BR112014011915B1 - Métodos para fabricar uma composição farmacêutica de liberação prolongada e para fornecer um revestimento de liberação prolongada, e, formulação de liberação prolongada - Google Patents

Métodos para fabricar uma composição farmacêutica de liberação prolongada e para fornecer um revestimento de liberação prolongada, e, formulação de liberação prolongada Download PDF

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Abstract

COMPOSIÇÃO, MICROPARTÍCULA, PLURALIDADE DE MICROPARTÍCULAS, E, MÉTODO PARA FABRICAR UMA COMPOSIÇÃO São fornecidos micropartículas contendo um núcleo proteína terapêutica e um córtex de um polímero biocompatível e biodegradável, e métodos de preparar e de usar as micropartículas. A liberação prolongada de uma proteína terapêutica das micropartículas em uma solução fisiológica é demonstrada no decorrer de um período de tempo prolongado.

Description

CAMPO
[0001] A invenção refere-se à fabricação, à composição, e ao uso de uma proteína terapêutica de liberação prolongada. Especificamente, a invenção refere-se à fabricação, à composição, e ao uso de uma pluralidade de microesferas de proteína revestidas com polímero para a liberação uniforme e prolongada de proteína em um ambiente fisiológico ou à base de água no decorrer do tempo.
ANTECEDENTES
[0002] A liberação prolongada de uma proteína terapêutica administrada para um alvo biológico, por exemplo, a retina ou um tumor, ou administrada parenteralmente é desejável para o tratamento de muitas condições diferentes, incluindo cânceres, doenças cardiovasculares, condições vasculares, distúrbios ortopédicos, distúrbios dentários, ferimentos, doenças autoimunes, distúrbios gastrointestinais, e doenças oculares. Polímeros biocompatíveis e biodegradáveis para a liberação controlada e prolongada de drogas têm estado em uso há décadas. À medida que o polímero se degrada no decorrer do tempo, a droga terapêutica é lentamente liberada.
[0003] No caso de terapias intraoculares, há uma necessidade médica significativa não atendida de formulações de liberação prolongada para liberar proteínas terapêuticas efetivamente no decorrer do tempo com tão poucas injeções intraoculares quanto possível. No caso de outras doenças, tais como câncer, doenças de inflamação, e outras doenças, há uma necessidade de formulações de liberação prolongada implantáveis melhoradas contendo proteínas terapêuticas.
[0004] Os requerentes têm descoberto e aqui revelam e reivindicam métodos de fabricação e de uso de micropartículas que contêm um polímero biodegradável e uma proteína terapêutica, que são capazes de liberar uma quantidade terapeuticamente efetiva da proteína terapêutica uniformemente durante um período de tempo prolongado.
SUMÁRIO
[0005] Em um aspecto, a invenção fornece uma micropartícula que compreende uma proteína revestida com um polímero. Em uma modalidade, a micropartícula tem um diâmetro de cerca de 2 micrômetros a cerca de 70 micrômetros. Em uma modalidade, a micropartícula tem um diâmetro de cerca de 15 micrômetros.
[0006] Em uma modalidade, a proteína é uma proteína de ligação de antígeno. Em uma modalidade, a proteína compreende um domínio Fc. Em uma modalidade, a proteína compreende um domínio de receptor. Em uma modalidade, a proteína é um anticorpo. Em outra modalidade, a proteína é uma proteína de fusão de receptor-Fc. Em outra modalidade, a proteína é uma proteína de captação, que compreende um fragmento de receptor cognato e um domínio Fc. Em uma modalidade específica, a proteína é uma proteína de armadilha-VEGF. Em uma modalidade, a proteína de armadilha-VEGF compreende uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:1.
[0007] Em uma modalidade, o polímero é um polímero biodegradável. Em algumas modalidades, o polímero é selecionado do grupo consistindo em poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero polilático-poliglicólico (PLGA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), fumarato de PLGA-(óxido de etileno), succinato de PLGA-alfa- tocoferila esterificado em polietilenoglicol 1.000 (PLGA-TGPS), polianidrido-poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-ε-caprolactona (PCL), poli(cianoacrilato de alquila) (PAC), poli(cianoacrilato de etila) (PEC), poli(cianoacrilato de isobutila), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (poli(HPMA)), poli-β-R-hidroxi-butirato (PHB), poli-β-R-hidroxi-alcanoato (PHA), poli-e-R-ácido málico, polímeros de fosfolipídeo-colesterol, 2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina/polietilenoglicol- distearoilfosfatidiletanolamina (DOPC/PEG-DSPE)/Colesterol, polissacarídeos, celulose, etilcelulose, metilcelulose, alginatos, polímeros de hidrogel de dextrano e dextrano, amilose, inulina, pectina e goma guar, quitosana, quitina, heparina, ácido hialurônico, polirrotaxanos e polipseudorrotaxanos à base de ciclodextrina (CD), poliaspartatos, poliglutamatos, polilucina, copolímeros de leucina-glutamato, poli(succinato de butileno) (PBS), gelatina, colágenos, fibrinas, fibroína, poliortoésteres, copolímero de poliortoéster-poliamidina, copolímeros de poliortoéster- diamina, poliortoésteres incorporando ácidos latentes, copolímero de poli(etilenoglicol)/poli(tereftalato de butileno), e suas combinações e seus copolímeros. Em uma modalidade, o polímero é poli-ε-caprolactona (PCL) ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o polímero é PLGA ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o polímero é etilcelulose ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o polímero é poliortoéster ou um seu derivado ou copolímero.
[0008] Em uma modalidade, a micropartícula compreende um núcleo de proteína micronizado menor que dez micrômetros e um córtex de polímero. Em uma modalidade, o núcleo de proteína micronizado está pelo menos 50% revestido com polímero, o que significa que não mais que 50% da superfície do núcleo de proteína micronizado está exposta. Em uma modalidade, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, ou 100% da superfície do núcleo de proteína micronizado está revestida com polímero.
[0009] Em uma modalidade, a micropartícula de tamanho maior que 10 micrômetros compreende (a) um núcleo de proteína micronizado menor que 10 micrômetros, em que a proteína é qualquer um ou mais de um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um receptor ou seu fragmento solúvel, um fragmento de receptor solúvel de célula-T, um fragmento solúvel de MHC, é uma proteína de fusão de receptor-Fc, uma proteína de captação, e uma proteína de armadilha-VEGF; e (b) uma capa de polímero, em que o polímero é qualquer um ou mais de um polímero biocompatível, um polímero biodegradável, um polímero bioerodível, poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero polilático-poliglicólico (PLGA), poli-D,L- lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), fumarato de PLGA-(óxido de etileno), succinato de PLGA-alfa-tocoferila esterificado em polietilenoglicol 1.000 (PLGA-TGPS), polianidrido-poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-ε-caprolactona (PCL), poli(cianoacrilato de alquila) (PAC), poli(cianoacrilato de etila) (PEC), poli(cianoacrilato de isobutila), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (poli(HPMA)), poli-β-R-hidroxi-butirato (PHB), poli-β-R-hidroxi-alcanoato (PHA), poli-e-R-ácido málico, polímeros de fosfolipídeo-colesterol, 2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina/polietilenoglicol- distearoilfosfatidiletanolamina (DOPC/PEG-DSPE)/Colesterol, polissacarídeos, celulose, etilcelulose, metilcelulose, alginatos, polímeros de hidrogel de dextrano e dextrano, amilose, inulina, pectina e goma guar, quitosana, quitina, heparina, ácido hialurônico, polirrotaxanos e polipseudorrotaxanos à base de ciclodextrina (CD), poliaspartatos, poliglutamatos, polilucina, copolímeros de leucina-glutamato, poli(succinato de butileno) (PBS), gelatina, colágenos, fibrinas, fibroína, poliortoésteres, copolímero de poliortoéster-poliamidina, copolímeros de poliortoéster- diamina, poliortoésteres incorporando ácidos latentes, copolímero de poli(etilenoglicol)/poli(tereftalato de butileno), e suas combinações e seus copolímeros.
[00010] Em uma modalidade, a micropartícula de um diâmetro médio de cerca de 15 micrômetros a cerca de 30 micrômetros compreende (a) um núcleo de proteína micronizado de cerca de 10 a cerca de 12 micrômetros, em que a proteína é uma proteína de armadilha-VEGF; e (b) uma capa de polímero, em que o polímero é qualquer um ou mais de PCL, PLGA, etilcelulose e poliortoéster, e seus copolímeros ou derivados.
[00011] Em um aspecto, a invenção fornece uma pluralidade de micropartículas, que variam em tamanho de cerca de dois micrômetros a cerca de 70 micrômetros, e que compreendem um núcleo de proteína micronizado de cerca de dois micrômetros a cerca de 30 micrômetros, e um córtex de polímero.
[00012] Em uma modalidade, a proteína é uma proteína de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de antígeno é qualquer um ou mais de um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um receptor ou seu fragmento solúvel, um fragmento de receptor solúvel de célula-T, um fragmento solúvel de MHC, é uma proteína de fusão de receptor-Fc, uma proteína de captação, e uma proteína de armadilha-VEGF. Em uma modalidade, a proteína compreende um domínio Fc. Em uma modalidade, a proteína é um anticorpo. Em outra modalidade, a proteína é uma proteína de fusão de receptor-Fc. Em outra modalidade, a proteína é uma proteína de captação, que compreende um fragmento de receptor cognato e um domínio Fc. Em uma modalidade específica, a proteína é uma proteína de armadilha- VEGF. Em uma modalidade específica, a proteína de armadilha-VEGF compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:1.
[00013] Em uma modalidade, o polímero é um polímero biocompatível. Em uma modalidade, o polímero é um polímero bioerodível. Em uma modalidade, o polímero é um polímero biodegradável. Em algumas modalidades, o polímero é selecionado do grupo consistindo em poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero polilático-poliglicólico (PLGA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), fumarato de PLGA-(óxido de etileno), succinato de PLGA-alfa-tocoferila esterificado em polietilenoglicol 1.000 (PLGA-TGPS), polianidrido-poli[1,6-bis(p- carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-ε-caprolactona (PCL), poli(cianoacrilato de alquila) (PAC), poli(cianoacrilato de etila) (PEC), poli(cianoacrilato de isobutila), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (poli(HPMA)), poli-β-R-hidroxi- butirato (PHB), poli-β-R-hidroxi-alcanoato (PHA), poli—e—R—ácido málico, polímeros de fosfolipídeo-colesterol, 2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfatidilcolina/polietilenoglicol—distearoilfosfatidiletanolamina (DOPC/PEG— DSPE)/Colesterol, polissacarídeos, celulose, etilcelulose, metilcelulose, alginatos, polímeros de hidrogel de dextrano e dextrano, amilose, inulina, pectina e goma guar, quitosana, quitina, heparina, ácido hialurônico, polirrotaxanos e polipseudorrotaxanos à base de ciclodextrina (CD), poliaspartatos, poliglutamatos, polilucina, copolímeros de leucina—glutamato, poli(succinato de butileno) (PBS), gelatina, colágenos, fibrinas, fibroína, poliortoésteres, copolímero de poliortoéster—poliamidina, copolímeros de poliortoéster—diamina, poliortoésteres incorporando ácidos latentes, copolímero de poli(etilenoglicol)/poli(tereftalato de butileno), e suas combinações e seus copolímeros. Em uma modalidade, o polímero é poli—ε— caprolactona (PCL) ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o polímero é PLGA ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o polímero é etilcelulose ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o polímero é um poliortoéster incorporando um ácido latente.
[00014] Em uma modalidade, o núcleo de proteína micronizado da maioria das micropartículas da pluralidade de micropartículas está pelo menos 50% revestido com polímero, o que significa que não mais que 50% da superfície do núcleo de proteína micronizado está exposta. Em uma modalidade, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, ou 100% da superfície do núcleo de proteína micronizado está revestida com polímero.
[00015] Em uma modalidade, a pluralidade de micropartículas, que variam em tamanho de cerca de dois micrômetros a cerca de 70 micrômetros, compreendem (a) um núcleo de proteína micronizado de cerca de dois micrômetros a cerca de 30 micrômetros, em que a proteína é qualquer um ou mais de um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um receptor ou seu fragmento solúvel, um fragmento de receptor solúvel de célula-T, um fragmento solúvel de MHC, é uma proteína de fusão de receptor-Fc, uma proteína de captação, e uma proteína de armadilha-VEGF; e (b) um córtex de polímero, em que o polímero é qualquer um ou mais de um polímero biocompatível, um polímero biodegradável, um polímero bioerodível, poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero polilático- poliglicólico (PLGA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), fumarato de PLGA-(óxido de etileno), succinato de PLGA-alfa-tocoferila esterificado em polietilenoglicol 1.000 (PLGA-TGPS), poli-ε-caprolactona (PCL), poli(cianoacrilato de alquila) (polianidrido-poli[1,6-bis(p- carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA),), poli(cianoacrilato de etila) (PEC), poli(cianoacrilato de isobutila), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (poli(HPMA)), poli-β-R- hidroxi-butirato (PHB), poli-β-R-hidroxi-alcanoato (PHA), poli—e—R—ácido málico, polímeros de fosfolipídeo-colesterol, 2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfatidilcolina/polietilenoglicol—distearoilfosfatidiletanolamina (DOPC/PEG— DSPE)/Colesterol, polissacarídeos, celulose, etilcelulose, metilcelulose, alginatos, polímeros de hidrogel de dextrano e dextrano, amilose, inulina, pectina e goma guar, quitosana, quitina, heparina, ácido hialurônico, polirrotaxanos e polipseudorrotaxanos à base de ciclodextrina (CD), poliaspartatos, poliglutamatos, polilucina, copolímeros de leucina-glutamato, poli(succinato de butileno) (PBS), gelatina, colágenos, fibrinas, fibroína, poliortoésteres, copolímero de poliortoéster-poliamidina, copolímeros de poliortoéster-diamina, poliortoésteres incorporando ácidos latentes, copolímero de poli(etilenoglicol)/poli(tereftalato de butileno), e suas combinações e seus copolímeros.
[00016] Em uma modalidade, a pluralidade de micropartículas, que variam em tamanho de cerca de dois micrômetros a cerca de 70 micrômetros, com um tamanho médio de cerca de 15 micrômetros a cerca de 30 micrômetros, compreendem (a) um núcleo de proteína micronizado de cerca de dois micrômetros a cerca de 30 micrômetros, com um tamanho médio de cerca de 10 micrômetros a cerca de 12 micrômetros, em que a proteína é uma proteína de armadilha-VEGF; e (b) um córtex de polímero, em que o polímero é qualquer um ou mais de PLA, PCL, PLGA, etilcelulose e poliortoéster, e seus copolímeros ou derivados.
[00017] Em um aspecto, a invenção fornece um método de fabricar uma micropartícula, que compreende um núcleo de proteína e um córtex de polímero. Em uma modalidade, a micropartícula fabricada tem um diâmetro de cerca de dois micrômetros a cerca de 70 micrômetros, ou um diâmetro médio de cerca de 15 micrômetros a cerca de 30 micrômetros. Em uma modalidade, o método de fabricar a micropartícula compreende (1) obter uma partícula de proteína; (2) suspender a partícula de proteína em uma solução que compreende o polímero e um solvente; e (3) remover o solvente, em que a micropartícula é formada compreendendo o núcleo de proteína revestido com o córtex de polímero.
[00018] Em uma modalidade, partícula de proteína de etapa (1) é uma partícula de proteína micronizada, que é obtida por secagem por pulverização de uma solução que compreende a proteína. Em algumas modalidades, a solução de proteína é seca por pulverização via sonificação com bocal dual, sonificação com bocal único, ou eletropulverização. Em algumas modalidades, a partícula de proteína micronizada resultante, que forma o núcleo da micropartícula fabricada, tem um diâmetro de cerca de dois micrômetros a cerca de 30 micrômetros, com um diâmetro médio de cerca de 10 micrômetros a cerca de 12 micrômetros.
[00019] Em algumas modalidades, a proteína que forma o núcleo é uma proteína de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de antígeno é qualquer um ou mais de um anticorpo (por exemplo, IgG) ou fragmento de anticorpo, um receptor ou seu fragmento solúvel, um fragmento de receptor solúvel de célula-T, um fragmento solúvel de MHC, é uma proteína de fusão de receptor-Fc, uma proteína de captação, e uma proteína de armadilha-VEGF. Em uma modalidade específica, a proteína é uma de armadilha-VEGF que compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:1.
[00020] Em uma modalidade, o solvente é removido em etapa (3) por produção de uma dispersão da mistura de proteína-polímero-solvente de etapa (2) e permissão que o solvente evapore das gotículas produzidas pela dispersão. Em uma modalidade, a dispersão é produzida por secagem por pulverização, que pode ser realizada por sonificação com bocal dual, sonificação com bocal único, ou eletropulverização. Em uma modalidade, o solvente é removido das gotículas por aplicação de calor ou ar, ou por extração química.
[00021] Em uma modalidade, o polímero é biodegradável, bioerodível, e/ou biocompatível. Em algumas modalidades, o polímero é qualquer um ou mais de poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero polilático-poliglicólico (PLGA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), fumarato de PLGA-(óxido de etileno), succinato de PLGA-alfa-tocoferila esterificado em polietilenoglicol 1.000 (PLGA-TGPS), polianidrido-poli[1,6- bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-ε-caprolactona (PCL), poli(cianoacrilato de alquila) (PAC), poli(cianoacrilato de etila) (PEC), poli(cianoacrilato de isobutila), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (poli(HPMA)), poli-β-R-hidroxi- butirato (PHB), poli-β-R-hidroxi-alcanoato (PHA), poli—e—R—ácido málico, polímeros de fosfolipídeo-colesterol, 2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfatidilcolina/polietilenoglicol—distearoilfosfatidiletanolamina (DOPC/PEG— DSPE)/Colesterol, polissacarídeos, celulose, etilcelulose, metilcelulose, alginatos, polímeros de hidrogel de dextrano e dextrano, amilose, inulina, pectina e goma guar, quitosana, quitina, heparina, ácido hialurônico, polirrotaxanos e polipseudorrotaxanos à base de ciclodextrina (CD), poliaspartatos, poliglutamatos, polilucina, copolímeros de leucina—glutamato, poli(succinato de butileno) (PBS), gelatina, colágenos, fibrinas, fibroína, poliortoésteres, copolímero de poliortoéster—poliamidina, copolímeros de poliortoéster—diamina, poliortoésteres incorporando ácidos latentes, copolímero de poli(etilenoglicol)/poli(tereftalato de butileno), e suas combinações e seus copolímeros. Em uma modalidade, o polímero é poli—ε— caprolactona (PCL) ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o polímero é PLGA ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o polímero é etilcelulose ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o polímero é poliortoéster, ou um seu derivado, que contém elementos instáveis a ácido. Em outra modalidade, o polímero é PLA.
[00022] Em um aspecto, a invenção fornece um método de fabricar uma micropartícula que compreende as etapas de (1) formar uma partícula de proteína micronizada que tem um diâmetro de cerca de dois micrômetros a cerca de 30 micrômetros, com um diâmetro médio de cerca de 10 micrômetros a 12 micrômetros, por secagem por pulverização de uma solução que contém uma proteína, em que a proteína é uma proteína de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de antígeno é qualquer um ou mais de um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um receptor ou seu fragmento solúvel, um fragmento de receptor solúvel de célula-T, um fragmento solúvel de MHC, é uma proteína de fusão de receptor-Fc, uma proteína de captação, e uma proteína de armadilha-VEGF (por exemplo, uma que tem a sequência de SEQ ID NO:1); (2) suspender a partícula de proteína micronizada em uma solução que compreende o polímero e um solvente, em que o polímero é qualquer um ou mais de um polímero biodegradável, um polímero bioerodível, um polímero biocompatível, poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero polilático-poliglicólico (PLGA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), fumarato de PLGA-(óxido de etileno), succinato de PLGA-alfa-tocoferila esterificado em polietilenoglicol 1.000 (PLGA-TGPS), polianidrido-poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-ε- caprolactona (PCL), poli(cianoacrilato de alquila) (PAC), poli(cianoacrilato de etila) (PEC), poli(cianoacrilato de isobutila), poli-N-(2- hidroxipropil)metacrilamida (poli(HPMA)), poli-β-R-hidroxi-butirato (PHB), poli-β-R-hidroxi-alcanoato (PHA), poli—e—R—ácido málico, polímeros de fosfolipídeo-colesterol, 2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfatidilcolina/polietilenoglicol-distearoilfosfatidiletanolamina (DOPC/PEG- DSPE)/Colesterol, polissacarídeos, celulose, etilcelulose, metilcelulose, alginatos, polímeros de hidrogel de dextrano e dextrano, amilose, inulina, pectina e goma guar, quitosana, quitina, heparina, ácido hialurônico, polirrotaxanos e polipseudorrotaxanos à base de ciclodextrina (CD), poliaspartatos, poliglutamatos, polilucina, copolímeros de leucina-glutamato, poli(succinato de butileno) (PBS), gelatina, colágenos, fibrinas, fibroína, poliortoésteres, copolímero de poliortoéster-poliamidina, copolímeros de poliortoéster-diamina, poliortoésteres incorporando ácidos latentes, copolímero de poli(etilenoglicol)/poli(tereftalato de butileno), e suas combinações e seus copolímeros; e (3) remover o solvente por secagem por pulverização da suspensão de partícula de proteína micronizada - polímero - solvente e expulsar o solvente pela aplicação de calor ou ar, ou por extração do solvente, em que é formada uma micropartícula que tem um diâmetro de cerca de dois micrômetros a cerca de 70 micrômetros, com um diâmetro médio de cerca de 15 micrômetros a cerca de 30 micrômetros, e que compreende um núcleo de proteína e um córtex de polímero.
[00023] Em algumas modalidades, a secagem por pulverização de etapa (1) ou etapa (3) é realizada via sonificação com bocal dual, sonificação com bocal único, ou eletropulverização.
[00024] Em uma modalidade, o método de fabricar a micropartícula compreende as etapas de (1) formar uma partícula de armadilha-VEGF micronizada que tem um diâmetro de cerca de 10 micrômetros a 12 micrômetros por secagem por pulverização de uma solução que contém uma proteína de armadilha-VEGF; (2) suspender a partícula de armadilha-VEGF micronizada em uma solução que compreende poliortoéster incorporando um ácido latente e um solvente compatível, ou etilcelulose e um solvente compatível; e (3) remover o solvente por (a) secagem por pulverização da suspensão de partícula de armadilha-VEGF micronizada - poliortoéster - ácido latente - solvente ou da suspensão de partícula de armadilha-VEGF micronizada - etilcelulose - solvente e (b) expulsar o solvente pela aplicação de calor ou ar, ou por extração do solvente, em que é formada uma micropartícula que tem um diâmetro de cerca de 15 micrômetros a cerca de 30 micrômetros, e que compreende um núcleo de armadilha-VEGF e um córtex de polímero de poliortoéster, e seus copolímeros ou derivados.
[00025] Em um aspecto, a invenção fornece uma formulação de liberação prolongada de uma proteína terapêutica para a soltura ou liberação de um nível constante da proteína terapêutica no decorrer do tempo. A formulação de liberação prolongada compreende uma pluralidade de micropartículas, que variam em tamanho de cerca de dois micrômetros a cerca de 70 micrômetros, cada uma das quais compreende um núcleo de proteína micronizado de cerca de dois micrômetros a cerca de 30 micrômetros, e um córtex de polímero.
[00026] Em uma modalidade, proteína terapêutica é uma proteína de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de antígeno é qualquer um ou mais de um anticorpo (por exemplo, IgG) ou fragmento de anticorpo, um receptor ou seu fragmento solúvel, um fragmento de receptor solúvel de célula-T, um fragmento solúvel de MHC, é uma proteína de fusão de receptor-Fc, uma proteína de captação, e uma proteína de armadilha-VEGF (por exemplo, uma das quais tem uma estrutura primária de SEQ ID NO:1). Em uma modalidade, a proteína terapêutica compreende um domínio Fc. Em uma modalidade, a proteína é um anticorpo. Em outra modalidade, a proteína é uma IgG. Em outra modalidade, proteína terapêutica é uma proteína de fusão de receptor-Fc. Em outra modalidade, proteína terapêutica é uma proteína de captação, que compreende um fragmento de receptor cognato e um domínio Fc. Em uma modalidade específica, proteína terapêutica é uma proteína de armadilha-VEGF. Em ainda outra modalidade, a armadilha-VEGF compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:1.
[00027] Em uma modalidade, o córtex de polímero compreende um polímero biocompatível. Em uma modalidade, o córtex de polímero compreende um polímero bioerodível. Em uma modalidade, o córtex de polímero compreende um polímero biodegradável. Em algumas modalidades, o córtex de polímero compreende um polímero selecionado do grupo consistindo em poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero polilático-poliglicólico (PLGA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), fumarato de PLGA-(óxido de etileno), succinato de PLGA-alfa- tocoferila esterificado em polietilenoglicol 1.000 (PLGA-TGPS), polianidrido-poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-ε-caprolactona (PCL), poli(cianoacrilato de alquila) (PAC), poli(cianoacrilato de etila) (PEC), poli(cianoacrilato de isobutila), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (poli(HPMA)), poli-β-R-hidroxi-butirato (PHB), poli-β-R-hidroxi-alcanoato (PHA), poli-e-R-ácido málico, polímeros de fosfolipídeo-colesterol, 2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina/polietilenoglicol- distearoilfosfatidiletanolamina (DOPC/PEG-DSPE)/Colesterol, polissacarídeos, celulose, etilcelulose, metilcelulose, alginatos, polímeros de hidrogel de dextrano e dextrano, amilose, inulina, pectina e goma guar, quitosana, quitina, heparina, ácido hialurônico, polirrotaxanos e polipseudorrotaxanos à base de ciclodextrina (CD), poliaspartatos, poliglutamatos, polilucina, copolímeros de leucina-glutamato, poli(succinato de butileno) (PBS), gelatina, colágenos, fibrinas, fibroína, poliortoésteres, copolímero de poliortoéster-poliamidina, copolímeros de poliortoéster- diamina, poliortoésteres incorporando ácidos latentes, copolímero de poli(etilenoglicol)/poli(tereftalato de butileno), e suas combinações e seus copolímeros. Em uma modalidade, o polímero é poli-ε-caprolactona (PCL) ou um seu derivado ou copolímero. Em uma modalidade, o córtex de polímero compreende a PLGA. Em uma modalidade, o córtex de polímero compreende uma etilcelulose. Em uma modalidade, o córtex de polímero compreende qualquer um ou mais de PLA, PLGA, etilcelulose, e poliortoéster, e seus copolímeros ou derivados.
[00028] Em uma modalidade, a pluralidade de micropartículas compreende uma coleção de micropartículas que tem uma variedade de espessuras do córtex de polímero, de tal modo que as micropartículas individuais da coleção de micropartículas se degradam em uma taxa diferente, o que permite uma taxa de liberação uniforme da proteína terapêutica.
[00029] Em uma modalidade, a pluralidade de micropartículas compreende uma mistura de partículas de proteína micronizadas não revestidas e de micropartículas que têm uma variedade de espessuras do córtex de polímero, o que permite a liberação de proteína terapêutica em intervalos periódicos com base na espessura do córtex.
[00030] Em uma modalidade, a pluralidade de micropartículas compreende uma mistura de micropartículas que têm córtices de polímero de níveis variados de hidrofobicidade para controlar a sincronização ou a duração de degradação e liberação subsequente. Em uma modalidade, cada uma das micropartículas compreende uma camada de polímero interna e uma camada de polímero externa, em que a camada de polímero externa limita a hidratação da camada de polímero interna para controlar a liberação da proteína terapêutica.
[00031] Em uma modalidade, proteína terapêutica é liberada da pluralidade de micropartículas em uma taxa de cerca de 0,01 mg/semana a cerca de 0,30 mg/semana durante pelo menos 60 dias, quando as micropartículas estão em um ambiente aquoso. Em uma modalidade, o ambiente aquoso é tampão in vitro. Em uma modalidade, o ambiente aquoso é in vivo. Em uma modalidade, o ambiente aquoso é ex vivo. Em uma modalidade, o ambiente aquoso é um humor vítreo.
[00032] Em uma modalidade, a formulação de liberação prolongada compreende uma pluralidade de micropartículas, que variam em tamanho de cerca de dois micrômetros a cerca de 70 micrômetros e que compreendem (a) um núcleo de proteína terapêutica micronizada de cerca de dois micrômetros a cerca de 30 micrômetros, em que a proteína terapêutica é uma proteína de ligação de antígeno, que em alguns casos pode ser qualquer um ou mais de um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um receptor ou seu fragmento solúvel, um fragmento de receptor solúvel de célula-T, um fragmento solúvel de MHC, é uma proteína de fusão de receptor-Fc, uma proteína de captação, e uma proteína de armadilha-VEGF; e (b) um córtex de polímero de uma variedade de espessuras, em que o polímero é qualquer um ou mais de um polímero biocompatível, um polímero biodegradável, um polímero bioerodível, poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero polilático-poliglicólico (PLGA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), fumarato de PLGA-(óxido de etileno), succinato de PLGA-alfa-tocoferila esterificado em polietilenoglicol 1,000 (PLGA-TGPS), polianidrido-poli[1,6- bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-ε-caprolactona (PCL), poli(cianoacrilato de alquila) (PAC), poli(cianoacrilato de etila) (PEC), poli(cianoacrilato de isobutila), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (poli(HPMA)), poli-β-R-hidroxi- butirato (PHB), poli-β-R-hidroxi-alcanoato (PHA), poli—e—R—ácido málico, polímeros de fosfolipídeo-colesterol, 2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfatidilcolina/polietilenoglicol-distearoilfosfatidiletanolamina (DOPC/PEG- DSPE)/Colesterol, polissacarídeos, celulose, etilcelulose, metilcelulose, alginatos, polímeros de hidrogel de dextrano e dextrano, amilose, inulina, pectina e goma guar, quitosana, quitina, heparina, ácido hialurônico, polirrotaxanos e polipseudorrotaxanos à base de ciclodextrina (CD), poliaspartatos, poliglutamatos, polilucina, copolímeros de leucina-glutamato, poli(succinato de butileno) (PBS), gelatina, colágenos, fibrinas, fibroína, poliortoésteres, copolímero de poliortoéster-poliamidina, copolímeros de poliortoéster-diamina, poliortoésteres incorporando ácidos latentes, copolímero de poli(etilenoglicol)/poli(tereftalato de butileno), e suas combinações e seus copolímeros, em que as micropartículas soltam ou liberam um nível constante da proteína terapêutica em uma taxa de cerca de 0,01 mg/semana a cerca de 0,30 mg/semana durante pelo menos 60 dias.
[00033] Em uma modalidade, a formulação de liberação prolongada compreende uma pluralidade de micropartículas, que variam em tamanho de cerca de dois micrômetros a cerca de 70 micrômetros, com um tamanho médio de cerca de 15 micrômetros a cerca de 30 micrômetros, e que compreendem (a) um núcleo de proteína micronizado de cerca de dois micrômetros a cerca de 30 micrômetros, com um tamanho médio de cerca de 10 micrômetros a cerca de 12 micrômetros, em que a proteína é uma proteína de armadilha-VEGF; e (b) um córtex de polímero de uma variedade de espessuras, em que o polímero é qualquer um ou mais de PLGA, etilcelulose, e poliortoéster, e seus copolímeros ou derivados, de tal modo que em um ambiente aquoso as micropartículas soltam ou liberam um nível constante de armadilha-VEGF em uma taxa de cerca de 0,06 ± 0,02 mg/semana durante pelo menos 60 dias.
[00034] Em um aspecto, a invenção fornece um método de modular a liberação de uma proteína. Em uma modalidade, o método compreende a etapa de preparar uma pluralidade de micropartículas conforme descrita no aspecto prévio, seguida pela etapa de colocar as micropartículas dentro de um solvente. O solvente em algumas modalidades é aquoso. O solvente por estar in vitro, tal como uma solução tamponada com fosfato. O solvente pode estar in vivo, tal como por exemplo humor vítreo.
DESENHOS
[00035] A Figura 1 retrata a quantidade relativa (% em volume) de partículas de proteína sem um córtex de polímero de um determinado diâmetro (ECD (μm)) em uma população de partículas de proteína fabricadas a partir de 50 mg/mL de proteína de armadilha-VEGF, 25 mg/mL de proteína de armadilha-VEGF, e 25 mg/mL de proteína de armadilha-VEGF mais 0,1% de polissorbato 80.
[00036] A Figura 2 retrata a quantidade relativa (% em volume determinado por MFI) de micropartículas de um determinado diâmetro (ECD (μm)) em uma população de micropartículas fabricadas a partir de 50 mg/mL de proteína de armadilha-VEGF mais 50 mg/mL de POE, 250 mg/mL de POE, e 50 mg/mL de EC.
[00037] A Figura 3 retrata a quantidade de proteína de armadilha- VEGF em miligramas liberadas de micropartículas fabricadas a partir de 50 mg/mL de POE, 250 mg/mL de POE, ou 50 mg/mL de EC durante aproximadamente 60 dias.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00038] A micropartícula e o núcleo de proteína da presente invenção são de formato aproximadamente esférica. Algumas micropartículas e alguns núcleos de proteína aproximar-se-ão da esfericidade, enquanto que outras (outros) serão de formato mais irregular. Desta forma, como aqui usado, o termo “diâmetro” significa cada um e qualquer um dos seguintes: (a) o diâmetro de uma esfera que circunscreve a micropartícula ou o núcleo de proteína, (b) o diâmetro da esfera maior que se encaixa dentro dos limites da micropartícula ou do núcleo de proteína, (c) qualquer medição entre a esfera circunscrita de (a) e a esfera confinada de (b), incluindo a média entre as duas, (d) o comprimento do eixo mais longo da micropartícula ou do núcleo de proteína, (e) o comprimento do eixo mais curto da micropartícula ou do núcleo de proteína, (f) qualquer medição entre o comprimento do eixo longo (d) e o comprimento do eixo curto (e), incluindo a média dos dois, e/ou (g) diâmetro circular equivalente (“ECD”, equivalent circular diameter), conforme determinado por Micro-Flow ImagingTM (MFI, formação de imagem por microscopia de fluxo), análise de rastreamento de nanopartícula (NTA, nanoparticle tracking analysis), ou métodos de obscurecimento de luz tal como espalhamento de luz dinâmica (DLS, dynamic light scattering). Consulte em geral Sharma et al., “Micro-flow imaging: flow microscopy applied to subvisible particulate analysis in protein formulations”, AAPS J. 2010 Set; 12(3): 455-64. O diâmetro é em geral expressado em micrômetros (μm ou micrômetro). O diâmetro pode ser determinado por medição óptica.
[00039] “Partícula de proteína micronizada” ou “partícula de proteína” significa uma partícula que contém múltiplas moléculas de proteína com quantidades baixas, muito baixas, ou próximas de zero de água (por exemplo, <3% em peso de água). Como aqui usada, a partícula de proteína micronizada é de formato em geral esférico e tem um ECD que varia de 2 micrômetros a cerca de 35 micrômetros. A partícula de proteína micronizada não é limitada a nenhuma entidade de proteína específica, e é adequada para a preparação e a liberação de uma proteína terapêutica. As proteínas terapêuticas adequadas incluem inter alia proteínas de ligação de antígeno, como por exemplo, fragmentos de receptor solúveis, anticorpos (incluindo IgGs) e derivados ou fragmentos de anticorpos, outras proteínas contendo Fc, incluindo proteínas de fusão de Fc, e proteínas de fusão de receptor-Fc, incluindo as proteínas de captação (Huang, C., Curr. Opin. Biotechnol. 20: 692-99 (2009)) como por exemplo armadilha-VEGF.
[00040] A partícula de proteína micronizada da invenção pode ser preparada por qualquer método conhecido na técnica para preparar partículas de proteína micronizadas. Por exemplo, a partícula de proteína pode ser preparada inter alia por secagem por pulverização (infra), liofilização, moagem por jato, cristalização por gota suspensa (Ruth et al., Acta Crystallographica D56: 524-28 (2000)), precipitação gradual (US 7.998.477 (2011)), liofilização de uma mistura aquosa de proteína - PEG (polietilenoglicol) (Morita et al., Pharma. Res. 17: 1367-73 (2000)), precipitação em fluido supercrítico (US 6.063.910 (2000)), ou formação de partícula induzida por dióxido de carbono em alta pressão (Bustami et al., Pharma. Res. 17: 1360-66 (2000)).
[00041] Como aqui usado, o termo “proteína” refere-se a uma molécula que compreende dois ou mais resíduos de aminoácido unidos uns nos outros por ligações peptídicas. Peptídeos, polipeptídeos e proteínas também estão incluídos em modificações que incluem, mas não se limitam a, glicosilação, ligação em lipídeo, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação. Os polipeptídeos podem ser de interesse científico ou comercial, incluindo as drogas à base de proteína. Os polipeptídeos incluem, dentre outras coisas, anticorpos e proteínas quiméricas ou de fusão. Os polipeptídeos são produzidos por linhagens celulares recombinantes de animais com o uso de métodos de culturas celulares.
[00042] Um “anticorpo” o intencionado para se referir às moléculas de imunoglobulina que consistem de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H, heavy) e duas cadeias leves (L, light) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada tem uma região variável de cadeia pesada (HCVR, heavy chain variable region ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada contém três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve tem uma região variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve consiste em um domínio (CL). As regiões VH e VL podem ser adicionalmente divididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas de regiões determinantes de complementariedade (CDR, complementarity determining regions), entremeadas por regiões que estão mais conservadas, chamadas de regiões de armação (FR, framework regions). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, posicionadas a partir da terminação- amino até a terminação-carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo “anticorpo” inclui referência a ambas as imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qualquer isótipo ou subclasse. O termo “anticorpo” inclui, mas não se limita àqueles que são preparados, expressados, produzidos ou isolados por meio recombinante, tais como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo. Uma IgG compreende um subconjunto de anticorpos.
[00043] “Proteínas de fusão de Fc” compreendem parte das ou todas de duas ou mais proteínas, uma das quais é uma porção Fc de uma molécula de imunoglobulina, que não estão fusionadas em seu estado natural. A preparação de proteínas de fusão que compreendem certos polipeptídeos heterólogos fusionados em várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) tem sido descritas, por exemplo, por Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; e Hollenbaugh et al., “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, em Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10,19,1 - 10,19,11, 1992. “Proteínas de fusão de receptor- Fc” compreendem um ou mais domínio(s) extracelular(es) de um receptor acoplado a uma porção Fc, que em algumas modalidades compreende uma região de dobradiça seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a proteína de fusão-Fc contém duas ou mais cadeias de receptor distintas que se ligam a um único ou mais do que um ligante(s). Por exemplo, uma proteína de fusão-Fc é uma de captação, tal como por exemplo uma IL-1 de captação (por exemplo, Rilonacept, que contém a região de ligação de ligante IL-1RAcP fusionada em região extracelular de IL-1R1 fusionada em Fc de hIgGI; consulte a patente US n° 6.927.004, que é aqui incorporada em sua totalidade como referência), ou uma de armadilha-VEGF (por exemplo, Aflibercept, que contém o domínio 2 de Ig do receptor Flt1 de VEGF, fusionado no domínio 3 de Ig do receptor Flk1 de VEGF fusionado em Fc de hIgG1; por exemplo, SEQ ID NO:1; consulte patentes US n° 7.087.411 e 7.279.159, que são aqui incorporadas em suas totalidades como referências).
[00044] Como aqui usado, o termo “polímero” refere-se a uma macromolécula que compreende monômeros repetidos conectados por ligações químicas covalentes. Os polímeros usados na prática desta invenção são biocompatíveis e biodegradáveis. Um polímero biocompatível e biodegradável pode ser natural ou sintético. Os polímeros naturais incluem polinucleotídeos, polipeptídeos, como as proteínas que ocorrem na natureza, proteínas recombinantes, gelatina, colágenos, fibrinas, fibroína, poliaspartatos, poliglutamatos, polileucina, copolímeros de leucina-glutamato; e polissacarídeos, como alginatos de celulose, polímeros de hidrogel de dextrano e dextrano, amilose, inulina, pectina e goma guar, quitosana, quitina, heparina, e ácido hialurônico. Polímeros sintéticos biocompatíveis ou biodegradáveis incluem poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímero polilático-poliglicólico (PLGA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), fumarato de PLGA-(óxido de etileno), succinato de PLGA-alfa- tocoferila esterificado em polietilenoglicol 1,000 (PLGA-TGPS), polianidrido-poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-ε-caprolactona (PCL), poli(cianoacrilato de alquila) (PAC), poli(cianoacrilato de etila) (PEC), poli(cianoacrilato de isobutila), poli-N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (poli(HPMA)), poli-β-R-hidroxi-butirato (PHB), poli-β-R-hidroxi-alcanoato (PHA), poli-e-R-ácido málico, polímeros de fosfolipídeo-colesterol, 2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina/polietilenoglicol- distearoilfosfatidiletanolamina (DOPC/PEG-DSPE)/Colesterol, etilcelulose, polirrotaxanos e polipseudorrotaxanos à base de ciclodextrina (CD), poli(succinato de butileno) (PBS), poliortoésteres, copolímero de poliortoéster-poliamidinas, copolímeros de poliortoéster-diamina, poliortoésteres incorporando ácidos latentes para controlar as taxas de degradação, e inter alia copolímeros de poli(etilenoglicol)/poli(tereftalato de butileno).
[00045] Etilcelulose (EC) é um biomaterial bem conhecido e facilmente disponível usado nas ciências de alimento e farmacêutica. É um derivado de celulose no qual alguns dos grupos hidroxila da glicose estão substituídos por éter etílico. Consulte Martinac et al., J. Microencapsulation, 22(5): 549-561 (2005) e suas referências, que descrevem métodos de usar etilcelulose como polímeros biocompatíveis na fabricação de microesferas. Consulte também US 4.210.529 (1980) e suas referências para uma descrição detalhada de etilcelulose e métodos de preparar derivados de etilcelulose.
[00046] Poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA) também é um polímero biocompatível e biodegradável bem conhecido e aprovado pela “Food and Drug Administration (FDA)” usado em engenharia de tecido e sistemas de liberação farmacêutica. PLGA é um poliéster que contém monômero ácido glicólico e ácido lático. Para uma descrição da síntese de PLGA e da fabricação de nanopartículas de PLGA, consulte Astete e Sabliov, Biomater. Sci. Polym. Ed., 17(3): 247-89 (2006) e suas referências.
[00047] Poli-ε-caprolactona (PCL) é outro polímero biocompatível e biodegradável aprovado pela FDA para uso em humanos como um dispositivo de liberação de drogas. PCL é um poliéster de ε-caprolactona, que se hidrolisa rapidamente no corpo para formar um ácido hidroxicarboxílico não tóxico ou de toxicidade baixa. Para uma descrição da fabricação de PCL, consulte Labet e Thielemans, Chemical Society Reviews 38: 3484-3504 (2009) e suas referências. Para uma descrição da fabricação e do uso de microesferas e nanoesferas à base de PCL como sistemas de liberação, consulte Sinha et al., Int. J. Pharm., 278(1): 1-23 (2004) e suas referências.
[00048] Poliortoéster (POE) é um polímero bioerodível planejado para liberação de droga. É em geral um polímero de um ceteno-acetal, preferencialmente um diceteno-acetal cíclico, como por exemplo, 3,9- dimetileno-2,4,8,10-tetraoxaespiro[5,5]-undecano, que é polimerizado via condensação de glicol para formar as ligações ortoéster. Uma descrição da síntese de poliortoéster e de vários tipos pode ser encontrada por exemplo em US 4.304.767. Poliortoésteres podem ser modificados para controlar seu perfil de liberação de droga e suas taxas de degradação por permuta de vários dióis e polióis hidrofóbicos, como por exemplo, substituição de um hexanotriol por um decanotriol; e também adição de ácidos latentes, como por exemplo, ácido octanodioico ou semelhantes, na cadeia principal para aumentar a sensibilidade ao pH. Outras modificações no poliortoéster incluem a integração de uma amina para aumentar a funcionalidade. A formação, a descrição, e o uso de poliortoésteres são descritos em US 5.968.543; US 4.764.364; Heller e Barr, Biomacromolecules, 5(5): 1625-32 (2004); e Heller, Adv. Drug. Deliv. Rev., 57: 2053-62 (2005).
[00049] Como aqui usada, a frase “secagem por pulverização” significa um método de produção de um pó seco que compreende partículas micronizadas a partir de uma pasta fluida ou suspensão pelo uso de um secador por pulverização. Os secadores por pulverização utilizam um atomizador ou bocal de pulverização para dispersar a suspensão ou pasta fluida em uma pulverização de tamanho de gota controlado. Tamanho de gota de 10 μm a 500 μm pode ser gerado por secagem por pulverização. À medida que o solvente (água ou solvente orgânico) seca, a substância de proteína seca em partícula micrométrica, formando uma substância semelhante a pó; ou no caso de uma suspensão de proteína-polímero, durante a secagem, a casca dura de polímero circunda a carga de proteína.
[00050] As micropartículas da invenção compreendem um núcleo de proteína circundado por um córtex de polímero ou uma capa de polímero. Resumidamente, é formada uma partícula de proteína micronizada, que é então dispersada em uma solução de polímero (polímero dissolvido em solvente) para formar uma suspensão de proteína-polímero. A suspensão de proteína-polímero é então dispersada em gotículas micronizadas (atomizadas), e o solvente é expulso para formar a micropartícula.
[00051] Em uma modalidade, a partícula de proteína micronizada é formada pela preparação de uma solução da proteína e então pela sujeição daquela solução de proteína à dispersão e ao calor para formar um pó seco que compreende a proteína. Um método de formar as partículas de proteína micronizadas é por secagem por pulverização. Em uma modalidade, a proteína é uma proteína terapêutica que é formulada para incluir tampões, estabilizadores e outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para preparar uma formulação farmacêutica da proteína terapêutica. Formulações farmacêutica exemplificadoras são descritas em US 7.365.165, US 7.572.893, US 7.608.261, US 7.655.758, US 7.807.164, US 2010-0279933, US 2011-0171241, e PCT/US11/54856.
[00052] A quantidade de proteína terapêutica contida nas formulações farmacêuticas da presente invenção pode variar dependendo das propriedades específicas desejadas das formulações, e também das circunstâncias específicas e dos propósitos específicos para as quais (para os quais) as formulações são intencionadas para serem usadas. Em certas modalidades, as formulações farmacêuticas podem conter cerca de 1 mg/mL a cerca de 500 mg/mL de proteína; cerca de 5 mg/mL a cerca de 400 mg/mL de proteína; cerca de 5 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de proteína; cerca de 25 mg/mL a cerca de 180 mg/mL de proteína; cerca de 25 mg/mL a cerca de 150 mg/mL de proteína; ou cerca de 50 mg/mL a cerca de 180 mg/mL de proteína. Por exemplo, as formulações da presente invenção podem compreender cerca de 1 mg/mL; cerca de 2 mg/mL; cerca de 5 mg/mL; cerca de 10 mg/mL; cerca de 15 mg/mL; cerca de 20 mg/mL; cerca de 25 mg/mL; cerca de 30 mg/mL; cerca de 35 mg/mL; cerca de 40 mg/mL; cerca de 45 mg/mL; cerca de 50 mg/mL; cerca de 55 mg/mL; cerca de 60 mg/mL; cerca de 65 mg/mL; cerca de 70 mg/mL; cerca de 75 mg/mL; cerca de 80 mg/mL; cerca de 85 mg/mL; cerca de 86 mg/mL; cerca de 87 mg/mL; cerca de 88 mg/mL; cerca de 89 mg/mL; cerca de 90 mg/mL; cerca de 95 mg/mL; cerca de 100 mg/mL; cerca de 105 mg/mL; cerca de 110 mg/mL; cerca de 115 mg/mL; cerca de 120 mg/mL; cerca de 125 mg/mL; cerca de 130 mg/mL; cerca de 131 mg/mL; cerca de 132 mg/mL; cerca de 133 mg/mL; cerca de 134 mg/mL; cerca de 135 mg/mL; cerca de 140 mg/mL; cerca de 145 mg/mL; cerca de 150 mg/mL; cerca de 155 mg/mL; cerca de 160 mg/mL; cerca de 165 mg/mL; cerca de 170 mg/mL; cerca de 175 mg/mL; cerca de 180 mg/mL; cerca de 185 mg/mL; cerca de 190 mg/mL; cerca de 195 mg/mL; cerca de 200 mg/mL; cerca de 205 mg/mL; cerca de 210 mg/mL; cerca de 215 mg/mL; cerca de 220 mg/mL; cerca de 225 mg/mL; cerca de 230 mg/mL; cerca de 235 mg/mL; cerca de 240 mg/mL; cerca de 245 mg/mL; cerca de 250 mg/mL; cerca de 255 mg/mL; cerca de 260 mg/mL; cerca de 265 mg/mL; cerca de 270 mg/mL; cerca de 275 mg/mL; cerca de 280 mg/mL; cerca de 285 mg/mL; cerca de 200 mg/mL; cerca de 200 mg/mL; ou cerca de 300 mg/mL de proteína terapêutica.
[00053] As formulações farmacêuticas da presente invenção compreendem um ou mais excipientes. O termo “excipiente”, como aqui usado, significa qualquer agente não terapêutico adicionado na formulação para conceder uma consistência, uma viscosidade ou um efeito estabilizador desejados.
[00054] As formulações farmacêuticas da presente invenção também podem compreender um ou mais carboidratos, por exemplo, um ou mais açúcares. O açúcar pode ser um açúcar redutor ou um açúcar não redutor. “Açúcares redutores” incluem, por exemplo, açúcares com um grupo cetona ou aldeído e contêm um grupo hemiacetal reativo, que permite que o açúcar atue como um açúcar redutor. Exemplos específicos de açúcares redutores incluem frutose, glicose, gliceraldeído, lactose, arabinose, manose, xilose, ribose, ramnose, galactose e maltose. Açúcares não redutores podem compreender um carbono anomérico que é um acetal e é não substancialmente reativo com aminoácidos ou polipeptídeos para iniciar uma reação de Maillard. Exemplos específicos de açúcares não redutores incluem sacarose, trealose, sorbose, sucralose, melezitose e rafinose. Ácidos de açúcar incluem, por exemplo, ácidos sacáricos, gliconato e outros açúcares poli- hidroxilados e seus sais.
[00055] A quantidade de açúcar contida dentro das formulações farmacêuticas da presente invenção variará dependendo das circunstâncias específicas e dos propósitos intencionados para as quais (os quais) as formulações são usadas. Em certas modalidades, as formulações podem conter cerca de 0,1% a cerca de 20% sugar; cerca de 0,5% a cerca de 20% sugar; cerca de 1% a cerca de 20% de açúcar; cerca de 2% a cerca de 15% de açúcar; cerca de 3% a cerca de 10% de açúcar; cerca de 4% a cerca de 10% de açúcar; ou cerca de 5% a cerca de 10% de açúcar. Por exemplo, as formulações farmacêuticas da presente invenção podem compreender cerca de 0,5%; cerca de 1,0%; cerca de 1,5%; cerca de 2,0%; cerca de 2,5%; cerca de 3,0%; cerca de 3,5%; cerca de 4,0%; cerca de 4,5%; cerca de 5,0%; cerca de 5,5%; cerca de 6,0%; 6,5%; cerca de 7,0%; cerca de 7,5%; cerca de 8,0%; cerca de 8,5%; cerca de 9,0%; cerca de 9,5%; cerca de 10,0%; cerca de 10,5%; cerca de 11,0%; cerca de 11,5%; cerca de 12,0%; cerca de 12,5%; cerca de 13,0%; cerca de 13,5%; cerca de 14,0%; cerca de 14,5%; cerca de 15,0%; cerca de 15,5%; cerca de 16,0%; 16,5%; cerca de 17,0%; cerca de 17,5%; cerca de 18,0%; cerca de 18,5%; cerca de 19,0%; cerca de 19,5%; ou cerca de 20,0% de açúcar (por exemplo, sacarose).
[00056] As formulações farmacêuticas da presente invenção também podem compreender um ou mais tensoativos. Como aqui usado, o termo “tensoativo” significa uma substância que reduz a tensão superficial de um fluido no qual ele está dissolvido e/ou reduz a tensão superficial entre óleo e água. Os tensoativos podem ser iônicos ou não iônicos. Exemplos de tensoativos não iônicos que podem ser incluídos nas formulações da presente invenção incluem, por exemplo, alquilpoli(óxido de etileno), alquilpoliglicosídeos (por exemplo, octilglicosídeo e decilmaltosídeo), álcoois graxos como álcool cetílico e álcool oleílico, cocamida-MEA, cocamida- DEA, e cocamida-TEA. Tensoativos não iônicos específicos que podem ser incluídos nas formulações da presente invenção incluem, por exemplo, polissorbatos como polissorbato 20, polissorbato 28, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 65, polissorbato 80, polissorbato 81, e polissorbato 85; poloxâmeros como poloxâmero 188, poloxâmero 407; polietileno-polipropilenoglicol; ou polietilenoglicol (PEG). Polissorbato 20 também é conhecido como TWEEN 20, monolaurato de sorbitana e monolaurato de polioxietilenossorbitana.
[00057] A quantidade de tensoativo contida nas formulações farmacêuticas da presente invenção podem variar dependendo das propriedades específicas desejadas das formulações, e também das circunstâncias específicas e dos propósitos específicos para as quais (para os quais) as formulações são intencionadas para serem usadas. Em certas modalidades, as formulações podem conter cerca de 0,05% a cerca de 5% de tensoativo; ou cerca de 0,1% a cerca de 0,2% de tensoativo. Por exemplo, as formulações da presente invenção podem compreender cerca de 0,05%; cerca de 0,06%; cerca de 0,07%; cerca de 0,08%; cerca de 0,09%; cerca de 0,10%; cerca de 0,11%; cerca de 0,12%; cerca de 0,13%; cerca de 0,14%; cerca de 0,15%; cerca de 0,16%; cerca de 0,17%; cerca de 0,18%; cerca de 0,19%; cerca de 0,20%; cerca de 0,21%; cerca de 0,22%; cerca de 0,23%; cerca de 0,24%; cerca de 0,25%; cerca de 0,26%; cerca de 0,27%; cerca de 0,28%; cerca de 0,29%; ou cerca de 0,30% de tensoativo (por exemplo, polissorbato 20).
[00058] As formulações farmacêuticas da presente invenção também podem compreender um ou mais tampões. Em algumas modalidades, o tampão tem uma faixa de tamponamento que inclui totalmente ou em parte a faixa de pH de 5,5 - 7,4. Em uma modalidade, o tampão tem um pKa de cerca de 6,0 ± 0,5. Em certas modalidades, o tampão compreende um tampão fosfato. Em certas modalidades, o fosfato está presente em uma concentração de 5 mM ± 0,75 mM a 15 mM ± 2,25 mM; 6 mM ± 0,9 mM a 14 mM ± 2,1 mM; 7 mM ± 1,05 mM a 13 mM ± 1,95 mM; 8 mM ± 1,2 mM a 12 mM ± 1,8 mM; 9 mM ± 1,35 mM a 11 mM ± 1,65 mM; 10 mM ± 1,5 mM; ou cerca de 10 mM. Em certas modalidades, o sistema tampão compreende histidina a 10 mM ± 1,5 mM, em um pH de 6,0 ± 0,5.
[00059] As formulações farmacêuticas da presente invenção podem ter um pH de cerca de 5,0 a cerca de 8,0. Por exemplo, as formulações da presente invenção podem ter um pH de cerca de 5,0; cerca de 5,2; cerca de 5,4; cerca de 5,6; cerca de 5,8; cerca de 6,0; cerca de 6,2; cerca de 6,4; cerca de 6,6; cerca de 6,8; cerca de 7,0; cerca de 7,2; cerca de 7,4; cerca de 7,6; cerca de 7,8; ou cerca de 8,0.
[00060] Em uma modalidade específica, proteína terapêutica é uma proteína de armadilha-VEGF. As formulações farmacêuticas para a formação de partículas micronizadas de proteína de armadilha-VEGF podem conter de cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de proteína de armadilha-VEGF, cerca de 10 mg/mL, cerca de 15 mg/mL, cerca de 20 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 30 mg/mL, cerca de 35 mg/mL, cerca de 40 mg/mL, cerca de 45 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 55 mg/mL, cerca de 60 mg/mL, cerca de 65 mg/mL, cerca de 70 mg/mL, cerca de 75 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 85 mg/mL, cerca de 90 mg/mL, cerca de 95 mg/mL, ou cerca de 100 mg/mL de proteína de armadilha-VEGF. Soluções podem conter um ou mais tampões de cerca de 5 mM a cerca de 50 mM. Em uma modalidade, o tampão é fosfato de cerca de 10 mM em um pH de cerca de 6 ± 0,5. Soluções também podem conter sacarose em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 10%. Em uma modalidade, a solução contém sacarose a cerca de 2% p/p.
[00061] Em algumas modalidades, a solução de proteína terapêutica contém proteína de armadilha-VEGF a cerca de 25 mg/mL ou cerca de 50 mg/mL em fosfato 10 mM, pH 6,2, 2% de sacarose, e opcionalmente 0,1% de polissorbato.
[00062] A formulação de proteína terapêutica é então submetida à dispersão e à secagem para formar partículas de proteína micronizadas. Um método de preparar as partículas de proteína micronizadas é submeter a solução de proteína à secagem por pulverização. Secagem por pulverização é em geral conhecida na técnica e pode ser realizada em equipamento tal como por exemplo, um BÜCHI Mini Spray Dryer B-290 (Büchi Labortechnik AG, Flawil, CH). Em uma modalidade específica, a solução de proteína (por exemplo, mas não limitada a qualquer uma das formulações de armadilha- VEGF descritas acima) é bombeada para dentro do secador por pulverização em uma taxa de cerca de 2 mL/min a cerca de 15 mL/min, ou cerca de 7 mL/min. A temperatura de entrada do secador por pulverização é ajustada em uma temperatura acima do ponto de ebulição da água, tal como, por exemplo, a cerca de 130°C. A temperatura de saída é ajustada em uma temperatura abaixo do ponto de ebulição da água e acima da temperatura ambiente, tal como por exemplo, 55°C. Em uma modalidade específica, a solução de proteína (por exemplo, solução de armadilha-VEGF ou solução de IgG) é bombeada para dentro de um BÜCHI Mini Spray Dryer B-290 a cerca de 7 mL/min, com uma temperatura de entrada de cerca de130°C e uma temperatura de saída de cerca de 55°C, com o aspirador ajustado a 33 m3/h e o gás de pulverização a 530 L/h.
[00063] As partículas de proteína micronizadas resultantes variam em tamanho de cerca de 1 μm a cerca de 100 μm em diâmetro, dependendo da formulação específica e da concentração de proteína e excipientes. Em algumas modalidades, as partículas de proteína micronizadas têm um diâmetro de cerca de 1 μm a cerca de 100 μm, de cerca de 1 μm a cerca de 40 μm, de cerca de 2 μm a cerca de 15 μm, de cerca de 2,5 μm a cerca de 13 μm, de cerca de 3 μm a cerca de 10 μm, cerca de 5 μm, cerca de 6 μm, cerca de 7 μm, cerca de 8 μm, cerca de 9 μm, cerca de 10 μm, cerca de 11 μm, ou cerca de 12 μm.
[00064] As partículas de proteína micronizadas são então revestidas com um polímero biocompatível e biodegradável. Isto pode ser realizado pela suspensão das partículas de proteína micronizadas em uma solução de polímero. Uma solução de polímero é essencialmente um polímero dissolvido em um solvente. Por exemplo, o polímero biocompatível e biodegradável pode ser dissolvido inter alia em cloreto de metileno, tetra-hidro-furano, acetato de etila, ou algum outro solvente útil. Acetato de etila é amplamente conhecido como um solvente seguro e é com frequência usado na preparação de drogas, implantes, e gêneros alimentícios.
[00065] Em algumas modalidades, o polímero pode ser etilcelulose (“EC”), poli(ácido lático) (“PLA”), poliortoéster (“POE”), poli-D,L-lactídeo- co-glicolídeo (“PLGA”), ou poli-ε-caprolactona (“PCL”). O polímero pode ser dissolvido no solvente (por exemplo, acetato de etila) em uma concentração de cerca de 10 mg/mL a cerca de 300 mg/mL, de cerca de 15 mg/mL a cerca de 295 mg/mL, de cerca de 20 mg/mL a cerca de 290 mg/mL, de cerca de 25 mg/mL a cerca de 280 mg/mL, de cerca de 30 mg/mL a cerca de 270 mg/mL, de cerca de 35 mg/mL a cerca de 265 mg/mL, de cerca de 40 mg/mL a cerca de 260 mg/mL, de cerca de 45 mg/mL a cerca de 260 mg/mL, de cerca de 50 mg/mL a cerca de 255 mg/mL, de cerca de 55 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, cerca de 20 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 30 mg/mL, cerca de 35 mg/mL, cerca de 40 mg/mL, cerca de 45 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 75 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 125 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 175 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 225 mg/mL, ou cerca de 250 mg/mL.
[00066] As partículas de proteína micronizadas são adicionadas na solução de polímero a cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL, cerca de 15 mg/mL a cerca de 95 mg/mL, cerca de 20 mg/mL a cerca de 90 mg/mL, cerca de 25 mg/mL a cerca de 85 mg/mL, cerca de 30 mg/mL a cerca de 80 mg/mL, cerca de 35 mg/mL a cerca de 75 mg/mL, cerca de 40 mg/mL a cerca de 70 mg/mL, cerca de 45 mg/mL a cerca de 65 mg/mL, cerca de 50 mg/mL a cerca de 60 mg/mL, a cerca de 25 mg/mL, a cerca de 30 mg/mL, a cerca de 35 mg/mL, a cerca de 40 mg/mL, a cerca de 45 mg/mL, ou a cerca de 50 mg/mL. As partículas são misturadas para formar uma pasta fluida ou suspensão, que é então submetida à dispersão e à secagem para formar a partícula de proteína revestida com polímero (isto é, micropartícula).
[00067] Em uma modalidade, a suspensão solução de partícula de proteína - polímero é submetida à secagem por pulverização, que é então conduzida em uma maneira similar à do método para fabricar as partículas de proteína micronizadas, mas com uma temperatura de entrada reduzida para proteger contra a ignição do solvente orgânico ou do polímero. Resumidamente, a suspensão solução de partícula de proteína - polímero é bombeada para dentro do secador por pulverização em uma taxa de cerca de 5 mL/min a cerca de 20 mL/min, ou cerca de 12,5 mL/min. A suspensão foi bombeada a 12,5 mL/min para dentro do secador por pulverização com uma taxa de fluxo de ar de aspirador ou de gás de pulverização de cerca de 530 L/h e 35 m3/h (mm), respectivamente. A temperatura de entrada foi ajustada a 90°C e a temperatura de saída foi ajustada a cerca de 54°C. A temperatura de entrada do secador de pulverização é ajustada em uma temperatura acima do ponto de fulgor do solvente, tal como por exemplo, a cerca de 90°C. A temperatura de saída é ajustada em uma temperatura abaixo da temperatura de entrada e acima da temperatura ambiente, tal como, por exemplo, a cerca de 54°C. Em uma modalidade específica, uma suspensão contendo cerca de 50 mg/mL de partícula de proteína (por exemplo, armadilha-VEGF) em cerca de 50 mg/mL a cerca de 250 mg/mL de solução de polímero/acetato de etila é bombeada para dentro de BÜCHI Mini Spray Dryer B-290 a cerca de 12,5 mL/min, com uma temperatura de entrada de cerca de 90°C e uma temperatura de saída de cerca de 54°C, com o ar de aspirador ajustado a cerca de 35 m3/h e gás de pulverização a cerca de 530 L/h.
[00068] As micropartículas resultantes, que contêm um núcleo de partícula de proteína dentro de um córtex de polímero, têm uma faixa de diâmetros de cerca de 2 μm a cerca de 70 μm, cerca de 5 μm a cerca de 65 μm, cerca de 10 μm a cerca de 60 μm, cerca de 15 μm a cerca de 55 μm, cerca de 20 μm a cerca de 50 μm, cerca de 15 μm, cerca de 20 μm, cerca de 25 μm, ou cerca de 30 μm. A variação de tamanho em grande parte reflete a espessura do córtex de polímero, embora o diâmetro do núcleo de proteína possa contribuir para a variação do tamanho em alguma extensão. A manipulação da concentração inicial da solução de polímero, e/ou do próprio polímero pode controlar o diâmetro da micropartícula. Por exemplo, aquelas micropartículas que foram fabricadas com o uso de 50 mg/mL de polímero têm um tamanho médio de cerca de 15 μm a 20 μm, enquanto que aquelas micropartículas que foram fabricadas com a utilização de 250 mg/mL de polímero tiveram um tamanho médio de cerca de 30 μm.
[00069] As micropartículas da presente invenção são úteis na liberação prolongada ou na liberação no decorrer do tempo de proteínas terapêuticas. Por exemplo, é previsto que as micropartículas de armadilha-VEGF são úteis na liberação prolongada de proteína terapêutica armadilha-VEGF, por exemplo, no humor vítreo para o tratamento de distúrbios vasculares dos olhos, ou em implantação subcutânea para a liberação prolongada de armadilha-VEGF para tratar câncer ou outros distúrbios.
[00070] As micropartículas da presente invenção liberam proteína em um ambiente aquoso fisiológico a cerca de 37°C em uma taxa relativamente constante durante um período de tempo prolongado, em pelo menos 60 dias. Em geral, aquelas micropartículas fabricadas com uma concentração mais alta de polímero (por exemplo, 250 mg/mL) tenderam a mostrar um perfil de liberação de proteína relativamente linear; enquanto que aquelas micropartículas fabricadas com uma concentração mais baixa de polímero (por exemplo, 50 mg/mL) tenderam a mostrar uma liberação repentina inicial seguida por um início de uma liberação repentina retardada. Ademais, as micropartículas formadas de uma concentração mais alta de polímero mostraram uma taxa mais lenta de liberação de proteína do que aquelas formadas a partir de uma concentração mais baixa de partículas. A qualidade da proteína liberada das micropartículas no decorrer do tempo foi consistente com a qualidade do material de proteína inicial. Ocorreu pouca ou nenhuma degradação de proteína.
EXEMPLOS
[00071] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a fornecerem àquelas pessoas comumente versadas na técnica uma revelação completa e uma descrição de como preparar e usar os métodos e as composições da invenção, e não são intencionados para limitarem o escopo do que os inventores consideram como a invenção deles. Esforços têm sido feitos para garantir acurácia com relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, tamanhos, etc.) mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados.
[00072] Nos seguintes exemplos, proteína de armadilha-VEGF (“VGT”), que é um dímero do polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:1, serve como uma proteína de fusão de receptor-Fc exemplificadora.
EXEMPLO 1: PROTEÍNAS MICRONIZADAS
[00073] Soluções contendo 25 mg/mL de proteína de armadilha-VEGF (“VGT”), 25 mg/mL de VGT mais 0,1% de polissorbato 80, e 50 mg/mL de VGT em fosfato 10 mM, 2% de sacarose, pH 6,2 foram cada uma independentemente atomizadas em um micronizador por secagem por pulverização (BÜCHI Mini Spray Dryer B-290, Büchi Labortechnik AG, Flawil, CH) para formar gotículas contendo armadilha-VEGF. Calor foi aplicado para evaporar a água das gotículas, resultando em um pó contendo armadilha-VEGF. A temperatura de entrada foi ajustada a 130°C e temperatura de saída a cerca de 55°C. O ar do aspirador foi ajustado a 33 m3/h e o gás de pulverização a 530 L/h. A solução de VGT foi bombeada a cerca de 7 mL/min.
[00074] O tamanho das partículas de VGT resultantes foi medido por micro-flow imaging (MFI, formação de imagem por microscopia de fluxo) e formação de imagem por luz dinâmica (DLS). Figura 1 retrata a distribuição de tamanhos de partícula conforme determinada por MFI para as partículas de VGT derivadas de cada uma das concentrações de 25 mg/mL de VGT, 25 mg/mL de VGT mais 0,1% de polissorbato 80, e 50 mg/mL de VGT. Para todas as concentrações, o diâmetro circular equivalente (ECD) das partículas de VGT variou de cerca de 1 μm a cerca de 39 μm, com a maioria das partículas variando em tamanho de cerca de 2 μm a cerca de 14 μm. Para a solução de 25 mg/mL de VGT, as partículas aglomeraram-se na faixa de cerca de 2,5 μm a cerca de 8,8 μm, com um valor modal cerca de 6 μm. Para a solução de 25 mg/mL de VGT mais 0,1% de polissorbato 80, as partículas aglomeraram-se na faixa de cerca de 2,5 μm a cerca de 9,7 μm, com um valor modal de cerca de 6 μm. Para a solução de 50 mg/mL de VGT, as partículas aglomeraram-se na faixa de cerca de 2,7 μm a cerca de 12,8 μm, com um valor modal de cerca de 7 μm. Os diâmetros médios de cada formulação, conforme determinados por ambos os métodos MFI e DLS, são descritos em Tabela 1.
[00075] As partículas de VGT foram reconstituídas em água para injeção e examinadas via cromatografia de exclusão de tamanho, isto é, cromatografia líquida de alta eficiência - de exclusão de tamanho (SE-UPLC, size exclusion - ultra performance liquid chromatography) para determinar a pureza da proteína. Não foi observada mudança na pureza após a micronização em relação ao material inicial (veja Tabela 3). Tabela 1: Tamanhos médios de partícula (μm) conforme determinado por MFI e DLS
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EXEMPLO 2: SUSPENSÕES DE PROTEÍNA MICRONIZADA EM SOLUÇÕES DE POLÍMERO ORGÂNICAS
[00076] Vários polímero foram usados ou são considerados para uso na fabricação do córtex de polímero das micropartículas. Aqueles polímeros incluem inter alia etilcelulose (“EC”), poliortoéster (“POE”), poli-D,L- lactídeo-co-glicolídeo (“PLGA”), e poli-ε-caprolactona (“PCL”).
Revestimento de etilcelulose
[00077] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas foram colocadas em suspensão em uma solução de 50 mg/mL de etilcelulose em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-50-EC”.
[00078] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas foram colocadas em suspensão em uma solução de 100 mg/mL de etilcelulose em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-100-EC”.
[00079] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas são colocadas em suspensão em uma solução de 250 mg/mL de etilcelulose em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-250-EC”.
Revestimento de poliortoéster
[00080] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas foram colocadas em suspensão em uma solução de 50 mg/mL de poliortoéster contendo cerca de 5% de ácido latente em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-50-POE”.
[00081] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas foram colocadas em suspensão em uma solução de 250 mg/mL de poliortoéster contendo cerca de 5% de ácido latente em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-250-POE”.
Revestimento de poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo
[00082] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas foram colocadas em suspensão em uma solução de 50 mg/mL de PLGA em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-50-PLGA”.
[00083] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas foram colocadas em suspensão em uma solução de 200 mg/mL de PLGA em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-200-PLGA”.
[00084] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas foram colocadas em suspensão em uma solução de 250 mg/mL de PLGA em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-250-PLGA”.
Revestimento de poli-ε-caprolactona
[00085] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas são colocadas em suspensão em uma solução de 50 mg/mL de PCL em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-50-PCL”.
[00086] Partículas de armadilha-VEGF micronizadas são colocadas em suspensão em uma solução de 250 mg/mL de PCL em acetato de etila em uma concentração de cerca de 50 mg/mL de VGT; chamada aqui de “suspensão de VGT-250-PCL”.
[00087] PCL tem uma Tg baixa e pode não ser adequada para secagem por calor conforme descrito abaixo, mas pode ser usada em extração por solvente em um banho aquoso com poli(álcool vinílico) (PVA), por exemplo.
EXEMPLO 3: DISPERSÃO DE GOTÍCULAS FINAS DE PROTEÍNA- POLÍMERO E REMOÇÃO DE SOLVENTE
[00088] Cada suspensão de VGT, que foi preparada de acordo com o Exemplo 2 (supra), foi submetida à secagem por pulverização com o uso de um BÜCHI Mini Spray Dryer B-290 (Büchi Labortechnik AG, Flawil, CH). Resumidamente, cada suspensão foi atomizada para formar microgotículas, que foram subsequentemente secas por calor para remover o solvente e formar as micropartículas de proteína revestida com polímero. A suspensão foi bombeada a 12,5 mL/min para dentro do secador por pulverização com uma taxa de fluxo de ar de aspirador e de gás de pulverização de cerca de 530 L/h e 35 m3/h, respectivamente. A temperatura de entrada foi ajustada a 90°C e a temperatura de saída foi ajustada a cerca de 54°C.
EXEMPLO 4: CARACTERIZAÇÃO DE MICROPARTÍCULAS DE PROTEÍNA-POLÍMERO
[00089] Partículas de proteína revestida com polímero secas por pulverização fabricadas de acordo com o processo exemplificado geram uma pluralidade de micropartículas que têm ima faixa de diâmetros circulares equivalentes de cerca de 2,5 μm a cerca de 65 μm (Figura 2). A variação de tamanho em grande parte reflete a espessura do córtex de polímero, embora o diâmetro do núcleo de proteína poderia contribuir para a variação de tamanho em alguma extensão.
[00090] O diâmetro da micropartícula correlaciona-se com a concentração inicial da solução de polímero (Tabela 2, Figura 2). Aquelas micropartículas que foram fabricadas com o uso de 50 mg/mL de polímero tiveram um tamanho médio de cerca de 17 μm ± 2,8 μm. Aquelas micropartículas que foram fabricadas com o uso de 250 mg/mL de polímero tiveram um tamanho médio de cerca de 29 μm.
EXEMPLO 5: ESTABILIDADE DA PROTEÍNA APÓS A SECAGEM POR PULVERIZAÇÃO
[00091] A estabilidade da proteína de armadilha-VEGF foi avaliada com o uso de cromatografia de exclusão de tamanho quantitativa (SE-UPLC), que permite a quantificação de produtos de degradação menores e produtos de agregação maiores em relação ao monômero intacto. Os resultados são descritos em Tabela 3. Essencialmente, a proteína permaneceu estável durante todos os processos de secagem por pulverização e revestimento por pulverização.
[00092] A razão em peso média entre a proteína e o polímero também foi determinada para as micropartículas fabricadas. Uma coleção de micropartículas fabricadas com polímeros variados e concentração de polímero variada foi extraída e submetida à cromatografia quantitativa em fase reversa (RP-HPLC). Os resultados são apresentados em Tabela 3. Os dados podem ser interpretados para confirmar a teoria de que uma concentração inicial mais alta de polímero dá um córtex de polímero mais espesso sobre a micropartícula. Tabela 2: Valores de diâmetro circular equivalente
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Tabela 3: Carregamento e estabilidade de proteína
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1Baseado em armadilha-VEGF extraída após 1 hora de reconstituição para remover armadilhaVEGF não revestida. 2 Média de nativa percentual determinada por SE-UPLC (n=4). 3 Média de porcentagem em peso em relação ao carregamento em peso de VGT em polímero determinada por RP-HPLC (n=4).
EXEMPLO 6: LIBERAÇÃO DE PROTEÍNA DAS MICROPARTÍCULAS
[00093] A liberação de proteína das micropartículas foi determinada por suspensão de várias bateladas de micropartículas em tampão (fosfato 10 mM, 0,03% de polissorbato 20, pH 7,0) e medição da quantidade e da qualidade da proteína liberada para dentro da solução no decorrer do tempo enquanto incubada a 37°C. Em intervalos de 1-2 semanas, as micropartículas foram pelotizadas por centrifugação suave e 80% do sobrenadante contendo a proteína liberada foi coletado para análise subsequente. Uma quantidade equivalente de tampão novo foi substituída e as micropartículas foram recoladas em suspensão por turbilhonamento suave e retornadas para a câmara de incubação a 37°C. A quantidade e a qualidade da proteína no sobrenadante foram avaliadas por cromatografia de exclusão de tamanho.
[00094] Em geral, aquelas micropartículas fabricadas com uma concentração mais alta de polímero (por exemplo, 250 mg/mL) tenderam a mostrar um perfil de liberação de proteína relativamente linear; enquanto que aquelas micropartículas fabricadas com uma concentração mais baixa de polímero (por exemplo, 50 mg/mL) tenderam a mostrar uma liberação repentina inicial seguida por um início de uma liberação repentina retardada. Os dados mostrando a liberação prolongada de proteína, que permaneceu estável, durante até cerca de 60 dias são apresentados em Figura 3 (dados de liberação). Tabela 4 resume ao dados de taxa de liberação linear. Tabela 4: Dinâmica de liberação de proteína
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EXEMPLO 7: TAMANHO DE PARTÍCULA PODE SER MANIPULADO POR CONCENTRAÇÃO DE POLÍMERO E FLUXO DE GÁS DE PULVERIZAÇÃO
[00095] Distribuições de tamanhos de partícula foram controladas por concentração de polímero e fluxo de gás de pulverização de atomização. A concentração de polímero aumentada deslocou a distribuição para partículas maiores (200 mg/mL de PLGA a fluxo de gás de pulverização de 45 mm3/h v. 100 mg/mL PLGA a fluxo de gás de pulverização de 45 mm3/h; veja Tabela 5). Similarmente, um fluxo de gás de pulverização de atomização mais baixo resultou em gotículas maiores e desta forma, em partículas maiores (100 mg/mL PLGA a fluxo de gás de pulverização de 25 mm3/h v. 100 mg/mL PLGA a fluxo de gás de pulverização de 45 mm3/h; veja Tabela 5). Tabela 5: Tamanho de partícula (todas as medidas são aproximadas)
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EXEMPLO 8: TAMANHO DE PARTÍCULA E LIBERAÇÃO DE PROTEÍNA ATRAVÉS DE VÁRIOS POLÍMEROS
[00096] Armadilha-VEGF ou IgG foi revestida por pulverização com um poli(ácido lático) (PLA-LMW) de peso molecular baixo (202S), poli(ácido lático) (PLA-HMW) de peso molecular alto (203S), polianidrido- poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co- ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero em bloco de PEG-poli(ácido lático) (PEG-PLA), e poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA). 25 mg/mL de proteína seca por pulverização foram combinados com 50-100 mg/mL de polímero. Ensaios de liberação in vitro foram realizados em tampão fosfato 10 mM, pH7,2 a 37°C. Os resultados são apresentados em Tabela 6. Tabela 6: Liberação de proteína e tamanho de partícula dependentes de
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EXEMPLO 9: ESTABILIDADE DE PROTEÍNA EM VÁRIOS POLÍMEROS
[00097] Armadilha-VEGF e IgG foram extraídas de suas respectivas capas de polímero e medidas para pureza por SE-UPLC. Os resultados são resumidos em Tabela 7. As proteínas em geral foram compatíveis com o processo de revestimento por pulverização para os polímeros testados. A proteína permaneceu estável durante pelo menos 14 dias para aqueles polímeros que continuaram a liberar proteína. Tabela 7
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Claims (23)

1. Método para fabricar uma composição farmacêutica de liberação prolongada compreendendo uma partícula de proteína revestida com um polímero biodegradável, caracterizado pelo fato de compreender: a. atomizar uma solução aquosa compreendendo uma proteína em um micronizador para formar gotículas contendo a proteína; b. aquecer as gotículas contendo a proteína em uma temperatura acima do ponto de ebulição da água para formar um pó compreendendo uma população de partículas de proteína; c. suspender dito pó compreendendo a população de partículas de proteína em uma solução compreendendo poli(ácido lático) (PLA), polianidrido-poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), etilcelulose (EC), poli-ε-caprolactona (PCL) e poliortoéster (POE) e um solvente orgânico para formar uma suspensão; e d. secar por pulverização a suspensão para formar a composição farmacêutica de liberação prolongada compreendendo uma população de micropartículas de proteínas revestidas com poli(ácido lático) (PLA), polianidrido-poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), etilcelulose (EC), poli-ε-caprolactona (PCL) e POE, em que dita composição farmacêutica de liberação prolongada compreende cerca de 50 a cerca de 180 mg/mL de proteína e libera um nível constante de proteína por pelo menos 60 dias em uma solução aquosa.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero biodegradável é poliortoéster (POE).
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada partícula de proteína da dita população de partículas de proteína compreende menos do que 3% de água em peso.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito solvente orgânico é acetato de etila.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita proteína é uma proteína de fusão de receptor-Fc ou um anticorpo.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dita proteína é uma armadilha-VEGF.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita secagem por pulverização da suspensão (d) compreende atomizar dita suspensão e então aplicar calor à suspensão atomizada em uma temperatura acima do ponto de ebulição do dito solvente orgânico para evaporar dito solvente orgânico para formar dita população de micropartículas de proteína-polímero.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o diâmetro médio da dita população de micropartículas de proteína- polímero é de cerca de 15 μm a cerca de 30 μm.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada partícula de proteína da dita população de partículas de proteína tem um diâmetro de cerca de 2 μm a cerca de 14 μm.
10. Método para fornecer um revestimento de liberação prolongada para uma proteína farmacêutica, caracterizado pelo fato de compreender: a. atomizar uma solução aquosa compreendendo uma proteína; b. secar por pulverização a solução aquosa atomizada em uma temperatura acima do ponto de ebulição da água para remover água na solução e formar uma população de micropartículas de proteína; c. revestir cada micropartícula de proteína da dita população de micropartículas de proteína com um polímero biodegradável suspendendo a partícula de proteína em um solvente orgânico e então remover o solvente orgânico para formar uma população de micropartículas de proteína-polímero, em que o polímero biodegradável é poli(ácido lático) (PLA), polianidrido- poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co- ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), etilcelulose (EC), poli-ε-caprolactona (PCL) e poliortoéster, em que dita composição farmacêutica de liberação prolongada libera um nível constante de proteína por pelo menos 60 dias em uma solução aquosa.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o polímero biodegradável é poliortoéster (POE).
12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que dita população de micropartículas de proteína é seca.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que dita população de micropartículas de proteína compreende menos do que 3% de água.
14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda combinar um solvente orgânico, dito polímero biodegradável, e dita população de micropartículas de proteína para formar uma pasta fluida; e secar por pulverização dita pasta fluida para formar dita pluralidade de micropartículas de proteína-polímero na etapa (c).
15. Método para fabricar uma composição farmacêutica de liberação prolongada compreendendo uma partícula de proteína revestida com um polímero biodegradável, caracterizado pelo fato de compreender: a. atomizar uma solução aquosa compreendendo uma armadilha- VEGF; b. secar por pulverização a solução aquosa atomizada em uma temperatura acima do ponto de ebulição da água para formar uma pluralidade de partículas de proteína secas sem liofilização; c. combinar: i. dita pluralidade de partículas de proteínas secas, ii. acetato de etila, e iii. poli(ácido lático) (PLA), polianidrido-poli[1,6-bis(p- carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), etilcelulose (EC), poli-ε- caprolactona (PCL) e poliortoéster para formar uma suspensão; d. atomizar dita suspensão; e e. secar por pulverização dita suspensão atomizada em uma temperatura acima do ponto de ebulição do acetato de etila para formar uma pluralidade de micropartículas de proteína-polímero para formar a composição farmacêutica de liberação prolongada que libera um nível constante de proteína por pelo menos 60 dias em uma solução aquosa.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o polímero biodegradável é poliortoéster (POE).
17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que dita proteína é um anticorpo ou proteína de fusão de receptor-Fc.
18. Método para fabricar uma composição farmacêutica de liberação prolongada compreendendo uma partícula de proteína revestida com um polímero biodegradável, caracterizado pelo fato de compreender: a. atomizar uma solução aquosa compreendendo uma armadilha- VEGF; b. secar por pulverização a solução aquosa atomizada em uma temperatura acima do ponto de ebulição da água para formar uma população de partículas de proteína; c. suspender dita população de partículas de proteína em um solvente orgânico compreendendo um polímero biodegradável e um solvente orgânico, em que o polímero biodegradável é poli(ácido lático) (PLA), polianidrido-poli[1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano] (pCPH), poli(ácido hidroxibutírico-co-ácido hidroxivalérico) (PHB-PVA), copolímero de polietilenoglicol-poli(ácido lático) (PEG-PLA), poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo (PLGA), etilcelulose (EC), poli-ε-caprolactona (PCL) e poliortoéster (POE); e d. secar por pulverização a suspensão para formar uma população de micropartículas proteína-polímero para formar a composição farmacêutica de liberação prolongada, em que dita composição farmacêutica de liberação prolongada libera um nível constante de armadilha-VEGF por pelo menos 60 dias em uma solução aquosa.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polímero biodegradável é poliortoéster (POE).
20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a taxa linear de liberação é entre 2,5 mg e 3,5 mg/dia.
21. Formulação de liberação prolongada, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método como definido na reivindicação 1.
22. Formulação de liberação prolongada, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método como definido na reivindicação 15.
23. Formulação de liberação prolongada, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como definido na reivindicação 18.
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