BR112014007694B1 - Compostos de 1-(3-(tert-butil)-1-(p-tolil)-1h-pirazol-5-il)-3-(4-((2-(fenilamino) pirimidin-4-il)óxi) naftalen-1-il)ureia, seus usos, composição e formulação farmacêutica compreendendo os mesmos - Google Patents

Abstract

1-PIRAZOLIL-3-(4-((2-ANILINOPIRIMIDIN-4- IL)ÓXI) NAFTALENO-1-IL)UREIAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, QUE OS COMPREENDE, SEUS USOS E PRODUTO DE COMBINAÇÃO. (I) A presente invenção refere-se a um composto de fórmula (I) é fornecido, que é um inibidor da família de enzimas de proteína cinase ativadas por mitógeno p38, e seu uso em terapia, incluindo em combinações farmacêuticas, especialmente no tratamento de doenças inflamatórias, incluindo doenças inflamatórias do pulmão, tal como asma e COPD.

Description

Campo da Invenção

[001] A invenção refere-se aos compostos que são inibidores da família de enzimas de proteína cinase ativadas por mitógeno p38 (referidos aqui como inibidores de p38 MAP cinase), por exemplo, os subtipos alfa e gama cinase das mesmas, e da família de Syk cinase e Src de tirosina cinases, e ao seu uso em terapia, incluindo em combinações farmacêuticas, especialmente no tratamento de doenças inflamatórias, em particular doenças inflamatórias do pulmão, tal como asma e COPD, bem como aquelas do trato gastrointestinal, tal como colite ulcerativa e doença de Crohn e do olho, tal como uveíte.

Antecedentes da Invenção

[002] Quatro isoformas de p38 MAPK (alfa, beta, gama e delta respectivamente), foram identificadas, cada qual exibindo diferentes padrões de expressão de tecido em homens. As isoformas alfa e beta de p38 MAPK são encontradas ubiquamente no corpo, estando presentes em muitos tipos de célula diferentes. A isoforma alfa é bem caracterizada em termos de seu papel na inflamação. Embora estudos usando um método genético químico em camundongos indiquem que a isoforma p38 MAPK beta não desempenha um papel na inflamação (O’Keefe, S.J. et al., J. Biol. Chem., 2007, 282(48):34663-71.), ela pode estar envolvida em mecanismos de dores através da regulação de expressão de COX2 (Fitzsimmons, B.L. et al., Neuroreport, 2010, 21(4):313-7). Estas isoformas são inibidas por diversos compostos de pequeno peso molecular anteriormente descritos. Classes antigas de inibidores eram altamente tóxicas devido à ampla distribuição de tecido destas isoformas que resultou em múltiplos efeitos descontrolados dos compostos. Além disso, o desenvolvimento de um número substancial de inibidores foi descontinuado devido aos perfis de segurança inaceitáveis em estudos clínicos (Pettus, L.H. e Wurz, R.P., Curr. Top. Med. Chem., 2008, 8(16):1452-67.). Visto que estes efeitos adversos variam com quimiotipo, e os compostos têm padrões de seletividade de cinase distintas, as toxicidades observadas podem ser relacionadas com a estrutura em vez de baseadas no mecanismo de p38.

[003] Pouco se sabe sobre as isoformas gama e delta de p38 MAPK, que, diferente das alfa e beta isoenzimas são expressas em tecidos e células específicas. A isoforma p38 MAPK-delta é expressa mais altamente no pâncreas, testículos, pulmão, intestino delgado, e no rim. Ela é também abundante em macrófagos e detectável em neutrófilos, células CD4+ T e em células endoteliais (Shmueli, O. et al., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10-11):1067-1072; Smith, S. J. Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404; Hale, K. K., J. Immunol., 1999, 162(7):4246-52; Wang, X. S. etal., J. Biol. Chem., 1997, 272(38):23668- 23674.) Muito pouco se sabe sobre a distribuição de p38 MAPK embora ela seja mais altamente expressa no cérebro, músculo esqueletal e coração, bem como em linfócitos e macrófagos (Shmueli, O. et al., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10-11):1067-1072; Hale, K. K., J. Immunol., 1999, 162(7):4246-52; Court, N. W. et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 2002, 34(4):413-26; Mertens, S. et al., FEBS Lett., 1996, 383(3):273-6.).

[004] Inibidores de molécula pequena seletivos de p38 MAPK gama e p38 MAPK delta não estão altamente disponíveis, embora um composto anteriormente descrito, BIRB 796, seja conhecido possuir atividade inibitória de pan-isoforma. A inibição de isoformas p38 MAPK gama e delta é observada em concentrações mais elevadas do composto do que aquelas requeridas para inibir p38 MAPK alfa e p38 beta (Kuma, Y., J. Biol. Chem., 2005, 280:19472-19479.). Além disso, BIRB 796 também prejudicou a fosforilação de p38 MAPKs ou JNKs pela cinase a montante MKK6 ou MKK4. Kuma descreveu a possibilidade de que a mudança conformacional causada pela ligação do inibidor à proteína MAPK pode afetar a estrutura tanto de sítio de fosforilação quanto sítio de acoplamento para o ativador a montante, desse modo prejudicando a fosforilação de p38 MAPKs ou JNKs.

[005] Acredita-se que a p38 MAP cinase desempenhe um papel fundamental na maioria das séries de sinalização que são envolvidas na iniciação e manutenção de inflamação crônica, persistente em doença humana, por exemplo, em asma severa e em COPD (Chung, F., Chest, 2011, 139(6):1470-1479.). Existe agora uma abundante literatura que demonstra que a p38 MAP cinase é ativada por uma faixa de citocinas pró-inflamatórias e que sua ativação resulta no recrutamento e liberação de citocinas pró-inflamatórias adicionais. De fato, os dados de alguns estudos clínicos demonstram mudanças benéficas na atividade de doença em pacientes durante o tratamento com inibidores de p38 MAP cinase. Por exemplo, Smith descreve o efeito inibitório inibidores de p38 MAP cinase sobre a liberação de TNFα (porém não IL-8) de PBMCs humanas.

[006] O uso de inibidores de p38 MAP cinase no tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) também foi proposto. Inibidores de molécula pequena alvejados para p38 MAPK α/β provou- se ser eficaz na redução de vários parâmetros de inflamação em células e tecidos obtidos de pacientes com COPD, que são geralmente insensíveis a corticosteroide, (Smith, S.J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404.) bem como em vários modelos de animal in vivo (Underwood, D.C. et al., Am. J. Physiol., 2000, 279:L895-902; Nath, P. et al., Eur. J. Pharmacol., 2006, 544:160-167.). Irusen e colegas também sugeriram o possível envolvimento de p38 MAPK α/β com insensibilidade a corticosteroide por meio da redução de afinidade de ligação do receptor de glicocorticoide (GR) em núcleos (Irusen, E. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2002, 109:649-657.). Experiência clínica com uma faixa de inibidores de p38 MAP cinase, incluindo AMG548, BIRB 796, VX702, SCIO469 e SCIO323 foi descrita (Lee, M.R. e Dominguez, C., Current Med. Chem., 2005, 12:2979-2994.).

[007] COPD é uma condição em que a inflamação fundamental é reportada ser substancialmente resistente aos efeitos anti-inflamatórios de corticosteroides inalados. Consequentemente, uma estratégia superior para o tratamento de COPD deveria desenvolver uma intervenção que tem tanto efeitos anti-inflamatórios inerentes quanto a capacidade de aumentar a sensibilidade dos tecidos do pulmão de pacientes de COPD a corticosteroides inalados. Uma publicação recente de Mercado (Mercado, N., et al., Mol. Pharmacol., 2011, 80(6):1128-1135.) demonstra que o silenciamento p38 MAPK Y tem o potencial de restaurar a sensibilidade a corticosteroides. Consequentemente pode existir um benefício dual para pacientes no uso de um inibidor de p38 MAP cinase para o tratamento de COPD e asma severa. Entretanto, o maior obstáculo dificultando a utilidade de inibidores de p38 MAP cinase no tratamento de doenças inflamatórias crônicas humanas tem sido a toxicidade severa observada em pacientes resultando no retrocesso do desenvolvimento clínico de muitos compostos incluindo todos aqueles especificamente mencionados acima.

[008] Muitos pacientes diagnosticados com asma ou com COPD continuam sofrer de sintomas descontrolados e de exacerbações de sua condição médica que pode resultar em hospitalização. Isto ocorre a despeito do uso dos regimes de tratamento atualmente disponíveis, mais avançados, compreendendo os produtos de combinação de um corticosteroide inalado e um β-agonista de longa ação. Os dados acumulados durante a última década indicam que uma falência para controlar eficazmente o componente inflamatório subjacente da doença no pulmão é a razão mais provável pelas quais exacerbações ocorrem. Determinada a eficácia estabelecida de corticosteroides como agentes anti-inflamatórios e, em particular, de corticosteroides inalados no tratamento de asma, estas descobertas provocaram intensa investigação. Estudos resultantes identificaram que alguns insultos ambientais evocam mudanças inflamatórias insensíveis a corticosteroide em pulmões de pacientes. Um exemplo é a resposta que se origina de infecções do trato respiratório superior viralmente mediado (URTI), que tem significância particular no aumento de morbidez associado com asma e COPD.

[009] Investigações epidemiológicas revelaram uma forte associação entre as infecções virais do trato respiratório superior e um percentual substancial das exacerbações sofridas por pacientes já diagnosticados com doença respiratória crônica. Alguns dos maiores dados que compelem a este respeito derivam-se de estudos longitudinais de crianças que sofrem de asma (Papadopoulos, N.G., Papi, A., Psarras, S. e Johnston, S.L., Paediatr. Respir. Rev,. 2004, 5(3):255-260.). Uma variedade de estudos adicionais sustenta a conclusão de que uma infecção viral pode precipitar as exacerbações e aumentar a gravidade de doença. Por exemplo, infecções clínicas experimentais com rinovírus foram reportadas causar hipersensibilidade brônquica à histamina em asmáticos que é não responsiva ao tratamento com corticosteroides (Grunberg, K., Sharon, R.F., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2001, 164 (10):1816-1822.). Outra evidência deriva-se da associação observada entre as exacerbações de doença em pacientes com fibrose cística e infecções por HRV (Wat, D., Gelder, C., et al., J. Cyst. Fibros,. 2008, 7:320-328.). Também consistente com este corpo de dados é a descoberta de que as infecções virais respiratórias, incluindo rinovírus, representa um risco independente de fator de risco que se correlaciona negativamente com a taxa de sobrevivência de 12 meses receptores de transplante de pulmão pediátricos (Liu, M., Worley, S., et al., Transpl. Infect. Dis,. 2009, 11(4):304-312.).

[0010] Pesquisas clínicas indicam que a carga viral é proporcional aos sintomas e complicações observadas e, por implicação, à gravidade de inflamação. Por exemplo, seguindo a infecção por rinovírus experimental, sintomas do trato respiratório inferior e hipersensibilidade brônquica significantemente correlacionados com a carga de vírus (Message, S.D., Laza-Stanca, V., et al., PNAS, 2008; 105(36):13562- 13567.). Similarmente, na ausência de outros agentes virais, infecções por rinovírus foram comumente associados com infecções do trato respiratório inferior e respiração difícil (chiado), quando a carga viral era em pacientes pediátricos imunocompetente (Gerna, G., Piralla, A., et al., J. Med. Virol,. 2009, 81(8):1498-1507.).

[0011] Interessantemente, reportou-se recentemente que a exposição anterior ao rinovírus reduziu as respostas de citocinas evocadas por produtos bacterianos em macrófagos alveolares humanos (Oliver, B.G., Lim, S., et al., Thorax, 2008, 63:519-525.). Adicionalmente, infecção de células epiteliais nasais com rinovírus foi documentada promover a adesão de bactérias, incluindo S. aureus e H. influenzae (Wang, J.H., Kwon, H.J. e Yong, J.J., The Laryngoscope, 2009, 119 (7):1406-1411.). Tais efeitos celulares podem contribuir para a probabilidade aumentada de pacientes sofrendo de uma infecção do trato respiratório inferior seguindo uma infecção no trato respiratório superior. Consequentemente, é terapeuticamente relevante focar na capacidade de novas intervenções para diminuir a carga viral em uma variedade de sistemas in vitro, como um prenunciador substituto de seu benefício em uma configuração clínica.

[0012] Grupos de risco elevado, para os quais uma infecção de rinovírus no trato respiratório superior pode induzir às complicações secundárias severas, não são limitados a pacientes com doença respiratória crônica. Eles incluem, por exemplo, os imuno comprometidos que são propensos à infecção do trato respiratório inferior, bem como pacientes passando por quimioterapia, que enfrentam febre que ameaça à vida, aguda. Foi sugerido também que outras doenças crônicas, tal como diabetes, são associadas com uma resposta de defesa imuno comprometida. Isto aumenta tanto a probabilidade de adquirir uma infecção do trato respiratório quanto de ser hospitalizado como um resultado (Peleg, A.Y., Weerarathna, T., et al., Diabetes Metab. Res. Rev., 2007, 23(1):3-13; Kornum, J.B., Reimar, W., et al., Diabetes Care, 2008, 31(8):1541-1545.).

[0013] Embora as infecções virais do trato respiratório superior sejam uma causa de morbidez e mortalidade considerável naqueles pacientes com doença subjacente ou outros fatores de risco; elas também representam um fardo de saúde significante na população geral e são uma principal causa de dias perdidos na escola e perda de tempo no local de trabalho (Rollinger, J.M. e Schmidtke, M., Med. Res. Rev., 2010, Doi 10.1002/med.20176.). Estas considerações tornam claro que novos medicamentos, que possuem eficácia melhorada sobre outras terapias atuais, são urgentemente requeridos para prevenir e tratar infecções do trato respiratório superior mediado por rinovírus. Em geral, as estratégias adotadas para a descoberta de agentes antivirais melhorados têm alvejado várias proteínas produzidas pelos vírus, como o ponto de intervenção terapêutica. Entretanto, a ampla faixa de sorotipos de rinovírus torna este método particularmente desafiador para prosseguir e poder explicar por que, no presente momento, um medicamento para a profilaxia e tratamento de infecções por rinovírus ainda deve ser aprovado por qualquer agência regulatória.

[0014] A entrada viral na célula hospedeira está associada com a ativação de diversas séries de reação de sinalização intracelular que, acredita-se que desempenhem um papel proeminente na iniciação de processos inflamatórios (revisado por Ludwig, S, 2007; Signal Transduction, 7:81-88.) e de propagação viral e liberação subsequente. Um tal mecanismo, que foi determinado desempenhar um papel na propagação do vírus influenza in vitro, é a ativação da série de reação de fosfoinositídeo 3-cinase / Akt. Reportou-se que esta série de reação de sinalização é ativada pela proteína NS1 do vírus (Shin, Y.K., Liu, Q. et al., J. Gen. Virol., 2007, 88:13-18.) e que sua inibição reduz os títulos de progênie viral (Ehrhardt, C., Marjuki, H. et al., Cell Microbiol., 2006, 8:1336-1348.).

[0015] Além disso, o inibir de MEK U0126 foi documentado inibir a propagação viral sem provocar a emergência de variantes resistentes do vírus (Ludwig, S., Wolff, T. et al., FEBS Lett., 2004, 561(1-3):37-43.). Mais recentemente, estudos que alvejam a inibição de Syk cinase demonstraram que a enzima desempenha um papel importante na mediação da entrada de rinovírus em células e também respostas inflamatórias induzidas por vírus, incluindo super-regulação de ICAM-1 (Sanderson, M.P., Lau, C.W. et al., Inflamm. Allergy Drug Targets, 2009, 8:87-95.). A atividade de Syk é reportada ser controlada por c-Src como uma cinase a montante em infecção por HRV (Lau, C. et al., J. Immunol., 2008, 180(2):870-880.). Surgiu um pequeno número de estudos que liga a ativação de Src celular (Src1 ou p60-Src) ou cinases da família Src à infecção com viroses. Estes incluem um relato de que o adenovírus evoca uma ativação mediada por PI3 cinase de Akt por meio de um mecanismo dependente de c-Src. Sugeriu-se também que a produção de IL-8 induzida por rinovírus-39 em células epiteliais depende da ativação de Src cinase (Bentley, J.K., Newcomb, D.C., J. Virol., 2007, 81:1186-1194.). Finalmente, foi proposto que a ativação de Src cinase está envolvida na indução de produção de mucina por rinovírus-14 em células epiteliais e glândulas submucosais (Inoue, D. e Yamaya, M., Respir. Physiol. Neurobiol., 2006, 154(3):484-499.).

[0016] Foi anteriormente descrito que os compostos que inibem a atividade tanto de c-Src quanto Syk cinases são agentes eficazes contra a replicação de rinovírus (Charron, C.E. et al., WO 2011/158042.) e que compostos que inibem p59-HCK são eficazes contra a replicação de vírus da influenza (Charron, C.E. et al., WO 2011/070369.). Para as razões sumariadas acima, os compostos designados para tratar doenças respiratórias crônicas que combinam estas propriedades inerentes com a inibição de p38 MAPKs, são esperados ser particularmente eficazes.

[0017] Certos inibidores de p38 MAPK também foram descritos como inibidores da replicação do vírus sincicial respiratório (Cass, L. et al., WO 2011/158039.).

[0018] Além disso, é notável que um inibidor de p38 MAPK foi descoberto liberar benefício para pacientes com IBD após um tratamento de uma semana que não foi prolongado durante um curso de quatro semanas de tratamento (Schreiber, S. et al., Clin. Gastro. Hepatology, 2006, 4:325-334.).

[0019] Além de desempenhar papeis principais nos eventos de sinalização de célula que controlam a atividade de séries de reação pró- inflamatórias, enzimas cinases são agora também reconhecidas regular a atividade de uma faixa de funções celulares. Entre aqueles que foram descritos recentemente são a manutenção da integridade de DNA (Shilo, Y. Nature Reviews Cancer, 2003, 3:155-168.) e coordenação dos processos complexos de divisão celular. Uma ilustração de descobertas recentes é a publicação que descreve o impacto de um grupo de inibidores que agem nas assim chamadas de "Olaharsky cinases" na frequência de formação de micronúcleo in vitro (Olaharsky, A.J. et al., PLoS Comput. Biol., 2009, 5(7):e1000446.). A formação de micronúcleo é implicada em, ou associada com, a ruptura dos processos mitóticos e é, portanto, uma manifestação indesejável de toxicidade potencial. A inibição de glicogênio sintase cinase 3α (GSK3α) foi descoberta ser um fator particularmente significante que aumenta a probabilidade de um inibidor de cinase promovendo a formação de micronúcleo. Recentemente, a inibição da cinase GSK3β com RNAi foi também reportada promover a formação de micronúcleo (Tighe, A. et al., BMC Cell Biology, 2007, 8:34.).

[0020] Pode ser possível atenuar os efeitos adversos que se originam das interações de fármaco com as Olaharsky cinases, tal como GSK3α, por otimização da dose e/ou mudando a rotina de administração. Entretanto, pode ser mais vantajoso identificar moléculas terapeuticamente úteis que demonstram baixa atividade ou não detectável contra estas enzimas descontroladas e consequentemente produzir pouca ou nenhuma ruptura de processos mitóticos, como medido em ensaios de mitose.

[0021] É evidente a partir da consideração da literatura citada aqui acima que, permanece uma necessidade de identificar e desenvolver novos inibidores de p38 MAP cinase que têm potencial terapêutico melhorada sobre os tratamento atualmente disponíveis. Os compostos desejáveis são aqueles que exibem um índice terapêutico superior exercendo, pelo menos, um efeito igualmente eficaz como agentes anteriores, porém em um ou mais aspectos, são menos tóxicos na dose terapêutica relevante. Um objetivo da presente invenção, portanto, é fornecer tais novos compostos que inibem a atividade de enzima de p38 MAP cinase, por exemplo, com certas especificidades de subtipo, juntamente com Syk cinase e tirosina cinases dentro da família Src (particularmente c-Src), desse modo possuindo propriedades anti- inflamatórias, e adequados para uso em terapia.

[0022] O composto (I) exibe uma longa duração de ação e/ou persistência de ação em comparação ao inibidor alostérico de p38 MAP cinase anteriormente descrito BIRB 796 (Pargellis, C. et al., Nature Struct. Biol., 2002, 9(4):268-272.). Uma modalidade adicional fornece tal novo composto em uma ou mais, formas cristalinas que possuem uma estabilidade química e física adequada para formulação como medicamentos inalados.

Sumário da Invenção

[0023] Desse modo, em um aspecto da invenção, é fornecido um composto de fórmula (I):

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, incluindo todos os estereoisômeros e tautômeros do mesmo.

[0024] "Composto de fórmula (I)" pode também ser referido aqui como o "Composto (I)".

[0025] Em outro aspecto da invenção, é fornecido composto (I) como acima definido, como a base livre.

[0026] Em outro aspecto da invenção, é fornecido composto (I) como acima definido, como a base livre de anidro.

[0027] Em outro aspecto da invenção, é fornecido composto (I) como acima definido, como a base livre de anidro em forma cristalina sólida.

[0028] Em um outro aspecto da invenção, é fornecido composto (I) como acima definido, como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida A.

[0029] Em um outro aspecto da invenção, é fornecido composto (I) como acima definido, como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida B.

Breve Descrição das Figuras

[0030] A Figura 1 mostra um padrão de difração de pó de raio X (XRPD) obtido de uma amostra de composto (I) como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida A.

[0031] A Figura 2 exibe um padrão de XRPD adquirido de uma amostra de composto (I) como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida B, pós micronização.

[0032] A Figura 3 releva os resultados de análise termogravimétrica de uma amostra de composto (I) como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida B, pós micronização.

[0033] A Figura 4 representa as plotagens de isoterma de absorção de vapor dinâmico (DVS) derivadas de amostras de composto (I) como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida B pós micronização.

[0034] A Figura 5 representa os resultados de um experimento de histerese conduzido no composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, pós micronização, para determinar o grau e taxa de absorção/desabsorção de umidade com tempo contra mudanças na umidade relativa.

[0035] A Figura 6 é o espectro de infravermelho (IR) obtido de uma amostra de composto (I) como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida B pós micronização.

[0036] A Figura 7 mostra análise térmica de uma amostra de composto (I) como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida B (micronizada) por calorimetria de varredura diferencial (DSC).

Descrição Detalhada da Invenção

[0037] O composto de fórmula (I) descrito aqui é: 1-(3-terc-butil-1- p-tolil-1H-pirazol-5-il)-3-(4-(2-(fenilamino)pirimidin-4-ilóxi)naftalen-1- il)ureia. Exemplos de sais de composto (I) incluem todos os sais farmaceuticamente aceitáveis, tais como, sem limitação, sais de adição de ácido de ácidos materiais fortes tais como sais de HCl e HBr e sais de adição de ácidos orgânicos fortes tal como ácido metanossulfônico.

[0038] Como empregado aqui abaixo, a definição de um composto de fórmula (I) destina-se a incluir sais, solvatos, e todos os tautômeros do referido composto, a menos que o contexto especificamente indique de outro modo. Exemplos de solvatos incluem hidratos.

[0039] A invenção fornecida aqui se estende ao profármacos do composto de fórmula (I), isto que dizer compostos que se decompõem e/ou são metabolizados in vivo para fornecer um composto ativo de fórmula (I). Exemplos gerais de profármacos incluem ésteres simples, e outros ésteres tais como ésteres de carbonato mistos, carbamatos, glicosídeos, éteres, acetais e cetais.

[0040] A invenção abrange todos os derivados isotópicos de composto (I). Desse modo, a invenção abrange compostos que sãos compostos de composto (I) tendo um ou mais átomos que foram substituídos por um átomo tendo uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa mais comumente encontrada na natureza, ou em que a proporção de um átomo tendo uma massa atômica ou número de massa encontrado menos comumente na natureza aumentou (o último conceito sendo referido como "enriquecimento isotópico"). Desse modo, os compostos da invenção incluem aqueles onde o átomo especificado é um isótopo de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Em uma modalidade, o isótopo é um isótopo estável. Desse modo, os compostos da invenção include, por exemplo, compostos contendo deutério e similares. Desse modo, em uma modalidade da invenção, o composto (I) contém um nível enriquecido de deutério em um ou mais átomos de hidrogênio (por exemplo, para um determinado átomo de hidrogênio, o isótopo de deutério excede 20%, 50%, 75%, 90%, 95% ou 99% por número). Exemplos de outros isótopos que podem ser incorporados em composto (I) ou enriquecidos no composto (I) incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, flúor, iodo, e cloro tal como 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 123I ou 125I, que podem ser isótopos de ocorrência natural e de ocorrência não natural.

[0041] Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um ou mais metabólitos do composto de fórmula (I), em particular um metabólito que mantém uma ou mais das atividades terapêuticas do composto de fórmula (I). Um metabólito, como empregado aqui, é um composto que é produzido in vivo do metabolismo do composto de fórmula (I), tal como, sem limitação, metabólitos oxidativos e/ou metabólitos gerados, por exemplo, de O-desalquilação.

[0042] A invenção também se estende a todas as formas polimórficas dos compostos aqui definidos.

[0043] Uma rotina adequada para a preparação do composto de fórmula (I) é mostrada abaixo (Esquema 1). Esquema 1

[0044] Grupos protetores podem ser requeridos para proteger grupos quimicamente sensíveis durante uma ou mais das reações descritas acima, para garantir que o processo possa ser realizado e/ou ser eficiente. Desse modo, se desejado ou necessário, compostos intermediários podem ser protegidos pelo uso de grupos protetores convencionais. Grupos protetores e os métodos para sua remoção são descritos em "Protecting groups in Organic Synthesis", por Theodora W. Greene e Peter G. M. Wuts, publicado por John Wiley & Sons Inc; 4a Edição revisada, 2006, ISBN-10: 0471697540.

[0045] Uma preparação detalhada de composto (I) é fornecida no exemplo 1.

[0046] Novos intermediários como descrito aqui, formam um aspecto da invenção.

[0047] Em outro aspecto da invenção, é fornecido composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida cristalina. Em um outro aspecto da invenção, é fornecido composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica A que pode ser obtida, por exemplo, por cristalização de composto (I) a partir de acetato de isopropila. Em um aspecto particular da invenção, é fornecido o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, que pode ser obtida, por exemplo, por cristalização de composto (I) a partir de acetona e água. Uma relação típica de acetona para água que é adequada para este processo está entre 5:1 e 200:1, por exemplo, cerca de 10:1. Alternativamente, a forma B pode ser obtida por cristalização de composto (I) de acetona sozinha. Preparações detalhadas de composto (I) como a base livre de anidro em formas polimórficas cristalinas sólidas A e B são fornecidas nos exemplos 1 e 3 da seção experimental, respectivamente.

[0048] Em um outro aspecto da invenção, as propriedades de estado sólido de composto (I) podem ser melhorados por outras etapas de suspensão ou recristalização para produzir, por exemplo, o material com morfologia melhorada e/ou contendo um nível reduzido de solvente residual. Por exemplo, o solvente residual pode ser removido do composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B por suspensão do composto (I) em forma polimórfica B, em água, ou alternativamente por outra recristalização a partir de acetona. Uma descrição detalhada de um procedimento de suspensão exemplar é fornecida no exemplo 3a da seção experimental.

[0049] Em uma modalidade, é fornecida forma polimórfica cristalina, solida A de composto (I) como a base livre de anidro tendo um padrão de XRPD substancialmente como mostrado na Figura 1. O método de obtenção dos dados de XRPD é descrito em Métodos analíticos e os dados descritos no exemplo 5.

[0050] Desse modo, é fornecido o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica A tendo um padrão de XRPD com pelo menos (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze ou todos os dezesseis) pico(s) em 7,8, 8,7, 10,3, 11,2, 12,4, 15,2, 16,2, 17,5, 19,7, 20,8, 22,6, 23,1, 24,6, 25,5, 26,7, 27,4 (± 0,2 graus, valores 2-teta), estes picos sendo característicos da forma polimórfica, cristalina, sólida A. Os picos a 10,3, 15,2, 17,5, 23,1, 24,6, 26,7 e 27,4 são particularmente característicos para a forma polimórfica, cristalina, sólida A e, portanto, é preferível que pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis ou todos os sete) destes picos seja observável no padrão de XRPD.

[0051] Em outra modalidade, é fornecida forma polimórfica, cristalina, sólida B de composto (I) como a base livre de anidro (micronizada) tendo um padrão de XRPD substancialmente como mostrado na Figura 2. O método de micronização é descrito em Exemplo 4 e o método de obtenção dos dados de XRPD é descrito em Métodos analíticos e os dados descritos no exemplo 5.

[0052] Desse modo, é fornecido composto (I) como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida B (micronizada) tendo um padrão de XRPD com pelo menos (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete ou todos os dezoito) picos a 3,9, 6,1, 7,7, 8,6, 10,9, 11,8, 12,7, 14,3, 15,9, 16,7, 18,3, 18,7, 19,9, 20,9, 22,0, 22,6, 25,2, 28,9 (± 0,2 graus, valores 2-teta), estes picos sendo característicos da forma polimórfica cristalina sólida B. Os picos a 3.9, 6.1, 11.8, 14.3, 16.7, 18.3, 18.7 e 28.9 são particularmente característicos para a forma polimórfica, cristalina, sólida B e, portanto, é preferível que pelo menos (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou todos os oito) destes picos seja observável no padrão de XRPD.

[0053] Os pontos de fusão de composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórficas A e B foram determinados usando calorimetria de varredura diferencial como descrito no Exemplo 6. O composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica A foi descoberto ter um ponto de fusão de 191,6 °C, e o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B foi descoberto ter um ponto de fusão de 214 °C. A forma polimórfica B foi também descoberta ter um calor maior de fusão do que a forma polimórfica A. Como explicado no exemplo 6, estes resultados sugerem que a forma polimórfica B é termodinamicamente mais estável do que a forma polimórfica A.

[0054] As estabilidades físicas e químicas de composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, foram investigadas, os resultados das quais são descritas aqui.

[0055] A fim de avaliar a estabilidade física, o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B foi micronizado seguindo o procedimento descrito no exemplo 4, e as amostras do material resultante foram armazenadas em recipientes abertos e submetidas à diferentes temperaturas ambientes e umidades relativas. As propriedades físicas e estabilidades das amostras foram investigadas usando TGA, DSC, DVS, espectroscopia de IR e análise de XRPD. Procedimentos experimentais completos são fornecidos na seção de procedimentos gerais e os resultados são sumariados no exemplo 7 (Tabela 7). Como descrito no exemplo 7, o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B (micronizada) foi constatado ter boa estabilidade física. Os mesmos procedimentos experimentais foram também realizados usando o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B em forma não micronizada e os resultados contatados ser substancialmente similares àqueles obtidos para o material micronizado, isto é, o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B tanto nas formas micronizadas quanto não micronizadas foi constatado ter boa estabilidade física.

[0056] A fim de avaliar a estabilidade química, o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B foi micronizada seguindo o procedimento descrito no exemplo 4. Amostras micronizadas foram armazenadas em recipientes abertos e submetidas a diferentes temperaturas ambientes e umidades relativas. As estabilidades químicas das amostras foram analisadas por HPLC. Os resultados são sumariados no exemplo 8 (Tabela 8) onde é indicado que o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, pós micronização foi constatado ser quimicamente estável, embora alguma sensibilidade à luz fosse detectada.

[0057] Como um resultado dos estudos de estado sólido descritos aqui, conclui-se que o composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B pode ser micronizada e que o material resultante tem boa estabilidade física e química.

[0058] O composto de fórmula (I) é um inibidor de p38 MAP cinase (especialmente do subtipo alfa) e em um aspecto o composto é útil no tratamento de doenças inflamatórias, por exemplo, COPD e/ou asma.

[0059] Surpreendentemente, o composto exibe uma longa duração de ação e/ou persistência de ação em comparação ao inibidor de p38 MAP anteriormente descrito BIRB796.

[0060] Persistência de ação, como usado aqui, está relacionada à taxa de dissociação ou constante de dissociação do composto do alvo (tal como um receptor). Uma baixa taxa de dissociação pode induzir à persistência.

[0061] Uma baixa taxa de dissociação em combinação com uma taxa de associação elevada tende a fornecer entidades terapêuticas potentes.

[0062] Espera-se que o composto de fórmula (I) seja potente in vivo.

[0063] Tipicamente, os compostos de técnica anterior, desenvolvidos até o momento, foram destinados para administração oral. Esta estratégia envolve a otimização dos compostos que obtêm sua duração de ação por um perfil farmacocinético apropriado, desse modo garantindo que uma concentração de fármaco suficientemente elevada seja estabelecida e mantida entre as doses para fornecer o benefício clínico. A consequência inevitável deste método é que todos os tecidos corporais, e especialmente o fígado e o intestino, são expostos às concentrações supra-terapeuticamente ativas do fármaco, sejam eles ou não adversamente afetados pela doença que está sendo tratada.

[0064] Uma estratégia alternativa é designar paradigmas de tratamento, em que o fármaco é dosado diretamente ao órgão inflamado (terapia tópica). Ao mesmo tempo em que este método não é adequado para o tratamento de todas as doenças inflamatórias crônicas, ele tem sido extensivamente explorado em doenças do pulmão (asma, COPD), condições de pele (dermatite atópica e psoríase), doenças nasais (rinite alérgica) e distúrbios gastrointestinais (colite ulcerativa).

[0065] Na terapia tópica, a eficácia pode ser obtida garantindo que fármaco tenha uma duração prolongada de ação e seja mantido no órgão relevante para minimizar os riscos de toxicidade sistêmica ou produzindo uma formulação que gere um "reservatório" do fármaco ativo que é disponível para prolongar seus efeitos desejado. O primeiro método é exemplificado pelo fármaco anticolinérgico tiotrópio (Spiriva). Este composto é topicamente ao pulmão como um tratamento para COPD, e tem uma afinidade excepcionalmente elevada quanto seu receptor alvo, resultando em uma taxa muito lenta e uma consequente duração prolongada de ação.

[0066] Em um aspecto da invenção, o composto de fórmula (I) é particularmente adequado para liberação tópica, tal como liberação tópica aos pulmões, em particular para o tratamento de doença respiratória, por exemplo, doenças respiratórias crônicas tal como COPD e/ou asma.

[0067] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) é adequado para sensibilização dos pacientes ao tratamento com um corticosteroide que se tornou refratário a tais regimes de tratamento.

[0068] O composto de fórmula (I) pode também ser útil para o tratamento de artrite reumatoide.

[0069] O composto de fórmula (I) pode ter propriedades antivirais, por exemplo, a capacidade de prevenir infecções de células (tais como células epiteliais respiratórias) com a picornavírus, em particular um rinovírus, vírus da influenza ou sincicial respiratório.

[0070] Desse modo, acredita-se que o composto seja um agente antiviral, em particular adequada para a prevenção, tratamento ou melhora de infecções por picornavírus, tais como infecção por rinovírus, vírus da influenza ou sincicial respiratório.

[0071] Em uma modalidade o composto de fórmula (I) é capaz de reduzir a inflamação reduzida por infecção viral, tal como infecção por rinovírus e em particular infecções virais que resultam na liberação de citocinas tal como IL-8, especialmente in vivo. Esta atividade pode, por exemplo, ser testada in vitro empregando um ensaio de IL-8 induzido por rinovírus como descrito nos exemplos aqui.

[0072] Em uma modalidade o composto de fórmula (I) é capaz de reduzir a expressão de ICAM1 induzida por rinovírus, especialmente in vivo. ICAM1 é o mecanismo receptor usado pelos assim chamados sorotipos de rinovírus de sulco principais para infectar as células. Esta atividade pode ser medida, por exemplo, por um método descrito nos exemplos aqui.

[0073] Espera-se que as propriedades acima tornem o composto de fórmula (I) particularmente adequado para uso no tratamento e/ou profilaxia de exacerbações de doenças inflamatórias, em particular exacerbações virais, em pacientes com uma ou mais das seguintes condições crônicas tais como insuficiência cardíaca congestiva, COPD, asma, diabetes, câncer e/ou em pacientes imunossuprimidos, por exemplo, pós transplante de órgão.

[0074] Em particular, o composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de um ou mais distúrbios respiratórios incluindo COPD (incluindo bronquite crônica e enfisema), asma, asma pediátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, rinite alérgica, rinite, sinusite, especialmente asma, e COPD (incluindo bronquite crônica e enfisema).

[0075] O composto de fórmula (I) pode também ser útil no tratamento de uma ou mais condições que podem ser tratadas por terapia tópica ou local incluindo conjuntivite alérgica, conjuntivite, dermatite alérgica, dermatite de contato, psoríase, colite ulcerativa, articulações inflamadas secundárias à artrite reumatoide ou à osteoartrite.

[0076] Espera-se também que o composto de fórmula (I) possa ser útil no tratamento de certas outras condições incluindo artrite reumatoide, pancreatite, caquexia, inibição do crescimento e metástase de tumores incluindo carcinoma de pulmão de célula não pequena, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, carcinomas colorretais e melanoma maligno.

[0077] O composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de doenças ou distúrbios oculares incluindo conjuntivite alérgica, conjuntivite, retinopatia diabética, edema macular (incluindo edema macular úmido e edema macular seco), inflamação por catarata pós- operativa ou, particularmente, uveíte (incluindo posterior, anterior e panuveíte).

[0078] O composto de fórmula (I) pode ser útil no tratamento de doenças ou distúrbios gastrointestinais incluindo colite ulcerativa ou doença de Crohn.

[0079] O composto de fórmula (I) pode também ressensibilizar a condição do paciente ao tratamento com um corticosteroide, quando a condição do paciente tornar-se refratária ao mesmo.

[0080] Além disso, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a invenção opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0081] A presente invenção também fornece um processo para a preparação de tal composição farmacêutica que compreende misturar os ingredientes.

[0082] Diluentes e veículos podem incluir aqueles adequados para administração parenteral, oral, tópica, mucosal e retal.

[0083] Como acima mencionado, tais composições podem ser preparadas, por exemplo, para administração parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular ou periarticular, particularmente na forma de soluções líquidas ou suspensões; para administração oral, particularmente na forma de comprimidos ou cápsulas; para administração tópica, por exemplo, pulmonar ou intranasal, particularmente na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis e administração transdérmica; para administração mucosal, por exemplo, à mucosa bucal, sublingual ou vaginal, e para administração retal, por exemplo, na forma de um supositório.

[0084] As composições podem convenientemente ser administradas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica, por exemplo, como descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edição, Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Formulações para parenteral podem conter como excipientes água estéril ou salina, alquileno glicóis tais como propileno glicol, polialquileno glicóis tais como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e similares. Formulações para administração nasal podem ser sólidas e podem conter excipientes, por exemplo, lactose ou dextrana, ou podem ser soluções aquosas ou oleosas para uso na forma de gotas nasais ou sprays dosados. Para administração bucal típica, excipientes incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinado, e similares.

[0085] Composições adequadas para administração oral podem compreender um ou mais veículos e/ou excipientes fisiologicamente compatíveis e podem ser na forma sólida ou líquida. Comprimidos e cápsulas podem ser preparadas com agentes de ligação, por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, ou poli-vinilpirollidona; cargas tais como lactose, sacarose, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol, ou glicina; lubrificantes, tais como estearato de magnésio, talco, polietileno glicol, ou sílica; e tensoativos, tal como sulfato de laurila de sódio. Composições líquidas podem conter aditivos convencionais tal como agentes de suspensão, por exemplo, xarope de sorbito, metil celulose, xarope de açúcar, gelatina, carboximetil-celulose, ou gorduras comestíveis; agentes emulsificantes tal como lecitina, ou acácia; óleos vegetais tais como óleo de amêndoa, óleo de coco, óleo de fígado de bacalhau, ou óleo de amendoim; conservantes tais como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT). Composições líquidas podem ser encapsuladas em, por exemplo, gelatina para fornecer uma forma de dosagem unitária.

[0086] Formas de dosagem orais sólidas incluem comprimidos, cápsulas de casca dura em duas partes e cápsulas de gelatina elástica macia (SEG).

[0087] Uma formulação de casca seca tipicamente compreende de cerca de 40% a 60% por peso/peso de concentração de gelatina, cerca de uma concentração de 20% a 30% de plastificante (tal como glicerina, sorbitol ou propileno glicol) e cerca de uma concentração de 30% a 40% de água. Outros materiais tais como conservantes, tinturas, opacificantes e aromatizantes também podem estar presente. O material de carga líquida compreende um fármaco sólido que foi dissolvido, solubilizado ou disperse (com agentes de suspensão tais como cera de abelha, óleo de rícino hidrogenado ou polietileno glicol 4000) ou um fármaco líquido em veículos ou combinações de veículos tais como óleo mineral, óleos vegetais, triglicerídeos, glicóis, polióis e agentes tensoativos.

[0088] Adequadamente, o composto de fórmula (I) é administrado topicamente ao pulmão. Consequentemente fornecemos, de acordo com a invenção, uma composição farmacêutica compreendendo composto (I) da invenção opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou veículos topicamente aceitáveis. A administração tópica ao pulmão pode ser obtida pelo uso de uma formulação de aerossol. Formulações de aerossol tipicamente compreendem o ingrediente ativo suspenso ou dissolvido em um propelente de aerossol adequado, tal como um clorofluorocarboneto (CFC) ou um hidrofluoro- carboneto (HFC). Propelentes de CFC adequados incluem tricloromo- nofluorometano (propelente 11), diclorotetrafluoro metano (propelente 114), e diclorodifluorometano (propelente 12). Propelentes de HFC adequados incluem tetrafluoroetano (HFC-134a) e heptafluoropropano (HFC-227). O propelente tipicamente compreende 40% a 99,5%, por exemplo, 40% a 90% por peso da composição de inalação total. A formulação pode compreender excipientes incluindo cossolventes (por exemplo, etanol) e tensoativos (por exemplo, lecitina, trioleato de sorbitano e similares). As formulações de aerossol são empacotadas em vasilhas e uma dose adequada é liberada por meio de uma válvula dosadora (por exemplo, como fornecido por Bespak, Valois ou 3M).

[0089] A administração tópica ao pulmão pode também ser obtida pelo uso de uma formulação não pressurizada tal como uma solução ou suspensão aquosa. Esta pode ser administrada por meio de um nebulizador. Os nebulizadores podem ser portáteis ou não portáteis. A administração tópica ao pulmão pode também ser obtida pelo uso de uma formulação de pó seco. Uma formulação de pó seco conterá o composto da invenção em forma finamente dividida, tipicamente com um diâmetro aerodinâmico médio de massa (MMAD) de 1 a 10 μm. A formulação tipicamente conterá um diluente topicamente aceitável tal como lactose, geralmente de tamanho de partícula maior, por exemplo, um MMAD de 50 μm ou mais, por exemplo, 100 μm ou mais. Um diluente topicamente aceitável alternativo é o manitol. Exemplos de sistemas de liberação de pó seco incluem SPINHALER, DISKHALER, TURBOHALER, DISKUS e CLICKHALER. Outros exemplos de sistemas inaladores de pó seco incluem ECLIPSE, ROTAHALER, HANDIHALER, AEROLISER, CYCLOHALER, BREEZHALER/NEO- HALER, FLOWCAPS, TWINCAPS, X-CAPS, TURBOSPIN, ELPENHALER, TURBUHALER, MIATHALER, TWISTHALER, NOVOLIZER, SKYEHALER, inalador de pó seco ORIEL, MICRODOSE, ACCUHALER, PULVINAL, EASYHALER, ULTRAHALER, TAIFUN, PULMOJET, OMNIHALER, GYROHALER, TAPER, CONIX, XCELOVAIR e PROHALER.

[0090] Um aspecto da invenção refere-se a uma formulação farmacêutica seca para inalação compreendendo: Composto (I)

(fenilamino)pirimidin-4-ilóxi)naftalen-1-il)ureia ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, incluindo todos os estereoisômeros e tautômeros do mesmo, em forma particulada (por exemplo, forma cristalina sólida B) como o ingrediente ativo; lactose particulada como o veículo; e um sal de metal particulado de ácido esteárico, tal como estearato de magnésio.

[0091] A invenção também fornece um dispositivo de inalação compreendendo uma ou mais doses da referida formulação.

[0092] O composto de fórmula (I) tem atividade terapêutica. Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um composto da invenção para uso como um medicamento. Desse modo, em um outro aspecto, a presente invenção fornece um composto como descrito aqui para uso no tratamento de uma ou mais das condições mencionadas.

[0093] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uso de composto (I) como descrito aqui para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma ou mais das condições mencionadas.

[0094] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma ou mais das condições mencionadas que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de composto (I) da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto.

[0095] A palavra "tratamento" destina-se a abranger a profilaxia bem como tratamento terapêutico.

[0096] O composto (I) da invenção pode também ser administrado em combinação com um ou mais outros ingredientes ativos, por exemplo, ingredientes ativos adequados para o tratamento das condições acima mencionadas. Por exemplo, possíveis combinações para o tratamento de distúrbios respiratórios incluem combinações com esteroides (por exemplo, budesonida, dipropionato de beclometasona, propionato de fluticasona, furoato de mometasona, furoato de fluticasona), beta agonistas (por exemplo, terbutalina, salbutamol, salmeterol, formoterol) e/ou xantinas (por exemplo, teofillina). Outros ativos adequados incluem anticolinérgicos, tal como tiotrópio e agentes antivirais tal como, porém não limitado a zanamivir ou oseltamivir, por exemplo, como o fosfato. Outros agentes antivirais incluem peramivir e laninamivir. Outras possíveis combinações para o tratamento de distúrbios respiratórios incluem combinações com esteroides tais como flunisolida, ciclesonida e triancinolona; beta agonistas tais como bambuterol, levalbuterol, clenbuterol, fenoterol, broxaterol, indacaterol, reproterol, procaterol e vilanterol; antagonistas muscarínicos, (por exemplo, ipratrópio, tiotrópio, oxitrópio, glicopirrônio, glicopirrolato, aclidinínio, tróspio) e antagonistas de leucotrieno (por exemplo, zafirlucaste, pranlucaste, zileuton, montelucaste). Será entendido que qualquer um dos ingredientes ativos anteriormente mencionados poderá ser empregado na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

[0097] Em uma modalidade o composto de fórmula (I) e o outro ingrediente(s) ativo são coformulados na mesma formulação farmacêutica. Em outra modalidade, os outros ingredientes ativos são administrados em uma ou mais formulações farmacêuticas separadas.

[0098] Consequentemente, outro aspecto da invenção fornece um produto de combinação compreendendo: um composto da presente invenção (isto é, um composto de fórmula (I) como acima definido, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo); e outro agente terapêutico, em que cada um dos componentes (A) e (B) é formulado em mistura com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0099] Neste aspecto da invenção, o produto de combinação pode ser uma formulação farmacêutica simples (combinação) ou um kit-de- partes.

[00100] Desse modo, este aspecto da invenção abrange uma formulação farmacêutica incluindo um composto da presente invenção e outro agente terapêutico, em mistura com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável (cuja formulação é aqui a seguir referida como uma "preparação combinada").

[00101] Ele também abrange um kit de partes que compreende os componentes: uma formulação farmacêutica incluindo um composto da presente invenção em mistura com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável; e uma formulação farmacêutica incluindo outro agente terapêutico, em mistura com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável, cujos componentes (i) e (ii) são cada qual fornecidos em uma forma que é adequada para administração em conjunção com os outros.

[00102] O componente (i) do kit de partes é desse modo o componente (A) acima em mistura com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Similarmente, o componente (ii) é o componente (B) acima em mistura com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[00103] O outro agente terapêutico (isto é, componente (B) acima) pode ser, por exemplo, qualquer um dos ingredientes ativos mencionados acima em conexão com o tratamento de distúrbios respiratórios.

[00104] Os dados reportados aqui abaixo em relação às propriedades antivirais do composto de fórmula (I) fornece evidência de que outras terapias antivirais em combinação com um composto de fórmula (I) seriam úteis no tratamento ou prevenção de exacerbações viralmente induzidas (por exemplo, infecções virais respiratórias) sofridas por pacientes com doença respiratória tal como COPD e/ou asma e/ou uma ou mais das indicações listadas acima. Desse modo, em um aspecto, é fornecido o uso de composto (I) em combinação com uma terapia antiviral tal como, porém não limitado a zanamavir ou oseltamivir (por exemplo, fosfato de oseltamivir) no tratamento ou prevenção de infecções virais respiratórias sofridas por pacientes com doença respiratória tal como COPD e/ou asma.

[00105] Os inventores também acreditam que outras terapias antivirais em combinação com composto (I) poderiam ser úteis no tratamento ou prevenção de exacerbações viralmente induzidas (por exemplo, infecções virais respiratórias) em pacientes com condições crônicas diferentes de doenças respiratórias, por exemplo, condições tais como insuficiência cardíaca congestiva, diabetes, câncer, ou condições sofridas por pacientes imunossuprimidos, por exemplo, pós transplante de órgão. Desse modo, em um outro aspecto é fornecido o uso de um composto da invenção em combinação com uma terapia antiviral, tal como, porém não limitado a zanamavir ou oseltamivir (por exemplo, fosfato de oseltamivir), no tratamento ou prevenção de infecções virais respiratórias em pacientes com condições crônicas tais como insuficiência cardíaca congestiva, diabetes, câncer, ou em condições sofridas por pacientes imunossuprimidos, por exemplo, pós transplante de órgão.

SEÇÃO EXPERIMENTAL

[00106] As abreviações usadas aqui são definidas abaixo (Tabela 1). Quaisquer abreviações não definidas são destinadas a transmitir seu significado geralmente aceito. Tabela 1: Abreviações AcOH Ácido acético glacial Aq Aquoso ATP adenosina-5'-trifosfato BALF Fluido de lavagem broncoalveolar BEGM Meio de crescimento de célula epitelial brônquica Br Amplo BSA Albumina de soro bovino CatCart® Cartucho catalítico CDI 1,1-carbonil-diimidazol COPD Doença pulmonar obstrutiva crônica CXCL1 Ligante 1 de quimiocina (motivo C-X-C) D Dupleto DCM Diclorometano DMSO Sulfóxido de dimetila DSC calorimetria de varredura diferencial d-U937 Células U-937 diferenciadas por PMA cells DVS Absorção de vapor dinâmico (ES+) Ionização por eletrovaporização, modo positivo Et Etila EtOAc Acetate de etila FCS Soro de bezerro fetal Transferência de energia de ressonância de FRET fluorescência GSK3α Glicogêncio sintase cinase 3α HBEC Células epiteliais brônquicas humanas primárias Hr hora(s) HRP Rábano picante peroxidase HRV Rinovírus humano ICAM-1 Molécula 1 de adesão intercelular IR infravermelho JNK Cinase de terminal N de c-Jun KC queratinócito quimioatraente Kd Constante de dissociação LPS Lipopolissacarídeo (M+H)+ MAPK Íon molecular protonado Proteína cinase ativada por proteína de mitógeno MAPKAP- Proteína cinase 2 ativada por proteína cinase ativada K2 por mitógeno Me Metila MeCN Acetonitrila MeOH Metanol MHz Megahertz min minuto(s) MIP1α Proteína 1 alfa inflamatória de macrófago MMAD Diâmetro aerodinâmico médio de massa MOI Multiplicidade de infecção m.p. Ponto de fusão Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- MTT difeniltetrazólio m/z: Relação massa-para-carga NMR Ressonância magnética nuclear (espectroscopia) PBMC Célula mononuclear de sangue periférico PBS salina tamponada por fosfato Ph Fenila PHA Fitoemaglutinina PMA Acetato de miristato de forbol pTSA Q Ácido 4-metilbenzenossulfônico Quarteto RT Temperatura ambiente RP HPLC cromatografia líquida de desempenho elevado de fase reversa RSV Vírus sincicial respiratório S Singleto sat Saturado SCX Permuta de cátion suportada por sólido (resina) SDS Sulfato de dodecila de sódio SNAr Substituição aromática nucleofílica T Tripleto TCID50 50% de dose infecciosa de cultura de tecido TGA análise termogravimétrica THF Tetraidrofurano TNFα Fator alfa de necrose de tumor XRPD Difração de pó de raio X

Procedimentos Gerais

[00107] Todos os materiais de partida e solventes foram obtidos de fontes comerciais ou preparados de acordo com a citação de literatura. A menos que de outro modo estabelecido, todas as reações foram agitadas. Soluções orgânicas foram rotineiramente secadas sobre sulfato de magnésio anidroso. Hidrogenações foram realizadas em um reator de fluxo Thales H-cube sob as condições estabelecidas. A cromatografia de coluna foi realizada em cartuchos de sílica pré- empacotados (230 a 400 malhas, 40 a 63 μm) usando a quantidade indicada. SCX foi adquirido de Supelco e tratado com ácido hidroclórico a 1M antes do uso. A menos que estabelecido de outro modo, a mistura reacional a ser purificada, foi primeiro diluída com MeOH e tornada acídica com algumas gotas de AcOH. Esta solução foi carregada diretamente e no SCX e lavada com MeOH. O material desejado foi em seguida eluído por lavagem com NH3 a 1% em MeOH.

[00108] Cromatografia Líquida de Desempenho Elevado de Fase Reversa Preparativa: Coluna C18 Agilent Scalar, 5 μm (21,2 x 50 mm), taxa de fluxo 28 mL min-1 eluindo com um gradiente de H2O-MeCN contendo 0,1% por volume/volume de ácido fórmico durante 10 minutos usando detecção de UV a 215 e 254 nm. Informação de gradiente: 0,0 a 0,5 minuto; 95% de H2O-5% de MeCN; 0,5 a 7,0 minuto; aumentado de 95% de H2O-5% de MeCN para 5% de H2O-95% de MeCN; 7,0 a 7,9 minuto; mantido a 5% de H2O a 95% de MeCN; 7,9 a 8,0 minutos; retornado para 95% de H2O-5% de MeCN; 8,0 a 10,0 minutos; mantido a 95% de H2O-5% de MeCN.

Métodos analíticos

[00109] Cromatografia Líquida de Desempenho Elevado de Fase Reversa: (Método 1): Coluna C18 Agilent Scalar, 5 μm (4,6 x 50 mm) ou Waters XBridge C18, 5 μm (4,6 x 50 mm) taxa de fluxo 2,5 mL min-1 eluindo com um gradiente de H2O-MeCN contendo 0,1% por volume/volume de ácido fórmico (Método 1 acídico) ou NH3 (Método 1 básico) durante 7 minutos empregando a detecção de UV a 215 e 254 nm. Informação de gradiente: 0,0 a 0,1 minuto, 95% de H2O-5% de MeCN; 0.1-5.0 minutos, aumentado de 95% de H2O-5% de MeCN para 5% de H2O-95% de MeCN; 5,0 a 5,5 minutos, mantido a 5% de H2O- 95% de MeCN; 5,5-5,6 minutos, mantido a 5% de H2O-95% de MeCN, taxa de fluxo aumentada para 3,5 mL min-1; 5,6 a 6,6 minutos, mantido a 5% de H2O-95% de MeCN, taxa de fluxo 3,5 mL min-1; 6,6 a 6,75 minutos, retornado para 95% de H2O-5% de MeCN, taxa de fluxo 3,5 mL min-1; 6,75-6,9 minutos, mantido a 95% de H2O-5% de MeCN, taxa de fluxo 3,5 mL.min-1; 6,9 a 7,0 minutos, mantido a 95% de H2O-5% de MeCN, taxa de fluxo reduzida para 2,5 mL min-1.

[00110] Cromatografia líquida de desempenho elevado de fase reversa: (Método 2): Coluna Agilent Extend C18, 1,8 μm (4,6 x 30 mm) a 40°C; taxa de fluxo 2,5 a 4,5 mL min-1 eluindo com um gradiente de H2O-MeCN contendo 0,1% por volume/volume de ácido fórmico durante 4 minutos empregando detecção de UV a 254 nm. Informação de gradiente: 0 a 3,00 minutos, elevado de 95% de H2O-5% de MeCN para 5% de H2O-95% de MeCN; 3,00 a 3,01 minutos, mantido a 5% de H2O-95% de MeCN, taxa de fluxo aumentada para 4,5 mL min-1; 3,01 a 3,50 minutos, mantido a 5% de H2O-95% de MeCN; 3,50 a 3,60 minutos, retornado para 95% H2O-5% MeCN, taxa de fluxo reduzida para 3,50 mL min-1; 3,60 a 3,90 minutos, mantido a 95% de H2O-5% de MeCN; 3,90 a 4,00 minutos, mantido a 95% de H2O-5% de MeCN, taxa de fluxo reduzida para 2,5 mL min-1.

[00111] Espectroscopia de 1H NMR: Os espectros foram adquiridos em um espectrômetro Bruker Avance III a 400 MHz usando solvente não deuterado residual como referência.

[00112] Absorção de vapor dinâmico: As plotagens foram obtidas usando um modelo de absorção de vapor dinâmico Surface Measurement Systems DVS-1 usando cerca de 10 mg da amostra. A mudança de peso foi registrada com respeito à umidade atmosférica a 25°C e foi determinada usando os seguintes parâmetros: secagem: 60 minutos sob nitrogênio seco; equilíbrio: 60 minuto/etapa; intervalo de dados: 0,05% ou 2,0 minutos. Os pontos de medição da umidade relativa [RH %] foram como segue:

[00113] Primeiro grupo: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5

[00114] Segundo grupo: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 0.

[00115] Difração de Pó de Raio X: Os padrões foram obtidos em um difractômetro PANalytical (Philips) X’PertPRO MPD equipado com um tubo de raio X Cu LFF (45 kV; 40 mA; Bragg-Brentano; estágio de centrifugação) e foram adquiridos usando radiação por Cu Kα sob as seguintes condições de medição: modo de varredura: contínuo; faixa de varredura: 3 a 50° 2θ; tamanho de etapa: 0,02°/etapa; tempo de contagem: 30 segundos/etapa; tempo de resolução de centrifugação: 1 segundo; trilha de feixe incidente: programa. Fenda de divergência: 15 mm; Fenda Soller: 0,04 rad; máscara de fenda: 15 mm; fenda antidispersão: 1°; faca de irradiação: +; trilha de feixe difratado: longa proteção antidispersão: +; fenda Soller: 0.04 rad; filtro de Ni: +; detector: X’Celerator. As amostras foram preparadas espalhando-as sobre um portador de amostra de base zero.

[00116] Espectroscopia por Infravermelho: Refletância total micro atenuada (microATR) foi usada e a amostra foi analisada usando um acessório microATR adequado e as seguintes condições de medição: aparato: espetrômetro Thermo Nexus 670 FTIR; número de varreduras: 32; resolução: 1 cm-1; faixa de comprimento de onda: 4000 a 400 cm-1; detector: DTGS com janela KBr; separador de feixe: Ge em KBr; acessório micro ATR: Harrick Split Pea com cristal de Si.

[00117] Calorimetria de varredura diferencial: Os dados foram coletados em um TA-Instruments Q1000 MTDSC equipado com unidade de resfriamento RCS. Tipicamente 3 mg de cada composto, em uma panela de amostra TA-Instrument de alumínio padrão, foram aquecidos a 10 °C/minuto de 25 C a 300°C. Uma purga de nitrogênio a 50 mL/minuto foi mantida sobre a amostra.

[00118] Análise termogravimétrica: Os dados foram coletados em um termogravímetro TA-Instruments Q500. Tipicamente 10 mg de cada amostra foram transferidos em uma panela de alumínio pré-pesada e foram aquecidos a 20°C/minuto de temperatura ambiente para 300°C ou < 80[(peso/peso)%] a menos que de outro modo estabelecido.

[00119] Estabilidade Química por HPLC: As análises foram realizadas em uma coluna Waters Xbridge C18 (3,0 x 150 mm; 3,5 μm) usando as seguintes condições de operação: temperatura de coluna: 40°C; temperatura de amostra: 5°C; taxa de fluxo: 0,45 mL/minuto; volume de injeção: 7 μL; detecção de UV a 260 nm; composição de fase móvel compreendida de fase A: acetato de amônio a 10 mM + 0,1%, volume/volume de ácido trifluoroacético em água e fase B: acetonitrila, usando o gradiente definido pelos parâmetros abaixo (Tabela 2). Tabela 2: Condições de Gradiente para Estudos de Estabilidade Química por HPLC.

Métodos experimentais para teste biológico Ensaios de Inibição de Enzima

[00120] As atividades de ligação de enzima cinase dos compostos descritos aqui, foram determinadas usando um ensaio proprietário que mede a ligação de competição direcionada ao sítio ativo a um ligante imobilizado (Fabian, M.A. et al., Nature Biotechnol., 2005, 23:329-336). Estes ensaios foram conduzidos por DiscoverX (anteriormente Ambit; San Diego, CA). O valor Kd (valor de constante de dissociação) foi calculado como o índice de afinidade dos compostos a cada cinase.

Ensaios de Inibição de Enzima

[00121] As atividades inibitórias de enzima de compostos descritos aqui foram determinadas por FRET usando peptídeos sintéticos rotulados tanto com fluoróforos de doador quanto de receptor (Z-LYTE, Invitrogen Ltd., Paisley, UK).

Inibição de Enzima p38 MAPKα

[00122] As atividades inibitórias de compostos teste contra a isoforma p38 MAPKα (MAPK14: Invitrogen), foram avaliadas indiretamente determinando-se o nível de ativação / fosforilação da molécula a jusante, MAPKAP-K2. A proteína p38 MAPKα (80 ng/mL, 2,5 μL) foi misturada com o composto teste (2,5 μL de 4 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,04 μg/mL ou 0,004 μg/mL) durante 2 horas em temperatura ambiente. A solução mista (2,5 μL) do alvo inativo de p38α MAPKAP-K2 (Invitrogen, 600 ng/mL) e peptídeo de FRET (8 μM; um alvo de fosforilação quanto à MAPKAP-K2) foi em seguida adicionado e a reação de cinase foi iniciada por adição de ATP (40 μM, 2,5μL). A mistura foi incubada durante 1 hora em temperatura ambiente. O reagente de desenvolvimento (protease, 5 μL) foi adicionado durante 1 hora antes da detecção em uma leitora de microplaca de fluorescência (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).

Inibição de Enzima p38 MAPKY

[00123] As atividades inibitórias de compostos da invenção contra p38MAPKy (MAPK12: Invitrogen), foram avaliadas em um modelo similar àquele descrito aqui acima. A enzima (800 ng/mL, 2,5 μL) foi incubada com o composto teste (2,5 μL em 4 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,04 μg/mL, ou 0,004 μg/mL) durante 2 horas em temperatura ambiente. Os peptídeos de FRET (8 μM, 2,5 μL), e solução de ATP apropriada (2,5 μL, 400 μM) foi em seguida adiciona às misturas de enzima / composto e incubada durante 1 hora. O reagente de desenvolvimento (protease, 5 μL) foi adicionado durante 1 hora antes da detecção em uma leitora de microplaca de fluorescência (Varioskan® Flash, Thermo Scientific).

Inibição de Enzima c-Src e Syk

[00124] As atividades inibitórias de compostos da invenção contra enzimas c-Src e Syk (Invitrogen), foram avaliadas em um modelo similar àquele descrito aqui acima. A enzima relevante (3000 ng/mL ou 2000 ng/mL respectivamente, 2,5 μL) foi incubada com o composto teste (4 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,04 μg/mL, ou 0,004 μg/mL, 2,5 μL cada) durante 2 horas em temperatura ambiente. Os peptídeos de FRET (8 μM, 2,5 μL), e solução de ATP apropriadas (2,5 μL, 800 μM para c-Src, e 60 μM ATP para Syk) foram em seguida adicionados às misturas de enzima / composto e incubadas durante 1 hora. O reagente de desenvolvimento (protease, 5 μL) foi adicionado durante 1 hora antes da detecção em uma leitora de microplaca de fluorescência (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).

Inibição de Enzima GSK 3α

[00125] As atividades inibitórias de compostos teste contra a isoforma de enzima GSK 3α (Invitrogen), foram avaliadas determinando-se o nível de ativação/fosforilação do peptídeo alvo. A proteína GSK3-α (500 ng/mL, 2,5 μL) foi misturada com o composto teste (2,5 μL em 4 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,04 μg/mL, ou 0,004 μg/mL) durante 2 horas em temperatura ambiente. O peptídeo de FRET (8 μM, 2,5 μL), que é um alvo de fosforilação para GSK3α, e ATP (40 μM, 2,5 μL) foram em seguida adicionados à mistura de enzima/composto e a mistura resultante incubada durante 1 hora. O reagente de desenvolvimento (protease, 5 μL) foi adicionado durante 1 hora antes da detecção em uma leitora de microplaca de fluorescência (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).

[00126] Em todos os casos, a protease específica de sítio cliva o peptídeo não fosforilado apenas e elimina o sinal de FRET. Os níveis de fosforilação de cada reação foram calculados usando a relação e emissão de cumarina (doador) sobre a emissão de fluoresceína (receptor), para os quais as baixas relações indicam fosforilação elevada e relações elevadas indicam baixos níveis de fosforilação. O percentual de inibição de cada reação foi calculado om relação ao controle não inibido e a concentração inibitória de 50% (valor IC50) foi em seguida calculada da curva de resposta à concentração.

Ensaios Celulares Liberação de TNFα/IL-8 Induzida por LPS em Células d-U937

[00127] Células U937, uma linhagem celular monocítica humana, foram diferenciadas em células tipo macrófago por incubação com PMA (100 ng/mL) durante 48 a 72 horas. As células foram pré-incubadas com concentrações finais de composto teste durante 2 horas e foram em seguida estimuladas com LPS (0,1 μg/mL; de E. Coli: O111:B4, Sigma) durante 4 horas. O sobrenadante foi coletado para determinação de concentrações de TNFα e IL-8 por ELISA sanduíche (Duo-set, R&D systems). A inibição de produção de TNFα foi calculada como um percentual daquela obtida por 10 μg/mL de BIRB796 em cada concentração de composto teste por comparação com controle de veículo. A concentração eficaz de 50% relativa (REC50) foi determinada da curva de resposta à concentração resultante. A inibição de Produção de IL-8 foi calculada em cada concentração de composto teste por comparação com controle de veículo. A concentração inibitória de 50% (IC50) foi determinada da curva de resposta à concentração resultante.

Liberação de TNFα Induzida por LPS em Células THP-1

[00128] Células THP-1, uma linhagem celular monocítica humana, foram estimuladas com 3 μg/mL de LPS (de E. Coli; 0111:B4, Sigma) durante 4 horas e o sobrenadante coletado para determinação da concentração de TNFα por ELISA sanduíche (Duo-set, R&D systems). A inibição de produção de TNFα foi calculada em cada concentração por comparação com controle de veículo. A concentração inibitória de 50% (IC50) foi determinada da curva de resposta à concentração resultante.

Expressão de ICAM-1 induzida por Poli I:C em Células BEAS2B

[00129] Poli I:C foi usado nestes estudos como um mímico simples de vírus de RNA. Mistura de Poli I:C-Oligofectamina (1 μg/mL de Poli I:C, ± 2% de Oligofectamina, 25 μL; Invivogen Ltd., San Diego, CA, e Invitrogen, Carlsbad, CA, respectivamente) foi transfectada em células BEAS2B (células epiteliais brônquicas humanas, ATCC). As células foram pré-incubadas com concentrações finais de compostos teste durante 2 horas e o nível de expressão de ICAM-1 na superfície celular foi determinada por ELISA com base em célula. Em um ponto de tempo de 18 horas após a transfecção de poli I:C, as células foram fixadas com 4% de formaldeído em PBS (100 μL) e em seguida peroxidase endógena foi extinguida pela adição de tampão de lavagem (100 μL, 0,05% de Tween em PBS: PBS-Tween) contendo 0,1% de azida de sódio e 1% de peróxido de hidrogênio. As células foram lavadas com tampão de lavagem (3 x 200 μL), e após bloqueio das cavidades com 5% de leite em PBS-Tween (100 μL) durante 1 hora, as células foram incubadas com anticorpo ICAM-1 anti-humano (50 μL; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) em 1% de BSA PBS durante a noite a 4°C.

[00130] As células foram lavadas com PBS-Tween (3 x 200 μL) e incubadas com o anticorpo secundário (100 μL; IgG anticoelho conjugada com HRP, Dako Ltd., Glostrup, Denmark). As células foram em seguida incubadas com substrato (50 μL) durante 2 a 20 minutos, seguido pela adição de solução de interrupção (50 μL, 1N de H2SO4). O sinal de ICAM-1 foi detectado por leitura e a leitura da absorvência a 450 nm com um comprimento de onda de referência de 655 nm usando um espectrômetro. As células foram em seguida lavadas com PBS- Tween (3 x 200 μL) e os números de célula totais em cada cavidade foram determinados por leitura de absorvência a 595 nm após manchamento com Cristal Violeta (50 μL de uma solução a 2% em PBS) e eluição por solução de SDS a 1% (100 μL) em água destilada. As leituras de OD 450-655 medidas foram corregidas quanto ao número de célula dividindo-se com a leitura de OD595 em cada cavidade. A inibição de expressão de ICAM-1 foi calculada em cada concentração de composto teste por comparação com controle de veículo. A concentração inibitória de 50% (IC50) foi determinada da curva de resposta à concentração resultante.

Ensaio de Mitose Celular

[00131] Mononucleócitos de sangue periférico (PBMCs) de indivíduos sadios foram separados de sangue total (Quintiles, Londres, UK) usando um gradiente de densidade (Histopaque®-1077, Sigma-Aldrich, Poole, UK). As PBMCs (3 milhões de células por amostra) foram subsequentemente tratadas com 2% de PHA (Sigma-Aldrich, Poole, UK) durante 48 horas, seguido por uma exposição de 20 horas a concentrações variáveis de compostos teste. Em 2 horas antes da coleta, as PBMCs foram tratadas com demecolcina (0,1 μg/mL; Invitrogen, Paisley, UK,) para interromper as células em metáfase. Para observar as células mitóticas, as PBMCs foram permeabilizadas e fixadas adicionando Intraprep (50 μL; Beckman Coulter, França), e manchadas com anti-fosfo-histona 3 (0,26 ng/L; #9701; Cell Signalling, Danvers, MA) e iodeto de propídio (1 mg/mL; Sigma-Aldrich, Poole, UK,) como previamente descrito (Muehlbauer P.A. e Schuler M.J., Mutation Research, 2003, 537:117-130). A fluorescência foi observada usando um citômetro de fluxo ATTUNE (Invitrogen, Paisley, UK), fechando para linfócitos. A percentagem de inibição de mitose foi calculada para cada tratamento com relação ao tratamento com o veículo (0,5% de DMSO).

Liberação de IL-8 induzida por Rinovírus e Expressão de ICAM-1

[00132] Rinovírus humano RV16 foi obtidos da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Matérias primas virais foram geradas infectando-se células Hela com HRV até 80% das células ficarem citopáticas.

[00133] Células BEAS2B foram infectadas com HRV em uma MOI de 5 e incubadas durante 2 horas a 33°C com suave agitação para promover a absorção. As células foram em seguida lavadas com PBS, meio fresco adicionado e as células foram incubadas por mais 72 horas. O sobrenadante foi coletado para o ensaio de concentrações de IL-8 usando um kit de desenvolvimento Duoset ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN).

[00134] O nível de expressão de ICAM-1 de superfície celular foi determinado por ELISA com base na célula. Em 72 horas após a infecção, as células foram fixadas com 4% de formaldeído em PBS. Após saciar a peroxidase endógena adicionando-se 0,1% de azida de sódio e 1% de peróxido de hidrogênio, as cavidades foram lavadas com tampão de lavagem (0,05% de Tween em PBS: PBS-Tween). Após bloquear a cavidade com de 5% leite em PBS-Tween durante 1 hora, as células foram incubadas com anticorpo de ICAM-1 antihumano em 5% de BSA PBS-Tween (1:500) durante a noite. As cavidades foram lavadas com PBS-Tween e incubadas com o anticorpo secundário (IgG anticoelho conjugado a HRP, Dako Ltd.). O sinal de ICAM-1 foi detectado adicionando-se substrato e leitura a 450 nm com um comprimento de onda de referência de 655 nm usando um espectrômetro. As cavidades foram em seguida lavadas com PBS- Tween e os números de célula totais em cada cavidade foram determinados por leitura de absorvência a 595 nm após manchamento com Cristal Violeta e eluição por solução de SDS a 1%. As leituras de OD450-655 medidas foram corrigidas para o número celular dividindo-se com a leitura de OD595 em cada cavidade. Os compostos foram adicionados 2 horas antes da infecção por HRV e 2 horas após a infecção quando HRV não infectado foi removido. Avaliação de CPE induzido por HRV16 em células MRC5 Células MRC-5 foram infectadas com HRV16 em uma MOI de 1 em DMEM contendo 5% de FCS e MgCl2 a 1,5 mM, seguido por incubação durante hora a 33°C para promover a adsorção. Os sobrenadantes foram aspirados, e em seguida meio fresco adicionado, seguido por incubação durante 4 dias. Quando apropriado, as células foram pré- incubadas com composto ou DMSO durante 2 horas, e os compostos e DMSO adicionados novamente após remoção do vírus.

[00135] Os sobrenadantes foram aspirados e incubados com solução de azul de metileno (100 μL, 2% de formaldeído, 10% de etanol e 0,175% de Azul de Metileno) durante 2 horas em temperatura ambiente. Após lavagem, 1% de SDS em água destilada (100 μL) foi adicionado a cada cavidade, e as placas foram agitadas ligeiramente durante 1 a 2 horas, antes da leitura da absorvência a 660 nm. A percentagem de inibição para cada cavidade foi calculada. O valor de IC50 foi calculado da curva de concentração-resposta gerada pelas diluições seriais dos compostos testes.

A carga de vírus RSV in vitro em células epiteliais brônquicas primárias.

[00136] Células epiteliais brônquicas humanas normais (NHBEC) cultivadas em placas de 96 cavidades foram infectadas com RSV A2 (Linhagem A2, HPA, Salisbury, UK) em uma MOI de 0,001 no Meio LHC8:RPMI-1640 (50:50) contendo cloreto de magnésio a 15 mM e incubadas durante 1 hora a 37°C para adsorção. As células foram em seguida lavadas com PBS (3 x 200 μL), meio fresco (200 μL) foi adicionado e a incubação continuada durante 4 dias. Quando apropriado, as células foram pré-incubadas com o composto ou DMSO durante 2 horas, e em seguida adicionadas novamente após remoção do vírus.

[00137] As células foram fixadas com 4% de formaldeído em solução de PBS (50 μL) durante 20 minutos, lavadas com tampão de lavagem (3 x 200 μL; PBS incluindo 0,5% de BSA e 0,05% de Tween-20) e incubadas com solução de bloqueio (5% de leite condensado em PBS) durante 1 hora. As células foram em seguida lavadas com tampão de lavagem (3 x 200 μL) e incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente com anticorpo de proteína de fusão F anti-RSV (2F7) (40 μL; camundongo monoclonal, lote 798760, Cat. No. ab43812, Abcam) em 5% de BSA em PBS-tween). Após lavagem, as células foram incubadas com uma solução de anticorpo secundário conjugado a HRP (50 μL) em 5% de BSA em PBS-Tween (lote 00053170, Cat.No. P0447, Dako) e em seguida substrato de TMB (50 μL; pacote de reagente de substrato, lote 269472, Cat. No. DY999, R&D Systems, Inc.) foi adicionado. Esta reação foi interrompida pela adição de H2SO4 a 2N (50 μL) e o sinal resultante foi determinado colorimetricamente (OD: 450 nm com um comprimento de onda de referência de 655 nm) em uma leitora de microplaca (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).

[00138] As células foram em seguida lavadas e uma solução violeta cristal a 2,5% (50 μL; lote 8656, Cat. No. PL7000, Pro-Lab Diagnostics) foi aplicada duante 30 minutos. Após lavagem com tampão de lavagem, 1% de SDS em água destilada (100 μL) foi adicionado a cada cavidade, e as placas foram agitadas ligeiramente na agitadora por 1 hora antes da leitura da absorvência a 595 nm. As leituras de OD450-655 medidas foram corrigidas para o número celular dividindo-se a OD450-655 pelas leituras de OD595. A percentagem de inibição para cada cavidade foi calculada e o valor de IC50 foi calculado a partir da curva de concentração-resposta gerada das diluições seriais de composto.

O Efeito de Compostos testes sob o Ensaio de Viabilidade Celular: MTT

[00139] Células U937 diferenciadas foram pré-incubadas com cada composto teste (concentração final 1 μg/mL ou 10 μg/mL em 200 μL de meio indicado abaixo) sob os dois protocolos: o primeiro durante 4 horas em 5% de meio FCS RPMI1640 e o segundo em 10% de meio FCS RPMI1640 durante 24 horas. O sobrenadante foi substituído por novo meio (200 μL) e solução de matéria prima de MTT (10 μL, 5 mg/mL) foi adicionada a cada cavidade. Após incubação durante 1 hora o meio foi removido, DMSO (200 μL) foi adicionado a cada cavidade e as placas foram agitadas ligeiramente durante 1 hora, antes da leitura da absorvência a 550 nm. A perda de percentagem de viabilidade celular foi calculada para cada cavidade, com relação ao tratamento com o veículo (0,5% de DMSO). Consequentemente um aumento evidente em viabilidade celular para tratamento com fármaco com relação ao veículo é tabulado como uma percentagem negativa.

Produção de citocina em macrófagos de esputo de COPD.

[00140] Pacientes com COPD foram inalados com uma solução de nebulização de 3 % (peso/volume) de salina hipertônica usando um nebulizador ultrassônico (Devilbiss, Carthage, MO) com respiração tidal durante 5 minutos. Este procedimento foi repetido um máximo de três vezes até expectoração suficiente ser obtida. As amostras de expectora- ção foram homogeneizadas e misturadas vigorosamente usando um misturador por turbilhonamento em 0,02 % por volume/volume de solução de ditiotreitol (DTT). As amostras foram novamente suspensas em PBS (40 mL) seguidas por centrifugação a 1500 rpm a 4 °C durante 10 min para obter péletes de célula de expectoração. As péletes foram lavadas duas vezes com PBS (40 mL). As células de expectoração foram em seguida novamente suspensas em meio livre de soro de macrófago (macrophage- SFM, Life technologies, Paisley, UK; para ativar 2x106/cavidade em uma placa de 24 cavidades) contendo 20 U/mL de penicilina, 0,02 mg/mL de estreptomicina e 5 μg/mL de anfotericina B e semeadas em placa de 96 cavidades de alta ligação, seguidas por incubação durante 2 horas a 37 °C e a 5 % de CO2 para permitir aos macrófagos ligarem-se à base da placa. As células sobre a placa foram lavadas com macrófago-SFM fresco (200 μL/cavidade) para remover os neutrófilos e outras células contaminadas. As células aderentes (principalmente macrófagos de expectoração) sobre placa foram usadas para outras análises. Isolação e indução de expectoração foram conduzidas em Quintiles Drug Research Unit at Guys Hospital e aprovação ética e consentimento informado escrito foram obtidos por Quintiles.

[00141] Onde apropriado, 1 μL de uma solução contendo o composto teste ou artigo de referência nas concentrações estabelecidas ou alternativamente 1 μL de DMSO como o controle de veículo foi adicionado em cada cavidade (200 μL em média) e as células foram incubadas durante 2 horas. As células foram estimuladas com solução de LPS (50 μL, concentração final: 1 μg/mL) e incubadas durante 4 horas a 37 °C e 5 % de CO2. O sobrenadante foi em seguida coletado e mantido a -80 °C. Kits luminex de milipóros foram usados para avaliar os quatro analisados. Após o descongelamento do sobrenadante, as contas de anticorpo magnéticas foram multiplexadas e incubadas em uma placa de 96 cavidades com solução de base padrão ou o volume apropriado de amostra durante a noite com agitação a 4 °C. Após lavar duas vezes com 200 μL de tampão de lavagem fornecido pelo kit por cavidade usando um lavador de placa magnético, as contas foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente com 25 μL da solução de anticorpo conjugada de biotina fornecida pelo kit com agitação. Solução de estreptavidina foi adicionada durante 30 minutos com agitação em temperatura ambiente. Após lavagem com 200 uL de tampão de lavagem por cavidade, as contas foram ressuspensas em fluido bainha (150 μL) e analisadas imediatamente. O nível de cada analisado no sobrenadante foi calculado usando software Xcel Fit com uma equação de parâmetro de 4 ou 5 usando cada curva padrão. As inibições de cada produção de citocina foram calculadas em cada concentração por comparação com controle de veículo. Os valores de IC50 foram determinados a partir das curvas de concentração-inibição usando XL-Fit (idbs, Guildford, UK)

Produção de citocina em células epiteliais brônquicas primárias de COPD.

[00142] Células epiteliais da via aérea primária obtidas de pacientes com COPD foram adquiridas de Asterand (Royston, Reino Unido), e mantidas em meio de crescimento de célula epitelial brônquica que foram preparados misturando-se juntamente LHC8 (Invitrogen) (500 mL), com LHC9 (Invitrogen) (500 mL) e 3 μL de solução de ácido retinóico (5 mg/mL em DMSO líquido. Os meios foram removidos por aspiração e BEGM fresco (200 μL) foi adicionado a cada cavidade. Onde apropriado, 1 μL de uma solução do composto teste na concentração estabelecida ou 1 μL de DMSO como o controle de veículo foi adicionado e as células foram incubada durante 2 horas. As células foram estimuladas com TNFa (50 μL; concentração final 50 ng/mL) e em seguida incubadas durante 4 horas a 37 °C e 5% de CO2. O sobrenadante foi em seguida coletado e mantido a -20°C.

[00143] Os níveis de IL-6 e IL-8 foram determinados por ELISA usando R&D Kits de Systems’ Human IL-6 e IL-8 Duoset® Elisa. A inibição de IL-6 e produção de IL-8 foram calculadas em cada concentração por comparação com o controle de veículo. As concentrações inibitórias de 50% (IC50) foram determinadas das curvas de respostas à concentração resultantes usando XL-Fit (idbs, Guildford, UK).

Análise In Vivo: Atividade Anti-inflamatória e Farmacodinâmicos Acúmulo de neutrófilo induzido por LPS em camundongos

[00144] Camundongos Balb/c não submetidos a jejum foram dosados pela rotina intratecal com veículo ou a substância teste nos tempos indicados (dentro da faixa de 2 a 8 horas) antes da estimulação da resposta inflamatória por aplicação de um desafio de LPS. No T = 0, os camundongos foram colocados em uma câmara de exposição e expostos a LPS (7,0 mL, 0,5 mg/mL de solução em PBS) durante 30 minutos). Após mais 8 horas, os animais foram anestesiados, suas traqueias canulados e BALF extraído por infusão e em seguida retirado de seus pulmões 1,0 mL de PBS por meio de cateter traqueal. Contagens de células brancas totais e diferenciais nas amostras de BALF foram avaliadas usando um hemocitômetro Neubaur. Esfregaços de citospina das amostras de BALF foram preparados por centrifugação a 200 rpm durante 5 minutos em temperatura ambiente e manchados usando um sistema de manchamento DiffQuik (Dade Behring). As células foram contadas usando microscopia de imersão de óleo. Os dados quanto aos números de neutrófilo em BAL são mostrados como média ± S.E.M. (erro padrão da média). O percentual de inibição de acúmulo de neutrófilo foi calculado para cada tratamento com relação ao tratamento de veículo.

Modelo de Fumaça de Cigarro

[00145] Camundongos A/J (machos, de 5 semanas de idade) foram expostos à fumaça de cigarro (fumaça de cigarro a 4%, diluída com ar) durante 30 minutos/dias durante 11 dias usando um Sistema de Experimento de Inalação de Fumaça de Cigarro para animais pequenos (Model SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tóquio, Japão). As substâncias teste foram administradas intranasalmente (35 μL de solução em 50% de DMSO/PBS) uma vez diariamente durante 3 dias após a exposição de fumaça de cigarro final. Em 12 horas após a última dosagem, cada um dos animais foi anestesiado, a traqueia canulada e o fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) foi coletado. Os números de macrófagos alveolares e neutrófilos foram determinados por análise de FACS (EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) usando anticorpo MOMA2 anticamundongo (macrófago) ou anticorpo 7/4 anticamundongo (neutrófilo). BALF foi centrifugado e o sobrenadante foi coletado. O nível de ceratinócito quimioatraente (KC; CXCL1) em BALF foi quantificado usando um kit KC ELISA de camundongo Quentikine® (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN, USA).

Exemplo 1- Preparação de Composto (I)

[00146] Os seguintes usados para preparar o Composto (I) da invenção foram anteriormente descritos e foram preparados usando os procedimentos contidos nas referências citadas abaixo (Tabela 3). Tabela 3: Intermediários Anteriormente Descritos.

Intermediário C: 4-((4-aminonaftalen-1-il)óxi)-N-fenilpirimidin-2-amina.

[00147] A uma solução purgada de nitrogênio de mistura de Intermediário B (50,0 g, 184 mmol) e anilina (42,0 mL, 460 mmol) em THF (200 mL) foi adicionado pTSA (17,5 g, 92,0 mmol) em uma porção única. A mistura reacional foi aquecida para 70 °C durante 1,5 horas, tempo durante o qual um precipitado formou-se. A mistura foi resfriada para temperatura ambiente e diluída com THF (200 mL). O precipitado foi coletado por filtração, lavado com THF (2 x 100mL) e em seguida suspenso em uma mistura heterogênea de DCM (600 mL) e NaOH aquoso (2M, 200 mL), e agitado vigorosamente durante 1 hora, tempo durante o qual os sólidos suspensos dissolveram-se. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com DCM (200 mL). Os extratos de DCM foram combinados, secados e evaporados a vácuo. O resíduo foi triturado com éter (150 mL) e o sólido resultante foi lavado com éter (2 x 50 mL) para fornecer Intermediário C como um sólido não totalmente branco (26 g, 43 %); Rt 1,95 minutos (Método 2); m/z 329 (M+H)+ (ES+). Composto (I): 1-(3-( tert-butil)-1-( p -tolil)-1 H-pirazol-5-il)-3-(4-((2- (fenilamino) pirimidin-4-il)óxi)naftalen-1-il)ureia.

[00148] Uma mistura heterogênea de uma solução de Na2CO3 (3,84 g, 36 mmol) em água (42 mL) e Intermediário A (10,5 g, 45,7 mmol) em acetato de isopropila (130 mL, 1,082 mol) foi agitada vigorosamente em temperatura ambiente durante 5 minutos e foi em seguida tratada com carbonocloridato de fenila (5,77 mL, 45,7 mmol). A agitação da mistura foi continuada durante mais 4 horas, após o que as camadas foram separadas. A fase orgânica foi adicionada a uma solução de Intermediário C (10,0 g, 30,5 mmol) e trietilamina (423 μL, 3,05 mmol) em acetato de isopropila (60 mL, 511 mmol). A mistura reacional foi aquecida para 48 °C durante 1 hora, em seguida diluída com acetato de isopropila (190 mL) e resfriada para temperatura ambiente durante mais 18 horas, tempo durante o qual um precipitado formou-se. O precipitado foi isolado por filtração, lavado com acetato de isopropila e em seguida secado a vácuo a 40 °C para fornecer o composto título, Composto (1) como um sólido branco (base livre de anidro, forma polimórfica A) (16,5 g, 92 %); Rt2,74 minutos (Método 2); m/z 584 (M+H)+ (ES+); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1,30 (9H, s), 2,41 (3H, s), 6,43 (1H, s), 6,58 (1H, d), 6,78 (1H, t), 6,97 (2H, t), 7,28 (2H, br m), 7,39 (2H, d), 7,40 (1H, d), 7,49 (2H, d), 7,56 (1H, m), 7,63 (1H, m), 7,82 (1H, dd), 7,95 (1H, d), 8,10 (1H, d), 8,40 (1H, d), 8,77 (1H, s), 9,16 (1H, br s), 9,50 (1H, br s).

Exemplo 2 - Sumário de Resultados de Análise In Vitro e In Vivo.

[00149] O perfil in vitro do Composto (I) descrito aqui, como determinado, usando os protocolos descritos acima, é apresentado abaixo (tabelas 4a a f) em comparação com o Composto de Referência estruturalmente relacionado que é N-(4-(4-(3-(3-terc-butil-1- p-tolil-1H-pirazol-5-il)ureido)naftalen-1-ilóxi)pyridin-2-il)-2- metoxiacetamida, que foi anteriormente descrito como um agente anti- inflamatório potente com atividade antiviral (Ito, K, e outro, WO 2010/112936, PCT/GB2010/050575, 7 Oct 2010 e Ito, K, e outro, WO 2010/067130, PCT/GB2009/051702, 17 de Junho de 2010.

[00150] O composto da presente invenção demonstra um perfil inibidor muito similar ao Composto de Referência na faixa de ensaios de enzima cinase com a exceção acentuada da atividade inibidora de Composto (I) contra a enzima GSK3α, que é muito mais fraca do que o Composto de Referência (Tabela 4a). Tabela 4a: Perfil de Enzima p38 MAPK, c-Src, Syk e GSK3 α de Composto (I)

[00151] O perfil de ligação de cinase de Composto (I) da presente invenção foi também comparado com o Composto de Referência contra p38 MAPK, HCK, cSrc, Syk, e GSK3α/β. O Composto (I) apresentou um fenótipo diferente, demonstrando inibição profunda de ligação versus cinases p38MAPK, HCK, cSrc e Syk, sem efeito significante contra GSK3α (Tabela 4b). Tabela 4b: Comparação do Perfil de Ligação de Enzima de Composto (I) com o Composto de Referência.

[00152] O composto da presente invenção demonstra um perfil similar ao Composto de Referência em ensaios celulares que revelam propriedades anti-inflamatórias contra liberação mediada por endotoxina tanto de TNFα quanto de IL-8 (Tabela 4c). Os perfis dos compostos são também similares em sistemas celulares que medem seus efeitos sobre a replicação do vírus respiratório (ICAM1 induzido por HRV e expressão de CPE e expressão estimulada por RSV de F- proteína) bem como inflamação induzida por vírus (liberação evocada por HRV de IL-8; Tabela 4d). Tabela 4c: Inibição de Liberação de TNFα e IL-8 induzida por LPS e Expressão de ICAM Induzida por PolyIC Para Composto (I)

Tabela 4d: Efeito de Composto (I) sobre Propagação de HRV-16 (CPE) e Inflamação (Expressão de Liberação de ICAM-1 e IL-8) e sobre a Propagação de RSV (Expressão de Proteína F).

[00153] O composto da presente invenção demonstrou maior eficácia na produção de citocina pró-inflamatória em macrófago de esputo e células epiteliais brônquicas obtidas de pacientes de COPD, que foram largamente insensíveis ao propionato de fluticasona, um corticosteroide. (Tabela 4e). Tabela 4e: O efeito de Composto (I) e propionato de fluticasona sobre a liberação de citocina pró-inflamatória em macrófagos de esputo e célula epitelial brônquica de pacientes de COPD.

Os valores de E-max (inibição máxima) foram calculados como a % de inibição obtida a 0,1 μg/mL

[00154] Entretanto, vantajosamente, o Composto (I) mostra atividade acentuadamente menor em sistemas de ensaio que medem seu impacto sobre a disponibilidade celular e divisão celular (mitose), indicando que o composto é também para possuir um índice terapêutico superior sobre o Composto de Referência (Tabela 4f). Tabela 4f: Efeito de Composto (I) sobre Disponibili8dade Celular e Divisão Celular

[00155] Análise de disponibilidade celular: -ve e +ve indicam que o valor está abaixo ou acima, respectivamente, que não há nenhum de efeito limiar significante definido como 30 % de inibição a 1 μg/mL no mesmo ponto de tempo indicado.

[00156] O tratamento de camundongos com o Composto (I) foi constatado produzir uma inibição dependente de dose sobre o acúmulo de neutrófilos induzidos por LPS e uma experiência ao longo do tempo revelou que a substância de fármaco tinha uma longa duração de ação (Tabela 5). Tabela 5: Efeitos do Tratamento com Composto (I) sobre Neutrofilia das Vias Aéreas Induzida por LPS em Camundongos.

1. N = 8 por grupo

[00157] O resultado do tratamento com Composto (I) em acúmulo de macrófago e neutrófilo em BALF no modelo de fumaça de cigarro em camundongo foi investigado (Tabela 6a). O modelo de fumaça de cigarro usado para este estudo é descrito ser um sistema refratário de corticosteroide, (Medicherla S, e outro, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2008, 324(3):921-9.) e foi confirmado que o propionato de fluticasona não inibe o acúmulo de neutrófilo ou macrófago nas vias aéreas a 1,75 μg/camundongo (35 μL, bid, i.n.), a mesma dose que produziu >80 % de inibição de acúmulo de neutrófilo induzido por LPS.

[00158] O tratamento de camundongos com Composto (I) foi constatado produzir uma inibição dependente de dose tanto em acúmulo de macrófago quanto de neutrófilo em BALF induzido por fumaça de cigarro. Tabela 6a: Os Efeitos de Tratamento com Composto (I) em Fumaça de Tabaco em Camundongos.

Os dados para números de célula são mostrados como a média ± SEM, N=5

[00159] O tratamento de camundongos com Composto (I) também inibiu a produção de CXCL1 (KC) induzida por fumaça de cigarro em BALF em uma maneira dependente de dose (Tabela 6b). Tabela 6b: Os Efeitos de Tratamento com Composto (I) sobre a Liberação de CXCL1 (KC) em BALF na Fumaça de Tabaco em Camundongos.

Os dados para nível de CXCL são mostrados como a média ± SEM, N=5

[00160] Em resumo, estes resultados sugerem que o Composto (I) tenha propriedades anti-inflamatórias similares ao Composto de Referência descrito acima e, vantajosamente, está associado com um índice terapêutico superior.

Exemplo 3: Preparação de Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B

[00161] O Composto (I) (398 g, em forma polimórfica A) foi apreendido em acetona (3,98 L) e a solução aquecida para 50°C. NORIT A SUPRA (19,9 g, um carbono ativado) e terra diatomácea, fluxo calcinado (3,98 g; um agente de filtro) foram em seguida adicionados e a mistura foi aquecida até refluxo (56°C) durante 15 minutos. A mistura foi filtrada e o sólido resultante foi lavado com acetona (100 mL). O filtrado combinado e a acetona de lavagem foram aquecidos até refluxo (56°C), e 900 mL de solvente foram removidos por meio da destilação sob pressão atmosférica a 56°C. A mistura foi resfriada para 50°C e água (398 mL) foi em seguida adicionada durante um período de 1 hora enquanto a temperatura foi mantida a 50°C. Após mais 30 minutos a 50°C, a mistura heterogênea foi resfriada para 20°C durante 6 horas e em seguida agitada a 20°C durante 10 horas. O produto resultante foi filtrado e a massa foi lavada com acetona (318 mL). O produto foi secado a vácuo a 45°C durante 20 horas para produzir o Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B (240,9 g; 60,5 % de produção).

[00162] O método acima pode opcionalmente ser adaptado para facilitar a cristalização com semeadura.

Exemplo 3a: Preparação de Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, contendo solvente residual reduzido.

[00163] Opcionalmente, o Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, como preparado de acordo com o procedimento descrito acima (Exemplo 3) ou um método similar, pode ser ressuspenso da água a fim de reduzir o solvente residual como segue:

[00164] O Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B (230 g, como preparado de acordo com o Exemplo 3) foi suspenso em água desionizada (2,30 L) e foi agitado a 20°C durante 4 horas. A mistura foi filtrada e o produto foi lavado com água desionizada (2 x 115 mL) e foi em seguida secada a 45°C a vácuo para produzir o Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B contendo solvente residual reduzido (227 g, 98,7 %).

Exemplo 4: Micronização de Composto (1) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B

[00165] A forma polimórfica cristalina micronizada B de Composto (1) como a base livre de anidro foi preparada usando um dispositivo de micronização de moinho a jato (1,5 bar usando um alimentador manual com uma pressão de injetor de 1,5 bar) (fabricado por Hosokawa Alpine). A distribuição de tamanho de partícula foi medida usando difração a laser (instrumento Malvern Mastersizer 2000S). As distribuições de tamanho de partícula podem ser representadas usando valores D10, D50 e D90. O valor médio de D50 de distribuições de tamanho de partícula é definido como o tamanho de partícula em mícrons que dividem a distribuição em metade. A medição derivada de fração a laser é mais acuradamente descrita como uma distribuição de volume, e, consequentemente, o valor D50 obtido usando este procedimento é mais significativamente referido como um valor Dv50 (média para uma distribuição de volume). Como usado aqui, os valores Dv referem-se a distribuições de tamanho de partícula medidas usando difração a laser. Similarmente, os valores D10 e D90, usados em relação à difração a laser, são tornados valores Dv10 e Dv90 médios e referem-se ao tamanho de partícula, segundo o qual 10 % da distribuição situam-se abaixo do valor D10, e 90 % da distribuição situam-se abaixo do valor D90, respectivamente. A forma polimórfica cristalina micronizada B de Composto (1) como a base livre de anidro tinha a seguinte distribuição de tamanho de partícula: D10 de 0,850 μm; D50 de 1,941 μm e D90 de 4,563 μm.

Exemplo 5: Análise de XRPD de Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórficas A e B

[00166] Análise de XRPD de Composto (I) como a base livre de anidro em formas polimórficas cristalinas sólidas A e B (a forma polimórfica B foi micronizada seguindo o procedimento de Exemplo 4) foi empreendido usando o método descrito nos procedimentos gerais. Os padrões de difração resultantes são mostrados nas figuras 1 e 2, respectivamente. Ambos os padrões de XRPD mostraram picos sem a presença de um halo, desse modo, indicando que ambos os materiais são cristalinos. Os picos e suas intensidades são listados abaixo (Tabela 7a e Tabela 7b). Tabela 7a: Picos de XRPD característicos e suas intensidades para Composto (I) como a base livre de anidro em forma cristalina, sólida A

1.Os valores são ± 0,2 grau Tabela 7b: Picos de XRPD característicos para Composto (I) como a base livre de anidro em forma cristalina sólida B, pós micronização.

1.Os valores são ± 0,2 grau

Exemplo 6: Determinação de ponto de fusão de Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórficas A e B

[00167] Os pontos de fusão de Composto (I) como a base livre de anidro em formas polimórficas cristalinas sólidas A e B (a última após micronização) foram obtidos usando calorimetria de varredura diferencial (DSC), como descrito nos procedimentos gerais. A forma polimórfica A fundiu-se a 191,6°C e a forma polimórfica B fundiu-se a 214,0°C. A partir dos dados de DSC, calculou-se que a forma B tinha um calor de fusão maior do que a forma A. Visto que a forma B também tem um ponto de fusão maior do que a forma A, isto indica que as formas polimórficas A e B são monotropicamente relacionadas, significando que a forma polimórfica B de fusão mais elevada será mais estável do que a forma polimórfica A de fusão inferior, em todas as temperaturas. Como tal, pode esperar-se que a forma polimórfica B seja, termodinamicamente, mais estável do que a forma polimórfica A.

Exemplo 7: Análise térmica de Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, pós micronização.

[00168] A análise térmica de Composto (I) como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina B (micronizada) foi empreendida usando análise de TGA, DVS, XRPD, espectroscopia de IR e DSC como descrito nos procedimentos gerais. Onde apropriado, uma amostra em temperatura ambiente e umidade relativa (amostra de referência/ "0 dia") foi comparada com amostras armazenadas em várias temperaturas e umidades relativas (amostras comparativas).

[00169] Análise termogravimétrica: A amostra de referência (t = 0) e as amostras comparativas, que foram expostas antes da análise de condições de armazenamento diferentes, foram aquecidas a uma taxa de 20°C/min de temperatura ambiente até 300°C. A curva de TGA da amostra de referência (t = 0) é ilustrada na Figura 3 e os resultados para todas as amostras são sumariados abaixo (Tabela 7). Como se pode observar a partir da Figura 3, uma perda de peso de 0,6 % foi observada na faixa de temperatura de temperatura ambiente até 180°C, que foi devido à evaporação do solvente. A perda de peso que ocorreu acima de 180°C foi devido à evaporação e à decomposição do produto. Comparando este perfil de perda de peso com aqueles das amostras comparativas na Tabela 7, nenhuma diferença significante foi observada.

[00170] Absorção de Vapor Dinâmico: A plotagem de isoterma de DVS para a amostra de referência micronizada ilustrada é ilustrada na Figura 4 e a mudança de DVS na plotagem de massa para a amostra de referência micronizada é ilustrada na Figura 5. Durante a etapa de secagem inicial, nenhuma perda de peso foi registrada e o produto não mostrou nenhum comportamento higroscópico. O produto absorveu até 0,4 % de umidade, dependendo da umidade atmosférica. O produto foi constatado secar completamente e permanecer no mesmo estado sólido cristalino (forma B) durante o teste, como evidenciado pelo espectro de IR e padrão de XRPD sendo, substancialmente, o mesmo antes e após a análise de DVS. Análise de XRPD e Espectroscopia de IR: O padrão de difração de XPRD da amostra de referência (t = 0) é ilustrado na Figura 2 e o traço de IR é ilustrado na Figura 6. O padrão de difração e o traço de IR foram comparados com aqueles das amostras comparativas (expostas a condições de armazenagem diferentes) e os resultados são sumariados na Tabela 7. Os padrões de difração e os traços de IR foram idênticos para todas as amostras.

[00171] Calorimetria de Varredura Diferencial: A amostra de referência (t = 0) e as amostras comparativas, anteriormente expostas a condições de armazenagem diferentes, foram aquecidas a uma taxa de 10°C/min de 25°C a 300°C. A curva de DSC da amostra de referência é ilustrada na Figura 7 e os resultados para todas as amostras são sumariados abaixo (Tabela 8). A partir da Figura 7, é evidente que a amostra de referência fundiu-se com decomposição a 214,0°C. Tabela 8: Análise térmica de Composto (I) como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida B pós micronização.

[00172] Em resumo, é evidente que o Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B tem boa estabilidade física.

Exemplo 8: Análise de HPLC de Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B pós micronização.

[00173] A estabilidade química do Composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, após micronização, foi determinada comparando uma amostra mantida em temperatura ambiente e umidade relativa (amostra de referência) com amostras armazenadas em várias temperaturas e umidades relativas como estabelecido aqui acima (as amostras comparativas, Tabela 8). As amostras de referência e comparativas foram em seguida analisadas por HPLC usando o método descrito nos procedimentos gerais e por inspeção visual. Os resultados deste estudo (dados sumariados na Tabela 9) revelam que o Composto (I), preparado como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, é quimicamente estável, embora alguma sensibilidade à luz fosse observada. Tabela 9: Estabilidade química de composto (I) como a base livre de anidro em forma sólida, cristalina, polimórfica B, pós micronização.

Exemplo 9 - Preparação de formulações farmacêuticas

[00174] Uma formulação farmacêutica exemplar da invenção pode consistir em 0,4 % por peso de composto (I) (como a base livre de anidro em forma polimórfica cristalina sólida B), 98,6 % por peso de monoidrato de lactose (grau de inalação) e 1,0 % por peso de estearato de magnésio, em que o % por peso de todos os componentes é baseada no peso da formulação farmacêutica seca.

[00175] Por toda a especificação e as reivindicações que seguem, a menos que o contexto requeira de outo modo, a palavra "compreende", será entendida implicar a inclusão de um número inteiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas estabelecido, porém não a exclusão de qualquer outro número inteiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupos de etapas.

[00176] Todas as Patentes e Pedidos de Patente referidos aqui são incorporados por referência em sua totalidade.

Claims (17)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula (I),

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, incluindo tautômeros do mesmo.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser como a base livre.

3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto de Fórmula (I) como a base livre de anidro está na forma cristalina sólida tendo um difratograma de pó de raio X com picos (2-teta) de 7,8, 8,7, 10,3, 11,2, 12,4, 15,2, 16,2, 17,5, 19,7, 20,8, 22,6, 23,1, 24,6, 25,5, 26,7 e 27,4 ± 0,2 graus e tendo um ponto de fusão de 191,6 °C como medido por calorimetria de varredura diferencial.

4. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto de Fórmula (I) como a base livre de anidro está na forma cristalina sólida tendo um difratograma de pó de raio X com picos (2-teta) de 3,9, 6,1, 7,7, 8,6, 10,9, 11,8, 12,7, 14,3, 15,9, 16,7, 18,3, 18,7, 19,9, 20,9, 22,0, 22,6, 25,2, e 28,9 ± 0,2 graus e tendo um ponto de fusão de 214°C como medido por calorimetria de varredura diferencial.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, incluindo tautômeros do mesmo, em combinação com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

6. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para preparar um medicamento pata o tratamento de um distúrbio selecionado do grupo consistindo em: COPD, bronquite crônica, enfisema, asma, asma pediátrica, rinite alérgica, rinite e sinusite.

7. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para preparar um medicamento para o tratamento de infecções virais respiratórias.

8. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para preparar um medicamento para o tratamento de uma condição selecionada de COPD, bronquite crônica, enfisema, asma, asma pediátrica, fibrose cística, fibrose pulmonar idiopática, rinite alérgica, rinite, sinusite, conjuntivite alérgica, conjuntivite, dermatite alérgica, dermatite de contato, psoríase, colite ulcerativa, articulações inflamadas secundárias à artrite reumatoide ou à osteoartrite, artrite reumatoide, pancreatite, caquexia, tumores selecionados de carcinoma de pulmão de célula não pequena, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, carcinomas colorretais e melanoma maligno.

9. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para preparar um medicamento para sensibilizar um indivíduo sofrendo de COPD ou asma através do tratamento com corticosteroide, em que um indivíduo tenha previamente se tornado refratário ao tratamento com corticosteroide.

10. Formulação farmacêutica de pó seco para inalação, caracterizada pelo fato de que compreende: um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

11. Formulação farmacêutica de pó seco de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente lactose.

12. Formulação farmacêutica de pó seco de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a lactose é lactose monoidratada.

13. Formulação farmacêutica de pó seco de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um sal de metal particulado de ácido esteárico.

14. Formulação farmacêutica de pó seco de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o sal de metal particulado de ácido esteárico é estearato de magnésio.

15. Composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de exacerbações em pacientes com doença respiratória crônica, tal como COPD (incluindo bronquite crônica e enfisema), asma, asma pediátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática.

16. Composição farmacêutica como definida na reivindicação 5, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de exacerbações em pacientes com doença respiratória crônica, tal como COPD (incluindo bronquite crônica e enfisema), asma, asma pediátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática.

17. Formulação farmacêutica de pó seco como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de exacerbações em pacientes com doença respiratória crônica, tal como COPD (incluindo bronquite crônica e enfisema), asma, asma pediátrica, fibrose cística, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática.

Images