KR101476045B1 - 활성성분을 다량 함유한 산꼬리풀 정제 분획물 (atc2), 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

활성성분을 다량 함유한 산꼬리풀 정제 분획물 (atc2), 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 신규 정제물, 이를 유효성분으로 포함하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 신규 정제물은 본 발명에 따른 제조방법을 통하여 함량이 현저하게 증강된, 고함량의 카탈폴 유도체를 포함하고 있기 때문에, 마우스 난백알부민-유도 천식 동물모델에서 호산구의 증가, 면역글로불린 및 염증성 케모카인의 분비를 효과적으로 억제하는 활성을 나타내 염증, 알레르기 및 천식 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물, 건강기능식품 또는 건강보조식품으로 유용하다.

Description

활성성분을 다량 함유한 산꼬리풀 정제 분획물 (ATC2), 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 조성물 {A purified extract (ATC2) isolated from Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum containing abundunt amount of active ingredient, the preparation thereof, and the composition comprising the same as an active ingredient for preventing or treating inflammation, allergy and asthma}
본 발명은 활성성분을 다량 함유한 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 정제 분획물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
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[문헌 13] Lee KS et al., FASEB J, 20, 455-465, 2006.
일반적으로 염증 반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려고 하는 생체의 방어 반응과정이다. 따라서 이러한 일련의 반응에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포, 면역관여 세포 등이 포함된다. 최근 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환이 사이토카인(cytokine)이라는 분자 수준에서의 이해가 시도되고 있으며, 이러한 질환에 영향을 주는 인자들도 하나씩 규명되고 있다.
알레르기 반응은 그 반응 형태에 의해 I형, II형, III형 및 IV형의 4 가지 유형으로 분류될 수 있고, 또는 항원에 의한 재감작(感作) 후 발증까지의 시간에 의해서 I형, II형 및 III형 알레르기는 즉시형 알레르기라고 불리며, IV형 알레르기는 지연형 알레르기로 분류될 수 있다.
이 중, I형 알레르기는 IgE 항체가 관여하는 반응으로서, 아나필락시형 알레르기라고 불리우며, 여기에는 기관지 천식, 아토피성 질환(피부염, 장염 등), 화분증 등의 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 음식물 알레르기 등이 포함된다.
천식(asthma)이란 여러 가지 자극에 대한 기도의 과민성을 그 특징으로 하는 질환으로 기도의 광범위한 협착에 의해 발생하는 천명(喘鳴), 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들은 자연히 혹은 치료에 의해 가역적으로 호전될 수 있다. 대부분의 천식은 알레르기성이며, 만성 기도염증(chronic airway inflammation)과 기도 과민반응성(bronchial hyperresponsiveness)이 특징이다(Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp97-104).
천식은 그 원인에 따라 외인성 천식과 내인성 천식으로 나누어질 수 있다. 외인성 천식의 경우 원인 항원에 노출되었을 때 증상이 나타나는 천식을 말한다. 원인 항원에 대한 피부시험이나 기관지 유발시험이 양성반응을 보이며 발병 연령이 어린 것이 일반적이다. 집 먼지, 진드기가 가장 많은 원인 항원이며, 그밖에 꽃가루, 동물의 상피, 곰팡이 등이 원인 항원으로 작용한다. 내인성 천식의 경우에는 상기도 감염, 운동, 정서불안, 한랭 기후 및 습도의 변화 등이 천식을 유발하거나 악화시키는 경우인데, 성인형 천식에서 흔히 볼 수 있다. 그 외에도 약물에 의해 유발되는 천식, 운동 유발성 천식 및 직업성 천식 등이 있다.
천식은 TH2(T helper 2) 타입 면역세포가 생성하는 인터루킨-4, 5, 13에 의해 염증세포가 증식, 분화 및 활성화되어 기도 및 기도 주변 조직으로 이동, 침윤하기 때문에 만성 염증질환으로도 인식되고 있다(Elias JA, et al., J. Clin. Invest., 111, pp291-297, 2003). 천식을 앓고 있는 환자의 기관지에서 활성화된 호산구, 비만세포, 폐포 대식세포 등의 염증세포는 다양한 염증매개인자들(시스테인 류코트리엔, 프로스타글란딘 등)을 분비하면서 강력한 기관지 수축작용에 관여한다(Maggi E., Immunotechnology, 3, pp233-244, 1998; Pawankar R., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1, pp3-6, 2001; Barnes PJ, et al., Pharmacol Rev., 50, pp515-596, 1998).
따라서 염증세포 활성화에 관여하는 IL-4, IL-5, IL-13 등 사이토카인 및 면역글로불린 E의 생산과 이들의 작용으로 호산구 등 염증세포에서 분비되는 시스테인 류코트리엔 생합성 등은 염증 및 알레르기 반응과 이로 인한 천식을 유발하는 주요 원인이므로 이들의 생산을 억제하기 위한 약물을 개발하고자 많은 연구가 진행되고 있다.
지금까지 본 발명자들은 염증, 알레르기 및 천식 질환에서 특징적으로 나타나는 다양한 종류의 사이토카인 및 케모카인에 대한 항체를 이용한 치료제로써 여러 가지 자원, 특히 안전성 및 유효성이 이미 알려진 천연물 자원을 이용한 치료제 개발을 중점으로 하여 개발되어 오고 있어 온 바, 특히 본 발명자들은 꼬리풀속 식물 추출물의 항염, 항알레르기 및 항 천식 활성을 확인하여 특허출원하고 (한국특허등록 제 10-860080호) 상기 추출물로부터 분리된 카탈폴(catalpol) 유도체 성분, 예를 들어, 베프로시드(verproside, 6-O-3,4-Dihydroxybenzoyl catalpol), 피크로시드 Ⅱ(picroside Ⅱ, 6-O-4-hydroxy-3-methozybenzoyl), 베르미노시드 (verminoside, 6-O-3,4-dihydroxy cinnamoyl catalpol), 6-O-베라트로일카탈폴(6-O-veratroylcatalpol, 6-O-3,4-Dimethoxy benzoyl), 미네코시드 (minecoside, 6-O-3-hydroxy-4-methozycinnamoyl catalpol), 카탈폴(catalpol) 등의 성분을 분리하고 이들 성분들이 항염, 항알레르기 및 항 천식 활성을 나타냄을 확인하여 특허출원한 바가 있다 (한국특허공개 제10-2006-125499호).
그러나 상기 문헌의 어디에도 본원 발명자가 개발한 활성 성분을 다량 함유한 산꼬리풀의 신규 정제물 및 상기 정제물을 이용한 염증, 알레르기 및 천식 질환 치료제에 대한 내용이 개시되거나 교시된 바는 없다.
"산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum = Veronica rotunda var. subintegra)은 현삼과(Scrophulariaceae)에 속하는 다년생 초본으로서, 산꼬리풀의 높이는 40~80 cm 정도이고, 줄기는 곧게 서 있으며, 굽은 털이 있다. 산꼬리풀의 잎은 마주나기를 하며 좁은 달걀형이거나 긴 타원형이다. 산꼬리풀 잎의 끝은 뾰족하며 기부는 좁아지고, 가장자리에는 불규칙한 톱니가 있고, 잎의 길이는 5~10 cm이다. 잎의 뒷면의 맥위로는 털이 약간 있다. 산꼬리풀의 꽃은 가지와 줄기 끝에 파란빛을 띤 자주빛의 꽃이 총상꽃차례로 달린다. 꽃받침과 꽃잎은 각 4개이며 끝은 뾰족하다. 수술은 2개이며 꽃밥은 짙은 자주색이다. 산꼬리풀의 열매는 삭과로 넓은 달걀 뒤집은 모양이다. 산꼬리풀은 한국, 일본, 만주, 사할린섬, 우수리강 등지에 분포한다 (Flora of China 18; 1-212. 1998).
이에 본 발명자들은 기존 한국특허등록 제 10-850080호에 개발된 연구를 바탕으로 하여 종래의 추출방법으로 제조된 꼬리풀속 식물중, 특히 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물을 대상으로 산업화 및 대량 생산을 할 수 있는 방법을 연구하여 왔는데, 상기 산꼬리풀 식물 중 포함된 활성 성분, 특히, 카탈폴 유도체들의 함량이 매우 소량으로 산업상 대량으로 생산하기에 어려운 문제점을 안고 있었다.
이에, 본 발명자들은 고함량의 카탈폴 유도체를 포함하는 제조방법을 예의 연구한 결과, 보다 활성성분, 특히 고함량의 카탈폴 유도체를 다량 함유한 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 정제물을 개발하고 이를 대상으로 마우스 난백알부민-유도 천식 동물모델 및 각종 염증조절인자들에 대한 억제활성을 실험한 바, 종래 방법으로 추출한 꼬리풀 추출물보다 호산구의 증가를 보다 현저하게 억제하고, 면역글로불린의 분비와 염증성 케모카인의 분비를 보다 효과적으로 억제하는 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 대량생산도 가능한 우수한 제조방법을 제공함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 특정한 제조방법으로 제조된 한 활성성분, 특히 고함량의 카탈폴 유도체를 다량 함유한 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum)유래 산꼬리풀 신규 정제물 및 이의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 활성성분, 특히 고함량의 카탈폴 유도체를 다량 함유한 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum)유래 꼬리풀 신규 정제물을 유효성분으로 포함하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 활성성분, 특히 고함량의 카탈폴 유도체를 다량 함유한 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum)유래 꼬리풀 신규 정제물을 유효성분으로 포함하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 신규 정제물을 제공한다.
본원에서 정의되는 상기 신규 정제물은 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 부탄올 분획 정제물(ATC1), 또는 산꼬리풀 유래 2차 분획 정제물(ATC2)을 포함한다.
본원에서 정의되는 상기 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 부탄올 분획 정제물(ATC1)은 전체 추출물 100% 중량 대비(w/w), 베르프로시드(veproside) 15 내지 50 중량%, 베라트릭산(veratric acid) 0.3 내지 10 중량%, 카탈폴시드(catalposide)를 0.5 내지 10 중량%, 피크로시드(picroside) Ⅱ 0.3 내지 10 중량%, 이소바닐로일 카탈폴(isovanilloyl catalpol)을 0.3 내지 10 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 0.5 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 전체 추출물 100% 중량 대비(w/w), 베르프로시드 20 내지 25 중량%, 베라트릭산 0.5 내지 5 중량%, 카탈폴시드를 1 내지 5 중량%, 피크로시드 II 0.5 내지 5 중량%, 이소바닐로일 카탈폴을 0.5 내지 5 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 1 내지 5 중량%을 함유하거나 또는 상기 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 부탄올 분획 정제물(ATC1)은 카탈폴 유도체 총함량은 12.3 내지 47 중량% 범위이며, 상기 카탈폴 유도체 간의 상대 배합 중량 비(w/w)가 베르프로시드 15.0 내지 18.0, 카탈폴시드 2.10 내지 2.60, 피크로시드 II 1, 이소바닐로일 카탈폴 1.00 내지 1.30 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2.00 내지 2.30의 중량 배합비, 바람직하게는, 베르프로시드 16.0 내지 17.0, 카탈폴시드 2.20 내지 2.50, 피크로시드 II 1, 이소바닐로일 카탈폴 1.10 내지 1.20 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2.10 내지 2.20의 배합비의 중량 배합비, 보다 바람직하게는 베르프로시드 16.20 내지 16,99, 카탈폴시드 2.40 내지 2.45, 피크로시드 II 1, 이소바닐로일 카탈폴 1.10 내지 1.19 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2.10 내지 2.19의 배합비로 함유한 정제물임을 특징으로 한다.
보다 더 바람직하게는, 상기 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 부탄올 분획 정제물(ATC1)은 건조 상태의 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 에 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30~80% 에탄올을 가하여 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 20℃ 내지 90℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 냉침 추출법, 초음파 추출법, 환류 냉각 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법, 환류추출법 또는 이들의 하나 이상의 추출법 조합으로부터 선택된 추출법, 바람직하게는 냉침 추출법후 환류추출법을 연속적으로 수행하는 추출법, 보다 바람직하게는 10℃ 내지 60℃, 바람직하게는 20℃ 내지 50℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 냉침 추출후 40℃ 내지 120℃, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 환류 냉각 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 회수하여 제 1차 추출액을 수득하는 제 1단계; 상기 1단계의 제 1차 추출액을 감압농축하고 농축한 농축액에 상기 농축액 부피의 약 0.5 내지 10배 부피(v/v), 바람직하게는, 약 1 내지 5배 부피(v/v)의 증류수를 포함한 물을 가하여 현탁시키고 상기 현탁액 부피의 약 0.5 내지 20배 부피(v/v), 바람직하게는, 약 1 내지 10배 부피(v/v)의 부탄올을 가하여 부탄올 가용 분획을 회수하고 감압 농축하는 제 2단계 공정을 포함하는 제조방법으로 제조되고, 전체 추출물 100% 중량 대비(w/w), 베르프로시드 15 내지 50 중량%, 베라트릭산 0.3 내지 10 중량%, 카탈폴시드를 0.5 내지 10 중량%, 피크로시드 Ⅱ 0.3 내지 10 중량%, 이소바닐로일 카탈폴을 0.3 내지 10 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 0.5 내지 10 중량%을 함유함을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명은 또 하나의 일 양태로서 건조 상태의 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum ) 에 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30~80% 에탄올을 가하여 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 20℃ 내지 90℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 냉침 추출법, 초음파 추출법, 환류 냉각 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법, 환류추출법 또는 이들의 하나 이상의 추출법 조합으로부터 선택된 추출법, 바람직하게는 냉침 추출법후 환류추출법을 연속적으로 수행하는 추출법, 보다 바람직하게는 10℃ 내지 60℃, 바람직하게는 20℃ 내지 50℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 냉침 추출후 40℃ 내지 120℃, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 환류 냉각 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 회수하여 제 1차 추출액을 수득하는 제 1단계; 상기 1단계의 제 1차 추출액을 감압농축하고 농축한 농축액에 상기 농축액 부피의 약 0.5 내지 10배 부피(v/v), 바람직하게는, 약 1 내지 5배 부피(v/v)의 증류수를 포함한 물을 가하여 현탁시키고 상기 현탁액 부피의 약 0.5 내지 20배 부피(v/v), 바람직하게는, 약 1 내지 10배 부피(v/v)의 부탄올을 가하여 부탄올 가용 분획을 회수하고 감압 농축하는 제 2단계 공정을 포함하는 제조방법으로 제조되고, 전체 추출물 100% 중량 대비(w/w), 베르프로시드 15 내지 50 중량%, 베라트릭산 0.3 내지 10 중량%, 카탈폴시드를 0.5 내지 10 중량%, 피크로시드 Ⅱ 0.3 내지 10 중량%, 이소바닐로일 카탈폴을 0.3 내지 10 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 0.5 내지 10 중량%을 함유한 산꼬리풀 유래 부탄올 분획 정제물(ATC1)을 제조하는 제조방법을 제공한다.
본원에서 정의되는 상기 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 2차 분획 정제물(ATC2)은 전체 추출물 100% 중량 대비(w/w) 베르프로시드 30 내지 60 중량%, 베라트릭산 0.5 내지 10 중량%, 카탈폴시드 2 내지 20 중량%, 피크로시드 Ⅱ 1 내지 10 중량%, 이소바닐로일 카탈폴 1 내지 10 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2 내지 20 중량%, 보다 바람직하게는 전체 추출물 100% 중량 대비(w/w), 베르프로시드 40 내지 50 중량%, 베라트릭산 1 내지 5 중량%, 카탈폴시드 3 내지 10 중량%, 피크로시드 Ⅱ 2 내지 5 중량%, 이소바닐로일 카탈폴 2 내지 8 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 3 내지 8 중량%을 함유하거나 또는 상기 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 2차 분획 정제물(ATC2)은 산꼬리풀 부탄올 분획 정제물의 카탈폴 유도체 총함량은 카탈폴 유도체를 36.5 중량% 내지 91 중량% 함유하는 범위이며, 상기 카탈폴 유도체 간의 상대 배합 중량 비(w/w)가 베르프로시드 13.0 내지 16.0, 카탈폴시드 2.20 내지 2.50, 피크로시드 Ⅱ 1, 이소바닐로일 카탈폴 1.10 내지 1.40 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2.00 내지 2.20의 중량 배합비, 바람직하게는, 베르프로시드 14.0 내지 15.0, 카탈폴시드 2.30 내지 2.45, 피크로시드 Ⅱ 1, 이소바닐로일 카탈폴 1.20 내지 1.35 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2.00 내지 2.10의 중량배합비, 보다 바람직하게는, 베르프로시드 14.50 내지 14.99, 카탈폴시드 2.35 내지 2.43, 피크로시드 Ⅱ 1, 이소바닐로일 카탈폴 1.25 내지 1.34 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2.01 내지 2.09의 배합비로 함유됨을 특징으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 건조 상태의 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum)에 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30~80% 에탄올을 가하여 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 20℃ 내지 90℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 냉침 추출법, 초음파 추출법, 환류 냉각 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법, 환류추출법 또는 이들의 하나 이상의 추출법 조합으로부터 선택된 추출법, 바람직하게는 냉침 추출법후 초음파 추출법을 연속적으로 수행하는 추출법, 보다 바람직하게는 10℃ 내지 60℃, 바람직하게는 20℃ 내지 50℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 냉침추출후 40℃ 내지 120℃, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 환류 냉각 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 회수하여 제 1차 추출액을 수득하는 제 1단계; 상기 1단계의 제 1차 추출액을 감압농축하고 농축한 농축액에 상기 농축액 부피의 약 0.5 내지 10배 부피(v/v), 바람직하게는, 약 1 내지 5배 부피(v/v)의 증류수를 포함한 물을 가하여 현탁시키고 상기 현탁액 부피의 약 0.5 내지 20배 부피(v/v), 바람직하게는, 약 1 내지 10배 부피(v/v)의 부탄올을 가하여 부탄올 가용 분획을 회수하고 감압 농축하여 1차 정제된 부탄올 분획 정제물을 수득하는 제 2단계; 상기 2단계에서 수득한 부탄올 분획 정제물을 역상 분배 크로마토그래피법(Reverse phase partition chromatography), 순상 크로마토그래피법(Normal phase partition chromatography), 이온교환 크로마토그래법(ion exchange chromatography), 크기 배제 크로마토그래피법 (size exclusion chromatography) 또는 이들의 하나 이상의 조합으로 구성된 추가 정제방법을 수행하는 제 3단계 공정을 포함하는 제조방법으로 제조되고, 베르프로시드 30 내지 60 중량%, 베라트릭산 0.5 내지 10 중량%, 카탈폴시드 2 내지 20 중량%, 피크로시드 Ⅱ 1 내지 10 중량%, 이소바닐로일 카탈폴 1 내지 10 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2 내지 20 중량%을 포함하는 항염, 항알레르기 또는 항천식활성을 갖는 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)을 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 건조 상태의 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum)에 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30~80% 에탄올을 가하여 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 20℃ 내지 90℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 냉침 추출법, 초음파 추출법, 환류 냉각 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법, 환류추출법 또는 이들의 하나 이상의 추출법 조합으로부터 선택된 추출법, 바람직하게는 냉침 추출법후 초음파 추출법을 연속적으로 수행하는 추출법, 보다 바람직하게는 10℃ 내지 60℃, 바람직하게는 20℃ 내지 50℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 냉침추출후 40℃ 내지 120℃, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 6시간 내지 48시간 동안 환류 냉각 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 회수하여 제 1차 추출액을 수득하는 제 1단계; 상기 1단계의 제 1차 추출액을 감압농축하고 농축한 농축액에 상기 농축액 부피의 약 0.5 내지 10배 부피(v/v), 바람직하게는, 약 1 내지 5배 부피(v/v)의 증류수를 포함한 물을 가하여 현탁시키고 상기 현탁액 부피의 약 0.5 내지 20배 부피(v/v), 바람직하게는, 약 1 내지 10배 부피(v/v)의 부탄올을 가하여 부탄올 가용 분획을 회수하고 감압 농축하여 1차 정제된 부탄올 분획 정제물을 수득하는 제 2단계; 상기 2단계에서 수득한 부탄올 분획 정제물을 역상 분배 크로마토그래피법(Reverse phase partition chromatography), 순상 크로마토그래피법(Normal phase partition chromatography), 이온교환 크로마토그래법(ion exchange chromatography), 크기 배제 크로마토그래피법 (size exclusion chromatography) 또는 이들의 하나 이상의 조합으로 구성된 추가 정제방법을 수행하는 제 3단계 공정을 포함하는, 항염, 항알레르기 또는 항천식 활성을 갖는 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)을 제조하는 제조방법을 제공한다.
본원에서 정의되는 추가 정제방법은 (a) 역상 분배 크로마토그래피법(Reverse phase partition chromatography), (b) 순상 분배 크로마토그래피법(Normal phase partition chromatography), (c) 이온교환 크로마토그래법(ion exchange chromatography), (d) 크기 배제 크로마토그래피법 (size exclusion chromatography) 또는 이들의 하나 이상의 조합, 바람직하게는, 역상 분배 크로마토그래피법 또는 극성 물질들을 먼저 용리되고, 비-극성 화합물이 정지상에 보유됨을 특징으로 하는 모든 수지를 이용한 크로마토그래피법, 보다 바람직하게는, 세파덱스(Sephadex), 세파덱스 LH20, 세파덱스 G-25, 세파덱스 G-10, 세파로스(Sepharose), 수퍼덱스(Superdex), 메틸아크릴레이트 수지, 카복시메틸 셀룰로스, 설포프로필 셀룰로스, 카복시메틸 세파덱스, 설포프로필 세파덱스, 설포프로필 세파로스 및 카복시메틸 세파로스를 포함하는 세파덱스 계열 수지; 폴리머(Polymer) X, HP20, PRP-h1 Polymer 등의 스틸렌-디비닐벤젠 공중합체 (Stylene-divinylbenzen co-polymer) 제품군, 메타아크릴레이트 (Methacrylate) 지지체 제품군 등을 이용한 역상폴리머 수지; 머크(Merck)사의 흡착 BPC(Bonded phase Chromatography) 제품군, YMC사의 Silica 제품군, DAISO사의 Silica 제품군, ASAHI사의 Silica 제품군, COSMOSYL사의 Silica 제품군 등의 순상 실리카겔; 주로 HPLC 충진제로 사용되는 YMC사의 ODS 제품군, DAISO사의 ODS 제품군, ASAHI사의 ODS 제품군, CHEMCO사의 ODS 제품군, Merck사의 ODS 제품군, COSMOSYL사의 ODS 제품군, FUJI사의 ODS 제품군 등을 역상 실리카겔군으로부터 선택된 수지를 정지상을 이용한 크로마토그래피법을 수행하는 방법을 포함한다.
구체적으로는 상기 (a) 역상 분배 크로마토그래피법에서,
정지상은 역상 컬럼 물질로서, 극성 물질들을 먼저 용리되고, 비-극성 화합물이 정지상에 보유됨을 특징으로 하는 모든 고정상으로서, 소수성 물질이 부착될 수 있는 고정상, 바람직하게는, 실리카겔(Silica Gel) 기반 고정상 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 등의 고분자 기반 고정상, 보다 바람직하게는 C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C16, 또는 C18 또는 이의 실리카겔 유도체 또는 PS-2, Oasis HLB, 등의 고분자 기반 고정상, 보다 바람직하게는, 역상 실리카겔 (C18(IV)-D), (YMC사의 ODS-A/ODS-AQ 제품군, CHMECO사의 SP-C-ODS 제품군, DAISO사의 SP-ODS-RPS 제품군, COSMOSYL사의 5C18 제품군, FUJI사의 Chromatorex 제품군) 을 사용함을 특징으로 한다.
이동상은 증류수, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 알콜 용매, 테트라히드로퓨란 또는 이의 혼합용매, 바람직하게는, 증류수 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 알콜 용매의 혼합용매, 보다 바람직하게는, 물 및 메탄올 혼합용매를 90:10 (v/v)을 시작하여 60:40의 비율을 조절하여 극성 물질을 용리함을 특징으로 한다.
구체적으로는 상기 (b) 순상 크로마토그래피법에서는
정지상은 순상 컬럼 물질로서, 비극성 물질들을 먼저 용리되고, 극성 화합물이 정지상에 보유됨을 특징으로 하는 모든 고정상으로서, 친수성 물질이 부착될 수 있는 고정상, 바람직하게는, 실리카겔(Silica Gel), 후로리실(Fluorosyl), 알루미나 기반 고정상, CN, 디올, NH2 성 고정상, 보다 바람직하게는 역상 실리카겔 또는 이의 실리카겔 유도체, 보다 더 바람직하게는, 역상 실리카겔 (C18(IV)-D), (YMC사의 ODS-A/ODS-AQ 제품군, CHMECO사의 SP-C-ODS 제품군, DAISO사의 SP-ODS-RPS 제품군, COSMOSYL사의 5C18 제품군, FUJI사의 Chromatorex 제품군)을 사용함을 특징으로 한다.
이동상은 헥산, 헵탄, 초산에틸, 에탄올, 디에틸에테르, 2-프로판올 또는 이의 혼합용매를 사용함을 특징으로 한다.
구체적으로는 상기 (c) 이온교환 수지 컬럼크로마토그래법(Ion Exchange resin columm Chromatography)에서는
"이온 교환 크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 작용기로서 공유 결합된 하전된 기를 갖는 부동의 모든 고분자량 고형상을 사용가능하며; 바람직하게는, 양이온교환수지, 음이온교환수지, 또는 합성 흡착제를 사용한 크로마토그래피법, 보다 바람직하게는, AG 50W-x8, 앰버라이트 (Amberlite) IR-120, 도웩스(Dowex) 50W-x8 및 SK1B 등과 같은 강산성 양이온 교환수지; 앰버라이트(Amberlite) IRC-50, 바이오-렉스(Bio-Rex) 70, 듀올라이트 (Duolite)-436 및 WK40 등과 같은 약산성 양이온 교환수지; 앰버라이트(Amberlite) IRA-67 및 도웩스(Dowex) 3-x4A 등과 같은 약염기성 양이온 교환수지; DIAION SK1B, DIAION PK216, DIAION CR11, DIAION CR20, DIAION UBK555(Mitsubishi Chemical co.), TRILITE SPC 160H, TRILITE SPC 180H, TRILITE SPC 400LH(Samyang co.), AMBERLITE 200C Na, AMBERLITE CG50, AMBERLITE CR1310 Na, AMBERJET 200H, AMBERLYST 131 WET, AMBERLYST 232 WET(ROHM and HAAS co.), Lewatit VP OC 1800, Lewatit VP OC 1812, Lewatit MDS1368 Na, Lewatit K1221(Bayer co.), PUROLITE PCR833CA, PUROLITE C145(Purolite co.), MFG 210, MFG 250(Finex co.)등의 강염기성 양이온 교환 수지; 보다 바람직하게는 강산성 양이온 교환수지인 SK1B형 교환수지를 사용할 수 있으며; 음이온교환수지로는 SA11A, SA20A 및 SA21A 등과 같은 강염기성 음이온 이온교환수지, CaptoQ (GE Healthcare로부터 구입가능), 또는 유사한 특징을 갖는 수지, 예를 들어, ToyoPearl QEA(Tosoh로부터 구입가능), Q Sepharose FF(GE Healthcare로부터 구입가능) 또는 Fractogel EMD, Fractogel TMAE 또는 Fractogel HICAP(Merck KGaA,Darmstadt Germany로부터 구입가능), 보다 더 바람직하게는 SA21A를 사용할 수 있으며; 합성흡착제로는 SP207, HP20SS, HP 20 등, 바람직하게는 HP20을 사용할 수 있다.
구체적으로는 상기 (d) 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에서는,
겔은 전형적으로 덱스트란-기반 겔, 예를 들어, Sephadex(예를 들어, Sephadex G-25) 또는 폴리아크릴아미드 겔, 예를 들어, Sephacryl(예를 들어, Sephacryl-S400), 아가로오스-기반 겔, 예를 들어, Superose 또는 Sepharose(예를 들어, Sepharose CL-4B),및 2 종류의 겔로부터 제조된 복합 겔, 예를 들어, Superdex 200 조합 Dextran(Sephadex™) 및 가교된 Agarose(Superose™) 겔을 포함하나 이에 제한되지는 않는 중합 겔 군으로부터 선택되며; 바람직한 구체예에서, 완충액은 소듐 포스페이트, 암모늄 아세테이트, MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), Bis-Tris (2-비스(2-히드록시에틸)아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올), ADA (N-(2-아세트아미도) 이미노디아세트산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산), ACES (N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산), BES (N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산), TES (N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산), HEPES (N-2-히드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄설폰산), 바람직하게는 소듐포스페이트 또는 암모늄 아세테이트, 더욱 바람직하게는 암모늄 아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또한 본 발명은 추가적으로 상기 (a) 역상 분배 크로마토그래피법(Reverse phase partition chromatography), (b) 순상 분배 크로마토그래피법(Normal phase partition chromatography), (c) 이온교환 크로마토그래법(ion exchange chromatography), (d) 크기 배제 크로마토그래피법 (size exclusion chromatography) 또는 이들의 하나 이상의 조합이외에 유기용매의 사용이 가능한 Sephadex LH-20이나 Toyopearl HW-40을 이용한 (e) 겔 침투(Gel permeation) 또는 겔 여과 크로마토그래피 (Gel filtration chromatography)을 추가적으로 사용가능하다.
한편, 구체적인 다른 실시예에서, 산꼬리풀 조추출물(ATE)은 베르프로시드 5.9 w/w%, 베라트릭산 0.21 w/w%, 카탈폴시드 0.82 w/w%, 피크로시드 Ⅱ 0.40 w/w%, 이소바닐로일 카탈폴 0.42 w/w% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 0.74 w/w%를 함유하고 있음을 확인하였고,(참고예 1)
산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum ) 유래 부탄올 분획 정제물(ATC1)은 베르프로시드 17.60 w/w%, 베라트릭산 0.72 w/w%, 카탈폴시드 2.62 w/w%, 피크로시드 Ⅱ 1.08 w/w%, 이소바닐로일 카탈폴 1.26 w/w% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2.36 w/w%를 함유하고 있음을 확인하였다(실시예 1).
본 발명에 따른 산꼬리풀 유래 2차 분획 정제물(ATC2)은 베르프로시드 43.83 w/w%, 베라트릭산 1.80 w/w%, 카탈폴시드 7.07 w/w%, 피크로시드 Ⅱ 2.93 w/w%, 이소바닐로일 카탈폴 3.85 w/w% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 6.15 w/w%를 함유하고 있음을 확인하였다 (실시예 2).
산꼬리풀을 본 발명에 따른 방법으로 추출, 분획 및 정제함으로써, 상기 카탈폴 유도체를 36.5 중량% 내지 91 중량%나 함유하는 산꼬리풀 유래 신규 정제물을 제조할 수 있었다.
본 발명에 따른 산꼬리풀 정제물은 호산구와 염증세포의 수, IgE의 수치 및 각종 사이토카인(IL-1β, IL-4, IL-5, IL-13)의 농도를 감소시키며, 또한 배상세포의 증식을 억제하므로 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 상기 신규 정제물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 상기 신규 정제물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유한 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에서 산꼬리풀은 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 산꼬리풀 추출물 또는 이의 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 열풍 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 산꼬리풀 정제물은, 베르프로시드를 30 내지 50 중량%, 베라트릭산을 1 내지 5 중량%, 카탈폴시드를 1.5 내지 10 중량%, 피크로시드 Ⅱ를 1 내지 6 중량%, 이소바닐로일 카탈폴을 1 내지 10 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴을 2 내지 10 중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 베르프로시드, 피크로시드 Ⅱ, 카탈폴시드, 이소바닐로일 카탈폴 및 6-O-베라트로일 카탈폴은, 카탈폴 구조를 모핵으로 하는 카탈폴 유도체들로서, 산꼬리풀 전초에 포함되어 있는 물질들이다.
그러나, 산꼬리풀 식물 중 포함된 상기 카탈폴 유도체들의 함량은 매우 소량이기 때문에, 산업상 이용되기 매우 부적절한 측면이 있었다. 이에, 본 발명자들은 고함량의 카탈폴 유도체를 포함하는 제조방법을 예의 연구한 결과, 산꼬리풀을 본 발명에 따른 방법으로 추출, 분획 및 정제함으로써, 상기 카탈폴 유도체를 36.5 중량% 내지 91 중량%나 함유하는 산꼬리풀 정제물을 제조할 수 있었다.
본원에서 정의되는 "염증"이란 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 정의되는 “알레르기”는 과민증, 알러지성 비염, 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 식품알러지 또는 약품 알러지, 바람직하게는 알러지성 비염, 천식, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 식품 알러지 또는 약품 알러지, 보다 바람직하게는 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염을 포함한다.
본원에서 정의되는 "천식"이란 집먼지 진드기, 꽃가루, 동물 털이나 비듬, 바퀴벌레, 식품, 약물, 감기, 담배연기와 실내오염, 대기오염, 식품첨가제, 운동 등 신체적 활동, 기후 변화, 황사, 스트레스 등에 기인한 기관지 천식을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 산꼬리풀 정제 분획물을 포함하는 조성물의 투여로 염증, 알레르기 또는 천식을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 산꼬리풀 정제 분획물을 포함하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 상기 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 상기 신규 정제물을 염증, 알레르기 및 천식환자에게 투여함을 포함하는 염증, 알레르기 및 천식을 치료하기 위한 치료방법을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 염증, 알레르기 및 천식환자를 치료하기 위한 치료제 제조를 위한 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 상기 신규 정제물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 정제물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 정제물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무,알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 봉해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 및 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다.
상기한 제제에는 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 정제물을 포함하는 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 정제물을 포함하는 약학조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 정제물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 상기 신규 정제물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 정제물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.
또한, 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
또한, 본 발명은 염증, 알레르기 및 천식의 예방 및 개선효과를 갖는 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var subintegrum) 추출물로부터 분리된 상기 신규 정제물을 주성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 염증, 알레르기 및 천식의 예방 및 개선효과를 갖는 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 상기 신규 정제물을 주성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가물을 제공한다.
또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 정제물이 포함된 기능성 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 정제물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 정제물은 목적 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출 정제물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖ 을 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g 의 비율로 가할 수 있다.
상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 정제물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
본 발명에 따른 산꼬리풀 정제물은 본 발명에 따른 제조방법을 통하여 함량이 현저하게 증강된, 고함량의 카탈폴 유도체를 포함하고 있으며, 대량생산도 가능한 우수한 제조방법을 제공할뿐만 아니라, 마우스 난백알부민-유도 천식 동물모델에서 호산구의 증가, 면역글로불린 및 염증성 케모카인의 분비를 효과적으로 억제하는 활성을 가져, 궁극적으로 염증, 알레르기 및 천식 질환의 예방 또는 치료제로 널리 활용될 수 있다.
도 1은 산꼬리풀 조추출물(ATE)의 HPLC 분석 실험 결과이며;
도 2는 산꼬리풀 부탄올 분획 정제물 (ATC1)의 HPLC 분석 실험 결과이며;
도 3는 산꼬리풀 2차 분획 정제물 (ATC2)의 HPLC 분석 실험 결과이며;
도 4는 천식동물모델에서 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)의 호흡률 억제효과를 측정한 결과이며;
도 5는 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)의 세포세척액 내 염증세포수 억제효과를 측정한 결과이며;
도 6는 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)의 혈청내 총 IgE 억제효과를 측정한 결과이며;
도 7는 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)의 혈청내 OVA특이적 IgE 억제효과를 측정한 결과이며;
도 8는 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)의 IL-1beta 억제효과를 측정한 결과이며;
도 9, 10, 11은 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)의 사이토카인 억제효과를 측정한 결과이며;
도 12, 13은 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)의 조직내 염증세포수 억제효과를 측정한 결과이며;
도 14, 15는 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)의 조직내 점액분비 억제효과를 측정한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: 산꼬리풀 조추출물의 제조 및 지표성분의 확인
1-1. 에탄올 추출물의 제조(ATE)
산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum = Veronica rotunda var. subintegra) 전초 (GAP 재배, 충북 음성군 소이면 비산리 244번지) 1.0 kg을 건조, 절단한 후, 산꼬리풀 전초 시료에 40% 에탄올 10 L를 가하여 상온에서 24시간 동안 냉침 추출하였다. 그 후, 78℃에서 12시간 교반하면서 환류 추출을 수행한 후 진공여과하여 상층액을 회수하였다. 상기 과정을 2회 반복하여 상층액을 회수하고 이 추출액을 감압농축기(EYELA, N-2100, JAPAN)로 감압 농축하여 산꼬리풀 40% 에탄올 조추출물 202 g 을 수득하였다. (이하 “ATE" 라 함)
1-2. 메탄올 추출물의 제조(ATM)
산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum = Veronica rotunda var. subintegra) 전초 (GAP 재배, 충북 음성군 소이면 비산리 244번지) 1.1 kg을 건조, 절단한 후, 산꼬리풀 전초 시료에 메탄올 5 L를 가하여 상온에서 24시간 동안 냉침 추출하였다. 그 후, 78℃에서 12시간 교반하면서 환류 추출을 수행한 후 진공여과하여 상층액을 회수하였다. 상기 과정을 2회 반복하여 상층액을 회수하고 이 추출액을 감압농축기(EYELA, N-2100, JAPAN)로 감압 농축하여 산꼬리풀 메탄올 조추출물 100.5 g 을 수득하였다. (이하 “ATM" 라 함)
상기에서 수득한 산꼬리풀 조추출물 중에 포함된 지표성분들을 확인하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, Agilent 1260, USA)를 하기 표 1과 같은 조건으로 수행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
HPLC 조건
고속액체크로마토그래피 분석조건
펌프(Pump) Agilent 1260 Series, 1260 quart pump
검출기(Detector) Agilent 1260 Series, 1260 DAD
컬럼(Column) Agilent Eclipse XDB C18, 4.6x50mm, 5μm
유속(Flow rate) 1.5ml/min
검출파장(UV absorbance) 266nm
이동상 이동상 A : 인삼염완충용액 (pH = 3.5)
이동상 B : 메탄올
시간 이동상 A (%) 이동상 B (%)
0~5 80 20
5~20 75 25
20~25 75 25
25~30 55 45
30~35 55 45
35~36 80 20
36~40 80 20
Injection volume 10μl
그 결과, 도 1에 나타나듯이 9.548분에 베르프로시드, 10.817분에 베라트릭산, 16.728분에 카탈폴시드, 20.346분에 피크로시드 Ⅱ, 21.853분에 이소바닐로일 카탈폴 및 30.462분에 6-O-베라트로일 카탈폴이 검출되는 것을 확인되었다.
도 1에 나타난 HPLC의 패턴(머무름 시간)을 바탕으로 하기 수학식 1에 따라 지표성분들의 함량(%)을 분석하였다.
Figure 112013064435224-pat00001
AT : 검액에서의 지표성분 면적
AS : 표준액에서의 지표성분 면적
단, 검액과 표준액의 지표성분에 대한 취한량이 동일할 때 사용함.
그 결과, 참고예 1의 제조방법으로 제조한 산꼬리풀 조추출물(ATE)은 하기 표 2과 같이 베르프로시드 5.9 w/w%, 1베라트릭산 0.21 w/w%, 카탈폴시드 0.82 w/w%, 피크로시드 Ⅱ 0.40 w/w%, 이소바닐로일 카탈폴 0.42 w/w% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 0.74 w/w%를 함유하고 있음을 확인하였다.
지표성분 조추출물(ATE)
머무름시간(분) 함량(w/w%)
베르프로시드 9.548 5.90
베라트릭산 10.817 0.21
카탈폴시드 16.728 0.82
피크로시드 II 20.346 0.40
이소바닐로일 카탈폴 21.853 0.42
6-O-베라트로일 카탈폴 30.462 0.74
합계 8.49
실시예 1: 산꼬리풀 추출물의 유기용매 가용분획물 제조 및 지표성분의 확인
상기 종래 추출방법으로 제조한 참고예 1의 제조방법으로 제조한 산꼬리풀 조추출물을 증류수 2L에 현탁시키고, 상기 현탁물에 2L의 부탄올을 가하여 혼합한 후에 부탄올 가용 분획부 및 수가용성 분획부를 분획하였다. 상기한 부탄올 분획부를 여과 및 감압농축하여 용매를 제거하여 정제된 산꼬리풀 부탄올 분획 정제물 82g 을 수득하였다. (이하, ATC1이라 함)
상기 산꼬리풀 부탄올 분획 정제물 중에 포함된 지표성분들을 확인하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2에 나타나듯이 9.545분에 베르프로시드, 10.821분에 베라트릭산, 16.727분에 카탈폴시드, 20.345분에 피크로시드 Ⅱ, 21.853분에 이소바닐로일 카탈폴 및 30.462분에 6-O-베라트로일 카탈폴이 검출되는 것을 확인되었다.
도 2에 나타난 HPLC의 패턴(머무름 시간)을 바탕으로 참조예 1의 수학식에 따라 지표성분들의 함량(%)을 분석하였다. 그 결과, 실시예 1의 제조방법으로 제조한 산꼬리풀 부탄올 분획 정제물은 하기 표 3와 같이 베르프로시드 17.60 w/w%, 베라트릭산 0.72 w/w%, 카탈폴시드 2.62 w/w%, 피크로시드 Ⅱ 1.08 w/w%, 이소바닐로일 카탈폴 1.26 w/w% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2.36 w/w%를 함유하고 있음을 확인하였다.
지표성분 ATC1 정제물
머무름시간(분) 함량(%)
베르프로시드 9.545 17.60
베라트릭산 10.821 0.72
카탈폴시드 16.727 2.62
피크로시드 II 20.345 1.08
이소바닐로일 카탈폴 21.853 1.26
6-O-베라트로일 카탈폴 30.462 2.36
합계 25.64
실시예 2: 산꼬리풀 추출물의 2차 분획 정제물(ATC2)의 제조 및 지표성분의 확인
상기 실시예 1에서 제조한 산꼬리풀 부탄올 분획 정제물을 증류수:메탄올 (1:0.03) 75㎖ 용매에 녹인 후, 이 용해물을 역상 실리카겔 (C18(IV)-D-75-120nm, AGC Si-Tech Co., Ltd. JAPAN) 450g 을 컬럼관에 충진시킨 후, 충진된 컬럼에 상기 산꼬리풀 부탄올 분획 정제물 75g 을 통과시켜 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)을 분리하였다. 분리를 위한 이동상 조성은 증류수:메탄올 (90:10 부터 60:40)의 비율을 조절하여 분리를 실시하였다. 먼저 증류수:메탄올 (90:10) 용리액 8.4L 를 감압 하에서 분리한 후, 증류수:메탄올 (60:40) 용리액 5.6L를 같은 조건에서 분리진행 후, 용리액 5.6L를 감압농축과정을 통한 용매 제거 후, 최종적으로 정제된 산꼬리풀 2차 분획 정제물을 33g 분리하였다.(이하, ATC2이라 함)
수득한 산꼬리풀 2차 분획 정제물 중에 포함된 지표성분들을 확인하기 위하여 참고예 1의 조건으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타나듯이 9.525분에 베르프로시드, 10.818분에 베라트릭산, 16.721분에 카탈폴시드, 20.346분에 피크로시드 Ⅱ, 21.857분에 이소바닐로일 카탈폴 및 30.462분에 6-O-베라트로일 카탈폴이 검출되는 것을 확인되었다.
도 3에 나타난 HPLC의 패턴(머무름 시간)을 바탕으로 참조예 1의 수학식에 따라 지표성분들의 함량(%)을 분석하였다. 그 결과, 실시예 2의 제조방법으로 제조한 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)은 하기 표 4과 같이 베르프로시드 43.83 w/w%, 베라트릭산 1.80 w/w%, 카탈폴시드 7.07 w/w%, 피크로시드 Ⅱ 2.93 w/w%, 이소바닐로일 카탈폴 3.85 w/w% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 6.15 w/w%를 함유하고 있음을 확인하였다.
지표성분 ATC2 정제물
머무름시간(분) 함량(%)
베르프로시드 9.524 43.83
베라트릭산 10.818 1.80
카탈폴시드 16.721 7.07
피크로시드 II 20.346 2.93
이소바닐로일 카탈폴 21.857 3.85
6-O-베라트로일 카탈폴 30.462 6.15
합계 65.63
실험예 1. 기관지 천식 유도 동물모델 예비 실험 으로부터 혈청내 총 IgE 농도 측정
기관지 천식 유도 실험동물을 제작하기 위하여, 평균 체중 20g 내외의 6주령 Balb/c 암컷 생쥐를 실험동물로 사용하였다. 실험 동물들은 1주간의 적응기간을 가진 후에 기본적인 신체검사 상에서 이상이 관찰되지 않는 개체를 대상으로 하였다. 2주 간격으로 2㎎의 수산화알루미늄(A8222, Sigma, St. Louis, MO)과 난백알부민 20 ㎍(A5503, Sigma, St. Louis, MO)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4) 200 μL를 복강에 주입하여 감작시켰다. 첫 번째 난백알부민(OVA) 복강투여 후, 28일부터 34일까지 7일 동안 1% 난백알부민을 초음파분무기를 이용하여 30 분간 흡입시켰다. 마지막 항원 투여 후 24시간 뒤에 기도과민성을 측정하였고 48 시간 뒤에 치사량의 펜토바비탈(엔토발, 한림제약주식회사)을 투여한 뒤 체중을 측정하였고, 기관지 절개를 실시하여 총 1.2 mL의 생리식염수로 기관지 폐포 세척을 실시한 뒤 검체를 수거하였다.
정상 대조군(NC)으로 난백알부민을 비투여 및 비흡입한 군, 천식 유도군(OVA)으로 난백알부민을 투여 및 흡입하여 기관지 천식을 유도한 군, 비교군으로 난백알부민 흡입 1시간 전에 천식치료제인 몬테루카스트(montelukast; 30 ㎎/㎏, PO, 시그마알드리치코리아, SML-0101)를 경구투여한 군(M30)을 준비하였다.
한편 본 발명에 따른 산꼬리풀 메탄올 추출물( ATM ) 및 부탄올 분획 정제물 ( ATC1 ) 은 난백알부민 흡입 1시간 전에 각각 5㎎/㎏, 10㎎/㎏, 25㎎/㎏, 및 50㎎/㎏을 경구투여한 군(각각 ATC1-5, ATC1-10, ATC1-25, 및 ATC1-50)을 준비하여 실험을 진행하였으며 각 군당 6 마리의 흰쥐를 사용하였다.
그 결과, 혈청 내의 총 IgE 항체의 농도는 천식 유도군(OVA)에서 현저하게 증가하였다. 실험 결과 산꼬리풀 BuOH분획 정제물(ATC1) 처리군(30 및 100mg/kg)에서는 산꼬리풀 MeOH 추출물 처리군(ATM, 30 및 100mg/kg) 에 비해 총 IgE의 농도가 더욱 감소하는 것을 확인할 수 있었다(표 5 참조)
　 혈청 내 총 IgE (mg/ml)
NC 0.57±0.02
OVA 5.23±0.34
ATC1 30mg/kg 2.05±0.12
100mg/kg 2.14±0.25
ATM 30mg/kg 3.09±0.54
100mg/kg 2.49±0.35
Monte30 1.82±0.40
실험예 2: 기관지 천식 유도 동물모델을 이용한 항천식 활성
상기 실시예에서 수득한 시료들의 항 천식활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 천식 발생에 의한 기도과민반응 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Elias, J.A, et al., J Clin Invest, 111, 291-297, 2003)
2.1. 기관지 천식 유도 동물모델의 제작 및 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)의 처리
기관지 천식 유도 실험동물을 제작하기 위하여, 평균 체중 20g 내외의 6주령 Balb/c 암컷 생쥐를 실험동물로 사용하였다. 실험 동물들은 1주간의 적응기간을 가진 후에 기본적인 신체검사 상에서 이상이 관찰되지 않는 개체를 대상으로 하였다. 2주 간격으로 2㎎의 수산화알루미늄(A8222, Sigma, St. Louis, MO)과 난백알부민 20 ㎍(A5503, Sigma, St. Louis, MO)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4) 200 μL를 복강에 주입하여 감작시켰다. 첫 번째 난백알부민(OVA) 복강투여 후, 28일부터 34일까지 7일 동안 1% 난백알부민을 초음파분무기를 이용하여 30 분간 흡입시켰다. 마지막 항원 투여 후 24시간 뒤에 기도과민성을 측정하였고 48 시간 뒤에 치사량의 펜토바비탈(엔토발, 한림제약주식회사)을 투여한 뒤 체중을 측정하였고, 기관지 절개를 실시하여 총 1.2 mL의 생리식염수로 기관지 폐포 세척을 실시한 뒤 검체를 수거하였다.
정상 대조군(NC)으로 난백알부민을 비투여 및 비흡입한 군, 천식 유도군(OVA)으로 난백알부민을 투여 및 흡입하여 기관지 천식을 유도한 군, 비교군으로 난백알부민 흡입 1시간 전에 천식치료제인 몬테루카스트(montelukast; 30 ㎎/㎏, PO, 시그마알드리치코리아, SML-0101)를 경구투여한 군(M30)을 준비하였다.
한편 본 발명에 따른 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2)은 난백알부민 흡입 1시간 전에 각각 5㎎/㎏, 10㎎/㎏, 25㎎/㎏, 및 50㎎/㎏을 경구투여한 군(각각 ATC5, ATC10, ATC25, 및 ATC50)을 준비하여 실험을 진행하였으며 각 군당 6 마리의 흰쥐를 사용하였다.
2.2. 천식 발생에 의한 기도과민반응 평가
천식에 의한 기도과민반응을 측정하기 위하여 단일 챔버 체적변동 측정기(one chamber whole body plethysmography, OCP3000; All Medicus, 서울,한국)를 사용한 기도 저항을 측정하고 수학적으로 계산된 기도의 폐색을 반영하는 수치인 펜(Penh; enhanced pause) 수치를 측정하였다. 펜 수치는 정상 호흡 상태에서 기저값을 측정한 후 PBS를 초음파분무기(Ultrasonic Nebulizer, NE-U12,OMRON Corp., Tokyo, Japan)를 이용하여 3분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다.
이후, 기관지 천식을 진단하는 일반적인 방법에서 사용되는 메타콜린(A2251, Sigma, St. Louis, MO)을 12, 25 및 50㎎/㎖의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후에 펜 수치를 측정하였다. 각 농도의 메타콜린을 흡입시킨 후 펜 수치의 증가를 백분율로 표현하고, 기저 펜 수치(식염수 흡입)는 100%로 표시하였다. 펜 수치의 계산 방법은 하기 수학식 2과 같이 계산하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
Figure 112013064435224-pat00002
Te : 호기 시간(expiratory time)(초), 흡기에서 다음 흡기까지 걸리는 시간
RT : 이완 시간(relaxation time), 호기 동안 호기양이 일회호흡양의 30%가 남을 때까지 걸리는 시간
PEF : 최대 호기률(Peak expiration flow)
PIF : 최대 흡기률(Peak inspiration flow)
그 결과, 도 4에 나타나듯이, 정상 대조군(NC)에서는 메타콜린 농도 증가에 따라 완만하게 펜 수치가 증가하는 것을 확인하였으나, 천식 유도군(OVA)에서는 유의성 있게 펜 수치가 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
반면, 몬테루카스트 투여군(M30, 30mg/kg)과 산꼬리풀 정제 분획물 처리군(ATC10, ATC25, 및 ATC50→ ATC10, ATC25, 및 ATC50)에서는 메타콜린 농도에 상관없이 펜 수치가 천식 유도군(OVA)보다 유의하게 감소하였다.(표 6 참조)
기도과민반응에 의한 펜 수치
Methacholine
(Conc. ㎎/㎖)		 0 12.5 25 50
NC 0.37± 0.03 0.39± 0.04 0.69± 0.14 1.07± 0.18
OVA 0.85± 0.10 2.79± 0.25 5.99± 0.92 7.24± 0.74
ATC2
(mg/kg)		 5 0.52± 0.05 1.69± 0.27 2.68± 0.52 5.19± 0.74
10 0.63± 0.06 1.54± 0.18 2.01± 0.52 3.08± 0.40
25 0.64± 0.08 1.31± 0.17 1.64± 0.31 2.43± 0.33
50 0.51± 0.06 1.02± 0.17 1.36± 0.09/ 1.82± 0.28
M30 0.49± 0.04 1.54± 0.20 1.98± 0.37 2.51± 0.36
이러한 차이는 저농도의 메타콜린보다는 고농도의 메타콜린을 흡입시켰을 때 더욱 뚜렷한 차이를 나타내었다.
또한 산꼬리풀 정제물은 동일 농도의 메타콜린에 대하여 농도 의존적으로 펜 수치를 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
이로써 본 발명에 따른 산꼬리풀 정제물이 기도 과민반응을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었고, 알레르기성 기도 과민 반응이 병리학적 특징인 천식 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 3. 기관지 폐포 세척액 내 염증세포 평가
상기 실시예에서 수득한 시료들의 항 천식활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 기관지 폐포 세척액 내 염증세포 평가 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Chen M et al, Immunology, p376-84, 2011)
기관지 폐포 세척액 내 염증세포 수를 확인하기 위하여 실험예 2에서 준비한 각각의 마우스의 기관지 폐포 세척액을 회수하고, 즉시 트립판 블루(Trypan blue, T8154, Sigma)로 염색하여 죽은 세포를 제외한 총 세포수를 혈구계수기(hemocytometer, MIS-1401, Superior)을 이용하여 계산한 다음 세포 포집용 원심분리기(Cellspin, Cyto12.5+clip5, 한일과학산업)를 이용하여 표본 도말 후, 디프-퀵(Diff-Quick) 염색(Sysmex, Switzerland)을 수행하여 호산구와 그 외의 염증세포를 감별 계산하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 호산구와 총 염증세포의 수는 정상 대조군(NC)에 비해 유의성있게 천식유도군 (OVA)에서 증가하였으며 증가된 호산구와 총 염증세포의 수는 몬테루카스트 투여군(M30, 30mg/kg)과 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2) 처리군(5, 10, 25, 및 50mg/kg)에서 모두 유의성있게 감소한 것을 확인하였다. (표 7 참조)
기관지 폐포 세척액 내 호산구 및 총 염증세포
Methacholine
(Conc. ㎎/㎖)		 0 12.5 25 50
NC 0.37± 0.03 0.39± 0.04 0.69± 0.14 1.07± 0.18
OVA 0.85± 0.10 2.79± 0.25 5.99± 0.92 7.24± 0.74
ATC2
(mg/kg)		 5 0.52± 0.05 1.69± 0.27 2.68± 0.52 5.19± 0.74
10 0.63± 0.06 1.54± 0.18 2.01± 0.52 3.08± 0.40
25 0.64± 0.08 1.31± 0.17 1.64± 0.31 2.43± 0.33
50 0.51± 0.06 1.02± 0.17 1.36± 0.09 1.82± 0.28
M30 0.49± 0.04 1.54± 0.20 1.98± 0.37 2.51± 0.36
실험예 4. 혈청 내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 농도 측정
상기 실시예에서 수득한 시료들의 항 천식활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 혈청 내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 농도 측정 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Kay, A.B. The New England Journal of Medicine, 344, 30-37, 2001)
천식의 중증도와 상관관계가 있는 IgE와 난백알부민 특이 IgE 농도를 측정하기 위하여 혈청에서 면역효소 반응 방법을 이용하였다.
각 군에서 채취한 혈청 및 기관지 폐포 세척액을 96-웰 플레이트(ELISA 플레이트)에 난백알부민(OVA, Sigma, MO, USA)을 20㎍/mL의 농도로 pH 8.3의 0.1 M NaHCO3 완충액에 녹여 4℃에서 밤샘 코팅시킨 후, 1% 소혈청 알부민이 함유된 PBS로 비특이 반응을 억제시킨 후, 혈청 검체를 1:400으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이를 세척한 후 항-마우스 IgE 단일클론성 항체(MCA419, Serotec, Oxford, UK)를 300배 희석하여 2시간 반응시킨 후 과산화효소가 결합된 HRP-결합 염소 항-래트 IgG 다중클로성 A(HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal A,STAR110P, Serotec, Oxford, UK)를 4000배 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 세척하였다. 발색은 3,3',5,5'-테트라메틸벤자이딘(3,3',5,5'-tetramethylbezidine(52-00-02, KPL)) 기질로 반응시킨 후, 2N 황산용액으로 반응을 정지시킨 후, 450 nm에서 흡광도 측정기기(Versamax, Molecular Devices, US)를 이용하여 분광 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이 혈청 내의 IgE 항체와 난백알부민 특이 IgE 항체의 농도는 천식 유도군(OVA)에서 현저하게 증가하였다. 반면, 몬테루카스트 투여군(M30, 30mg/kg)과 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2) 처리군(5, 10, 25, 및 50mg/kg)에서는 IgE 항체와 난백알부민 특이 IgE 항체의 농도가 유의성있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(표 8 참조).
혈청 내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 농도
농도 (μg/mL) 혈청 내 IgE 난백알부민 특이 IgE 농도
NC 0.92± 0.17 0.05± 0.00
OVA 7.68± 0.42 0.17± 0.02
ATC2 (mg/kg) 5 6.51± 0.72 0.13± 0.01
10 4.97± 0.91 0.10± 0.01
25 4.56± 0.73 0.09± 0.02
50 4.01± 0.67 0.08± 0.01
M30 4.76± 0.73 0.09± 0.02
따라서 산꼬리풀 정제 분획물은 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 농도를 억제함으로써 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 5. 기관지 폐포 세척액 내 싸이토카인 생성 평가
상기 실시예에서 수득한 시료들의 항 천식활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 기관지 폐포 세척액 내 싸이토카인 생성 평가 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Renz H, et al., J Exp Med, 1777, 1175-1180, 1993)
기관지 폐포에 존재하는 Th2 싸이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-13)과 IL-1β를 측정하기 위하여 문헌에 기재된 샌드위치형 효소면역 반응시험(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 수행하였다. 구체적으로 기관지 폐포 세척액을 사이토카인 항체가 붙어 있는 96웰 플레이트에 넣어 2시간 동안 실온에서 항원-항체 반응을 유도하였다. IL-4, IL-5 및 IL-13의 함량을 측정하기 위하여 각각의 사이토카인에 특이적으로 반응하는 ELISA kit (Biosource Int. CA, USA)를 사용하였으며 제조사의 방법에 따라 각 사이토카인의 함량을 측정하였다.
그 결과, 도 8 및 도 9~11에 나타나듯이 기관지 폐포 세척액 내 IL-1β, IL-4, IL-5, 및 IL-13의 농도는 난백알부민 투여 48 시간 후에 정상 대조군(NC)에 비해 천식 유도군(OVA)에서 유의성있게 증가하였다. 증가한 싸이토카인의 농도는 천식 치료제인 몬테루카스트(M30, 30㎎/㎏) 및 산꼬리풀 2차 분획 정제물(10㎎/㎏, 25 ㎎/㎏, 및 50 ㎎/㎏)의 투여로 유의성있게 감소하는 것을 확인하였다.(표 9 참조)
기관지 폐포 세척액 내 싸이토카인의 농도
농도 (pg/mL) IL-1β IL-4 IL-5 IL-13
NC 94.12± 65.24 20.94± 1.76 57.51± 3.15 22.25± 3.04
OVA 281.78± 26.15 48.76± 6.96 109.48± 2.87 44.76± 4.85
ATC2
(mg/kg)		 5 243.93± 27.58 35.27± 5.26 90.77± 12.78 34.29± 7.55
10 226.33± 14.21 35.18± 4.45 79.26± 9.60 29.50± 2.76
25 190.30± 17.82 29.94± 2.32 73.74± 9.54 27.27± 4.42
50 170.70± 25.43 25.26± 5.55 57.92± 19.99 23.53± 4.10
M30 187.03± 47.17 32.60± 4.53 69.74± 7.17 25.93± 4.13
실험예 6. 조직병리학적 분석
상기 실시예에서 수득한 시료들의 항 천식활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 기관지 폐포 조직의 조직병리학적 분석 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Kwak YG, et al., J Clin Invest, 111, 1083-92, 2003)
염증 세포의 침윤을 확인하기 위하여 상기에서 준비한 각각의 마우스의 기관지 폐포 세척을 수행하지 않은 폐를 적출하여 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거쳐 4㎛ 두께로 영구조직 절편을 제작하여 헤마톡실린(MHS16, Sigma, H3136)과 에이오신(H&E,Eosin Y, T-6766007, Thermo) 염색을 수행하였다. H&E 염색 후 각 개체의 조직 절편당 무작위로 5개 부위의 염증 지수를 측정하여 평균을 내었다.
염증지수(inflammation score) 0은 기관지 주변에 염증세포가 발견되지 않은 경우, 염증지수 1은 간헐적으로 염증 세포가 관찰되는 경우, 염증지수 2는 대부분의 기관지 주변에 얇은 염증세포층이 관찰되는 경우, 염증지수 3은 대부분의 기관지 주변에 두꺼운 염증세포층이 관찰되는 경우로 평가하였다.
그 결과, 도 12, 13에 나타나듯이 천식 유도군(OVA)에서는 세기관지 주변에 호산구를 비롯한 많은 염증세포가 침윤되어 있었으며 과다 증식된 상피 세포와 비후된 기관지 평활근도 확인되었다. 반면 몬테루카스트(M30, 30㎎/㎏) 및 산꼬리풀 2차 분획 정제물(10㎎/㎏, 25㎎/㎏, 및 50㎎/㎏)를 투여한 군에서는 염증 세포의 침윤이 현저하게 감소되었으며 이를 수치화하였을 때 유의성있게 염증 세포 침윤이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(표 10 참조).
기관지 폐포 조직의 염증지수 및 배상세포가 세기관지 상피세포에서 차지하는 비율
조직병리학적 결과 염증지수 PAS+cells/bronchiole (%)
NC 0.06± 0.05 2.19± 0.54
OVA 2.11± 0.07 52.75± 1.42
ATC2 (mg/kg) 5 1.75± 0.17 48.07± 1.15
10 1.33± 0.14 44.59± 1.60
25 1.17± 0.11 38.61± 1.74
50 1.08± 0.18 35.71± 1.14
M30 1.25± 0.13 39.21± 2.34
이로써, 산꼬리풀 정제 분획물이 염증 또는 천식의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 7. 배상세포 증식 평가
상기 실시예에서 수득한 시료들의 항 천식활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 배상세포 증식 분석 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Lee KS et al., FASEB J, 20, 455-465, 2006).
배상세포 수의 증가를 확인하기 위하여 상기에서 준비한 각각의 마우스의 기관지 폐포 세척을 수행하지 않은 폐를 적출하여 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거쳐 4 ㎛ 두께로 영구조직 절편을 제작하여 과요오드산쉬프(Periodic acid Schiff,PAS stain kit, T-K7308, IMEB, CA, USA) 염색을 통해 감별된 배상세포가 기관지 상피세포에서 차지하는 비율을 측정하여 배상세포 증식 정도를 평가하였다.
그 결과, 도 14, 15에 나타나듯이, 정상 대조군(NC)에 있어서, 배상세포가 세기관지 상피세포에서 차지하는 비율은 정상대조군(Nc)에 비해 천식 유도군(OVA)에서 유의성있게 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 몬테루카스트(M30, 30 ㎎/㎏) 및 산꼬리풀 2차 분획 정제물(10 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏, 및 50 ㎎/㎏)를 투여한 군에서는 모두 유의성있게 감소하는 것을 확인하였다.(표 10 참조)
이로써 산꼬리풀 정제 분획물은 배상세포의 증식을 억제함으로써 천식 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (21)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 전체 추출물 100% 중량 대비(w/w) 베르프로시드 30 내지 60 중량%, 베라트릭산 0.5 내지 10 중량%, 피크로시드 Ⅱ 2 내지 20 중량%, 카탈폴시드 1 내지 10 중량%, 이소바닐로일 카탈폴 1 내지 10 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2 내지 20 중량%을 함유함을 특징으로 하는 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 2차 분획 정제물(ATC2).
  6. 카탈폴 유도체 총함량은 카탈폴 유도체를 36.5 중량% 내지 91 중량%나 함유하는 범위이며, 상기 카탈폴 유도체 간의 상대 배합 중량 비(w/w)가 베르프로시드 13.0 내지 16.0, 카탈폴시드 2.20 내지 2.50, 피크로시드 Ⅱ 1, 이소바닐로일 카탈폴 1.10 내지 1.40 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2.00 내지 2.20의 중량 배합비로 함유함을 특징으로 하는 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 2차 분획 정제물(ATC2).
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
    건조 상태의 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum)에 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여 10℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 72시간 동안 냉침 추출법, 초음파 추출법, 환류 냉각 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법, 환류추출법 또는 이들의 하나 이상의 추출법 조합으로부터 선택된 추출법을 1 내지 20회 반복 수행하여 얻은 추출액을 회수하여 제 1차 추출액을 수득하는 제 1단계; 상기 1단계의 제 1차 추출액을 감압농축하고 농축한 농축액에 상기 농축액 부피의 0.5 내지 10배 부피(v/v)의 증류수를 포함한 물을 가하여 현탁 시키고 상기 현탁액 부피의 0.5 내지 20배 부피(v/v)의 부탄올을 가하여 부탄올 가용 분획을 회수하고 감압 농축하여 1차 정제된 부탄올 분획 정제물을 수득하는 제 2단계; 상기 2단계에서 수득한 부탄올 분획 정제물을 역상 분배 크로마토그래피법(Reverse phase partition chromatography), 순상 크로마토그래피법(Normal phase partition chromatography), 이온교환 크로마토그래법(ion exchange chromatography), 크기 배제 크로마토그래피법 (size exclusion chromatography) 또는 이들의 하나 이상의 조합으로 구성된 추가 정제방법을 수행하는 제 3단계 공정을 포함하는 제조방법으로 제조되고, 베르프로시드 30 내지 60 중량%, 베라트릭산 0.5 내지 10 중량%, 카탈폴시드 2 내지 20 중량%, 피크로시드 Ⅱ 1 내지 10 중량%, 이소바닐로일 카탈폴 1 내지 10 중량% 및 6-O-베라트로일 카탈폴 2 내지 20 중량%을 포함하는 항염, 항알레르기 또는 항천식 활성을 갖는 산꼬리풀 2차 분획 정제물(ATC2).
  8. 건조 상태의 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum)에 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 가하여 10℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 72시간 동안 냉침 추출법, 초음파 추출법, 환류 냉각 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법, 환류추출법 또는 이들의 하나 이상의 추출법 조합으로부터 선택된 추출법을 1 내지 20회 반복 수행하여 얻은 추출액을 회수하여 제 1차 추출액을 수득하는 제 1단계; 상기 1단계의 제 1차 추출액을 감압농축하고 농축한 농축액에 상기 농축액 부피의 0.5 내지 10배 부피(v/v)의 증류수를 포함한 물을 가하여 현탁시키고 상기 현탁액 부피의 0.5 내지 20배 부피(v/v)의 부탄올을 가하여 부탄올 가용 분획을 회수하고 감압 농축하여 1차 정제된 부탄올 분획 정제물을 수득하는 제 2단계; 상기 2단계에서 수득한 부탄올 분획 정제물을 역상 분배 크로마토그래피법(Reverse phase partition chromatography), 순상 크로마토그래피법(Normal phase partition chromatography), 이온교환 크로마토그래법(ion exchange chromatography), 크기 배제 크로마토그래피법 (size exclusion chromatography) 또는 이들의 하나 이상의 조합으로 구성된 추가 정제방법을 수행하는 제 3단계 공정을 포함하는, 항염, 항알레르기 또는 항천식활성을 갖는 제 5항 또는 제 6항의 산꼬리풀 2차 분획 정제물을 제조하는 제조방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 제 5항 또는 제 6항의 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 2차 분획 정제물(ATC2)을 유효성분으로 함유하는 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염증; 과민증, 알러지성 비염, 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 식품알러지 또는 약품 알러지로부터 선택된 알레르기; 또는 집먼지 진드기, 꽃가루, 동물 털, 비듬, 바퀴벌레, 식품, 약물, 감기, 담배연기, 실내오염, 대기오염, 식품첨가제, 운동, 기후 변화, 황사, 또는 스트레스에 기인한 기관지 천식로부터 선택된 천식의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 제 5항 또는 제6항의 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 유래 2차 분획 정제물(ATC2)을 유효성분으로 함유하는 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염증; 과민증, 알러지성 비염, 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 식품알러지 또는 약품 알러지로부터 선택된 알레르기; 또는 집먼지 진드기, 꽃가루, 동물 털, 비듬, 바퀴벌레, 식품, 약물, 감기, 담배연기, 실내오염, 대기오염, 식품첨가제, 운동, 기후 변화, 황사, 또는 스트레스에 기인한 기관지 천식로부터 선택된 천식의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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