BR112014022767B1 - Processo para a preparação de nanopartículas de polissacarídeos e nanopartículas assim obtidas - Google Patents

Processo para a preparação de nanopartículas de polissacarídeos e nanopartículas assim obtidas Download PDF

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Abstract

processo para a preparação de nanopartículas de polissacaríodeos e nanopartículas assim obtidas. o processo para a preparação de nanopartículas a partir de polissacarídeos e de derivados dos mesmo, por sua oxidação parcial específica, para produzir grupos aldeído e ligar compostos com o grupo amino ou outros grupos com a ligação r-nh2, que reage com grupos aldeído, compreendendo a oxidação do polissacarídeo ou do derivado do mesmo por um método conhecido, para se obter grupos aldeído, até que seja obtido o grau de oxidação de 0,1% a 80% dos anéis de açúcar, então, a adição de pelo menos um agente de formação de nanopartículas, que, depois de ligação do grupo aldeído, exiba propriedades hidrofóbicas, selecionado a partir do grupo compreendendo: aminas orgânicas alifáticas ou aromáticas contendo de 4 a 20 átomos de carbono, amidas e hidrazidas de ácido orgânicos alifáticos e aromáticos contendo de 4 a 20 átomos de carbono, aminoácidos hidrofóbicos, fosfatidil-etanolamina, e de pelo menos uma substância ativa contendo pelo menos um grupo amino, amido ou hidrazida, à solução do polissacarídeo oxidado em água ou uma mistura de água e um solvente orgânico, a reação sendo conduzida em ph da solução de 1 a 9, na temperatura de desde 10 a 100°c, sendo que a razão molar total de grupos amino em relação a grupos aldeídos é de 20 a 0,5.

Description

[001] A invenção fornece um processo para a preparação de nanopartículas a partir de polissacarídeos e de derivados dos mesmos, por oxidação específica de cadeias de polissacarídeos e ligação de compostos hidrofóbicos, incluindo medicamentos.
[002] São conhecidos conjugados de compostos a partir do grupo de polissacarídeos e de substâncias químicas, que exibem atividade terapêutica e incluem grupos amino. Por exemplo, o documento WO 2012/004007 descreve conjugados de derivado hidróxi-etilado de amido e vários medicamentos. O documento WO 03/000738 descreve conjugados de antibiótico/amido, nos quais o antibiótico está ligado à extremidade redutora de um polissacarídeo através de uma ligação peptídica. A ligação é obtida por oxidação do derivado de amido com I2 em sua extremidade redutora, em uma solução aquosa alcalina, seguida por acoplamento do derivado oxidado com o antibiótico em uma solução orgânica. Além disso, a partir do pedido internacional WO03/15826, é conhecida uma composição farmacêutica para inibição de metástases ou para prevenção da recorrência de um câncer maligno, que compreende, como um princípio ativo, um polissacarídeo com um grupo carbóxi ligado a uma substância ativa com atividade anticâncer através de aminoácido ou peptídeo que compreende 2 a 8 aminoácidos. O pedido WO03/074087 se refere ao acoplamento de proteínas com um polissacarídeo modificado com amido, com a interação de ligação, entre o polissacarídeo modificado e a proteína, compreendendo uma ligação covalente resultando de uma reação de acoplamento entre um grupo aldeído terminal do polissacarídeo modificado e um grupo funcional da proteína capaz de reagir com o grupo aldeído. A invenção também fornece formulações farmacêuticas, que incluem compostos acoplados, preparados por acoplamento e aplicação dos compostos para tratamento preventivo ou terapêutico de seres humanos e de animais.
[003] A partir do pedido internacional N° WO 2011/069475, é conhecido um processo para a preparação de derivados de ácido hialurônico oxidados e um processo para modificação de tais derivados. De acordo com o processo daquele pedido, o ácido hialurônico é oxidado com um agente oxidante específico, TEMPO, para se obter um derivado de ácido com grupos aldeído. O derivado é, então, usado para ligação com aminas, diaminas, aminoácido, peptídeos e outros compostos contendo amino. Tal ligação é implementada por aminação redutora com NaBH3CN, em água ou uma mistura de água e um solvente orgânico.
[004] As invenções mencionadas acima fornecem acoplamentos (conjugados) de polissacarídeos e vários tipos de substâncias terapêuticas, no entanto, qualquer uma das soluções almejava obter nanopartículas de polissacarídeos. Enquanto isso, atualmente, nanopartículas são intensivamente estudadas como potenciais veículos para medicamentos, devido a inúmeras novas propriedades desejadas [Biodegradable nanopartides are excellent vehicle for site directed i n-vivo delivery of drugs and vaccines, Mahaparto A., Singh K., Journal of Nanobiotechnology, 9, 2011]. Nanopartículas com diâmetros de cerca de 50 nm a cerca de 200 nm, tendo propriedades de superfície adequadas, poderiam circular durante um longo tempo no sangue evitando a eliminação por filtração pelos rins, fígado ou baço (partículas de longa circulação, partículas furtivas). A superfície de tais nanopartículas não deve induzir nem uma resposta do sistema imunológico nem agregação de pequenas proteínas do plasma - opsoninas. Naquele caso, uma superfície de propriedades de hidrogel, conforme criada por polímeros altamente hidrofílicos, tais como poli(etileno glicol), polissacarídeos, poli(álcool de vinila), é particularmente desejável. Polissacarídeos são especialmente desejáveis devido à sua origem frequentemente natural, biodegradabilidade e similaridade com substâncias que ocorrem no corpo. Tais nanopartículas de longa circulação tendem a se acumular em áreas de tumores ou de inflamações (focalização passiva) [Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cancer, Kwangjae Cho, Xu Wang, Shuming Nie, Zhuo Chen, Dong M, Shin, Clin. Cancer Res., 2008 14; 1310]. O efeito é devido ao fato de que membranas celulares de células endoteliais preenchendo o sistema respiratório são hermeticamente seladas por proteínas apropriadas e um intervalo entre elas é de vários nanômetros de largura. No tumor ou na área de inflamação, os intervalos são muito mais largos e atingem várias centenas de nanômetros. Isso faz com que as nanopartículas se acumulem nos intervalos e "vazem" da circulação para o tecido afligido circundante, incluindo o tumor. Tal acumulação passiva de nanopartículas na área afligida com a doença permite aumentar a concentração de droga nas áreas, intensifica a eficácia do tratamento e reduz os efeitos colaterais. Característica adicional das nanopartículas é sua capacidade de ser modificada em superfície com proteínas, metabólitos ou antibióticos adequados, para exibirem afinidade ativa em relação a tipos de células específicos, incluindo células de tumor. Isso permite entregar medicamentos primariamente às células afligidas. Q desejável preparar a superfície de nanopartículas a partir de polissacarídeos, devido ao fato de que células de tumor exibem demanda significativamente aumentada por glicose (o efeito Warburg), o que, por sua vez, permite obter afinidade aumentada de nanopartículas de polissacarídeos em relação a células de tumor. Tais nanopartículas de polissacarídeos com uma droga penetrariam de maneira mais eficiente nas células de câncer e as mataria, e, quando marcadas com marcador fluorescente, elas se tornam uma ferramenta diagnóstica eficiente. Outra aplicação importante de nanopartículas é a terapia genética. Uma nanopartícula contendo um fragmento de ARN ou de ADN é capaz de penetrar uma célula e de influenciar os processos de leitura de genes que ocorrem na célula. Surge a esperança de se curar doenças genéticas.
[005] Existem inúmeros métodos para preparação de nanopartículas, mas, infelizmente, a maioria deles são muito complexos e exigem a aplicação de condições drásticas (ultrassons, temperaturas elevadas), compostos químicos agressivos, solventes orgânicos tóxicos ou compostos ativos em superfície [Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in-vivo delivery of drugs and vaccines, Mahaparto A., Singh K., Journal of Nanobiotechnology, 9, 2011]. Nanopartículas para aplicação terapêutica devem ser não tóxicas e muitíssimo preferivelmente biodegradáveis. Os polissacarídeos constituem um material muito bom para a preparação de tais nanopartículas, devido à sua biocompatibilidade e biodegradabilidade [Lemarchand C., R. Gref, P. Couvreur, Polysaccharide-decorated nanoparticles, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 58, 2004]. Entretanto, os métodos conhecidos são complexos e exigem a aplicação de materiais ativos em superfície ou de entes químicos agressivos [Nanoparticles of hydrophobically modified dextranes as potential drugs carrier system, Aumelas A., Serrero A., Durand E., Dellacherie E., Leonard M., Colloids and Surfaces B, 59, 2007]. Nanopartículas assim preparadas têm que ser ulteriormente purificadas durante um longo período de tempo, como uma consequência de propriedades tóxicas dos compostos.
[006] A invenção foi direcionada a um processo para a preparação de nanopartículas de polissacarídeo em condições brandas, para permitir ligação covalente decompostos terapêuticos, que sejam sensíveis a ambiente agressivo.
[007] O processo para a preparação de nanopartículas a partir de polissacarídeos e de derivados dos mesmos, por sua oxidação parcial específica, para produzir grupos aldeído e se ligar a compostos com grupo amino ou outro grupo com a ligação R-NH2, que reage com grupos aldeído da invenção, é caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo ou derivado do mesmo é oxidado por um método conhecido, para dar grupos aldeído, até que o grau de oxidação de 0,1 % a 80 % dos anéis de açúcar seja obtido, então, pelo menos um agente de formação de nanopartículas, que é um composto químico orgânico com uma ligação R-NH2, que, depois de tratamento do grupo aldeído, exibe propriedades hidrofóbicas, e pelo menos uma substância ativa compreendendo pelo menos uma ligação R-NH2 ou N-H é adicionada à solução do polissacarídeo oxidado em água ou em uma mistura de água e um solvente orgânico, a reação sendo conduzida no pH da solução de 1 a 9, na temperatura de 10 a 100OC, muitíssimo de preferência, 20-60oC, sendo que a razão molar total de grupos amina em relação a grupos aldeído é de cerca de 20 a 0,5. O agente de formação de nanopartículas é selecionado a partir de um grupo compreendendo: aminas orgânicas alifáticas ou aromáticas compreendendo de 4 a 20 átomos de carbono, aminoácidos hidrofóbicos, fosfatidil-etanolamina. A substância ativa contém um grupo amino, amido ou hidrazida.
[008] O agente de formação de nanopartículas pode ser adicionado simultaneamente com a substância ativa ou depois que a substância ativa seja adicionada. Q preferível adicionar primeiro a substância ativa, uma vez que a reação ocorre mais lentamente depois que as nanopartículas são dobradas, resultando possivelmente em adição incompleta da substância ativa e de perda da mesma na purificação do produto. Algumas vezes, a substância ativa poderia estar acumulada nas nanopartículas nas formas de nanocristais precipitados em áreas hidrofóbicas, criadas pelo agente de dobra, então, ela não está ligada de maneira covalente, mas de maneira física, e poderia ser adicionada em maiores quantidades. Esse é o caso quando ela for pobremente solúvel em água em torno do pH neutro, e bem solúvel em pH menor do que 7.
[009] Tanto o agente de formação quanto a substância ativa são, de preferência, introduzidos na forma de sais que sejam prontamente solúveis em água, por exemplo, cloridratos. Se amina for introduzida como o sal mais prontamente solúvel (por exemplo, cloridrato), o pH baixa no curso da reação, e a solução é, então, lentamente neutralizada com a solução de base aquosa. O pH ótimo é dependente da alcalinidade da amina empregada. Geralmente, o aumento na concentração de íons hidrogênio ativa o grupo aldeído, mas também resulta na queda de concentração da amina não protonada livre; o pH ótimo da reação de primeira ordem se situa entre 4 e 6, aumento adicional de pH permite completar o processo por diminuição da concentração de cátions da amina.
[0010] O processo para a preparação de nanopartículas também poderia ser conduzido em solventes orgânicos ou mistos, tais como água/DMSO, água/acetonitrila, água/éter. Para aumentar a resistência à hidrólise das nanopartículas obtidas, a redução das ligações formadas com NaBH4 ou NaBH3CN é utilizada, também em solução aquosa e sob condições brandas.
[0011] De preferência, como um agente de formação de nanopartículas, são empregados os seguintes: butil-amina, pentil-amina, hexil-amina, octil-amina, decil-amina, dodecil-amina, tetradecil-amina, hexadecil-amina, ciclo-hexil-amina, benzil-amina, etil- fenil-amina, esfingosinas, amida de ácido oléico, amida de ácido palmítico, hidrazida de ácido esteárico, hidrazida de ácido palmítico, hidrazida de ácido oléico, leucina, isoleucina, valina, metionina, alanina, fenil-alanina ou cefalina (fosfatidil-etanolamina). Q preferível adicionar o agente de formação como uma solução aquosa de um sal de amina, por exemplo, cloridrato, nitrato ou sulfato, uma vez que os sais das presentes aminas são usualmente melhor solúveis em água.
[0012] De preferência, como uma substância ativa, compreendendo grupo amino, amido ou hidrazida, são usadas drogas que contenham tais grupos, tais como daunorubicina, doxorubicina, amino-acridinas e derivados das mesmas (como amsacrina), cisplatina e derivados da mesma, metotrexato, citarabina, gemcitabina, dapsona, aciclovir, azido- timidina, 5-fluoro-uracila, mercapto-purina, imatinib, sunitinib, bleomicina, actinomicina, mitomicina, dactinomicina, melfalan, temozolomida, celecoxib, nelarabina, cladribina, isoniazida ou medicamentos derivados, nos quais um grupo carbóxi foi convertido em amida ou hidrazida; fragmentos de ARN ou de ADN adequados para terapia genética, ou derivados dos mesmos; corantes simples e fluorescentes, tais como 9-amino-acridina e outros corantes de acridina, DAPI, rodamina e derivados da mesma, Vermelho Neutro, Azul de Tripano. Q preferível adicionar a substância ativa ao meio de reação como uma solução aquosa de um sal de amina, por exemplo, cloridrato, nitrato ou sulfato, os sais das presentes aminas são usualmente melhor solúveis em água. Se uma tal substância ativa se dissolver em água no ambiente ácido, mas se ela for pobremente solúvel no ambiente neutro, a substância poderia estar ligada dentro das nanopartículas somente por interações físicas. Quando do aumento de pH, ela precipitar-se-ia, dentro de áreas hidrofóbicas das nanopartículas, como nanocristais.
[0013] De preferência, como um polissacarídeo, o polissacarídeo que é usado é solúvel em água ou outros solventes, com o peso molecular de até 1.000 KDa, muitíssimo de preferência, dextrana, amido e derivados do mesmo (hidróxi-etil-amido), amilose e derivados da mesma, derivados de celulose (hidróxi-etil-celulose, hidróxi-propil-celulose, carbóxi-metil-celulose), glicogênio, ácido hialurônico, heparina, ácido algínico, carragenana.
[0014] De preferência, a oxidação é realizada até o grau de oxidação de 0,5 % a 80 % dos anéis de açúcar oxidados no polissacarídeo.
[0015] De preferência, a oxidação é realizada com a participação do agente de oxidação, que compreenda íons de periodato (por exemplo, periodato de sódio ou de potássio), sais de chumbo com o número de oxidação de 4, compostos de cobre com o número de oxidação de 2 ou água, oxidado na presença de catalisadores adequados, tais como, por exemplo, óxidos de vanádio.
[0016] Além disso, as nanopartículas obtidas poderiam ser modificadas com anticorpos ou peptídeos, ou proteínas, também por reação de grupos aldeído do polissacarídeo oxidado com grupos amina de peptídeos.
[0017] A suspensão aquosa de nanopartículas assim obtidas é purificada por diálise, precipitação, centrifugação, ou é empregada diretamente. A solução de nanopartículas obtida poderia ser liofilizada. Para liofilização, uma substância poderia ser adicionada, a qual desempenhe um papel de um agente de proteção (crioprotetor), tal como um polissacarídeo não modificado - por exemplo, dextrana. As nanopartículas obtidas desempenham capacidades auto-organizantes, se liofilizadas para formar um pó seco, depois de suspensão em água ou salina, formam nanopartículas em vários minutos.
[0018] De acordo com a invenção, um polissacarídeo é pré-oxidado em uma solução aquosa, por adição de uma quantidade pré-determinada de um agente oxidante. No curso da oxidação específica, monossacarídeo, por exemplo, anéis de glicose são clivados ao invés da cadeia de polissacarídeo, e os anéis oxidados formam grupos aldeído. Essa é uma das reações de oxidação específica típicas empregadas em química orgânica, conforme exemplificado por um processo de oxidação de mono- ou polissacarídeos com periodatos [Heanes, Allene e Wilham, C. A. Periodate Oxidation de Dextran, Journal of American Chemical Society 72.6, (1950): 2655-2657]. No processo de oxidação, uma ligação carbono-carbono é clivada, a qual tem grupos -OH nos carbonos adjacentes, e grupos aldeído se formam em ambas as extremidades formadas. Outros métodos de oxidação parcial também poderiam ser empregados, os quais conduzem à formação de grupos aldeído ao longo da cadeia de polissacarídeo por clivagem de anéis de monossacarídeo (glicose) e prosseguindo sem clivar a cadeia de polissacarídeo. O grau de oxidação - um número de grupos aldeído pode ser determinado de uma maneira conhecida; por exemplo, por reação de aldeídos com cloridrato de hidroxilamina e titulação do ácido clorídrico liberado [Zhao, Huiru, Heindel, Ned D., Determination of Degree of Substitution of Formyl Groups in Polyaldehyde Dextran by the Hydroxylamine Hydrochloride Method, Pharmaceutical Research, 8.3(1991):400-402]. Às moléculas de polissacarídeo preparadas, compostos de formação são ligados por reação de grupos aldeído com grupos amino, o que conduz à formação espontânea de nanopartículas.
[0019] De acordo com a invenção, o polissacarídeo oxidado é simultaneamente modificado por pelo menos dois tipos de substâncias com a natureza de amina: agente(s) de formação de nanopartículas de natureza hidrofóbica, com substâncias remanescentes sendo agentes terapêuticos ou corantes, embora seja possível usar, em uma nanopartícula, ao mesmo tempo, várias substâncias ativas. Isso permite obter efeito sinergístico de atividades combinadas de vários medicamentos. O uso simultâneo de vários medicamentos diminui, de maneira significativa, a possibilidade de desenvolvimento de resistência à droga pelo tumor e possibilita a destruição ativa de uma célula, independentemente da fase do ciclo celular. No processo da invenção, devido às interações hidrofóbica-hidrofílica, é formada nanopartícula de polissacarídeo, que contém a substância ativa e o agente de dobra hidrofóbico no lado de dentro, e sua camada exterior compreende componentes hidrofílicos, principalmente o polissacarídeo. Q também possível modificar simultaneamente o polissacarídeo com o agente de formação, a(s) droga(s) e o componente reativo com grupo aldeído, que intensifica a afinidade em relação a tipos de células específicos, tais como antibióticos, bases de nucleotídeos ou metabólitos, por exemplo, ácido fólico. Quando da formação de nanopartículas, os agentes hidrofóbicos quedam do lado de dentro, e aqueles hidrofílicos, são posicionados do lado de fora das nanopartículas.
[0020] A reação da invenção se decorre no ambiente aquoso, sob as condições de temperatura brandas e sem solventes orgânicos ou tensoativos. As nanopartículas obtidas são não tóxicas como tais (se preparadas sem uma droga tóxica) e poderiam ser usadas como veículos para medicamentos e indicadores coloridos ou fluorescentes, na terapia e no diagnóstico de tumores, em particular. As nanopartículas podem conter um ou mais agentes de formação ou várias drogas em várias combinações, e eles também podem conter adjuvantes (di-indolil-metano), que melhorem sua eficiência como medicamentos.
[0021] A estabilidade das macromoléculas preparadas é usualmente suficiente e atinge de várias a acima de uma dúzia de semanas no ambiente aquoso. A estabilidade a seco depois de liofilização é marcadamente mais elevada e excede um ano com armazenamento apropriado. A estabilidade da ligação formada entre os grupos amino e aldeído poderia ser adicionalmente fortalecida por redução da ligação aldeído - amina.
[0022] O processo da invenção foi ilustrado em mais detalhes nos exemplos de operação.
Exemplo 1.
[0023] Dextrana com o peso molecular de 70 KDa foi oxidada com periodato de sódio para oxidar cerca de 5 % de anéis de glicose e foi purificada. Para conduzir isso, uma solução de dextrana aquosa foi preparada e periodato de sódio foi adicionada a ela. A estequiometria da reação depende das condições de oxidação, com o peso molecular e, frequentemente, da origem da dextrana, e é igual a desde 1 a 2 moles de periodato por urn mol de glicose oxidada (dois grupos aldeído formados), e tem de ser verificada experimentalmente. O processo de oxidação da dextrana foi conduzido à temperatura ambiente em um vaso feito de vidro escuro durante uma hora. A seguir, a solução foi neutralizada e purificada por diálise contra água destilada, seguido por esgotamento da água em vácuo. O número de grupos aldeído foi determinado pelo método de titulação com hidroxilamina conhecido. Foi preparada uma solução à 5 % da dextrana em água destilada. Então, foi adicionado cloridrato de daunorubicina, à 15 % em mol, com base no número de moles de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada. A solução foi agitada durante 20 minutos, à 30oC. A seguir, foi adicionada a solução aquosa de cloridrato de dodecil-amina à 85 % em mol, com base no número de moles inicial de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada, e a temperatura foi elevada para 35OC, e a reação foi continuada durante 60 minutos. A reação em decurso provoca a diminuição do pH do ambiente reacional. A seguir, a elevação do pH foi iniciada por adição de solução aquosa de NaOH à 5 %. A adição foi conduzida de uma maneira a elevar o pH para pH 9 em 30 minutos. Depois que o pH = 9 foi alcançado, a reação foi continuada durante 30 minutos adicionais. Alanina foi, então, adicionada à 15 % em mol com base no número de moles inicial de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada, para se ligar a todos os grupos aldeído não reagidos. Depois de 15 minutos de agitação, a solução foi neutralizada com ácido clorídrico à 5 % para pH = 7 e foi purificada por diálise durante 24 horas. Então, foram adicionados 10 % em peso (com base no peso inicial de dextrana oxidada) de dextrana não oxidada pura como um agente crioprotetor e a solução foi liofilizada. O pó foi ressuspenso em água para dar uma suspensão de nanopartículas. A distribuição de diâmetros das nanopartículas obtidas foi medida com o aparelho Malvern Zeta Sizere é mostrada na Fig. 1. As medições deitas com o aparelho NanoSight,com um laser à 405 nm revelaram o diâmetro de partícula médio ligeiramente mais baixo e a distribuição de diâmetros mais estreita.
Exemplo 2.
[0024] Dextrana com o peso molecular de 40 KDa foi oxidada com periodato de sódio para oxidar cerca de 20 % de anéis de glicose e foi purificada. Foi preparada uma solução à 10 % de tal dextrana em água destilada. Então, foi adicionado cloridrato de daunorubicina, à 20 % em mol, com base no número de moles de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada. A solução foi agitada durante 20 minutos, à 30oC. A seguir, foi adicionada a solução aquosa de cloridrato de octil-amina à 80 % em mol, com base no número de moles inicial de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada, e a temperatura foi elevada para 40oc, e a reação foi continuada durante 60 minutos. A reação em decurso provoca a diminuição do pH. A seguir, a elevação do pH foi iniciada por adição de solução aquosa de NaOH à 5 %. A adição foi conduzida de uma maneira a elevar o pH para pH 8 em 30 minutos. Alanina foi, então, adicionada à 10 % em mol com base no número de moles inicial de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada. Depois de 15 minutos de agitação, a solução foi neutralizada com ácido clorídrico à 5 % para pH = 7 e foi adicionado NaBH3CN em excesso de 10 % em mol, com base na quantidade inicial de grupos aldeído. A seguir, a reação foi deixada prosseguir durante 12 horas. A solução foi neutralizada e purificada por diálise extensiva durante 48 horas, então, foi adicionada dextrana à 50 % em peso, com base no peso inicial de dextrana, e a solução foi liofilizada. Depois de ressuspensão em água, a distribuição de diâmetros das nanopartículas obtidas foi medida com o aparelho NanoSight, com um laser à 405 nm, e é mostrada na Fig. 2.
Exemplo 3.
[0025] Foi preparada uma solução aquosa à 4 % de carbóxi-metil-celulose, com o peso molecular de cerca de 100 KDa e com o índice de oxidação de 5 %, e o pH foi ajustado para pH 5. A seguir, 9-amino-acridina foi adicionada como sua solução aquosa de cloridrato à 50 % em mol, com base na quantidade inicial de grupos aldeído do derivado de celulose usado. Então, octil-amina aquosa foi adicionada à 55 % em mol, com base no número de moles inicial de grupos aldeído. A reação foi realizada à 40oC durante uma hora. A seguir, a solução foi neutralizada por elevação do pH para pH 9 em 15 minutos, deixada repousar durante 30 minutos e dialisada. As nanopartículas fluorescentes foram obtidas com o diâmetro médio de 150 nm.
Exemplo 4.
[0026] Dextrana com o peso molecular de 70 KDa foi oxidada com periodato de sódio para oxidar cerca de 15 % de anéis de glicose e foi purificada. Foi preparada uma solução à 10 % de tal dextrana em água destilada. Então, foi adicionado cloridrato de daunorubicina, à 25 % em mol, com base no número de moles de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada. A solução foi agitada durante 20 minutos, à 35OC. A seguir, ácido fólico foi adicionado à 5 % em moles, com base na quantidade inicial de grupos aldeído, para intensificar a afinidade das nanopartículas em relação às células de tumor. Depois de 15 minutos, a solução aquosa de cloridrato de isoleucina à 5 % foi adicionada à 80 % em mol, com base no número de moles inicial de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada, e temperatura foi elevada para 40OC, e a reação foi conduzida durante 60 minutos. A seguir, a elevação do pH foi iniciada por adição da solução aquosa de NaOH à 5 %. A adição foi conduzida de uma maneira a elevar o pH para pH 9,5 em 30 minutos. A reação foi continuada durante um adicional de 30 minutos. Então, a solução foi neutralizada e purificada por diálise extensiva durante 24 horas. O diâmetro médio das nanopartículas era de 140 nm.
Exemplo 5.
[0027] O sal de sódio de carbóxi-metil-celulose foi oxidada na solução aquosa com peróxido de hidrogênio na presença de catalisador de tetrassulfo-ferro-ftalocianina [Weber, H H. et ai., Complexes derived from strong field iigants, Inorganic Chemistry, 1965, 4, 469-471]. O processo foi conduzido durante 12 horas à 40OC, então, o produto foi purificado por filtração, seguido por diálise. A quantidade de grupos aldeído no derivado de carbóxi-metil-celulose de aldeído foi determinada pelo método de titulação com hidroxilamina conhecido. Foi preparada uma solução à 5 % do derivado obtido em água destilada. Então, foi adicionado cloridrato de daunorubicina, à 10 % em mol, com base no número de moles de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada. A solução foi agitada durante 20 minutos, à 30OC. A seguir, foi adicionada a solução aquosa de cloridrato de dodecil-amina à 5 %, à 90 % em mol, com base no número de moles inicial de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada, e a temperatura foi elevada para 35OC, e a reação foi continuada durante 60 minutos. A seguir, a elevação do pH foi iniciada por adição de solução aquosa de NaOH à 5 %. A adição foi conduzida de uma maneira a elevar o pH para pH 9 em 30 minutos. Depois que o pH = 9 foi alcançado, a reação foi continuada durante 30 minutos adicionais. Alanina foi, então, adicionada à 30 % em mol, com base no número de moles inicial de grupos aldeído na quantidade usada de dextrana oxidada, para se ligar a todos os grupos aldeído não reagidos. Depois de 15 minutos de agitação, a solução foi neutralizada com ácido clorídrico à 5 % para pH = 7 e foi purificada por diálise durante 24 horas. O diâmetro médio das nanopartículas obtidas, conforme medido com o aparelho Malvern Zeta Sizere é mostrada na Fig. 1. As medições deitas com o aparelho NanoSight, era de 110 nm.
Exemplo 6.
[0028] Foi preparada a solução aquosa do sal de sódio de ácido hialurônico e oxidada com periodato de sódio até o grau de oxidação de 5 %, como no Exemplo 1. O pH foi ajustado para pH 5, foram adicionados cloridrato de daunorubicina e cloridrato de citarabina para cada droga compreendendo 10 % em mol de todos os grupos aldeído do ácido hialurônico oxidado, e a reação foi conduzida durante 15 minutos, à 30OC. A seguir, foi adicionada solução aquosa de cloridrato de decil-amina à 85 % em mol, com base no número de moles inicial de grupos aldeído. A reação foi conduzida à 40OC durante uma hora. Então, o pH foi elevado para pH 9 dentro de 20 minutos, a solução foi neutralizada e dialisada. Foi obtida uma suspensão aquosa de nanopartículas de polissacarídeos compreendendo duas drogas com mecanismos de ação distintos.

Claims (20)

1. Processo para a preparação de nanopartículas a partir de polissacarídeos e de derivados dos mesmos, por sua oxidação parcial específica, para produzir grupos aldeído e ligar compostos com grupo amino ou outros grupos com a ligação R-NH2, que reage com grupos aldeído, caracterizado por o polissacarídeo ou o derivado do mesmo ser oxidado por um método conhecido para se obter grupos aldeído até que seja obtido o grau de oxidação de 0,1% a 80% dos anéis de açúcar e, então, à solução do polissacarídeo oxidado em água ou uma mistura de água e um solvente orgânico são adicionados:i. pelo menos um agente de formação de nanopartículas, que, depois de ligação do grupo aldeído, exiba propriedades hidrofóbicas, selecionado a partir do grupo compreendendo: aminas orgânicas alifáticas ou aromáticas contendo de 4 a 20 átomos de carbono, amidas e hidrazidas de ácidos orgânicos alifáticos e aromáticos contendo de 4 a 20 átomos de carbono, aminoácidos hidrofóbicos, fosfatidil-etanolamina, eii. pelo menos uma substância ativa contendo pelo menos um grupo amino, amido ou hidrazida,e a reação ser conduzida em pH da solução de 1 a 9, na temperatura de desde 10 a 100°C, sendo que a razão molar total de grupos amino em relação a grupos aldeído é de 20 a 0,5.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de formação de nanopartículas é adicionado simultaneamente com a substância ativa.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de formação de nanopartículas é adicionado depois da adição da substância ativa.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de formação de nanopartículas é selecionado a partir do grupo compreendendo: butil-amina, pentil-amina, hexil-amina, octil-amina, decilamina, dodecil-amina, tetradecil- amina, hexadecil-amina, ciclo-hexil-amina, benzil-amina, etil-fenil-amina, esfingosinas, amida de ácido oléico, amida de ácido palmítico, hidrazida de ácido esteárico, hidrazida de ácido palmítico, hidrazida de ácido oléico, leucina, isoleucina, valina, metionina, alanina, fenil- alanina ou cefalina.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, como a substância ativa, são usadas as drogas compreendendo grupos amino, amido ou hidrazida ou drogas derivadas, nas quais um grupo carbóxi foi modificado para formar amida ou hidrazida, fragmentos de ARN ou de ADN adequados para terapia genética, ou derivados dos mesmos, corantes simples e fluorescentes.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado pelo fato de que a substância ativa é selecionada a partir do grupo compreendendo: daunorubicina, doxorubicina, amino-acridinas e derivados das mesmas, cisplatina e derivados da mesma, metotrexato, citarabina, gemcitabina, dapsona, aciclovir, azido-timidina, 5-fluoro-uracila, mercapto-purina, imatinib, sunitinib, bleomicina, actinomicina, mitomicina, dactinomicina, melfalan, temozolomida, celecoxib, nelarabina, cladribina, isoniazida, 9-amino-acridina e outros corantes de acridina, DAPI, rodamina e derivados da mesma, Vermelho Neutro, Azul de Tripano.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tanto o agente de formação quanto a substância ativa são adicionados à reação na forma de sais prontamente solúveis.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que cloridratos, nitratos ou sulfatos são usados como sais.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que são usados, como polissacarídeos, dextrana, amido e derivados do mesmo, amilose e derivados da mesma, derivados de celulose, glicogênio, ácido hialurônico, heparina, ácido algínico, carragenana.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo é realizado nas misturas de solventes de água/DMSO, água/acetonitrila, água/éter.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a oxidação é realizada até que seja obtido o grau de oxidação de 0,1 % a 80 % dos anéis de açúcar no polissacarídeo.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a oxidação é realizada na presença de um agente oxidante compreendendo íons periodato, sais de chumbo com o número de oxidação de 4, compostos de cobre com o número de oxidação de 2 ou água oxidada na presença de catalisadores adequados.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, depois que a reação estiver completada, é realizada a redução das ligações formadas.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a redução é realizada com NaBH4 ou NaBH3CN em solução aquosa.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a suspensão aquosa de nanopartículas é purificada por diálise, precipitação, centrifugação ou é usada diretamente.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas obtidas são modificadas com antibióticos, peptídeos ou proteínas, também por reação de grupos aldeído do polissacarídeo oxidado com grupos amino de peptídeo.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução das nanopartículas obtidas é liofilizada.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a liofilização é realizada com uma substância crioprotetora adicionada.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor é um polissacarídeo não modificado.
20. Uma nanopartícula caracterizada por ser produzida pelo processo de qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
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