温度、真空度-0.04～-0.07MPa的条件下真空干燥，粉碎为细粉，即得到用于治疗乙型肝炎病的美洲大蠊提取物成品4.5Kg。
实施例3
一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，包括以下步骤：
取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物0.3g，加水8.0ml使溶解，离心弃去沉淀，取上清液0.5ml加于Sephadex G25层析柱(10×80mm)上，用0.15mol/L氯化钠的0.010mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)洗脱，收集样品前端的暗红色带组分，约2ml。取该组分30μl，加入人胰岛素的0.015mol/LNaOH溶液(分子量5800Da，浓度2mg/ml,对照品1)和肌苷溶液(分子量268Da，浓度2mg/ml,对照品2)的混合液(2:1)10μl，注入色谱柱Superdex peptide 10/300GL，以0.15mol/L氯化钠的0.010mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)为流动相洗脱，流速1.2ml/min，紫外225nm检测，记录色谱图(见附图3)。对照品1和2色谱峰的保留时间测定值各为Rt1和Rt2，供试品色谱峰的保留时间测定值为Rt。供试品色谱峰绝大部分应位于对照品色谱峰1和2之间，呈近似正态分布，其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt’之间的相对偏差不得过±8％。
计算式：Rt’＝0.95×(Rt1+Rt2)/2
＝0.95×(17.88+36.13)/2
＝25.65
相对偏差＝(Rt-Rt’)/Rt’×100％
＝(23.85-25.65)/25.65，×100％
＝-7.02％
因此，该份样品的分子量检测结果是合格的。
所述的治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物的提取方法，包括以下步骤：
A、灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用88℃的热水杀死，控温在60℃±5℃范围内烘干，取100Kg粉碎，过24目筛，制得美洲大蠊粗粉；
B、提取：将步骤A所得美洲大蠊粗粉投入提取罐内，在75～80℃温度下进行4次回流提取，第一次提取时，加700Kg浓度90％的乙醇，提取时间为6小时；第二次以后每次加500Kg浓度90％的乙醇，提取时间为5小时；提取过程中，乙醇温度均保持在75～80℃；提取完成后，合并提取液，过滤得乙醇提取液；
C、一级浓缩：将步骤B所得乙醇提取液放入单效浓缩器在真空度-0.05～-0.06MPa、温度50～60℃的条件下减压浓缩，至比重为1.12时，得乙醇浓缩液28.7Kg；
D、脱脂吸附：将步骤C所得乙醇浓缩液移入脱脂罐内，加入260Kg蒸馏水，边搅拌边升温至80～90℃后，搅拌60分钟，搅拌速度为30转/分，然后保温静置4小时使油水分层；收集下层水液，经滤纸过滤后，在所得滤液中加入26.0Kg药用活性炭在55℃温度下搅拌50分钟，使其充分吸附；
E、洗脱：将步骤D所得含活性炭药液装入层析柱中，放出药液，先用780Kg蒸馏水洗涤，水洗液弃去；再用1560Kg浓度20％醋酸的水饱和正丁醇溶液洗脱，收集洗脱液，经滤纸过滤，得洗脱滤液；
F、二级浓缩：将步骤E所得洗脱滤液放入单效浓缩器在温度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa条件下减压浓缩，浓缩至比重为1.25时，得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏5.0Kg；
G、干燥粉碎：将步骤F所得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物在50℃～60℃温度、真空度-0.04～-0.07MPa的条件下真空干燥，粉碎为细粉，即得到用于治疗乙型肝炎病的美洲大蠊提取物成品4.6Kg。
实施例4
一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，包括以下步骤：
取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物0.3g，加水10.0ml使溶解，离心弃去沉淀，取上清液0.5ml加于Sephadex G10层析柱(10×80mm)上，用0.18mol/L氯化钾的0.005mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)洗脱，收集样品前端的暗红色带组分，约2ml。取该组分30μl，加入人胰岛素的0.018mol/L KOH溶液(分子量5800Da，浓度2mg/ml,对照品1)和肌苷溶液(分子量268Da，浓度2mg/ml,对照品2)的混合液(2:1)10μl，注入色谱柱Superdex peptide 10/300GL，以0.18mol/L氯化钾的0.005mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)为流动相洗脱，流速1.5ml/min，紫外225nm检测，记录色谱图(见附图4)。对照品1和2色谱峰的保留时间测定值各为Rt1和Rt2，供试品色谱峰的保留时间测定值为Rt。供试品色谱峰绝大部分应位于对照品色谱峰1和2之间，呈近似正态分布，其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt’之间的相对偏差不得过±8％。
计算式：Rt’＝0.95×(Rt1+Rt2)/2
＝0.95×(18.01+41.49)/2
＝28.26
相对偏差＝(Rt-Rt’)/Rt’×100％
＝(28.26-26.68)/26.68’×100％
＝5.92％
因此，该份样品的分子量检测结果是合格的。
所述的治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物的提取方法，包括以下步骤：
A、灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用90℃的热水杀死，控温在60℃±5℃范围内烘干，取100Kg粉碎，过24目筛，制得美洲大蠊粗粉；
B、提取：将步骤A所得美洲大蠊粗粉投入提取罐内，在75～80℃温度下进行5次回流提取，第一次提取时，加800Kg浓度90％的乙醇，提取时间为6小时；第二次以后每次加600Kg浓度90％的乙醇，提取时间为5小时；提取过程中，乙醇温度均保持在75～80℃；提取完成后，合并提取液，过滤得乙醇提取液；
C、一级浓缩：将步骤B所得乙醇提取液放入单效浓缩器在真空度-0.05～-0.06MPa、温度50～60℃的条件下减压浓缩，至比重为1.12时，得乙醇浓缩液29.7Kg；
D、脱脂吸附：将步骤C所得乙醇浓缩液移入脱脂罐内，加入297Kg蒸馏水，边搅拌边升温至80～90℃后，搅拌60分钟，搅拌速度为20转/分，然后保温静置5小时使油水分层；收集下层水液，经滤纸过滤后，在所得滤液中加入29.7Kg药用活性炭在60℃温度下搅拌60分钟，使其充分吸附；
E、洗脱：将步骤D所得含活性炭药液装入层析柱中，放出药液，先用891Kg蒸馏水洗涤，水洗液弃去；再用1782Kg浓度20％醋酸的水饱和正丁醇溶液洗脱，收集洗脱液，经滤纸过滤，得洗脱滤液；
F、二级浓缩：将步骤E所得洗脱滤液放入单效浓缩器在温度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa条件下减压浓缩，浓缩至比重为1.24时，得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏5.2Kg；
G、干燥粉碎：将步骤F所得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物在50℃～60℃温度、真空度-0.04～-0.07MPa的条件下真空干燥，粉碎为细粉，即得到用于治疗乙型肝炎病的美洲大蠊提取物成品4.7Kg。
实施例5
精密度、重现性及稳定性实验
1.精密度实验：
以取自同一治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物样品5份，按照上述方法连续检测5次，测得其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt，之间的相对偏差的RSD(相对标准偏差)均在0.3～1.0％之间，说明本方法精密度良好。
2.重现性实验：
取同一批次治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物样品5份，按照上述方法连续检测5次。测得其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt，之间的相对偏差的RSD(相对标准偏差)均在0.4～1.5％之间，说明本方法重现性良好。
3.稳定性实验：
取乙型肝炎美洲大蠊提取物样品1份，分别在0、2、4、8、12、24h进样测定，测得其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt，之间的相对偏差的RSD均小于2.0％，说明本方法在24h内测定是稳定的。
由于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的成分十分复杂，目前尚没有一套完善的检测方法对其有效成份进行相应的检测。鉴于选取其中某一标志性成分作为HPLC检测对象的可能性较低，本发明选择Sephadex层析柱与HPLC相结合的方法，对治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的相对分子质量进行检测，，形成一种针对性强、可操作性高的检测方法，填补了该有效成分检测领域的空白，能够应用于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的生产控制方面。
实施例6
治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物制备的药物及治疗病例：
取实施例1-4中制备的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物细粉500g，加淀粉200g、微晶纤维素300g、硬脂酸镁2g混合均匀，得药粉1000g，按每粒0.3g填充硬胶囊。
80例慢性乙型肝炎及80乙肝病毒携带者，证属肝郁脾虚兼血瘀，随机分为甲、乙、丙和丁四组，每组20慢性乙型肝炎患者，20例乙肝病毒携带者，四组分别给药实施例1-4所得的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物制备的胶囊，每次2粒，每日两次，四组均给药90天。检查体温、呼吸、脉率、血压、血常规、大小便常规及隐血、总胆红素、直接胆红素、ALT、TTT、BUN、CRN、A/G、血K+Na+、Cl-等项目。
治疗结果：
(1)对HBV感染标志物阴转影响
对于慢性乙肝患者，
甲组：HBeAg转阴10例(转阴率50％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)，HBV-DNA转阴8例(转阴率40％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)；
乙组：HBeAg转阴8例(转阴率40％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)，HBV-DNA转阴8例(转阴率40％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)；
丙组：HBeAg转阴12例(转阴率60％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)，HBV-DNA转阴10例(转阴率50％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)；
丁组：HBeAg转阴10例(转阴率50％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)，HBV-DNA转阴8例(转阴率40％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)；
对于乙肝病毒携带者，
甲组HBeAg转阴8例(转阴率40％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)，HBV-DNA转阴4例(转阴率20％)，治疗前后差异无显著性(P＞0.05)。
乙组HBeAg转阴9例(转阴率45％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)，HBV-DNA转阴3例(转阴率15％)，治疗前后差异无显著性(P＞0.05)。
丙组HBeAg转阴10例(转阴率50％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)，HBV-DNA转阴5例(转阴率25％)，治疗前后差异无显著性(P＞0.05)。
丁组HBeAg转阴10例(转阴率50％)，治疗前后差异有显著性(P＜0.05)，HBV-DNA转阴4例(转阴率20％)，治疗前后差异无显著性(P＞0.05)。
(3)中医证候疗效
甲组，临床控制3例，显效12例，有效2例，无效3例，总有效率85％，总显效率75％；
乙组，临床控制2例，显效13例，有效3例，无效2例，总有效率90％，总显效率75％；
丙组，临床控制3例，显效12例，有效2例，无效3例，总有效率85％，总显效率75％；
丁组，临床控制4例，显效11例，有效3例，无效2例，总有效率90％，总显效率75％。
由以上的结果可知，本发明确定为合格的产品在药效上没有明显的变化，整体药物质量稳定，本发明的方法准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品加水溶解，离心弃去沉淀，取上清液加于层析柱上，洗脱液洗脱，收集样品前端的暗红色带组分；
(2)取暗红色带组分，然后加入人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液，然后取混合液上HPLC色谱检测，记录色谱图；
(3)人胰岛素和肌苷的色谱峰的保留时间测定值各为Rt1和Rt2，治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰的保留时间测定值为Rt，如果治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品的色谱峰位于人胰岛素和肌苷的色谱峰之间，呈近似正态分布，且其色谱峰的保留时间测定值Rt与计算值Rt’之间的相对偏差不得过±8％，则乙型肝炎美洲大蠊提取物成品是合格的，
所述计算值的计算式：Rt’＝0.95×(Rt1+Rt2)/2
所述相对偏差＝(Rt-Rt’)/Rt’×100％。
2.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的美洲大蠊提取物成品与水的比例为美洲大蠊提取物成品0.3g，加水5～10ml。
3.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的层析柱为Sephadex G25或G10层析柱。
4.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的洗脱液中包括pH4～8的0.05～0.20mol/L氯化钾或氯化钠的0.005～0.030mol/L磷酸盐缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的人胰岛素的溶液和肌苷溶液混合液为人胰岛素的溶液与肌苷溶液按照体积比1:4～4:1混合所得的溶液，所述的人胰岛素的溶液为分子量5800Da的人胰岛素溶解于0.005～0.020mol/LKOH或NaOH溶液，形成浓度0.5～4.0mg/ml的溶液；所述的肌苷溶液为分子量268Da溶解于纯净水形成的浓度为0.5～4.0mg/ml的溶液。
6.根据权利要求1所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的HPLC色谱检测的色谱柱为Superdex peptide 10/300GL色谱柱。
7.根据权利要求5所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的HPLC色谱检测包括：进样量为40μL，以pH4～8的0.05～0.20mol/L氯化钾或氯化钠的0.005～0.030mol/L磷酸盐缓冲溶液为流动相洗脱，流速0.5～1.5mL/min，紫外225nm检测，记录色谱图。
8.根据权利要求1-7任一项所述的治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法，其特征在于：所述的治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物的制备方法，包括以下步骤：
A、灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用80℃～90℃的热水杀死，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过24目筛，制得美洲大蠊粗粉；
B、提取：将步骤A所得美洲大蠊粗粉在75～80℃温度下进行3～5次回流提取，第一次提取时，加粗粉重量5～8倍量浓度90％～95％的乙醇，提取时间为4～6小时；第二次以后每次加粗粉重量3～6倍量浓度90％～95％的乙醇，提取时间为3～5小时；提取过程中，乙醇温度均保持在75～80℃；提取完成后，合并提取液，过滤得乙醇提取液；
C、一级浓缩：将步骤B所得乙醇提取液在真空度-0.05～-0.06MPa、温度50～60℃的条件下减压浓缩，至比重为1.05～1.15时，得乙醇浓缩液；
D、脱脂吸附：将步骤C所得乙醇浓缩液加入乙醇浓缩液重量7～10倍量的蒸馏水，边搅拌边升温至80～90℃后，搅拌10～60分钟，搅拌速度为20～60转/分，然后保温静置1～5小时使油水分层；收集下层水液，经滤纸过滤后，在所得滤液中加入乙醇浓缩液0.5～1.0倍量药用活性炭在40～60℃温度下搅拌30～60分钟，使其充分吸附；
E、洗脱：将步骤D所得含活性炭药液装入层析柱中，放出药液，先用药用活性炭10～30倍量蒸馏水洗涤，水洗液弃去；再用药用活性炭30～60倍量的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，经滤纸过滤，得洗脱滤液；所用洗脱剂为浓度10％～20％、pH值2.0～3.0的醋酸乙醇液或浓度10％～20％醋酸的水饱和正丁醇溶液或苯酚浓度为10％～20％的苯酚乙醇液；
F、二级浓缩：将步骤E所得洗脱滤液在温度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa条件下减压浓缩，浓缩至比重为1.20～1.30时，得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏；
G、干燥粉碎：将步骤F所得治疗乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏在50℃～60℃温度、真空度-0.04～-0.07MPa的条件下真空干燥，粉碎为细粉，即得到用于治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物成品。
CN201610893252.0A 2016-10-13 2016-10-13 一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法 Active CN106353433B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610893252.0A CN106353433B (zh) 2016-10-13 2016-10-13 一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610893252.0A CN106353433B (zh) 2016-10-13 2016-10-13 一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106353433A CN106353433A (zh) 2017-01-25
CN106353433B true CN106353433B (zh) 2018-09-14

Family

ID=57866168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610893252.0A Active CN106353433B (zh) 2016-10-13 2016-10-13 一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106353433B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010031794A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Entomopharm Aps Screening methods employing insects with blood brain barrier
CN102885856A (zh) * 2012-11-10 2013-01-23 昆明赛诺制药有限公司 用美洲大蠊提取物生产治疗乙型肝炎药物的生产方法
CN102895263A (zh) * 2012-11-10 2013-01-30 昆明赛诺制药有限公司 去除美洲大蠊提取物中的油脂及其检测方法
CN104822386A (zh) * 2012-12-31 2015-08-05 永进药品株式会社 从东北婆婆纳中分离的含有大量活性成分的纯化提取物、其制备以及包含该提取物作为活性成分用于预防或治疗炎症、过敏和哮喘的组合物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010031794A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Entomopharm Aps Screening methods employing insects with blood brain barrier
CN102885856A (zh) * 2012-11-10 2013-01-23 昆明赛诺制药有限公司 用美洲大蠊提取物生产治疗乙型肝炎药物的生产方法
CN102895263A (zh) * 2012-11-10 2013-01-30 昆明赛诺制药有限公司 去除美洲大蠊提取物中的油脂及其检测方法
CN104822386A (zh) * 2012-12-31 2015-08-05 永进药品株式会社 从东北婆婆纳中分离的含有大量活性成分的纯化提取物、其制备以及包含该提取物作为活性成分用于预防或治疗炎症、过敏和哮喘的组合物

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bennett Ma 等.Purification and cloning of a Delta class glutathione S-transferase displaying high peroxidase activity isolated from the German cockroach Blattella germanica.《The FEBS Journal》.2007,第274卷 *
The Use of Insects in Folk Medicine in the State of Bahia, Northeastern Brazil, With Notes on Insects Reported Elsewhere in Brazilian Folk Medicine;Eraldo Medeiros Costa-Neto;《Human Ecology》;20020630;第30卷(第2期);第245-263页 *
治疗乙型肝炎新药肝龙胶囊的药效学初步研究;杜一民 等;《时珍国医国药》;20061231;第17卷(第8期);第1369-1371页 *
肝龙胶囊中总肽含量及其分子量分布的研究;那凯哥 等;《中国生化药物杂志》;20151231;第35卷(第3期);第159-161页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106353433A (zh) 2017-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101035548B (zh) 甾体皂苷药物组合物及其制备方法和应用
CN102600219B (zh) 黄蜀葵花总黄酮提取物及其制备方法
CN110455965A (zh) 药物组合物的制备方法及其hplc指纹图谱建立方法
CN101007017B (zh) 具有α-糖苷酶抑制剂活性的中药提取物及其应用
CN102178741A (zh) 具有降血糖作用的番石榴叶提取物及其制备方法与应用
CN100584348C (zh) 一种抗肝炎的药物组合物
CN101401829A (zh) 一种野金柴活性提取物及其制备方法和应用
CN107778376A (zh) 一种三叶青多糖的制备方法及其应用
CN108210600A (zh) 一种柠檬苦素类提取物的制备方法及其应用
CN106353433B (zh) 一种治疗乙型肝炎美洲大蠊提取物的检测方法
CN115010618B (zh) 一种可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法及其应用
CN110960569A (zh) 一种余甘子提取物及其制备方法和应用
CN106265717B (zh) 狗肝菜多糖在制备防治糖尿病药物或保健品中的应用
CN101396373A (zh) 一种华蟾素提取物及其制备方法
CN102670698B (zh) 千斤拔提取物在制备防治糖尿病药物中的应用
CN101244124B (zh) 一种桑叶活性部位的制备方法及应用
CN103285113B (zh) 一种预防和/或治疗糖尿病的药物组合物
CN101249129B (zh) 一种治疗糖尿病的中药提取物组合物及其医药用途
CN1491684A (zh) 治疗乙肝的组合物
CN114831309B (zh) 一种灵芝西洋参组合物及其制备方法与应用
CN100355424C (zh) 治疗糖尿病的楤木提取物及楤木皂苷在制备治疗糖尿病的药物中的应用
CN103880913A (zh) 一种具有保肝作用的化合物及其应用
CN112353828B (zh) 一种补血、活经的人参膏及其制备方法
CN1322539A (zh) 由匙羹藤叶制备治疗糖尿病药物的方法
CN101732545B (zh) 知母、黄芪、苦瓜复方提取物的制备及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant